Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

β-ксилозидаза из Aspergillus awamori: свойства и использование в ферментативном синтезе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "β-ксилозидаза из Aspergillus awamori: свойства и использование в ферментативном синтезе"

На правах рукописи

УДК 577.152.32

Г'

Энейская Елена Владимировна

ß-КСИЛОЗИДАЗА ИЗ ASPERGILLUS A WAMORI: СВОЙСТВА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ФЕРМЕНТАТИВНОМ СИНТЕЗЕ

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ГАТЧИНА 2006г.

Работа выполнена в Петербургском институте ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Неустроев Кирилл Николаевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация-

доктор биологических наук, профессор Пучкова Людмила Валентиновна доктор биологических наук Янковский Олег Юлианович

Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук

Зашита диссертации состоится ¿Lft/SJJ 2006 г. в " " часов на заседании Диссертационного совета К 208 088.01 при ГОУ ВПО Санкт-Петербургская Государственная Химико-Фармацевтическая академия по адресу 197 376 Санкт-Петербург, ул Проф Попова, Д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Санкт-Петербургская Государственная Химико-Фармацевтическая академия по адресу: 197 376 Санкт-Петербург, ул. Проф. Попова, д. 14.

Автореферат разослан '¿^ " ^ г

Учёный секретарь

Диссертационного совета К 208.088 01 кандидат биологических наук

Караваева А В.

АУР б А-

6ГГГ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе Гликозидгидролазы - ферменты, способные ускорить гидролиз гликозидной связи более чем в 10'7 раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих катализаторов Поэтому интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен не только фундаментальными, но и прикладными задачами Ксилан - основной структурный полисахарид клеток растений Основными компонентами ксиланолитической системы, определяющими скорость гидролиза ксилана, являются два типа ферментов эндо-ксиланазы, гидролизующие ксилан до коротких ксилоолигосахаридов, и Р-ксилозидазы, расщепляющие короткие ксилоолигосахариды до ксилозы и являющиеся ключевыми ферментами полной деградации ксилана Огромный интерес к изучению системы ферментов, участвующих в метаболизме этого полимера, связан с их широким применением в биотехнологии - целлюлозно-бумажной, текстильной и пищевой промышленности, и постоянно стимулирует два основных направления исследований поиск новых источников ферментов и подробное изучение их ферментативных свойств, дающее возможность более эффективно использовать данные ферменты в биотехнологических процессах Второе направление возможного использования гликозидгидролаз в биотехнологии основывается на том факте, что многие представители этого класса ферментов обладают не только гидролитической, но и трансгликозилирующей - синтазной активностью, и способны осуществлять ферментативный синтез различных гликоконьюгатов Метод ферментативного синтеза имеет неоспоримые преимущества в сравнении с органическим, который является гораздо более дорогостоящим, трудоемким и экологически вредным Получение данных о взаимосвязи строения активного центра ферментов и их способности к проведению реакции трансгликозилирования, несомненно, важно, так как дает возможность эффективно использовать трансгликозидазы в ферментативном синтезе и позволяет получить новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом В данной работе подробно изучены физико-химические свойства, кинетические параметры реакции гидролиза и трансгликозилирующая активность фермента (3-ксилозидазы из мицелиального гриба АчрегцШт смапхпп, описан ферментативный синтез пара-нитрофенил- и метилумбеллиферил-ксилоолигосахаридов и возможность использования данных соединений в качестве субстратов для исследования ферментативных свойств экзо- и эндо-гликозидгидролаз, способных гидролизовать ксилоолигосахариды

Основные цели и задачи диссертационной работы. Целью данной работы является подробное структурно-функциональное исследование Р-ксилозидазы из мицелиального гриба

Aspergillus awamori с последующим использованием реакции трансгликозилирования, катализируемой изучаемым ферментом в синтезе модифицированных ксилоолигосахаридов Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи

1 Выделение и очистка фермента ß-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori до гомогенного состояния

2 Изучение физико-химических свойств фермента

3 Исследование стереохимии гидролиза и характера действия ß-ксилозидазы

4 Исследование трансгликозилирующей активности фермента и характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии

5 Анализ кинетических характеристик и констант ингибирования реакции гидролиза, катализируемой ß-ксилозидазой

6 Выделение и очистка ß-ксиланаз из мицелиального гриба Aspergillus опте (семейство 10) и мицелиального гриба Т reesei (семейство 11)

7 Исследование продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой изучаемой ß-ксилозидазой, в качестве субстратов для эндо-ксиланаз семейств 10 и 11

Научная новизна работы. В данной работе был впервые выделен и очищен до гомогенного состояния фермент ß-ксилозидаза из мицелиального гриба Aspergillus awamori Изучены физико-химические характеристики данного фермента, установлена гомология исследуемой ß-ксилозидазы с представителями семейства 3 гликозидгидролаз, детально изучена трансгликозилирующая активность фермента, методами ЯМР и масс-спектрометрии получены характеристики структур продуктов трансгликозилирования, проведен подробный анализ кинетических характеристик и констант ингибирования реакции гидролиза, катализируемой ß-ксилозидазой С применением реакции трансгликозилирования, катализируемой ß-ксилозидазой, синтезированы ла/?а-нитрофенил-ксилоолигосахариды со степенью полимеризации (с п) 2-7 и метилумбеллиферил-ксилоолигосахариды со с п 3-5, и показана возможность использования данных соединений в качестве субстратов для исследования ферментативных свойств изучаемой в данной работе ß-ксилозидазы и эндо-ксиланаз семейств 10 и 11

Практическая значимость. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание механизма действия представителей семейства 3 гликозидгидролаз. Подробное исследование реакции трансгликозилирования, катализируемой ß-ксилозидазой из Aspergillus awamori, имеет большое значение для решения как фундаментальных, так и прикладных задач, так как дает возможность эффективно использовать трансгликозилирующую активность ß-ксилозидазы в ферментативном синтезе различных гликоконьюгатов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 ß-Ксилозидаза из мицелиального гриба Aspergillus awamiiri относится к семейству 3 гликозидгидролаз

2 Исследуемая ß-ксилозидаза является ферментом экзо-действия

3 Фермент катализирует гидролиз гликозидной связи с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата

4 ß-Ксилозидаза катализирует реакцию трансгликозилирования

5 Синтезированные с использованием реакции трансгликозилирования, катализируемой ß-ксилозидазой, хромофорно и флуоресцентно меченые ксилоолигосахариды являются эффективными субстратами для изучения структурно-функциональных свойств экзо- и эндо- гликозидгидролаз, способных гидролизовать ксилоолигосахариды

Личный вклад соискателя. Соискателем проведено выделение и очистка всех используемых в работе ферментов, исследование физико-химических свойств, кинетических характеристик и констант ингибирования реакции гидролиза, катализируемой ß-ксилозидазой Подробно изучена трансгликозилируюшая активность фермента Ферментативно синтезированы хромофорно и флуоресцентно меченые ксилоолигосахариды и проведено исследование данных соединений в качестве субстратов для эндо-ксиланаз семейств 10 и 11 Апробация работы. Материалы работы представлены на 2-ом немецко-польско-российском Симпозиуме по бактериальным углеводам (Москва, сентябрь 10-12, 2002) По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ (статьи)

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 107 страницах, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 21 рисунком

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В обзоре литературы дано представление о современной классификации и механизме действия О-гликозидгидролаз Охарактеризованы источники и структура ксиланов -природных субстратов ß-ксилозидаз Проведена сравнительная характеристика физико-химических и структурно-функциональных свойств ß-ксилозидаз Дано представление о механизме действия реакции трансгликозилирования и возможности использования данной реакции в ферментативном синтезе различных гликоконьюгатов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Методы измерения ферментативной активности. ß-Ксилозидазную активность всех ферментных препаратов измеряли спектрофотометрическим методом с использованием пара-

нитрофенил-Р-О-ксилопиранозида (и-НФК) в качестве субстрата (З-Ксиланачную активность ферментных препаратов определяли по методу Сомоджи-Нельсона с использованием ксилана в качестве субстрата

Выделение р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori. Культивацию мицелиального гриба Aspergillus awanwri проводили согласно процедуре, описанной нами для мицелиального гриба Trichoderma ree.sei (Golubev et al, 2000) Выделение и очистку |3-ксилозидазы достигали с применением пяти хроматографических стадий ионообменная хроматография на колонках DEAE Toyopearl, TSK DEAE-5PW и TSK SP 5PW (Pharmacia-LKB), фенилинтеракция на колонке Phenyl-Superose HR (Pharmacia Biotech) и гель-фильтрация на колонке Sephacryl S-200 (Pharmacia)

Методы определение чистоты и молекулярной массы ферментов. Чистоту и молекулярную массу ферментов в денатурирующих условиях устанавливали с использованием электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле в присутствии ДСН Определение молекулярной массы нативного белка выполняли методом гель-фильтрации Методы определения частичной аминокислотной последовательности fi-ксилозидазы. Набор пептидов (З-ксилозидазы получали обработкой фермента бромцианом Очистку пептидов достигали с применением гель-фильтрации и ВЭЖХ Определение аминокислотной последовательности пептидов осуществляли методом автоматической деградации по Эдману (выполнено в лаборатории химии белков, Институт биотехнологии, Финляндия) Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей полученных пептидов, осуществляли с помощью программы CLUSTAL W

Методы исследования физико-химические свойств Р-ксилозидазы. Влияние рН и температуры на активность и стабильность фермента исследовали 8 диапазоне значений рН 3 -9 в растворах 100 мМ натрий-цитрат-фосфатного буфера и диапазоне температур 30 - 80°С Влияние ионов металлов на активность (3-ксилозидазы исследовали в присутствии 0 1 М ЭДТА или ионов двухвалентных металлов Са2*, Mg2*, Мтг*, Zn2*, Си2*, Ре2* в диапазоне концентраций 0 01-0 1 мМ

Методы определение кинетических характеристик и констант ингибирования реакций гидролиза, катализируемых ферментами. Кинетические характеристики реакций гидролиза, катализируемых ферментами - константы Михаэлиса (К„) и каталитические константы скоростей гидролиза (Ктт) каждого из субстратов определяли методом начальных скоростей в диапазоне различных концентраций субстратов 0,1-8 Ки с последующей обработкой данных с помощью нелинейного регрессионного анализа уравнения Михаэлиса-Ментен Константы конкурентного ингибирования (К„) определяли в диапазоне концентраций ингибитора 0,1 -8 К„ для четырех различных концентраций субстрата

Определение стереохимии ферментативного гидролиза ß-ксилозидазы методом *Н ЯМР спектроскопии. Концентрации субстрата (л-НФК) и продуктов реакции гидролиза определяли, интегрируя характерные пики для каждого соединения сигнал 5 4 ррм соответствовал протону HI остатка л-НФК, сигнал 5.2 ррм соответствовал протону HI остатка а-ксилозы и сигнал 4.6 ррм соответствовал протону H1 остатка ß-ксилозы. Исследование трансгликозилируюшей активности ß-ксилозидазы. Наличие

трансгликозилирующей активности фермента исследовали, проводя реакцию в растворах 50 мМ натрий - ацетатного буфера pH 4.0 и натрий-фосфатного буфера pH 6.5 с исходной концентрацией л-НФК и метилумбеллиферил-ксилобиозида (МУФК>) 100 мМ Продукты реакции анализировали методом ТСХ и ВЭЖХ.

Исследование влияния pH и концентрации n-НФК и МУФК2 на выход продуктов трансгликозилирования. Влияние pH на выход продуктов трансгликозилирования исследовали при проведении реакции в диапазоне значений pH 3 - 8 5 в 50 мМ в растворах фосфат-цитратного буфера Влияние концентрации л-НФК и МУФК2 на выход продуктов трансгликозилирования исследовали в серии экспериментов с различным диапазоном исходных концентраций субстрата 5 - 200 мМ

Препаративный синтез л-НФ- и МУФ- ксилоолигосахаридов (КОС). Синтез л-НФКОС со сп 2 и 3 и МУФКОС со с.п. 3-5 осуществляли в растворе 50 мМ натрий-фосфатного буфера pH 6 5 с исходной концентрацией субстратов 100 мМ Для синтеза л-НФКОС со с п. 4-7 использовали синтезированный на предыдущей стадии л-НФКОС со с п 3 Продукты реакции трансгликозилирования разделяли методом ВЭЖХ и гель-фильтрации

Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методом ЯМР. Все 'Н и ПС ЯМР спектры регистрировали на ЯМР спектрометре АМХ-500 Bruker ("Н 500 13 МГц, "С 125 МГц,) в ДгО при комнатной температуре, с использовании ацетона в качестве внутреннего стандарта Химические сдвиги определяли относительно внутреннего стандарта 2.225 ррм для 'Н и 31 5 ррм для "С Результаты анализировали с использованием пакета программ XW1NNMR (Bruker).

Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования ß-ксилозидазы методом масс-спектрометрии. Масс-спектры продуктов трансгликозилирования снимали в режиме регистрации положительных ионов на Micromass Q-TOF2 (ортогонально ускоряющий квадруполь/время-пролетный масс-спектрометр), соединенном с нанофлоу источником ионов (Micromass, Manchester, UK), (Королевский институт биотехнологии, Швеция) Для создания центроидного спектра использовали 60-80 индивидуальных МС/МС спектров Для калибровки МС/МС спектров была использована масса моноизотопного фрагментарного иона В-2 (287 0743 массовой единицы).

Исследование характера действия ксиланаз семейств 10 и 11 по отношению к ферментативно синтезированным л-НФК2.« и МУФКд.5. Реакции гидролиза л-НФК2-б и МУФКч.5. катализируемые исследуемыми ксиланазами, проводили в растворе 50 мМ натрий-ацетатного буфера рН 4.0 с исходной концентрацией субстрата 1 2 мМ при 37°С Продукты гидролиза разделяли методом ВЭЖХ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и физико-химические свойства Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamorL Секретируемая P-D-ксилозидаза была выделена из культуральной жидкости мицелиального гриба Aspergillus awamori и очищена до гомогенного состояния с использованием пяти хроматографических стадий (табл. 1).

Таблица 1. Стадии выделения Р-ксилозидазы

Стадия очистки Объем, мл Общее к-во белка, мг Общая активность, ед. Удельная активность, ед/мг Степень очистки Выход %

Культуральная жидкость 4000 60000 64 1.07x10'3 1 100

DEAE Toyopearl 1000 3384 44 0.013 12.1 68 7

TSK DEAE-5PW 100 240 32 0.13 121 50.0

TSK SP-5PW 40 45.5 23 05 467 35 9

Phenyl-Superose 1 2 9.6 14 5 1.5 1401 22 6

Sephacryl S-200 5 20 8.5 4.2 3925 13.3

Очищенный фермент имел удельную активность 4 2 ед/мг. Анализ очищенного фермента в денатурирующих условиях с использованием электрофореза в полиакриламидном геле показал, что фермент мигрирует в виде единичной зоны с молекулярной массой 125±1 кДа Молекулярная масса нативного фермента, оцененная при помощи гель-фильтрации, составила 250±5 кДа Сравнение данных результатов позволяет сделать вывод, что фермент имеет массу 250±5 кДа и состоит из двух одинаковых субъединиц р-Ксилозидаза обладает наибольшей активностью в диапазоне рН 3 5 - 4 5 Фермент демонстрирует большую стабильность при кислых рН и сохраняет более, чем 80% активности при инкубации в течение часа при температуре 60°С Присутствие ионов металлов Са2*, Мп2*, Си2*, Яе2* и ЭДТА, не оказывают влияния на активность фермента

Исследование первичной структуры Р-ксилозидазы. По результатам сравнительного анализа аминокислотных последовательностей пептидов, полученных обработкой фермента бромцианом, была установлена высокая степень гомологии аминокислотной

последовательности изучаемой (3-ксилозидазы с Р-ксилозидазами семейства 3 гликозидгидролаз

Исследование стереохимии гидролиза и характера действия Р-ксилозидазы. Анализ продуктов гидролиза и-НФК методом 'Н ЯМР показал, что на промежуточных этапах гидролиза и по завершении реакции (0-5 мин) в реакционной смеси наблюдается только сигнал 4 6 ррм, соответствующий протону Н1 остатка Р-ксилозы (рис I) В течение последующего времени (5-30 мин) появляется сигнал 5.2 ррм, соответствующий протону Н1 остатка а-ксилозы, возникающий в результате мутаротации О-ксилозы

Рисунок 1 'Н ЯМР спектры реакции гидролиза и-НФК:

1

_J_1_лЖ

1 , I л

в начальный момент времени, О мин (нижний); по окончании реакции, 5 мин (средний), через 60 мин (верхний).

М» 7Л 72 «Я Я.4 Я» 1Л

44 4 Я

Таким образом результаты 'Н ЯМР эксперимента служат очевидным доказательством того, что фермент катализирует гидролиз с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата Характер действия р-ксилозидазы определяли при исследовании гидролитической активности фермента по отношению к р-(1-4)-связанным л-НФКОС со с п 2-6. Анализ продуктов гидролиза методами ТСХ и ВЭЖХ на начальных этапах реакции показали, что в качестве главного продукта реакции наблюдается ксилоза и олигосахарид, который на одну ксилозную единицу короче, чем исходный субстрат. Продуктом полного ферментативного гидролиза субстрата являлась только ксилоза Полученные данные в совокупности с данными исследования продуктов ферментативного гидролиза и-НФК методом 'Н ЯМР спектроскопии позволяют утверждать, что данная р-ксилозидаза является ферментом экзо-действия и имеет только один гликон-связывающий сайт

Исследование трансгликозилирующей активности Р-ксилозидазы. Исследование трансгликозилирующей активности Р-ксилозидазы, проводили с использованием в качестве субстратов л-НФК и МУФК2 при концентрации 100 мМ Анализ продуктов реакции методом ВЭЖХ и ТСХ, показал появление модифицированных КОС со с п. больше, чем исходный субстрат, возникающих в результате трансгликозилирующей активности фермента Исследование условий ферментативного синтеза при различных значениях рН показало, что максимальный выход продуктов реакции трансгликозилирования был получен при рН 6 5, в то время как рН-оптимум реакции гидролиза находится в области рН 4 - 4 5 (рис 2)

Рисунок 2. рН-Зависимость гидролитической активности Р-ксилозидазы из

Aspergillus awamon (О)

л-НФК. и-НФК

100

80-

bos'

X

Л 40 ^ 20-

0-

и формирования продуктов реакции трансгликозилирования-и-НФКг (•) и и-НФКт (7)

рН

Изучение влияния концентрации субстрата на . выход продуктов реакции трансгликозилирования позволяет сделать вывод, что существенное увеличение выхода происходит в диапазоне концентраций 0-50 мМ (рис 3) Оптимальная степень глубины реакции при получении максимального выхода продуктов реакции трансгликозилирования составила 60% Количественное определение получаемых в результате ферментативного синтеза п-НФ и МУФ-ксилоолигосахаридов в оптимизированных условиях показало, что фермент катализирует достаточно высокий выход п-НФ-ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 2 и 3 - 29% и 7% соответственно, и несколько меньший выход МУФ-ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 3 и 4 - 21% и 12% соответственно Было показано, что для эффективного синтеза более длинных л-НФКОС в качестве исходного субстрата можно использовать полученный на предыдущей стадии л-НФК. имеющий с п 3 (табл. 2).

Рисунок 3. Зависимость образования продукта реакции трансгликозилирования (п-НФК2),катализируемой Р-ксилозидазой, от концентрации исходного субстрата (л-НФК)

25-

20-

15-

Ю

1-'-1---1-1-1---1-1-г"

о 20 40 60 80 100

Концентрация л-НФК, мМ

Таблица 2. Выход продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой (3-ксилозидазой.

Исходный субстрат Продукт реакции трансгликозилирования Выход,%

я-НФК п-НФК2 29.0

л-НФКз 7.0

л-НФКэ л-НФК, 29.15

л-НФК5 12 63

л-НФК« 3.91

л-НФК7 0 88

МУФК, МУФК, 21 0

МУФК4 12.0

МУФК, 6.0

МУФКб 30

Работы по исследованию трансгликозилирующей активности Р-ксилозидаз немногочисленны Описана только одна Р-ксилозидаза из Trichoderma reesei, которая демонстрирует похожие выходы л-НФКз (18%) и л-НФКз (6%) в реакции трансгликозилирования с использованием в качестве акцептора я-НФК, причем данный фермент, как и исследуемая нами Р-ксилозидаза, относится к семейству 3 гликозидгидролаз (Herrmann et al, 1997) Таким образом изучаемая в данной работе Р-ксилозидаза из Aspergillus awamori обладает наиболее эффективной

трансгликозилирующей способностью среди исследованных Р-ксилозидаз Данный фермент является потенциальным объектом для улучшения его трансгликозилирующей активности методом сайт-направленного мутагенеза на основании структурно-функциональных исследований, проведенных в данной работе и наших работах по исследованию трехмерной структуры (3-ксилозидазы из Tr'uhoderma ree¡,ei (Golubev et al, 2000; Rojas et al, 2005) Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования методами ЯМР и масс-спектрометрии. ESI-TOF МС каждого из очищенных полисахаридов показывают только один пик, соответствующий иону (М + Na)* и ассоциированные изотопные пики. Предпочтительной фрагментацией, наблюдаемой для каждого соединения, была потеря нейтрального л-НФ при разрыве гликозидной связи, давая натриевые В-серии ионов (Рис. 4) В каждом спектре В-серии натриевых ионов были легко идентифицированы от В„ до Вз, где п соответствует числу ксилозных единиц в олигосахариде Картина фрагментации, полученная для каждого соединения в серии, таким образом, ясно указывает стехеометрию ксилозных остатков с увеличивающимися молекулярными массами.

а.

»1 г*. г*, Г*1 г*. КЬ»- 9? 9.J B.-J Я,- м ■ т МО Рисунок 4. МС/МС Г спектр я-НФК4. i

> «Ц И* т ¡ni т "•Г 1К»

iio 1 5¿e ' Я л ' ей ' efa ' 01 ММ 7¿0 ' 7SÖ ' вСв*1

Все пики 'Н и "С ЯМР спектров были соотнесены так, чтобы- 1 - определить спиновую систему для каждого индивидуального Р-О-ксилопиранозного остатка, 2 - установить межсахаридные связи Константы спин-спинового взаимодействия для близких протонов получены из Ш и 'Н ЯМР спектров и имеют величины, характерные для Р-ксилопиранозных остатков (¡и 7 2-8.0; 123 9.2-9.5; Ь* 8 8-9 3; 1,5а 10 0-10 9; Л456 5 0-5.5 Иг) Р-Аномерные конфигурации всех моносахаридных остатков также следуют из величин химического сдвига для аномерных атомов углерода. Типы гликозидных связей в олигосахаридах были получены независимо из позиций сигналов для С-5 в "С ЯМР спектрах.

Анализ кинетических характеристик реакции гидролиза, катализируемой Р-ксилозидазой. Кинетика реакции гидролиза, катализируемой исследуемой Р-ксилозидазой, в области низких концентраций субстрата (0-10 мМ) подчиняется зависимости Михаэлиса-Ментен, что подтверждается линейностью зависимостей в координатах Лайнуивера-Берка Кинетическая схема реакции в данном случае может быть представлена следующим уравнением:

Р>

к, Т к5 E + S «-» ES —» ES' —> Е+Р2 (1) к., к2

где Е - фермент, S -субстрат; ES - фермент-субстратный комплекс; ES' - ксилозил-фермент комплекс; Р| - продукт реакции, формирующийся из агликоновой части субстрата (л-НФ); Р2 -ксилоза; к.ь к2 и ks-константы скорости соответствующих стадий (k3=k5 [Н20])

Для Р-ксилозидазы были определены значения Км=0 4 мМ и Я"„т= 17 5 с"1 в диапазоне концентраций субстрата 0 1-10 мМ. Помимо основной, Р-ксилозидазной активности, фермент обладает ос-арабинопиранозидазной активностью Этот эффект возможно является следствием похожего пространственного расположения гидроксильных групп и гликозидных связей в Р-D-ксилопиранозидах и a-L-арабинопиранозидах, которые различаются только ориентацией гидроксильной группы в положении С4 (Bravman et al, 2003). Сравнение кинетических параметров гидролиза л-НФКОС со с.п 2-6 показало, что параметры Км и Кт имеют сходные значения и не зависят от длины субстрата (табл 3), что позволяет сделать предположение о наличии только одного сайта связывания агликонового остатка в активном центре фермента

Таблица 3. Кинетические параметры реакций гидролиза, катализируемых Р-ксилозидазой из Aspergillus awanwri (рН 4.5,37°С).

Субстрат Км, мМ Ксщ, сек1 KaJ Км, (сек мМ)'1

л-НФК 0.40± 0.025 17 52 ±0 88 43 80±2 19

л-НФАра 6.81 ±0.34 31 54 ±1.58 4 63±0 23

л-НФКз 0.38 ±0.19 17.12 ± 0 86 45.05 ± 2.25

я-НФКт 0.39 ±0 2 17 25 ±0 86 44 23 ±2 21

п-НФК< 0 38±0 19 17 13 ± 0 86 45 07 ±2 25

л-НФК, 0.37 ±0 19 17 31 ±0.87 47.78 ± 2 39

л-НФЮ, 0.36 ±0.18 17.25 ±0 86 47 91 ±2.39

В области высоких концентрациях субстрата (10-100 мМ) фермент катализирует реакцию трансгликозилирования Минимальная кинетическая схема с учетом реакции трансгликозилирования может быть представлена следующим образом-

Р, Трансгликозилирование

к, Т к, 1с,

Е + Б «-» М —» ЕЗ' + в «-> ЕЭ'в -> Е+8'8 (2)

к., к2 I к5

Е+Р2 Гидролиз

где Е - фермент; Б -субстрат; Е8 - фермент-субстратный комплекс; ЕБ' - ксилозил-фермент комплекс; Р| - продукт реакции, формирующийся из агликоновой части субстрата (л-НФ для л-НФК), Р2 - ксилоза; 8'в - продукт реакции трансгликозилирования; кь , к2, к т, к, и к5 -константы скорости соответствующих стадий (к3 = к5 [Н20])

Сравнение скоростей гидролиза Кат при низких и высоких концентрациях субстрата показало, что скорость ферментативной реакции гидролиза увеличивается в 2 5 раза при высоких концентрациях субстрата. Очевидная активация гидролиза гликозидаз, катализирующих реакцию трансгликозилирования, объясняется в литературе тем, что вторая стадия - стадия дегликозилирования фермента двустадийного механизма гидролиза, является лимитирующей для общего гликозидного гидролиза. Иными словами возрастание скорости гидролиза в присутствии нуклеофилов, а точнее скорости отрыва агликона, будет наблюдаться в том случае, когда к5 (кгелы) > к4 (к и)КЛсофнла) до тех пор, пока одна из двух других стадий не станет лимитирующей

Анализ констант ингибироваиия реакции гидролиза, катализируемой (3-ксилозидазой.

Ингибиторный анализ Р-ксилозидазы показал, что фермент конкурентно ингибируется продуктом реакции, ксилозой (К,=17 мМ) а также ксилобиозидом и ксилотриазидом Константа ингибироваиия ксилозой имеет значение в несколько раз выше, чем константы ингибироваиия для ксилобиозида и ксилотриазида, которые имеют близкие значения (табл 4) Этот факт также подтверждает предположение, что фермент имеет в активном центре только один сайт связывания для гликонового остатка и один для агликона (+1 и -I сайт), что постулируется по номенклатуре Дэвиса для класса ферментов - гликозидаз

Таблица 4. Константы ингибирования реакции гидролиза л-НФК, катализируемого ß-ксилозидазой гриба А spergillus awamori (pH 4 5, 37°С)

Ингибитор К„, мМ

Ксилоза 7 71+0.38

Ксилобиоза 1.11±006

Ксилотриоза 1.20±0.06

Исследование продуктов реакции трансгликозилирования, катализируемой изучаемой ß-ксилозидазой из мицелиального гриба Aspergillus awamori, в качестве субстратов для эндо-ксиланаз семейств 10 и 11. Анализ продуктов гидролиза и-НФКп и МУФК2.3, катализируемого ксиланазами из мицелиального гриба Asp orizae (ксиланаза 10) и мицелиального гриба Т Reesei ксиланаза (ксиланаза 11) на малых временах конверсии методом ТСХ и ВЭЖХ показал наличие только свободного и-НФ или МУФ, и ксилобиозы (гидролиз л-НФК, и МУФК>) или ксилотриозы (гидролиз и-НФКз и МУФКз). Оба фермента демонстрируют высокую каталитическую эффективность Ки,/ К„ по отношению к данным соединениям (табл 5)

Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза п-НФК> 3 и МУФК>.3, катализируемого ксиланазами 10 и 11

Субстрат Ксиланаза 10

Км, мМ fcai, сек"' k*J Км. (секмМ)"'

я-НФКт 0.25±0 01 55.2±2.76 220.94±19.84

л-НФКз 0 16+0 01 74 1±3 7 463 13+23.15

МУФК2 0 10±0 005 48 0+24 480.12±24 01

МУФКз 0.054±0.027 65 2±3.3 1207.41±60.37

Ксиланаза 11

Км, мМ к^, сек"1 KJKM. (секмМ)"'

л-НФКз 0 3±0.03 56.4+2.8 188.01±9.40

л-НФКз 0.19+001 71.2±3.5 374 73±18.74

МУФК2 0.15± 0008 45.1±2 25 30067±15 03

МУФКз 0.083±0 004 63 2±3.16 761 44±38 07

Таким образом, полученные результаты позволяют использовать эти субстраты для определения ферментативной активности ксиланаз, измеряя освобожденный хромофор спектрофотометрически Традиционный метод измерения активности ксиланаз с помощью определения редуцирующих концов менее чувствителен и более трудоемок, чем

детектирование свободного хромофора Флуоресцентно меченые ксилоолигосахариды обладают более высокой чувствительностью в сравнении с хромофорными и могут быть использованы для измерения в присутствии сильно окрашенных соединений Изучение гидролиза обеими ксиланазами и-НФК: 3 и МУФК2 з показало схожий характер действия, но картина различается при гидролизе более длинных ксилоолигосахаридов В процессе реакции образуется не только свободный и-НФ или МУФ, но и набор хромофорно или флуоресцентно меченых ксилоолигосахаридов различной с п Типичный профиль элюции продуктов гидролиза л-НФК4 обеими ксиланазами, полученный методом ВЭЖХ, изображен на рис 5

Рисунок 5 Разделение продуктов реакции гидролиза л-НФК4, катализируемой ксиланазами (А- ксиланаза 10; В- ксиланаза 11) методом ВЭЖХ

Время, [мин]

Время, [мин]

Из профиля элюции и колличественного определения продуктов гидролиза можно сделать вывод, что исследуемые ксиланазы имеют различный характер действия по отношению к модифицированным ксилоолигосахаридам со с.п >3 Полученные результаты подтверждают данные, имеющиеся в литературе о различном механизме действия ксиланаз семейства 10 и 11 Для отдельных представителей этих семейств предполагается, что ксиланазы 10 семейства имеют меньшее количество субстрат-связывающих сайтов (обычно четыре или пять сайтов), в активном центре и большее сродство к коротким линейным ß-l-4-ксилоолигосахаридам, чем ксиланазы 11 семейства Таким образом, специфичные хромофорные и флуоресцентные субстраты, полученные методом ферментативного синтеза с помощью описанной в этой работе ß-ксилозидазы из Aspergillus awamori, позволяют детально изучать субсайтную структуру, каталитические функции эндо- и экзо-ферментов, способных гидролизовать ксилоолигосахариды, так как продукты гидролиза могут быть легко разделены с помощью ВЭЖХ и охарактеризованы количественно и качественно

4. ВЫВОДЫ

1 ß-Ксилозидаза, выделенная из мицелиального гриба Aspergillus awamori, имеет молекулярную массу 250±5 кДа и состоит из двух одинаковых субъединиц На основании анализа аминокислотной последовательности ß-ксилозидазы фермент классифицирован как представитель 3 семейства гликозидгидролаз

2 ß-Ксилозидаза катализирует реакцию гидролиза с сохранением конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата ß-Ксилозидаза является экзо-действующей гликозидгидролазой.

3. ß-Ксилозидаза катализирует реакцию трансгликозилирования Продукты реакции трансгликозилирования представляют по своей структуре линейные ß-1-4-ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2-6. 4 Анализ значений каталитической эффективности (KJKM) реакций гидролиза ксилоолигосахаридов со с п 2-6, катализируемых ß-ксилозидазой, и констант ингибирования реакции гидролиза позволяет предположить наличие только одного сайта связывания для гликонового остатка и одного сайта связывания для агликона в активном центре фермента.

5. Специфичные хромофорные и флуоресцентные субстраты, полученные методом ферментативного синтеза с помощью описанной в этой работе ß- ксилозидазы из Aspergillus awamori, позволяют детально изучать субсайтную структуру и

каталитические функции эндо- и экзо-ферментов, способных гидролизовать ксилоолигосахариды.

6 Модифицированные ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2 и 3 являются эффективными субстратами для измерения ксиланазной активности и могут быть использованы в промышленном производстве ферментных ксиланазных препаратов и в биотехнологических процессах

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ РАБОТ

1 Родионова Н.А., Дубовая Н.В., Энейская Е.В, Мартинович Л.И., Грачева И.М., Безбородое AM. 2000 Очистка и характеристика эндо-1,4-Р-ксиланазы из Geotrichum tandidumJC Прикладная биохимия и микробиология, т 36, № 5, С 535-540

2 Bomss R., Krah М., Brumer Н. 3rd., Kerzhner М A., Ivanen D.R., Eneyskaya Е V , Elyakova L.A , Shishlyannikov S M., Shabalin K.A., Neustroev К N 2003. Enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl (l->3)-beta-D-glucooligosaccharides-new substrates for beta-1,3-1,4-D-lucanase. Carbohydr Res. 338(14). 1455-67.

3 Eneyskaya E.V , Brumer H 3"1., Backinowsky L.V., Ivanen D R , Kulminskaya A A , Shabalin K.A, Neustroev K.N. 2003. Enzymatic synthesis of beta-xylanase substrates transglycosylation reactions of the beta-xylosidase from Aspergillus sp. Carbohydr Res. 338(4)-313-25

4 Eneyskaya E.V , Ivanen D.R , Shabalin К A , Kulminskaya A A , Backinowsky L V., Brumer Iii. H, Neustroev К N 2005. Chemo-enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl beta-(l—>4)-D-xylooligosides: new substrates for beta-D-xylanase assays Org Biomol Chem. 3(1): 146-51.

5 Golubev A M., Brandao Neto J R , Eneyskaya E.V , Kulminskaya A V , Kerzhner M A , Neustroev К N , Polikarpov I. 2000. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of beta-xylosidase from Trichoderma reesei. Acta Crystallogr. D Biol Crystallogr 56 ( Pt 8)-1058-60.

6 Golubev A M., Nagem R A., Brandao Neto J.R., Neustroev К N., Eneyskaya E V, Kulminskaya A A., Shabalin K.A., Savel'ev A.N., Polikarpov I 2004 Crystal structure of alpha-galactosidase from Trichoderma reesei and its complex with galactose implications for catalyticmechanism. J.Mol.Biol. 28,339(2): 413-22.

7 Rojas A L, Fischer H., Eneyskaya E.V, Kulminskaya A A , Shabalin К A , Neustroev К N , Craevich A.F., Golubev A M , Polikarpov I 2005 Structural insights into the P-Xylosidase from Trichoderma reese obtained by synchrotron small-angle x-ray scattering and circular dichroism spectroscopy Biochemistry 44- 15578-15584.

Savel'ev, AN Ibatullin FM, Eneyskaya EV Kachurin AM, Neustroev KN, 1996 Enzymatic properties of a-D-galactosidase from Tnchoderma reesei Carbohydrate Research 296 261 273

«

Отпечатано в Гатчинской типографии 188300, Гатчина Ленинградская обл., пр. 25 Октября, д. 2, корп. 1 Зак. 47, т. 80,21.03.2006

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Энейская, Елена Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту

1.4. Научная новизна полученных результатов

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Гликозидгидролазы, механизм действия

2.2. Ксиланы - природные субстраты Р-ксилозидаз

2.3. р-Ксилозидазы микроорганизмов, физико-химические 23 характеристики

2.4. Структурно-функциональные исследования Р-ксилозидаз

2.5. Трансгликозилирование, ферментативный синтез 33 гликоконьюгатов

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Субстраты для измерения ферментативной активности

3.2. Методы измерения ферментативной активности

3.3. Выделение Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus 40 awamori

3.4. Выделение Р-ксиланазы из мицелиального гриба Trichoderma 42 reesei (семейство 11)

3.5. Выделение Р-ксиланазы из мицелиального гриба Aspergillus orizae (семейство 10)

3.6. Методы определение чистоты и молекулярной массы 43 ферментов

3.7. Методы определения частичной аминокислотной 43 последовательности Р-ксилозидазы

3.8. Методы исследования физико-химических свойств (3- 44 ксилозидазы

3.9. Методы определения кинетических характеристик и констант 46 ингибирования реакций гидролиза, катализируемых ферментами

ЗЛО. Определение стереохимии ферментативного гидролиза рксилозидазы методом 'Н ЯМР спектроскопии

3.11. Исследование трансгликозилирующей активности (3- 48 ксилозидазы

3.12. Исследование влияния рН и концентрации и-НФК и МУФК2 49 на выход продуктов трансгликозилирования

3.13 Препаративный синтез «-НФК2.3 и МУФК3.

3.14. Препаративный синтез и-НФК4.

3.15. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования 51 методом ЯМР

3.16. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования 52 методом масс-спектрометрии

3.17. Исследование характера действия ксиланаз семейств 10 и 11 по 53 отношению к ферментативно синтезированным гс-НФК2-б и МУФК2

4. | РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выделение и физико-химические свойства Р-ксилозидазы из 54 мицелиального гриба Aspergillus awamori

4.2. Исследование первичной структуры р-ксилозидазы 57 4.3.Определение констант ионизации каталитических групп Р- 59 ксилозидазы

4.4. Исследование стереохимии гидролиза и характера действия |3- 60 ксилозидазы

4.5. Исследование трансгликозилирующей активности р~ 62 ксилозидазы

4.6. Характеристика структуры продуктов трансгликозилирования 69 методами ЯМР и масс-спектрометрии

4.7. Анализ кинетических характеристик реакции гидролиза, 77 катализируемой {З-ксилозидазой

4.8. Анализ констант ингибирования реакции гидролиза, 82 катализируемой (З-ксилозидазой

4.9. Исследование продуктов реакции трансгликозилирования, 84 катализируемой изучаемой [З-ксилозидазой из мицелиального гриба Aspergillus awamori, в качестве субстратов для эндо-ксиланаз семейств 10 и

5. ВЫВОДЫ

6. Список опубликованных по теме работ

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "β-ксилозидаза из Aspergillus awamori: свойства и использование в ферментативном синтезе"

1.1. Актуальность проблемы Углеводы играют существенную роль в мириадах биологических структур, процессов. Офомное количество различных олигосахаридных обнаруженных в природе, происходит из рациональной организации ферментативного образования и разрыва гликозидных связей. Гликозидная связь является одной из наиболее прочных связей, существующих в природе. Период ее естественного распада составляет более 5 миллионов лет. Гликозидгидролазы ферменты, способные ускорить гидролиз гликозидной связи более чем в 10 раз, являются одними из наиболее эффективных из существующих катализаторов. Поэтому интерес к реакциям ферментативного гидролиза природных полимеров обусловлен не только фундаментальными, но и прикладными задачами. Ксилан основной структурный полисахарид клеток растений, зторой по распространенности после целлюлозы полисахарид в природе. Ксилан представляет собой полимер, состоящий, в основном, из цепей |3-Dостатков, соединенных 1-4-гликозидными связями ксилопиранозных Основными компонентами ксиланолитической системы, определяющими скорость гидролиза ксилана, являются два типа ферментов: эндо-ксиланазы (1,4-Р-В-ксиланогидролазы К.Ф. 3.2.1.8.), гидролизующие ксилан до коротких ксилоолигосахаридов, и Р-ксилозидазы (1,4-Р-В-ксилогидролазы К.Ф. 3.2.1.37), расщепляющие короткие ксилоолигосахариды до ксилозы и являющиеся ключевыми ферментами полной деградации ксилана (CoUinset al., 2005). Огромный интерес к изучению системы ферментов, участвующих в метаболизме этого полимера, связан с их широким применением в биотехнологии. Эти ферменты используют в целлюлозно-бумажной, текстильной и пищевой промышленности (Beg et ah, 2001). Ин1енсивное использование эндо-ксиланаз и Р-ксилозидаз в промышленном производстве постоянно стимулирует два основных направления исследований поиск новых источников ферментов и подробное изучение их ферментативных свойств, дающее возможность более эффективно использовать данные ферменты в биотехнологических процессах. Второе направление возможного использования гликозидгидролаз в биотехнологии основывается на том факте, что многие представители этого класса ферментов обладают не только гидролитической, но и трансгликозилирующей синтазной активностью, и способны осуществлять ферментативный синтез различных гликоконьюгатов. Одним из примеров применения трансгликозилирующей активности гликозидгидрола:[ является ферментативный синтез олигосахаридов, содержащих хромофорные или флуоресцентные группы (Zeng et al., 2000; Mala et al., в 1999). синтезе и для Гликозидгидролазы подобных являются эффективным их инструментом высокой олигосахаридов благодаря рода селективности используются стереоспецифичности. Такого субстраты исследований щирокого круга гликаназ (Honda et al., 2000), традиционный метод измерения ферментативной активности которых основывается на регистрации восстанавливающих концов олигосахаридов, образующихся в процессе гидролиза полимера. Данный метод имеет недостаточную чувствительность для детальных исследований ферментов, и использование таких полимерных субстратов активности гликаназ препятствует в связи со изучению сложностью трансгликозилирующей различия продуктов гидролиза и продуктов трансгликозилирования. Метод ферментативного синтеза различных гликоконьюгатов имеет неоспоримые преимущества в сравнении с органическим, который является гораздо более дорогостоящим, трудоемким и экологически вредным. На сегодняшний день описано более сотни различных экзо-гликозидаз, выделенных из широкого круга микроорганизмов и успешно применяемых в ферментативном синтезе новых биологически активных веществ. Получение данных о взаимосвязи строения активного центра ферментов и их способности к проведению трансгликозилирующей реакции, несомненно, важно, так как не только дает возможность эффективно использовать трансгликозидазы в ферментативном синтезе, но и позволяет получить новую информацию о механизме действия гликозидгидролаз в целом. В данной работе подробно изучены кинетические параметры физико-химические свойства, и трансгликозилирующая реакции гидролиза активность фермента Р-ксилозидазы из мицелиального гриба Aspergillus awamori, описан ферментативный синтез «ара-нитрофенил

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Энейская, Елена Владимировна

1. Р-Ксилозидаза, выделенная из мицелиального гриба Aspergilius awamori,

имеет молекулярную массу 250±5 кДа и состоит из двух одинаковых

субъединиц. На основании анализа аминокислотной последовательности

Р-ксилозидазы фермент классифицирован как представитель 3 семейства

гликозидгидролаз. 2. Р-Ксилозидаза катализирует реакцию гидролиза с сохранением

конфигурации при аномерном центре гликоновой части субстрата, р Ксилозидаза является экзо-действующей гликозидгидролазой. 3. Р-Ксилозидаза катализирует реакцию трансгликозилирования. Продукты

реакции трансгликозилирования представляют по своей структуре

линейные Р-1-4- ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2 - 6 . 4. Анализ значений каталитической эффективности (^са/^м) реакций

гидролиза ксилоолигосахаридов со степенью полимеризации 2 - 6 ,

катализируемых Р-ксилозидазой, и констант ингибирования реакции

гидролиза позволяет предположить наличие только одного сайта

щ связывания для гликонового остатка и одного сайта связывания для

агликона в активном центре фермента. 5. Специфичные хромофорные и флуоресцентные субстраты, полученные

методом ферментативного синтеза с помощью описанной в этой работе Р ксилозидазы из Aspergilius awamori, позволяют детально изучать субсайтную структуру и каталитические функции эндо- и экзо-ферментов,

способных гидролизовать ксилоолигосахариды. 6. Модифицированные ксилоолигосахариды со степенью полимеризации 2 и

3 являются эффективными субстратами для измерения ксиланазной

активности и могут быть использованы в промышленном производстве

ферментных ксиланазных препаратов и в биотехнологических процессах.7. Список опубликованных но теме работ

1. Родионова Н.А., Дубовая Н.В., Энейская Е.В., Мартинович Л,И.„ Грачева

И.М., Безбородов A.M. 2000. Очистка и характеристика эндо-1,4-Р ксиланазы из Geotrichum candidum ЗС. Прикладная биохимия и

микробиология, т. 36, JV» 5, с. 535-540. 2. Borriss R., Krah М., Brumer Н. 3rd., Kerzhner М.А., Ivanen D.R., Eneyskaya

E.V., Elyakova L.A., Shishlyannikov S.M., Shabalin K.A., Neustroev K.N. 2003. Enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl (l-->3)-beta-D-

glucooligosaccharides-new substrates for beta-l,3-l,4-D-glucanase. Carbohydr. Res. 338(14): 1455-67. 3. Eneyskaya E.V., Brumer H. 3rd., Backinowsky L.V., Ivanen D.R.,

Kulminskaya A.A., Shabalin K.A., Neustroev K.N. 2003. Enzymatic synthesis

of beta-xylanase substrates: transglycosylation reactions of the beta-]<:ylosidase

from Aspergillus sp. Carbohydr Res. 338(4): 313-25. 4. Eneyskaya E.V., Ivanen D.R., Shabalin K.A., Kulminskaya A.A.,

Backinowsky L.V., Brumer Iii. H., Neustroev K.N. 2005. Chemo-enzymatic

synthesis of 4-methylumbeIliferyl beta-(l—>4)-D-xylooligosides: new

substrates for beta-D-xylanase assays. Org. Biomol. Chem. 3(1): 146-51. 5. Golubev A.M., Brandao Neto J.R., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.V.,

Kerzhner M.A., Neustroev K.N., Polikaфov I. 2000. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of beta-xylosidase from

Trichoderma reesei. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 56 ( Pt 8): 1058-60. 6. Golubev A.M., Nagem R.A., Brandao Neto J.R., Neustroev K.N., Eneyskaya

E.V., Kulminskaya A.A., Shabalin K.A., Savel'ev A.N., РоИкафоу I .2004. Crystal structure of alpha-galactosidase from Trichoderma reesei and its

complex with galactose: implications for catalyticmechanism. J.Mol.Biol. 28;339(2): 413-22. 7. Rojas A.L., Fischer H., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Shabalin K.A.,

Neustroev K.N., Craevich A.F., Golubev A.M., Polikaфov I. 2005. Structural

insights into the P-Xylosidase from Trichoderma reese obtained by

synchrotron small-angle x-ray scattering and circular dichroism spectroscopy. Biochemistry. [Epub ahead of print]

8. Savel'ev, A.N.; Ibatullin F.M., Eneyskaya E.V., Kachurin A.M., Neuslroev

F K.N., 1996. Enzymatic properties of a-D-galactosidase from Trichodeima

reesei. Carbohydrate Research 296: 261-273.БЛАГОДАРНОСТИ

Я хочу выразить особую благодарность своему научному

руководителю, безвременно погибшему к.б.н. Кириллу Николаевичу

Неустроеву за неоценимый опыт, переданный мне в процессе совместной

научной работы. Я выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории энзимологии

отделения молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН за помощь

в работе над диссертацией. Особенно хочу поблагодарить к.б.н. Кульминскую А.А., Голубева A.M., к.б.н. Савельева А.Н. за критический

анализ ценные замечания в процессе подготовки диссертации. Я приношу благодарность нашим заграничным коллегам д-]зу Ниссе

Калкиннен (Финляндия) и д-ру Харри Брумеру (Швеция) за плодотворное

сотрудничество по теме данной работы и содействие в подготовке

щ публикаций. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы

фундаментальных исследований «Молекулярная и клеточная биология»

Президиума РАН и Российского фонда фундаментальных исследований

(проекты 03-04-48756, 05-04-49216).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Энейская, Елена Владимировна, Гатчина

1. Родионова Н.А., Дубовая Н.В., Энейская Е.В., Мартинович Л.И.. Грачева ИМ., Безбородов A.M. 2

2. Очистка и характеристика эндо-1,4-Рксиланазы из Geotrichum candidum ЗС. Прикладная био>:имия и микробиология, т. 36, }к 5, с. 535-540.

3. Ajisaka К, Fujimoto Н, Miyasato М An alpha-L-fucosidase from Penicillium multicolor as a candidate enzyme for the synthesis of alpha (l->3)-linked fucosyl oligosaccharides by transglycosylation. Carbohydr. Res.- 1998.- V. 309, №1.-P. 125-9.

4. Allen J.D. Subsite mapping on enzymes: application to polysaccharide depolymerases. Methods Enzymol.- 1980.- V. 64,- P. 248-277.

5. Ashida H., Yamamoto K., Kumagai, H. 2

6. Enzymatic syntheses of T antigen-containing glycolipid mimicry using the transglycosylation activity of endo-a-N-acetylgalactosaminidase.Carbohydr. Res. 330: 487-493.

8. Purification and properties of an extracellular Pxylosidase from a newly Technology. 90: 33-38.

10. Synthesis of O-p-galactopyranosylL-serine derivatives using p-galactosidase in aqueous-organic reaction systems. J. Carbogydr. Chem. 18: 121-129. isolated Fusarium proliferatum. Bioresourse 95

11. Engineering of a glycosidase Family 7 cellobiohydrolase to more alkaline pH optimum: the pH behaviour of Trichoderma reesei Cel7A and its E223S/ A224H/L225V/T226A/D262G mutant. Biochem. J 356(Ptl): 19-30. 8. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. 2

12. Microbial xylanases and their industrial applications: a review. 56(3-4): 326-38.

13. Belfaquih N., Penninckx M.J. 2000. A bifunctional beta-xylosidase-xylose isomerase from Streptomyces sp. EC

14. Enzyme Microb. Technol. 27(1-2): 114-121.

15. Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. 1

16. Endo-P-l-4-xylanase families: differences in catalytic properties. J. of Biotech. 57: 151-166.

17. Borriss R., Krah M., Brumer H. 3rd., Kerzhner M.A., Ivanen D.R., Eneyskaya E.V., Elyakova L.A., Shishlyannikov S.M., Shabalin K.A., Neustroev K.N. 2

18. Enzymatic synthesis of 4-methylumbelliferyl (1—>3)-beta-D- glucooligosaccharides-new substrates for beta-l,3-l,4-D-glucanase. Carbohydr. Res. 338(14): 1455-67.

19. Bravman Т., Mechaly A., Shulami S., Belakhov V., Baasov Т., Shoham G., Shoham Y. 2

20. Glutamic acid 160 is the acid-base catalyst of beta-xylosidase 96

21. Detailed kinetic analysis of a family 52 glycoside hydrolase: a beta-xylosidase from Geobacillus stearothermophilus. Biochemistry/. 42(35): 10528-36. H.Chanda S.K., Hirst E.L., Jones J.K.N. 1950. The constitution of xylan from 4 esperanto grass. J. Chem. Soc. 50: 1287-1289.

23. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol. Reviews 29: 3-23.

25. Carbohydrate-Active Enzymus server. (http://afmb.cnrs-mrs.fr/-pedro/CAZY/db.html).

26. Czjzek M., David A.B., Bravman Т., Shoham G., Henrissat )3., Shoham Y. 2

27. Enzyme-Substrate Complex Structures of a GH39 beta-Xylosidase from Geobacillus stearothermophilus. J. Mol. Biol. [Hpub ahead of print]

29. Hemicellulases, theiroccurrence, purification, properties and mode of action. Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 32:277-352.

30. Davies G.J., Wilson K.S., Henrissat B. 1

31. Nomenclature for sugar-binding subsites in glycoside hydrolases, Biochem. J. 321: 557-559. 97

32. Xylan isolated from the stalks of Nicotiana tabacum, Agric. Biol, Chem. 40: 359-354. 21,Enzyme Nomenclature: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature a Classification of Enzymes, San Diego: Academic Press; 1992. 862 p.

33. Finch P., Yoon J.H. 1997. The effects of organic solvents, on the synthesis of galactose disaccharides using P- galactosidases. Carbohydr. Res. 303: 339-345.

34. Fujimoto H., Isomura M., Ajisaka K. 1

35. Syntheses of Alkyl p-DMannopyranosides and P-1,4-Linked Oligosaccharides Using P-Maanosidase from Rhizopus niveus. Biosi. Biotech. Biochem. 61(1): 164-165.

36. Garcia-Campayo V., Wood T.M. 1993 Purification and characterization of Pxylosidase from the anaerobic rumen fungus Neomallistrix frontalis Neomallistrix frontalis. Carbohyd. Res. 242: 229-245.

37. Golubev A.M., Brandao Neto J.R., Eneyskaya E.V., Kulminskaya Kerzhner M.A., and Neustroev K.N., РоИкафОУ I. study of 2000. A.V., Purification, from crystallization preliminary X-ray beta-xylosidase Trichoderma reesei. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 56 Pt 8): 1058-60.

38. Golubev A.M., Nagem R.A., Brandao Neto J.R., Neustroev K.N., Bneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Shabalin K.A., Savelev A.N., РоИкафОУ I .2

39. Crystal structure of alpha-galactosidase from Trichoderma reesei and its 98

40. Hayashi S., Ohno Т., Ito M., Yokoi H. 2

41. Purification and properties of the cell-associated beta-xylosidase from Aureobasidium. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26(5):276-279.

42. Herrmann M.C., Vrsanska M., Jurickova M., Hirsch J., Biely P., Kubicek C.P. 1997. The P-D-xylosidase of Trichoderma reesi is multifunctional (i-D-xylan xylohydrolase. Biochem. J. 321: 375-381.

43. Interpretation of dependency of rate parameters on the degree of polymerization of substrate in enzyme-catalyzed reactions. Evaluation of subsite affinities of exo-enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 40: 1-6.

44. Hiromi K., Nitta Y., Numata C Ono S. 1

45. Subsite affinities of glucoamylase: examination of the validity of the subsite theory. Biochim. Biophys. Acta. 302: 362-375.

46. Honda Y., Tanimori S., Kirihata M., Kaneko S., Tokuyasu K., Hashimoto M, Watanabe Т., Fukamizo T. 2

47. Kinetic analysis of the reaction catalyzed by chitinase Al from Bacillus circulans WL-12 toward the novel substrates, partially N-deacetylated 476(3): 194-7.

49. Enzymatic-catalyzed synthesis of alkylglycosides in monophasic and biphasic systems. The reverse hydrolysis reaction. J. Biotech. 69: 145-149. 4-methylumbelliferylchitobiosides. FEBS. Lett. 99

50. High-efficiency synthesis of oligosaccharides with a truncated beta-galactosidase bifidum. Appl. Microbiol. Biotechnol. 57(5-6): 647-52.

51. Kaneko S., Kitaoka M., Kuno A., Hayashi K. 2000. methylumbelliferyl-beta-D-xylobioside xylobioside for sensitive and Syntheses of 4from Bifidobacterium 5-bromo-3-indolyl-beta-Dactivity on agar plates. detection of xylanase Biosci.Biotechnol.Biochem.64(4):741-5. 35.Kim Y., Lee S., Antony J. R., Warren В., Withers S.G. 2

52. Directed Evolution of a Glycosynthase from Agrobacterium sp. Increases Its Catalytic Activity Dramatically and Expands Its Substrate Repertoire. J. Biol. Chem. 279, Issue 41, 42787-42793.

53. Kitamoto N., Yoshino S., Ito M., Kimura Т., Ohmiya K., Tsukagoshi N. 1

54. Repression of the expression of genes encoding xylanolytic en2ymes in Aspergillus oryzae by introduction of multiple copies of the xynFl promoter. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50(5): 558-63.

55. Kitpreechavanich characterization V., of Hayashi extracellular M., Nagai (B-xylosidase S. 1986. and Purification and from P-glucosidase Aspergillus fumigatus. Agric. Biol. Chem. 50 (7): 1703-1711.

57. Stereochemistry and the mechanism of enzymatic reactions. Biol. Revs. Cambridge. Phil. Soc. 28: 416-436.

59. Transglycosylation of p-Xylosidase from Aspergillus awamori K

60. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:20Ш-2014. 100

61. Characteristics of transxylosylation by beta-xylosidase from Aspergillus awamori K

62. Biochim Biophys Acta. [Epub ahead of print] 41,Laemmli U.K. 1

63. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T

65. Lama L., Calandrelli V., Gambacorta A., Nicolaus B. 2

66. Purification and characterization of thermostable xylanase and P-xylosidase by thermophilic bacterium Bacillus thermantarcicus. Research in microbiology. 155: 283-289. 43.Li Y.K., Yao H.J., Pan I.H. 2

67. Mechanistic study of beta-xylosidase from Trichoderma koningii G-39. J. Biochem. (Tokyo). 127(2): 315-20.

68. Luthi E., Love D.R., McAnulty J., Wallace C Caughey P.A., Saal D., Bergquist P.L. 1

69. Cloning, sequence analysis and expression of genes encoding xyIandegrading enzymes from the thermophile Caldocellum saccharolyticum. Appl. Environ Microbiol. 56: 1017-1024.

70. Mackenzie L.F., Wang O., Antony R., Warren J., Withers S.G. 1

71. Glycosynthases: Mutant Glycosidases for Oligosaccharide Synthesis. J. Am. Chem. Soc. 120(22): 5583 5584.

72. Mala S., Dvorakova H., Hrabal R., Kralova B. 1

73. Towards regioselective synthesis of a-glucosidases with different substrate specificity. Carbohydr. Res. 322:209-218. 47.Man Peij N.N., Brinkmann J., Vrsanska M., Visser J., de Graaff L.H. 1997. beta-Xylosidase activity, encoded by xlnD, is essential for complete hydrolysis 101

74. Manzanares P., Ramon D., Querol A. 1

75. Screening of non-Saccharomyces wine yeasts for the production of beta-D-xylosidase activity. Int. J. Food Microbiol. 46(2): 105-12.

76. Matsumura S., Sakiyama K., Toshima K. 1

77. Preparation of oi:tyl P-Dxylobioside and xyloside by xylanase- catalyzed direct transglycosylation reaction of xylan and octanol. Biotech. Let. 21: 17-22. 45O.McCarter J.D., Withers S.G. 1

78. Mechanisms of enzymatic glycosidase hydrolysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 885-892. 5LMurata Т., Hattori Т., Amarume S., Koichi A., Usui T. 2

79. Kinetic studies on endo-beta-galactosidase by a novel colorimetric assay and synthesis of Nacetyllactosamine-repeating oligosaccharide beta-glycosides using its transglycosylation activity. Eur. J. Biochem. 270(18): 3709-19. 52.0kuyama M., Mori H., Watanabe K., Kimura A., Chiba S. 2

80. Alphaglucosidase mutant catalyzes "alpha-glycosynthase"-type reaction. Biosci. Biotechnol.Biochem.66(4):928-933.

82. Enzyme-catalyzed synthesis of alkyl-|3-glucosides in a wayer-alcogol two-phase system. Biores. Technol. 77: 157-161.

83. Petzelbauer I., Reiter A., Splechtna В., Kosma P., Nidetzky B. 2

84. Transgalactosylation by thermostable beta-glycosidases from Pyrococcus furiosus and Sulfolobus solfataricus. Binding interactions of nucleophiles with 102

86. Chemistry of hemicelluloses: relationchip between hemicellulose structure and enzyme required for hydrolysis. Portland Press, London, 1-28.

87. Rizzatti A.C., Sandrim V.C.,. Jorge J.A., Terenzi H.F., Polizeli Mde L. 2

88. Influence of temperature on the properties of the xylanolytic enzymes of the thermotolerant fungus Aspergillus phoenicis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 88-93.

89. Rizzatti A.C., Jorge J.A., Terenzi H.F., Rechia C.G., Polizeli M.L. 2

90. Purification and properties of a thermostable extracellular beta-D-xylosidase produced by a thermotolerant Aspergillus phoenicis. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 26(3): 156-60.

91. Rojas A.L., Fischer H., Eneyskaya E.V., Kulminskaya A.A., Shabalin K.A., Neustroev K.N., Craevich A.F., Golubev A.M., РоИкафОУ I. 2

92. Structural insights into the P-Xylosidase from Trichoderma reese obtained by synchrotron small-angle x-ray scattering and circular dichroism spectroscopy. Biochemistry. .44: 15578-15584. 103

93. Xylanase from a newly isolated Fusarium verticillioides capable of utilizing com fiber xylan. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56(f!-6):7626. 6O.Saha B.C. 2

94. Purification and characterization of an extracellular betaxylosidase from a newly isolated Fusarium verticillioides. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 27(4): 241-5.

95. Saverev, A.N.; Ibatullin F.M., Eneyskaya E.V., Kachurin A.M., Neustroev K.N., 1

96. Enzymatic properties of a-D-galactosidase from Trichoderma reesei. Carbohydrate Research 296: 261-273.

97. Shallom D., Leon M., Bravman Т., Ben-David A., Zaide G., Belakhov V., Shoham G., Schomburg D., Baasov Т., Shoham Y. 2

98. Biochemical characterization and identification of the catalytic residues of a family 43 betaD-xylosidase from Geobacillus stearothermophilus T-

99. Biochemistry. 2005. At» 44(1): 387-97.

100. Shinoyama, H., A. Ando, T. Fujii, and T. Yasui. 1991. The possibility enzymatic synthesis of a variety of ofAspergillus of P-xylosides using the transfer reaction niger P-xylosidase. Agric. Biol. Chem. 55: 849-850. of beta-xylosidase by yeast Cry]3tococcus

101. Purification podzolinus. Bioorg. Khim. 26(8): 613-616.

103. Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer. Chem. Rev. 90: 1171-1202.

104. Somogyi M. 1952 Notes on sugar determination. J. Biol. Chem. 195: 19-23 104

105. Comparative study of new alpha-galactosidases in transglycosylation reactions, (arbohydr Res. 2000. 329(1): 65-73

106. Tuohy M.G., Puls J., Claeysens M., Vrsanska M., Couglan M.P. 1993. The xylan- degrading enzyme system of Talaromyces emersonii: novel enzymes with activity against aryl P-D-xylosides and unsubstituted xylans. 1993 Biochem.J. 290: 515-523. 69.Utt E.A., Eddy C.K., Keshav K.F., Ingram L.O. 1

107. Sequencing and expression of the Butyrivibrio fibrisolvens xylB gene encoding a novel bifunctional protein with P-D-xylosidase and a-arabinofuronasidase activites. Ap[)l. Environ Microbiol. 57: 1227-1234.

108. Vocadlo D.J., Davies G.J., Laine R., Withers S.G. 2

109. Catalysis by hen eggwhite lysozyme proceeds via a covalent intermediate. Nature. 412(6849): 8358.

110. Vocadlo D.J., MacKenzie L.F., He S., Zeikus G.J., Withers S.G. 1

111. Identification of glu-277 as the catalytic nucleophile of Thermoanaerobacterium saccharolyticum beta-xylosidase using electrospray MS. Biochem. J. 335 Pt 2): 449-55.

112. Vocadlo D.J., Wicki J., Rupitz K., Withers S.G. 2

113. Mechanism of Thermoanaerobacterium saccharolyticum Thermoanaerobacterium saccharolyticum beta-xylosidase: kinetic studies. Biochemistry. 41(31): 9727-35. 105

114. Production of beta-xylanase and beta-xylosidase by the extremely halophilic archaeon Halorhabdus utahensis. Extremophiles. 7(2): 87-93.

116. Agrobacterium tumefaciens betaglucosidase is also an effective beta-xylosidase, and has a high transglycosylation activity in the presence of alcohols. Biochim. Biophys .Acta. ll;1385(l):78-88.

117. Wattiez R., Hermans C Cruyt C Bernard A., Falmagne P. 2

118. Human bronchoalveolar lavage fluid protein two-dimensional database: study of interstitial lung diseases. Electrophoresis 21: 2703-2712.

120. Hemicelluloses. The carbohydrates. ACADEMIC Press, New york. 447-469.

121. Williams S.J., Stephen G., Withers. 1

122. Glycosil fluorides in enzymatic reactions. Carbohydrate Res. 327: 27-46.

123. Wong K.K.Y., Tan L.U.L., Saddler J.N. 1

124. Multiplicity of beta-1,4-xyIanase in microorganisms: functions and applications. Microbiol. Rev. 52(3): 305-317. 79.Xue Y., Shao W. 2

125. Expression and characterization of a thermostable betaxylosidase from the hyperthermophile, Thermotoga maritima. Biotechnol. Lett. 26(19): 151 l-15Yanai Т., Sato M. 2

126. Purification and characterization of an beta-D-xylosidase from Candida utilis IFO 0

127. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65(3): 527-33. 106

128. Chemoenzymatic synthesis of a novel glycopeptide using a microbial endoglycosidase. Carbohydr. Res. 305: 415-422.

130. Purification and characterization of an beta-D-xylosidase from Candida utilis IFO 0

131. Biosci Biotechnol Biochem. 65(3): 527-33.

132. Yang J.K., Yoon H.J., Ahn H.J., Lee B.I., Pedelacq J.D., Liong E.C., Berendzen J., Laivenieks M., Vieille C Zeikus G.J., Vocadlo D.J., Withers S.G., Suh S.W. 2

133. Crystal structure of beta-D-xylosidase from Thermoanaerobacterium saccharolyticum, a family 39 glycoside hydrolase. J. Mol. Biol. 335(1): 155-65.

134. Zeng X., Yoshino R., Murata Т., Ajisaka K., Usui T. 2

135. Regioselective synthesis of p-nitrophenyl glycosides of beta-D-galactopyranosyl-disaccharides by transglycosylation with beta-D-galactosidases. Carbohydr. Res. 325(2): 1201.31. 107