Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Пространственная структура модифицированных нуклеотидов и ее связь с биологической активностью

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Гурская, Галина Викторовна, Москва

А

/

.„у^1-'

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУ Т МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им.В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ГУРСКАЯ ГАЛИНА ВИКТОРОВНА

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА МОДИФИЦИРОВАННЫХ НУКЛЕОЗИДОВ И ЕЕ СВЯЗЬ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

ЛЗ.ОО.ОЗ—молекулярная -биология

ПРЕЗИДИУМ ВАН сссг

протокол

присудил а I

учзнуиэ степень

В4К !-'Л.Г с

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Официальные оппоненты:

7

3

'С

с

доктор химических наук, профессор, академик

А.А. БОГДАНОВ Г.Н. ТИЩЕНКО С.Н. КОЧЕТКОВ

доктор химических наук , профессор доктор химических наук, профессор

Ведущая организация: ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ.

М.М.ШЕМЯКИНА И Ю.А.ОВЧИННИКОВА РАН

заседании Диссертационного совета Д 002.79.01 по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, В-334, ул.Вавилова, дом 32.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится 1995 г. в "

часов на

Диссертация а виде научного доклада разослана

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. КРИЦЫН

Актуальность темы. Пространственная структура биологически активных соединений является одним из основных факторов, определяющих особенности их функционального поведения на молекулярном уровне. Поэтому не удивительно, что основные фундаментальные успехи в области молекулярной биологии в значительной степени достигнуты благодаря результатам рентгеноструктурных исследований. В процессе жизнедеятельности биологических систем одна из ведущих ролей принадлежит нуклеиновым кислотам и их компонентам -нуклеозидам и нуклеотидам. Благодаря участию в метаболических процессах и взаимодействию с ключевыми ферментными системами, компоненты нуклеиновых кислот и их многочисленные производные имеют важное значение для поиска новых лекарственных веществ. Среди соединений этого класса обнаружены эффективные противовирусные, противоопухолевые, кардиотонические и иммуномодулирующие агенты.

Разработка научных основ целенаправленного поиска биологически активных соединений с заданным спектром активности является одной из главных задач современной молекулярной биологии, биоорганической химии и фармакологии. Решение этой задачи неразрывно связано со знанием пространственных структур исследуемых соединений и их корреляции с биологической активностью.

Основными химическими подходами при создании новых биологически активных аналогов нуклеозидов и нуклеотидов являются: а) замена или удаление функциональных групп в углеводном или гетероциклическом фрагментах ; б) замена углеводного компонента молекул ациклическим; в) создание конъюгатов с другими биологически активными соединениями; г) введение химически инертных заместителей (например, СНз-групп) вместо атомов водорода в углеводных фрагментах с сохранением всех функциональных групп, характерных для природных соединений.

Проведенные нами серии рентгеноструктурных исследований пространственного строения аналогов нуклеозидов охватывают почти все вышеприведенные типы модификаций. Однако, особое внимание нами уделено изучению закономерностей в строении молекул З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов, в число которых входят основные лекарственные соединения, используемые в медицинской практике для лечения больных СПИДом.

В настоящее время установлено, что нуклеотидные остатки 5'-трифосфатов некоторых З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклеозидов могут включаться в З'-конец новосинтезируемой цепи ДНК и, из-за отсутствия у них З'-гидроксила или же изменения его реакционной способности, прерывать (терминировать) ее дальнейшую элонгацию. В случае вирусов это влечет ингибирование их репродукции. Такие свойства З'-замещенных аналогов нуклеозидов широко используются для создания новых лекарственных препаратов, а также для фундаментальных исследований механизмов функционирования ДНК-полимераз ' зличного происхожения.

Сродство и специфичность модифицированных нуклеозид-5'-трифосфатов к ¿ому или иному виду ДНК-полимераз зависит как от химического структуры заместителя в З'-положении, так и от пространственного строения молекулы в целом. В- целях выяснения стереохимических аспектов субстратной специфичности ряда ДНК-полимераз нами исследовано пространственное строение молекул конформацйонно подвижных и конформационно ограниченных, специфичных и неспецифичных терминаторов синтеза ДНК, подавляющих репродукцию рет-ровирусов, в том числе вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), изучена корреляция пространственных структур этих соединений с их биологической активностью, выявлены структурные закономерности, ответственные за узнавание и специфичность модифицированных нуклеозидов. Последнее крайне необходимо для организации целенаправленного поиска селективных ингибиторов обратных | гранскриптаз ретровирусов, включая ВИЧ.

Цель работы. Основной задачей настоящей работы было получение кристаллов и исследование методом рентгеноструктурного анализа пространственного строения молекул семи групп модифицированных нуклеозидов, включая известные антивирусные агенты, выявление основных конформационных закономерностей строения их молекул и установление корреляции между пространственной структурой и биологической активностью исследуемых классов соединений. Особое внимание в работе уделено изучению нескольких групп родительских нуклеозидов терминаторных субстратов ДНК-полимераз различного происхождения с целью получения структурной информации для целенаправленного поиска новых эффективных блокаторов ВИЧ.

Научная новизна и практическая ценность

I. На основе рентгеноструктурных исследований впервые установлены пространственные структуры и получены конформационные параметры нескольких групп соединений: 1. Группы конформационно подвижных З'-замещенных 2',3'-дидезоксинуклео-зидов: блокатора репродукции ВИЧ 3'-азидо~2',3'-дидезокситимидина (сМТ(3'№), AZT), 5'-трифосфат которого является специфичным ингибитором обратных транскриптаз, неспецифичного ингибитора биосинтеза ДНК З'-ами-но-2',3'-дидезокситимидияа (сШТСЗ'ЫНг)) , 5'-трифосфат которого проявляет свойства терминаторного субстрата ДНК-полимераз различного происхождения, и его аналога 3'-метиламино-2',3'-дидезокситимидина (сМТ(ЗТЧНМе)), специфичных ингибиторов репродукции ВИЧ 3'-нитро-2',3'-дидезокситимидина (йс1Т((3'ЫОг)), 3'-гидроксимино-2',3'-дидезокситимидина (<ИТ(3'=>ТОН)) и его метального аналога 3'-метоксимино-2',3'-дидезокситимидина (<1с1Т(3'=МОМе)) , соединений с объемными ациклическими и циклическими заместителями З'-О-метилтиометил-2'-дезоксигимидина (сЩЗ'ОСНзЗМе)), З'-О-метилсульфинил-метил-2'-дезокситимидина (сЩЗ'ОСНгБОМе)), 3'-(тетразол-2"-ил)-2',3'-дидезок-ситимидина (с!с1Т(3'1еГг)) и 3'-(5"-метилтетразол-2"-ил)-2',3'-дидезокситимидина ((МТ(ЗЧе1г-5"Ме)).

2. Конформационно ограниченных по фуранозному циклу блокаторов биосинтеза ДНК: 2',3'-ликсоангидротимидина (1аТ), 2',3-рибоангидроаденозина (гаА), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина (ё^Т), 3'-метил-2'-дезокситимидина (йТЗ'Ме)

3. Конформационно подвижных и конформационно ограниченных соединений

с двойной модификацией по углеводному циклу : 3'-хлор,4'-метил-2',3'-дидезок-ситимидина (<МТ(3'С1,4'Ме)), 4'-гидроксиметил-2',3'-ликсоангидроцитидина (1аС(4'СН20Н)), 4'-гидроксиметил-2' ,3'-рибоангидроаденозина (гаА(4'СН20Н)), 3'(8)-метил-3,(К)-фтор-2',3'-дидезокситимидина (скЩЗ'Ме^)).

4. Группы диоксолановых аналогов 2',3'-дидезоксинуклеозидов: цис-4(К,8)-гидроксиметил-2(8Д)-(тимин-1 -илметил)-1,3-диоксолана (цис-4(11,8)Т-1,3ди-окс), ¡/мс-2(К,8)-гидроксиметил-4(5Д)-(тимин-1-илметил)-1,3-диоксолана (цис-2 (К,5)Т-1,Здиокс) и транс-4(К,8)-гидроксиметил-2(8,К)-(урацил-1 -илметил)-1,3-диоксолана (транс-4(Я,§)С-1 ,Здиокс).

5. Аналогов нуклеозидов, в которых сохранены все функциональные группы природных нуклеозидов, потенциально необходимые для связывания с ферментами биосинтеза нуклеиновых кислот: 2'-метилуридина (и(2'Ме)), З'-ме-тилцитидина (С(З'Ме)), 5'(Я)-метилцитидина (С(5'(Л)Ме)), 5'(!5)-метилцитидина (С(5'(8)Ме)), 5'(8)-метил-2-дезокситимидина (ёТ(5'(3)Ме)) и Г-гидроксиметил-цитидина (С(ГСНгОН)).

6. Ангидронуклеозидов с закрепленной сад-конформацией вокруг гликозидной связи: 6,Г-ангидро-6-гидрокси-1-(2-р-0-псикофуранозил)цитозина (6,Г-0-аСр) и 8,1'-ангидро-8-гидрокси-9-(2-р-В-псикофуранозил)аденина (ЯЛ'-О-аА5').

7. Ациклических аналогов рибавирина и ацикловира, проявляющих различную степень антигерпесной активности: 1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-5-карбоксамида (5-НЕМТ), 1-(1,5-дигидрокси-3-оксапент-2-ил)-1,2,4-

триазол-5-карбоксамида (5-ОНРТ), 1-(2-гидроксиэтоксиметил)-1,2,4-триазол-З-карбоксамида (3-НЕМТ) и (8)-9-(2,3-дигидроксипропил) аденина ( (8)-ОНРА).

II. Впервые определены пространственные структуры лекарственных соединений, используемых в медицинской практике для лечения больных СПИДом -3'-азидо-2',3'-дидезокситимидина ( зидовудина, ретровира, тимазида, А£Т) и 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина (ставудина), проанализированы основные конформационные свойства этих соединений, ответственные за активность, включая конформационную подвижность молекул и ориентацию азидогруппы, имитирующую ориентацию гидроксигруппы природных нуклеозидов, в случае первого соединения и плоскостное строение углеводного цикла - в случае второго.

III. На основе стереохимических данных, полученных для конформационно ограниченных соединений 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидина, 2',3'-ликсоан-гидротимидина и 2',3'-рибоангидроаденозина, показано, что высокое сродство и относительно низкая специфичность 5'-трифосфатов 2',3'-дидезокси-2',3'-диде-гидронуклеотидов к различным ДНК-полимеразам, включая обратные транкриптазы ретровирусов, коррелируют с плоскостным строением их фу-ранозных циклов, которое, по-видимому, моделирует структуру природного с!МТР в ДНК-синтезирущем комплексе. Выявлена пониженная субстратная специфичность обратных транскриптаз по сравнению с другими ДНК-полимеразами к различным конформационным состояниям субстрата.

IV. Изучено влияние на конформацию молекул нуклеозидов введения вместо атомов водорода метальных заместителей по атомам углерода в 2'-, 3'- и 5'-положениях их углеводных фрагментов. Установлено увеличение длин С-О-связей при всех метилированных атомах углерода в углеводных остатках, которое может приводить к уменьшению реакционной способности соответствующих гидроксильных групп. Обнаружена конформационная ограниченность у З'-ме-тилпиримидиновых нуклеозидов, обусловленная стерическими затруднениями, возникающими между атомами объемных метальных групп, расположенных над углеводными циклами со стороны оснований, атомами оснований и атомами 5'-гидроксиметильных групп. Дано возможное стереохимическое объяснение причин наличия у 5'-трифосфатов З'-метилнуклеозидов свойств терминаторных субстратов в РНК-синтезирующих системах и отсутствие их в ДНК-синтезирующих комплексах.

Полученный обширный рентгеноструктурный материал внесен в Международный Кристаллографический Банк Данных (Кембридж, Великобритания) и может служить структурной базой для целенаправленного конструирования и синтеза новых объектов с заданным спектром биологической активности, для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, химии и медицины.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на : I Всесоюзном Биофизическом Съезде (Москва, 1982); Всесоюзной конференции "Перспективы биоорганической химии в создании новых лекарственных препаратов" (Рига, 1982); VIII Международном Конгрессе Кристаллографов (Гамбург, ФРГ, 1984); IV и VI Всесоюзных совещаниях по органической кристаллохимии (Звенигород, 1984; Киев, 1991); VII Международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Бехине, ЧССР, 1987); Международном симпозиуме по компьютерным методам в молекулярном моделировании (Шлосс-Эльмау, ФРГ, 1988); Международной школе по трехмерной молекулярной структуре и действию лекарств (Эриче, Италия, 1989); Международном симпозиуме по органической кристаллохимии (Познань, Польша, 1989); XII Европейском совещании кристаллографов (Москва, 1989); Международном симпозиуме "Синтез' олигонуклеотидов, проблемы и границы практического

применения" (Москва, 1991); IV и V Международных конференциях по росту кристаллов биологических макромолекул (Фрайбург, Германия, 1991; Сан-Диего, США, 1993); Международной конференции "СПИД, рак и ретровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992); X и XI Международных круглых столах "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Парк-сити, США, 1992; Лувен, Бельгия, 1994); XVI Европейском совещании кристаллографов (Лунд, Швеция, 1995).

Структура работы. Диссертация изложена в виде научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с E.H. Цапкиной, Г.М. Джавадо-вой, A.B. Бочкаревым, В.Е. Заводником. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Исследованные соединения были синтезированы в Институте молекулярной биологии РАН (в лабораториях A.A. Краевского, С.Н. Михайлова, Б.П. Готтиха и В.Л. Флорентьева), в Московской медицинской академии им. Сеченова (И.И. Федоров, Э.М. Казьмина), в Институте тонкой химической технологии (А.Д.Шуталев, Ю.Е. Райфельд), в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (С.Г.Завгородний), в Самарском государственном университете (А.В.Папчихин, П.П. Пурыгин). Всем коллегам приношу глубокую благодарность за участие в совместных работах. Искренне признательна A.A. Краевскому за постоянный интерес, поддержку и обсуждение работы.

Список остальных сокращений

dNTP - 2'-дезоксинуклеозид-5'-трифосфат

ВИЧ-вирус иммунодефицита человека

AMV - вирус птичьего миелобластоза

cUN - 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидронуклеозид

raN - 2',3'-рибоангидронуклеозид

laN - 2',3'-ликсоангидронуклеозид

dT -тимидин

ddT(3'F) - 3'- фтор-2',3'-дидезокситимидин

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения корреляции между пространственным строением молекул различных групп модифицированных нуклеозидов и их биологической активностью нами были проведены рентгеноструктурные исследования более 30 соединений, являющихся аналогами нуклеозидов дезокси- и рибо-рядов.

Необходимые для. рентгеновской съемки кристаллы всех исследованных соединений были выращены из их насыщенных растворов в различных органических растворителях либо методом медленного испарения растворителей при комнатной температуре или при Т=4°С, либо методом медленного охлаждения раствора от Т= 40-60°С до комнатной температуры.

Рентгеновская съемка кристаллов проводилась на автоматических дифрактометрах CAD4, Syntex P2i , Hilger-Watts методами 6/29- или ео/8-сканирования на СиКа- или МоКа - излучениях.

Пространственные структуры исследованных соединений определялись прямым методом по программам РЕНТГЕН-75, MULTAN и SHELX. Структуры уточнялись в основном полноматричным методом наименьших квадратов (МНК) в анизотропном приближении для атомов О, N, С. Положения атомов водорода в большинстве случаев определялись из разностных синтезов Фурье и уточнялись МНК в изотропном приближении. Некоторые кристаллографические данные для исследованных соединений приведены в табл. 1.

Таблица 1. Некоторые параметры кристаллических структур исследованных соединений

Соединение Пространственная группа Число молекул в ячейке, г Я-фактор, %

(1<ЩЗ'№,) (АгТ) Р21 4 3.5

<МТ(3'МН2) Р2, г^сщз'ын^-на) 2.4

сМТ(3'1ЧНМе) Р212121 4 4.8

ащзтчЮг) Р212121 4 2.1

сИТ(3'=ЫОН) Р1 1 4.2

сМТ(3'=ЫОМе) Р21 2(сШТ(3'=ЬГОМе)-Н20) 3.0

с!Т(3'ОСН28Ме) Р212121 4(<ЩЗ'ОСН28Ме)-Н20) 3.8

с1Т(3'0СН280Ме) Р2, 2 2.8

скЩЗ^г) Р212121 4 3.7

сМТ(ЗЧе12-5"-Ме) Р2,2,2! 4 5.9

1аТ Р1 2 3.8

гаА Р1 2 4.1

с14Т Р1 2 3.4

с1Т(3'Ме) Р2, 2 2.3

1аС(4'СН2ОН) Р212121 4 3.7

гаА(4'СН2ОН) Р2,2,2, 4{гаА(4'СН2ОН)-Н20) 2.3

аат(з'С1,4'Ме) Р2, 4 2.6

<МТ(3'(8)Ме,Е) 4 2.8

^нс-4(К,8)Т-(1,3 диокс) Р1 2 4.4

г^с-2(11,8)Т-(1,3 диокс.) Р2,/Ъ 4 3.9

транс-ЩК,8)-и(1,3 диокс.) Р1 2 4.0

С(5'(Я)Ме) Р2,2,2, 4 3.9

С(5'(3)Ме) Р2,2,2, 4 3.2

сГГ(5'(8)Ме) Р2,2,2, 4 2.7

С(3'Ме) Р2,2,2, 4 6.2

С(1'СН2ОН) Р2,2,2, 4(С(1'СН2ОН)-2Н20) 4.0

и(2'Ме) Р2,2,2 4(и(2'Ме)-2Н20) 3.8

6,1-0-аСр) Р2, 2 5.6

8,1-0-аАр) Р1 2((8,1-0-аАР)-6Н20) 5.0

5-НЕМТ Р2,/с 4 4.5

5-ОНРТ Р2,/п 4 2.9

3-НЕМТ Р1 2 3.7

(8)-ОНРА Р2, 2 4.2

Напомним, что метод рентгеноструктурного анализа дает наиболее полную и объективную, по сравнению с другими методами, информацию о пространственном строении исследуемых объектов, в том числе и биологически

5

активных соединений. Однако, этот метод имеет дело с кристаллами, а упаковка молекул в них иногда влияет на конформационные параметры конформационно подвижных фрагментов молекул, что может приводить к конформациям, отличным от конформаций в растворах. Поэтому наиболее полная информация о строении биологически активных соединений может быть получена при совокупном использовании методов рентгеноструктурного анализа для кристаллов, фи