Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента

Серебряный, Всеволод Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента"

На правах рукописи

СЕРЕБРЯНЫЙ ВСЕВОЛОД АЛЕКСАНДРОВИЧ

КСИЛАНАЗA PENICILLIUM CANESCENS: ВЫДЕЛЕНИЕ ГЕНА, ИЗУЧЕНИЕ ЕГО РЕГУЛЯЦИИ И СОЗДАНИЕ ШТАММА - ПРОДУЦЕНТА

Специальность: 03,00.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии эукарштических микроорганизмов ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ю. П. Винецкий кандидат биологических наук С. В. Беневоленский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор A.C. Миронов кандидат биологических наук Е.С. Захарова

Ведущая организация: Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 2- ' 91 200 бгода в / С/ часов

на заседании диссертационного сбйета ФГУЙ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: Москва, 117545,1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат диссертации разослан 2А1 ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совет кандидат биологических наук Г.Г. Заиграева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ксилан - второй по распространенности природный полимер после целлюлозы, он встречается практически во всех растительных тканях. В зависимости от происхождения, структура и химический состав ксилана значительно меняются, но, в любом случае, главная цепь образована Р-1,4-связанными остатками D-ксилозы. В качестве ответвлений встречаются различные заместители, чаще всего арабиноза.

Во многих технологических процессах, прежде всего при производстве бумаги и целлюлозы, ксилан является нежелательной примесью, и встает проблема его деградации. Также необходимо гидролизовать ксилан в некоторых процессах пищевой и кормовой промышленности, и при комплексной переработке растительных отходов. Гидролиз ксилана возможно осуществлять с помощью химических реагентов или ферментативным путем. Ферментативный гидролиз является предпочтительным, так как меньше влияет на структуру других волокон, и при нем образуется меньше химических отходов. В пищевой или кормовой промышленности, химический гидролиз вообще неприемлем. Для исчерпывающего ферментативного гидролиза ксилана, включающего расщепление боковых цепей, требуется достаточно широкий спектр ферментов, однако, в большинстве технологических процессов достаточно действия фермента, расщепляющего главную цепь ксилана — эндо-Р-1,4-ксиланазы (далее просто ксиланаза).

В современной промышленности используются кснланазы бактериального и грибного происхождения. Большинство грибных ксипаназ принадлежат к 10-му и 11-му семействам гликозил-гидролаз, различающихся по своим физическим свойствам, по субстратной специфичности и оптимуму рН. Многие грибы имеют гены, кодирующие несколько различных ксиланаз, принадлежащих как к одному, так и к разным семействам, и синтезируют несколько ксиланаз одновременно [de Vries R.P., Visser J., 2001.]. V некоторых видов обнаружен синтез только одного фермента.

Изучение синтеза ксиланолитических ферментов мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения.

В настоящее время основными продуцентами ксиланаз грибного происхождения являются грибы родов Aspergillus и Trichoderma. В то же время, постоянно ведется поиск новых продуцентов, вызванный потребностью в ферментах с улучшенными свойствами, и желанием расширить спектр существующих продуцентов.

Мицелиальный гриб P. canescens F178 (ВКПМ) первоначально был выделен как природный продуцент р-галактоз ид азы, и в настоящее время используется для производства этого фермента. Он характеризуется большой продукцией внеклеточного белка, большая часть которого представлена несколькими ферментами, что делает его перспективным биотехнологическим объектом.

Недавно был клонирован ген, кодирующий (3-галактоз ид азу P. canescens F178, и введен в геном этого гриба в нескольких копиях, в результате чего продукция р-галактозидазы была увеличена в 12 раз [Николаев И.В. и др., 1999]. Кроме того, было показано, что культуральная жидкость, полученная при его росте в жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, кроме (1- галактоз ид аз ной, обладает значительной ксиланазной активностью [Николаев И.В., Винецкнй Ю.П., 1998.]. Мы решили изучить возможность создания продуцента ксиланазы на базе этого штамма.

Цель и задачи исследования. Целью представляемой работы являлся поиск путей увеличения продукции ксиланазы мицелиальным грибом Р. canescens F178, и оценка возможности создания на основе этого организма промышленного штамма — продуцента. В рамках этой работы были поставлены следующие задачи:

клонировать ген, кодирующий мажорную ксиланазу P. canescens F178;

оценить возможность увеличения продукции ксиланазы с помощью увеличения числа копий этого гена;

определить влияние увеличения числа копий этого гена на продукцию других внеклеточных ферментов;

выяснить наличие у P. canescens F178 других генов, кодирующих ксиланазы, и оценить их влияние на суммарную продукцию ксиланазы; изучить регуляцию транскрипции гена (генов), кодирующих ксиланазу P. canescens F178;

клонировать ген, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens F178, и определить его роль в продукции других ферментов этим организмом.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проделанной работы были получены следующие результаты:

клонирован ген xylA, кодирующий мажорную ксиланазу P. canescens

F178 и подтверждено, что этот фермент принадлежит к 10-му семейству

гл икозил-гидролаз;

показано, что транскрипция xylA является лимитирующим фактором в продукции ксиланазы P. canescens F178, и что введение дополнительных копий xylA в исходный штамм пропорционально увеличивает продукцию ксиланазы (до 7 раз);

показано, что транскрипция xylA индуцируется L-арабинозой и D-ксилозой, причем арабиноза является лучшим индуктором, чем ксилоза; показано наличие в геноме P. canescens гена, кодирующего ксиланазу 11-го семейства, и установлено, что его вклад в общую продукцию ксиланазы P. canescens незначителен;

клонирован ген xinR, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens F178;

показано, что xlnR играет ключевую роль в регуляции синтеза ряда других ксиланолитических ферментов; что введение дополнительных копий в xlnft в исходный штамм увеличивает продукцию этих ферментов и ксиланазы;

показано, что синтез ряда ферментов, также индуцируемый арабинозой (прежде всего бета-галактоз идазы и арабино фуранозидазы), не находится под прямым контролем продукта xlnR;

создан штамм — продуцент кскланазы, превосходящий по продуктивности исходный штамм Р. canescens Fl78 более чем в семь раз.

Апробация работы. Материалы, представленные в работе, докладывались на семинарах лаборатории №18, ФГУП "ГосНИИ генетика", на 6-ой Европейской Конференции по Генетике грибов (6-th European Conference of Fungal Genetics, 6-9 April 2002, Pisa, Italy).

Апробация диссертации прошла на заседании секции молекулярной генетики ученого совета ФГУП "ГосНИИ генетика" 22 мая 2006 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы, одно тезисное сообщение в материалах научной конференции, и получен один патент.

Структура работы. Диссертация изложена на//?стр. машинописного текста, включая 2В рисунквГи 3 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы по теме диссертации, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов работы, выводов, и списка цитированной литературы (¿¿¿наименований).

Список сокращений, использованных в автореферате: кДа — килодальтон; ПЦР - полимеразно-цепная реакция; ОГ-ПЦР - ПЦР, использующая в качестве матрицы продукт обратной транскрипции мРНК; п.н. — пара нуклеотидов; т.п.и — тысяча пар нуклеотидов; SDS — додецилсульфат натрия; ПААГ - полна кр ил амндный гель; КМЦ — карбоксиметилцеллюлоза.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо-1,4-бета-ксиланазу РепШШит canescens. При разделении белков культуральной жидкости Р. canescens F178, полученной при росте на жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, обнаруживаются два мажорных белка с молекулярными массами около 120 и 30 кДа (Рис. 1).

Ранее было показано, что белок размером 120 кДа является р-галактозидазой [Николаев И.В., и др., 1989.], а 31 кДа - ксиланазой, по своим биохимическим параметрам относящейся к 10-му семейству глнкознл-гидролаз [Сштцына О.А. и др., 2003].

кДа

170_ _

130 ЧИЖ-*- р-Оа! Рис. 1. Электрофоретическое

100" ^■■-'¿ЗЗ разделение белков кулыуральиой

70— жидкости Р. сапезсепз Р178,

55-

полученной при

культивировании штамма в

Ци жидкой среде со свекловичным

40- ^

жомом в качестве источника 35— ^ углерода.

2515- '

Мы сравнили нуклеотидные последовательности генов, представленных в СепВапк, кодирующих ксиланазы с молекулярной массой около 30 кДа, определили их консервативные области, и на основе полученных данных синтезировали вырожденные олиго нуклеотидные прайм еры.

ху11: 5" - САТОААОТОООАТСС(Т/С)АСТОАОССТ- 3'.

ху12:5* - ССАСТТСТТОАС(С/А)Т(Ю(С/Т)ТС АССА-3'.

С помощью этих праймеров, методом ПЦР, мы амплифицировали фрагмент геномной ДНК Р. сапеясепз Р178, который использовали в качестве зонда, для скрининга библиотеки генов этого организма, полученной ранее. В результате скрининга, был выделен фрагмент геномной ДНК Р. сапезсепв размером 3,4 т.п.н., который затем был субклонирован в плазмидный вектор (Рис, 2). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента подтвердило, что он содержит область, с высокой степенью нуклеотидной гомологииис ксиланазами 10-го семейства родов АзрещШия и РепШШит. Мы

обозначили эту область как ху1А, а полученная плазмида была названа рРСХУЬА.

Кргй. Ара\ Sail

/ * "1 HindiW

EcoRl Noll

xylA

PBluescriptSK I

pPCXYLA (6.5 т.п.н.)

Рис. 2. Карта плазм иды pPCXYLA.

Для установления структуры клонированного нами гена, мы получили соответствующую кДНК, и определили ее нуклеотидную последовательность. Для этого мы синтезировали олигонуклеотидные праймеры xylA57: 5*-CTCGААААССАААСАСАТТСАС-3 * ху1А31: 5 *-СС A ATCGTAG АССТС АТСТС-3',

фланкирующие предполагаемую структурную область xylA. Сравнение нуклеотндных последовательностей геномной и кДНК показало, что структурная часть гена разделена восемью нитронами, и состоит, таким образом, из девяти экзонов. Предполагаемый размер незрелого белка - 327 аминокислотных остатков, расчетная масса незрелого белка составляет 35,1 кДа.

Для подтверждения того, что клонированный нами ген, кодирует именно мажорную ксиланазу P. canescens, он, с помощью плазмидной котрансформации, был введен в штамм P. canescens РСА10, изогенный исходному штамму F178, но несущий мутацию по гену нитратредукгазы, использованную как маркер для проведения трансформации. В результате был отобран ряд трансформантов с повышенной, относительно F178, продукцией ксиланазы (Табл. 1). Как видно из приведенных данных у отдельных штаммов продуктивность возросла более чем в семь раз. С помощью гибридизации геномной ДНК было определено, что в геноме трансформанта с максимальной продукцией ксиланазы (XYL23) содержится 8 копий ксиланазного гена. Таким

образом, повышение продукции ксиланазы оказалось пропорциональным числу копий гена, введенного в геном гриба.

Таблица 1. Продукция ксиланазы мультикопийными штаммами при ферментации в жидкой среде со свекловичным жомом.

N Штамм Ксиланазная активность, ед./мл Увеличение продукции, раз

1 РСА10 (контроль) 104 -

2 XYL1 718 6,90

3 XYL7 562 5,42

4 XYL16 703 6,76

5 XYL22 681 6,55

6 XYL23 770 7,40

7 XYL26 767 7,38

Электрофорез белков кулыуральной жидкости полученных трансформантов показал, что введение плазмиды не привело к появлению новых белков, но вызвало увеличение количества белка размером 31 кДа (рис. За). Увеличение транскрипции клонированного гена также было подтверждено гибридюационным анализом мРНК (рис. 36).

Таким образом, увеличение в исходном штамме числа копий, клонированного нами гена, привело к пропорциональному увеличению количества соответствующей мРНК, и к пропорциональному увеличению продукции белка и ксиланазной активности, что свидетельствует о том, что клонированный нами ген, действительно, кодирует мажорную эндо-р-1,4-ксиланазу P. canescens. Более того, пропорциональность между увеличением числа копий, количества мРНК и количества белка свидетельствует о том, что транскрипция является лимитирующим фактором в продукции ксиланазы у P. canescens.

а. б.

Рис. 3. Увеличение продукции ксиланазы мультикопийным штаммом.

а. БОЗ-ПААГ-электрофорез белков культуральной жидкости Р. сапезсеш РСА10 (2) и мультикопийного штамма ХУЬ23 (1), выращенных в жидкой среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода. 3 - белковые маркеры.

б. Блот-гибрнднзация РНК исходного (РСА10) и мультикопийного (ХУЬ23) штаммов: 1; 2; 3 - 10; 5; 2,5 мкг РНК РСА10, соответственно. 4; 5; б - 10; 5; 2,5 мкг РНК ХУЬ23, соответственно. В качестве зонда использовался фрагмент ДНКлуМ.

Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопнНным и мультикопийным штаммами. Известно, что внеклеточные гликолитические ферменты подвергаются посттрансляционной модификации, включающей в себя отщепление лидерных последовательностей и гликознлирование. Свойства зрелого белка зависят от того, правильно ли прошли эти процессы. В связи с этим встал вопрос, справляются ли системы, отвечающие за посттрансляционную модификацию ксиланазы с почти восьмикратным увеличением количества этого белка? Мы провели сравнение свойств ксиланазы, производимой исходным штаммом и мультикопийным продуцентом ХУЬ26. Эта часть работы производилась совместно с кафедрой химической энзимологии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

С помощью многоступенчатой хромато графической очистки, из культуральной жидкости однокопийного штамма Р. сапезсет Р178 и

многокопийного Р. сапеБсепя ХУЬ2б (табл. 1), был выделен чистый фермент и определены его биохимические и кинетические параметры, субстратная специфичность, температурный и рН оптимумы, стабильность и др. Показано, что свойства нативного и рекомбинантного ферментов практически не различаются. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Сравнение свойств ксиланазы, производимой исходным штаммом (РСА10), и штаммом с увеличенным числом копий ксиланазного гена (ХУЬ26).

Параметры РСА10 ХУЬ26

Молекулярная масса, кДа 31 31

Р1 8,2-9,3 8,2-9,3

Оптимум рН 5,9 5,4

Оптимум Т°С 55 60

Термостабильность, (период полу инактивации, мин) при рН 4/5/6 40°С 180/>180/>180 >180/>180/>180

50"С 15/180/130 20/120/60

60°С 1/5/2 1/4/2

Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом Р. сишсш. Ранее было показано, что синтез ксиланазы индуцируется Ь-арабинозой, и, в меньшей степени, О-кснлозой [Николаев И. В., Винецкий Ю. П., 199$ г., Вавилова Е. А., Винецкий Ю. П., 2003 г.]. Эти данные были получены при переносе предварительно выращенного мицелия, в среды с различными источниками углерода. Однако сам факт переноса мицелия является мощным физиологическим стрессом, что может исказить картину индукции. Кроме того, в этих экспериментах не исследовалась транскрипция ксиланазного гена. Поэтому, для подтверждения данных об индукции синтеза ксиланазы Ь-арабинозой и О-ксилозой, и для изучения транскрипции ху1А, мы провели ферментацию на этих сахарах и на не индуцирующем источнике углерода -фруктозе. Так как Р. сапе$сею Р178 практически не способен утилизировать

арабикозу, то & среду с этим сахаром также была добавлена фруктоза. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3. Ксиланазная активность кулыуральной жидкости Р. сапехсепх Р178 при росте на синтетической среде с различными источниками углерода.

Источник углерода Активность ксиланазы, ед/мл

Арабиноза + фруктоза 5,0

Ксилоза 0,1

Фруктоза не детектируется

Как видно из данных, приведенных в таблице, синтез ксиланазы происходит при росте на средах с арабинозой и ксилозой, причем арабиноза является лучшим индуктором, чем ксилоза. При росте на фруктозе, ксиланазная активность не обнаружена. Этот результат совпадает с результатами, полученными в опытах с переносом мицелия, однако, в опытах с переносом ксилоза вызывала значительно более сильный синтез ксиланазы.

Анализ транскрипции ху1А с помощью гибридизации РНК, выделенной из мицелия, выращенного в указанных условиях, показал транскрипцию этого гена при росте на среде с арабинозой. В то же время, соответствующая мРНК не была обнаружена при росте на среде с ксилозой, что может объясняться недостаточной чувствительностью метода (Рис. 4а). В связи с этим, мы провели анализ РНК с помощью ОТ-ПЦР. Результат электрофоретического разделения продуктов реакции представлен на Рис. 46. Можно видеть, что синтез фрагмента, соответствующего мРНК ху1А (фрагмент размером около 0,9 т.п.н.), происходит как при проведении реакции с препаратами РНК, выделенными из мицелия, выращенного на среде со свекловичным жомом и на среде со смесью фруктозы с арабинозой (дорожки 3 и 4), так и на среде с ксилозой (дорожка 5). В препарате РНК, выделенном из мицелия, выращенного на среде с фруктозой,

транс крипт ху/А практически не обнаруживается. При этом количество образующегося транскрипта убывает в ряду "жом — фруктоза + арабиноза — ксилоза", что соответствует результатам измерения активности фермента.

Таким образом, мы показали, что транскрипция ху/А индуцируется как Ь-арабинозой, так и О-ксилозой, причем индукция Б-ксилозой происходит значительно слабее.

1234 5 678 9 п.н. 1 2 3 4 5 6

150СК_ " юогг"-

а- б.

Рис. 4. Транскрипция ху1А при росте на различных источниках углерода, а. Гибридизация РНК, выделенной из мицелия, выращенного на синтетической среде с: 1; 2; 3 — фруктозой, 4; 5; 6 — ксилозой, 7; 8; 9 — арабинозой и фруктозой. В случае каждой среды наносилось поЮ; 5; 2,5 мкг РНК, соответственно. Б качестве зонда использовался фрагмент ДНК ху/А. б. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР РНК из мицелия, выращенного на различных средах, с праймерами ху1А57 и ху)А31. Дорожки: 1 — ДНК маркер, 2 — амплификат геномной ДНК Р. сапехсею с теми же праймерами, 3 — амплификат продукт обратной транскрипции РНК из мицелия, выращенного на среде со свекловичным жомом, 4 — с арабинозой и фруктозой, 5 — с ксилозой, 6 — с фруктозой.

Влияние суперпродукции кснланазы на продукцию других внеклеточных ферментов. Увеличение числа копий сильно экс пресс ирующихся генов, кодирующих внеклеточные гликозилазы, может влиять (обычно в сторону уменьшения) на продукцию других внеклеточных ферментов. Это влияние может объясняться различными причинами, например конкуренцией за связывание белка активатора транскрипции, изменением внутриклеточного пула индуктора и питательных веществ, голоданием клетки,

вызванным сверхпродукиией белка, или перегрузкой секреторного аппарата. В связи с этим, мы сравнили продукцию ряда ферментов мультикопийным штаммом Ху123 и исходным штаммом РСА10. Для сравнения мы измерили активности тех же ферментов в культуральной жидкости мультикопииного продуцента р-галактозвдазы РСА26. Результаты приведены в таблице 4. Как видно из приведённых данных, введение дополнительных копий ксиланазного гена не приводит к изменению продукции большинства ферментов, что говорит о том, что не происходит голодания клеток по ростовым факторам или питательным веществам. В тоже время продукция двух ферментов — р-галактозндазы и эндоглюканазы, снижена значительно. Это снижение можно было бы объяснить эффектом титрования общего для этих генов белка активатора, но в мультикопийном по гену р-галактозидазы штамме (РСА26) не происходит снижения продукции ни ксиланазы, ни эндоглюканазы, в то время как уменьшается продукция арабиназы. Таким образом, снижение р-галактозидазы и эндоглюканазы происходит не из-за титрования общего белка активатора, а вследствие каких-то других причин, например изменения внутриклеточных концентраций индукторов синтеза этих белков.

Таблица 4. Относительные активности некоторых ферментов культуральной жидкости штаммов Р. сапехсепз РСА26 и ХУЬ-23, при выращивании на среде со свекловичным жомом. За 100% приняты соответствующие активности РСА10.

Штамм Кснланаза Р- галакто-зндаз* Р- ксилози-даза Ара би нам Арабкно-фурянозидязя Р- глюко-зидаза Экдоглюка-наза

РСА26 97 761 91 29 97 77 108

895 58 93 98 118 114 53

Ксиланаза В. Как уже было упомянуто, мицелиальные грибы производят несколько типов ксиланаз, причем многие организмы производят несколько ферментов одновременно. Мы проверили, имеет ли Р. сапевсет другие структурные гены ксиланаз, и, если имеет, то экспрессируются ли они. Для выполнения этой задачи, мы использовали тот же подход, что и при

клонировании гена ксиланазы А. Мы определили консервативные области генов одного го типов кснланаз 11-го семейства, имеющих размер около 20кДа, синтезировали олигонуклеотидные праймеры ху1В50 и хуШЗО, гомологичные этим областям, и с помощью ПЦР амплифицировали соответствующий участок генома P. canescens,

ху1В50: 5 ' - А АСТАС A ACGGCA ACCTTGG-3 ' xylB30: 5'-TTCGCCCAGAAGTTGAAATG-3 ' Определение нуклеотидной последовательности полученного фрагмента ДНК подтвердило, что он обладает высокой структурной гомологией с генами кснланаз 11-го семейства родов Aspergillus и Pénicillium, имеющих молекулярную массу около 20 кДа. Мы обозначили фрагмент геномной ДНК Л canescens,

предположительно кодирующий вторую ксиланазу этого организма, как xylB. Чтобы определить происходит ли транскрипция этого гена, мы провели ПЦР, используя в качестве матрицы продукты реакции обратной транскрипции РНК, выделенной из мицелия P. canescens, выращенного на различных источниках углерода, и праймерами ху!В50 и хуШЗО. Места отжига этих прайм еров располагаются с разных сторон от содержащегося в гене интрона, в результате чего продукты амплификации кДНК и геномной ДНК должны различаться на 50 оснований. (Такой метод анализа был выбран из-за его большей чувствительности, по сравнению с гибридизацией, так как в спектре белков культуральной жидкости не наблюдается значительного

1 2 3 4 5 6 7 пн.

Рис. 5. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР с праймерами ху1В50 и хуШЗО РНК из мицелия Р. сапезсею, выращенного на различных источниках углерода. Дорожки: 1 — в качестве матрицы для ПЦР использовалась геномная ДНК (контроль), 2 - продукт обратной транскрипции РНК из мицелия, выращенного на среде со свекловичным жомом, 3 — на среде со смесью фруктозы и арабинозы, 4 - с ксилозой, 5 — с фруктозой, 6 — пустая проба, 7 - ДНК-маркер.

количества белка соответствующего молекулярного веса {Рис. 1)). Результат электрофоретического разделения продуктов реакции представлен на Рис. 5. Из приведенной фотографии видно, что транскрипт xylB удалось обнаружить только в пробе, полученной из мицелия, выращенного на среде со свекловичным жомом (нижняя полоса), причем транскрипция даже в этих условиях происходит чрезвычайно слабо. В пробах, полученных из мицелия, выращенного на ксилозе, смеси фру ¡егозы и арабинозы, и на фруктозе, амплифицируется только фрагмент геномной ДНК, содержащейся в качестве примеси в препаратах РНК.

Таким образом, P. canescens имеет ген, кодирующий ксиланазу 11-го семейства, с молекулярной массой около 20 кДа, но, в изученных условиях, его вклад в общую продукцию ксиланазы незначителен.

Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитическнх генов. Некоторое время назад был клонирован ген xlnR, кодирующий белок — активатор транскрипции генов ксиланолитического и целлюлолитического комплексов мицелиального гриба Aspergillus niger [Noel et al., 1998]. Этот белок активирует транскрипцию целого ряда генов, индуцируемую ксилозой, связываясь с последовательностью "5*-GGCTAA-3* " в их промоторах. Гомолог этого гена найден в ряде других аспергиллов, и в мицелиальном грибе Trtchoderma reesei. . Во всех этих организмах он регулирует транскрипцию внеклеточных ферментов, индуцированную ксилозой. Для Aspergillus niger было показано что, введение дополнительных копий xlnR в геном исходного штамма, приводит к повышению уровня транскрипции контролируемых им генов. (Также введение дополнительных копий гена активатора может супрессировать эффект титрования белка активатора, вызванный введением дополнительных копий контролируемых генов.)

Мы решили выяснить, есть ли у P. canescens ген, гомологичный xlnR A. niger, и если есть, то какова его роль в регуляции продукции ксиланазы и других внеклеточных ферментов этим организмом.

Эта часть работы состояла из следующих этапов:

- поиска в геноме Р. «шетсепз уникального участка с похожей структурой.

- клонирование этого участка, определение и анализ его нуклеотидной последовательности

- определение физиологической роли клонированного фрагмента ДНК.

Анализ геномной ДНК Р. сапе$сет и клонирование гена. С помощью ПЦРмы получили фрагмент ДНК х1пНА. п!§ег, который использовали в качестве зонда для гибридизации по Саузерну геномной ДНК Р. сатхсею. Анализ показал наличие в геноме Р. сапехсет единственной области, с высокой степенью нуклеотидной гомологии с х!пЯ А. niger, Эту область мы выделили из банка генов Р. сапезсею в составе фрагмента ДНК размером около 7,5 т.п.н., и субклонировли в плазмидный вектор. Полученная плазмида была названа рХИ53 (рис. 6 а).

а.

_Т;'11пк

I—►

фу

хШ

З'хШ

рЦС57

рХЯ53

б.

ШаО

»1

З'хШ

риС57

рХ1Ш53

Рис. 6. а. Карта плазм иды рХЛ53. Фрагмент геномной ДНК Р. сапезсепз, клонированный в плазмидный вектор риС57, содержит кодирующую область гена, 0,8 тпо промоторной области, и около б тпо 3'- не транслируемой области. Закрашенными стрелками отмечены сайты рестрикции, по которым производилось расщепление, для создания конструкции для делеции гена. б. Плазм ида рХКЫ53, примененная для делеции х!пЯ.

Мы определили нуклеотидиую последовательность части клонированного фрагмента, и определили, что она кодирует белок на 70% совпадающий с Х1пЯ А. т%ег. По аналогии с А. т%ег эта область была обозначена х1пЯ. Мы нашли, что в К-концевой области белка, кодируемого х1пЯ находится кластер со структурой "Су5-Х2-Сув-Хб-Су5-Х5-Суз-Х2-Су5-Х6-СуЕ", характерный для вАЫ-подобных грибных транскрипционных регуляторов, у которых он образует цинк-содержащий ДНК-связы вающий домен ("цинковый палец") типа "2п2Су5б". Сравнение аминокислотных последовательностей "цинковых пальцев" известных на настоящий момент времени гомологов Х1пЯ А. п'щег представлено на Рис. 7. Также на этом рисунке приведена структура ДНК-связывающего домена дрожжевого регулятора 6АЬ4 и активатора транскрипции целлюлазных генов Т. геезе! асе2.

РСХ1ПЙ. Ап1дХ1пК АОХ1Ш1

Ап1<ЗХ1оИ ТгеуХ1пЕ

ТгеуАсе2 Са14

ТАтаиИЗМ CDOCÍЮLRTKCDGOQPCAHCI'BFGL£C^, ар таил соосиоьетксбоон рсднс 1еесЬт ОР свосвдьрткстеокрсднс хвреглШ

АРтаяшзм стаэоаджтксооон РСАНСГ егоьтс Е АРтамазы соосмошткотедкгрршсхЕгоьтф вршиизкг СРасм0ькткахз1дрсднс1Егаь01

ТАКЕККК1ЩКА5КК01ААААА :УАЕЕНКИиЗКА5КК1ДААААА :УАЕЕЕХКЕ.аКА5ККВ1ЛАААА ТАБЕЮСККгКАБККОЬААААА IХАКЕККЮШКАЗККБIААААА :утаяиШ«ЗКАЗКК01АА00А

ЖОД|СР11СНРККЬКСРК 15а5РСС5КСАКДМУАфГ5 РРБЛР

мои;__

МН,ЬЭ51 ЕОД|СР1 СКЬККЬКС5КЕКРКСАКС1.КИ№(Е(ЗРУ5РКГККЗ РЬТЯАКЬТЕУЕЗ

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей ДНК-связывающих доменов известных на настоящий момент времени гомологов Х1п11 А. тзег. Для сравнения на этом рисунке приведена структура ДНК-связывающего домена дрожжевого регулятора вАЫ и активатора транскрипции целлюлазных генов Т. геезе! Асе2. Обведены области цинк-содержащего кластера, серым фоном отмечены совпадающие аминокислоты. Приведены последовательности (сверху вниз): Х1пП Р. сапехсею, Х1пЯ А. т%ег, АоХ1пК А. огугае, Х1пИ А. ксмаски, Х1гЛ А. т(Ы1ат, Хуг1 Т. геезе1, Асе2 Т. гее$е1, Оа14 сегеутае.

Из приведенного сравнения видно, что аминокислотная последовательность ДНК-связывающего домена Х1пЯ Р. сапевсепь отличается от домена Х1пЯ А. пщег на две аминокислоты, но эти аминокислоты не являются консервативными. Такая высокая степень гомологии позволяет предположить, что Х1пЯ Р. сапезсет связывается с той же последовательностью, что и его гомологи.

Влияние делецни и амплификации Х1пН на продукцию ксиланазы и рост штамма. Для определения физиологической роли х1пН мы заменили его кодирующую область геном нитратредуктазы мицелиального гриба Р. сНгу50§епит, под управлением собственного промотора, для чего создали конструкцию, изображенную на Рис. б б. Также, с помощью плазмидной трансформации, мы получили ряд штаммов с увеличенным числом копий х1пН.

Штаммы с делецией оказались практически не способны к росту на агаризованной среде с ксиланом в качестве единственного источника углерода, но продолжали хорошо расти на среде с глюкозой (Рис. 8 а), фруктозой, ксилозой, и карбоксиметилцеллюлозой (фотографии не приведены).

1 1 3 4

25 — - .... 15— -

а. б.

Рис. & Влияние делеции х1пК на рост гриба и продукцию ксиланазы. а. Рост штаммов на среде с глюкозой (в) и ксиланом (X). 1 - дикий тип (РЭАЮ), 2, 3, 4 — штаммы с делецией х1пИ. б. БЭЗ-ПААГ—электрофорез белков культуральной жидкости штаммов, ферментированных в жидкой среде со свекловичным жомом. Дорожки: 1 — белковый маркер, 2, 3 — культуральная жидкость штаммов дикого типа, 4, 5, б — штаммов с делецией х1пК.

Культивирование этих штаммов в жидких средах с различными источниками углерода показало, что у них значительно снижена продукция ксиланазы как при росте на среде со свекловичным жомом (Рис 8 б, Табл. 5), так и при росте и среде с ксилозой, и среде со смесью фруктозы и арабинозы

(Табл. 5). Таким образом, белок, кодируемый xlnR, необходим для индукции синтеза ксиланазы обоими сахарами.

Одновременно с ксиланазной активностью, в культуральной жидкости измерялась активность р-галактозидазы. Результаты измерений также представлены в таблице 5. Из приведенных данных видно, что делеция xlnR влияет на продукцию Р-галактозидазы значительно слабее, чем на продукцию ксиланазы. К тому же это влияние неоднозначно. Таким образом, продукция ¡3-галактозидазы у P. canescens, находится под контролем другого регулятора, несмотря на то, что она индуцируется арабинозой, также как продукция ксиланазы.

Таблица 5. Накопление ксиланазной и р-галактозкаазной активностей при ферментации штамма дикого типа (РСАЮ) и штамма с делецией х!пЯ (АхЫР.) на средах, содержащих различные источники углерода.

Источник углерода Фермент РСАЮ, ед/мл AxlnR, ед/мл Остаточная активность %

Свекловичный жом Ксиланаза 97,5 14,7 14

Р" галактозидаза 64,2 43,4 67

Арабиноза + фруктоза Ксиланаза 5,1 не обнаруживается 0

Р- галактозидаза 17,6 13,2 77

Ксилоза Ксиланаза 0,1 не обнаруживается 0

Р- галактозидаза 0,2 0,4 200

Фруктоза Ксиланаза не обнаруживается не обнаруживается -

Р- галактозидаза 0,3 0,4 133

Также было показано, что введение дополнительных копий х1пК увеличивает продукцию ксиланазы (Табл. 6, Рис. 9 б). Анализ мРНК штаммов с делецией х1пИ и дополнительными копиями этого гена, выращенных на

свекловичном жоме, показал, соответственно, снижение и увеличение количества мРНК ху1А, что говорит о том, что делеция х1пН влияет именно на транскрипцию ксиланазного гена. (Рис. 9 а).

Роль хЫК в регуляции продукции других ферментов. Мы измерили активности ряда ферментов в культуральной жидкости штаммов с делецией и дополнительными копиями х1пИ, выращенных на среде со свекловичным жомом. Результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6. Активности ферментов в культуральной жидкости штамма дикого типа (РСА10), штамма с делецией х1пЯ (Ах1пН), и штамма с дополнительными копиями х1пЯ (ХК53), выращенных на среде со свекловичным жомом.

Фермент Активность, ед/мл

РСА10 Лх1пН Х1153

а-/,-араб инофураноз ид аза 39,6 38,4 45,6

Р-Л-глюкозидаза 6,0 4,4 7,0

Р-С-целлобиаза 0,4 0,04 1,8

р-£>-ксилозидаза 9,3 3,3 27,9

а-О-галактозидаза 4,8 1,4 26

Р-О-галактзидаза 64,2 43,4 55,8

эстеразная активность (по лНФ-бутирату) 2,6 0,8 22

эстеразная активность (иНФ-капроату) 0,« 1,0 14,6

Ксиланаза (по ксилану из березы, рН 5,0) 132 22 300

Араб ино кс илан-араб инофураногидро лаза (по арабиноксилану из пшеницы) 148 72 320

Эндоглюканаза (по КМЦ) 2,2 2,0 11

Эндоглюканаза (по р-гл ю кану из овса) 2,4 3,2 25,2

Из представленных данных видно, что у штаммов с делецией х!пЯ значительно уменьшена не только продукция эндо-р-1,4-кснланазы, но, также, других ферментов с ксилаполитической активностью (арабиноксилан-арабинофураногидролазы, р-ксилозндазы и р-целлобиазы), в то время как продукция р-галактозидазы и а-Ь-арабинофуранозидазы изменялась незначительно. Активности р-глюкозидазы и энио-Р-1,4-глюканазы так же изменялись мало, оставаясь весьма низкими. Электрофоретическая картина секретируемых белков исследуемых штаммов приведена на Рис. 9. Можно

Рис. 9. Влияние делении и амплификации х1пК на транскрипцию ху1Л и продукцию внеклеточных ферментов, а. Блот-гибридизация РНК из мицелия, выращенного на свекловичном жоме, с фрагментом ДНК ху1А. Дорожки: 1,2,3 -10, 5,2,5 мкг РНК исходного штамма (РСА10), соответственно; 4, 5,6 — 10, 5,2,5 мкг РНК штамма с делецией х1пЯ\ 7, 8, 9 — 10, 5, 2,5 мкг РНК штамма с дополнительными копиями х!пН. б. 305-ПААГ-электрофорез белков культуральной жидкости штаммов, ферментированных в жидкой среде со свекловичным жомом. Дорожки: 1 — исходный штамм (РСА10), 2 — штамм с делецией х1пК, 3 — штамма с увеличенным числом копий х!пЯ, 4 — маркер молекулярного веса.

видеть, что штамм с делецией х1пН синтезируют два мажорных белка — р-галактозидазу (полоса в области 120 кДа) и а-Ь-арабинофуранозидазу (полоса в

области 70 кДа), в то время как другие ферменты, проявляющиеся на электрофорезе в виде заметных полос, в том числе мажорная кснланаза (полоса в области 31 кДа), практически не секретируются.

Увеличение числа копий х!пН увеличивало активность тех же ферментов, активность которых уменьшалась у штамма с удалённым геном х!пЯ (Табл. б). Из Рис. 96 видно, что среди всех секретируемых белков значительно увеличивался вклад компонентов с массой 50-60 кДа, а так же появлялись новые электрофоретические полосы, соответствующие белкам с массой порядка 20 кДа, возможно соответствующие ксиланазе В. Затрагивались и некоторые целлюлитнческие ферменты: в мультикопийном варианте Р.сапезсет ХК53 возрастала секреция (3-целлобиазной и эндо-глюканазной активностей. Вместе с тем, активность р-галактоз ид азы и а-Л-арабинофуранозидазы, как и в случае делеционного варианта х1пК, изменялась незначительно.

Транскрипция дс/лЛ. Мы попытались определить, как регулируется транскрипция хЫК, Для этого мы использовали тот же подход, что и при исследовании транскрипции ху1А и ху1В. Были синтезированы два

олигонуклеотидных прайм ера х!пЯ72 и х1пЕ32, комплементарных областям, расположенным с двух сторон первого интрона х1пЯ.

х1пК72: 5-ТССААТСОТТССССААТТССТ-3'

х1пК32:5'-ССААОАТССТТТТТСОАСОСТТ-3'

С помощью этих праймеров была проведена ПЦР с продуктами реакции обратной транскрипции РНК,

1 - 2А„Я_£......£

Рис. 10. Электрофоретическое разделение продуктов ОТ-ПЦР с праймерами х1пН72 и х1пЯ32 РНК из мицелия Р. сапезсепз, выращенного на различных источниках углерода. Дорожки: I -ДНК-маркер, 2 - ПЦР с геномной ДНК (контроль), 3 - ПЦР с продуктом обратной транскрипции РНК из мицелия, выращенного на свекловичном жоме, 4 — на смеси фруктозы и арабинозы, 5 — на ксилозе, 6 - на фруктозе.

выделенной из мицелия Р. сапезсепя, выращенного на различных источниках углерода. Фотография электрофоретического разделения продуктов реакции представлена на Рис. 10. Можно видеть, что транскрипт х1пЯ удалось обнаружить в препарате РНК, выделенном из мицелия, выращенного на свекловичном жоме, и не удалось - при росте на синтетических средах. Этот факт позволяет сделать вывод о том, что транскрипция хЫИ регулируется, но не позволяет определить природу этой регуляции. Можно предложить два объяснения усиления транскрипции х1пК при росте на среде со свекловичным жомом: либо в этой среде присутствует специфический индуктор транскрипции хЫК, либо транскрипция этого гена подвержена катаболитной репрессии.

Выводы.

1. Показано наличие у P. canescens F178 двух генов xylA и xylB, первый из которых кодирует ксиланазу 10-госемейства, авторов - 11-го.

2. Показано, что продукция ксиланазы P. canescens обусловлена, главным образом, активностью гена xylA, в то время как вклад xylB в общую продукцию ксиланазы незначителен.

3. Клонирован полный ген xylA, и показано, что введение дополнительных копий этого гена в исходный штамм пропорционально увеличивает продукцию ксиланазы. Это доказывает, что транскрипция xylA является лимитирующим фактором в продукции ксиланазы P. canescens.

4. Клонирован ген xlnR, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens xylA, и показано что его амплификация приводит к увеличению транскрипции этого гена.

5. Показано, что xlnR необходим для индукции синтеза ксиланазы, обусловленной как L-арабинозой, так и D-ксилозой.

6. Показано, что xlnR играет ключевую роль в продукции целого ряда ксиланолитических ферментов мицелиальным грибом P. canescens, и что увеличение числа копий этого гена приводит к увеличению синтеза этих ферментов.

7. Показана перспективность использования P. canescens FI78 в качестве базового штамма, для создания промышленного продуцента ксиланазы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Николаев И.В., Беккер О.Б., Серебряный В.А., Чулкин А.М., Винецкий Ю.П. Суперпродукция секретируемой бета-галактозидаз ы мицелиальным грибом Pénicillium canescens: структура гена и конструкция мультикопийного продуцента // Биотехнология. 1999. №3. С. 3-13.

2. Серебряный В. А., Вавилова Е.А., Чулкин A.M., Винецкий Ю.П. Клонирование гена эндо-1,4-р-ксиланазы Pénicillium canescens И получение мультикопийных штаммов // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т.38. №5.С.495-501.

1. Serebrianyi V.f Nikolaev I., Aleksenko A., Vinetski Y., Nielsen J. Expression of genes encoding arabinose induced carbohydrolases in Aspergillus nidulans is modulated by different factors // Abstracts of б-th European Conference of Fungal Genetics, 6-9 April 2002, Pisa, Italy. P. 18.

2. Снннцына O.A., Гусаков A.B., Окунев O.H., Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Рекомбинантная эндо-1,4-р-ксиланаза Pénicillium canescens // Биохимия. 2003. Т. 68. Ка 12. С. 1631-1638.

3. Винецкий Ю.П., Вавилова Е.А., Серебряный В.А., Чулкин А.М. Фрагмент ДНК РСХ-302, кодирующий синтез секретируемой эндо-(1-4)-бета-кснланазы Pénicillium canescens и штамм гриба Pénicillium canescens -продуцент секретируемой эндо-( 1 -4 )-бета-кс нланазы. Патент РФ № 2197526.2003.01.27.

4. Серебряный В.А., Синицына О.А., Федорова Е.А., Окунев О.Н., Беккаревим А.О., Соколова Л.М., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Синтез ксиланолитических ферментов и других карбогидраз в трансформантах гриба Pénicillium canescens с измененным числом копий гена транскрипционального активатора xlnR И Приют, биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. № б. С. & ?Ь

Принято к исполнению 16/11/2006 Исполнено 17/11/2006

Заказ № 947 Тираж: 100 экз.

Типография «1 ] -й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское т., 36 (495) 975-78-56

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Серебряный, Всеволод Александрович

Введение.

Список сокращений, использованных в работе.

1. Обзор литературы.

1.1 Структура полисахаридов растительных клеточных стенок.

1.1.1. Целлюлоза.

1.1.2. Лигнин.

1.1.3. Гемицеллюлозы.

1.1.3.1. Р-Глюканы.

1.1.3.2. Ксилоглюкан.

1.1.3.3. Ксилан.

1.1.3.4. Галактоманнан, галактоглюкоманнан.

1.1.4. Пектин.

1.2. Ксиланазы мицелиальных грибов.

1.2.1. Молекулярная масса.

1.2.2. Температурный и рН оптимум грибных ксиланаз, классификация

1.2.3. Субстратная специфичность и продукты расщепления.

1.2.4. Побочные активности грибных ксиланаз.

1.2.5. Структура ксиланаз 10 и 11 семейства.

1.2.6. Аминокислотные последовательности грибных ксиланаз и структуры кодирующих их генов.

1.2.7. Посттрансляционная модификация ксиланаз.

1.3. Регуляция транскрипции генов ксиланаз мицелиальных грибов.

1.3.1. Aspergillus.

1.3.2. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Aspergillus XlnR и CreA.

1.3.3. Координированная экспрессия арабиназных генов A. niger.

1.3.4. Trichoderma.

1.3.5. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Т. reesei.

1.3.6. Регуляция промотора xynl Т. reesei.

1.3.7. Регуляция промоторахуп2 Т. reesei.

1.3.8. Penicillium.

1.3.9. Регуляция транскрипции генов ксиланаз в зависимости от рН среды.

1.4. P. canescens F178 (ВКПМ).

2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты и материалы.

2.2. Бактериальные и грибные штаммы, их культивирование.

2.3. Общие методы.

2.4. Исследование ростовых характеристик грибов.

2.5. Электрофоретическое разделение белков.

2.6. Получение [а-32Р]-меченных фрагментов ДНК.

2.7. Выделение ДНК из грибного мицелия.

2.8. Выделение РНК из грибного мицелия.

2.9. Обратная транскрипция РНК и ОТ-ПЦР.

2.10. Электрофорез РНК и перенос на нейлоновую мембрану.

2.11. Гибридизация.

2.12. Плазмидная трансформация Е. coli.

2.13. Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК рекомбинантных фагов.

2.14. Трансформация гриба Penicillium canescens.

2.15. Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК.

2.16. ПЦР с использованием грибных спор в качестве матрицы.

2.17. Измерение активностей ферментов.

2.18. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.19. Клонирование xylA P. canescens.

2.20. Получение кДНК xylA и определение ее нуклеотидной последовательности.

2.21. Определение числа копий xylA в геноме мультикопийного продуцента.

2.22. Клонирование xlnR P. canescens.

2.23. Делеция xlnR.

2.24. Синтез праймеров для амплификации фрагмента гена у-актина

P. canescens.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. КсиланазаА.

3.1.1. Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо-1,4-бета-ксиланазу Penicillium canescens.

3.1.2. Определение структуры xylA.

3.1.4. Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультикопийным штаммами.

3.1.5. Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом

P. canescens.

3.1.6. Влияние суперпродукции ксиланазы на продукцию других внеклеточных ферментов.

3.2. Ксиланаза В.

3.3. Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитических генов.

3.3.1. Анализ геномной ДНК P. canescens и клонирование гена.

3.3.2. Влияние делеции и амплификации xlnR на продукцию ксиланазы и рост штамма.

3.3.3. FonbxlnR в регуляции продукции других ферментов.

3.3.4. Транскрипция xlnR.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента"

Человек давно использует ферменты мицелиальных грибов для обработки различного сырья. Однако, на протяжении долгого времени это использование ограничивалось небольшим количеством технологических процессов, таких как производство соевого соуса или сыра. В последние десятилетия, в связи с интенсификацией технологических процессов и с развитием новых технологий переработки растительного сырья и охраной окружающей среды, появилась потребность в получении ферментных препаратов с заданными свойствами. В связи с этим повысился интерес к молекулярной биологии грибов, как природных продуцентов гликолитических ферментов.

Следует отметить, что изучение синтеза внеклеточных ферментов мицелиальными грибами объясняется не только растущей потребностью современной промышленности в этих ферментах, но и тем, что это удобная модель для изучения регуляции транскрипции эукариотических генов и секреции белков. Являясь одними из простейших эукариотических организмов, мицелиальные грибы представляют собой удобный объект для изучения. Многие их виды быстро растут, не требуют сложных питательных сред, и для них разработаны относительно простые способы генетической трансформации.

Одним из ферментов, находящих все большее применение в современной промышленности, является эндо-1,4-р-ксиланаза (эндо-ксиланаза, ксиланаза) - фермент, расщепляющий главную цепь ксилана на ксилоолигосахариды. Он находит применение при производстве бумаги для отбеливания целлюлозной пульпы, в пекарном деле для удаления ксилана из теста для улучшения его свойств. В кормовой промышленности ксиланаза входит в состав мультиферментных комплексов, улучшающих свойства кормов. Возможно применение ксиланазы, совместно с другими ферментами, для утилизации растительных отходов, таких как солома, опилки, и прочее.

Объектом нашего исследования был выбран мицелиальный гриб Penicillium canescens ВКПМ F178, первоначально выделенный как природный продуцент (З-галактозидазы, и до настоящего времени использующийся для производства этого фермента. Мы поставили перед собой задачу определить пути увеличения продукции эндо-1,4-р-ксиланазы этим организмом, и оценить возможность создания на его основе промышленного штамма - продуцента.

Создание современных продуцентов является комплексной задачей, и одним из первых этапов этой работы является клонирование генов, кодирующих целевой фермент. Выделение гена открывает следующие возможности:

- повысить продукцию целевого фермента, путем увеличения числа копий кодирующего его гена, или путем изменения промоторной области этого гена

- изменить свойств белка, путем изменения нуклеотидной последовательность гена

- изучать закономерности секреции белка.

Другим подходом к повышению продукции целевого фермента является изучение регуляции транскрипции кодирующего его гена. Эта работа включает в себя поиск низкомолекулярных индукторов транскрипции, поиск белков - регуляторов транскрипции, изучение путей передачи сигнала от индуктора к регуляторному белку. В некоторых случаях увеличение внутримолекулярной концентрации индуктора и регуляторного белка приводит к повышению транскрипции гена целевого фермента.

Исходя из описанных выше подходов, в нашей работе были поставлены следующие задачи:

- клонировать ген, кодирующий мажорную ксиланазу P. canescens F178

- оценить возможность увеличения продукции ксиланазы с помощью увеличения числа копий этого гена

- определить влияние увеличения числа копий этого гена на продукцию других внеклеточных ферментов

- выяснить наличие у P. canescens F178 других генов, кодирующих ксиланазы, и оценить их влияние на суммарную продукцию ксиланазы

- изучить регуляцию транскрипции гена (генов), кодирующих ксиланазу P. canescens F178

- клонировать ген, кодирующий позитивный регулятор транскрипции гена мажорной ксиланазы P. canescens F178, и определить его роль в продукции других ферментов этим организмом.

Список сокращений, использованных в работе.

КФ - классификация ферментов по рекомендациям Международного

Биохимического Союза [20] ПЦР - полимеразно-цепная реакция

ОТ-ПЦР - ПЦР, использующая в качестве матрицы продукт обратной транскрипции мРНК п.н. - пара нуклеотидов т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза ТХУ - трихлоруксусная кислота SDS - додецилсульфат натрия dATP - дезоксиаденозинтрифосфат dNTP - смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов

1. Обзор литературы.

В природе многие мицелиальные грибы получают питательные вещества для своего роста, разрушая клеточные стенки растений, с помощью внеклеточных гликолитических ферментов. Спектр ферментов, производимых каждым видом грибов при росте на конкретном субстрате, зависит как от вида гриба, так и от субстрата. Поэтому прежде чем переходить к описанию внеклеточных грибных гликозилаз, нам представляется целесообразным дать краткое описание полимеров составляющих растительные клеточные стенки.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Серебряный, Всеволод Александрович

Выводы.

1. Показано наличие у P. canescens F178 двух генов xylA и xylB, первый из которых кодирует ксиланазу 10-го семейства, а второй - 11-го.

5. Показано, что xlnR необходим для индукции синтеза ксиланазы, обусловленной как L-арабинозой, так и D-ксилозой.

7. Показана перспективность использования P. canescens F178 в качестве базового штамма для создания промышленного штамма продуцента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Серебряный, Всеволод Александрович, Москва

1. Билай В.И., Школьный А.Т., Элланская И.А., Черемнова Т.А., Югова Л.В., Дорохов В.В., Калунянц К.А. // А.с. СССР № 1065476. 1984.

2. Вавилова Е. А., Винецкий Ю. П. Индукция синтеза эндо-1,4-Р-ксиланазы и Р-галактозидазы в исходных и рекомбинантных штаммах гриба Penicillium canescens II Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. №2. С. 167-172.

3. Вавилова Е.А., Антонова С.В., Барсуков Е.Д., Винецкий Ю.П. Механизм суперпродукции секретируемых ферментов у мицелиального гриба Penicillium canescens II Прикл. биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 3. С. 284-292.

4. Головлева Л.А., Мальцева О.В. Биохимия разложения лигнина микроорганизмами. // Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: Наука, 1986. С. 93-136.

5. Голубев A.M., Ибатуллин Ф.М., Килимник А.Ю., Родионова Н.А., Неустроев К.Н. Выделение и свойства эндоксиланазы и Р-ксилозидазы из Aspergillus oryzae II Биохимия. 1993. Т. 58. № 6. С. 845-851.

6. Гринюс Л.Л. Транспорт макромолекул у бактерий / / М: Наука, 1986. 240 с.

7. Клёсов А.А. Ферменты целлюлазного комплекса. // Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: Наука, 1986. С. 93-136.

8. Левит М.Н., Шкроб A.M. Лигнин и лигниназа // Биоорганическая Химия. 1992. Vol. 18. №3. Р. 309-345.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование IIМ.: Мир, 1984. 480 с.

10. Неустроев К.Н., Голубев A.M., Ибатуллин Ф.М., Фирсов JI.M. Влияние ингибиторов гликозилирования на секрецию гликозидаз у Aspergillus awamori var. X100/D27 // Биохимия. 1993. Т. 58. № 4. С. 574-579.

11. Николаев И.В., Епишин С.М., Захарова Е.С., Котенко С.В., Винецкий Ю.П. Молекулярное клонирование гена секретируемой Р-галактозидазы мицелиального гриба Penicillium canescens II Молекулярная биология. 1992. Т. 26. С. 869-875.

12. Николаев И.В., Ходова О.М., Тимохина Е.А., Алексенко А.Ю., Винецкий Ю.П. Молекулярные характеристики секретируемой галактозидазы Penicillium canescens // Биохимия. 1989. Т. 54. № 8. С. 1294-1299.

13. Николаев И.В., Ю.П В. L-арабиноза индуцирует синтез секретируемой Р-галактозидазы у мицелиального гриба Penicillium canescens II Биохимия. 1998. Т. 63. № 11. С. 1523-1528.

14. Родионова Н.А., Горбачева И.В., Буйвид В.А. Фракционирование и очистка эндо-1,4,-Р-ксиланаз и экзо-1,4,-Р-ксилозидаз Aspergillus niger II Биохимия. 1977. Т. 42. № 4. С. 659-671.

15. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов// М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 С.

16. Синицына О.А., Бухтояров Ф.Е., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Беккаревич А.О., Винецкий Ю.П., Синицын А.П. Выделение и свойства основных компонентов внеклеточного комплекса Penicillium canescens II Биохимия. 2003. Т. 68. № 11. С. 1494 1505.

17. Шарков В.И., Куйбина Н.И. Химия гемицеллюлоз / / М: Лесная промышленность, 1972. 440 с.

18. Номенклатура ферментов: Рекомендации Международного Биохимического Союза // М.: ВИНИТИ, 1979. 312 с.

19. Alconada T.M., Martinez M.J. Purification and characterization of an extracellular endo-l,4-beta-xylanase from Fusarium oxysporum f. sp. melonis //FEMS Microbiol. Lett. 1994. Vol. 118. № 3. P. 305-310.

20. Aleksenko A., Nikolaev I., Vinetski Y., Clutterbuck A.J. Gene expression from replicating plasmids in Aspergillus nidulans II Mol Gen Genet. 1996. Vol. 253. № 1-2. P. 242-246.

21. Aleksenko A.Y., Makarova N.A., Nikolaev I.V., Clutterbuck A.J. Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene // Curr.Genet. 1995. Vol. 28. P. 474-477.

22. Aro N., Ilmen M., Saloheimo A., Penttila M. ACEI of Trichoderma reesei is a repressor of cellulase and xylanase expression // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69. № 1. P. 56-65.

23. Aro N., Pakula Т., Penttila M. Transcriptional regulation of plant cell wall degradation by filamentous fungi // FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 29. № 4. P. 719-739.

24. Aro N., Saloheimo A., Ilmen M., Penttila M. ACEII, a novel transcriptional activator involved in regulation of cellulase and xylanase genes of Trichoderma reesei // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. № 26. P. 24309-24314.

25. Bailey. M. J., Puis J., Poutanen K. Purification and properties of two xylanases from Aspergillus oryzae II Biotechnol. Appl. Biochem. 1991. Vol. 13. P. 380-389.

26. Bazus A., Rigal L., Gaset A., Fontaine T. W.J.M., Fournet B. Isolation and characterisation of hemicelluloses from sunflower hulls // Carbohydr. Res. 1993 Vol. 243. №2. P. 323-332.

27. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanases and their industrial applications: a review // Appl Microbiol Biotechnol. 2001. Vol. 56. № 3-4. P. 326-338.

28. Belancic A., Scarpa J., Peirano A., Diaz R., Steiner J., Eyzaguirre J. Penicillium purpurogenum produces several xylanases: purification and properties of two of the enzymes // J. Biotechnol. 1995. Vol. 41. № 1. P. 7179.

29. Biely P., Vrsanska M., Gorbacheva I.V. The active site of an acidic endo-1,4-beta-xylanase of Aspergillus niger II Biochim. Biophys. Acta. 1983. Vol. 743. № l.P. 155-161.

30. Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. Endo-beta-l,4-xylanase families: differences in catalytic properties. // J. Biotechnol. 1997. Vol. 57. P. 151-166.

31. Carpita N.C., Gibeaut D.M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth // Plant J. 1993. Vol. 3. P. 1-30.

32. Chavez R., Bull P., Eyzaguirre J. The xylanolytic enzyme system from the genus Penicillium II J. Biotechnol. 2006. Vol. 123. № 4. P. 413-433.

33. Chavez R., Schachter K., Navarro C., Peirano A., Aguirre C., Bull P., Eyzaguirre J. Differences in expression of two endoxylanase genes (xynA and xynB) from Penicillium purpurogenum II Gene. 2002. Vol. 293. № 1-2. P. 161-168.

34. Chavez. R., Almarza. C., Schachter. K., Peirano. A., Bull. P., Eyzaguirre. J. Structure analysis of the endoxylanase A gene from Penicillium Purpurogenum //Biol. Res. 2001. Vol. 34. P. 217-226.

35. Chen C., Chen J.-L., Lin T.-Y. Purification and characterization of a xylanase from Trichoderma longibrachiatum for xylooligosaccharide production // Enzyme. Microb. Technol. 1997. Vol. 21. № 2. P. 91-96.

36. Christakopoulos P., Kekos D., Macris B.J., Claeyssens M., Bhat M.K. Purification and characterisation of a major xylanase with cellulase and transferase activities from Fusarium oxysporum II Carbohydr. Res. 1996. Vol. 289. P. 91-104.

37. Christakopoulos P., Nerinckx W., Kekos D., Macris В., Claeyssens M. Purification and characterization of two low molecular mass alkaline xylanases from Fusarium oxysporum F3 II J. Biotechnol. 1996. Vol. 51. № 2. P. 181-189.

38. Christakopoulos P., Nerinckx W., Kekos D., Macris В., Claeyssens M. The alkaline xylanase III from Fusarium oxysporum F3 belongs to family F/10 // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 302. № 3-4. P. 191-195.

39. Chung C.T., Niemela S.L., Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 2172-2175.

40. Collinsa Т., Gerdaya C., Fellera G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases // FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 29. № 1. P. 323.

41. Colquhoun I.J., Ralet M.-C., Thibault J.-F., Faulds C.B., Williamson G. Structure identification of feruloylated oligosaccharides from sugar-beet pulp by NMR spectroscopy // Carbohydr. Res. 1994. Vol. 263. № 2. P. 243-256.

42. Crous J.M., Pretorius I.S., van Zyl W.H. Cloning and expression of an Aspergillus kawachii endo-l,4-beta-xylanase gene in Saccharomyces cerevisiae II Curr. Genet. 1995. Vol. 28. № 5. P. 467-473.

43. Dea I.C.M., Morrison A. Chemistry and interactions of seed galactomannans //Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1975. Vol. 31. P. 241-312.

44. Dean J.F., Anderson J.D. Ethylene Biosynthesis-Inducing Xylanase : II. Purification and Physical Characterization of the Enzyme Produced by Trichoderma viride II Plant Physiol. 1991. Vol. 95. № 1. P. 316-323.

45. Decelle В., Tsang A., Storms R.K. Cloning, functional expression and characterization of three Phanerochaete chrysosporium endo-l,4-beta-xylanases // Curr. Genet. 2004. Vol. 46. № 3. P. 166-175.

46. Dey P.M. Biochemistry of plant galactomannans // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1978. Vol. 35. P. 311-376.

47. Dowzer C.E., Kelly J.M. Cloning of the creA gene from Aspergillus nidulans: a gene involved in carbon catabolite repression // Curr. Genet. 1989. Vol. 15. № 6. P. 457-459.

48. Dowzer C.E., Kelly J.M. Analysis of the creA gene, a regulator of carbon catabolite repression in Aspergillus nidulans II Mol. Cell. Biol. 1991. Vol. 11. № 11. P. 5701-5709.

49. Drysdale M.R., Kolze S.E., Kelly J.M. The Aspergillus niger carbon catabolite repressor encoding gene, creA И Gene. 1993. Vol. 130. № 2. P. 241-245.

50. Egana L., Gutierrez R., Caputo V., Peirano A., Steiner J., Eyzaguirre J. Purification and characterization of two acetyl xylan esterases from Penicillium purpurogenum II Biotechnol. Appl. Biochem. 1996. Vol. 24. № 1. P. 33-39.

51. Felenbok В., Flipphi M., Nikolaev I. Ethanol catabolism in Aspergillus nidulans: a model system for studying gene regulation // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. Vol. 69. № 149-204.

52. Fernandez-Espinar M.T., Pinaga F., de Graaff L., Visser J., Ramon D., VallesS. Purification, characterization and regulation of the synthesis of an Aspergillus nidulans acidic xylanase // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. Vol. 42. № 4. P. 555 562.

53. Fernandez-Espinar M.T., Pinaga F., Sanz P., Ramon D., Valles S. Purification and characterization of a neutral endoxylanase from Aspergillus nidulans II FEMS Microbiol. Lett. 1993. Vol. 113. № 2. P. 223-228.

54. Flipphi M.J., Visser J., van der Veen P., de Graaff L.H. Arabinase gene expression in Aspergillus niger: indications for coordinated regulation // Microbiology. 1994. Vol. 140. № 10. P. 2673-2682.

55. Frederick M.M., Frederick J.R., Frayzke A.R., Reilly P.J. Purification and characterization of a xylobiose- and xylose-producing endo-xylanase from Aspergillus niger IIСarbohydr. Res. 1981. Vol. 97. № 1. P. 87-103.

56. Frederick M.M., Kiang C.-H., Frederick J.R., Reilly P.J. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus niger. I. Two isozymes active on xylan backbones near branch points // Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27. № 4. P. 525 532.

57. Fujimoto H., Ooi Т., Wang S.-L., Takiwaza Т., Hidaka H., Murao S., AraiM. Purification and properties of three xylanases from Aspergillus aculeatus II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1995. Vol. 59. P. 538-540.

58. Furniss C.S.M., Williamson G., Kroon P.A. The substrate specificity and susceptibility to wheat inhibitor proteins of Penicillium funiculosum xylanases from a commercial enzyme preparation // J. Sci. Food Agric. 2005. Vol. 85. № 4. P. 574-582.

59. Gaspar A., Cosson Т., Roques C., Thonart P. Study on the production of a xylanolytic complex from Penicillium canescens 10-10c // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. Vol. 67. № 1-2. P. 45-58.

60. Gielkens M.M., Visser J., de Graaff L.H. Arabinoxylan degradation by fungi: characterization of the arabinoxylan-arabinofuranohydrolase encoding genes from Aspergillus niger and Aspergillus tubingensis II Curr. Genet. 1997. Vol. 31. № l.P. 22-29.

61. Guillon F., Rombouts J.-F.T.M., Voragen A.G.J., Pilnik W. Enzymic hydrolysis of the "hairy" fragments of sugar-beet pectins // Carbohydr. Res. 1989. Vol. 190. № LP. 97-108.

62. Gurr S.J., Unkles S.E., Kinghorn J.R. The structure and organization of nuclear genes in filametous fungi / Gene structure in eukaryotic microbes. Ed. Kinghorn J.R. / Oxford: IRL Press, 1987. P. 93-139.

63. Haas H., Friedlin E., Stoffler G., Redl B. Cloning and structural organization of a xylanase-encoding gene from Penicillium chrysogenum II Gene. 1993. Vol. 126. №2. P. 237-242.

64. Haas H., Herfurth E., Stoffler G., Redl B. Purification, characterization and partial amino acid sequences of a xylanase produced by Penicillium chrysogenum II Biochim. Biophys. Acta. 1992. Vol. 1117. № 3. P. 279-286.

65. Hasper A.A., Dekkers E., van Mil M., van de Vondervoort P.J., de Graaff L.H. EglC, a new endoglucanase from Aspergillus niger with major activity towards xyloglucan // Appl Environ Microbiol. 2002. Vol. 68. № 4. P. 15561560.

66. Hisamatsu M., York W.S., Darvill A.G., Albersheim P. Characterization of seven xyloglucan oligosaccharides containing from seventeen to twenty glycosyl residues// Carbohydr. Res. 1992. Vol. 227. № 6. P. 45-71.

67. Hoffman M., Jia Z., Pena M.J., Cash M., Harper A., Blackburn A.R. 2nd, Darvill A., York W.S. Structural analysis of xyloglucans in the primary cell walls of plants in the subclass Asteridae // Carbohydr. Res. 2005. Vol. 340. № 11. P. 1826-1840.

68. Hou Y.H., Wang Т.Н., Long H., Zhu H.Y. Novel cold-adaptive Penicillium strain FS010 secreting thermo-labile xylanase isolated from Yellow Sea // Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai). 2006. Vol. 38. № 2. P. 142-149.

69. Hrmova M., Biely P., Vranska M. Specificity of cellulase and p-xylanase induction in Trichoderma reesei QM 9414 // Arch. Microbiol. 1986. Vol. Vol. 144. №3. P. 307-311.

70. Ito K., Ikemasu Т., Ishikawa T. Cloning and sequencing of the xynA gene encoding xylanase A of Aspergillus kawachii II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. Vol. 56. №6. P. 906-912.

71. Ito K., Iwashita K., Iwano K. Cloning and sequencing of the xynC gene encoding acid xylanase of Aspergillus kawachii II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. Vol. 56. № 8. P. 1338-1340.

72. Ito K., Ogasawara H., Sugimoto Т., IshikawaT. Purification and properties of acid stable xylanases from Aspergillus kawachii II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. Vol. 56. P. 547-550.

73. Jiang Z.Q., Yang S.Q., Tan S.S., Li L.T., Li X.T. Characterization of a xylanase from the newly isolated thermophilic Thermomyces lanuginosus CAU44 and its application in bread making // Lett. Appl. Microbiol. 2005. Vol. 41. № l.P. 69-76.

74. Jin-Rong Xu, Hamer. J.E. Assessment of Magnaporthe grisea mating type by spore PCR // www.fesc.net/fgn42/xu.html.

75. John M., Schmidt В., Schmidt J. Purification and some properties of five endo-l,4-beta-D-xylanases and a beta-D-xylosidase produced by a strain of Aspergillus niger II Can. J. Biochem. 1979. Vol. 57. № 2. P. 125-134.

76. Jorgensen H., Morkeberg A., Krogh K.B., Olsson L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides // J. Biotechnol. 2004. Vol. 109. № 3. P. 295-299.

77. Kimura Т., Ito J., Kawano A., Makino Т., Kondo H., Karita S., Sakka K., Ohmiya K. Purification, characterization, and molecular cloning of acidophilic xylanase from Penicillium sp.40 II Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. Vol. 64. № 6. P. 1230-1237.

78. Kimura Т., Kitamoto N., Kito Y., Karita S., Sakka К., К. O. Molecular Cloning of Xylanase Gene xynGl from Aspergillus oryzae KBN 616, a Shoyu Koji Mold, and Analysis of Its Expression // J. Ferment. Bioeng. 1998. Vol. 85. P. 10-16.

79. Kimura Т., Suzuki H., Furuhashi H., Aburatani Т., Morimoto K., Sakka K., Ohmiya K. Molecular cloning, characterization, and expression analysis of the xynF3 gene from Aspergillus oryzae // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. Vol. 66. № 2. P. 285-292.

80. Kitamoto N., Yoshino S., Ohmiya K., Tsukagoshi N. Purification and characterization of the overexpressed Aspergillus oryzae xylanase, XynFl // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. Vol. 63. № 10. P. 1791-1794.

81. Kolpak F.J., Blackwell J. Determination of the structure of cellulose II // Macromolecules. 1976. Vol. 9. P. 273-278.

82. Konno H., Yamasaki Y. Studies on the Pectic Substances of Plant Cell Walls: III. DEGRADATION OF CARROT ROOT CELL WALLS BY

83. ENDOPECTATE LYASE PURIFIED FROM ERWINIA AROIDEAE // Plant Physiol. 1982. Vol. 69. № 4. P. 864-868.

84. Kormelink F.J.M., Leeuwen M J.F.S.-V., Wood T M., Voragen A.G.J. Purification and characterization of three endo-(l,4)-P-xylanases and one P-xylosidase from Aspergillus awamori II J. Biotechnol. 1993. Vol. 27. № 3. P. 249-265.

85. Kormelink F.J.M., Leeuwen M.J.F.S.-V., Wood T.M., Voragen A.G.J. Purification and characterization of a (l,4)-p-d-arabinoxylan arabinofiiranohydrolase from Aspergillus awamori II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. Vol. 35. № 6. P. 753-758.

86. Kormelink F.J.M., Leeuwen M.J.F.S.-V., Wood T.M., Voragen A.G.J. (1,4)-P-d-Arabinoxylan arabinofuranohydrolase: a novel enzyme in the bioconversion of arabinoxylan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. Vol. 35. №2. P. 231-232.

87. Kormelink F.J.M., Voragen A.G.J. Degradation of different (glucurono)arabino.xylans by a combination of purified xylan-degrading enzymes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. Vol. 38. № 5. P. 688-695

88. Krengel U., Dijkstra B.W. Three-dimensional structure of Endo-l,4-beta-xylanase I from Aspergillus niger. molecular basis for its low pH optimum // J. Mol. Biol. 1996. Vol. 263. № 1. P. 70-78.

89. Labavitch J.M., Greve L.C. Cell Wall Metabolism in Ripening Fruit : III. Purification of an Endo-beta-l,4-xylanase that Degrades a Structural Polysaccharide of Pear Fruit Cell Walls // Plant Physiol. 1983. Vol. 72. № 3. P. 668-673.

90. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

91. Lappalainen A., Siika-Aho M., Kalkkinen N., Fagerstrom R., Tenkanen M. Endoxylanase II from Trichoderma reesei has several isoforms with different isoelectric points//Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. Vol. 31. № 1. P. 61-68.

92. Lenartovicz V., Marques de Souza C.G., Moreira F.G., Peralta R.M. Temperature effect in the production of multiple xylanases by Aspergillus fumigatus // J. Basic. Microbiol. 2002. Vol. 42. № 6. P. 388-395.

93. Levasseur A., Asther M., Record E. Overproduction and characterization of xylanase В from Aspergillus niger // Can. J. Microbiol. 2005. Vol. 51. № 2. P. 177-183.

94. Liab K., Azadi P., Collins R., Tolan J., Kim J.S., Eriksson K.L. Relationships between activities of xylanases and xylan structures // Enzyme. Microb. Technol. 2000. Vol. 27. № 1-2. P. 89-94.

95. MacCabe A.P., Fernandez-Espinar M.T., de Graaff L.H., Visser J., Ramon D. Identification, isolation and sequence of the Aspergillus nidulans xlnC gene encoding the 34-kDa xylanase // Gene. 1996 Vol. 175. № 1-2. P. 29-33.

96. MacCabe A.P., Orejas M., Perez-Gonzalez J.A., Ramon D. Opposite patterns of expression of two Aspergillus nidulans xylanase genes with respect to ambient pH//J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. №5. P. 1331-1333.

97. Mach R.L., Strauss J., Zeilinger S., Schindler M., Kubicek C.P. Carbon catabolite repression of xylanase I (xynl) gene expression in Trichoderma reesei II Mol. Microbiol. 1996. Vol. 21. № 6. P. 1273-1281.

98. Mach R.L., Zeilinger S. Regulation of gene expression in industrial fungi: Trichoderma//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. Vol. 60. P. 515-522.

99. Mandels M., Parrish F.W., Reese E.T. Sophorose as an inducer of cellulase in Trichoderma viride IIJ Bacteriol. 1962. Vol. 83. P. 400-408.

100. Mandels M., Reese E.T. Induction of cellulase in fungi by cellobiose // J Bacteriol. 1960. Vol. 79. P. 816-826.

101. Margolles-Clark E., Ihnen M., Penttila M. Expression patterns of ten hemicellulase genes of the filamentous fungus Trichoderma reesei on various carbon sources//J. Biotechnol. 1997. Vol. 57. № 1-3. P. 167-179.

102. Marui J., Kitamoto N., Kato M., Kobayashi Т., Tsukagoshi N. Transcriptional activator, AoXlnR, mediates cellulose-inductive expression of the xylanolytic and cellulolytic genes in Aspergillus oryzae // FEBS Lett. 2002. Vol. 528. № 1-3. P. 279-282.

103. Maruyama K., Goto C., Numata M., Suzuki Т., Nakagawa Y., Hoshino Т., Uchiyama T. O-acetylated xyloglucan in extracellular polysaccharides from cell-suspension cultures of Mentha // Phytochemistry. 1996. Vol. 41. № 5. P. 1309-1314.

104. McMaster G.K., Carmichael G.G. Analysis of single and double-stranded nucleic acids on polyacrilamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. Vol. 74. № 11. P. 48354838.

105. McNeil M., Albersheim P. The Structure of Plant Cell Walls VII. BARLEY ALEURONE CELLS // Plant Physiol. 1975. Vol. 55. P. 64-68.

106. McNeil M., Darvill A.G., Fry S.C., Albersheim P. Structure and function of the primary cell walls of plants // Annu. Rev. Biochem. 1984. Vol. 53. P. 625663.

107. Mellinger C.G., Carbonero E.R., Cipriani T.R., Gorin P.A., Iacomini M. Xylans from the medicinal herb Phyllanthus niruri // J. Nat. Prod. 2005. Vol. 68. № l.P. 129-132.

108. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S., von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites // Protein Eng. 1997. Vol. 10. № 1. P. 1-6.

109. Orejas M., MacCabe A.P., Perez Gonzalez J.A., Kumar S., Ramon D. Carbon catabolite repression of the Aspergillus nidulans xlnA gene // Mol. Microbiol. 1999. Vol. 31. № l.P. 177-184.

110. Perez-Gonzalez J.A., De Graaff L.H., Visser J., Ramon D. Molecular cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of two Aspergillus nidulans xylanase genes // Appl. Environ. Microbiol. 1996. Vol. 62. № 6. P. 21792182.

111. Perez S., Mazeau K., Herve du Penhoat C. The three-dimensional structures of the pectic polysaccharides // Plant Physiol. Biochem. 2000. Vol. 38. № 1-2. P. 37-55.

112. Raghukumar C., Muraleedharan U., Gaud V.R., Mishra R. Xylanases of marine fungi of potential use for biobleaching of paper pulp // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2004. Vol. 31. № 9. P. 433-441.

113. Rahman A.K., Sugitani N., Hatsu M., Takamizawa K. A role of xylanase, alpha-L-arabinofuranosidase, and xylosidase in xylan degradation // Can. J. Microbiol. 2003. Vol. 49. № 1. P. 58-64.

114. Rao M., Gaikwad S., Mishra C., Deshpande V. Induction and catabolite repression of cellulase in Penicillium funiculosum II Appl. Biochem. Biotechnol. 1988. Vol. 19. № 2. P. 129-137.

115. Ratanachomsri U., Sriprang R., Sornlek W., Buaban В., Champreda V., Tanapongpipat S., Eurwilaichitr L. Thermostable xylanase from Marasmius sp.: purification and characterization // J. Biochem. Mol. Biol. 2006. Vol. 39. № l.P. 105-110.

116. Rauscher R., Wurleitner E., Wacenovsky C., Aro N., Strieker A.R., Zeilinger S., Kubicek C.P., Penttila M., Mach R.L. Transcriptional regulation of xynl, encoding xylanase I, in Hypocrea jecorina // Eukaryot. Cell. 2006. Vol. 5. № 3. P. 447-456.

117. Ricardo F.A., Frederick M.M., Frederick J.R., Reilly P.J. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus niger. III. An enzyme of pi 3.65 // Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27. № 4. P. 539-546.

118. Romanowska I., Polak J., Bielecki S. Isolation and properties of Aspergillus niger IBT-90 xylanase for bakery // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. Vol. 69. №6. P. 665-671.

119. Royer J.C., Nakas J.P. Purification and characterization of two xylanases from Trichoderma longibrachiatum II Eur. J. Biochem. 1991. Vol. 202. № 2. P. 521-529.

120. Royer J.C., Novak J.S. N.J.P. Apparent cellulase activity of purified xylanase is due to contamination of assay substrate with xylan // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 1992. Vol. 11. № 1. P. 59 61.

121. Ruijter G.J., Visser J. Carbon repression in Aspergilli II FEMS Microbiol. Lett. 1997. Vol. 151. № 2. P. 103-114.

122. Saarelainen R., Paloheimo M., Fagerstrom R., Suominen P.L., Nevalainen K.M. Cloning, sequencing and enhanced expression of the Trichoderma reesei endoxylanase II (pi 9) gene xln2 II Mol. Gen. Genet. 1993. Vol. 241. P. 497-503.

123. Sakamoto Т., Sakai T. Analysis of structure of sugar-beet pectin by enzymatic methods. // Phytochemistry. 1995. Vol. 39. № 4. P. 821-823.

124. Schmidt A., Gubitz G.M., Kratky C. Xylan binding subsite mapping in the xylanase from Penicillium simplicissimum using xylooligosaccharides as cryo-protectant// Biochemistry. 1999. Vol. 38. № 8. P. 2403-2412.

125. Schmidt A., Schlacher A., Steiner W., Schwab H., Kratky C. Structure of the xylanase from Penicillium simplicissimum II Protein Sci. 1998. Vol. 7. № 10. P. 2081-2088.

126. Schwartz T.W. The processing of peptide precursors. 'Proline-directed arginyl cleavage' and other monobasic processing mechanisms // FEBS Lett. 1986. Vol. 200. № l.P. 1-10.

127. Shei J.C., Fratzke A.R., Frederick M.M., Frederick J.R., Reilly P.J. Purification and characterization of endo-xylanases from Aspergillus niger. II. An enzyme of pi 4.5 // Biotechnol. Bioeng. 1985. Vol. 27. № 4. P. 533 538.

128. Showalter A.M. Structure and Function of Plant Cell Wall Proteins // The Plant Cell. 1993. Vol. 5. P. 9-23.

129. Silva С. H. C., Puis J., Valle de Sousa M., Ferreira Filho E. X. Purification and characterization of low molecular weight xylanase from solid-state cultures of Aspergillus fumigatus Fresenius II Rev. Microbiol. 1999. Vol. 30. P. 114-119.

130. Simao R.C., Souza C.G.M., Peralta R.M. Induction of xylanase in Aspergillus tamarii by methyl B-d-xyloside // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. Vol. 47. № 3. P. 267-271

131. Strauss J., Mach R.L., Zeilinger S., Harder G., Stoffler G., Wolschek M., Kubicek C.P. Crel, the carbon catabolite repressor protein from Trichoderma reesei II FEBS Lett. 1995. Vol. 376. № 1-2. P. 103-107.

132. Subramaniyan S., Prema P. Biotechnology of microbial xylanases: enzymology, molecular biology, and application // Crit. Rev. Biotechnol. 2002. Vol. 22. № 1. P. 33-64.

133. Tan L. U. L., Wong К. K. Y., Yu E. К. C., Saddler J. N. Purification and characterization of two -xylanases from Trichoderma harzianum II Enzyme. Microb. Technol. 1985. Vol. 7. № 9. P. 425-430.

134. Tanaka H., Nakamura Т., Hayashi S., Ohta K. Purification and properties of an extracellular endo-l,4-beta-xylanase from Penicillium citrinum and characterization of the encoding gene // J. Biosci. Bioeng. 2005. Vol. 100. № 6. P. 623-630.

135. Tokumoto H., Wakabayashi K., Kamisaka S., Hoson T. Changes in the sugar composition and molecular mass distribution of matrix polysaccharides during cotton fiber development. // Plant Cell Physiol. 2002. Vol. 43. № 4. P. 411-418.

136. Torronen A., Harkki A., Rouvinen J. Three-dimensional structure of endo-1,4-beta-xylanase II from Trichoderma reesei: two conformational states in the active site. // EMBO J. 1994. Vol. 13. № 11. P. 2493-2501.

137. Torronen A., J. R. Structural comparison of two major endo-l,4-xylanases from Trichoderma reesei. И Biochemistry. 1995. Vol. 34. № 3. P. 847-856.

138. Torronen A., Mach R.L., Messner R., Gonzalez R., Kalkkinen N., Harkki A., Kubicek C.P. The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes // Biotechnology (N. Y.). 1992. Vol. 10. № 11. P. 1461-1465.

139. Vrsanska M., Gorbacheva I.V., Kratky Z., Biely P. Reaction pathways of substrate degradation by an acidic endo-l,4-beta-xylanase of Aspergillus niger II Biochim. Biophys. Acta. 1982 Vol. 704. № 1. P. 114-122.

140. Witterveen C.F.B., Busink R., van de Vondervoort P., Dijkema C., Swart K., Visser J. L-arabinose and D-xylose catabolism in Aspergillus niger II J. Gen. Microbiol. 1989. Vol. 135. № 8. P. 2163-2171.

141. Wurleitner E., Pera L., Wacenovsky C., Cziferszky A., Zeilinger S., Kubicek C.P., Mach R.L. Transcriptional regulation of xyn2 in Hypocrea jecorina // Eukaryot. Cell. 2003. Vol. 2. № 1. P. 150-158.

142. Xiong H., Turunen O., Pastinen O., Leisola M., von Weymarn N. Improved xylanase production by Trichoderma reesei grown on L-arabinose and lactose or D-glucose mixtures // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2004. Vol. 64. № 3. P. 353-358.

143. Xu J., Nogawa M., Okada H., Morikawa Y. Regulation of хупЗ gene expression in Trichoderma reesei PC-3-7 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. Vol. 54. №3. P. 370-375.

144. York W.S., Kumar Kolli V.S., Orlando R., Albersheim P., Darvill A.G. The structures of arabinoxyloglucans produced by solanaceous plants // Carbohydr. Res. 1996. Vol. 285. № 14. P. 99-128.

145. Zadra I., Abt В., Parson W., Haas H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenumnitrogen regulator NRE // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66. № 11. P. 4810-4816.

146. Zeilinger S., Mach R.L., Schindler M., Herzog P., Kubicek C.P. Different inducibility of expression of the two xylanase genes xynl and xyn2 in Trichoderma reesei //J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. № 41. p. 25624-25629.

Информация о работе

Серебряный, Всеволод Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Ксиланаза Penicillium Canescens: выделение гена, изучение его регуляции и создание штамма-продуцента - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы