Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора

Скоблов, Юрий Самойлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора"

На правах рукописи

СКОБЛОВ Юрий Самойлович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИД -5'-ТРИФОСФАТОВ, МЕЧЕННЫХ РАДИОАКТИВНЫМИ ИЗОТОПАМИ ФОСФОРА

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва - 2009

2 5 МД? 2010

003494190

Работа выполнена на предприятии «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР (г. Ташкент), в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (г. Москва), в Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (г. Москва).

Официальные оппоненты:

академик РАН,

профессор, доктор химических наук Свердлов Евгений Давидович

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна

доктор биологических наук, профессор Карпов Вадим Львович

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «7» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, ул. Миклухо-Маклая

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru Автореферат разослан « 4» марта 2010 г.

16/10.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

д.ф-м.н., с.н.с.

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в биологических исследованиях начиналось в 50-х годах XX века с применения 32Р-ортофосфата для введения радиоактивного фосфора в нуклеиновые кислоты. Исследования взаимосвязи падения инфекционности бактериофагов и радиоактивного распада фосфора-32, включившегося в состав вирусной нуклеиновой кислоты, дали мощный импульс к возникновению и развитию молекулярной биологии. Одновременно расширялись сферы применения и номенклатура соединений, меченных фосфором-32, а позднее - и фосфором-ЗЗ. На первое место среди используемых соединений, меченных фосфором-32, вышли предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот - нуклеозид-5'-трифосфаты. Развитие с середины 1970-х годов методов секвенирования ДНК значительно изменило объем и характер исследований, проводимых в области молекулярной генетики, молекулярной биологии и биотехнологии. Потребление нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-ЗЗ, в первую очередь аденозин-5'- [у-32Р] трифосфата, 2'-дезоксиаденозин-5'- [а-32Р] трифосфата и 2'-дезоксицитидин-5'- [а-32Р] трифосфата, в мире в 80-х годах достигло очень большой величины - до 10 Ки ежемесячно. Разработка флуоресцентных автоматических секвенаторов и внедрение их в рутинную повседневную практику существенно снизило потребление меченых фосфором нуклеотидов, однако, в целом, разнообразные исследования с использованием радиоактивных изотопов фосфора, остаются в методическом арсенале ученых.

Главным преимуществом использования соединений, меченных фосфором-32, в различных биологических исследованиях является высокая чувствительность методов. Теоретически чувствительность таких методов определяется молярной (удельной) активностью используемых соединений и может достигать достоверного обнаружения и измерения 10"15 моль в исследуемом образце. Высокая чувствительность в сочетании с высокой специфичностью и простотой реализации делают использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, по-прежнему, важнейшим и распространенным инструментом исследователей.

Технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-ЗЗ, имеют свои специфические проблемы и ограничения.

1. Высокая молярная активность вынуждает проводить синтезы с количеством радиоактивного изотопа 10'8 - 10'9 моля, что соответствует активности 10-100 мКи.

2. Реакции, используемые для синтеза меченых соединений, не должны приводить к неконтролируемому изотопному разбавлению нерадиоактивным фосфором-31, и местоположение радиоактивного атома должно быть строго зафиксировано.

3. Фосфор-32 и фосфор-33 являются реакторными изотопами, т.е. нарабатываются в результате облучения соответствующих мишеней в нейтронном потоке ядерного реактора, и, при получении этих изотопов с максимально высокой молярной активностью, в ходе первичной переработки облученного радиоактивного сырья, получается ортофосфорная кислота, меченная фосфором-32 или фосфором-33, соответственно. Следовательно, схемы получения соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, основываются на использовании в качестве исходного радиоактивного соединения (радиоактивного сырья) 32(33)Р-ортофосфорной кислоты.

4. При высокой объемной активности радионуклида (1-10 Ки/мл) в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать.

5. Количество синтезируемых веществ слишком мало, чтобы использовать классические методы органического синтеза (перегонка, кристаллизация, осаждение и т.д.) и существенно ограничивает возможности использования физико-химических методов анализа: ЯМР-спектрометрию, масс-спектрометрию, УФ и ИК-спектроскопию.

6. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению техники радиационной безопасности и вынуждает осуществлять технологический процесс в соответствующих защитных боксах.

Среди методов синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, можно выделить химические, химико-ферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментом для проведения сложных радиохимических синтезов. Основньм ограничением ферментативных и химико-ферментативных методов синтеза является отсутствие высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными этимологическими исследованиями.

Цель и задачи исследования. Цель исследования: создание технологий серийного производства нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, для

обеспечения исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе 100 мКи по радиоактивному сырью.

2. Разработка методов очистки целевых соединений.

3. Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта.

4. Создание ферментативной технологической базы, необходимой для реализации технологии получения нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

5. Внедрение разработанных методов в серийное производство.

6. Создание эффективного радиопротектора, обеспечивающего увеличение срока годности синтезированных меченых соединений.

Научная новизна и практическая значимость исследования. Проведенное исследование позволило создать технологию получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, основанную на использовании ферментов. Были разработаны ферментативные способы синтеза целевых соединений, очистки этих соединений с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, а также разработан и внедрен эффективный радиопротектор, замедляющий радиолитическое разрушение конечного продукта. Разработаны методы контроля качества нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, при их серийном производстве.

Внедрение полученных научных, технологических, конструкторских и организационных решений позволило создать эффективное серийное производство, а также в 1989 г. осуществить продажу части этой технологии на Кубу для организации там собственного производства [у-32Р]АТР, [а-32Р]с!АТР и [а-32Р]АТР.

Серийное производство нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, по разработанной ферментативной технологии в разные годы было реализовано на различных предприятиях: 1) на предприятии «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР, 2) в Государственном научном центре - Физико-энергетическом институте (г. Обнинск), 3) в Государственном унитарном предприятии -Институте реакторных материалов (Свердловская обл.).

Личный вклад автора заключается в формулировании и постановке целей и за, исследования, обосновании путей их решения и непосредственном выполнен экспериментов, анализе, обобщении и оформлении подученных результатов, организа1 опытно-промышленного и серийного производства на основании разработали технологических процессов.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на следукж симпозиумах и конференциях: 1) Iii-Международный симпозиум по органическ соединениям, меченным радиоактивными изотопами. 1988, Марианске Лазне, 2) Всемирный съезде по ядерной медицине и биологии. 1998, Берлин, 3) I и II Всесоюзк совещания по проблеме «Физиологически активные соединения, меченн радиоактивными и стабильными изотопами» 1985 и 1988, Звенигород.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введен литературного обзора, 6 глав, экспериментальной части, выводов, списка литературы (1 наименования). Основной текст диссертации изложен на 137 страницах, включая 14 сх 20 рисунков и 12 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Синтез нуклеозид-5'-[у-32(33)Р] трифосфатов.

Нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в га.м положении, широко используются в фундаментальных и прикладных биохимичеа исследованиях, связанных с ферментативным фосфоршшрованием, в качестве дот фосфатной группы. Поскольку основным донором фосфатных групп в клетках являе аденозин-5'- трифосфат, наиболее востребованным среди нуклеозид-5 трифосфатов является аденозин-5'-[у-32(33)Р] трифосфат ([у-32(33)Р]АТР). Более того,

32(зз)р]АТр

является промежуточным продуктом при ферментативном синтезе нуклеоз: 5'-[а-32(33'Р] трифосфатов, поэтому синтез [у-32(33)Р]АТР является ключевым.

1.1 Синтез [у-пР]АТРреакцией «обмена».

В основе технологии получения [у-32Р]АТР реакцией «обмена» лежит работа Гш и Чаппела [I.M.Glynn, J.B.Chappell BiochemJ. 1964, 90, 147], в которой было предлож( синтезировать [у-32Р]АТР из АТФ по следующей схеме (схема 1):

1) рррА+ 3-pGlyOH >ррА+ 1,3-pGlyOp

2) 1,3-pGlyOp + NADH гашшшшимтитщош™ > 3-pGla + p( (32 pi) + NAD+

схем:

На первой стадии фосфоглицераткиназа (PGK) фосфорилирует 3-фосфоглицерат (З-pGlyOH) с помощью АТР (рррА), превращая их в 1,3-дифосфоглицерат (1,3-pGlyOp) и ADP (ррА), соответственно. На второй стадии глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (GAPD) дефосфорилирует 1,3-дифосфоглицерат с одновременным восстановлением до глицеральдегид 3-фосфата (З-pGla). Именно на этой стадии, благодаря обратимости этой реакции, радиоактивный неорганический ортофосфат (32р0, добавленный в реакционную смесь, включается в состав органического соединения - 1,3-дифосфоглицерата - с образованием радиоактивного 1,3-[1-32Р]дифосфоглицерата. Радиоактивный [у-32Р]АТР синтезируется за счет обратимости реакции, которую катализирует PGK. Молярная активность [у-32Р] АТР, синтезированного этим способом, рассчитывается по формуле 1:

Амол = ш^зшт- где £ (м + м ) ATP »pi

Амол - молярная активность, Ки/ммоль Аоб - общая активность в реакции, Ки

% выхода - выход реакции (доля радиоактивного фосфата, конверсировавшего в АТР), % ~(Матр ' M»pjсуммарное количество ммолей АТР и неорганического (радиоактивного) фосфата - *pi

Формула 1.

Количество ферментов для синтеза всегда берется в значительном избытке (в 30100 раз по единицам ферментативной активности). Это обусловлено низкой концентрацией реагентов и необходимостью максимально сократить длительность реакций до достижения равновесия. Теоретически варьируя соотношение реагентов, в первую очередь молярное соотношение АТР и *р,, можно менять молярную активность в широких пределах. Однако, как следует из формулы 1, при этом будет существенно меняться выход реакции. Так, при выходе 75% (соотношение АТР : *pi =3:1) молярная активность не может превышать 1300 Ки/моль, независимо от абсолютного количества радиоактивного фосфата, взятого в реакцию. Реально, за счет примеси «холодного» 3|Р-ортофосфата во всех компонентах реакционной смеси, молярная активность зависит от количества радиоактивного фосфата, взятого в синтез, и оказывается всегда немного ниже расчетной. Оптимальным для серийного производства оказалось соотношение АТР : *pi = 2,5 :1, которое обеспечивает технологический выход на уровне 65-70% с гарантированной молярной активностью не ниже 1600 Ки/моль при загрузке 100 мКи меченого ортофосфата (см. рис.1, реакция 1). Эта технология легко масштабировалась в широком

диапазоне (вплоть до 1 Ки по радиоактивному сырью) и полностью применима как для фосфора-32, так и для фосфора-33.

Pi Рис. 1. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе аликвот

реакционных смесей синтеза ["у-32Р]АТР. Элюент 1 М КН2Р04.

1 - синтез реакцией «обмена»;

2 - синтез прямой реакцией из ADP. АТР Выход реакции, определенный с помощью

фосфоиммиджера: для реакции 1 - 68%; для реакции 2 - 95%.

1.2. Синтез [у-31Р]АТР по прямой реакции из ADP.

Технология синтеза [у-32Р]АТР по прямой реакции из ADP была разработана на основе работ Джонсона и Валсеса [Walseth T.F., Johnson R.A. Biochim Biophys Acta. 1979, 562(1): 11-31], которые предложили модифицировать предыдущую схему за счет дополнительного фрагмента цепи гликолиза (см. схему 2). По их методу глицеральдегид-3-фосфат (3-pGla) синтезируется из L-a-глицеролфосфата (3-pGly) с помощью глицеролфосфатдегидрогеназы (GPD) и триозофосфатизомеразы (ТР1).

1) СН2-ОН + NAD+ шштшШтшщтвж > CHrOH + NADH

Г I

сн-он с=о

I I

СН2-0-Н2Р0з СН2-0-Н2Р03

3-pGly DAP

2~j ÇJ-I2 ОН триозофосфатизомераза ^ СН—О

с=о сн-он

I I

СН2-0-Н2Р03 СН2-0-Н2Р0з

DAP 3-pGla

3) СН=0 + NAD++ Н3*Р04 > 0=С-0-Н2*Р0з +NADH

I I

СН-ОН сн-он

I I

СН2-0-Н2Р0з СН2-0-Н2Р0з

3-pGla 1,3-pGlyOp

4) 0=СН-0-Н2*Р03 + ррА > ОС-О-Н + *РррА

([у-2(33)Р]АТР)

СН-ОН

сн-он

CHÎ-O-HJPOJ

СН2-0-Н2Р0з

1,3-pGlyOp

3-pGlyOH

5) СН3+ NADH СНз +NAD+

С=0

СН-ОН

соон

Руг

схема 2

На первой стадии из 3-pGly с помощью GPD образуется диоксиацетонфосфат (DAP), который на второй стадии с помощью TPÎ изомеризуется в 3-pGla. На стадиях 3 и 4 последовательно синтезируется [у-32(33)Р]АТР - на схеме 2 он обозначен *РррА - с помощью, соответственно, GAPD и PGK. Для увеличения выхода [у-32(33)Р]АТР NAD+, расходующийся на стадиях 1 и 3, регенерируется лактатдегидрогеназой (LDH) на стадии 5. Несмотря на кажущуюся сложность, метод очень прост в реализации. Отдельно готовится смесь ферментов из сульфат-аммонийных суспензий индивидуальных ферментов и отдельно готовится реакционная смесь, содержащая необходимые компоненты. Затем обе смеси прибавляется к раствору радиоактивного фосфата. Синтез завершается через 10-15 мин. инкубации с выходом 95-98% и полностью применим как для фосфора-32, так и для фосфора-33. Специфичность PGK позволяет синтезировать по этой технологии практически все природные нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в гамма положении.

Однако масштабирование этой технологии имеет серьезные ограничения. Несмотря на значительный избыток ферментов, выход [у-32Р]АТР сильно зависит от загрузки радиоактивного сырья. Так, при исходной активности 32Р-ортофосфата до 1 мКи в реакционной смеси, выход реакции стабильно достигает 98%. С увеличением активности до 10 мКи выход несущественно снижается до 95%, а при активности 50 мКи - до 85-90%. С увеличением загрузки свыше 100 мКи выход снижается до 70%. Одновременно резко возрастает чувствительность всей системы к химическим микропримесям, содержащимся в исходном 32Р-ортофосфате, что также отражается на выходе продукта.

Исследование моделей реакционной смеси синтеза [у-32Р]АТР с различным количеством ортофосфата от 1 до 100 нмоль, но с одинаковым аналитическим количеством радиоактивности (0,1 мКи), показало, что в исследуемом диапазоне

применяемый избыток ферментов обеспечивает стабильный выход [у-32Р]АТР более 95 Это означает, что фактором, снижающим выход [у-32Р]АТР, является количестг радиоактивного ортофосфата, т.е. на ферментативный синтез оказывает влияш ионизирующее излучение.

Сравнивая синтез [у-32Р]АТР по реакции «обмена» и синтез [у-32Р]АТР по прямс реакции из ADP, мы предположили, что наибольшую чувствительность к ионизирующее излучению проявляет GPD. Остальные ферменты (TPI и LDH) намного стабильнее, LDH, к тому же, вообще выполняет «вспомогательную» функцию поддержан! постоянной концентрации NAD+ и напрямую в синтезе [у-32Р]АТР не участвует. Так к; GPD и TPI катализируют реакции на первой и второй стадиях. Эти реакции протекают б участия радиоактивного ортофосфата, их функция в синтезе подготовительная наработка 3-pGla. Мы несколько изменили порядок прибавления реагентов, и оказалос что, если провести инкубацию всех ферментов с компонентами реакционной смеси б радиоактивного ортофосфата, а затем добавить в реакционную смесь нейтралы« раствор 32Р-ортофосфата (pH 7.0), то выход [у-32Р]АТР стабилизируется (см. рис реакция 2). При таком порядке проведения синтеза достигается стабильный выход око 95%, с количеством радиоактивного ортофосфата вплоть до 200 мКи.

Дальнейшее развитие этого подхода привело к технологическому решет создания набора компонентов для синтеза [у-32Р]АТР - «кита» для синтеза. Состав тако кита представлен в табл.1.

Таблица 1. Состав набора компонентов для синтеза [у-32Р]АТР.

Смесь реагентов Смесь ферментов (конечная концентрация)

50 мМ Трис-HCl, pH 8,0 GPD 1 ед. акт./мл

5 мМ MgCh TPI 2 ед. акт./мл

5 мМ ДТТ G APD 3 ед. акт./мл

2 мМ 3-pGly PGK 10 ед. акт./мл

4 мМ ß-NAD+ LDH 25 ед. акт./мл

20 мМ пируват натрия

Общий объем реакционной смеси: 60 -70 мкл.

Особенность ферментативного синтеза [у-32Р]АТР заключается в значительн избытке ферментов (в 10-50 раз по количеству единиц ферментативной активности) г незначительном избытке нерадиоактивных компонентов (в 2 - 4 раза по отношению количеству ортофосфата). Соотношение ферментов,, подобранное для максимально выхода [у-32Р]АТР, в цепи катализируемых реакций характеризуется увеличен!

количества каждого последующего фермента цепи по сравнению с предыдущим. Значительный избыток пирувата и LDH необходим для эффективной регенерации NAD+ . Просто использовать значительный избыток NAD+ нельзя, потому что образующийся в реакции NADH ингибирует реакции на стадиях 1 и 3, и выход [у-32Р]АТР сразу снижается. Объединенная смесь реагентов и ферментов инкубируется при 37"С, а затем добавляется расчетное количество ADP и нейтральный (pH 7,0) раствор 32Р-ортофосфорной кислоты. Синтез завершается при 37°С инкубации через 20 мин. Более того, оказалось очень технологичным готовить единую смесь для синтеза сразу на 20-30 китов, проводить первую инкубацию, расфасовывать киты по пластиковым пробиркам и хранить их при -70°С или в жидком азоте. При этих условиях они могут храниться несколько месяцев без заметного снижения ферментативной активности. В этом варианте синтез [у-32Р]АТР заключается в добавлении к раствору 32Р-ортофосфата ADP и размороженного кита, и после инкубации в отобранной аликвоте определяется выход синтезированного [у-32Р]АТР.

1.3. Синтез [y-2P]NTP конверсией из [у-32Р]АТР.

Для различных биохимических исследований часто необходимо синтезировать [у-32P]NTP, где N - химически модифицированный нуклеозидный фрагмент. Исходным соединением является соответствующий нуклеозид-5'-дифосфат (NDP). Если фосфоглицераткиназа (PGK) не фосфорилирует модифицированный NDP, как представлено на схеме 2, то можно воспользоваться иным способом, представленным на схеме 3.

ppN + *рррА > *pppN + ррА

схема 3

NDPk - это нуклеозиддифосфаткиназа - фермент, осуществляющий обмен «концевой» у-фосфатной группой между [у-32Р]АТР и NDP. Константа равновесия этой реакции близка к 1, а низкая специфичность NDPk к гетероциклическому основанию нуклеотидов позволяет легко синтезировать этим методом широкий круг разнообразных химически модифицированных производных. На схеме 4 представлены структуры модифицированных нуклеозид-5'-дифосфатов, которые были успешно профосфорилированы с помощью NDPk и [у-32Р]АТР до соответствующих [y-32P]NTP. Выход реакции зависит от молярного соотношения [у-32Р]АТР : NDP и составляет около 90%. На рис. 2 представлен автограф ТСХ продуктов реакции синтеза некоторых модифицированных [y-32P]NTP.

Ам"°ОР адро

Схема 4

Рис. 2. Радиоавтограф ТСХ на РЕЬцеллюлозе аликвот реакционных смесей синтеза [у-32Р]ЫТР. Элюент - 1 М КН2Р04.

1 - [у-32Р]АТР (контроль);

2 - синтез [у-32Р]4,ТТР;

3 - синтез [у-32Р] АВгТР;

4 - синтез [у-32Р] АВ"ТР;

5 - синтез [у-32Р] АЫ"°ТР; 6- синтез [у-32Р]А2ТТР.

Выход продукта в реакциях 3,4,5 определялся ВЭЖХ.

Основным недостатком этого метода является необходимость использован значительного избытка N0? по отношению к [у-32Р]АТР. Очевидно, что, увеличив избыток до 20-ти кратного, можно получить выход около 95%. Однако, при такс соотношении возникают проблемы очистки целевого соединения от избыт:: непрореагировавшего ИОР. Поэтому оптимальным для этого метода являет: соотношение [у-32Р]АТР : N0? =1:9, при котором высокий выход сочетается с умеренными трудностями хроматографической очистки.

2. Синтез нуклеозид-5'-[а-32<33)Р] трифосфатов.

Синтез нуклеозид-5'-[а-32,33)Р] трифосфатов состоит из двух разных задач: синте _ нуклеозид-[5'-32(33,Р] монофосфатов и их последующего фосфорилирован.... нерадиоактивными фосфатами до конечного продукта. При этом синтез меченс_

алтр (р ;;

МММ

1 2 3 4 5 6

нуклеотида иногда проводится химически, а иногда - с помощью ферментов. Никаких существенных различий в химических или ферментативных процессах между фосфором-32 и фосфором-33 при синтезе меченных радиоактивным фосфором нуклеотидов не обнаружено, и первоначальная разработка синтеза нуклеотидов для изотопа фосфор-32 была без особых технологических трудностей использована для изотопа фосфор-33.

2.1. Ферментативный синтез нуклеозид-[5 '.32<33>р] монофосфатов.

В основе технологии ферментативного получения нуклеозид-[5'-32Ш)Р] монофосфатов мы использовали работу Валсеса [Walseth T.F., Yuen P.S., Moos M.C. Jr Methods Enzymol. 1991, 195, 29-44], в которой целевой продукт получается в две стадии (см. схему 4). Сначала нуклеозид-З'-фосфат (Np) фосфорилируется до нуклеозид 3',5'- [5'-32(33)Р] дифосфата с помощью Т4-полинуклеотидкиназы (PNK). На этой стадии донором радиоактивной фосфатной группы является [у-32(33,Р]АТР. Затем проводится дефосфорилирование «лишней» З'-фосфатной группы с помощью нуклеазы Рь

1. Np + *рррА -т-> *pNp + ррА

2. *pNp —и-> *pN + pi

схема 4.

Такой путь достаточно универсален. Все природные нуклеотиды, входящие в состав нуклеиновых кислот, легко синтезируются по этой схеме из соответствующих нуклеозид-З'-фосфатов. Полинуклеотидкиназа фага Т4 - фермент доступный и широко применяется в молекулярной биологии и биотехнологии. Так же доступны все природные нуклеозид-З'-монофосфаты, которые производятся многими фирмами. Несколько сложнее проблема с нуклеазой Рь Этот фермент, выделяемый из Pénicillium citrum, производится только фирмой Sigma, и довольно дорог. Мы исследовали возможность использования для синтеза нуклеазы Si, доступного и широко применяемого фермента, который выделяется из Aspergillus aryzae. Данные по начальным скоростям ферментативного 3'-дефосфорилирования нуклеазой Sj различных нуклеозид-3',5'-дифосфатов (pNp), приведенные в табл.2, показывают, что гидролиз 2'-дезоксинуклеозидных производных проходит примерно в 40-80 раз медленнее, чем гидролиз рибонуклеозидных аналогов.

Таблица 2. Начальные скорости гидролиза 'нуклеазой Si различных субстратов.

рАр рСр pGp pUp pdAp pdCp pdGp pTp

Скорость реакции в пмоль/мш 275 350 250 232 6,6 7,9 3,2 13,3

*- количество фермента во всех экспериментах -10 ед.нуклеазной активности.

Тем не менее, активность нуклеазы в) достаточна, чтобы использовать этот фермент вместо нуклеазы Р] для препаративного синтеза [а- 32(33)Р] сЮТР.

2.2. Синтез нукпеозид-[5 '.32(23>р] монофосфатов химическим фосфорилированием.

В силу специфики процессов наработки радиоактивных изотопов фосфор (фосфор-32 и фосфор-33) их получают в виде соответствующих ортофосфорных кислот. Стремление к максимально высокой молярной активности заставляет избегать методов синтеза, которые приводят к изотопному разбавлению радиоактивного фосфор «холодным» изотопом фосфором-31, например, используя меченный радиоактивным фосфором хлороксид фосфора РОСЬ. Поэтому исходным сырьем для химического синтеза меченых нуклеотидов также является 32(33)Р-ортофосфорная кислота. Фосфорилирование нуклеозиодов проводится в присутствии конденсирующего агента в безводной среде. Так как химическое фосфорилирование не имеет ярко выраженной селективности, то для фосфорилирования только 5'-гидроксильной группы необходимо использовать 3'-защищенные 2'-дезоксинуклеозиды или 2',3'-защищеннные рибонуклеозиды. В качестве защитной группы мы использовали ацетильную или изопропилиденовую (для рибонуклеозидов). После конденсации защитная группа удаляется и нуклеозид-[5'-

ЗДЯр]

монофосфат выделяется хроматографически. Очевидно, что такой путь синтеза более трудоемкий, чем ферментативный, и выход целевого нуклеотида значительно ниже. К тому же, выделение продукта после химического синтеза также является более сложной задачей, т.к. в реакционной смеси присутствует значительное количество побочных радиоактивных продуктов. Поэтому химический синтез мы использовали только для фосфорилирования нуклеозидов (их структуры представлены на схеме 5), которые невозможно синтезировать ферментативно, как описано выше на схеме 4.

В частности, это синтетические аналоги нуклеозидов: 2',3'-дидезокси-2',3'-дегидронуклеозиды или 3'-замещенные нуклеозиды. На примере З'-азидотимидина (А2Т) было проведено сравнение эффективности нескольких конденсирующих агентов, широко применяемых в химии фосфорилирования нуклеозидов, а именно, 2,4,6-триизопропилбензолсульфохлорид (ТР8С1), НК'-дициклогексилкарбодиимид фСС), морфолиноэтил- К-циклогексил карбодиимид (МСС), и трихлороацетонитрил (ТСЫ). Выходы целевого [32Р]-АгТМР (структура А на схеме 6) и составы реакционных смесей в этих реакциях приведены в таблице 3.

но

(X 7hy ^ № но

HoYy

,Cyt

AZT

d4T

3TC

Ade

HO^V

Gua

d2A

ACV

Схема 5.

Таблица 3. Состав продуктов реакции фосфорилирования А2Т [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов

Конденсирующий Содержание компонентов в реакционной массе, %

агент [J'P]-AZTMP (А) бис(азидотимидин)-[32Р1-дифосфат (В) Н332Р04 НП*

TPSC1 35 4 61 0

TCN 15 0 84 1

DCC 18 50 23 9

МСС 30 26 39 4

♦Неидентифицированные примеси.

Выход [32P]-AZTMP, полученный в условиях классического синтеза Симонса с использованием TCN [Symons R.H. Methods Enzymology 1974,29, 102-8], составлял 1-2%. Замена растворителя (пиридин вместо DMSO) позволила нам существенно увеличить выход продукта (до 15%) и снизить количество побочных продуктов.

Выбранное нами соотношение реагентов характерно для химического радиоактивного синтеза, в котором радиоактивная компонента используется в значительном недостатке (к 1 экв. [32Р]-фосфорной кислоты добавляли 100 экв. AZT и 10 экв. соответствующего конденсирующего агента). Столь значительный избыток нуклеозидной компоненты позволяет провести реакцию в условиях, при которых скорость реакции практически не зависит от изменения концентрации AZT. В случае применения ВЭЖХ такой избыток AZT не вызывает дополнительных потерь при выделении.

Использование 10 эквивалентов конденсирующего агента позволяет значительно повысить воспроизводимость реакции за счет нивелирования влияния качества растворителей и реактивов. Реакции проводили в среде абсолютного пиридина при 18°С. Ход реакции и выход продукта оценивали по ТСХ на силикагеле. На рис. 3 представлен радиоавтограф такого анализа с помощью пластинки Кизельгель 60 Бги. Точки отобраны в моменты времени, соответствующие максимальным выходам продукта [32Р]-А2ТМР (15 мин для ТРБО, 1 ч для ТС1Ч, 2,4 ч для БСС и 1,8 ч для МСС).

При использовании наиболее распространенного конденсирующего агента БСС, так же, как и его водорастворимой формы МСС, достигались сравнительно невысокие выходы целевого продукта [32Р]-А2ТМР (20-25%). Кроме того, в этих реакциях наблюдалось образование значительного количества (до 50%) бис(азидотимидин)-[32Р]-дифосфата (структура В на схеме 6).

О" "О О"

Н-О-Р-ОАЗТ АЗТО-Р-О-Р-ОАЗТ

о о

Схема 6.

В случае ТРвС1 количество примесей было минимально, однако выход целевого нуклеотида не превышал 30-32%.

1 2 3 4 5

Рис. 3. Радиоавтограф тонкослойной хроматограммы (Кизельгель 60 Ргя) реакции фосфорилирования АТТ [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии различных конденсирующих агентов: 1- реакция с ТР5>С1, 2- реакция с ТСЫ, 3- реакция с ОСС, 4-реакция с МСС, 5- реакция с (элюция в системе диоксан : изопропанол : вода : 25% водный аммиак 3:3:3:1).

Поскольку ни один из изученных конденсирующих агентов не показал высокой эффективности в реакции фосфорилирования AZT, была исследована возможность использования в этом качестве BrCN - активирующего агента, который ранее применяли для синтеза олигонуклеотидов [Shabarova et. al. Orig Life Evol Biosph. 1997, 27, 555-66]. Использование N-алкилморфолинов в качестве основания нам показалось неприемлемым, поскольку отмеченное авторами в этой работе расщепление третичных аминов под действием BrCN приводит к нецелевому расходованию активирующего агента и накоплению побочных продуктов. Проведение реакции в присутствии BrCN в условиях, описанных выше для других конденсирующих агентов, невозможно, так как было показано, что в среде абсолютного растворителя основным продуктом является дифосфат (В). Мы провели реакцию в 5 М водном пиридине и получили [32P]-AZTMP с выходом 46%. Выход дифосфата [32Р]- (В) составил 4%. Следует отметить, что существенное преимущество BrCN заключается в том, что избыток этого реагента может быть полностью удален упариванием в вакууме, что уменьшает потери при выделении продукта [32P]-AZTMP. Другим преимуществом BrCN является крайне высокая скорость реакции. Мы сравнили динамику реакции фосфорилирования AZT в присутствии TPSC1 и BrCN в пиридине при 20°С при оптимизированных соотношениях реагентов (рис. 4 и 5). Скорости этих реакций различаются, по крайней мере, на порядок. Для реакции с TPSC1 оптимальное время реакции 10-20 мин, а затем выход незначительно уменьшается, вероятно, за счет процесса димеризации [32Р]-А2ТМР. Для реакции с BrCN оптимальное время реакции -1 мин.

100 -г

Рис. 4. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии ТРЭД. Р,- - содержание неорганического фосфата; (2) - содержание в реакционной смеси [32Р]-АгТМР; (3) -содержание в реакционной смеси бис(азидотимидин)-[32Р]-дифосфата.

: 60 ' 50

30 20 I Ю 0

0 1 2 4 6 8 10

Врамя, мин

Рис. 5. Динамика реакции фосфорилирования в присутствии ВгСЫ. Р1 - содержание неорганического фосфата; (2) - содержание [32Р]-АгТМР; (3) - содержание бис(азидотимидин)-[32Р]-дифосфата.

Фосфорилирование других нуклеозидных аналогов в присутствии ВгСИ также протекает достаточно быстро (см. Табл.4), и глубина прохождения реакции мало зависит от увеличения времени реакции. На примере фосфорилирования АСУ хорошо видно, что даже значительное увеличение длительности реакции не увеличивает выход целевого продукта.

К сожалению, такой метод фосфорилирования нуклеозидов не является селективным в отношении гидроксильных групп углеводного фрагмента (см. Табл.5). Он требует введения защитных групп на 3' (или на 2' и 3') гидроксильные группы нуклеозидов перед фосфорилированием с последующим удалением защитных групп после окончания реакции и для фосфорилирования природных нуклеозидов нецелесообразен.

Таблица 4. Состав продуктов реакции фосфорилирования нуклеозидных аналогов [32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии ВгШ.

Нуклеозид Соотношение продуктов фосфорилирования, % Выход 5'-монофосф ата, %

5'-монофосфат 1 5'-дифосфат 2 биснуклеозид -дифосфат 3 Ам*** Р|

дгт 55 3 14 11 10 62

(14Т 58 4 10 12 9 65

зтс 53 3 5 9 24 59

ё2А 46 1 11 18 20 50

АСУ* 7 менее 1% менее 1% 82 -10 7

АСУ** 9 менее 1% менее 1% менее 1% -90 9

*время реакции 4 ч;

** время реакции 24 ч;

*** Ам - побочный продукт (фосфоамид).

Таблица 5. Состав продуктов реакции фосфорилирования нуклеозидов

[32Р]-ортофосфорной кислотой в присутствии BrCN.

Нуклеозид Соотношение продуктов фосфорилирования, %

5'-монофосфат 3'-монофосфат 3',5'-дифосфат

тимидин 53 44 3

2'-дезоксиуридин 50 45 5

аденозин 39 60* 1**

смесь 2'- и 3'-монофосфатов;

"смесь 2',5' и 3',5'- дифосфатов

Тем не менее, такой метод имеет свои преимущества. При фосфорилировании ортофосфорной кислотой в присутствии BrCN не затрагиваются аминогруппы нуклеозида, и, следовательно, нет необходимости использовать защиту NH2-rpynn. Также возможно фосфорилирование без введения защитных группировок модифицированных нуклеозидов, содержащих тиагруппы и двойные связи.

3. Ферменты для фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов.

Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-5'-монофосфатов в клетках обеспечивается группой фосфотрансфераз, которая получила собирательное название нуклеозидмонофосфаткиназы или нуклеотидкиназы. Строгое название по Номенклатуре ферментов Международного биохимического союза - АТР: нуклеозид-5'-монофосфат фосфогрансферазы, (КФ 2.7.4.4.). В клетках прокариот и эукариот эти ферменты специфичны к гетероциклическому основанию акцептора фосфатной группы и слабо различают рибозный и 2'-дезоксирибозный фрагмент нуклеотида. Следовательно, для фосфорилирования природных нуклеотидов необходимы 5 ферментов: аденозинмонофосфаткиназа (АМР-киназа), гуанозинмоиофосфаткиназа (GMP-киназа), цитидинмонофосфаткиназа (СМР-киназа), тимидинмонофосфаткиназа (ТМР-киназа) и уридинмонофосфаткиназа (UMP-киназа). Коммерчески доступным препаратом является только АМР-киназа. Коммерческий препарат GMP-киназы мало пригоден к использованию в синтезе [а-32(33,Р] GTP, т.к. часто загрязнен примесями фосфатаз и других нуклеотид-разрушающих ферментов. Для фосфорилирования пиримидиновых нуклеотидов существует коммерческий препарат под названием «нухлеозидмонофосфаткиназа», который представлял собой сульфат-аммонийную

фракцию суммы нуклеозидмонофосфаткиназ переменного состава. Колебания в соотношении целевых ферментативных активностей и значительные количества примесей нуклеотид-разрушающих ферментов делают этот препарат крайне ненадежным при использовании в препаративном синтезе [а-32<33,Р] NTP. Поэтому нами была разработана технология выделения индивидуальных нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli с чистотой, необходимой для ферментативного синтеза [ct-32(33)P] NTP.

3.1. Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli.

Источником нуклеозидмонофосфаткиназ была выбрана E.coli MRE-600. В дальнейшем было обнаружено, что можно успешно использовать E.coli В. Колебания в уровне содержания различных нуклеозидмонофосфаткиназ в биомассе зависят, прежде всего, от условий выращивания. При этом наибольшая зависимость уровня ферментативной активности лизата от условий выращивания E.coli была обнаружена для ТМР-киназы. Активность ТМР-киназы в лизатах колебалась более, чем в 10 раз, в то же время для остальных нуклеозидмонофосфаткиназ такая зависимость менее характерна.

Очистка нуклеозидмонофосфаткиназ включала следующие стадии:

1 .Разрушение биомассы E.coli ультразвуком и осветление лизата.

2.0саждение нуклеиновых кислот полиэтиленимином и сульфат-аммонийное фракционирование.

З.Обессоливание сульфат-аммонийной фракции.

^Фракционирование хроматографией на DEAE-целлюлозе.

5.Фракционирование аффинной хроматографией на биогелях со специфическими красителями.

6.Концентрирукяций диализ.

Три первых стадии являются традиционной процедурой лизиса клеток и подготовки белкового раствора к хроматографическому фракционированию. Ионообменная хроматография позволила разделить все нуклеозидмонофосфаткиназы между собой, кроме АМР-киназы и UMP-киназы, проводя элюцию ферментов линейным градиентом концентрации KCl (см. рис 6.).

А&О Е, отн.сд.акт,

[KCl], м

0,4-

0,6-

40 60 80 X» фракций

Рис. 6. Профиль хроматографического разделения NMPk Е. coli на DEAE-целлюлозе.

-поглощение элюата при длине волны 280 нм;

-----концентрация KCl;

----ферментативная активность NMPk E.coli;

1 - АМР-киназа; 2 - UMP-киназа; 3 - GMP-киназа; 4 - ТМР-киназа; 5 - СМР-киназа.

Дальнейшую очистку ферментов проводили с использованием аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих биоспецифические красители («dye-ligand chromatography»). Фракции, содержащие АМР-киназу и UMP-киназу, фракционировали хроматографией на биогеле Blue А (цибакроновый голубой). При этом АМР-киназная активность сорбировалась на колонке и элюировалась линейнам градиентом KCl (см. рис.7а). UMP-киназная активность не сорбировалась на биогеле Blue А, поэтому элюат с несорбировавшейся UMP-киназой фракционировали на колонке с биогелем Red А (проционовый красный) и также элюировали градиентом концентрации KCl (см. рис.7б).

Для очистки СМР-киназы и ТМР-киназы после ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе фракции, содержащие соответствующие активности, хроматогрфировали на колонке с биогелем Blue А. Типичный профиль элюции СМР-киназы градиентом концентрации KCl представлен на рис.7в.

Рис.7а. Профиль хроматографии АМР-киназы и UMP-киназы E.coli на на колонке с биогелем Blue А.

-поглощение элюата при длине волны 280 нм

-------концентрация KCl;

---- активность ферментов

1 - АМР-киназа: 2 - UMP-киназа

Рис.76. Профиль хроматографии UMP-киназы E.coli на колонке с биогелем Red А.

- поглощение элюата при длине волны 280 нм;

- - - - концентрация KCl; ----активность UMP-киназы

А280 Е, отн.ед акт. 1.0. .100

[KCl], м

3,0.

0.5 50

10 20 30 40 номера фракций

Рис.7в. Профиль хроматографии СМР-киназы E.coli на колонке с биогелем Blue А.

- поглощение элюата при длине волны 280 нм;

-----концентрация KCl;

----активность СМР-киназы.

Для очистки GMP-киназы после ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе фракции, содержащие соответствующую активность, хроматографировали на колонке с биогелем Green А.

После концентрирующего диализа растворы очищенных ферментов в 50% глицерине могли храниться при -20°С несколько лет без заметного снижения активности.

Основным критерием пригодности нуклеозидмонофосфаткиназ для препаративного синтеза [а-32(33)Р] NTP или [а-32(33)Р] dNTP является их способность разрушать (гидролизовать) нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфаты. При инкубации с соответствующим нуклеотидом, меченньм фосфором-32, с молярной активностью более 1000 Ки/моль препараты АМР-киназы, СМР-киназы и ТМР-киназы не разрушали [а-32Р]АМР, [а-32Р]СМР и [а-32Р]ТМР в течение 12-18 часов. Использование всех очищенных таким способом ферментов для синтеза соответствующих [а-32Р] NTP показало, что даже длительные инкубации по 18 часов не приводят к значительному накоплению 32Р-ортофосфата. Энзимологическая чистота выделенных ферментов приведена в табл. 6.

Таблица 6. Энзимологическая чистота нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Степень Активность нуклеотид-

Фермент хроматографической дефосфорилирующих

очистки ферментов, %

1 АМР-киназа 30 0,010

2 СМР-киназа 180 0,020

3 UMP-киназа 60 0,010

4 GMP-киназа 130 0,001

5 ТМР-киназа 90 0,005

Степень хроматографической очистки для каждого фермента дана по отношению к активности фермента во фракции после сульфат-аммонийного фракционирования. Точное количественное измерение активности выделяемых ферментов в клеточном лизате затруднительно из-за высокой активности фосфатаз и нуклеотид-разрушающих ферментов, содержащихся в гомогенате. Следует отметить, что все выделенные вышеизложенным способом ферменты не являлись чистыми белками и содержали значительное количество балластного белка. Например, для очистки СМР-киназы до чистоты не ниже 90% по электрофорезу в ПААГ, потребовалось провести дополнительно гельфильтрацию на колонке LKB Ultrapac TSK G 3000 SWG и ионообменную хроматографию на колонке DEAE-Toyopearl 650 М. Окончательно СМР-киназа была очищена в 2650 раз, выход по активности составил около 10%. Для технологических целей такая высокая чистота не требуется, и подобную глубокую очистку нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli не проводили, считая ее нецелесообразной.

3.2. Свойства нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Для использования нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в препаративном синтезе [а-32Ш)Р] NTP и [а-32(33)Р] dNTP необходимо знать основные свойства ферментов: оптимум pH и температуры, необходимые для активности кофакторы, ионы металлов, стабильность при хранении, оптимальные концентрации субстратов, возможные ингибиторы. Особенно важно определить субстратную специфичность ферментов и их чувствительность к ионизирующему излучению в растворе, т.к. эти факторы определяют возможность использования фермента и возможный масштаб синтеза меченого соединения. Температурный оптимум для всех выделенных ферментов бьи близок и находился в интервале 35-40°С.

Несмотря на некоторые различия, все ферменты проявляют практически максимальную активность в интервале рН 7,5-8,0 (см. рис 8).

АМР-киназа

UMP-киназа

45 6789 10 45 6 789 10 45 6789 10 pH

ТМР-киназа

СМР-киназа

-1-i-,-,-,--L-Ц-,-------1---I—

45 6789 10 4567 89 10 pH

Рис.8. Влияние pH на ферментативную активность NMPk E.coli.

Для активности всех исследуемых NMPk E.coli абсолютно необходимы катионы двухвалентных металлов, максимальная активность проявляется ферментами в присутствии 5мМ MgCh (см. табл. 7). В присутствии 0,5 мМ ЕДТА активность ферментов полностью подавлялась, однако процесс обратимый, и после добавления MgCb до 5мМ концентрации ферментативная активность восстанавливалась. ДТТ, ß-меркаптоэтанол, N-этилмалеилимид не оказывали заметного влияния на активность NMPk E.coli.

Специфичность нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в отношении доноров фосфатной группы проявляется в явном предпочтении АТР и dATP всем остальным нуклеозид-5'-трифосфатам (см. табл.8), однако, предпочтение явно не является абсолютным, и различные ферменты проявляют различную способность к замене АТР на СТР или dGTP. Для технологических целей важно, что существует возможность полноценной замены АТР на dATP в качестве донора фосфата, поскольку это расширяет

возможности синтеза [а-32(33)Р] NTP и [а-32(33)Р] dNTP.

Таблица 7. Влияние катионов двухвалентных металлов на активность нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli *.

Ферменты Мп7+ Со2+ Са

Аденилаткизаза 100% 100% 46% 70%

Гуанилаткиназа 100% 95% 70% 85%

Цитидилаткиназа 100% 100% 93% 50%

Уридилаткиназа 100% 65% 45% 20%

Тимидилаткиназа 100% 72% 40% 1%

•Максимальная активность каждого фермента, проявившаяся в присутствии 5мМ

MgCb, взята за 100%.

Таблица 8. Доноры фосфатной группы для нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Донор Относительная скорость фосфо рилирования, %

АМР-киназа СМР-киназа GMP-киназа ТМР-киназа UMP-киназа

АТР 100 100 100 100 100

dATP 75 97 78 84 50

СТР 22 9 13 35 0

dCTP 0 4 7 16 0

GTP 0 9 2 3 0

dGTP 0 14 0 0 0

ТТР 8 10 5 5 2

UTP 1,5 6 3 2 2

Специфичность нуклеозидмонофосфаткиназ Е.соИ в отношении акцепторов фосфатной группы существенно иная (см. табл.9). Наблюдается строгая специфичность к гетероциклическому основанию нуклеотида, что ограничивает широкое использование этих ферментов для фосфорилирования модифицированных нуклеотидов.

Таблица 9. Акцепторы фосфатной группы для нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

Акцептор Относительная скорость фосфо рилирования, %

АМР-киназа СМР-киназа GMP-киназа ТМР-киназа UMP-киназа

AMP 100 0 0 0 0

dAMP 50 0 0 0 0

CMP 0 100 0 0 0

dCMP 0 68 0 0 0

GMP 0 0 100 0 0

dGMP 0 0 75 0 0

TMP 0 0 0 100 0

UMP 0 0 0 0 100

dUMP 0 0 0

Исследование зависимости скоростей реакций фосфорилирования, катализируемых соответствующими NMPk E.coli, от концентрации субстратов показало, что для АМР-киназы высокие концентрации AMP (или dAMP) снижают скорость реакции

фосфорилирования, в то же время для АТР, который является донором фосфатной группы, такой эффект не обнаружен (см. рис.9). Для СМР-киназы заметно ингибирование при высокой концентрации АТР, а акцепторы фосфатной группы СМР и dCMP ингибирующего эффекта при высоких концентрациях не проявляют (см. рис.10). Константы Михаэлиса для СМР-киназы и АМР-киназы приведены в табл.10.

Таблица 10. Константы Михаэлиса для СМР-киназы и АМР-киназы.

Субстрат СМР-киназа, мкМ АМР-киназа, мкМ

АТР 78 300

AMP - 70

dAMP - 60

СМР 300 -

dCMP 250

6,4 [S],mM

0,1

0,2 0,3 0,4 [S], мМ

Рис.9. Зависимость скорости реакции, катализируемой АМР-киназой от концентрации субстратов:

1 - переменная концентрация АТР;

2 - переменная концентрация AMP;

Рис.10. Зависимость скорости реакции, катализируемой СМР-киназой от концентрации субстратов:

1 - переменная концентрация АТР;

2 - переменная концентрация СМР;

Подробные кинетические исследования для остальных NMPk E.coli не проводили, однако, экспериментально было установлено, что при концентрациях субстратов до 200 мкМ ингибирование соответствующих ферментативных реакций не обнаружено. Это означает, что в условиях реального препаративного синтеза [а-32(33)Р] NTP, когда

концентрации субстратов не превышают 200 мкМ, эффектами ингибирования ферментов избыточной концентрацией субстрата можно пренебречь.

Исследование стабильности нуклеозидмонофосфаткиназ Е.соН в условиях радиоактивного синтеза [а-32(33)Р] МТР подробно проводились для АМР-киназы. Длительная ишсубация фермента с радиоактивными соединениями приводит к потере ферментативной активности, однако, в течение 1-3 часов активность сохраняется даже при объемной активности более 3000 мКи/мл (см. рис.11). Такая стабильность фермента означает, что для синтеза в масштабе 100 мКи фосфора-32 эффектом радиационной инактивации можно пренебречь.

il100

_I_I_1_I_>

50 100 200 t, мин.

Рис. 11. Инактивация АМР-киназы Е.соН ионизирующим излучением фосфора-32. Ферментативная активность определялась спектрофотометрически после прединкубации: 1 - Н332Р04 4 Ки/мл; 2- [5'-32Р] AMP 3,5 Ки/мл; 3 - Н332Р04 4 Ки/мл + 50 мкМ AMP.

Снижение активности АМР-киназы под действием ионизирующего излучения фосфора-32 в ходе ферментативной реакции представлено на рис.12. Ферментативная активность определялась спектрофотометрически в присутствии радиоактивных субстратов - [5'-32Р] AMP или [у-32Р] АТР.

Снижение активности фермента наблюдается только при очень высокой объемной активности радионуклида (около 1000 мКи/мл). Для объемной активности радионуклида менее 100 мКи/мл существенных изменений ферментативной активности АМР-киназы не обнаружено. Некоторые различия инактивирукяцего воздействия [5'-32Р] AMP (линия 1) и [у-32Р] АТР (линия 2) невозможно однозначно объяснить без специальных исследований.

Эти различия могут определяться как природой субстратов, так и артефактными примесями, содержащимися в высокомеченных субстратах.

Рис. 12. Снижение активности АМР-киназы под действием 32Р-радионуклида. Начальная концентрация AMP и АТР в реакционной смеси по 67 мкМ:

oN Я Н X

£ D.

1 - [5'-32Р] AMP и АТР; 2-[у-32Р] АТР и AMP.

л н

о я ш s

Остальные NMPk E.coli были протестированы на устойчивость к действию ионизирующего излучения фосфора-32 только по изменению ферментативной активности в присутствии 100 мКи фосфора-32. Для всех исследованных ферментов снижения ферментативной активности не обнаружено.

Таким образом, было определено, что для масштаба синтеза 100 мКи по радиоактивному сырью инактивирующим действием ионизирующего излучения на ферментативную активность NMPk E.coli можно пренебречь.

3.3. Свойства дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5.

В середине 60-х годов группой Бессмана было опубликовано сообщение [M.J.Bessman, S.T.Herriot, M.J.V. Bibber Огт, J.Biol.Chem. 1965, 240(1),439-445] о ферменте бактериофага Т5 - дезоксинуклеозидмонофосфаткиназе, способной фосфорилировать все природные 2'-дезоксинуклеозидмонофосфаты, Правда, количество фермента, которым располагала эта группа исследователей, было весьма ограничено, поэтому в этой работе утверждалось, что рибонуклеотиды фосфорилируются этим ферментом очень плохо. Позднее коллеги из Пущинского биологического научного центра РАН смогли проклонировать и получить эффективную экспрессию гена дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 (dNMPk Т5), а также наработать фермент в препаративных количествах [G.V. Mikoulinskaia et al. Protein Expr. Purif 2003, 27, 195-201]. Это позволило нам подробно охарактеризовать субстратную специфичность

фермента. Основные кинетические параметры - константы Михаэлиса (Км) и каталитические константы (Ккет) - приведены в табл. 11. Хотя скорость фосфорилирования dNMP выше скорости фосфорилирования NMP, тем не менее, скорости фосфорилирования AMP, CMP и GMP достаточно высокие для измерения спектрофотометрическим методом. Следовательно, появляется реальная возможность замены нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli одним ферментом.

Таблица 11. Субстратные свойства Т5-киназы.

нуклеотид K„, мМ Ккат> CCK Ккат/ Км

dAMP 0,275 58 211

AMP 0,367 31 84

dGMP 0,267 43,2 162

GMP 0,81 0,29 0.33

dCMP 0,037 32,8 886

CMP 0,39 11 28

TMP 0,190 38,7 204

dUMP 4,2 10 2.4

ATP 0,042

Весьма удобным оказалось, что условия, оптимальные для активности dNMPk Т5 (pH, концентрация ионов Mg2+, концентрация KCl), совпадают с условиями действия NMPk E.coli.

К сожалению, скорость фосфорилирования UMP оказалась чрезвычайно низкой -примерно в 20 ООО раз ниже скорости фосфорилирования TMP. Собственно, сам факт такой реакции удалось установить только благодаря высокой чувствительности метода с использованием [5'-32P]UMP с молярной активностью более 1000 Ки/ммоль (см. рис.13).

Рис. 13. Радиоавтограф хроматограммы на PEI-целлюлозе аликот реакции фосфорилирования [5'-32P]UMP с помощью dNMPk Т5. Элюент -0,5 М KCl. Состав реакционной смеси: 50 мМ Трис-НС1 рН=7,6; 5 мМ MgCl2; 50 мкМ АТР; 0,1 М KCl; 2 мкКи [5'-32P]UMP с молярной активностью 1000 Ки/ммоль и 2 ед. акт. фермента. Инкубация при 37°С.

1 - 0 мин. инкубации (контроль);

2-15 мин. инкубации;

3-60 мин. инкубации.

Доля [а -32P]UDP в аликвоте 3, определенная с помощью фосфоиммиджера составила 10% от общей активности в реакционной смеси.

Таким образом, использование этого фермента для синтеза [a-32P]UTP не представляется целесообразным.

Устойчивость dNMPk Т5 к инактивирующему действию ионизирующего излучения на ферментативную активность оказалась аналогичной устойчивости NMPk E.coli.

3.4. Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-[5'-32<33>Р] монофосфатов.

Препаративное ферментативное фосфорилирование [5'-32(33,Р] (d)NMP проводили с помощью NMPk E.coli и пируваткиназы (РК) - фермента, который неспецифически фосфорилирует NDP до NTP. Реакция синтеза [a-32(33,P] (d)NTP протекает в две стадии и представлена на схеме 7.

1. *pN + рррА p*pN + ррА

2. p*pN + PEP -т-> pp*pN + Руг

схема 7.

Реакция 1 на схеме 7 отражает фосфорилирование нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов до соответствующих дифосфатных производных с помощью NMPk E.coli. Реакция 2 показывает завершающую стадию фосфорилирования, которая осуществляется с помощью пируваткиназы (РК) и фосфоенолпирувата (PEP) до соответствующих трифосфатных производных. Пируваткиназы из различных источников имеют одинаковую специфичность - они фосфоршгаруют нуклеозид-5'-дифосфаты до нукдеозид-5'-трифосфатов, слабо различая производные рибозы и 2'-дезоксирибозы, а пуриновые производные в 7-10 раз эффективнее, чем пиримидиновые. Поэтому для фосфорилирования всех 8 основных природных нуклеотидов были использованы 5 NMPk E.coli: АМР-киназа, GMP-киназа, СМР-киназа, UMP-киназа и ТМР-киназа, а также пируваткиназа из мышц кролика. Оптимальные условия для действия NMPk E.coli и РК достаточно близки, и это позволило унифицировать состав реакционной смеси для ферментативного фосфорилирования (табл.12). Ферменты для синтеза берутся в значительном избытке (20-100 кратный избыток по количеству единиц ферментативной активности). PEP также берется в 30-100 кратном избытке. В то же время избыток АТР по отношению к меченому нуклеотиду сравнительно небольшой (в 3-10 раз). Это упрощает выделение целевого продукта и его очистку от АТР. Такая схема фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов универсальна, однако имеется одно ограничение -фосфорилирование [5'-32(33)Р] AMP. Очевидно, что при синтезе [а-32(33,Р] АТР по этой схеме происходит изотопное разбавление за счет донора фосфатной группы -«холодного» АТР.

Таблица 12. Состав реакционной смеси для фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33,Р]

монофосфатов.

Компоненты универсальной реакционной смеси Ферменты для синтеза

50 мМ Трис-HCl pH 7,8 0,1 ед. акт. соответствующей NMPk

5 мМ MgCl2 0,5 ед. акт. РК

0,1 МКС1

ЮмМРЕР

50 мкМ АТР

Общий объем: 100 мкл Общий объем: 20 - 30 мкл

Например, фосфорилирование [5'-32Р] AMP в количестве 5 мКи по этой схеме снижает молярную активность целевого [а-32Р] АТР почти в 5 раз - до 1000 Ки/моль. Чтобы избежать снижения молярной активности, вместо АТР в качестве донора фосфатной группы можно использовать dATP, т.к. при хроматографической очистке конечного продукта [а-32Р] АТР хорошо отделяется от dATP.

Таким образом, для ферментативного фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33,Р] монофосфатов к меченому нуклеотиду необходимо добавить компоненты универсальной реакционной смеси и соответствующую смесь ферментов NMPk и РК. Выход реакции около 90%.

Дезоксинуклеозидмонофосфаткиназа бактериофага Т5 (dNMPk Т5) была успешно использована для синтеза [а-32(33)Р] dNTP, а также для синтеза [а-32Р] АТР, [а-32Р] GTP и [а-32Р] СТР. Все компоненты и условия реакций синтеза при использовании dNMPk Т5 были аналогичны компонентам и условиям реакций синтеза с использованием NMPk E.coli. В то же время для синтеза [а-32(33)Р] UTP этот фермент оказался непригоден.

4. Очистка нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Способ выделения синтезированных меченых нуклеотидов из реакционной смеси зависит от состава реакционной смеси и требований к чистоте выделяемого соединения. Например, [у-32Р]АТР, синтезированный реакцией «обмена», обычно выделялся ионнообменой хроматографией. Мы использовали колоночную хроматографию на PEI-целлюлозе с градиентной элюцией бикарбонатом триэтиламмония (ТЕАВ). Одноразовые колонки объемом 1 мл позволяли четко отделять [у-32Р]АТР от других радиоактивных продуктов (см. рис.13).

У этого метода было два серьезных недостатка. Во-первых, [у-32Р]АТР получался в объеме 3,5-4 мл раствора бикарбоната триэтиламмония высокой концентрации (около 0,7М), и после выделения приходилось удалять соль лиофилизацией или упариванием под вакуумом. Во-вторых, несмотря на высокую радиохимическую чистоту (более 95%), [у-32Р]АТР, выделенный таким образом, содержал значительное количество нерадиоактивных химических примесей, которые часто снижали качество конечного продукта. Для выделения [а-32(33)Р] сШТР хроматографическая очистка на РЕ1-целлюлозе оказалась хуже, т.к. чувствительность реакций, в которых использовались [а-32<33)Р] сШТР, к химическим примесям очень высокая, и чистота целевого продукта после такой очистки недостаточна.

хроматографией на РЕ1-целлюлозе в линейном градиенте концентрации ТЕАВ.

Объем колонки - 1,0 мл; объем градиента-20 мл(от 0 до 1М); скорость элюции - 12 мл/час,

-показания проточного детектора радиоактивности,

-----концентация ТЕАВ.

Следующим шагом в повышении чистоты меченых нуклеотидов стало применение для их очистки ионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В качестве сорбента использовался аминопропилсиликагель. Сравнение различных марок: ЗИобогЬ, ЗИосЬгот, ПсЬтобоЛ, гогЬах и др. показало, что для выделения нуклеотидов

градиентной элюцией бикарбоната триэтиламмония различия в качестве сорбента несущественны. Гораздо важнее - качество упаковки хроматографической колонки и качество раствора ТЕАВ. Химическая чистота меченых нуклеотидов, выделенных ионообменной ВЭЖХ, существенно возрастает, и заметно снижается количество нерадиоактивных примесей, ингибирующих ферментативные реакции с использованием [а-32(33,Р] dNTP.

Однако, этот способ очистки имел несколько существенных недостатков. Во-первых, меченые нуклеотиды элюировались с колонки раствором ТЕАВ с концентрацией 0,4-0,6 М (в зависимости от природы гетероциклического основания нуклеотида), и, по-прежнему, требовалась операция по удалению ТЕАВ. Во-вторых, концентрированный раствор ТЕАВ достаточно быстро разрушает силикагельный сорбент. В среднем, одна колонка выдерживает 10-15 хроматографий, после чего резко увеличивается необратимая сорбция радиоактивно материала на сорбенте и ухудшается разделение. Колонки для ВЭЖХ - достаточно дорогостоящие комплектующие, и такой режим их использования делает весь процесс слишком затратным. В-третьих, использование концентрированного раствора ТЕАВ (1 М) осложняет стандартизацию процесса, т.к. этот раствор нестабилен, быстро «теряет» С02 в процессе работы, что приводит к защелачиванию раствора. Более того, стандартный процесс подготовки растворов к ВЭЖХ включает дегазацию растворов, а для раствора ТЕАВ эта процедура бессмысленна и губительна.

Все эти недостатки удалось преодолеть при переходе на обратнофазовую хроматографию. Для повышения сорбции нуклеотидов на обратной фазе С-18 мы использовали ион-парный вариант хроматографии. В качестве источника противоиона мы попытались использовать различные алкиламмонийные производные: триметиламмоний ацетат, триэтиламмоний бикарбонат, трибутиламмоний хлорид и тетраэтиламмоний хлорид.

Трибутиламмоний и тетраэтиламмоний оказались весьма эффективными противоионами и способствовали высокой сорбции нуклеозид-5'-монофосфатов и их дифосфатных и трифосфатных производных. Однако, из-за сильной сорбции снижалась селективность хроматографического разделения, т.к. нуклеотидные производные элюировались этанолом или ацетонитрилом высокой концентрации. Снижение концентрации противоионов в элюирующем буфере не приводило к улучшению хроматографического разделения нуклеотидов. Триметиламмоний оказался недостаточно эффективным для сорбции всех исследованных нуклеотидов, и от него также пришлось отказаться.

Наиболее эффективным оказался триэтиламмоний - 50 мМ раствор бикарбоната или ацетата позволял проводить хроматографическую очистку в градиенте концентрации этанола или ацетонитрила. Так как удаление ацетата триэтиламмония сложнее, чем бикарбоната, то оптимизация условий проводилась для градиента 50 мМ ТЕАВ - 70% этанол. Учитывая незначительные молярные количества компонентов ферментативных реакционных смесей, размер хроматографических колонок - 4x150 мм - оказался достаточным для качественного разделения продуктов реакции. Типичные профили хроматографического выделения [у-32Р]АТР и [а-32Р] ёАТР приведены на рис.14.

Рис.14. Хроматографическая очистка [a-32P]dATP (А) и [у-32Р]АТР (Б) обратно-фазовой ВЭЖХ. Колонка 4x150 мм, 5 мкм, Lichrosorb С-18, градиентная элюция 70% этанолом со скоростью 0,5 мл/мин.

1 - профиль элюции по УФ-поглощению при длине волны 254 нм;

2 - профиль элюции по проточному детектору радиоактивности.

Регистрация элюата проточными детекторами по УФ-поглощению и по радиоактивности значительно облегчает идентификацию целевых продуктов и делает всю процедуру очистки достаточно рутинной.

Очищенные обратно-фазовой хроматографией меченные фосфором нуклеотиды характеризуются высокой радиохимической чистотой - не ниже 97%. Особенно следует подчеркнуть, что такие препараты не содержат химических примесей, ингибирующих ферментативные реакции с участием [а-32(33)Р] Ш"Р и [а-32(33)Р] сЮТР.

В настоящее время при серийном производстве нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, их очистка проводится обратно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме, как описано выше. Такой способ очистки обеспечивает необходимые параметры качества конечной продукции и широко применяется в лабораторной практике.

5. Радиопротектор для 32(33)Р-меченых нуклеотидов.

Срок годности нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, весьма ограничен и определяется не только химической нестабильностью полифосфатного фрагмента или периодом полураспада радионуклида. Основным фактором нестабильности нуклеотидов, меченных фосфором с высокой молярной активностью, является радиолиз. Под радиолизом понимают процесс изменения химических соединений под воздействием совокупности различных химических реакций, индуцированных ионизирующим излучением. Различают первичный и вторичный радиолиз. Первичный радиолиз вещества - это химические превращения, возникающие в молекулах при непосредственном взаимодействии с ионизирующим излучением (а-, (5-или у- частицами). Вторичный радиолиз вещества. - это химические превращения, индуцированные активированными продуктами первичного радиолиза растворителя. Большинство реакций вторичного радиолиза по своей природе являются свободнорадикальными и протекают по длинной цепи различных превращений. Очевидно, что из-за крайне низкой концентрации меченых нуклеозид-5'-трифосфатов в растворах, вклад первичного радиолиза в их нестабильность очень незначителен. Поэтому, для снижения радиолиза меченых нуклеозид-5'-трифосфатов в растворах, необходимо подавить свободнорадикальные реакции продуктов радиолиза растворителя. Среди известных радиопротекторов - «ловушек свободных радикалов» - часто использовались меркаптаны, политиоловые соединения, замещенные амины, нитрилы, полициклические ароматические и гетероциклические соединения, содержащие карбонильные (альдегидные) или карбоксильные группы, а также соединения, с сопряженными ненасыщенными связями. Однако, не смотря на широкий выбор, есть достаточно жесткие ограничения:

1. Радиопротектор должен хорошо растворяться в воде, т.к. для биохимических

исследований основным растворителем является вода.

2. Сам радиопротектор не должен оказывать влияния на изучаемые биохимические процессы.

3. Продукты радиолиза радиопротектора не должны оказывать влияния на изучаемые биохимические процессы.

4. Желательно, чтобы радиопротектор был окрашен, что делает работу с такими растворами удобной.

Мы предложили использовать в качестве радиопротектора цианкобаламин (витамин В12) в виде водного раствора. Мы сравнили несколько известных радиопротекторов и предложенный нами B!2 по их эффективности. В качестве модели для изучения эффективности радиопротектора использовался раствор [у-32Р]АТР с высокой молярной активностью (более 5000 Ки/ммоль), который хранился при + 4°С. Анализ изменений радиохимической чистоты (РХЧ) раствора [у-32Р]АТР во времени позволяет сравнить эффект «защиты» целевого соединения от радиолитического разрушения. Определение РХЧ проводилось методом ТСХ на PEI-целлюлозе. Типичная хроматограмма продуктов радиолитического разрушения [у-32Р]АТР приведена на рис. 15.

Рис. 15. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе аликвот препаратов [у- 2Р]АТР после 48 часов хранения при +4°С в присутствии различных радиопротекторов. Исходная объемная активность всех препаратов - 12 мКи/мл (444МБк/мл). Элюент -1 M КН2Р04.

1 - В присутствии В12;

2 - в бидистиллированной воде (без добавок);

3 - в присутствии 10 мМ DTT;

4 - в присутствии 50% этанола;

5 - в присутствии 50 мМ Трис-HCl, рН=8,0.

Обращает на себя внимание появление значительного количества неидентифицированного продукта (или продуктов) с хроматографической подвижностью более низкой, чем АТР (на рис.15 он обозначен «polyP»), Этот продукт радиолиза, получивший в литературе название «полифосфат», чрезвычайно важен для качества целевых меченых нуклеотидов, т.к. именно при его появлении возникают крайне нежелательные эффекты ферментативного ингибирования и высокой неспецифической сорбции. Поэтому в параметрах качества меченных радиоактивными изотопами нуклеотидов обязательно жестко регламентируется максимально допустимое содержание «полифосфатной фракции» - не более 1%. В табл. 11 приведены данные по снижению РХЧ [у-32Р]АТР в ходе хранения в присутствии некоторых радиопротекторов при +4°С.

Сравнивая продукты радиолиза [у-32Р]АТР, накопившиеся при хранении в присутствии разных радиопротекторов, видно, что в воде быстро накапливается «полифосфатная» фракция, в то же время в присутствии радиопротекторов скорость накопления полифосфатов значительно ниже. Очень эффективным радиопротектором оказался ДТТ, однако, продукты радиолиза и/или окисления ДТТ оказались весьма токсичными для некоторых ферментативных реакций. Поэтому при длительном хранении в присутствии ДТТ, несмотря на достаточно высокую РХЧ, использование в некоторых ферментативных системах [у-32Р]ЛТР и, особенно [а-32Р] (фЭТР приводит к нежелательным артефактам.

Таблица 11. Изменение РХЧ [у-32Р]АТР при хранении в присутствии радиопротекторов.

Радиопротектор РХЧ %

Через 1 сутки Через 2 суток Через 4 суток Через 7 суток

вода 30 10 1 1

50% этанол* 80 65 40 20

ЮмМДТТ 90 85 70 55

Трис-НС1 рН=8,0 80 60 35 15

В,2 95 90 80 60

* - для объемной активности 10 мКи/мл.

6. Параметры и методы контроля качества конечного продукта.

Соединения, меченные радиоактивными изотопами, должны характеризоваться следующими параметрами:

- наименование радионуклида (изотопа) и его место в молекуле,

- радионуклидная чистота (содержание целевого радионуклида) в %,

- объемная активность (концентрация радионуклида) в мКи/мл или МБк/мл,

- молярная (удельная) активность в Ки/ммоль или ТБк/моль,

- радиохимическая чистота (РХЧ) в %.

Возможны также дополнительные характеристики, например, состав растворителя, примеси солей тяжелых металлов и др.

Радионуклидная чистота - параметр, который определяется измерением спектра излучения радионуклида, и для радиоактивных изотопов фосфора содержание радионуклидных примесей не должно превышать 2%. Следует отметить, что для биохимических исследований примеси фосфора-33 в целевом соединении, меченном фосфором-32, совершенно несущественны. Однако, примеси фосфора-32 в целевом соединении, меченном фосфором-33, являются во многих случаях крайне

нежелательными, поэтому радионуклидная чистота фосфора-33 установлена на уровне 98%.

Радиохимическая чистота (РХЧ), или доля основного радиоактивного вещества, традиционно определяется с помощью ТСХ на PEI-целлюлозе в калий-фосфатом буфере с измерением распределения радиоактивности после хроматографии. Такой унифицированный для всех [y-32<33)P]NTP и [а-32<33)Р] NTP метод легко воспроизводится и позволяет сопоставлять данные по РХЧ, полученные в различных лабораториях и в ходе длительного хранения. Обычно РХЧ меченых нуклеотидов составляет не ниже 95%. Содержание полифосфатов - не более 1%.

Молярная активность - весьма важная для пользователей величина, которая фактически показывает доли радиоактивного и нерадиоактивного соединений в общей массе. Молярная активность - расчетная величина, которая определяется из молярной концентрации целевого вещества и его объемной активности. Для нуклеотидов, меченных фосфором-32, молярная активность обычно составляет не менее 5000 Ки/ммоль (185 ПБк/моль), для соединений фосфора-33 - не менее 4000 Ки/ммоль (148 ПБк/моль).

Объемная активность - это количественный параметр, который определяет концентрацию радиоактивного соединения в растворе и определяется с помощью измерительной радиометрической аппаратуры путем сравнения скорости счета измеряемого образца и эталона. Препараты [y-32P]NTP, [а-32Р] NTP и [а-32Р] dNTP, которые начинали серийно производить для биологических исследований, имели объемную активность 1 мКи/мл (37-40 МБк/мл) и были растворены в 50% этаноле. Такие препараты были достаточно стабильны благодаря радиопротекторным и антибактериальным свойствам этанола, однако были не удобны в работе. Ферментативные реакции ингибируются высокой концентрацией этанола, и перед работой меченые соединения приходилось упаривать под вакуумом досуха, а затем растворять в рабочем буфере. По требованию исследователей, использующих в работе меченые нуклеотиды, объемную активность препаратов пришлось повысить до 10 мКи/мл (370-400 МБк/мл) и отказаться от этанола в качестве растворителя.

Нуклеозид-5'-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора, предназначаются для различных биохимических исследований, поэтому для их характеристики вышеперечисленных параметров оказалось недостаточно. Необходимо было ввести параметр, количественно определявший возможность использования меченых NTP. Таким параметром стало тестирование меченых NTP на их способность участвовать в качестве субстрата в определенных ферментативных реакциях. Такое тестирование получило название - определение биологической активности или просто -

биологическая активность. Для [у-32(33,Р]АТР и [у-32<33,Р]ОТР использовалась реакция ферментативного фосфорилирования цитидин-З'-моиофосфата с помощью Т4 полинуклеотидкиназы. Для [а-32(33)Р] ЫТР использовалась реакция ферментативного синтеза РНК с помощью Т7 РНК-полимеразы. Для [а-32(33)Р] d^JTP использовалась реакция ферментативного синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы I Е.соН в реакции «ник-трансляции». Позднее этот тест был заменен реакцией синтеза фрагментов ДНК по методу «случайной затравки».

Следует подчеркнуть, что биологическая активность является с точки зрения потребителей главным критерием качества. Поэтому количественная оценка биологической активности препарата всегда являлась наиболее значимой для потребителей и вызывала острые дискуссии. Для биологической активности препаратов [у-32(33,Р]АТР удовлетворительным был принят уровень фосфорилирования не ниже 50%. Для биологической активности [а-32<33,Р] Ш? включение в РНК должно составлять не менее 40%. Для биологической активности [а-32<33)Р] (ШТР включение в ДНК должно составлять не менее 50%, с получением удельной активности фрагментов ДНК не ниже 108 имп./мин на мкг синтезированной ДНК.

7. Технологический процесс синтеза пуклеознд-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Синтез [у-32(33)Р]>1ТР или [а-32(33)Р] сЮТР ([а-32(33)Р] ЫТР) начинали из соответствующей 32(33)Р-ортофосфорной кислоты, штоковый раствор которой хранился в 0,05 М НС1 в кварцевой емкости для снижения сорбции меченого фосфата на стенках сосуда. После нейтрализации НС! в реакционную смесь добавляли расчетное количество 10 мМ АБР и кит для синтеза [у-32(33,Р]АТР. Через 20 мин. инкубации при 37°С отбирали аликвоту для определения технологического выхода, и хроматографией на пластинке РЕ1-целлюлозы в 0,5 М КН2РО4 определяли степень конверсии меченого фосфата в [у-32<33)Р]АТР (см. рис.15, стадия 1). Реакционную смесь прогревали 5 мин. 95°С для инактивации ферментов синтеза [у-32(33)Р]АТР. Если был необходим собственно [у-32(33)Р]АТР - следовала стадия выделения продукта с помощью ВЭЖХ.

Для получения [а-32(33)Р] ёИТР или [а-32(33)Р] ЫТР в реакционную смесь после охлаждения добавляли растаор З'-^^МР и ПНК, После инкубации отбирали аликвоту, и хроматографией на пластинке РЕГ-целлюлозы определяли технологический выход.

Рис.15. Технологический контроль синтеза [<х-32Р] <1СТР Радиоавтограф ТСХ на РЕ1-целлюлозе в 0,5 М КНгРО аликвот реакционной смеси на разных стадиях:

1 - исходная 32Р-ортофосфорная кислота;

2 - синтез [у-32Р]АТР - стадия 1;

3 - синтез 3',5'-[5'-32Р] ёСБР - стадия 2;

4 - синтез -[5'- Р] аСМР - стадия 3;

5 - синтез [а-32Р] сЗСТР - стадия 4.

4 4 4 4 4

1 2 3 4 5

На рис.15 (стадия 2) показан выход 3',5'-[5'-32Р]с1СОР при синтезе [а-32Р] (1СТР. Затем следовала стадия дефосфорилирования 3'-фосфатной группы, для чего в реакционную смесь добавляли уксусную кислоту до рН 4,5-5,0 и нуклеаза (Р0 и, после инкубации в течение 30 мин. при 37°С отбирали аликвоту для определения технологического выхода с помощью ТСХ в тех же условиях (см. рис.15, стадия 3).

К реакционной смеси, содержащей [5'-32Р]с1СМР, добавляли необходимое количество КОН до рН 7.7-8.0, универсальную смесь для фосфорилирования и ферменты: пируваткиназу и СМР-киназу Е.соИ или (ШМРк Т5. После инкубации в течение 30 мин. при 37°С отбирали аликвоту для определения выхода [а-32Р] с1СТР помощью ТСХ в тех же условиях (см. рис. 15, стадия 4).

Таким образом, все стадии синтеза [а-32(33,Р] <ЮТ? ([а-32(33)Р] 1>ГГР) проводили в одном реакционном сосуде без выделения промежуточных продуктов. Постадийный технологический контроль осуществляли с помощью ТСХ на РЕ1-целлюлозе, визуализацию хроматограмм проводили авторадиографически или с помощью фосфоиммиджера.

8. Синтез модифицированых нуклеозид-5'-[а-32<33)Р| трифосфатов терминаторов биосинтеза ДНК.

Для некоторых фундаментальных и прикладных исследований полезными инструментами оказались меченные радиоактивными изотопами фосфора терминаторы биосинтеза ДНК. Это - модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты, в которых 3'-гидроксильная группа углеводного фрагмента замещена или отсутствует. Примеры таких модификаций нуклеозидной части представлены на схеме 5. Ферментативный синтез таких [5'-32(33,Р]-нуклеотидов с помощью ПНК невозможен, поэтому их синтезируют

Р;

# т

,5'(1СОР |

АТР^

химическим путем. Однако, дальнейшее ферментативное фосфорилирование до трифосфатного производного также существенно ограничено специфичностью нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli в отношении акцепторов фосфатной группы. Например, для АМР-киназы E.coli число субстратов с модифицированной нуклеозидной частью невелико (см. табл.1), и модификации касаются, в основном, углеводной части акцептора фосфата. Модификации гетероциклического основания (или замена аденина на другое основание) делают нуклеотид недоступным для фосфорилирования этим ферментом. Важную роль в распознавании акцептора играет 2'-гидроксильная группа рибозного остатка - ее отсутствие или этерификация резко снижают сродство фермента к такому соединению.

Следует отметить, что аналогичные результаты были получены для СМР-киназы E.coli с некоторыми соответствующими производными цитозиновых нуклеотидов.

Таблица 11. Специфичность АМР-киназы E.coli к акцепторам фосфатной группы.

Нуклеотид Активность, %

5'-АМР 100

5'-dAMP 35

г'З'-сМ-З'-Шз-б'-АМР 17

г'^'^-з'-Из-б'-АМР 5

3'-d-3'-N3-5'-AMP 90

8-Вг-5'-АМР 0

8-(CH2)6-NH2-5'-AMP 0

2 ',3 '-О-изопропилиден-5 '-АМР 0

3'-0-Ac-5'-dAMP 0

Иногда за счет изменения рН среды удается добиться приемлемого уровня фосфорилирования модифицированного нуклеотида (см. рис. 16). Тем не менее, в большинстве случаев ИМРк Е.соН не могут успешно использоваться для этих целей.

Расширить возможности ферментативного фосфорилирования модифицированных нуклеотидов позволяет использование йЫМРк Т5. Например, фосфорилирование 2\3'-дидезоксицитидин-5'-монофосфата легко проводится с помощью (ШМРк Т5, а СМР-киназа Е.соН в аналогичных условиях такую реакцию не катализирует (см. рис. 17).

Рис. 16. Влияние рН на активность АМР-киназы Е.coll

1 - для субстратов AMP и dAMP;

2 - для субстрата 2\3'-дидезокси-3'-аминоаденозин-5'-фосфата.

1 2 3 4 5

Рис. 17. Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе в 0,5 М КН2РО4 аликвот реакционных смесей фосфорилирования dCMP и 0гСМР:

1 - [у-32Р]АТР (контроль);

2 - фосфорилирование djCMP dNMPk Т5;

3 - фосфорилирование dCMP dNMPk Т5;

4 - фосфорилирование d2CMP CMPk E.coli;

5 - фосфорилирование dCMP CMPk E.coli.

Следует отметить, что ферментативное фосфорилирование модифицированных ЫРР до соответствующих ОТР, как правило, без осложнений осуществляется с помощью пируваткиназы и фосфоенолпирувата.

9. Синтез нуклеозид-5'-[р-мР] (ди)трифосфатов.

Для биологических исследований иногда необходимы яуклеозид-5'-трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора в (3-положение. Синтез таких соединений с помошью ферментов проводится по схеме 8.

1. pN + *рррА *ppN + ррА

2. *ppN + PEP -м-> p*ppN + Руг

схема 8.

Фактически, это реакции фосфорилировакия нукяеотвдов, аналогичные представленным на схеме 7, только для фосфорилирования нуклеотида используется [у-32Р]АТР. Однако, в синтезе [Р-32Р] 1ЧТР или [р-32Р] ИОР есть несколько отличий. Во-первых, на стадии 1 нуклеотид используется в 7-10 кратном избытке по отношению к [у-32Р]АТР, что обеспечивает увеличение выхода реакции. Во-вторых, стадии 1 и 2 обязательно проводятся последовательно, т. к. необходимо, чтобы стадия 2 начиналась, когда [у-32Р]АТР уже израсходован. Пример синтеза [Р-32Р] СТР представлен на рис. 18.

[Р-32Р] CDP ^ -► Щ Рис. 16. Синтез $-32Р] СТР.

Радиоавтограф ТСХ на PEI-целлюлозе в 0,5

№-32Р] стр

М КН2РО4 аликвот реакционной смеси на

разных стадиях:

[у-32Р]АТР А W 1 - исходный [у-згР]АТР; -► Щ * 1 r\iго rn 32D

2 - фосфорилирование CMP до Р] CDP;

3 - фосфорилирование до [Р-32Р] СТР.

t t t

1 2 3

Аналогичным образом были синтезированы [р-32Р] UTP и [р-32Р] АТР, используя соответствующие NMPk E.coli. По этой схеме удалось синтезировать 2-метилтиоаденозин-5'-[р-32Р]-дифосфат. Оказалось, что 2-метилтиоаденозин-5'-фосфат распознается АМР-киназой E.coli и хорошо фосфорилируется с помощью образуя целевой продукт, который представляет интерес для исследований клеточных рецепторов.

10. Технологическая линия по получению нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

Технология получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, была разделена на отдельные блоки (технологические участки), которые вместе обеспечивали работу всей технологической цепочки (см. схему 8).

1. Участок радиоактивного сырья. На участке нарабатывалась, хранилась, расфасовывалась и передавалась для синтеза 32(33,Р-ортофосфорная кислота. Участок был оснащен оборудованием и устройствами для дистанционной безопасной работы с активностью до 10 Ки на рабочем месте; защитными камерами, боксами, манипуляторами, системой спецвентилляции и спецканализации, трехзональной системой организации работ.

2. Участок ферментативной подготовки производства. Участок фактически являлся биохимической лабораторией, в которой нарабатывались, хранились, расфасовывались и готовились к синтезу все необходимые ферментные препараты и другие нерадиоактивные компоненты и реагенты для синтеза. Здесь же проверялись ферментативные активности всех коммерческих ферментативных препаратов, которые используются в работе (входной контроль ферментов).

3. Участок синтеза целевых соединений. На участке осуществлялся синтез меченых соединений, для чего он был оснащен необходимым оборудованием для дистанционной работы в защитном боксе.

4. Участок выделения (очистки) синтезированных соединений. На участке проводилась хроматографическая очистка синтезированных меченых соединений, поэтому участок непосредственно бьи связан с участком синтеза целевых соединений. Участок оснащался хроматографическим оборудованием для ВЭЖХ, а также оборудованием для защиты персонала.

5. Участок анализа готовой продукции. На участке проводились все анализы готовой продукции, оговоренные в Технических условиях, включая определение биологической активности.

6. Участок расфасовки и упаковки готовой продукции.

7. Вспомогательный участок подготовки посуды, реагентов, растворителей. Этот вспомогательный участок иногда целесообразно объединить с участком ферментативной подготовки производства.

Продолжительность технологического цикла получения [у-32(33)Р]АТР - 4 часа, длительность получения [а-32<33)Р] МТР или [а-задз)Р] с1МТР -13 часов. Технологическая мощность линии - 1 -2 Ки соединений в год (суммарно).

Схема 8. Технологическая схема производства.

Численность работающего персонала - 22-28 человек: 7 инженеров-технологов с высшим специальным образованием, остальные - рабочие, подготовленные к работе с открытыми источниками ионизирующих излучений по I классу (работа с радиоактивными веществами). Режим работы - 2-х сменный на участке синтеза и на участке выделения синтезированных соединений. Остальные участки работают в односменном режиме.

Технологические линии для реализации ферментативной технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, были созданы на предприятии «Радиопрепарат» Института ядерной физики АН УзССР (г. Ташкент) и в Физико-энергетическом институте (ГНЦ РФ ФЭИ Минатома РФ, г. Обнинск).

выводы.

1. На основании проведенных исследований создана и внедрена в серийное производство ферментативная технология синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33 в альфа- и гамма- положении.

2. Разработана и внедрена технология очистки меченых нуклеотидов с использованием обратно-фазовой ВЭЖХ в ион-парном режиме.

3. Разработаны критерии качества и методы контроля качества для производимых нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, которые были закреплены в ТУ 95 2665-97 ЛУ. Впервые для контроля качества радиохимической продукции был введен критерий биологической активности меченых соединений.

4. Создана ферментативная база для синтеза и контроля качества меченых нуклеозид-5'-трифосфатов.

5. Показана возможность применения ферментов для синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, модифицированных по углеводной части молекулы и меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6. Разработаны методы введения радиоактивных изотопов фосфора в синтетические аналоги нуклеозидов.

7. Разработан и внедрен новый радиопротектор на основе циаикобаламина (витамин Вп), обеспечивающий увеличение срока годности нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33.

Список сокращений.

[у-32<33)Р]АТР - аденозин-5'- трифосфат, меченный фосфором-32 (или 33) в у-положении [y-32(33>P]NTP - нуклеозид-5'- трифосфат, меченный фосфором-32 (или 33) в у-положении рррА., ррА - ATP, ADP Рут - пируват

*р - радиоактивный (32Р или 33Р) фосфат или фосфорил

♦рррА - аденозин-5'- трифосфат, меченный фосфором-32 (или 33) в у-положении *pNp - нуклеозид 3\5'- [5'-32<33)Р] дифосфат *pN - нуклеозид-[5'- 32(33)Р] фосфат ДТТ - дитиотрейтол

NAD+h NADH - никотинамидадениндинуклеотид (окисленная и восстановленная формы)

рАр, рСр, pGp, pUp, pdAp, pdCp, pdGp, pTp - нуклеозид-3\5'-дифосфаты (соответственно:

аденозин, цитидин, гуанозин, уридин, 2'-дезоксиаденозин, 2'-дезоксицитидин, 2'-

дезоксигуанозин и тимидин)

AZT - З'-азидотимидин

РЕР - фосфоенолпируват

[а-32(33,Р] NTP - нуклеозид-5'-[а-32(33)Р] трифосфат

[а-32(33)Р] dNTP - 2 '-дезоксинуклеазид-5' -[а-32<33)Р] трифосфат

PEI-целлюлоза - сорбент полиэтилениминцеллюлоза

d(T - 2',3'-дидезокси, - дидегидротимидин

diА - 2',3'-дидезоксиаденозин

ЗТС - 3'- тиа-2'-дезоксицитидин

TCN - трихлорацетонитрил

TPSC1 - триизопропилфенилсульфохлорид

BrCN - бромциан

ACV - ацикловир

ABzDP - Ы6-бензоиладенозин -5'-дифосфат

ABnDP - К6-бензиладенозин - 5'-дифосфат

AZTDP - З'-азидотимидин -5'-дифосфат

An"°DP -N'-оксиаденозин -5'-дифосфат

d4TDP - 2',3'- дидезокси, - дегидротимидин-5'-дифосфат

d:CMP - 2',3' - дидезоксицитидин-5'-фосфат

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Абдукаюмов М., Петренко Т.Д.,

Козлов A.B. Способ получения аденозин-5'- трифосфата, меченного радиоактивными изотопами фосфора в гамма- положение //Авторское свидетельство - 1986 - № 245965.

2. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Петренко Т.Д., Волкова И.И., Абдукаюмов М. Способ одновременного получения нуклеозид-5'- трифосфатов, меченных фосфором-32(33) в альфа и гамма положение// Авторское свидетельство - 1988 - № 281100.

3. Ажаев A.B., Абдукаюмов М., Гнучев Н.В., Краевский A.A., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П. Способ очистки нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32(33) // Авторское свидетельство - 1987 247519.

4. Ажаев A.B., Абдукаюмов М., Гнучев Н.В., Краевский A.A., Куханова М.К., Рабинов Й.В., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П.К. 2'!3'-дидезокси-3*аминонуклеозид-5'-трифосфаты,

меченные фосфором-32 или тритием или углеродом-14 в качестве терминаторов биосинтеза нуклеиновых кислот и способы их получения // Авторское свидетельство -1987-№238016.

5. Кузнецов С.А., Ли В.А., Осинский В.Ф., Петренко Т.Д., Рабинов И.В., Скоблов Ю.С., Рихтер В.А. Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33// Авторское свидетельство - 1991 - № 1715218.

6. Кузнецов С.А., Рабинов Й.В., Рихтер В.А., Ли В.А., Скоблов Ю.С., Зинченко A.M., Попов И.Н., Барай В.Н., Михайлопуло А.И Способ получения 2'-и 3'- замещенных производных нуклеозид-5'- монофосфатов меченных фосфором-32(33) // Авторское свидетельство - 1987 - № 1685092.

7. Абдукаюмов М., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П.К. Способ выделения нуклеозидмонофосфаткиназ // Авторское свидетельство - 1986 - № 1274295.

8. Абдукаюмов М., Ганиев А., Ларченко В.А., Петренко Т.Д., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П.К. Способ получения нуклеотидов, меченных фосфором-33 // Авторское свидетельство - 1987 - № 249404.

9. Рихтер В.А., Рабинов И.В., Кузнецов С.А., Павлий Т.Б., Скоблов Ю.С. Выделение и некоторые свойства нуклеозидмонофосфаткиназ из ESCHERICHIA COLI Приклад, биохим. микробиол.- 1988 - т. XXIV, N 3 - С. 310-318.

10. Скоблов Ю.С. Методы получения биологически активных соединений, меченных фосфором-32, фосфором-33 и серой-35. Материалы Ill-Международного симпозиума по органическим соединениям, меченным радиоактивными изотопами. Марианске Лазне. 1988 С. 9

11. Грачев М.А., Лухтанов Е.А., Мустаев A.A., Рихтер В.А., Рабинов И.В., Скоблов Ю.С., Абдукаюмов М. Локализация остатков лизина в области связывания инициирующего субстрата РНК-полимеразы E.coli. // Биоорган, химия -1987 - т. 13, N 4 - С. 552-556.

12. Грачев М.А., Лухтанов Е.А., Мустаев A.A., Рихтер В.А., Рабинов И.В., Скоблов Ю.С., Абдукаюмов М. Локализация остатков гистидина в области связывания инициирующего субстрата РНК-полимеразы E.coli. // Биоорган, химия - 1987 - т. 13, N 7 - С. 992-995.

13. Скоблов Ю.С., Королев А.Э., Маслова Р.Н. Синтез нуклеозид-5-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора. // Успехи химии - 1995 - т. 64 N 8 - С. 850-858.

14. Skoblov J.S., Frank-Kamenetskaya M.D. Chernov D.N. Krayevsky A.A. Modified nucleotides as substrates and inhibitors of adenylate kinase from different sources. // FEBS Letters -1996 - v. 395 - C. 283-285.

15. Скоблов Ю.С., Лосев А.П., Сметанин ЭЛ., Фределинг Жан Пьер, Королев А.Э.,

Гжива Надина Способ получения водных растворов препаратов, меченных ¡3-радионуклидами. // Патент РФ - 1998 - № 2104035.

16. Скоблов М.Ю., Лсько М.В., Скоблов Ю.С. Получение 32Р-меченных 2-метилтио-аденозин ди- и трифосфатов. // Биоорган, химия - 1999 - т.25, N 9 - С.702-707.

17. Shirokova ЕА, Khandazhinskaya AL, Skoblov YS, Goryunova LY, Beabealashvilli RS, Krayevsky AA. Modified dinucleoside tetraphosphonates, new potential inhibitors of HIV reverse transcriptase. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. - 2001 - 20(4-7) - C.1033-6

18. Д.Ю. Январев, E.A. Широкова, Ю.С. Скоблов Изучение активирующих агентов для фосфорилирования З'-азидо- З'-дезокситимидина [32Р]ортофосфоргной кислотой. // Биоорган, химия - 2005 - т.31 - N 4 - С. 399-403.

19. А.Ю. Скоблов, М.В. Ясько, A.M. Мурабулдаев, М.К. Куханова, Ю.С. Скоблов Ферментативный синтез бис(5'-нуклеозидил)тетра- или трифосфатов. // Биоорган, химия -2005-t.31.N6-C. 623-626.

20. Yanvarev DV, Shirokova ЕА, Astapova MV, Skoblov YS. AZT 5'-Cholinephosphate as an anti-HIV agent: the study of biochemical properties and metabolic transformations using its 32P-labelled counterpart. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids - 2007 - Vol. 26 - (1) - P. 23-36.

21. D.V. Yanvarev, E.A. Shirokova, M.K. Kukhanova, Yu.S. Skoblov A new method of synthesis of modified nucleoside [32P]phosphates. // J. Label Сотр. Radiopharm. - 2008 - Vol, 51-P. 303-307.

22. Микулинская Г.В., Мирошников А.И., Скоблов Ю.С., Скоблова Н.А., Третьякова С.Ю., Феофанов С.А. Способ синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении. // Патент РФ 2009 № 2355768.

23. А.Ю. Скоблов, Г.В. Микулинская, С.А. Таран, А.И.Мирошников, С.А. Феофанов, Ю.С. Скоблов Субстратная специфичность дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5 и использование фермента для синтеза [a-32P]d/rNTP. // Биоорган, химия - 2009-т. 35, №6-С. 816-821.

В связи с завершением работы над диссертацией и представлением ее к защите выражаю искреннюю признательность всем моим соавторам и коллегам за участие в выполнении отдельных этапов и полезные дискуссии, а также сотрудникам лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений, лаборатории стереохимии ферментативных реакций ИМБ РАН, лаборатории биотехнологии, лаборатории биокатализа, лаборатории сравнительной и функциональной геномики ИБХ РАН за плодотворные дискуссии и критические замечания, высказанные при обсуждении работы.

Заказ №76. Объем 2 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул. Палнха-2а, тел. 250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, доктора химических наук, Скоблов, Юрий Самойлович

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Методы синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

1.1.Методы синтеза [у-32(33)Р] NTP.

1.1.1. Химические методы.

1.1.2. Химико-ферментативные методы.

1.1.3. Ферментативные методы.

1.2.Синтез нуклеозид-5'-[а-32(33)Р]трифосфатов.

1.2.1. Синтез нуклеозид [5' -32(33)Р]монофосфатов.

1.2.1.1. Химические методы синтеза нуклеозид -[5'-32(33)Р]монофосфатов.

1.2.1.2. Ферментативные методы синтеза нуклеозид -[5'-32(33)Р]монофосфатов.

1.2.2. Методы фосфорилирования нуклеозид-[5'-32(33)Р]монофосфатов до нуклеозид-5' - [а-32(33)Р]трифосфатов.

1.2.2.1. Химические методы.

1.2.2.2. Ферментативные методы.

2. Нуклеотидкиназы - ферменты, фосфорилирующие (d)NMP.

2.1.Бактериальные АТФ: нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы.

2.2.АТФ: нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы млекопитающих.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

1.1 Синтез нуклеозид-5'-[у-32(33)Р] трифосфатов.

1.1.1. Синтез [у-32Р]АТР реакцией «обмена».

1.1.2. Синтез [у-32Р]АТР по прямой реакции из ADP.

1.1.3. Синтез [y-32P]NTP конверсией из [у-32Р]АТР.

1.2 Синтез нуклеозид-5'-[а-32(33)Р] трифосфатов.

1.2.1 Синтез нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов химическим фосфорилированием.

1.2.2 Ферментативный синтез нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов.

1.2.3. Ферментативное фосфорилирование нуклеозид-[5'-32(33)Р] монофосфатов.

1.3 Очистка нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

2. Разработка критериев качества нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

2.1 Основные критерии качества меченых соединений.

2.2 Биологическая активность - дополнительный критерий качества меченых соединений.

3. Создание ферментативной базы для производства нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

3.1. Ферменты для синтеза [у- Р]АТР.

3.2. Ферменты для синтеза [5'-32(33)P](d)NMP.

3.3 Ферменты для фосфорилирования [5'-32(33)P](d)NMP.

3.3.1 Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ из E.coli.

3.3.2 Свойства нуклеозидмонофосфаткиназ E.coli.

3.3.3 Свойства дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5.

3.4 Фермент для фосфорилирования [5'-32(33)P](d)NDP.

4. Радиопротектор для 32(33)Р-меченых нуклеотидов.

5. Технологическая линия по получению нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6. Получение модифицированных нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

6.1 Синтез модифицированых нуклеозид-5'-[а-32(33)Р] трифосфатов терминаторов биосинтеза ДНК.

6.2. Синтез нуклеозид-5'-[Р~ Р] (ди)трифосфатов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Материалы.

1.1. Реактивы и ферменты.

1.2. Хроматографические сорбенты и колонки.

1.3. Непромышленные препараты.;.

2. Методы.

2.1. Приготовление раствора триэтиламмоний бикарбоната (ТЕАВ).

2.2. Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ Е. coli.

2.3. Определение активности нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.4. Определение нуклеотиддефосфорилирующих примесей в препаратах нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.5. Определение оптимума рН для реакций, катализируемых нуклеозидмонофосфаткиназами.

2.6. Определение влияния ионов двухвалентных металлов на активность нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.7. Изучение субстратной специфичности нуклеозидмонофосфаткиназ.

2.8. Определение концентрации белка.

2.9. Очистка цитидилаткиназы Е. coli MRE-600 до гомогенного состояния.

2.10. Методы электрофореза.

2.10.1. Электрофорез белков.

2.10.2. Электрофорез нуклеиновых кислот.

2.11. Тестирование биологической активности [у-32Р] NTP и [а-32Р] (d)NTP.Ill

2.11.1. Тестирование биологической активности у- Р] NTP

2.11.2. Тестирование биологической активности [а- Р] NTP.

2.11.3. Тестирование биологической активности [а-Р] dNTP.

2.11.3.1. Метод «ник-трансляции».

2.11.3.2. Метод случайной затравки.

2.12. Ферментативный синтез [а-32Р] (d)NTP.

2.13. Хроматографическая очистка [у-32(33)Р] NTP и [a-32(33)P](d)NTP.

2.13.1. Хроматографическая очистка на колонках с PEI-целлюлозой.

2.13.2. Ионообменная ВЭЖХ.

2.13.3. Обратно-фазовая ВЭЖХ.

2.14. Химическое фосфорилирование нуклеозидов.

2.14.1 Общая методика синтеза 3,-азидо-2',3'-дидезокситимидин-[5'- Р]-фосфата ([5'-32Р] AzTMP) активацией TPSC1, TCN, DCC и МСС.

2.13.2. Синтез З'-азидо^'З'-дидезокситимидин-^'- Р]-фосфата активацией

BrCN.

2.13.3 Препаративное химическое фосфорилирование нуклеозидов.

ВЫВОДЫ.

Список сокращений.

Благодарности.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора"

Использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в биологических, исследованиях начиналось в середине XX века с применения Р-ортофосфата для введения радиоактивной «метки» в нуклеиновые кислоты. С помощью радиоактивного фосфора была однозначно показана роль нуклеиновых кислот в хранении и передаче генетической информации [1,2,3]. Вместе с другими вирусологическими и рентгеноструктурными исследованиями в этой области был дан мощный импульс к возникновению и развитию молекулярной биологии. Одновременно расширились сферы применения и номенклатура соединений, меченных фосфором-32, а позднее - и фосфором-33. Благодаря исследованиям матричного синтеза ДНК и РНК на первое место среди используемых соединений, меченных фосфором-32, вышли предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот — нуклеозид-5'-трифосфаты. Разработка и развитие методов секвенирования ДНК в 70-х годах значительно изменили объем и характер исследований, проводимых в области молекулярной генетики, молекулярной биологии и биотехнологии [4,5,6]. Потребление нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, в первую очередь аденозин-5'- [у- Р] трифосфата, 2'-дезоксиаденозин-5'- [а- Р] трифосфата и 2'-дезоксицитидин-5'- [а- Р] трифосфата, в мире в 80-х годах достигло очень большой величины — до 10 Ки ежемесячно. Создание флуоресцентных автоматических секвенаторов и внедрение их в рутинную повседневную практику существенно снизило потребление меченых фосфором нуклеотидов, однако, в целом, разнообразные исследования с использованием радиоактивных изотопов фосфора остаются в методическом арсенале ученых.

Главными преимуществами методов, в которых используются соединения, меченные радиоактивным фосфором, являются их высокая чувствительность и специфичность. Краткие характеристики радионуклидов

32 33

Р и Р, приведенные в табл.1, показывают, что оба радиоактивных изотопа фосфора обладают энергией излучения р-частиц, достаточной для уверенной регистрации и количественного измерения с эффективностью 90-95%. Высокая молярная активность, как теоретически возможная, так и практически достижимая, позволяют достигать достоверного обнаружения и измерения 10"15 моль меченого вещества. Для изучения метаболизма соединений в клетке или организме, исследования специфичности взаимодействия молекул и молекулярных механизмов ферментативных реакций не менее важным фактором является идентичность меченых и немеченых соединений. Использование радиоактивных «меток» в таких исследованиях предпочтительнее флуоресцентных или других химических модификаций, так как замена атома фосфора-31 на радиоактивный фосфор-32 (или 33) вносит минимальные изменения в структуру «меченой» молекулы и, как правило, не приводит к искажению изучаемых молекулярных процессов.

Таблица 1. Характеристики радионуклидов фосфора.

Физические характеристики Фосфор-32 Фосфор-33

Период полураспада, сутки 14.3 25.4

Максимальная энергия р-излучения, Мэв 1.7 0.2

Теоретическая молярная активность, Ки/мАт 9130 5200

Максимальная практическая молярная активность меченных фосфором соединений, Ки/ммоль 7000-8000 4500-5000

Высокая чувствительность в сочетании с высокой специфичностью и простотой реализации делают использование соединений, меченных радиоактивными изотопами фосфора, по-прежнему, важнейшим и распространенным инструментом исследователей.

Технологии получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, имеют свои специфические проблемы и ограничения.

1. Высокая молярная активность вынуждает проводить синтезы с

8 9 количеством радиоактивного изотопа 10" — 10" моля, что соответствует активности 10-100 мКи.

3. Фосфор-32 и фосфор-33 являются реакторными изотопами, т.е. нарабатываются в результате облучения соответствующих мишеней в нейтронном потоке ядерного реактора, и, при получении этих изотопов с максимально высокой молярной активностью, в ходе первичной переработки облученного радиоактивного сырья получается ортофосфорная кислота, меченная фосфором-32 или фосфором-33, соответственно. Следовательно, схемы получения любых соединений, меченных фосфором-32 или фосфором-33, основываются на использовании в качестве исходного радиоактивного соединения (радиоактивного сырья) 32(33)Р-ортофосфорной кислоты.

4. Низкая концентрация радиоактивного вещества требует использования большого избытка нерадиоактивных компонентов для увеличения скорости и выхода реакции, что часто приводит к появлению побочных соединений.

5. При высокой объемной активности (1-10 Ки/мл) в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать.

6. Количество синтезируемых веществ слишком мало, чтобы использовать классические методы органического синтеза (перегонка, кристаллизация, осаждение и т.д.) и существенно ограничивает возможности использования физико-химических методов анализа: ЯМР-спектрометрию, масс-спектрометрию, УФ и ИК-спектроскопию.

7. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению техники радиационной безопасности и вынуждает проводить технологический процесс в соответствующих защитных боксах.

Среди методов синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33, можно выделить химические, химико-ферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментом для проведения сложных радиохимических синтезов. Основным ограничением ферментативных и химико-ферментативных методов синтеза является отсутствие высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными энзимологическими исследованиями.

Следует подчеркнуть, что по уровню радиохимических работ, включая производство различных радионуклидов, к концу 70-х годов XX века наша страна занимала лидирующее положение в мире. База, имеющаяся в стране по наработке и выделению из мишеней реакторных и циклотронных изотопов, охватывала широкий спектр радионуклидов и не имела аналогов. Однако, биохимические аспекты получения соединений, меченных радиоактивными изотопами, существенно отставали от радиохимических разработок.

Целью настоящего исследования было создание технологий серийного производства нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, для обеспечения исследований в области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

1. Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе не менее 100 мКм по радиоактивному сырью.

2. Разработка методов очистки целевых соединений.

3. Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта.

5. Внедрение разработанных методов в серийное производство.

7. Разработка, согласование и утверждение нормативно-технической документации, необходимой для серийного производства.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Скоблов, Юрий Самойлович

выводы

4. Создана ферментативная база для синтеза и контроля качества меченых нуклеозид-5'-трифосфатов.

6. Разработаны методы введения радиоактивных изотопов фосфора в синтетические аналоги нуклеозидов.

7. Разработан и внедрен новый радиопротектор на основе цианкобаламина (витамин В12), обеспечивающий увеличение срока годности нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32 и фосфором-33.

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Скоблов, Юрий Самойлович, Москва

1. Tessman J.// Virology - 1959 - Vol. 7 - P. 263.

2. Rubenstein J., Thomas C.A. Jr., Hershey A.D. // Proc.Nat. Acad. Sci. U.S. -1961 Vol. 8-P. 1113.

3. Hershey A.D., Kamen M. D., Kennedy J. W., Gest H., (1951), The mortality of bacteriophages containing assimilated radioactive phosphorous, // J.Gen.Physiol. — 1951-Vol. 34-P. 305.

4. Maxam A., Gilbert W. A new method for sequencing DNA.// Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1977 - Vol. 74 - P. 560

5. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1977 - Vol. 74 - P. 5463.

6. A.C. Краев, К.Г. Скрябин Методы изучения первичной структуры нуклеиновых кислот. В сб. Итоги науки и техники. Молекулярная биология. М. 1980 т.12 - ч.П - С. 141-195.

7. Левин В.И. Получение радиоактивных изотопов. Атомиздат, М., 1972.

8. Т. Форстер, JI. Буршич «Получение нуклеотидов, меченных 32Р, путем биосинтеза».: Тез. докл. II Симпозиум стран-членов СЭВ «Органические соединения, меченные радиоактивными изотопами» Ленинград, 1981, ЦНИИ Атоминформ, Москва, 1982 С. 157.

9. R.B. Hurlert and N.B. Furlong Biosyntetic preparation of 32P labeled nuecleoside-5 '-triphosphates// Methods Enzymology 1967 - XII Part A - P. 192202.

10. A.M. Moffat Chemical syntheses of specifically a-, P- and у- 32P labeled nuecleoside-5'-triphosphates// Methods Enzymology 1967 - XII Part A - P. 182192.

11. A. Janecka, H. Panusz, J. Pankowski and W. Koziolkiewicz Chemical Synthesis of Nucleoside- y- 32p. Triphosphates of High Specipic Activity// Preparative Biochemistry and Biotechnology 1980 - Vol. 10 - (1) - P. 27 — 35.

12. S.M. Hecht J.W. Kozarch A Chemical synthesis of adenosine 5'-y-32P. triphosphate// Biochimica et Biophysca Acta 1973 - Vol. 331 - P. 307-309.

13. Lucien Bettendorff, Hoang-Oanh Nghiem, Pierre Wins, Bernard Lakaye A general method for the chemical synthesis of y-32P-labeled or unlabeled nucleoside 5'-triphosphates and thiamine triphosphate// Analytical Biochemistry — 2003-Vol. 322-P. 190-197.

14. I.M.Glynn, J.B.Chappell A Simple Method for the Preparation of 32P-Labelled Adenosine Triphosphate of High Specific Activity// Biochem.J. 1964 - Vol. 90 -P. 147-149

15. A.M. Maxam, W. Gilbert Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages.// Methods Enzymology, Part I 1980 - Vol. 65 - P. 499-518

16. M.Stupar, V.Leskovac // Jogoslav. Physiol. Pharmacol. Acta 1982 - Vol.18 -P. 269.

17. K.Schendel, M.Wells The Synthesis and Purification of y-32P. -Adenosine Triphosphate with High Specific Activity// J. Biol. Chem. 1973 - Vol. 248 - P. 8319

18. Walseth TF, Johnson RA. The enzymatic preparation of alpha-32P.nucleoside triphosphates, cyclic [32P]AMP, and cyclic [32P] GMP// Biochim. Biophys. Acta 1979-Vol. 562-(1)-P. 11-31.

19. Banschke K.G. Patent DDR № 212391, 1984.

20. J. Linn Patent PCT № 0577 255 A2, 1994.

21. Symons R.H. Modified procedure for the synthesis of 32P-labelled ribonucleoside 5'-monophosphates of high specific activity.// Biochim. Biophys. Acta 1968 - Vol. 155 - (2) - P. 609-610.

22. Biebricher С.К. A simple procedure for the synthesis of a-32P.-nucleoside triphosphates.// Anal. Biochem. 1979 - Vol. 95 - (2) - P. 429-432.

23. Anthony E. Reeve and Ru Chih C.Huang A method for the enzymatic synthesis and purification of a-32P. nucleoside triphosphates.// Nucleic Acids Res. 1979 -Vol. 6-(1)-P. 81-90.

24. Symons R.H. Preparation of a-32P.nucleoside and deoxynucleoside 5'-triphosphates from 32Pi and protected and unprotected nucleosides.// Biochim. Biophys. Acta 1969 - Vol. 190 - (2) - P. 545-557.

25. Пумпен П.П., Тауринь В.Э., Грен Э.Я. Синтез нуклеотидов in vitro ферментами бесклеточного экстракта Escherihia coli. // Биохимия — 1974 — т.39 №3 - С. 504-511.

26. Рихтер В.А., Рабинов И.В., Кузнецов С.А., Павлий Т.Б., Скоблов Ю.С. Выделение и некоторые свойства нуклеозидмонофосфаткиназ из ESCHERICHIA COLI.// Приклад, биохим. микробиол.- 1988 т. XXIV - №3 -С. 310-318

27. Lehman I.R.,Bessman M.J., Simms E.S., Komberg A. Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. Preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherihia coli.// J.Biol.Chem. 1958 - Vol. 233 - (1) - P. 163-170.

28. Correction and Addition Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (NC-IUB).// Eur.J.Biochem. 1980 - Vol. 104 - (1) - P. 3.

29. Lehman I.R., Bessman M.J., Simms E.S., Kornberg A. Preparation of substrates and partial purification of an enzymes from Escherihia coli.// J. Biol. Chem. 1958 - Vol. 233 - (1) - P. 163-170.

30. Hurwits J. The enzymatic incorporation of ribonucleosides into polydeoxynucleotides material.// J. Biol. Chem. 1959 - Vol. 234 - (9) - P. 2351-2358.

31. Bresler A.E., The preparation of labelleduridine-5'-triphosphates by the action of mono- and diphosphokinase from Escherihia coli.// Biochem. Biophys. Acta -1962 Vol. 61 - (1) - P. 29-33.

32. Hiraga S., Sugino Yu. Nucleoside monophosphokinases of Escherihia coli infected and uninfected with an RNA phages.// Biochem. Biophys. Acta 1969 — Vol. 119-(2)-P. 416-418.

33. M.P. Oescher and M.J. Bessman Purification and properties of guanylate kinase from E. coli.// J. Biol. Chem. 1966 - Vol. 241 - (2) - P. 5453-5460

34. Gentry D., Bengra C., Ikehara K. & Cashel M. Guanylate kinase of Escherichia coli K-12.// J. Biol. Chem. 1993 - Vol. 268 - P. 14316-14321.

35. Nelson D.J., Carter Ch.E. Purification and characterization of thymidine 5'-monophosphate from Escherihia coli B.// J. Biol. Chem. 1969 - Vol. 244 - (19) -P. 5254-5262.

36. Holmes,R.K. and Singer,M.F. Purification and characterization of adenylate kinase as an apperent adenosine triphosphate dependnt inhibitor of ribonuclease II in Escherchia coli.// J. Biol. Chem. - 1973 - Vol. 246 - P. 2014-2021.

37. M.Brune, R.Schumann and F.Wittinghofer Cloning and sequencing of the adenylate kinase gene (adk) of Escherchia coli.// Nucleic Acids Res. 1985 - Vol. 13-(19)-P. 7139-7151.

38. I.S. Girons, A-M. Gilled, D. Margarita, S. Michelsonl, M. Monnot, S. Fermandjian, A. Danchin, and O. Barzu Structural and Catalytic Characteristics of Escherichia coli Adenylate Kinase.// J. Biol. Chem. 1987 - Vol. 262 - (2) - P. 622-629.

39. Watanabe K., Fukumoto H., Isoi K. Intracellular localization of ATP: AMP phosphotranspherase in Escherchia coli.// Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1986 Vol. 134 - (2) - P. 527-531.

40. Marco-Marin C., Rubio V. The site for the allosteric activator GTP of Escherichia coli UMP kinase. // FEBS Lett. 2009 - Vol. 583 - (1) - P. 185-189.

41. Yamanaka K., Ogura T., Niki H., and Hiraga S. Identification and Characterization of the smbA Gene, a Suppressor of the mukB Null Mutant of Escherichia coli.// J. Bacteriol. 1992 - Vol. 174 - P. 7517-7526.

42. Huang S. H., Tang A., Drisco B., Zhang S. Q., Seeger R., Li C., Jong A. Human dTMP kinase: gene expression and enzymatic activity coinciding with cell cycle progression and cell growth.// DNA Cell Biol. 1994 - Vol. 13 - P. 461471.

43. Lee, L. S., Cheng, Y. Human thymidylate kinase. Purification, characterization, and kinetic behavior of the thymidylate kinase derived from chronic myelocytic leukemia. //J. Biol. Chem. 1977 - Vol. 252-P. 5686-5691.

44. Su, J. Y., Sclafani, R. A. Molecular cloning and expression of the human deoxythymidylate kinase gene in yeast.// Nucleic Acids Res. 1991 - Vol. 19 - P. 823-827.

45. Arima T., Akiyoshi H. and Fujii S. Characterization of pyrimidine nucleoside monophosphokinase in normal and malignant tissues. Cancer Res. — 1977 Vol. 37-P. 1593-1597.

46. Klelly R.K. Purification and Properties of Thymidine Monophosphate Kinase from Mouse Hepatoma. // J. Biol. Chem. 1970 - Vol. 245 - P. 4204-4212.

47. Maness P., Orengo A. A pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from rat liver. //Biochemistry 1975 - Vol. 14-P. 1484-1489.

48. Van Rompay A.R., Johansson M., Karlsson A. Phosphorylation of deoxycytidine analog monophosphates by UMP-CMP kinase, molecular characterisation of the human enzyme. // Mol. Pharmacol. 1999 - Vol. 56 — P. 562-569.

49. Hande K.R. and Chabner B.A. Pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from human leukemic blast cells. // Cancer Res. 1978 - Vol. 38 - P. 579-585.

50. Scott E.M. and Wright R.C. Kinetics and equilibria of pyrimidine nucleoside monophosphate kinase from human erythrocytes. // Biochim. Biophys. Acta -1979-Vol. 571-P. 45-54.

51. Shimono H., Sugino Y. Metabolism of desoxyribonucleotides. Purification and properties of deoxyguanosine monophosphokinase of calf thymus, // Eur. J. Biochem.-1971-Vol. 19-P. 256-263.

52. Agarwal K. C., Miech R. P., Parks R. E. Jr. Guanylate kinases from human erythrocytes, hog brain and rat liver. // Methods Enzymol. 1978 Vol. 51 - P. 483 -490.

53. Zschocke, P. D., Schiltz, E., and Schulz, G. E. Purification and sequence determination of guanylate kinase from pig brain. // Eur. J. Biochem. 1993 - Vol. 213-P. 263-269.

54. Hall S., Kiihn H. Purification and properties of guanylate kinase from bovine retinas and rodouter segments. // Eur. J. Biochem. 1986 - Vol. 161 - P. 551-556.

55. Galdarov I.O., Suslov O.N., Ovchinnikova T.V., Abdulaev N.G. Guanylate kinase from bovine retina: isolation, primary structure, and expression in E. coli. // BioorgKhim.- 1994-Vol. 20-(4)-P. 367-381.

56. Richard E. Boehme Phosphorylation of the antiviral precursor9-(l,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanine monophosphate by guanylate kinase isoenzyme. // J. Biol. Chem. 1984 - Vol. 259 - P. 12346-12349.

57. Noda L. and Kuby S.A. Adenosine triphosphate adenosine monophosphate transphosphorilase (myokinase). // J. Biol. Chem. - 1957 - Vol. 226 - P. 541-549.

58. Heil A., Muller G., Noda L., Pinder T., Schirmer I., Schirmer R. H., and Von Zabern, I. The amino-acid sequence of porcine adenylate kinase from skeletal muscle. // Eur. J. Biochem. 1974 - Vol. 43 - (1) - P. 131-144.

59. Thuma E., Schirmer R.H. & Schirmer I. Preparation and characterization of crystalline human ATP:AMP phosphotransferase. // Biochim. Biophys. Acta -1972-Vol. 268-(1)-P. 83 -91.

60. Tamura T., Shiraki H. and Nakagawa H. Purification and characterization of adenylate kinase isozymes from rat muscle and liver. // Biochim. Biophys. Acta -1980 Vol. 612 - (1) - P. 56-66.

61. Noda L., Schulz G.E. & von Zabern I. Crystalline adenylate kinase from carp muscle. // Eur. J. Biochem. 1975 - Vol. 51 - (1) - P. 229-235.

62. Markland F.S. & Wadkins, C.L. Adenosine triphospate adenosine 5'-monophosphate phosphotransferase of bovine liver mitichondria. // J. Biol. Chem. - 1966 - Vol. 241 - (18) - P. 4136-4145.

63. Sapico V., Litwack G. & Criss W.E. Purification of rat liver adenylate kinase isizyme II and comprison with isozyme III. // Biochim. Biophys. Acta 1972 -Vol. 258-(2)-P. 436-445.

64. Hamada M., Sumida M., Okuda H., Watanabe Т., Nojima M., and Kuby, S.A. Adenosine Triphosphate-Adenosine-5'-monophosphate Phosphotransferase from Normal Human Liver Mitochondria. // J. Biol. Chem. 1982 - Vol. 257 - P. 13120-13128.

65. Chiga M. & Plaut G.W. E. Purification and properties of an adenosine triphosphate adenosine monophosphate transphosphorylase from swine liver. // J. Biol. Chem. - 1960 - Vol. 235 - (11) - P. 3260-3265.

66. Itakura Т., Watanabe K., Shiokawa H. & Kubo S. Purification and characterization of acidic adenylate kinase in porcine heart. // Eur. J. Biochem. — 1978 Vol. 82 - (2) - P. 431 - 437.

67. A. G. Tomasselli, R.H. Schirmr, and L.H. Noda Mitochondrial ATP :AMP Phosphotransferase from Beef Heart : Purification and Properties. // Eur. J. Biochem. 1980 - Vol. 103 - P. 481-491.

68. Tsuboi, К. K. & Chervenka, С. H. Adenylate kinase of human erythrocyte. // J. Biol. Chem. 1975 - Vol. 250 - (1) - P. 132- 340.

69. Tomasselli A.G. & Noda L.H. Mitochondrial GTP-AMP Phosphotransferase. 1. Purification and Properties. // Eur. J. Biochem. 1979 - Vol. 93 - P. 263 - 270.

70. Hamada M., and Kuby S. A. Studies on adenosine triphosphate transphosphorilase. // Arch. Biochem. Biophys. 1978 - Vol. 190 - (2) - P. 772792.

71. Rhoads, D. G., and Lowenstein, J. M. Initial velocity and equilibrium of myokinase. // J. Biol. Chem. 1968 - Vol. 243 - (14) - P. 3963-3972.

72. И.К. Духницкая Получение набора ферментов для синтеза у-32(33)Р. АТР.// Дисс.канд.биол.наук. ЛТИ им. Ленсовета, Ленинград — 1991.

73. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Абдукаюмов М., Петренко Т.Д., Козлов А.В. Способ получения аденозин-5'- трифосфата, меченного радиоактивными изотопами фосфора в гамма- положение // Авторское свидетельство 1986 - № 245965

74. Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Рабинов И.В., Петренко Т.Д., Волкова И.И., Абдукаюмов М. Способ одновременного получения нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32(33) в альфа и гамма положение// Авторское свидетельство — 1988 № 281100

75. Микулинская Г.В., Мирошников А.И., Скоблов Ю.С., Скоблова Н.А., Третьякова С.Ю., Феофанов С.А. Способ синтеза нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора в альфа-положении. // Патент РФ 2009 № 2355768

76. Hayashi F, Hatano O, Shinozawa T Preparation of highly concentrated superhot gamma-32P.ATP using small-scale ion-exchange chromatography. // Radioisotopes. 1987 - Vol. 36 - (7) - P. 347-350.

77. Lucien Bettendorff, Hoang-Oanh Nghiem, Pierre Wins, Bernard Lakaye A general method for the chemical synthesis of y-32P-labeled or unlabeled nucleoside 5'-triphosphates and thiamine triphosphate. // Anal. Biochem. 2003 -Vol. 322-(1)-P. 190-197.

78. Ажаев A.B., Абдукаюмов M., Гнучев Н.В., Краевский А.А., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П. Способ очистки нуклеозид-5'-трифосфатов, меченных фосфором-32(33) // Авторское свидетельство 1987 - № 247519

79. Кузнецов С.А., Ли В.А., Осинский В.Ф., Петренко Т.Д., Рабинов И.В., Скоблов Ю.С., Рихтер В.А. Способ очистки нуклеотидов, меченных фосфором-32 и фосфором-33// Авторское свидетельство — 1991 № 1715218

80. Richardson, С. С. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. // Proc.Nat. Acad. Sci. — 1965 Vol. 54 -(1)-P. 158-165.

81. Lillehaug, J. R. and Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. // Biochem. 1975 - Vol. 14 - (6) - P. 1225-1225

82. Feinberg A.P., Vogelstein B. A technique for radiolabeling DNA restriction endonuclease fragments to high specific activity.// Anal Biochem. 1983 - Vol. 132 - (1) — P. 6-13.

83. Абдукаюмов М., Рабинов И.В., Рихтер В.А., Скоблов Ю.С., Хабибуллаев П.К. Способ выделения нуклеозидмонофосфаткиназ // Авторское свидетельство 1986 - № 1274295

84. M.J.Bessman, S.T.Herriot, M.J.V. Bibber Orr THE ENZYMOLOGY OF VIRUS-INFECTED BACTERIA. VI. PURIFICATION AND PROPERTIES OF THE DEOXYNUCLEOTIDE KINASE INDUCED BY BACTERIOPHAGE T5. // J.Biol.Chem. 1965 - Vol. 240 - (1) - P.439-445

85. Mikoulinskaia G.V., Gubanov S.I., Zimin A.A.,Kolesnikov I.V.,Feofanov S.A., Miroshnikov A.I.Purification and characterization of the deoxynucleoside monophosphate kinase of bacteriophage T5. // Protein Expr. Purif 2003 - Vol. 27 -P. 195-201

86. R.E. O'Brien, N.R. Tzodikov. // Patent US 1983 - № 4390517.

87. N.R. Tzodikov Patent US 1983 - №4411881.

88. Скоблов Ю.С., Лосев А.П., Сметанин Э.Я., Фределинг Жан Пьер, Королев А.Э., Гжива Надина Способ получения водных растворов препаратов, меченных р- радионуклидами. // Патент РФ 1998 - № 2104035.

89. Y. Furuichi and A. J. Shatkin A simple method for the preparation of P-32P.purine nucleoside triphosphates. // Nucleic Acids Res. 1977 - Vol. 4 - (10) -P. 3341-3355

90. Скоблов М.Ю., Ясько М.В., Скоблов Ю.С. Получение 32Р-меченных 2-метилтио-аденозин ди- и трифосфатов.// Биоорган, химия — 1999 — т.25 — N 9- С.702-707

91. А.Н. Warner. A simple and inexpensive method for the preparation of |3,y-32P. guanosine 5'-triphosphate. // Biochim. Biophys. Acta 1975 - Vol. 383 - P. 229-235.

92. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976 - Vol. - 7 - (1) - P. 248-254.

93. Laemmly U.K., Favre M. Maturation of the head of backteriopage T4. DNA packaging events. // J. Mol. Biol. 1973 - Vol. 80 - (2) - P. 575-599.

94. Holbrook I.B., Leaver A.G., A procedure to increase the sensitivity of staining by coomassie brilliant blue G-250 perchloric acid solution. // AnaLBiochem. - 1976 - Vol. 75 - (2) - P. 634-636.

95. Л.А.Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот, изд. Московский центр непрерывного математического образования. Москва -2002-С. 112.

96. Schenbom, Е.Т. and Mierendorf, R.C. A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: Dependence on template structure. // Nucl. Acids Res.- 1985 Vol. 13 - P. 6223-6236.

Информация о работе

Скоблов, Юрий Самойлович
доктора химических наук
Москва, 2010
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы