Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов

Крылов, Игорь Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов"

На правах рукописи

• 1.—I

КРЫЛОВ ИГОРЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ БИОМАССЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1998

Работа выполнена в Российском химико-технологическо университете им. Д.И.Менделеева

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Манаков Михаил Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор технических наук, профессор, академш РАМН

Быков Валерий Алексеевич Доктор химических наук, профессор Юркевич Александр Морисович Доктор химических наук, профессор Неклюдов Андрей Дмитриевич

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок), (г.Москва, Б. Коммуни тическая, 27)

Защита состоится 1998 г. в часов на заседаш

диссертационного совета Д. 053. 34. 13 в Российском химико-технолог ческом университете им. Д.И.Менделеева, 125190, Москва, Миусская пл., 9

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном цент РХТУ им. Д.И.Менделеева

Автореферат разослан "ХЗ »^с&Ьр^ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 053.34.13, к.б.н.

И.И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Одним из достижений современной промышленной биотехнологии является создание крупнотоннажного производства микробной биомассы (дрожжей и бактерий). В этом отношении особое место среди'промышленно развитых стран занимает Россия, которой принадлежит приоритет в области разработки крупнотоннажных технологий и большая часть производственных мощностей. Созданная база определила перспективу дальнейшего развития промышленного производства микробного белка, где биомасса микроорганизмов не является единственным конечным продуктом, а рассматривается и как сырье для получения разданных по свойствам и назначению препаратов белковой, нуклео-тидной и липидной природы. Отечественные и зарубежные технологии опытно-промышленного производства различных продуктов комплексной переработки микробной биомассы в отличие от аналогичных индивидуальных производств демонстрируют более высокие технико-экономические показатели.

Общим недостатком разработанных технологий является невысокая рентабельность комплексного производства, что сдерживает его развитие. Повышение рентабельности возможно, если действующие биохимические заводы перейдут на выпуск фармацевтических препаратов или субстанций, из которых наибольший интерес представляют продукты переработки биополимеров нуклеопщной и белковой природы.

Если технологии получети белковых изолятов, автолизатов и фер-ментолизатов различной степени гидролиза и очистки можно считать раз-работшшыми, то успехи в области многотоннажного производства микробных полинуклеотидов, особенно РНК, невелики. Отметим что интерес к микробным полинуклеоттвдам проявляют практически все фармацевтические фирмы промышленно развитых стран, выпускающие препараты нук-леотидной природы, из которых противовирусная группа относится к числу наиболее дорогостоящих лекарственных средств. Отсутствие их производства в России усиливает актуальность этой проблемы.

В настоящее время выделение из микробных клеток компонентов нуклеиновых кислот - KHK и белковых веществ - КБВ, и получение их модифицированных производных может быть реализовано только в варианте комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов при минимизации затрат на сырье, энергию и природоохранные системы. Такой подход не только не исключает выпуск кормового белка, но, наоборот, сохраняет его в виде производства частично денуклеинизированных и де-протеинизнрованных микробных' клеток.

Цель и задачи исследований: Цель исследований состояла в: разработке концепции второго этапа развития биотехнологии крупнотоннажного производства кормовой биомассы;

создании научных основ ее глубокой комплексной переработки в препараты KHK и КБВ;

разработка системы взаимосочетающихся ресурсо- и энергосберегающих малоотходных и экологически безопасных технологий. В задачи работы входило:

1) разработать высокоэффективные конкурентноспособные технологии глубокой переработки микробного сырья с целью получения серии препаратов нуклеотидной и белковой природы различной степени очистки и назначения;

2) разработать математические модели для создания алгоритма управления основными стадиями технологического процесса получения микробных полинуклеотидов, белков и продуктов их деполимеризации;

3) разработать объективные критершш продуктивности узловых стадий процессов глубокой переработки микробного сырья на основе анализа данных кинетики отдельных превращений для обоснования технико-экономической оценки технологий;

4) провести поиск нетрадиционных сфер использования белковых гидролизатов дня расширения области их применения;

5) разработать нормативно-техническую документацию для организации опытного производства KHK и КБВ.

Научная новизна исследований: Разработана научно-обоснованная концепции второго этапа развития биотехнологии крупнотоннажного производства микробной биомассы, предусматривающего комплексную переработку промышленных микроорганизмов, основаной на выделении из дрожжей и бактерий нуклеиновых кислот и белковых веществ и их трансформации в наиболее ценные продукты или перспективные субстанции для применения в различных областях хозяйственной деятельности.

Разработаны нетрадиционные методы выделения из микробных клеток полинуклеотидов и их очистки в рациональном химическом процессе, исключающем использование протеолитических ферментов и фенолсодер-жащих растворов.

- Впервые разработаны приемы выделения из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus как РНК, так и ДНК без применения органических растворителей.

- На основе кинетических исследований разработаны математические модели реакционных взаимодействий для всех основных стадий получения очищенных полинуклеотидов: экстракции НК водными и солевыми растворами; ультраконцетрирования бесклеточных экстрактов; осаждения и разложения белково-нуклеиновых комплексов в среде ортофосфата. Выявлены параметры для прогнозирования доли белковых примесей в поли-нуклеотидных препаратах.

- Установлены основные закономерности гидролитического расщепления РНК до нуклеозидов и пуринов под действием химических агентов и ферментов. Проведен сравнительный анализ промышленных способов гидролиза РНК и переработки различных гидролизатов в очищенные препараты KHK.

- разработаны технологические приемы глубокой переработки отдельных KHK в водных растворах - химическая трансформация Ado в Ino, Guo в Gua и D-рибозу, фосфолирирование Ado в 5'-аденозинфосфаты ферментным комплексом пивных дрожжей - с получением очищенных препаратов.

Впервые на основании кинетических исследований основных стадий выделения НК и деполимеризации белков из дрожжей и бактерий под действием химических агентов и технических ферментных комплексов разработаны математические модели процессов, обеспечивающие создание алгоритмов управления ими.

Расширена область применения белковых гидрошпатов: впервые показана возможность их использования для выделения металлов (на примере золота, серебра и меди) из второсортного сырья и отходов.

Практическая ценность. Преимуществами разработанных технологий получения КНК и КБВ при комплексной переработке микробного сырья являются: 1) использование сырьевой базы производства кормового белка; 2) применение водных реагентов для проведения большинства стадий; 3) регенерация малотоксичных органических растворителей; 4) отсутствие образования токсичных соединений; 5) малоотходность; 6) замкнутость циклов, предусматривающая возрат твердых отходов и значительной части жидких стоков в основное производство; 7) высокая экономическая эффективность за счет выпуска серии продуктов разной степени очистки и минимизации затрат на природоохранные мероприятия.

Разработаны два варианта использования солей ортофосфорной кислоты в технологии получения очищенных полинуклеотидов: 1) для малотоннажного производства в составе экстрагента, извлекающего из клеток нуклеиновые кислоты, практически свободные от белковых примесей; 2) для крупнотоннажного производства в составе раствора, разлагающего нуклеопротеиды с выделением свободных полинуклеотидов, исключающих в обоих вариантах применение протеолитических ферментов и фенолсо-держащих растворов.

Проведение стадии осаждения нуклеопротеидов РНК отстаиванием из сконцентрированных ультрафильтрацией растворов позволило сократить время процесса не менее, чем в 5 раз и исключить энергозатраты на получение холода.

Предложен критерий качества перерабатываемых в КНК полинуклеотидов - доля, содержащейся в них белковой примеси. При ее содержании не выше 5% переработка получаемых гидролизатов или ферментолизатов РНК требует минимальных норм расхода сорбентов (ионитов).

На основании результатов апробации различных способов получения препаратов очищенной РНК в производственных условиях на опытных и опытно-промышленных установках ВНЦ антибиотиков, Киришско-го БХЗ и Светлоярского БВК подготовлена нормативно-техническая документация и исходные данные на проектирование производства РНК мощностью I т в год.

Созданы математические модели основных стадий получения полинуклеотидов, экстракции и гидролиза белковых веществ для создания алгоритма управления ими.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на 2-ой Республиканской конференции "Проблемы охраны окружающей среды в районах с интенсивно развивающейся промышленностью" (Кемерово, 1982); 3-ем Симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (Братислава, 1983); 1У-ой Всесоюзной конференции по ПАВ и сырью для их производства (Волгодонск, 1984); Ш-ем Всесоюзном совещании по аминокислотам (Ереван, 1984); 4-ом Симпозиуме социалистических стран по биотехнологии (Варна, 1986); Всесоюзной конференции "Аминокислоты для сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований" (Ереван, 1988); Всесоюзной научно-технической конференции "Итоги и перспекивы использования природных и синтетических ВМС

в производстве пищи" (Суздаль, 1991); III German-russian Workshop Biotechnology (Berlin, 1994), III-ем Международном конгрессе "Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес и экологическое образование"(Самара, 1998).

, Публикация результатов исследований: По материалам диссертации опубликованы 23 статьи, тезисы 11 докладов и получено 9 авторских свидетельств и патентов РФ на изобретения.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на^."? страницах машинописного текста, содержит^ рисунков, 4?.. таблиц и 5 схем. Работа включает введение, главу общей характеристики объектов и методов исследования, 4 главы собственных исследований (каждой главе предшествует анализ литературных данных), заключение, выводы и список литературы (из25г? наименований, из них/Й?£?- на иностранных языках). Материалы, имеющие практическое значение и подтверждающие основные результаты работы, представлены в приложении.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Общая характеристика объектов и методов исследования

Объектами исследования явились промышленные продуценты кормового белка: дрожжи Candida maltosa ВСБ-899 и С. ethanolica ВСБ-651, бактерии - М. capsulatus ВСБ-874, которые выращивали в асептических условиях в хемостате на н-парафинах нефти (фракции Сн-Сш), этаноле и природном газе соответственно. В работе также использовали паприн, эп-рин и гаприн - кормовые белковые препараты, выработанные на основе этих штаммов Российскими предприятиями микробиологической промышленности и промышленные суспензии нативных клеток парафинокисляю-щих дрожжей и метанокисляющих бактерий со степенью доминирования основного штамма 95 и 70% соответственно, полученные в условиях Ки-ришского БХЗ и Светлоярского завода БВК; сгущеную суспензию клеток пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis S-Львовская со степенью доминирования основного штамма не ниже 85% производства Московского экспериментального завода напитков.

В клетках, экстрактах, гидролизатах и препаратах определяли спектр о ф ото м етр и чески ("Specord М-40"): общее содержание НК по методу А.С. Спирина; только в препаратах: ДНК - по методу Дише и РНК - как разность между общим содержанием НК и ДНК; фосфат-ионы - по методу Фисже-Саббороу; сырой протеин - по методу Кьельдаля; белковые вещества - модифицированным методом Лоури; аминный азот - по реакции взаимодействия аминогрупп с нингидриновым реагентом; активность протеаз в ФП поджелудочной железы - по методу Акселя. Нуклеозиды разделеляли методом двухмерной ТСХ на пластинах марки "Silufol UV-254" с использованием элюентов: 1) изопропанол - аммиак - вода (70:10:20 % об.) и 2) н-бутанол - ацетон - муравьиная кислота - вода (45:45:2:8 % об.); при фосфо-рилировании Ado и Ino элюировали в системе 3) изопропанол - аммиак -вода (70:15:15% об.), 5'-аденозинфосфаты - в системе 4) 1,4 диоксан - изопропанол- аммиак в (60:30:10 % об.).

Достоверность полученных экспериментальных данных оценивали по результатам трех параллельных опытов, использую критерии Стьюдента для уровня значимости 0,05.

Экспериментальные данные обрабатывали с применением компьютерного программирования с последующей оптимизацией установленных параметров и проверкой разработанных моделей на адекватность по критерию Фишера, отвечающему условию Fon < F табл для уровня значимости 0,05.

2. Денуклеинизация биомассы промышленных микроорганизмов

Анализ литературы показывает, что для крупнотоннажного производства НК из микробных клеток наиболее целесообразна их экстракция низкоконцентрированными растворами щелочей. Солевые экстрагеиты загрязняют биомассу, но могут использоваться в опытно-промышленном производстве, если обеспечивают необходимую степень очистки НК от белков непосредственно на стадии экстракции. Среди апробированных нами растворов солей только растворимые соли ортофосфорной кислоты экстрагировали НК без примеси белка, что существенно упрощает технологию химической очистки и увеличивает выход НК в 1,5-2 раза. Поэтому мы уделили особое внимание изучению и модификации основных стадий выделения и очистки НК при их экстракции растворами щелочей и ортофос-фатов.

2.1. Выделение РНК и ДНК из клеток дрожжей и бактерий экстракцией слабощелочными растворами

Среди факторов, влияющих на степень извлечения НК из дрожжей и бактерий, наиболее существенными были длительность экстракции, температура, рН среды и плотность микробных суспензий.

Из представленных на рис.1 и 2 кинетических кривых экстракции КНК следует, что выбранные экстрагенты не менее, чем на 95% извлекают НК из всех видов микробных клеток, причем из высушенных дрожжей в 34 раза быстрее, чем из нативных клеток. Для всех видов микробного сырья типична потеря части РНК до начала ее экстракции за счет деятельности термостабильных внутриклеточных РНК-аз.

Скорость извлечения НК не зависела от плотности клеточной суспензии при значениях этого параметра в интервале от 5 до 20% МСК, что указывает на псевдопервый порядок по концентрации клеток в кинетике экстракции НК.

Факторами, существенно влияющими на скорость экстракции НК, были температура и рН среды. Обработка соответствующих серий кривых в координатах: ln (X«,, рнк нот днк - X) - время, показала наличие линейных зависимостей, что позволило рассчитать для кинетических кривых значения эффективных констант скоростей (к3фф) и зависимости скорости экстракции НК от температуры и рН среды. Было установлено, что кинетика экстракции подчиняется закономерностям специфического кислотно-основного катализа, температурная зависимость - уравнению Аррениуса, а процесс реализации НК из микробных клеток можно представить в виде следующей схемы превращений:

Кь кг

+ ОН- [ I ] МАь + ОН- (1),

где КАя , ЫАь соответственно РНК (ДНК) внутри клетки и в объеме экс-трагенга, [ I ] - интермедиат от обратимого взаимодействия экстрагента с НК, распад которого приводит к извлечению их из клетки.

В табл. 1 приведены величины констант кг, Кь и энергий активаций (Еа), адекватно описывающие кинетику процесса щелочной экстракции НК из суспензий промышленных микроорганизмов в интервалах изменения температуры от 70 до 95°С и рН от 7,0 до 9,0.

Значения параметров в табл. 1 и схема превращений (1) использованы для содания математической модели щелочной экстракции НК из микробных клеток, что позволяет вести управление процессом. Последнее особенно важно для случаев, когда наряду с РНК, может извлекаться ДНК, что требует- в дальнейшем их разделения. Согласно расчетам, был найден режим экстракции, при котором извлекается с выходом 75% практически только РНК: температура - 90°С, рН 7,5, время обработки - 1 ч. Выделенный в этих условиях препарат бактериальной РНК содержит не более 1,54,0% ДНК (в коммерческих препаратах РНК из дрожжей примесь ДНК не превышает 1,5%).

Для извлечения ДНК из бактерий рекомендуется более жесткий режим: температура - 90°С, рН 8,6, время экстракции - 4 ч. В этих условиях выход ДНК составляет 65% и существенно не меняется с увеличением времени обработки и показателя рН среды.

При сравнении результативности использования при равных условиях щелочных экстрагенгов и растворов ДАФ, отмечено, что скорость экстракции НК в солевую среду несколько ниже, а степень их извлечения не зависиг от вида микробных клеток и снижается с увеличением концентрации ДАФ в растворе. Этот факт можно объяснить эффектом высаливания НК, который снижает их растворимость в экстракте. Для раствора ДАФ найдена постоянная высаливаниях=(0,015±0,001)М-1, которая связывает между собой кинетические кривые экстракции НК щелочными и солевыми растворами.

Таблица 1.

Значения констант и энергий активации в процессе экстракции НК из клеток микроорганизмов__ ___

Вид микробных клеток Кь х 106, м к2х 105, (90 "С), с-' Еа, кДж-М'

Пивные дрожжи 7,8 ±0,6 50,5 ±5,5 69,1 ±2,5

Высушенные распылительно кормовые дрожжи (паприн, эприн) 6,6 ±0,6 390 ± 46 62,8 ±2,1

Плазмолизованные метанутилизи-рующие бактерии (гаприн): для РНК. для ДНК 19,4 ± 1,8 38,0 ±2,5 75,3 ±5,8 9,3+1,2 64,5 ±2,1 35,2 ±2,5

Т. о., результаты исследований кинетики экстракции НК из микробных клеток показывают, что приемлемые для технологии выходы могут быть достигнуты при использовании слабощелочных водных или солевых растворов. Чтобы избежать значительных потерь целевого продукта жела-

«ремя„чин

Рпс.1 Кинетика птв лечения НК гид-роксидом натрия (1) и 1,75 М раствором ДАФ (2) из папрниа и эприна (а), пивных дрож-жен (G) и парафпн-окнеляющих дрожжей С. maltosa ВС К-899 (в), выращенных в лабораторных условиях. Условия экстракции: температура 80°С.рН 8.6.

А у '

Г" > "ЧО1 <

г т; е

ff 1 S

г/

( ¿i—=

время, ч Рис.3. Кинетика осаждения нук-леопротеидов отстаиванием из водного раствора при различной начальной концентрации НК. Условия процесса: рН 2,0, температура 4-8 °С.

Начальные концентрации РНК г/л: 12(1); 16,5 (2); 23,5(3); 44,4(4)

У* >

15 : зо бо

время, мин Рис.2. Кинетика извлечения НК раствором гндрокенда натрия (1) и 1,75 М раствором ДАФ (2) пз метанокне-ляющих бактерий М. сарзи!а№ ВСБ -874, выращенных в лабораторных условиях (в) и условиях Светлояр-ского завода БВК (б).

Условия экстракции: температура _

90°С, рН 8,6

. !<5 Ска, гИА-л-1 Рис.4. Влияние начальной концентрации нуклеопротеидов на степень их осаждения (рН 2,0). Условия эксперимента: фактор разделения Рг=2475.

тельно перерабатывать клетки, не содержащие активных РНК-аз. Это исключает применение ингибиторов нуклеаз - соединений, как правило, дорогостоящих и загрязняющих биомассу.

22. Выделение и очистка нуклеиновых кислот

2.2.1. Получение бесклеточных экстрактов

Для выделения НК из экстрактов наиболее целесообразно удалять клеточную массу традиционными приемами - фильтрованием или сепарированием. Поскольку после денуклеинизации способность клеток к осаждению может изменяться, был исследован процесс образования их осадков. Показано, что клетки дрожжей с достаточно высокой эффективностью от-делепяются фильтрованием в режиме постоянного нарастания давления над слоем жидкости от 0,01 до 0,20 МПа и выше при производительности оборудования не менее 40-130 л-м"2-'ч-!, что позволило рекомендовать использование закрытых рамных фильтр-прессов. При этом суспензии высушенных клеток дрожжей (палрин, эприн) образуют более легко фильтруемые осадки. Их трехкратная промывка свежим экстрагентом или водой с гидромодулем 1 увеличивает выход НК от 79 до 94%.

Клетки метанокисляющих бактерий могут быть успешно отделены от экстракта только при наличии сдвига; наблюдаемый при этом концентра-ционныйпорядок в кинетике осаждения частиц остается низким, равным 1, что обуславливает необходимость применения высокоэффективных сепараторов или бактофуг. Желательно проведение промывки клеток, т.к. без этой стадии потери НК составляют не менее 25% от их содержания в экстракте.

2.2.2. Осаждение нуклеиновых кислот п изоэлектрической точке

Традиционно НК из бесклеточных экстрактов выделяют осаждением в ИЭТ (рН 1,0-2,0) из растворов, охлажденных до 4-12°С. При этом полного осаждения НК не происходит. Для повышения их выхода (до 10%) обычно вводят стадию доосаждения НК из фильтрата, что занимает не менее 12-24 ч. Недостатком такого способа являются высокие энергозатраты.

Для совершенствования технологии были исследованы закономерности осаждения в ИЭТ дрожжевых нуклеопротеидов (из водных растворов) и полинуклеотидов (из солевых) при различной начальной концентрации НК в растворе (рис.3). Выявленная зависимость степени осаждения (Xs) от начальной концентрации НК свидетельствует, что концентрационный порядок в кинетике их осаждения отличается от 1. Как следует из рис.3, осаждение НК целесообразно проводить из концентрированных растворов. В этом случае время образования осадков сокращается до 1,5-2 ч, что снижает энергозатраты.

Другой способ получения осадков, который не зависит от образования флокул при отстаивании - центрифугирование. Выявленная зависимость показателя Xs от начальной концешрации'НК (рис.4, кривая 1) была использована для количественного изучения данного процесса.

В условиях индуцированных сдвигом скорость зарождения и начального роста частиц осадка описывается уравнением 2-ого порядка. Тогда схему образования осадка можно представить в виде:

2 NAH" (NAH°)2 i (2),

где NAH0 - нейтрализованные молекулы HK, (NAH°)2- флокулы образующегося осадка, ki ик-i - константы скоростей его образования и растворения в отсутствии равновесия или K's=ki/k-i при наличии последнего.

В случае установившегося термодинамического равновесия, которое достигается при центрифугировании, схеме превращений (2) отвечает зависимость Xs от начальной концентрации НК в растворе: Xs /(1 - Xs)2 = =K's Cna,o. Обработка данных в координатах Xs/ (l-Xs)2, С na.o выявила линейную зависимость, что позволило найти численное значение константы K's=(650±I6) л-моль Р-'.

Схема превращений (2) при концентрациях НК 15 г-л-1 и выше количественно описывает представленные на рис.3 кривые осаждения нуюгео-протеидов из экстрактов при значениях констант ki=(4,l±0,7) л-мольР-' •мин1 и k-i=(6,2±l,2)-10-J мшг1. Это позволило рассчитать время, необходимое для осаждения нуклеопротеидов на 95 и 100% - 0,5 и 4 ч соответственно.

Для экстрактов (рис.4, кривая 2) с типичной на практике концентрацией менее 15 г-хг1 схема превращений при осаждении НК более сложная:

Kl K'si K'sz

NAH° + Lo NAH4L ; 2NAH0о(NAH°)2i; 2NAH°L(NAH°L)24- (3), где L - извлекаемые из клеток низкомолекулярные "мешающие" примеси, а NAH°L и (NAH°L)2 - соответственно аддукгы, образующиеся при их взаимодействии с нуклеопротеидами и флокулами осадка. Тле. величина L неизвестна и потому значения констант Kl hK's2 нельзя рассчитать, для создания алгоритма управления процессом саждения можно использовать экспериментально полученную S-образную зависимость Xs от Cna.o и описывающую ее схему превращений (3), в которой для параметра L следует подобрать положительные значения констант Kl иК'и.

Проведенный анализ позволил сделать важный для технологии вывод: эффективность получения осадков нуклеопротеидов отстаиванием существенно зависит от их начальной концентрации, что связано с энергозатратами на охлаждение экстрактов. Реальный путь снижения энергоемкости производства - повышение концентраций нуклеопротеидов, для чего рекомендуется ввести стадию вакуум-выпаривания бесклеточных экстрактов или концентрировать их ультрафильтрацией.

Другим фактором, влияющим на образование осадков НК, является pH среды (рис.5), создаваемого соляной или ортофосфорной кислотой, при этом показатель Xs не зависит от выбора минеральной кислоты, а характер кривой предполагает следующую схему превращений:

Ki К2 Ks

NA- +Н+ о NAH0 ; NAH" + Н+ о NAH2+; ЖАН" о (NAH°)24- (4), где NA-, NAH' и NAH2+ - соответственно отрицательно, нейтрально и положительно заряженные молекулы НК.

Значение Xs связано с начальной концентрацией НК и величиной pH через константы равновесия К|, К2 и Ks, рассчитанные при обработке экс-

периментальных данных (рис.5): Кз=(1013±57) л моль-Р-', К|=(460±23), Кг = =(3,0±0,9) (М-1). Используя их, был определен показатель р1, который находится в интервале значений рН 1,8-2,2. Последнее немаловажно, поскольку гарантирует полноту осаждения НК при концентрации минеральной кислоты в 10 раз меньшей, чем обычно применяемая.

Исследования кинетики отщепления пуриновых оснований РНК (см. разд.3.2.1) показали, что при концентрации соляной кислоты 0,01 Ми комнатной температуре заметного разрыва Ы-гликозидных связей за б ч не происходит. Это позволяет исключить из технологии получения РНК стадию глубокого охлажден™ экстрактов, что существенно сокращает энергозатраты.

Для осаждения из бесклеточных экстрактов полинуклеотидов, выделенных из микробных клеток растворами ДАФ, выявлены аналогичные закономерности: зависимость от концентраций НК, ортофосфата и рН среды раствора (рис.6-8).

Обнаружено, что вне зависимости от присутствия соли параметр Х5 растет симбатно начальной концентрации РНК, причем степень осаждения с увеличением концентрации ДАФ падает, хотя можно было бы ожидать повышения их осаждаемости за счет эффекта высаливания. Наблюдаемый факт объясним, если образование осадка происходит по схеме (3), дополненной уравнением: Ко

(КАП0)^ О- 01АН°)2ЬТ (5),

количественно описывающем процесс осаждения РНК в солевом растворе, где ортофосфат играет роль "мешающей" примеси.

Поскольку концентрация ортофосфата в среде известна были найдены значения констант в схемах превращений (3) и (5): Кь=(15,2±2,0), Ко= =(0,12±0,02), К1=(1100+185), К2=(2,6 ±1,0) (М-1 ) и Кз=(370±85) л-моль-Р1, которые определяют математическую модель, позволяющую управлять процессом осаждения полирибонуклеотидов из солевого раствора. Рассчитанный показатель р1 находится в области более высоких значений рН от 1,7 до 2,2 по сравнению с р1 для нуклеопротеидов. Чтобы достичь величины р1 в конце1ггрированном растворе ортофосфата, обладающего большой буферной емкостью, необходимо не менее 20% от объема концентрированной минеральной кислоты, но при значении показателя рН 2,2 расход нейтрализующего агента сокращается на 10%.

Недостатками технологии являются относительно низкая степень осаждения РНК в ИЭТ, необходимость утилизации солевых маточных растворов, высокий расход минеральной кислоты и консистенция осадков очищенных НК. В отличие от порошкообразных, лепсофильтруемых осадков нуклеопротеидов, полинуклеотиды выпадают в виде густой массы, прилипающей к мешалке и стенкам аппарата, что создает проблему выгрузки в многотоннажном производстве. Указанные недостатки обусловили необходимость разработки оригинальных технологических приемов концентрирования солевых растворов очищенных НК, их обессоливания и возврата отработанного раствора ортофосфата на стадию экстракции. Наиболее целесообразным оказалось введение в Технологический процесс стадии ультрафильтрации.

/ \

В 11 1

0.8

0,4"

2 ____

2 3 _ рН а

Рис.5 Зависимость степени осаждения нуклеопротеидов от рН среды, создаваемой соляной (•) и (пли) ортофосфорной (о) кислотами. Условия эксперимента: те же , что и на рис.4, начальная концентрация РНК 26 г-л-'.

О . £ 4о ,*£ го

См А,О г-Л"1

Рис.6. Зависимость степени осаждения полирибонуклеотидов в ИЭТ (рН 2,0) от их начального содержания в растворе в присутствии 1.3 моль-л-1 (1) и в отсутствие ортофос-фата (2).

Условия эксперимента: фактор раз-

■

0,5

У. О

0.6

0А

1,5

2,0

[оПЬо-Р], М Рис.7. Зависимость степени осаждения полирибонуклеотидов в ИЭТ (рН 2,0) от содержания в среде ор-тофосфата при концентрации РНК 12.3-15.6

Условия эксперимента: те же, что и нарис.б.

• ■ V

° й 2 3 рН

Рис. 8. Влияние рН среды на степень осаждения полирибонуклеотидов из водных растворов (1) и растворов ортофосфата с концентрацией 1.41.6 моль-л-1 (2).

Условия эксперимента: те же, что и на рис. 6, начальная концентрация РНК 26 г-лг'.

2.2.3. Концентрированно и очистка растворов нуклеиновых кислот ультрафильтрацией

При оценке эффективности б ар омем бранных процессов необходимо охарактеризовать тип мембраны применительно к объектам исследований. Для нас особый интерес представляла фильтрация солевых растворов по-линуклеотидов, отличающихся от растворов нуклеопротендов большей вязкостью и меньшей селективностью при ультрахонцентрировании.

Для концентрирования растворов РНК наилучшими показателями обладают плоские мембраны типа "МШфоге-Ю" и половолоконные мембраны типа ВПУ 15 ПА российского производства. Отметим, что разделительные аппараты на полых волокнах более предпочтительны, чем плоскорамные, для использования в промышленности.

Для мембран данного типа были изучены зависимости удельной производительности и дифференциальной селективности от концентрации полирибонуклеогидов в солевом растворе и нуклеопротеидов в воде. Их анализ показал, что зависимость производительности мембранного концентрирования от содержания НК в ретанте соответствует уравнению производительности дня мембраны с '"идеальной селективностью": 1п(Сг.ма/Сма), что позволило найти величину концентрации гелеобразова-ния (Сг.ка). а также коэффициенты массоотдачи (Рэ). Значения последних для РНК в солевом растворе и нуклеопротеидов в воде составит! соответственно Сг.иа=(210±24) гмг1, рй—(2,02 ± 0,2) л-м^атм-'-Ч"1 и Сг,ка=(83±1 4) г-Л'1, Рз—(11,5±0,2) л-м^атм-'-ч"1, что позволяет считать влияние гелеобразо-вания на скорость ультраконцешрирования несущественным и дает возможность перевеет большую часть низкомолекулярных продуктов в пер-меат с утилизацией последних в других стадиях технологического процесса.

Аналогичным образом были подобраны режимы обессоливания очищенных полинуклеотидов в растворе ортофосфата на мембранах вышеуказанных типов, работающих сначала для концентрирования НК, а затем - диафильтрациидо содержания соли в ретанте около 0,3 М. Это позволяет, при необходимости, выделять очищенные НК осаждением из водно-спиртовых растворов. При обессоливании доля полирибонуклеотидов, отходящих с пермеатом, составляет те же 30%, что и в надосадке после их осаждения в ИЭТ из раствора ортофосфата. Кроме того, было обнаружено, что использование мембранной технологии улучшает качество препарата бактериальной РНК за счет снижения примеси ДНК с 4-х до требуемых по ФС 1,5% в результате ее обратимой сорбции на полых волокнах.

2.2.4. Разложение нуклеопротеидов в среде ортофосфата

Выделение свободных от белковых примесей полинуклеотидов при обработке микробных суспензий раствором ДАФ поставило задачу более глубоко изучить процесс разложения нуклеопротеидов как изолированных, так и внутриклеточных. В разработанной нами математической модели этого процесса значения основных параметров не зависят от природы микробных нуклеопротеидов.

Рис.9 иллюстрирует влияние концентрации ДАФ на изменение относительных концентраций (X) ВМФ и НМФ КНК и белков в экстракте на примере парафинокисляющих дрожжей. Влиятельную компоненту ДАФ в

-—в—в—»- ^А.Н

\ к"*

Р„по м [оПИо-Р], М

гис.у. Изменение относительных концентраций фракций ЙНК и белков в экстракте при обработке клеток дрожжей в среде с различным содержанием ДАФ. Условия эксперимента: темпера-туРа-^С.рШ.б, время 1 ч, МСК -10% мае.

4,0

0 1 2

[опЬо-!7], М 1ИС.10. Изменение относительных концентрации полирибонуклеотидов и белков в супернатанте при разложении нуклео протеидов дрожжей в зависимости от их содержания в среде ортофосфата. Условия эксперимента: температура - 70°С, рН 6-7, время 1 ч, начальная концентрация РНК (пг1): 1-(12), 2-(26).

Рис. 11. Определение численных значений параметров Км и п на основе экспериментальных данных, приведенных на рис. 10, и уравнения (7).

относительном содержании каждой фракции оценивали при расчете соотношений концентраций НК в солевом и водном экстрактах, взятых из параллельных опытов, выполненных при одинаковых условиях. Анализ выявил, что снижение удельной доли ВМФ НК (Xna.h) и НМФ белков (Xna.l) подчиняется одному и тому же закону. Принципиально по иному влияет изменение концентрации ортофосфата на извлечение ВМФ белков (Хр,н) и не сказывается на реализации НМФ НК (Xna,l). Разложение комплексов НК с белками (в опытах с изолированными нуклеопротеидами) также зависит от их начального содержании в среде. Анализ экспериментальных данных (рис.10) выявил 1-ый концентрационный порядок зависимости выхода ВМФ НК и НМФ белков от ортофосфатов в среде и порядок, отличный от 1, для ВМФ белков. Характер кривых Хр,н объясним изменяющимся составом нуклеопротеидов в растворе за счет взаимодействия ортофосфатов с белками, наличием термодинамического равновесия между распадающимися под действием соли комплексами НК с белками и образующимися свободными полинуклеотидами. Такие взаимодействия можно представить в виде схемы превращений:

Ki К2 К з

NAP + ortho-F о [I] + ortho-F О [И] + ortho-F о [III] +... и т.д., или: KN

NAP + n(ortho-F) NA + P(ortho-F)n (6),

где: NAP, ortho-F, [I], [II], .....[N-l], NA,P(ortho-F)n - соответственно концентрации нуклеопротеидов, ортофосфата, шггермедиатов, полинуклеотидов и комплексов белков с ортофосфатом.

Согласно схеме (6) происходит обмен полинуклеотидов на ортофос-фат в нуклеопротеидах, при этом эффект очистки НК от белков основывается на малой растворимости, по сравнению с полинуклеотидами, комплексов белков с ортофосфатом в солевом растворе. Данный вывод подтвержден экспериментально.

Для создания математической модели выделения полинуклеотидов с контролируемым содержанием белковых примесей в уравнении (6) были определены значения константы равновесия Kn=KiTv2'... Ка и стехиомет-рического коэффициента п. Отметим, что значения равновесных концентраций белков могут отличаться от экспериментальных, о чем свидетельствует "падающий" характер кривых Xna,h (рис. 10). Концентрационная зависимость 1-го порядка, обусловленная высаливанием полинуклеотидов, должна учитываться в отношении ВМФ белков. Для них постоянная высаливания (хр.н) найденная, исходя из значения производной функции Хр.н (рис.10) в точке нулевой концентрации ортофосфата и ионной силы раствора соли (цО, составила (0,018±0,002) М-1 и практичеки совпадает с установленной ранее в опытах по экстракции НК из микробных клеток раствором ДАФ. Используя уравнение связи равновесной концентрации белков (Ср.н) с концентрацией белков в эксперименте (Ср,н): Ср,н=Ср,н» lOIp'H,li , легко рассчитать значения 7„р,н.

Для схемы превращений (6) справедливо уравнение:

(1 - Хр.н)2/ Хр,н = Rn [ortho-F]«/ Ср,о (7),

где [ortho-F] - концентрация свободного ортофосфата в растворе, которая должна быть меньше исходной. Тле. его содержание в супернатантах отли-

чается от начального не более, чем на 3%, можно не учитывать расход соли на образование комплексов белков с ортофосфатом и найти значения параметров Kn и п в уравнении (7): Км=( 1,1810,05) г-белка-л2 (М ортофосфа-та )-3 и п =(3,01±0,02) (рис.11). Для этих значений Kn , п н %Р,н, были рассчитаны минимальные концентрации ортофосфата в средах, обеспечивающие извлечение из клеток свободных полинуклеотидов: в суспензиях с 10-15% МСК концентрация соли должна быть 1,50-1,75 М; в растворе нуклеопро-т-еидов с концентрацией НК 15 r-Jr1 - 1,8-2,2 М, что согласуется с экспериментом.

Расчет технико-экономическнх показателей производства очищенных полнрибонукпеотндов и микробного белка для предприяпи мощностью 60 тыс. т кормовых дрожжей в год с учетом всех природоохранных затрат показал, что себестоимость препарата РНК, получаемого по разработанной технологии, снижается по сравнению с малотоннажным производством в 3 раза. Однако этого недостаточно для рентабельности производства в целом и РНК как сырья для получения препаратов пищевого и медицинского назначения. Выходом из этой ситуации является более глубокая переработка выделенных полинуклеотидов и микробного белка в высокорентабельные продукты, такие как 5'-мононуклеотиды, нуклеозиды и азотистые основания НК. Поскольку производство 5'-мононуклеотидов из РНК требует дефицитной фосфодиэстеразы змеиного яда, более перспективным, по нашему мнению, является гидролиз РНК до нуклеозидов, основанный на применении доступных и дешевых химических агентов и технических ферментов. В разрабатываемой нами технологии получения кри-сталшгческих препаратов нуклеозидов были апробированы гидроксиды свинца и кальция, ацетат аммония и комплекс ферментов, продуцируемый Streptomyces (Actinomyces) coelicolor.

3. Химический и энзиматический гидролиз РНК

3.1. Технология получения нуклеозидов

3.1.1. Гидролиз РНК до нуклеозидов

3.1.1.1. Гидролиз РНК гидроксидами свинца и кальция

При гидролизе РНК до нуклеозидов под действием гидроксидов свинца и кальция значимыми являются: температура (95-140 °С), мольное соотношение реагентов - гидроксида к РНК (п= 1,0-2,1) и начальная концентрация РНК (30-100 г-л"1). Оптимизация процесса позволила получать нуклеозиды с технологически приемлемыми выходами, которые практически не зависили от концентрации РНК при сохранении мольного соотношения реагентов, определяющего рН среды гидролиза, что обуславливает выход целевых продуктов 80-95 и 53-81% соответственно. Для гидроксида свинца увеличение параметра "п" от оптимального 1,6-1,7 до 2,0 изменяет значение рН среды с 8,8 до 9,4, что практически не отражается на выходе Ado и Cyd, но ведет к снижению выхода Urd на 18%. При использовании гидроксида кальция увеличение параметра "п" от оптима-льного 1,2 до 2,0 изменяет значение рН от 9,5 до И, что существенно влияет на выход

нуклеозидов и качество гидролшатов (рис.12,13). При увеличении параметра "п" нуклеозиды начинают разрушаться и Су(1 практически полностью исчезает. Образующиеся в ходе гидролиза А(1е и пигменты свидетельствуют о разрыве в нуклеозидах Ы-гликозидных связей с превращением освободившейся О-рибозы в окрашенные продукты.

Было отмечено, что при использовании гидрокснда кальция гидро-лизаты РНК по всем показателям уступают, полученным гидроксидом свинца. Однако использовать последний в многотоннажном производстве нежелательно ввиду его высокой токсичности и образования больших количеств неутилизируемых отходов. Применение гидроксида кальция, который не имеет вышеуказанных недостатков, имеет поэтому лучшую перспективу.

3.1.1.2. Гидролиз РНК под действием ацетата аммония

Ацетат и формиат аммония, наряду с формамидом, наиболее часто упоминаются в патентах Японии как реагенты для получения нуклеозидов из более дешевых, по сравнению с РНК, нуклеопротеидов, что является их несомненным преимуществом. Для сравнительного анализа различных технологий получения гидролизатов был воспроизведен способ, изложенный в одном из патентов, где в качестве сырья мы использовали очищенную РНК. Наблюдаемый аномально высокий выход Иге! (125%) и низкий Сус! (45%) был связан с дезаминированием последнего. Готовый гидроли-зат содержал взвешенные частицы и сильноокрашенные продукты, что создает серьезные проблемы при его переработке, от которой в дальнейшем мы отказались.

3.1.1.3.Гидролиз РНК под действием ферментного препарата Б^ер^тусев соеНсо1ог

В работе был использован комплекс ферментов, содержащий экзо-нуклеазы и щелочную фосфатазу, продуцируемые 3.соеИсо1ог шт.А-165-25, опытно- промышленное производство которого освоено в России. Оптимальными условиями для ферментативного гидролиза РНК являются: температура 37-40°С, рН 8,7-9,1, концентрации РНК - 20 г л1 и растворимой соли магния - 0,01 М; при массовом соотношении ФП к субстрату - 0,5.

Изучение кинетики образования нуклеозидов показало, что их выход, достигнув 34-52% через 2 ч гидролиза, в дальнейшем не меняется, что, видимо, обусловлено ингибированием процесса. Получить технологически приемлемый выход нуклеозидов (70-90%) оказалось возможным при 3-х кратном внесении ФП через каждые 1,5 ч гидролиза (рис.14). Однако использование технического ФП приводит к загрязнению гидролизата солями, белковыми веществами и трудноотделяемыми взвешенными частицами, что осложняет его переработку.

3.1.2. Переработка гидролизатов РНК в нуклеозиды

Гидролизаты РНК, содержащие нуклеозиды целесообразно перере-батывать по схеме двухстадийного ионного обмена с применением сильнокислотных катионитов и сильноосновных анионитов при соотношении их объемов 10:1. Такая схема позволяет очищать любые гидролизаты РНК независимо от вида гидролизующего агента. Такой способ позволяет выде-

время, ч время, ч

Рис.12. Зависимость выходов нуклеозидов от времени гидролиза РНК гид-роксидами свинца (а) и кальция (б). Условия гидролиза: температура 115-

леозидов и Ade от мольного соот- нуклеозидов во времени при дроб-ношення реагентов (п) при гидроли- ном внесении ФП в среду гидролизе РНК гидроксидом кальция. зующейся РНК. Условия гидролгаа: 120°С, время Условия гидролиза: температура - -гидролиза - 5 ч. 37°С, pH 9,0. ■

Условные обозначения: г -момент времени внесения ФП в гидролизат

пять все нуклеотиды, входящие в состав РНК, с технологически приемлемыми выходами.

Т.к. наиболее свободным от мешающих примесей является гидроли-зат РНК, где в качестве реагента был использован гидроксид свинца, технологическую схему выделения и получения препаратов нуклеозидов разрабатывали для этого случая. Для гидролизатов более сложного состава были введены дополнительные стадии химической очистки.

3.1.2.1. Получение препаратов нуклеозидов из РНК, гидролизованной гнд-роксидом свинца

Схема получения препаратов нуклеозидов из РНК, гидролиз о ванной гидроксидом свинца, предусматривает проведение следующих операций.

После отделения горячим фильтрованием из гидролизата РНК осадка соли свинца из фильтрата выделяли основное количество Guo при охлаждении фильтрата до 4°С и выдерживании в течение 12 ч (в осадок переходит 85-90% Guo). Кристаллы технического Guo растворяли в горячей воде, раствор осветляли активированным углем, который затем удаляли горячим фильтрованием. Guo перекристаллизовывали и получали препарат с выходом 75% и содержанием основного вещества не менее 98%, который направляли на переработку в Gua и D-рибозу.

Маточник после первой кристаллизации направляли на колонну с катионитом КУ-2-8 (в Н-форме) для ионообменного разделения остальных нуклеозидов. На колонне сорбируются Ado, Guo и Cyd. Незаряженный Urd, выходящий в виде раствора из свободного объема колонны, подвергали предварительной очистке от мешающих кристаллизации примесей методом ионного обмена на колоше с анионитом АВ-17-2П. Urd десорбиро-вали 3%-ным раствором уксусной кислоты. Из элюата, сконцентрированного вакуум-выпариванием до концентрации ~1 ООО г-л-1 и разбавленного 9-ью объемами этанола, кристаллизовали Urd при 4°С за 12 ч. После перекристаллизации и сушки получали препарат с выходом 72% и содержанием основного вещества не менее 97% .

Десорбцию Ado, Guo и Cyd с катеонита осуществляли 2%-ным раствором водного аммиака. Сорбент регенерировали 4%-ным раствором соляной кислоты. Аммиачный элюат направляли на колонну с анионитом АВ-17-10П (в ОН-форме), на которой сорбируются остаточный Guo и Ade (если образуется), а Ado и Cyd в виде раствора выходят из свободного объема колонны. Анионит регенерировали последовательной обработкой растворами сульфата аммония (3,5%), соляной кислоты (0,4%) и водного аммиака (2%).

Раствор Ado и Cyd концентрировали вакуум-выпариванием до концентрации Ado ~ 100 г-л-1 и кристаллизовали при 4°С за 12 ч. Полученный осадок отделяли фильтрованием, перекристаллизовывали и получали препарат с выходом 76% и содержанием основного вещества не менее 98%, который направляли на получение 5'-AMP. Фильтрат-маточник, содержащий около 60 г л"1 Cyd и 10-12 г-л-1 Ado, перерабатывали двумя способами:

1.Фильтрат упаривали под вакуумом до концентрации Cyd 300 r ir1, разбавляли 4-мя объемами этанола и кристаллизовали Cyd при 4°С за 16 ч. После перекристаллизации и сушки получали препарат с выходом 71% и содержанием основного вещества не менее 97%.

2. Маточник подкисляли до pH 3,3 серной кислотой и осаждали Cyd добавлением 4-5-ти объемов этанола. Выпавший осадок Cyd. 1/2 H2SO4 отделяли фильтрованием и перекристаллизовывали в препарат Cyd того же качества, что и по способу 1, с применением анионита АВ-17-2П для очистки от сульфата. Этот способ менее зависим от наличия в среде мешающих примесей. Выход препарата вышеуказанного качества не менее 60%.

3.1.2.2. Особенности получения препаратов нуклеозидов из РНК, гидро-лшоваиной шдроксидом кальция

Разделение нуклеозидов РНК, гидролизованной гадроксидом кальция, и очистку Urd-содержащего раствора ионным обменом проводят при увеличении объемов сорбентов: катионита на 20%, анионита на 30%. На-тивный Cyd, из-за наличия мешающих примесей из водно-спиртового раствора не кристаллизуется. Выделение Cyd возможно только в виде соли (Cyd. 1/2 H2SO4) с последующим ее разложением и очисткой от сульфата. Выход нуклеозидов, содержащих не менее 97% основного вещества, составляет 45-70%.

3.1.2.3. Особенности получения препаратов нуклеозидов из РНК, гидролизованной техническим препаратом экзонуклеаз и фосфатаз

Получение препаратов нуклеозидов из ферментолизатов РНК включает дополнительные стадии их очистки от белковых веществ ультрафильтрацией и концентрирование полученного пермеата вакуум-выпариванием не менее, чем в 5 раз. Разделение нуклеозидов проводят при увеличении объема катионита в 5 раз, а анионита - в 2 раза. Увеличение содержания белковой примеси в гидролнзуемой РНК с 4 до 10% требует вдвое большего количества катионита, осложняет проведение его очистки от пигментов, снижает выход и качество препарата Urd. До ионообменной очистки Urd из Urd-содержащего раствора удаляют фосфаты обработкой гадроксидом кальция. Выход нуклеозидов, содержащих не менее 97% основного вещества, составляет 53-67%.

3.2. Технология получения пуриновых оснований нуклеиновых кислот

Пуриновые основания НК, наряду с нуклеозидами, широко используются в производстве лекарственных средств. Из РНК наиболее просто получать Ade и Gua, используя в качестве сырья нуклеопротеиды, более дешевые, чем очищенные полинуклеотиды.

Известно, что пуриновые основания в отличие от пиримидиновых легко отщепляются от НК в кислой среде под действием минеральных кислот. Это их свойство было использовано для разработки технологии получения кристаллических препаратов Ade и Gua.

3.2.1. Гидролиз РНК до пуриновых оснований

Гидролиз РНК до пуриновых оснований проводили в широком интервале изменяющихся концентраций полирибонуклеотидов и гидроли-зующих агентов. В качестве последних использовали растворы соляной - и серной кислот.

Основными параметрами, влияющими на процесс гидролиза РНК были ее содержание в среде (25-100 г л1), температура (60-90°С) и концентрация гидролизующего агента (0,01-1,5 М).

На рис.15 приведены типичные кривые кинетики образования пуринов из нуклеопротеидов и очищенной РНК при различных начальных концентрациях НК. Кинетика накопления свободных оснований не зависит от примесей белков в НК. Кривые Ade и Gua совпадают п интервале, соответствующем концентрациям РНК 25-75 гл-'. и имеют линейную зависимость в координатах Ln(l-x)-1, время, что свидетельствует о реакции 1-го порядка и позволяет найти величину эффективной константы скорости (к3фф) для каждой кинетической кривой.

При изучении влияния концентраций минеральной кислоты на скорость образования каждого из пуринов было установлено,что кинетика процесса подчиняется закономерностям сцецифического кислотно-основного катализа и позволяет представить реакции отщепления пуринов от НК в виде следующей схемы превращений:

КьА к2

А + НзО+ <-> {АН+} ->В + НзО+ (8),

где А, АН4' и В - соответственно РНК, ее протонированный интермедиат и свободное пуриновое основание.

В результате обработки экспериментальных данных для Ade удалось раздельно получить численные значения констант k2=(2,9±0,2)-10"3 с1 (80°С) и Къ'^ (0,115±0,010) М-', а для Gua - только их произведение (к2-КьА)=(4,70±0,15)-10-4 М-' с-' (80»С).

Исследование влияния температуры на величину кэфф в координатах Аррениуса выявило линейную зависимость, что позволило найти значения энергий активаций, которые для Ade и Gua имеют близкие значения и со-савляют соответственно (102±2) и (105±3) кДж- М*1.

Установленные закономерности справедливы для концентраций пщ-ролизующих агентов до 0,5 М и РНК не выше 75 г-лг1. В случаях с более высокими концентрациями реагентов кЭфф не остается постоянной, а падает с увеличением начального содержания РНК в среде. Это не противоречит теории кислотно-основного катализа, поскольку при сопоставлении концентраций НК и ионов пщроксония кислотность среды оказывается меньше кислотности минеральной кислоты на величину суммы концентраций протонированных форм всех оснований. Используя известные значения констант протонирования оснований РНК, были рассчитаны значения истинной кислотности среды и выходы пуринов на основе схемы превращений (8) и вышеустановленных значений констант.

Выявленные закономерности кислотного гидролиза РНК, подтвержденные экспериментом, позволили найти, с одной стороны, оптимальные условия апуринизации РНК (90°С, 1 М раствор серной кислоты, 1ч), обеспечивающие отщепление пуринов на 98%, а с другой, - незначительный уровень ее апуринизации до 1% (20°С, pH 2,0, создаваемый 0,01 М раствором соляной кислоты, 6 ч), что позволило сократить энергозатраты на стадии осаждения нуклеопротеидов в ИЭТ (см. разд. 2.2.2).

3.2.2. Переработка гидролизатов ануриннзирооанных полирибонуклеоти-дов, получение кристаллических препаратов аденшю и гуанина

Переработка сернокнслотных гидролгоатов апурннизнрованных по-лирибонуклеотндов, основанная на различной растворимости Ade и Gua В зависимости от температуры и pH среды, включает следующие операции.

Гидролизат, содержащий около 200 г-.т1 апуринизированной РНК, Ade, Gua и сульфаты, нейтрализовали гидроксидом натрия до pH 3,2-3,5, охлаждали до 4°С и выдерживали 1 б ч, в результате чего большая часть пуринов выпадает в осадок, который отделяли фильтрованием. Осадок пуринов на фильтре промывали горячей водой (70°С, pH 6-7), 90% Ade (1% Gua) переходило в раствор, нерастворившийся Gua отделяли фильтрованием. Из фильтрата при 4°С за 10 ч кристаллизовали с выходом 91% Ade, который отделяли фильтрованием и высушивали. Образующийся маточник использовали в последующем технологическом цикле на стадии растворения осадка пуринов.

Осадок технического Gua растворяли в щелочном растворе (pH 12,5) и обрабатывали гидроксидом кальция, осаждающим пигменты. Образующийся осадок отделяли фильтрованием. Осветленный раствор Gua нагревали до 70°С , нейтрализовали до pH 6-7 соляной кислотой, образовавшийся осадок Gua отделяли горячим фильтрованием и высушивали.

Такая переработка позволяет получать препараты Ade и Gua, содержащие не менее 97% основного вещества и до 1% примесного аналога, с выходом 75 и 85% соотвественно.

При переработке гпдролшатов нуклеопротендов технико-экономические показатели процесса снижаются: выход пуринов падает на 15-20%; содержание примесных аналогов в препаратах возрастает в 2 раза; изменяется их окраска от белого цвета к желтому. Последующая очистка от пигментов с применением традиционных приемов не дает желаемых результатов. Как появление окраски в препаратах пуринов, так и их низкий выход связаны с наличием белковой примеси. Качество препаратов Ade и Gua может быть повышено, если использовать РНК, содержащую не более 10% белка, что предполагает проведение частичной очистки экстрагированных нуклеопротендов от белков.

3.3. Технологии трансформации рибонуклеозидов пуринового ряда

Среди существующих технологий переработки рибонуклеозидов в субстанции, пригодные для синтеза лекарственных средств, были выбраны те, которые могут быть реализованы на предприятиях крупнотоннажного производства кормового белка. К числу наиболее перспективных для трансформации рибонуклеозидов отнесется Ado и Guo. Первый можно рассматривать как полупродукт для получения Ino и аденозинфосфатов (5'-АТР и 5'-AMP), второй - Gua и D-рибозы,

3.3.1. Трансформация гуанозина в гуаиии и D-рибозу, получяше кристаллических препаратов

Трансформация Guo в Gua и D-рибоэу путем разрыва N-гликозидной связи в нуклеозиде при его кислотном гидролизе является наиболее простым способом его переработки. Аналогичный подход был

применен для получения из НК препаратов Ade и Gua, однако в отношении перерабатываемого Guo следует учитывать химическую неустойчивость D-рибозы в кислой среде, что ведет к снижению ее выхода и обуславливает необходимость оптимизации условий гидролиза, которые могут отличаться от условий апуринизации РНК.

Изучение кинетики образования Gua и фурфурола (продукта распада D-рибозы) из Guo показало, что разрыв N-гликозидной связи под действием серной кислоты подчиняется тем же закономерностям, что и процесс апуринизации РНК. Значения полученных при этом констант и энергий активации составили для Gua - ктКъА=(2,18±0,06)-104 М-'-сН (60°С) и Е3= ~(95±2) кДж-М-1, для фурфурола kj=(26,7+0,7)-10«-c-i (90°С), Кьа=(0,010± ±0,002) М'1 и Еа=(9б±3) кДж-М"1, что позволило найти оптимальные параметры проведения процесса (85°С, 0,5 М-ный раствор серной кислоты, 1 ч).

Разработанная схема переработки гидролизата Guo в очищенные препараты Gua и D-рибозы включает следующие операции.

Из гидролизата, содержащего Guo в концентрации не менее 30 г-Л"1, при температуре 4°С за 8 ч кристаллизовали сульфат Gua (91%), который отделяли фильтрованием. Осадок сульфата Gua растворяли в горячем (70°С) щелочном растворе (pH 12,5) до концентрации пурина 15-20 г-л-1, охлаждали, нейтрализовали соляной кислотой до pH 6-7 и нагревали до температуры 70°С. Образующийся в течение первых 20 минут осадок Gua отделяли фильтрованием, промывали и высушивали. Выход препарата Gua - 85%, содержание основного вещества не менее 98%. Осадок гипса отделяли фильтрованием, полученный фильтрат обессоливали на ионигах КУ-2-8 и AB-17-iOn.

Содержащий D-рибозу фильтрат концентрировали вакуум-выпариванием до концентрации 900-1000 г-Л"!, охлаждали и смешивали с одним объемом метанола и 2-мя объемами изопропанола. Из раствора, охлажденного до -10°С, за 72 ч кристаллизовали D-рибозу.

Кристаллы технического продукта отделяли фильтрованием, перекристаллизовывали из спирта и высушивали. Выход препарата D-рибозы -70%, содержание основного вещества не менее 96%.

3.3.2. Трансформация аденозина в инозин

Ino или его лекарственную форму - рибоксин получают прямым микробиологическим синтезом, однако в зависимости от рентабельности технологии и рыночной коньюктуры может оказаться конкурентнспособным производство рибоксина из Ado.

В промышленных условиях Ado может быть переработан в Ino путем его дезаминирования под действием азотистой кислоты. Процесс протекает при температуре 50°С за 7 ч в среде , содержащей уксусную кислоту, нитрит натрия и Ado в мольных концентрациях 1,5; 1,0 и 0,25 соответственно. В этих условиях, как показали наши исследования, Ado на 1(30% превращается в Ino и кристаллизуется из полученного гидролизата на 65% за 12 ч при температуре 4°С. Дополнительное его количество можно получить из маточника после сорбции на катионите КУ-2-8 (в Н-форме), вакуум-выпаривания элюата и кристаллизации. Очищенный перекристаллизацией продукт содержит не менее 98% основного вещества. После высушивания общий выход препарата составляет 80%.

3.3.3. Трансформация аденозина в 5 -аденозннфосфаты ферментными системами клеток пивпьгх дрожжей

Анализ литературных данных показал, что Ado с выходом не ниже 85% может быть превращен в АТР в среде, содержащий неорганический фосфат, сахарозу, соли калия и магния, под действием ферментных систем предварительно подготовленных клеток пивных дрожжей. На выход АТР влияет количество всех компонентов реакционной смеси, а также "живого" фермента - клеток дрожжей, температура и pH среды. Известны оптимальные условия фосфорщшрования: температура - 37°С, pH 7,0, содержание в среде неорганического фосфата - 0,22 М, Ado -10 г л*1, клеток дрожжей -110 г МСК л:1, сахарозы - 20 г лг\ солей калия и магния по 0,8 г-jt1. Отмечена важная роль стадий предварительной подготовки клеток, обеспечивающей необходимую активность ферментных систем дрожжей. Доказано, что "сверхсинтез" АТР реализуется только клетками, предварительно обработанными толуолом или ацетоном.

Вышеуказанные приемы и рекомендации были воспроизведены нами при выполнении соответствующих экспериментов с положительными результатами в части, касающейся получения АТР .

Относительно способов получения AMP - продукта, не менее важного, чем АТР, известно мало. Отмечено, что он может образовываться на средах с низким содержанием источника углерода. Поэтому, вначале была поставлена задача получения АТР, а затем - разработки технологии получения других аденозинфосфатов.

3.3.3.1. Закономерности образования АТР при фосфорнлировашш аденозина ферментными системами клеток пивных дрожжей

В известном процессе получения АТР из Ado в присутствии клеток дрожжей были выявлены неизвестные ранее закономерности, которые оказывают существенное влияние на выход аденозинфосфатов.

Уровень накопления АТР практически не зависит от содержания в среде солей магния и калия; однако, их присутствие стабилизирует активности фосфатаз, гидролизующих АТР в ADP и AMP, что отражается на временном интервале максимума образования АТР (рис.1б).

На активность дрожжевых фосфатаз влияет способ предварительной обработки клеток. Их инкубация с ацетоном снижает активность фосфатаз, что обеспечивает стабилизацию АТР и сохраняет длительное время его высокую концентрацию в среде.

В свою очередь, более высокая активность фосфатаз наблюдается при обработке дрожжей толуолом (рис.16). Интенсификация фосфорилирова-ния Ado такими клетками, скорее всего, происходит за счет увеличения концентрации Сахаров, образующихся в результате частичного автолиза дрожжей (рис.17). Наряду с низкими концентрациями солей магния и калия, высокое содержание в среде источника углерода (20 г-лг' и более) стабилизирует выход АТР (рис.18). При пониженной концентрации сахара (510 г-л-'), выход АТР несколько ниже, но заметно активизируются фосфа-тазы, которые последовательно дефосфорилируют АТР вплоть до Ado (рис.18). Аналогичным образом на выход АТР влияет изменение содержания в среде неорганического фосфата.

4.0

0,5

Glta Г .Sfs^

/ '/ f/^AJe

Л .о/ /

iß

Cß

—1»

/ г

' 0,5" 1,0 1,5

время, ч

Рис.15. Кинетика образования пу-рнновых оснований при кислотном гидролизе РНК или нуклеопротеи-дов.

Условия гидролиза: температура 80°С, гидролизующий агент - серная кислота - 1.0 М.

Условные обозначения: начальных концентраций ПК (вг-Л"1): х- 25, • - 50, Д-75, □ - 220.

3 г ц 6

время, ч

Рис. 16. Зависимость выхода АТР от времени фосфорилирования Ado ферментами пивных дрожжей, обработанных толуолом (1) и ацетоном (2).

Условия: температура - 37°С, pH 7,0; содержание в среде Ado-10, сахаро-зы-20, хлоридов калия и магния - по 0,8 (г-л1) неорганического фосфата -0,2М, МСК-10% (1), 15% (2).

О 10 20 3 0 40

сахароза, г-л"' Рис.!7. Зависимость максимума выхода АТР от начального содержания сахарозы в среде фосфорилиро-вания Ado ферментами пивных дрожжей, обработанных толуолом (о) и ацетоном (•) Условия: те же, что и на рис.16.

AMP

время, ч

Рис,18. Кривые расходования Ado и образования продуктов его фосфорцлирования ферментами пивных дрожжей, обработанных толуолом. Условия: те же,что и на рис. 16 при содержании сахарозы 5 г-л-'.

Помимо вышеуказанных закономерностей, процесс характеризуется тем, что независимо от условий фосфоршшропання основным продуктом трансформации Ado является АТР. AMP и ADP присутствуют в ферменто-лизате в более низких концентрациях. Полученные факты объяснимы при учете предложенных нами представлений о механизме образования АТР. В литературе этот процесс представляют как рад ферментативных реакций спиртового брожения и взаимодействия различных субстратов с Ado, которые участвуют в "сверхсинтезе" АТР. Однако, как показали результаты нашего анализа, этих реакций недостаточно. Поэтому, исходя из существующей теории спиртового брожения, мы предположили, что ответственным за "сверхсинтез" АТР являются присутствующие в сахаромицетах активные фосфоенолпируваткиназы, фосфорилирующие не только ADP, но AMP и Ado. Анализ значений AG01 ддя реакций, протекающих с участием фосфо-енолпирувата, показывает, что термодинамически наиболе выгодно превращение Ado в АТР (AG01=-110,6 кДж-М-'). Для промежуточных продуктов фосфорилироваши значения AG01 по абсолютной величине в 2,3-3,5 раза ниже. Поэтому возможность их получения следует искать на пути активации фосфатаз, гидролизующих образующийся АТР.

3.3.3.2. Фосфорнлиропаиие адеиозина а AMP и ADP ферментными системами клеток пивных дрожжей

Одним из селективных условий "сверхсшггеза" AMP может быть пониженное (по сравнению с режимом синтеза АТР) содержание сахарозы в среде при сохранении оптимальных концентраций фосфатов, солей калия и магния, обеспечивающих повышенный выход АТР и необходимую активность фосфатаз дрожжей, изначально обусловленную обработкой клеток толуолом. Тогда повышенные выходы AMP и ADP можно ожидать при более продолжительном времени фосфорилироваши Ado.

В результате опытов, проведенных с различным содержанием в среде сахарозы, была установлена ее оптимальная концентрация 5 г-л1, при которой Ado на 80 - 85% превращается в АТР, который затем гидролизуется преимущественно в AMP (рис.18). Для варианта продолжительного фосфо-рилирования Ado отмечен максимум на кривой образования ADP. Характер кривых накопления AMP и ADP предполагает, что гидролиз АТР протекает по схеме его последовательных превращений сначала в ADP, а затем в AMP. С точки зрения термодинамики представляется более выгодным превращение АТР в AMP, причем высокая активность фосфатаз в среде с пониженным содержанием сахарозы может приводить к образованию Ado (рис.18).

Условия фосфорилирования Ado в AMP, приведенные на рис.18, являются оптимальными. Выход AMP зависит также от количества, внесенного в среду субстрата и при его концентрации 15-5 г-л-' через 8 ч составляет 70-78%.

Помимо этого, на эффективность процесса влияют температура и pH среды. Выявленные зависимости те же, что и для синтеза АТР, но при более низких выходах целевого продукта.

Некоторым своеобразием отличается процесс продолжительного фосфорилирования Ado при повышенном содержании клеток дрожжей. В этом случае кривые образования АТР и AMP имеют максимум и процесс фосфо-

ршшрования сдвигается в сторону накопления ADP. Его концентрация приближается к стационарным значениям и выход ADP достигает 85%. Наблюдаемые закономерности можно объяснить протеканием реакций, в которых участвуют АТР-аза, фосфоенолпируваткиназа и АМР-киназа.

Участие в фосфорилировашш AMP и ADP ферментов дрожжей было показано нами в опытах, где эти нуклеотиды являлись субстратами в среде, обеспечивающей "сверхсингез" АТР. При этом AMP с выходом 98% превращается в ATP, a ADP играет роль промежуточного продукта. В случае субстрата ADP он с таким же выходом превращается в АТР, но накоплению последнего предшествует образованием AMP. Его появление, скорее всего, обусловлено реакцией днспропорционирования ADP, протекающей при участии миокиназы. Наряду с АМР-киназой, ее присутствие в клетках дрожжей считается доказанным.

Т. о. результаты наших исследований показывают, что приемлемых для технологии выходов аденозинфосфатов можно достичь в определенных для каждого из них условиях фосфорилирования Ado. При этом следует учитывать следующую последовательность в цепи превращений Ado в аде-нозинфосфаты: Ado->ATP—»AMP—»ADP, в которой, наряду с целевым продуктом, образуются близкие по своим свойствам аналоги. Это осложняет процесс выделения и очистки препаратов индивидуальных аденозинфосфатов и требует разработки определенных приемов.

3.3.3.3. Разделение аденозинфосфатов ионным обменом

Среди способов выделения мононуклеотвдов, как правило, используют ионный обмен с применением сильно основных аниошггов.

Предварительная подготовка к очистке полученных при фосфорилирования Ado ферментолизатов включала удаление из суспензий клеток дрожжей и взвешанных частиц центрифугированием с трехкратным промыванием осадков горячей (60-70°С) водой с гидромодулем 1.

В литературе (Брод И.И.,1982) описан способ очистки АТР-содер-жащего ферментолизата с применением сильноосновного анионита марки АРА-5П, хорошо воспроизводимый, но основанный на использовании дефицитного сорбента. Более перспективны, по нашему мнению, промышленные аниониты. Среди них наиболее близким по своим свойствам к сорбенту АРА-5П оказался ашюнит AB-17-2, который в отличие от АРА-5П в большой степени склонен необратимо сорбировать пигменты, что ведет к увеличению нормы его расхода.

Альтернативным сорбция является известный способ очистки растворов от окрашенных продуктов ультрафильтрацией. Для удаления пигментов из бесклеточных ферментолизатов были использованы половолокон-ные мембраны марки ВПУ-15-ПА. В режиме глубокого ультраконценгри-рования с последующей диафильтрациен степень очистки от высокомолекулярных пигментов составила 73-87%. Потерь фосфатов Ado при этом не происходило, а оставшиеся в пермеате пигменты затем обратимо сорбировались на анионите АВ-17-2.

Поскольку каждый из фосфатов Ado можно рассматривать как конечный продукт производства, были разработаны приемы их ионообменного разделения, обеспечивающие отсутствие в элюатах примесных аналогов. Для этого, используя литературные данные и результаты собственных

исследований экспериментальным путем были определены составы элюен-тов, способных последовательно в динамическом режиме десорбировать с анионита аденозинфосфаты: 0,008 н NaCl в 0,01 и HCl - дня десорбции AMP, 0,05 н NaCl в 0,01 н HCl - для десорбции ADP и оставлен без изменения состав элюента №2 (Брод И.И., 1982) для десорбции АТР.

Анализ элюатов показал, что в каждом из них присутствует только один из фосфатов Ado, причем наиболее разбавленными были AMP - и ADP - содержащие растворы. В ходе ионообменного разделения не наблюдалось заметных потерь целевых продуктов.

3.3.3.4. Получение кристаллических препаратов ATP, ADP и AMP

Из всех способов выделения фосфатов Ado из водных растворов и последующей очистки препаратов до уровня, предъявляемого к фармакологическим субстанциям, наиболее предпочтительным является осаждение их из водно-спиртовых растворов. В литературе описан способ переработки элюата, содержащего АТР, основанный на различной растворимости нуклеотида и хлорида натрия в водно-спиртовой среде. После перекристаллизации препарат содержит не менее 98% основного вещества.

При апробации данного способа нами были получены зависимости растворимости АТР, AMP и хлорида натрия в водно-спиртовых растворах с различным содержанием этанола. Установлено, что растворимость фосфатов Ado всегда ниже, чем хлорида натрия. Используя эти данные, было рассчитано и проверено в экспериментах значение гидромодуля этанола, необходимого дая наиболее полного осаждения АТР из элюата. Выявлено, что из 88%-этанола АТР кристаллизуется на 97%. Технические кристаллы АТР содержали 30% соли. Аналогичные расчеты и эксперименты показали, что при перекристаллизации необходимо использовать 77%-ный этанол, иначе заметная часть АТР остается в маточнике.

Среди других параметров процесса кристаллизации АТР было исследовано влияние температуры и времени. Оптимальными были температура растворов 4-б°С и время образования осадков 8-12 ч. В этих условиях степень осаждегагя АТР на стадиях кристаллизации составляет 88-92%. Промытые этанолом и ацетоном кристаллы очищенного АТР высушивали в вакууме при температуре не выше 35°С в течение 4 ч. Готовый препарат -порошок белого цвета, содержит не менее 98% основного вещества. Аналогичным образом были выделены и очищены AMP и ADP. Отметим, что растворимости аденозинфосфатов в водно-спиртовой среде мало отличаются друг от друга, если их концентрация в водном растворе до обработки этанолом выше 20 г л-'. При такой концентрации они осаждаются на 8595% из водно-спиртового раствора, что позволяет выделять каждый из них в одних и тех же условиях. Но в нашем случае содержание AMP и ADP в элюатах составляло 0,8-1,0 и 2,7-3,0 r-ir' соответственно,что потребовало их концентрирования в 6-25 раз вакуум-выпариванием. Однако такой подход не дал желаемого результата, поскольку на стадии перекристаллизации препараты не удалось с приемлемым для технологии выходом очистить от соли. По этой причине хлорид натрия в элюенгах был заменен на хлорид аммония, отличающийся более высокой растворимостью в водном спирте, в результате чего увеличены выходы кристаллических препаратов AMP и

ADP с 35-45% до 78-85%, а содержание в них основного вещества с 96 до 98%.

На основе проведенных исследований была разработана технологическая схема получения кристаллических препаратов аденозинфосфатов и рассчитаны технико-экономические показатели производства, предусматривающего переработку РНК из кормовых дрожжей в уридин и шгпщин, гуанозин, затем в гуанин и D-рибозу, а также аденозин, затем в 5'-адено-зинмонофосфат. Результаты расчетов подтвердили справедливость выбранного направления развития производства кормового белка: за счет организации выпуска сопутствующей продукции его рентабельность существенно возрастает.

Другая группа соединений, содержащихся в клетках дрожжей и бактерий, способных быть переработанными в ценные продукты, - это белки и продукты их гидролиза.

4. Депротеинизация денуклеинизированной биомассы промышленных микроорганизмов

В разрабатываемой нами многостадийной технологии комплексной переработки биомассы микроорганизиов сырьем для получения белковых препаратов являются утилизируемые отходы от производства НК.

Белковые вещества - аминокислоты и пептиды присутствуют в заметном количестве в пермеате, образующимся при ультраконцентрировании раствора нуклеопротеидов. При этом соотношение аминного азота к общему составляет 0,4-0,5, что отвечает требованиям, предъявляемым к дрожжевым экстрактам и делает целесообразной переработку пермеата концентрированием его вакуум-выпариванием и высушиванием концентрата распылением в токе горячего воздуха. Выход препарата не менее, чем в 2 раза превышает выход очищенной РНК и составляет около 4-5% МСК. Апробация его в составе среды для культивирования генно-инженерного штамма Escherihia coli - продуцента люциферазы подтвердила возможность полной замены им традиционного дрожжевого экстракта.

Однако основным источником белковых веществ слезет считать де-нуклеинизированные клетки промышленных микроорганизмов. При переработке их в условиях многотоннажного производства кормового белка достаточно успешно могут быть реализованы технологии, основанные на применении минеральных кислот и технических ферментов. В первом случае конечным продуктом являются низкогидролизованные белковые изо-шпы, что требует изыскания приемов и режимов обработки микробных клеток, не вызывающих глубоких химических превращений белковых макромолекул и не ухудшающих качество клеточного шлама, который может использоваться как кормовой продукт. В исследованиях использовали тот же подход, что и в случае выделения НК, когда изучение кинетики процессов на основных стадиях завершалось созданием математических моделей.

4.1 Выделение белковых веществ кислотным гидролизом дрожжей и бактерий

В данном разделе приводятся результаты исследований процесса кислотной экстракции белковых веществ различной молекулярной массы из

клеток дрожжей и бактерий в зависимости от варьирования температуры (70-160°С), концентрации минеральных кислот (0,05-1,0 М) и плотности клеточных суспензий (15-20% от МСК).

Изучение кинепш1 экстракции белковых вешеств показало: 1) выход белков из дрожжей и бактерий не зависит от плотности клеточных суспензий, что указывает на псевдопервый порядок процесса по концентрации внутриклеточных белков (рис.19); он не изменяется при гидролизе изолированных белковых фракций; 2) скорость выделения белков и их гидролиз зависит только от кислотности минеральной кислоты и температуры.

Установлено, что кинетике процесса отвечает следующая схема последовательно-параллельных превращений: крд. кр.о кр| Рц Рь Ро Р| (9),

4-кррх 4-крр.о ^крр,1 РРь(ААь) РРо(ЛАо) РР|(АА0 где Ры - исходные внутриклеточные белки, Рь - внутриклеточный ннтерме-диат, Ро и Р1- промежуточные высокомолекулярные фракции в растворе, а РРь(ААО, РР<э(ААо) и РР|(АА1) - образующиеся ш них низкомолекулярные продукты гидролиза.

Для схемы превращении (9) были найдены значения эффективных констант, которые использовали для определения связи скоростей отдельных стадий с температурой и концентрацией минеральной кислоты. Установлено, что температурные зависимости подчиняются уравнению Арре-ниуса, а концентрация минеральной кислоты через функцию кислотности Гаммета связана со скоростью каждой стадии уравнением специфического кислотно-основного катализа. В табл.2 приведены значения констант и энергий активации этих стадий в схеме превращений (9). Они определяют математическую модель выделения и гидролиза белковых веществ. Результаты расчетов, подтвержденные экспериментом, указывают на то, что мак-

Таблица 2.

Значения констант и энергий активации или параметров отдельных стадий экстракции и гидролиза белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий (паприна и гаприна) при воздействии на них водных растворов минеральных кислот. ____

Определяемый параметр Значения параметров отдельных стадий в схеме превращений (9)

крх кр.о кр.> крр.ь крр.о крр,|

Энергия активации, Е, кДж-М-' 43+4 24±3 21+2 69±5 120±18 12±2

КьА, М-1 13±2 0,12± ±0,02 *0,14± ±0.04 4,0±0,5 0,32± ±0,06 0,12± +0,02

кго, С (90°С) (для денуюхеинизи-рованных дрожжей) 0,79+ ±0,09 0,23+ ±0,02 0,49± +0,05 0,24± ±0,02 0,25± ±0,05

к2о, с-1 (90°С) (для денуклеинизи-рованных бактерий) 0,40+ ±0,09 0,17± ±0,02 *0,08± ±0,02 0,27± ±0,03 0,15± ±0,02 0,23+ ±0,05

*) произведение Кь^кго (90°С)

ашум выхода ВМФ белковых веществ составляет 38-45% от их содержания в микробных клетках.

Отмечено, что депротеинизированные клетки (остаточный шлам) содержат 25-30% белка от МСК и могут быть использованы в производстве кормов. ВМФ белков, присутствующие в экстрактах, могут быть переработаны в белковые изоляты, содержащие не менее 80% основного вещества (Безруков М.Г.), для пищевой промышленности иди гидролизованы до аминокислот.

Недостатками технологии, основанной на кислотной экстракции белков из микробных клеток, являются повышенные энергозатраты, коррозионный износ оборудования и образование солевых стоков, требующих утилизации. Однако существующий в мире дефицит пищевого белка оправдывает любые попытки организовать его промышленное производство, в том числе, в виде вышеуказанных изолятов. Из всех известных способов их получения технологии, основанные на кислотной экстракции про-теимов из клеток микроорганизмов, играют первостепенную роль.

Разработка экологически чистых технологий получения НМФ белков возможна, согласно литературным данным, при использовании доступных и дешевых технических ФП на основе протеаз, в наших исследованиях -технических препаратов протосубташина ГЗх и фементного комплекса предварительно подготовленных клеток поджелудочной железы свиньи.

4.2. Выделение белковых веществ из ферментолизатов дрожжей и бактерий

В опытах с использованием протосубтилина изучали аналогичные зависимости выхода растворимых белковых фракций во времени от температуры (40-70°С), рН среды (6,0-8,0), соотношения масс фермента к клеточному материалу ( 20-100).

На рис.20 приведены кинетические кривые превращения клеточного белка при ферментолизе дрожжей, протекающем в условиях, близких к оптимальным. При сопоставлении зависимостей, характеризующих процессы гидролитической (рис.19) и энзиматической (рис.20) обработки клеток, видно, что в растворимой части ферментолизатов за счет быстрого протео-лиза постоянно низок уровень ВМФ. Рекомендуется дробное внесение в среду ФП, что обеспечивает технологически приемлемые выходы КБВ. Достигаемая при этом степень гидролиза оказывается невысокой - доля образующегося аминного азота составляет около 20%.

Чтобы найти схему возможных превращений клеточного белка при действии протосубтилином на суспензии денуклеинизированных клеток дополнительно были исследованы закономерности ферментолиза выделенных по способу 4.1 белковых изолятов дрожжей и бактерий. Результаты показали, что скорость гидролиза белков типична для ферментативных реакций и имеет экстремумы при температуре около 50-60°С и рН 7,4, а кинетика процесса подчиняется схеме последовательно-параллельных превращений и имеет вид:

К, кр.о К2 Рк + Е о [РыЕ], -> Ро + Е [Р0Е]

¿крр.о ^крр.1

РРо(ААо) + Е РР.(АА1) + Е (10),

кип Е -> Ен/а

где [РмЕ] и [РоЕ] - концентрации комплексов протосубтилина с высокомолекулярными белковыми субстратами, свободного (Е) и инактивированно-го в ходе гидролиза фермента ( Ен/а).

Схеме превращений (10) отвечают значения констант и энергий активации, найденных по урапнеишо Аррениуса, приведенные в табл. 4. Их использование для количественного описания кривых накопления растворимых белковых веществ показало, что реальные скорости образования продуктов гидролиза белков заметно выше расчетных. Объяснить установленный факт возможно, исходя из двух альтернативных гипотез. Первая предполагает участие в процессе внутриклеточных протеаз, вторая основывается на обратимом изменении конформации внеклеточных протеаз (протосубтилина) и повышении их ферментативной активности под действием экстрагируемых низкомолекулярных метаболитов денуклеинизированных клеток. В любом случае кинетика гидролиза белков должна учитывать участие в процессе двух видов протеаз (вне- и внутриклеточных) или двух форм протеаз протосубтилина. Выдвинутым гипотезам соответствуют результаты опытов по гидролизу изолятов протосубтидином в воде и в среде бесклеточных ферментолизатов. В последнем случае скорость процесса независимо от условий его проведения всегда выше. Поскольку извлечению КБВ из дрожжей и бактерий предшествовала высокотемпературная (90°С) экстракция из клеток КНК, то маловероятно (но не невозможно) сохранение активности внутриклеточных, протеаз и, скорее всего, справедлива вторая гипотеза. При этом ни одно из вышепринягых предположений не приводит к различиям в кинетике гидролиза белков. Изменяться могут только значения констант. Поэтому для построения математической модели фер-ментолиза дрожжей и бактерий протосубтишшом мы воспользовались первой гипотезой, которая в отличие от второй, не предусматривает подбора неизвестных параметров (концентрации нгокомолекулярных модификаторов).

Найти вклад в общую скорость гидролиза от воздействия на белки "допошштельных" протеаз оказалось возможным, если считать, что кинетика параллельного пути образования продуктов подчиняется той же схеме превращений (10), в которой могут меняться только величины параметров. Сначала они были рассчитаны с точностью до некой постоянной величины у из данных экспериментов по гидролизу изолированных белков в среде ферментолизата. В дальнейшем значение параметра у и откорректированные значения констант были установлены при обработке опытов по фер-ментолизу микробных клеток (табл.3). Выявлено, что значение у практически не зависит от природы и плотности суспензий дрожжей и бактерий и составляет (0,10+0,02)% от внутриклеточных белков. В рамках выдвинутых выше гипотез величину у можно интерпретировать как долю внутриклеточного белка, обладающего протеолготшеской активностью, или как долю протосубтилина, активированного компонентами ферментолизата.

Схема превращений(10) и установленные для нее значения параметров определяют математическую модель ферментолиза белков дрожжей и бактерий, которую использовали для выявления оптимальных условий проведения процесса. Путем расчетов, подтвержденных затем эксперимен-

Таблица 3.

Значения констант и энергий активации отдельных стадий процесса экстракции и гидролиза белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий (паприна и гаприна) при воздействии на них протосубтилина._

Определяемый параметр Значения констант и энергий активации отдельных стадий в схеме превращений (10) от воздействия

протосубтилина доп. активн. "протеаз"

крр.о крр.1 кр,о кин крр.о крр.1 кр.о кин

Энергия активации. Е, кДж'Моль-1 31,4± ±2.2 17,3± ±1,0 16,2± ±0,9 50,0+ ±4.4 38,1± ±2,3 28,8± +1,9 35,8± +3,1 27±3

Ка, Л'МОЛЬ'1 1,2± ±0,2 1,4± ±0,2 2,9± ±0,3 1,4± ±0,2 1,2± ±0,1 0,08± ±0,01 5,3± ±0,4 1,6± ±0,1

киь с-1 (60°С) (для денуклеиннзи-рованных дрожжей) 0,35+ ±0,02 0,51± ±0,04 0,31+ ±0,04 (1,3± ±0,02) ЧО4 0,31± ±0,02 0,45± ±0,04 0,27± ±0,04 ±0.6)1 ю-4

¡£20, С' (60°С) (для денуклеинизи-рованных бактерий) 0,17+ ±0,02 0,25± ±0,04 0,15± ±0,02 (0,9± ±0,1)1 ю-4 0,1 б± ±0,02 0,22± ±0,04 0,10± ±0,03 (0,7± ±0,1) х ю-4

*) К» - равновесная константа протони-рования фермент-субстратного комплекса К|= (0,037±0,002) л-г.1 К2= (0,18±0,003) л-г.1 К1=(0,020±0,002)лт.1 К2=(0>°10±0,003) лт.1

тально, установлены оптимальные условия извлечения КБВ из микробных клеток: 1) режим изотермический - температура 50°С, рН 7,4 и 2) режим рН-стахирования (7,4) - при нарастании температуры со скоростью 2° мин-1 с 50 до 90°С после первых 1,5-2 ч обработки клеток ферментом. В последнем случае при сохранении нормы расхода ФП и выхода аминного азота (2025%) время экстракции сокращается на 20-25%.

4.3 Гидролиз микробных белков ферментным комплексом поджелудочной железы

Получение продуктов более глубокого гидролиза белков возможно при использовании качественно других протеаз. Применительно к промышленным условиям наиболее реально использовать ферментный комплекс поджелудочной железы. Субстратами в наших экспериментах служили белковые изодяты, реализованные из клеток дрожжей и бактерий кислотной экстракцией или обработкой протосубтшшном. Изменяемыми параметрами ферментолиза белков были температура (40-б0°С), рН среды (5,0-7,5), начальная концентрация субстрата (1-10% мае.), соотношение субстрата к массе ФП (100-800) и режим внесения фермента. При изучении кинетики образования НМФ было установлено, что самым влиятельным условием, определяющим выход аминного азота является дробное внесение ФП в среду (рис.21). Отмечено, что дрожжевые белки гидролизуются с более высокой скоростью, чем бактериальные.

Исследование кинетики ферментолиза белков показало, что накопление аминного азота подчиняется схеме превращений (10), но с учетом необратимой инактивации фермента в составе его комплекса с субстратом и

Таблица 4.

Значения констант и энергий активаций отдельных стадий процесса гидролиза белковых веществ дрожжей и бактерий при действием ферментной системы поджелудочной железы._

Определяемый параметр Значения констант и энергий активации отдельных стадий в схеме превращений (10)

Гидролизуемые белки

дрожжей | бактерий

крр.о крр,| кр.о кин крр.о крр.1 кр.о кин

Энергия активации Е, кДж-моль"1 25+2 40+2 32±2 22+2 25±2 40±2 32±2 22±2

кго-103, с-1 (55°С) 1,3± ±0,1 2,0± ±0.2 1,5± ±0,1 1,7+ ±0,2 0,8± ±0,1 1,2+ ±0,1 0,10± ±0,01 0,10± 0,01

Ка, Л-МОЛЬ"1 6,2± +0,5 5,3± ±0,4 2,9± ±0,4 3,8+ ±0,3 ' 3,1± ±0,4 2,6+ ±0,3 2,9± ±0,3 3,0± ±0,3

К|=(3,4±0,4) л-г1; К2=(2,3+0,4) д-г'; Ки=(25±5) л-Н

снижения доли свободного фермента за счет его обратимого взаимодействия с аминным азотом. Оптимальные значения температуры и рН среды находятся в интервалах 50-55°С, 6,5-7,2 соответственно. Установленные значения констант и энергий активации отдельных стадий (табл.4) были использованы для расчета зависимости образования аминного азота в процессе гидролиза белковых веществ как в составе бесклеточных фермен-толизатов дрожжей и бактерий, так и при последовательной обработке де-нуклеинизированных клеток смешанным ФП, содержащим протосубтилин и ферментный комплекс пожеяудочной железы. Разработанные математические модели ферментолиза белков дрожжей и бактерий адекватно описывали экспериментальные данные. Это означает, что каждый из компонентов смешанного ФП сепаративно действует на микробные белки. Эффект от совместного применения двух ферментных систем очевиден, поскольку упрощает технологию глубокого пиролиза микробных белков, а также позволяет увеличить выход целевого продукта не менее, чем в 2 раза.

Как и в предыдущем случае, процесс ферментолиза белков можно интенсифицировать при проведении его в режиме ступенчатого нарастания температуры от 55 до 90°С.

4.4. Получение препарата смеси аминокислот и низших пептидов

Кислотные экстракты микробных КБВ были переработаны по известной схеме, предусматривающей отделение микробных клеток центрифугированием с последующим осаждением "глобулиповой" (соле- и щело-черастворимой) фракции белков в ИЭТ (рН 4,5-4,7) с выходом 20-25% от МСК. Оставшиеся в супернатанге альбумины были сконцентрированы ультрафильтрацией с выходом 12-15% от МСК и после объединения с "глобулинами" гидролгоованы ФП поджелудочной железы до аминокислот и низших пептидов.

Из ферментолизатов, полученных при последовательной обработке микробных клеток протосубтилином и ФП поджелудочной железы, депро-теинизированные дрожжи или бактерии были удалены центрифугировани-

/ у i

¿ ч

время, ч

Рис.19. Зависимость степени извлечения белковых веществ (X) от времени обработки дрожжей кислотным экстрагентом. Условия: МСК - 10%, температура 90°С, 0,10 М р-р серной кислоты. Условные обозначения индексов при X: р - ВМФ, рр и аа- НМФ и L -сумма долей белковых веществ.

*z 0.«

Крр

0,4

■Хщх Хр

..... i 7 i

^Г л ti

3 ... ч

время, ч

Рис.20. Зависимость степени извлечения белковых веществ от времени обработки дрожжей протосубгили-ном.

Условия: МСК - 5%, температура 50°С, рН 7,4, соотношение масс клеток к ФП - 50 .

Условные обозначения: 4- - момент времени внесения ФП, остальные обозначения те же, что и на рис. 19.

Хрр

о,„ г ч б 8

время, ч

Рис. 21. Кинетика ферментолиза белвовых изолятов дрожжей под действием ферментного комплекса поджелудочной железы. Условия: температура 50°С, рН -5,7, исходная концентрация белка 5,0% мае., соотношение масс белка к ФП - 400.

Условные обозначения: те же, что и на рис.19 и 20.

ем. Образующиеся фугаты, содержащие смесь аминокислот и низших пептидов, после отделения пигментов ультрафильтрацней были направлены на стадию ионообменной сорбции аминокислот на катионите КУ-2-8 (в Н-форме). С катиошгга аминокислоты и низшие пептиды были десорбирова-ны 2-3%-ным раствором аммиака. Элюаты концентрировали вакуум-выпа-рнваннем до 10% мае. и высушивали распылением в токе горячего воздуха. Полученный с выходом до 25-30% от МСК очищенный препарат смеси аминокислот и низших пептидов был испытан в нетрадиционных областях применения, в частности, для синтеза белковых ПАВ типа ламепон и суль-фопон конденсацией аминокислот и низших пептидов с хлорангидридами жирных кислот или алкилсульфохлорндами (Си-Сгё), а также в электрохимическом извлечении некоторых металлов (золота, серебра и меди) из вторичного сырья и низкосортных руд. Положотедьные результаты испытаний позволили создать научно-техническую программу перспективных исследований по переработке металлсодержащего низкосортного сырья, направленную на замену традиционных способов экологически чистыми технологиями получения некоторых металлов, основанных на применении концентрированных растворов минеральных кислот и цианидов.

Расчеты технико-экономических показателей производства широкого спектра препаратов нутслеотидной и белковой природы на предприятиях по выпуску кормовых дрожжей показали, что рентабельность производств кормового белка значительно возрастает за счет реализации продукции, полученной в результате предложенных нами технологий комплексной переработки микробного сырья.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. По результатам теоретических исследований и их практической апробации разработана концепция следующего этапа развития биотехнологии крупнотоннажных производств биомассы промышленных микроорганизмов на основе системы гибкого сочетания ресурсо- и энергосберегающих технологий глубокой комплексной переработки микробного сырья, включающей денукленнгоацци и депротеинизацию микробных клеток; последующую деполимеризацию нуклеиновых кислот и белков; их трансформацию и получение спектра продуктов нуклеотидной и белковой природы различной степени очистки и назначения.

2. Предложен новый подход к оценке эффективности технологических процессов переработки микробиологического сырья, основанный на математическом анализе эффективных костант и энергий активации в схеме превращений высокомолекулярных компонентов микробной клетки в низком олекулярные.

3- Установлены в пределах варьируемых параметров (условий) количественные закономерности процессов денуклешшзации дрожжей и бактерий и получения очищенных препаратов полинуклеотидов. Созданы математические модели основных стадий выделения, очистки и возможных превращений нуклеиновых кислот: экстракции из дрожжей и метанокис-ляющих бактерий водными и солевыми растворами, концентрирования экстрактов ультрафилмрацией, разложения их комплексов с белками в сре-

де ортофосфата, осаждения в изоэлектрической точке и отщепления пури-новых оснований РНК в кислых средах.

4. Разработаны новые высокоэффективные и экологически безопасные технологии получения высокоочшценных полинуклеотидов, основанные на применении солей ортофосфорной кислоты, преимуществами которых являются: 1) сокращение стадии технологического процесса выделения и очистки микробных полинуклеотидов; 2) увеличение в 2 раза (по сравнению с традиционными технологиями) выхода целевого продукта; 3) исключение из технологического процесса вредных соединений (фенола) и дорогостоящих препаратов (ферментов); 4) осаждение нуклеопротеидов в изоэлектрической точке в отсутствие глубокого охлажения растворов, что позволило исключить из технологического процесса применение холодильных машин и перевести, тем самым, производство РНК в разряд неэнергоемких; 5) отсутствие неутилизируемых жидких и твердых отходов, которые успешно апробированы в опытно- промышленных условиях на Ки-ршнском БХЗ и Свегшоярском заводе БВК.

5. Установлены основные закономерности процессов химической и энзиматической деполимеризации РНК до нуклеозидов и пуриновых оснований под действием гидроксидов свинца и кальция, ацетата аммония, ферментного препарата S. coelicolor и растворов минеральных кисяют.

Разработаны и апробированы высокоэффективные технологии получения гидролизатов РНК и их переработки в очищенные препараты, отвечающие требованиям, предъявляемым к качеству субстанций для синтеза лекарственных форм.

Разработан и апробирован способ получения индивидуальных нуклеозидов двухступенчатым ионным обменом с применением сильнокислотного катеонита и сильноосновного анионкга, позводяеющий сократить число стадий очистки и повысить выход препаратов с содержанием основного вещества 96-98%.

6. Разработаны технологические приемы химической трансформации нуклеозидов и получения очищенных препаратов: гуанина и D-рибозы путем кислотного гидролиза гуанознна, а также инозина при дезаминирова-нии аденозина нитритом натрия в среде уксусной кислоты.

7. На основании анализа термодинамики реакций образования АТР из аденозина и неорганического фосфата при участии сахарозы и ферментов гликолиза выдвинута гипотеза, согласно которой основной путь образования АТР обусловлен фосфорилированием Ado и AMP фосфоенолпиру-ватом под действием пируваткиназ (сахаромицетов), обеспечивающих "сверхсинтез" АТР. Показано, что образующийся под действием фосфатаз дрожжей АТР может быть превращен с высоким выходом в AMP, а последний- в ADP.

Разработан способ фосфорилирования аденозина неорганическим фосфатом в присутствии сахарозы под действием ферментных систем пивных дрожжей; определены оптимальные условия получения 5'-аденозин-фосфатов (АТР, ADP и AMP); рекомендованы технологические приемы получения очищенных кристаллических препаратов аденозинфофатов на основе метода ионного обмена на анионите АВ-17-2 и кристаллизации нуклеотидов из водно-спиртовых растворов.

8. Установлены в пределах варьируемых параметров (условий) количественные закономерности процессов депротегашзацин денуклешшзиро-ванных дрожжей и бактерий под действием минеральных кислот и технических ферментов: протосубтилина и протеолитического комплекса поджелудочной железы. Созданы прогностические математические модели получения высоко- п низкомолекулярных белковых веществ.

Разработаны технологические приемы выделения и деполимеризации микробных белков, а также переработки изолятов и гидролизатов в очищенные препараты белковых веществ с различной степенью гидроли-зованности.

9. Рассчитаны технико-экономические показатели организации многотоннажного производства продуктов комплексной переработки микробного сырья на основе выделения из него полинуклеотидов и белков, трансформации их в серию продуктов различной степени гидролизованности и получения широкого спектра препаратов различной степени очистки для использования в медицинской, фармацевтической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других отраслях хозяйственной деятельности. По результатам расчетов организация выпуска гаммы препаратов различной степени очистки в условшх современны? биохимических заводов позволяет существенно увеличить рентабельность производства кормового микробного белка за счет реализации более дорогостоящей продукции.

Список публикаций, отражающих основное содержание работы:

1. Кастальская-Бороздинская Н.К., Крылов И.А., Манаков М.Н. Исследование возможности получения поверхностно-активных веществ из активного ила IIТез. докл. 2-ая Респ. конф. "Проблемы охраны окружающей среды в районах с интенсивно развивающейся промышленностью", Кемерово, 1982, С. 107.

2. Кастальская-Бороздинская Н.К., Крылов И.А., Панфилов В.И., Манаков М.Н. Получение ПАВ на основе аминокислот белка биомассы различных микроорганизмов //Тез. докл. 3-ий Симп. соц. стран по биотехнологии, Братислава, апрель 1983, В 9-7.

3. Кастальская-Бороздинская Н.К., Крылов И А., Малахов М.Н. Получение поверхностно-активных веществ на основе гидролизатов активного ила производства синтетических жирных кислот //Сб. "Переработка и утилизация отходов производства микробиологической промышленности" ОРИСО Главмикробиопрома, М., 1982, С. 65-68.

4. Кастальская-Бороздинская Н.К., Крылов И.А., Манаков М.Н. Получение ПАВ на основе аминокислот активного ила //Нефтепереработка и нефтехимия, М., 1984, N 3, С. 31-33.

5. Тихонова И.В., Крылов И.А., Панфилов В.И., Манаков М.Н. Исследование процесса получения аминокислот и пептидов гидролизом биомассы микроорганизмов //Тез. докл. III Всесоюзн. совещ. по аминокислотам, Ереван, апрель 1984, С. 108-109.

6. Тихонова И.В., Крылов И.А., Панфилов В.И., Манаков М.Н. Синтез ПАВ на основе продуктов неполного гидролиза белка биомассы микроорганизмов //Тез. докл. IV Всесоюзн. конф. по ПАВ и сырью для их производства, Волгодонск, 1984, С. 79-80.

за

7. Борискина Г .Я., Пекелис М.В., Балабушевич Н.Г., Крьшов И А. Сравнение различных методов денуклинизацни промышленной биомассы дрожжей IIТр. МХТИ им.Д.И.Менделеева, Биотехнология и промышленная экология, М., 1985, вып. 135, С. 77-81.

8. Панфилов В.И., Черноверхская Е.А., Крьшов И.А. Использование белковых флокулянтов для концентрирования микробных суспензий //Тр. МХТИ им. Д.И.Менделеева, Биотехнология и промышленная экология, М., 1985, вып. 135, С. 81-97.

9. Тихонова И.В., Крылов И.А., Манаков М.Н. Выделение и очистка пептидов, аминокислот из солевых растворов методом модифицированной ультрафильтрации //Тез. докл. IV Симп. соц. стран по биотехнологии, Варна, 1986, С. 221.

10. Павлов А А., КуркинаС А., Крылов И А., Манаков М.Н., Математическое описание процесса разрушения клеток дрожжей в баллистическом дезинтеграторе //Тез. докл. IV Симп. соц. стран по биотехнологии, Варна, 1986, С. 317.

11. Тихонова И.В., Крьшов И А. Исследование возможностей метода уль-трафшгьтрации для разделения компонентов биологических жидкостей. //Тр. МХТИ им.Д.И.Менделеева. Химия и биотехнология физиологиче-скиактивных соединений и их полупродуктов. М., 1987, вып. N 149, С. 102-106.

12. Тихонова И.В., Крьшов И.А., Молчан В.М., Манаков М.Н. Кинетика кислотного гидролиза биомассы парафинутилизирующих дрожжей до свободных аминокислот //Тез. докл. IV Всесоюзн. конф. " Аминокислоты дня сельского хозяйства, пищевой промышленности, медицины и научных исследований", Ереван, июнь 1988. С. 113-114.

13. Рихтера М., Крьшов И.А., Басаржова Г., Манаков М.Н. Дезинтегриро-ва-ние промышленной биомассы дрожжей Candida utilis. Определение степени дезинтеграции клеток с точки зрения последовательного выделения белковых веществ //Сб. Пражского химико-технологического института , X 2, Прага, 1986, С. 259-278.

14. Павлов A.A., Куркина С.А., Шестаковский Л.Я., Крьшов И.А. Баллистическая дезинтеграция микроорганизмов. Кинетический подход. //Сб. "Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и микробиологии. Описание научных принципов устройства новых приборов и методики пользования ими", Пущи-но, 1988, С. 81-93.

15. Крьшов И.А., Гунин В.А., Манаков М.Н., Рихтера М. Исследование процесса денуклинизацни биомассы парафинутилизирующих дрожжей и оценка качества полученных РНК и белкового концентрата //Сб. научных трудов. Сотрудничество МХТИ им. Д.И. Менделеева с Пражским химшсо-технологиче-ским институтом, М., 1990, С. 47-56.

16. Гунин В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. Получение изолята РНК из биомассы микроорганизмов перспективы его использования в пищевой технологии //Тез. докл. Всесоюзн. научно-техн. конф. "Итоги и перспективы использования природных и синтетических ВМС в производстве пищи", Суздаль,декабрь 1991,С. 110-111.

17. Крьшов И.А., Гунин В А., Краснопгганова A.A., Манаков М.Н., Маркина Н.С. Выбор оптимальной схемы получения дрожжевой РНК в уело-

виях современных биохимзаводов БВК и лизина У/Биотехнология, 1992, N 2, С. 81-83.

18. Гунин В.А., Крылов И.А., Карпович О.В., Манаков М.Н. Использование ультрафильтрациошгого оборудования отечественного производства в процессе мембранного концентрирования и разделения KHK, выделенных из биомассы промышленных микроорганизмов //Тез. докл. в Сб. " Мембранные процессы в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности", М., 1991, С. 69.

19. Крылов И.А., Волкова Н.В., Королев Ю.Г., Адеева В.И., Красноштано-ва A.A., Пономаренко Н.К., Манаков М.Н. Получение субстанций для производства лекарственных средств на основе продуктов гидролиза микробных РНК и ДНК //Тез. докл. в Сб. "Химия и технология лекарственных средств", С-Пб., 1994, С. 23.

20. Panfilov V.l., Krylov I.A., Shakir I.V., Manakov M.N. Microbial and Plant Biomass Processing //Тез. докл. в Сб. III German-Russian workshop Biotechnology, Berlin, 1994, P.9

21. Королев Ю.Г., Крылов И.А., Манаков М.Н. Кинетика образования пу-риновых оснований при кислотном гидролизе РНК //Биотехнология, 1994, N11-12,С.57-60.

22. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Исследование модельной системы БСА - серная кислота. //Биотехнология, 1996, N 3, С. 39-40.

23. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 2. Кинетика гидролиза белковых фракций дрож-жен и бактерий. //Биотехнология, 1996, N 3, С. 45-49.

24. Крылов И.А., Красноштанова A.A., Манаков М.Н. Кислотный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Кинетика кислотной экстракции белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий. //Биотехнология, 1996, N3, С. 50-55.

25. Крылов И.А., Волкова Н.В., By Тхи Фыонг Ань, Манаков М.Н. Кинетика экстракции полинуклеотидов из клеток дрожжей и метанутилгои-рующих бактерий. //Биотехнология, 1996, N 7, С.52-57.

26. Крылов ИА., Волкова Н.В., Гунин ВА., By Тхи Фыонг Ань, Манаков М.Н. Разложение нуклеопротеинов дрожжей и бактерий в среде ортофос-фата.//Биотехнология. 1996, N 7, С. 58-64.

27. Королев Ю.Г., Крылов И.А., Манаков М.Н. Количественные закономерности кислотного гидролиза гуанозина. //Биотехнология, 1996, N 10, С. 60-64.

28. Адеева В.И., Крылов И.А., Манаков М.Н. Фосфорилирование адено-зина клетками пивных дрожжей Sacchoromyces carlsbergensis. 1. Биосинтез аденозинтрифосфата. //Биотехнология, 1998, № 3, С. 25-29.

29. Адеева В.И., Крылов И.А., Манаков М.Н. Фосфорилирование адено-зинаклетками пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. 2. Биосинтез аденозинмонофосфата и аденозиндифосфата. //Биотехнология, 1998, №3, С. 30-33.

30. Крылов И.А., Красиоштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 1. Кинетика гидролиза белковых фракций дрожжей и бактерий протосубтилином. //Биотехнология, 1998 №6, С.50-56.

31. Крылов И.А., Красиоштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативный гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 2. Кинетика экстракции белковых веществ из клеток дрожжей и бактерий протосубтилином. //Биотехнология, 1998, №6, С.57-62.

32. Крылов H.A., Красиоштанова A.A., Манаков М.Н. Ферментативньш гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов. Количественные закономерности процесса. 3. Гидролиз белковых веществ биомассы промышленных микроорганизмов ферментными системами поджелудочной железы. //Биотехнология, 1998, №6, С.63-68.

33. Крылов И.А., Красиоштанова A.A. Извлечение и выделение металлов из отходов, низкосортных и нетрадиционных источников сырья в присутствии комплексообразователей белковой природы //Тез. докл. 111-й Международный конгресс "Окружающая среда для нас и будущих поколений: экология, бизнес и экологическое образование", Самара-Астрахань-Самара, сентябрь 1998, С. 47

34. A.c. 1135481 СССР. Способ концентрирования бактериальной биомас-сы//Черноверхская Е.А., Панфилов В.И., Крылов И.А., Манаков М.Н. Заявл. 01.02.83, опубликовано 23.01.85, Бюл-N 3.

35. A.c. 1736280 СССР Способ получения лизина //Молчан В.М., Крылов ИЛ., Зайцева З.М., Манаков М.Н., Гунин В-А., Коновалова A.B., Нейе-штадт-Абрамович С.Р. Заявл. 30.08.90, опубл. 30.11.91., Бюл. N 30 (1993).

36. Ал. на выдачу пат. РФ на Способ получения РНК N 5009965 //Гунин В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н., приоритет 20.11.91., положительное решение 23.07.92.

37. А.з. на выдачу пат. РФ на Способ получения РНК и очищенного дрожжевого экстракта N 92001860 //Гунин В.А., Крылов И.А., Мельниченко Е.Г., Манаков М.Н., приоритет 22.10.92., положит, решение 29.08.96.

38. Ал. на выдачу пат. РФ на Способ полученга нуклеозидов N 93054225 //Королев Ю.Г., Пономаренко Н.К., Крылов И А., Адеева В.И., Манаков М.Н., Вишняков A.B., приоритет 14.10.92, положит, решение

39. Ал. на патент РФ на Способ получения нуклеиновых кислот из бактерий N 95112201 //Крылов И.А., Панфилов В.И., Волкова Н.В., Манаков М.Н., приоритет 14.07.95, положит, решение 30.10.96.

40. Пат. РФ N 2095478, Способ извлечения золота из отходов. // Богданов-ская В.А., Тарасевич М.Р., Крылов И.А. Красиоштанова A.A., Манаков М.Н., приоритет 25.04.96, опубликовано 10.11.97, Бюл. N 31.

41. А.з. на пат. РФ на Способ извлечения драгоценных металлов N 97110752. //Крылов И.А., Красиоштанова A.A., Манаков М.Н., Богданов-ская В .А., Тарасевич М.Р., приоритет 26.06.97, положит, решение 05.01.98.

03.12.93.

Условные обозначения:

KHK и КБВ - соответственно компоненты нуклеиновых кислот и белковых веществ,

ВМФ, НМФ - соответственно высоко- и низкомолекулярные фракции нуклеиновых кислот и (или) белков,

РНК и ДНК - соответственно полирибонуклеотиды и полидезоксирибо-нуклеотиды,

МАФ и ДАФ - соответственно моно- и диаммонийфосфат, Ade, Guo, Ado, Gua, Cyt, Urd, 5'-AMP, 5'-ADP и 5'-ATP, Ino - соответственно аденин, гуанин, аденозин, гуанозин, цитидин, уридин, S'-аденозннмоно-фосфат, 5'-аденозиндифосфат, 5'-аденозинтрифосфат, инозин, МСК масса сухих клеток, ИЭТ - изоэлектрическая точка, ФП - ферментный препарат.

Заказ _ Объеме.. 5 п. д._Тираж 100 экз

Издательский центр РХТУ им. Д. И. Менделеева

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Крылов, Игорь Алексеевич, Москва

Российский химико-технологический университет

имени Д.И.Менделеева

ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ БИОМАССЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГ АНИЗМОВ

03.00.23. - Биотехнология

Диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

К ¿>г Ъ 1 ^гс

На правах рукописи

К1 )РЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

УДК 663.1:636.-087.24

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор |Манаков М.Н.

Москва 1998

О Г Л А В Л Е Н И Е

ГЕ..................................................................................................6.

Список принятых в работе сокращений................................................13.

Глава 1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ......................14.

1.1. Объекты исследования.......................................................14.

1.2. Материалы и реактивы......................................................14.

1.3. Методы исследования основных стадий получения препаратов КПК и КБВ.....................................................16.

1.4. Методы анализа..................................................................16.

1.5. Статистическая обработка экспериментальных данных...................................................................................17

Глава 2. ДЕНУКЛЕИНИЗАЦИЯ БИОМАССЫ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ...............................................18.

2.1. Получение препаратов микробных полинуклеотидов -РНК и ДНК из дрожжей и бактерий. (Литературные данные)................................................................................18.

2.2. Разработка стадий выделения и очистки полинуклеотидов дрожжей и бактерий...............................................40.

2.2.1. Экстракция КН.К из дрожжей и бактерий водными и солевыми растворами.....................................40.

2.2.2. Переработка КПК-содержащих экстрактов, выделение и очистка препаратов нуклеиновых кислот...............................................................................50.

2.2.2.1. Получение бесклеточных экстрактов, содержащих КПК.................................................................50

2.2.2.2. Осаждение нуклеиновых кислот в изоэлектри-ческой точке............................................................53

2.2.2.3. Концентрирование и очистка нуклеиновых кислот ультрафильтрацией........................................71,

2.2.2.4. Разложение нуклеопротеидов в среде ортофос-

фата..........................................................................74.

2.2.2.5. Получение сухих форм препаратов РНК и концентрата ДНК........................................................78.

Глава 3. ХИМИЧЕСКАЯ И ЭНЗИМАТИЧЕСКАЯ ДЕПОЛИМЕРИЗАЦИЯ РНК ДО НУКЛЕОЗИДОВ И ПУРИНОВЫХ

ОСНОВАНИЙ...........................................................................83.

3.1. Получение препаратов нуклеозидов из РНК, гидроли -

зованной химическими агентами и ферментами.

(Литературные данные.).,..................................................83,

3.2. Получение препаратов нуклеозидов из РНК.................94.

3.2.1. Гидролиз РНК до нуклеозидов под действием гидроксидов свинца и кальция..............................94.

3.2.2. Гидролиз РНК до нуклеозидов под действием ацетата аммония.....................................................106.

3.2.3. Гидролиз РНК до нуклеозидов под действием ферментного препарата Strept.om.yces соеНсо1ог.Ю8.

3.2.4. Переработка различных нуклеозидсодержащих гидролнзатов РНК. Особенности получения

кристаллических препаратов нуклеозидов..........112.

3.3. Получение пуриновых оснований нуклеиновых кислот из РНК.................................................................................146.

3.3.1. Получение пуриновых оснований нуклеиновых кислот. (Литер атурные данные.)..............................................Л 46.

3.3.2. Гидролиз РНК до пуриновых оснований растворами минер альеых кислот......................................150,

3.3.3. Кинетика отщепления пуриновых оснований при кислотном гидролизе РНК.....................................Л51.

3.3.4. Переработка кислотных гидролнзатов РНК, получение кристалличнских препаратов аденина и гуанина........................................................................156.

Глина 4. ХИМИЧЕСКИЕ И ЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ ТРАНСФОРМАЦИИ ГУАНОЗИНА И АДЕНОЗИНА............................163.

4.1. Получение препаратов гуанина из гуанозина, инозина

из аденозина и фосфорилирование аденозина ферментными системами дрожжей. (Литературные данные.) ...164,

4.2. Трансформация гуанозина в гуанин и О-рибозу..........185.

4.2.1. Кинетика образования гуанина и О-рибозы при гидролизе гуанозина растворами серной кислоты........... .....................................................................185.

4.2.2. Переработка сернокислотных гидролизатов гуанозина, получение кисталлических препаратов гуанина и 1)-рибозы.....................................................189.

4.3. Трансформация аденозина в инозин..............................190.

4.3.1. Дезаминирование аденозина в инозин под действием нитрита натрия в растворе уксусной кислоты...............................................................................190.

4.3.2. Переработка гидролизата аденозина, получение кристаллического препарата инозина................192.

4.4. Трансформация аденозина в 5'-аденозинфосфаты......193.

4.4.1. Фосфорилирование аденозина до 5'-аденозинфос-фатов ферментными системами клеток пивных дрожжей....................................................................193.

4.4.2. Переработка растворов, содержащих продукты фосфор ил ир ов ания аденозина, получение кристаллических препаратов 5'-аденозиифосфатов....213

4.4.2.1. Отделение отработанной биомассы дрожжей, получение растворов адсиозинфосфатов...........213

4.4.2.2. Разделение и очистка 5'-аденозинфосфатов ионным обменом....................................................214,

а « лпуттрптвднизация денукжинизированнои :сы ПРОМЫШЛЕННЫХ микроорганиз-

5.1. Выделение белков из клеток дрожжей и бактерий, получение препаратов белковых веществ с различной степенью гидролиза. (Литературные данные.)...................

5.2. Выделение белковых веществкислотным гидролизом биомассы дрожжей и бактерий........................................

5.3. Выделение белковых веществ ферментолизом дрожжей и бактерий............................................................................266.

5.4. Гидролиз микробных белков ферментным комплексом поджелудочной железы......................................................278.

5.5. Переработка экстрактов и ферментолизатов белковых веществ, получение препарата аминокислот и низших пептидов...............................................................................284.

ВЫВОДЫ...................................................................................................295.

список ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...........................299.

ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................................................330.

Приложение 1. Расчет технико-экономических показателей комплексной переработки биомассы кормовых дрожжей. Приложение 2. Акты испытаний, протоколы, титульные листы НТД.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Одним из достижений современной промышленной биотехнологии является разработка технологий и создание крупнотомнажноI-о производства микробной биомассы (дрожжей и бактерий). В этом отношении особое место среди промышленно развитых стран занимает Россия, поскольку ей принадлежит приоритет в области разработанных технологий и она располагает большей частью производственных мощностей. Наличие крупного промышленного производства микробной биомассы и результаты научных исследований определили перспективу его дальнейшего развития пли следующий этап в биотехнологии, где биомасса микроорганизмов уже не является конечным продуктом, а рассматривается как сырье для получения различных по свойствам и назначению препаратов, преде всего, белковой, липидной и нуклеотидной природы. Отечественные и зарубежные авторы на основе различных подходов разработали и реализовали в опытно-промышленном производстве различные варианты технологий комплексной переработки биомассы дрожжей и бактерий, которые в отличие от индивидуальных производств позволяют добиться лучших технико-экономических показателей. Сегодня можно считать разработанными для крупнотоннажного производства разные варианты технологий выделения из микроорганизмов липидных фракций и их переработки до индивидуальных соединений, получения белковых концентратов, изолятов и фермеитолизатов с различной степенью гидролиза и очистки белковых веществ. Объединение германских фирм (ОГФ) Хёхст-Уд') перерабатывает сухую биомассу бактерий Ме-1Ьу1отопаз с1ага, выращенных на метаноле, в гамму продуктов, состоящую из отдельных фракций липидов, эргостерина, убихинона <3-10, белкового концентрата как пищевой добавки, ДНК и 5'-монорибонуклеоти-дов. Отечественная технология основывается на ряде схем комплексной переработки биомассы дрожжей и бактерий. Одна из них аналогично процессу ОГФ Хёхст-Удэ предусматривает переработку липидных фракций

микробных клеток, а образующийся обезжиренный шрот - в кормовой продукт. Другие преследуют цель получения белковых изолятов пищевого и медицинского назначения, пищевкусовой добавки, содержащей продукты гидролиза нуклеиновых кислот, и кормового продукта на основе клеточного шлама и неизвлечениого белка. Общим недостатком всех вышеуказанных технологий является невысокая рентабельность продукции комплексного производства, что сдерживает его развитие. Высокорентабельную продукцию можно получить, если действующие биохимические заводы перейдут на выпуск фармацевтических препаратов или субстанций для них, изготовленных на основе компонентов микробгёых клеток. И здесь наибольший интерес представляет шлдсл ей не и переработка биополимеров нуклеотидной и белковой природы. Успехи в области многотоннажного производства микробных полинуклеогидов, особенно РНК, невелики. Известен процесс японской фирмы Kancgaruchy Chemical Industry Ltd, которая из дрожжей Candida utilis, выращенных па мелассе сахарного тростника, щелочной экстракцией выделяет нуклеопротеиды и перерабатывает их в продукты гидролиза РНК. Интерес к РНК и КНК проявляют практически все фармацевтические фирмы промышленно раз-витых стран мира, выпускающие препараты нуклеотидной природа. Их противовирусная группа относится к числу наиболее дорогостоящих ле-карственных средств. Отсутствие их производства в России усиливает актуальность проблемы. Сегодня выделение КНК и КБВ из микробных клеток и получение их модифицированных аналогов на действующих биохимических предприятиях может быть реализовано только по варианту комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов при минимуме затрат на сырье, энергию и природоохранные системы. Такой подход ни только не исключает производство кормового белка, а, наоборот, сохраняет его в виде частично денуклеинизированных и депро-теинизированных микробных клеток.

При разработке технологий комплексной переработки дрожжей или бактерий для современных биохимических заводов должны учитываться их сырьевая база, энерговооруженность, низкая категория пожароопас-иости производства, использование водных сред на всех стадиях технологического процесса, наличие станции (цехов) биологической очистки стоков и опыт рабо ты производственного персонала. Все это позволяет считать наиболее перспективными те технологии, которые предполагают проведение основных стадий в водных средах с использованием традиционного для данных предприятий источников сырья и оборудования. Больше всего чтим условиям отвечаю т такие компоненты микробных клеток, как полпнхклеотиды и белковые вещества.

Цель и задачи исследования: Цель исследований состояла в разработке концепции второго этапа развития биотехнологии промыш-ленных микроорганизмов и научных основ глубокой комплексной пере-работки микробного сырья дня получения очищенных препаратов КНК и КБВ в системе взаимосочетающихся ресурсо- и энергосберегающих малоотходных технологий в условиях производства кормового белка.

В задачу работы входило:

- разработать высокоэффективные не уступающие лучшим мировым стандартам технологии глубокой переработки микробиологического сырья и получения очищенных препаратов полниуклеотидов и белковых веществ;

- для создания алгоритма управления основными стадиями технологического процесса получения микробных полинуклеотидов и деполимеризации белковых веществ в низко молекулярные продукты разработать математические модели процессов;

- разработать технологию очищенных препаратов КНК и КБВ на основе продуктов гидролиза микробных РНК и белков; для расширения области применения белковых гидролизатов провести поиск нетрадиционных сфер их применения;

- разработать нормативно-техническую документацию для организации опытного производства KHK и КБ В.

Научная новизна исследований состоит в разработке научно-обоснованной концепции второго этапа развития биотехнологии крупнотоннажного производства микробной биомассы, предусматривающего комплексную переработку промышленных микроорганизмов, основаной на выделении из дрожжей и бактерий нуклеиновых кислот и белковых веществ и их трансформации в наиболее ценные продукты или перспективные субстанции для применения в различных областях хозяйственной деятельности.

Разработ аны нетрадиционные методы выделения из микробных клеток полинуклеотидов и их очистки в рациональном химическом процессе, исключающем использование протеолнтических ферментов и фенолсо-держащпх растворов:

- впервые разработаны приемы выделения из метанокисляющих бактерий Methylococcus capsulatus как РНК, так и ДНК без применения органических растворителей:

- разработаны математические модели реакционных взаимодействий для всех основных стадий получения очищенных полинуклеотидов: экстракции ПК водными и солевыми растворами; ультракоицентрирова-ния бесклеточных экстрактов, осаждения и разложения белково-нуклеи-новых комплексов в среде ортофосфата; выявлены параметры для прогнозирования доли белковых примесей в полинуклеотидных препаратах;

- установлены основные закономерности гидролитического расщепления РНК до нуклсозидов и пуринов под действием химических агентов и ферментов. Проведен сравнительный анализ промышленных способов гидролиза РНК и переработки различных гидролизатов в очищенные препараты KHK;

- разработаны технологические приемы глубокой переработки отдельных KHK в водных растворах: химические трансформации Ado в Ino,

Guo в Gua и D-рибозу, биофосфолирнрование Ado в 5'-аденозинфосфаты ферментами пивных дрожжей с получением очищенных препаратов.

Впервые по результатам кинетических исследований основных стадий выделения ПК, извлечения и гидролиза белков из дрожжей и бактерий под действием химических агентов и технических ферментов (про-тосубтилина и ферментной системы поджелудочной железы) разработаны математические модели.

Расширена область применения белковых гидролизатов: впервые показана возможность их использования для выделения металлов (на примере золота, серебра и меди) из второсортног о сырья и отходов.

Практически» ценность. Преимуществами получения KHK и КБВ при комплексной переработке микробного сырья являются: 1) использование сырьевой базы производства кормового белка; 2) применение водных реагентов для проведения большинства стадий; 3) регенерация малотоксичных органических растворителей; 4) отсутствие образования токсичных соединений; 5) малоотходиость; 6) замкнутость циклов, предусматривающая возрат твердых отходов и значительной части жидких стоков в основное производство; 7) высокая экономическая эффективность за счет выпуска продуктов разной степени очистки и минимизации затрат на природоохранные мероприятия.

Разработаны два варианта использования солей ортофосфорной кислоты в технологии получения очищенных полинуклеотидов: 1) для малотоннажного производства в составе окстрагента, извлекающего в ра-створ нуклеиновые кнслоы, свободные от белковой примеси; 2) для крупнотоннажного производства в составе раствора, разлагающего нук-леопротеиды с выделением свободных полинуклеотидов, исключающих в каждом случае применение протеолитических ферментов и фенолсодер-жащих растворов.

Проведение стадии осаждения нуклеопротеидов РНК отстаиванием из сконцентрированных ультрафильтрацией растворов позволило сокра-

<1 ц>

тить время процесса не менее, чем в 5 раз и энергозатраты на получение холода.

Разработан критерий качества перерабатываемых в KHK поли-нуклеотидов - доля белковой примеси в среде. При ее содержании до 5% переработка получаемых гидролизатов или ферментолизатов РНК требует минимальных норм расхода сорбентов (ионитов). Выявлена линейная корреляция между значением критерия и нормой расхода ионитов или количеством жидких стоков с ионообменных колонн.

На основании результатов апробации различных способов получения препаратов очищенной РНК в производственных' условиях на опытных и опытно-промышленных установках ВИЦ антибиотиков, Киришско-го БХЗ и Светлоярского БВК подготовлена нормативно-тех-ническая документация и исходные данные на проект ирование опытного производства РНК мощностью 1 т в год.

Созданы математические модели основных стадий получения поли-нуклеотидов, экстракции и гидролиза белковых веществ для создания алгоритма управления ими.

Информация о работе

Крылов, Игорь Алексеевич
доктора химических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.23

Диссертация

Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Крылов, Игорь Алексеевич, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Основы комплексной переработки биомассы промышленных микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология