Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Новый метод фингепринтинга поли (A) РНК

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Новый метод фингепринтинга поли (A) РНК"

те or

I1, О ill КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

на правах рукописи

Дьяченко Людмила Борисовна

НОВЫЙ МЕТОД ФИНГЕРПРИНТИНГА ПОЛИ(А)+РНК

Специальности 03.00.04 - биохимия

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1993г

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Кардиологического научного центра РАМН

Научные руководители

кандидат физико-математических наук Бибилашвили Р.Ш.

Официальные оппоненты

Ведущее учреждение

доктор биологических наук Фаворова 0.0.

доктор биологических наук, Тер-Аванесян М.Д.

доктор биологических наук, профессор, Никифоров В Г

Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта Российской Академии наук

Защита состоится " . . . . . . 199.Ч г.

в ...//.. часов на заседании специализированного сипота К 001.02 в Кардиологическом научном цонтр-^ РАМН. (121552, г Москва, 3*-я Черепковская ул., д 15А)

С диссертацией м«жно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " ^^^) 1993

Ученый секретарь специализированного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Общее число генов, экспрессирующихся в клетках человека или других млекопитающих составляет, вероятно, не менее, чем 50 000-100 000. Из них от" 10 000 до 20 000 генов экспрессируется в каждой соматической клетке. В настоящее 'время анализ экспрессии генов в клетках различных типов проводится " на уровне белковых продуктов с использованием метода двумерного электрофореза. Применение этого метода позволяет одновременно определять содержание 1 000 - 2 000 индивидуальных белков, каждый из которых составляет не менее 0,001% от общего клеточного белка, и анализировать их количественные изменения в клетках и тканях при дифференцировке, патологических состояниях, вирусных заражениях, лекарственной терапии, интоксикация и других воздествиях на организм.

Для обнаружения и клонирования генов, дифференциально экспрессирующихся при различных воздействиях, используется также метод дифференциального скрининга кДНК-библиотек, выявляющий изменения на уровне мРНК. Метод основан на сравнительной гибридизации кДНК-библиотеки определенных клеток (тканей) с радиоактивно-меченными препаратами мРНК (кДНК), выделенных из того

Принятые_сокращения:

дэРНК - дифференциально экспрессирующаяся мРНК; ПААГ полиакриламидный гель'; И-МЦ/ - вирус лейкемии мышей Колония; АМУ -вирус миобластоза птиц; Н1У-1 -вирус иммунодеффицита человека 1; ИТ-РСИ - полимеразная цепная реакция, проведенная на кДНК; (ПТР(ЗТ) - 3'-фтор-2'3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; с1ТТР(3'Щ?) - 3'-амино-2' ,3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; с!ТТРСЗ'Ы,7 - 3'-азидо-2' ,3'-дидезоксириботимидин-5'-трифосфат; агаТТР(3 НН,) - 3'-амино-3'-дезоксиарбинотимидин-5'-трифосфат; агаТТР(3'N.,7 - 3'-азидо-3'-дезоксиарабинотимидин-5'-трифосфат; сйиТР(5АА);' 3'-дидезокси-5-(3-аминопропенил-)-уридин-5'-трифосфат; с1сШТР(5Л,\~Вл.о), с!сШТР(5АА-Рат) , йсП1ТР(5АА-Лое) , (1иТР(5АА-Йох), с1сШТР(5;>Д-ТМЮ - 5-аллиламино-производные сЗсШТР, имеющие в качестве репортеркых групп биотиновый или флуоресцентные остатки.

же источника до и после воздействия, требует длн анализа нескольких месяцев работы и сотни микрограмм поли(А)"*~РНК. Кроме того, в конечном итоге он малоинформативен, поскольку приводит к получению единичных клонов дифференциально экспрессирующихся мРНК (дэРНЮ.

В настоящей диссертационной работе предлагается новый метод фингерпрингинга РНК, позволяющий проводить количественное сравнение популяций поли(А)*РНК без конструирования кДНК-библиотек. Всего несколько дней и 10 микрограмм поли(А)+РНК требуется исследователю для того, чтобы с помощью этого метода получить данные по изменению относительных концентраций нескольких сотен индивидуальных мРНК. Последующее определение первичной структуры кДНК, представленных отдельной полосой ка электрофореграмме и соответствующих индивидуальным дэРНК, позволяет идентифицировать эти РНК по сопоставлению, с банком данных нуклеотидных последовательностей, а также дает возможность амплифицировать и клонировать полноразмерные кДНК, что особенно важно для неизвестных мРНК.

Цель исследования заключалась в разработке нового удобного и информативного метода сравнительного анализа содержания индивидуальных мРНК в популяциях поли(А)+РНК, основанного на получении коротких кДНК-продуктов дискретной длины, соответствующих практически каждой индивидуальной мРНК.

Новизна результатов. В диссертационной работе предложен новый метод фингерпринтинга РНК. Представлены данные, демонстрирующие возможность одновременно анализировать с помощью этого метода экспрессию большого числа генов, что является важным шагом в изучении изменения генной активности и ее регуляции. Метод

был применен и показал свою информативность при анализе спектров поли(А)+РНК различных тканей человека у различных индивидуумов. Выявлены изменения представленности отдельных РНК при циррозе печени и миоме матки человека по сравнению с нормальными тканями, а также при дифференцировке клеток эмбриональной карциномы мыши . Дальнейшее развитие метода, включающее прямое секвенирование коротких кДНК-продуктов, предоставило новые возможности для обнаружения и клонирования генов, изменяющих свою экспрессию з ходе дифференцкровки, опухолевого процесса и т.д.. В ходе исследования проведен анализ субстратных и терминаторных свойств новых синтезированных 5-аллиламиновых производных сЗсШТР для различных обратных транскриптаз. Получены новые данные о влиянии первичной структуры и длины праймера на эффективность синтеза кДНК обратной транскриптаэой М-МЬУ с полностью комплементарного матрице праймера и праймера с единичными некомплементарными нуклеотидами.

Практическая ценность работы. Предложенный метод позволяет изучать регуляцию экспрессии ансамблей генов наряду с методами двумерного электрофореза белков и дифференциального скрининга кДНК-библиотек. Анализ спектров поли(А)+РНК может дать ценную информацию для понимания механизмов тканеспецифической регуляции экспрессии генов, и позволяет обнаруживать гены, которые изменяют свою эь. прессию при воздействии на клетку различных агентов, влияющих на ее дифференцировку, клеточный цикл, мутагенез и т.д.. Кроме того, полученные результаты по праймерной и субстратной специфичности обратных транскриптаз могут быть применены в секвенировании и амплификации ДНК и РНК, а также в ингибиторном анализе полимеризухлцих ферментов.

Апробация работы, Результаты работы были представлены на V Всесоюзной конференции по структуре, функции и биосинтезу нуклеиновых кислот в Пущино в 1991 г., на III Международной конференции "Геном человека" в Сан-Диего (США) в 1991 г., на II Международной Гауссовой конференции в Мюнхене (Германия) в 1993 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре статьи и одно тезисное сообщение.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы" и "Список литературы", работа изложена на 150 страницах машинописного текста, включающего 16 рисунков, 11 таблиц и список литературы, содержащий 110 ссылок.

' МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Конструирование рекомбинантных плазмид, секвенирование индивидуальных РНК и выделение суммарной и поли(А)+РНК проводили как описано Маниатисом с соавт. (Maniatis et al., 1982). РНК-продукты, полученные с помощью РНК-полимеразы фага Т7 на рекомбинантной плазмиде и содержащие определенный праймерный сайт, транскрибировали и очищали как описано Гловером (1989).

Опыты по исследованию субстратных свойств различных аналогов ddUTP, эффективности синтеза кДНК с различных праймеров и получению, спектров полиСА)+РНК проводили в 5 мкл инкубационной смеси, содержащей 50 мМ.Трис-HCl (рН 8,3 при 22°С), 75 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 100 мкг/мл БСА, РНК- или ДНК-матрицы в концентрациях от 0.02 до 0,2 мкМ, зйр- или 33Р-меченого праймера от 0.02 мкМ до 1 мкМ, по 10 мкМ природных dATP, dGTP, dCTP и 504

2№ мкУ тг>рми1м1 i; "О."!) нунлеотидэ J, 6 '•д/мкя обрртной транскрип-тазы M-MLV или по 0.2 ед/мкл обратных транскриптаз HIV-1 и AMV.

Экэонуклеазную обработку терминированных кДНК-продукгов фосфодиэстеразой I проводили, добавляя в реакционную смесь, содержащую продукты синтеза кДНК, 50 мкг/мл фосфодиэстеразы I в 100 мМ буфере глицин-NaOH (рН 10,1) и инкубируя 45 мин при 56°С

Химическое определение первичной структуры олигонуклеогидон проводили в соответствии с методикой (Williamson and Celander, 1989), за исключением химической модификации по основанию С. которая была выполнена с перекисью водорода, как описано у Свердлова и Калининой (1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Новый метод одновременного анализа относительных концентраций нескольких сотен индивидуальных мРНК в препаратах поли(А) Tf!K эснован на синтезе обратной транскриптазой на матрице поли(А>+РНК набора коротких продуктор кДНК дискретной длины с 5'-меченого -(ороткого олигодезоксирибонуклеотидного праймера. Число, длина и тоследовательность прайме we выбирались таким образом, чтобы обеспечить синтез кДНК практически со всех индивидуальных мРНК в юпуляции поли(А)ТНК. При этом каждой индивидуальной мРШ :оответствовал короткий кДНК-продукт дискретной длины и зпределенного нуклеотидкого состава. Для этого реакция синтез;] сДНК проводилась в присутствии трех природных нуклеотидов clATl , IGTP и dCTP, a dTTP был заменен на терминирующий аналог так, чтобы ;интез каждой инициируемой цепи кДНК с каждой индивидуальной mFi-.K •ерминировался против первого встреченного аденозина в цепи РНК. [родукгы синтеза обрабатывались фосфодиэстеразой I для удаления шигонуклеотидов, не содержащих терминатор на 3'-конце, и

разделялись электрофорезом в денатурирующем ПААГ. Необходимс подчеркнуть, что терминированные олигонуклеотиды разделяются е денатурирующем 20% ПААГ не только по длине синтезирующихся коротких кДНК, но и в соответствии с первичной структурой их 3'-концов, что и обеспечивает разрешающую способность до 100 полос е треке при длине терминированных олигонуклеотидов от 10 до 3£ нуклеотидов. Электрофоретическая картина, полученная с использованием 30 праймеров, позволяет получить информацию с представленности мРНК в виде карты транскрипционной активное™ генов ткани или культуры клеток. Сравнение электрофореграм!-распределения и интенсивностей терминированных кДНК-продунтов дву> популяций поли(А)+РНК позволяет выявлять РНК, дифференциальнс представленные в одной популяции поли(А)+РНК и не представленные I другой.

1,ПРДОРР_терминирующего нуклеотияа. Одна из проблем, <

которой мы столкнулись при разработке метода, состояла в том что при синтезе обратными транкриптазами на РНК-матрице < праймера длиной 9-15 нуклеотидов, кроме правильно терминировании: цепей, обнаруживается также большая доля полинуклеотидных цепей которые не удается далее удлинить в условиях реакции, хотя они н< имеют терминатора на 3'-конце. По-видимому, это связано с тем, чт< до достижения кДНК-продуктом длины 20 нуклеотидов обратньп транскриптазы работают дистрибутивно. Для избирательного удалени) таких продуктов мы решили воспользоваться различно! гидролитической устойчивостью олигонуклеотидов, содержащих и Н1 содержащих терминаторный нуклеотид на 3*-конце. Для этоп исследовали устойчивость к ферментативному гидролизу олигонуклео-

Таблица 1

Нуклеотидные аналоги

Относительная устойчивость к 3'-5' экзонуклеазному действию терминированного и нетерминированного олигонуклеотидов

Фосфодиэстераза I

Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I

IdUTP

ldTTP(3'F),ddTTP(3,N3)

idTTP(3'NH2)

iraTTPO'NH,), iraTTP(3 'Ng7

idUTP(5AA), IdUTP ( 5AA-Fam) , idUTP (5AA-Joe), IdUTP(5AA-TMR), ldUTP(5AA—Rox), idUTP(5AA-Bio)

* 2 • 2 "10

"150

>1000

50

>1000

гидов, терминированных различными нуклеотидными аналогами [табл. 1), в том числе синтезированными М.А.Луниным и I.A.Александровой аллиламиновыми 5-производными ddUTP, которые жазались эффективными терминаторными субстратами для различных обратных транскриптаз.

Если широко используемый в качестве терминатора ddUTP, зключенный на 3'-конец олигонуклеотида, придает ему только 50-<ратную устойчивость к 3'-5' экзонуклеазному действию фрагмента (ленова ДНК-полимеразы I, то олигонуклеотиды, содержащие на 3'-(онце различные 5-производные ddUTP, оказались по меньшей мере в L000 раз более устойчивы к гидролизу фосфодиэстеразой I и фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, чем нетерминированние >лигонуклеотиды. Использование ddUTP(5AA-Fam) в качестве герминатора в предлагаемом методе фингерпринтинга РНК позволило »ффективно удалять с помощью экзонуклеазной обработки

фосфодиэстеразой I олигонуклеотидц, не содержащие на З'-конц^ терминирующий аналог, из продуктов синтеза кДНК.

2.Выбор олигонуклеотидов. В качестве праймеров были выбраны 30 9-членных олигонуклеотидов: TGCAGGCTG (FU, TGCAGGTGG (F2) , TGGAGCTGG (F4), TGTGGCTGG (F5), TGTGGCAGG (F6), TGCTGGGGA (Р8), ÎG"TGGAGG (Р10), TGCTGGAGT (Р32), TGCTGGACG (РЗЗ), TGCTGGATG (Р.1.1). TGCTGGCGG (Р35), TGCTGGTGG (Р36), TGCTGCAGG (Р37), TGCT'JTAGG (Р38), TGCTGGCGT (Р39), TGCTGGCGC (Р40), TGCTGGCAG С i'41 ) , TGCTGGCCG (Р42), TGCTGACGG (Р43), TGCTGTCGG (Р44), TGCTGGTGT (Р46), TGCTGGTGC (Р47), TGCTGGTAG (Р48), TGCTGGTCG СР49), TGCTGGCGA (Р50), TGCTGGTGA (P50), TGCTGGGTG (P55), TGCTGGTTG (P56), TGCTGGCTG (P57), TGCTGCATG (P59). Компьютерный iiiiam по выбору олигонуклеотидов был проведен Р.Ш.Бибилашвили. На структуру олигонуклеотидов были наложены следующие ограничения. При одновременном использовании этих олигонуклеотидов в . 30 отдельных реакциях синтеза кДНК должно было быть обеспечено премирование синтеза не менее, чем с 90-95% индивидуальных РНК в препарате поли(А)+РНК. Длина и нуклеотидная последовательность праймера были выбраны таким образом, чтобы вероятность нахождения г.?.7х комплементарных к нему участков в одной и той же молекуле мГНК не превышала 3%. При этом учитывалась неслучайность распределения вероятности встречаемости различных последовательностей нуклеотидов. Соответствующие коэффициенты были выбраны на основании анализа кодирующей части 200 генов мРНК млекопитающих.

Кроме того, при выборе структуры олигонуклеотидов стремились достичь максимального отношения эффективности синтеза с полностью комплементарной матрицы к эффективности синтеза с матрицы, в которой один из нуклеотидов не комплементарен затравке. Для

введения соответствующих коэффициентов был проведен ряд опытов по сравнению эффективности синтеза кДНК, инициированного с праймеров, содержащих единичныа нуклеотидиые замены, некомплементарные матрице. Исследовалось влияние изменения как положения кекомплементарного нуклеотида, так и длины праймера. Анализ полученных данных показал, что для всех возможных положений некомплементарных нуклеотидов наибольший синтез обеспечивает праймер с пурин-пуриновыми или пиримидин-пиримидиновыми заменами (рис.1). Кроме того, с увеличением длины праймерного олигонуклеотида от 9 до 13 звеньев возрастает эффективность синтеза с олигонуклеотидов, содержащих некомплементарные, замены (рис. 2). Было также найдено, что эффективность синтеза кДНК с олигонуклеотида, имеющего единичные некомплементарныа матрице нуклеотидные остатки в 5'-концевой части праймера, превосходит эффективность синтеза с олигонуклеотида, имеющего такие замены в З'-концевой части. Более того, замена 5'-концевого нуклеотида праймера, как правило, не приводит к уменьшению эффективности синтеза (рис. 1,2,3). Однако, мы не обнаружили монотонного уменьшения эффективности синтеза для праймеров с последовательными от 5'- к 3'-концу заменами комплементарного нуклеотида на некомплементарный. Как оказалось, большое значение для эффективности праймирования имеет не только положение 'некомплементарного нуклеотида, но и конкретная нуклеотидная последовательность праймера. Так, на рис.3 можно видеть, что перемещение нуклеотидного блока З'-вТСб-б' в составе олигонуклеотидов 3'-АСТССССТС6Т-5' и 3 ' -АСАвАБйТС0Т-5 с 5'-конца праймеров (гистограммы 1 и 2) к 3'-концу (гистограммы 3 и 4) приводит к уменьшению эффективности некомплементарного

Рис.I. Относительная эффектив ность синтеза кДНК обратно транскриптазой н-ШУ с 10-членны праймеров, содержащих все возмозк ные единичные нуклеотидные заме ны (1,2,3) в сравнении прайыерныы олигонуклеотидом 3' АСЕТАССАСТ-б', полностью компле ментарным РЖ-матрице (%).

Рис.2. Относительная эффектиЕ ность синтеза кДНК обратно транскриптазой и—м ьV с набора 12 членных (I), П-членных (2) и 9 членных (3) праймеров, содержащи единичные нуклеотидные замен пурина на пурин или пиримидина ь пиримидин в каждом положени праймерного олигонуклеотида, сравнении с полностью комплемен тарным матрице олигонуклеотидом соответствующей длины (3' СААСА5АССТС6Т-5' , 3' -АСАСАСС1ТСС1 5' И З'-АСАСбТССТ-б') (%).

Рис.3. Относительная эффектш ность синтеза кДНК обратно транскриптазой М-М1У на четыре РНК-матрицах с 11-членных прайме ров, содержащих единичные нуклес тидные замены пурина на пурин ш пиримидина на пиримидин в каждс положении праймерного олигонук леотида, в сравнении с полност! комплементарными соответствующе матрице праймерными олигонуклес тидами 3'-Астсссстсат-5' (I) З'-АСАСАЙбТССТ-б' (2), З'-АЙТ отсссвт-б' (3), 3' (4) (%). Черным цветом обозначе нуклеотидный блок 3'-СГСб-5' белым цветом - блок 3'-ТССС-5' точками - блок З'-вАв-б'. '

раймирования, что а общем случае верно для большинства зследованных нами праймеров. Однако, и в аналогичном положении от '-конца праймеркого олигонуклеотида нуклеотидкый блок 3'-БТСС-5' 5еспечивает различную эффективность некомплементарного раймирования в зависимости от того, какая нуклеотидная эследовательность окружает рассматриваемый блок (гистограммы 1 и ). При этом в целом профиль блока в большинстве случаев охраняется при различном нуклеотидном окружении. Например, в ^клеотидном блоке 3'-5ТСС-5', как можно видеть на всех четырех 1стограммах на рис. 3, нуклеотидные остатки сЮ обеспечивают «меньшее некомплементарное праймирование, а с!С и с!Т ~ «большее. Эти и ряд других выявленных закономерностей легли в :нову компьютерной программы по выбору олигонуклеотидов, ¡пользованных в работе.

Кроме того, оказалось, что относительный уровень )фективности некомплементарного праймирования зависит не только нуклеотидной последовательности праймерного сайта, но и от :ловий проведения реакции синтеза кДНК (отношения концентраций >аймер-матрица-обратная транскриптаза, наличия конкурирующей 1Трицы). Оба эти фактора были учтены при оптимизации реакции [нтеза кДНК. В условиях наших экспериментов соотношение >фективности некомплементарного и комплементарного праймирования 'ставляло не более 15%.

3.Применение метода Фингерпринтинга РНК для исследования ФФеренциально экспрессирующихся генов. Возможности применения тода фингерпринтинга поли(А)"*"РНК зависят в первую очередь от фективности выявления небольших изменений в количественном держании индивидуальных РНК в клетках и тканях при различных

биологических процессах: патологически»? спот;>тчия канцео'тенр s дифференцировка, гормональная регуляция, регуляция пролиферации и т.д. Представленные ниже данные демонстрируют возможности выявления дэРНК в различных биологических объектах, начиная с тех, где ожидаемый уровень различий в экспрессии генов по данным двумерного электрофореза белков (Celis and Bravo, 1984) должен быть высок (различные ткани человека, нормальная, циррозная и эмбриональная печень человека) и заканчивая сложными для анализа объектами, где ожидаемые различия могут быть небольшими (недифференцированные и дифференцированные клетки F9 эмбриональной карциномы мыши, нормальный миометрий матки и миома матки человека).

3.1 Сравнение нормальных тканей человека. На рис. 4 показаны различия в спектре терминированных продуктов кДНК, синтезированных обратной транскриптазой M-MLV на матрицах поли(А)+РНК, очищенных из 15 различных тканей человека (треки 115) или поли(А)~РНК из печени человека (треки 16), с 33Р-меченых праймеров Р44 и Р46, которые были выбраны из первоначально использованных 30 олигонуклеотидных праймеров. Как видно из рис.4, спектр синтезированных терминированных олигонуклеотидов уникален как для каждой исследованной поли(А)+РНК, так и для праймера. Поли(А)+РНК, выделенные из гистологически различных тканей (например, из печени (трек 1) и мозга (трек 15)), дают значительно больше отличий в спектрах терминированных олигонуклеотидов, чем-из сходных тканей (например, из органов, содержащих мышечные ткани: скелетной мышцы (трек 9), сердца (трек 8) и матки (трек 10)). Поли(А)~РНК из печени (трек 16) дает значительно более простой спектр синтезированных продуктов (олигонуклеотид Р44) или полное отсутствие синтеза (олигонуклеотид Р46), что также характерно и

-м •и

— тт -

• -г " ■ -.1

«я

(

Р44 I , Р48 - ''

|ЯВ«ВВ11И9 I 1 I ! «3 2 1(12 3«5«789Ю11ШЗт5

Рис. 4. Электрофореграмма терминированных продуктов синтеза кДНК с праймеров Р44 и Р46 на матрицах поли(А)"'РНК (1-15) и поли(А)"РНК (16) человека. 1, 16 - печень, 2 - слюнная «елеза, 3 -поджелудочная железа, 4 - надпочечники, 5 - семенники, 6 -предстательная железа, 7 - тимус,.8 - сердце, 9 - скелетная мышца, 10 - селезенка, 15 - кора больших полушарий мозга. <1(Т)П - маркер длины олиго с1(Т) , где п - 12, 13, 14 и т.д.

для всех других праймерных олигонуклеотидов, использованных в данной работе. Наиболее интенсивные полосы терминированных олигонуклеотидов в треке 2 (праймер Р46) соответствуют по предварительной оценке на основании экспериментов по добавлению в препараты поли(А)+РНК известных количеств РНК, синтезированной in vitro, примерно 5%-ному содержанию индивидуальных мРНК, а наименее интенсивные - 0,03-0,05% содержанию (праймер Р46, трек 6, полосы с длиной более 11 нуклеотидов). Как видно из рис. 4, наиболее яркие сигналы соответствуют препаратам поли(А)"'"РНК, выделенным из тканей, специализированных на синтезе какого-либо

тканеспецифического белка: из слюнной железы (трек 2), поджелудочной железы (трек 3), надпочечников (трек 4), печени (трек 1), сердца (трек 8), скелетной мышцы (трек 9) и матки (трек 10), Как известно, в препаратах поли(А)+РНК, выделенных из таких тканей, содержание индивидуальных РНК, кодирующих

тканеспецифические белки, достигает 20-30% (Гайцхоки, 1980).

3.2. Сравнение нормальной, циррозной и Фетальной печени.

Для дальнейшей оценки возможностей метода мы попытались обнаружить различия в спектрах поли(А)+РНК, выделенных из нормальной, циррозной и фетальной печени. Из 30 использованных олигонуклеотидов, праймирующих синтез кДНК на более, чем 90% индивидуальных РНК в поли(А)+РНК, с помощью 28 были выявлены четкие отличия в содержании индивидуальных РНК в препаратах поли(А)"*"РНК из нормальной и фетальной печени и только при использовании 5 праймеров были обнаружены различные дэРНК в спектрах поли(А)+РНК для нормальной и циррозной печени. На рис. 5 представлены результаты, демонстрирующие такие изменения для нормальной и фетальной печени (праймеры Fl, F6, Р55, Р41, Р10,

30

и

24

27

и

29 24

2) 22 21 20 -19 -18 — 17 —

1$

15"

£

- 3 Г

ю-Г *

«ГЦ .

I Г"-

л

— *

- \ 5

— - - 5

«

12 «Э .

лт|„

■га (1 Р55 Р41 РК> Р35 РЗЬ Р57

1 2 3 1 2 3 I 2 3 1 23 1 2 3 ) 2 3 1 13 1 2 3

Р32 1 2 3

Рис. 5. Сравнение спектров терминированных олигонуклеотидов, синтезированных обратной транскриптазой на матрицах поли(А)"1'РНК из нормальной (1), циррозной (2) и фегальной (3) печени человека с праймеров Р1, Г6, Р55, Р41, Р10, Р35, Р57 и Р32. с1(Т)п - маркер длины олиго с1(Т) , где п - 12, 13, 14 и т.д.

, F36, Р57), для нормальной и циррозной печени (F6, полосы 1, ; •. PS5, полоса 3; Р35, полоса 4; Р36, полосы 5, 6; Р57 , полоса 7) v. но -обнаруживающие таких отличий (праймер Р32).

Для того, чтобы понять, отражают ли наблюдаемые различия в полученном фингерпринте поли(А)+РНК реальные различия в составе ¡:слк(А)"*"РНК фетальной и нормальной печени, мы вырезали из геля дифференциально представленные полосы, обозначенные на рис. 5 цифрами 8-18, элюировали терминированные олигонуклеотиды и определили их нуклеотидную последовательность. В табл. 2 представлены данные по сравнению полученных последовательностей с оазой данных нуклеотидных последовательностей GenBank. Из 11 анализируемых последовательностей для 7 (полосы 9,10,11,12,13, 17,18) в базе данных были найдены уникальные комплементарные последовательности, соответствующие индивидуальным мРНК. Одна из определенных последовательностей длиной 13 нуклеотидов (полоса 16) соответствовала двум индивидуальным мРНК и одна, также длиной 13 нуклеотидов (полоса 8) - четырем индивидуальным мРНК. Двум последовательностям (полосы 14 и 15) не нашлось соответствия в базе данных нуклеотидных последовательностей. По-видимому, они соответствуют неизвестным мРНК, дифференциально экспрессирующимся в фетальной, но не в нормальной печени. Согласно данным, представленным в табл.2 и на рис.5, мРНК альфа-1-глобина, альфа-2-глобина, гамма-глобина и инсулин-подобного фактора роста II синтезируются почти исключительно в фетальной, но не в нормальной печени. Это согласуется с многочисленнымии данными о повышенной экспрессии этих мРНК в фетальной печени человека (Higgs et al., i969; Gray et al., 1987). Таким образом, регистрируемые в условиях на^лх экспериментов по фингерпринтингу РНК изменения

Табя.л. Идентификация мРНК человека, экспрессирдаихся в нормальной, Шфрсзнсй и фетальдая печени в соответствия с данными фингерпритшга РНК (рис. 5).

I

N I Последовательность терми-поллнированной кДНК (5'—>3') и сы шайпенный комплементарный I ей участок мРНК (зч—5')а

ДЛФе- I I Международный коьтс

ренци- I Ияентиришфо- I последовательнссти,

альная I ванная РНК или I в скобках указан:- -

экспрес-1 ее белковый I лзжение комшкменту^

сия I продукт I юго участка нйа

тстсссАссддд! ССАСССГСССССА

9 ТОТОССАССаддаасддс:1 СОССССГССТССтаСССА

10 ТСГ-СССАССадасадсасса1 АСАССССТССТСТСТССТССТА

О

11 ТССТСвСА0даддаасддс1

ТССССССТССТССТТССССА д

12 ТССТСОСА5дадасадсасса1 •

АСАССССТССТСТСТССЮСТА д

13 ТССТОйСАОаддсададдасадд1 АСТАСССТСТСССТСТССЮТССА

14 ТССТСОСАгдддасадсассасда!

15 ТССТС0САСдддддддсадсдсаддддс1

16 ТССТСОТССдда1 СССАССАССССТА

17 ТССТС5ТС5ддааддасаддааса1 + АССАССАССССТТССЮТССТТСТА

18 ТССТ0СТ6Сдсададсдсдддсаддсд1 + СССАССАССССТСТСССОССССГССССА

-гатрияуретичес-кий белэк 1-озга -гуанин-связы-ваодий белок -пируватккназа -псевдоген прохшээина

альфа-2-глобин

альфа-1-гюбт альфа-2-глобин

альфа-2-пгобш

альфа-1-глэбин альфа-2-глобин

М31776 (1123-1134'

«19184 (376-397)

Х56494 (4374-4355,

Н57267 (78-89)

У00488 (837-357)

У00488 (137-158)

У00488 (837-856)

У00488 (13" '57)

1 ол1ггк1

АГШ*а~глэбин Л00176 (444-467) не найдена

не найдена

-ЩЛШРОМ Р450 М61854 (1088-1099) -цистешовый ингибитор протеиназ ¡119169 (1280-1291)

аяьЦй-1-глзбин альФа-2-гдзбин

,'00489 (350-374)

Инсулин-подоййй

фактор роста И Х05330 (269-296)

4 Последовательность использованного праймера и найденной комплементарной мРНК, обозначены болынши буквами; некомплементарнье мРНК основания в прапмере гюдчеркнуты; секвенированная последовательность терминированной кДНК о&эвчена каленькши буквзми; в случае неоднозначности определения первичной структуры два эоэ-ежньк нуклеотида указаны в одном месте.

1 7

в интенсивности индивидуальных полос на электрофореграмме отражают реальное изменение концентраций индивидуальных дэРНК. Выявление неизвестных дэРНК подтвердило применимость предлагаемого метода фингерпринтинга РНК для обнаружения генов, изменяющих свою экспрессию в ходе индивидуального развития печени человека.

Основываясь на полученных данных, мы попытались оценить возможность прямого секвенирования по методу Сэнгера непосредственно в поли(А)+ фракции более протяженных участков дэРНК. Для этого мы химически синтезировали олигонуклеотид с нуклеотидной последовательностью полосы 10 (табл.2). Далее, используя этот олигонуклеотид в качестве праймера, провели реакцию секвенирования с использованием обратной транскриптазы АМУ на матрице поли(А)+РНК из фетальной печени. Определенная последовательность соотвествовала 37 нуклеотидам с 5'-конца мРНК глобина. Аналогичный подход может быть также использован в случае дэРНК, для которых отсутствует информация о первичной структуре в базе данных нуклеотидных последовательностей или эта информация неполная.

Наблюдаемые различия в представленности и интенсивности отдельных полос на электрофореграмме в спектрах поли(А)+РНК, выделенных из тканей различных индивидуумов, составили около 0.2% от общего числа полос спектра поли(А)+РНК печени, выявленных с помощью 30 праймеров, при этом все дифференциально представленные полосы (рис. 5) не выявляют различий в интенсивности терминированных полос для образцов поли(А)+РНК из трех индивидуумов. Такое же количество индивидуальных различий (0.2%) в представленности и интенсивности'полос для образцов поли(А)+РНК из пяти пациентов мы наблюдали для спектров поли(А)+РНК нормального миометрия и миомы матки человека. Миома-специфичные изменения в

представленности и интенсивности полос составили 0.1% от общего числа полос, причем они характеризовались лишь изменением содержания некоторых индивидуальных РНК в 2-5 раз, а не исчезновением или появлением новых РНК.

3.3. Дифференцировка клеток F9 эмбриональной карциномы мыщи.

Метод фингерпринтинга поли( А)"*"РНК был применен также для анализа экспрессии генов в клеточной культуре клеток F9 эмбриональной карциномы мыши, используемой как модель дифференцировки. Клетки F9, происходящие от тератокарциномы семенников мыши, дифференцируются в клетки париетальной эндодермы при обработке ретиноевой кислотой и дибутирил-сАМР. Изменения в клеточном фенотипе, на'блюдающиеся после 2-3-хдневной обработки, сопровождаются включением транскрипции ряда генов: активатора плазминогена, коллагена IV, ламининов А и В, цитокератинов Endo А и Endo В, генов Sparc, Н-2, бета-2-микроглобулина и др. (Goodfel-low, 1984; Rickles et al., 1988., Mason et al., 1986).

Анализировали. спектры поли(А)+РНК, выделенных из недифференцированных клеток (рис. 6, треки 1) и клеток, обработанных смесью ретиноевой кислоты и дибутирил-сАМР в течение 1 и 6 суток (рис. 6, треки 2 и 3, соответственно). Из 30 использованных в работе праймеров 8 выявили 10 индивидуальных РНК, содержание которых изменялось не менее, чем в 2 раза в ходе дифференцировки. Так, праймеры Р55, Р35, Р37 и Р43 выявили 6 индивидуальных РНК (рис. 6, полосы 1,2,3,4,,5,7), количество которых возрастало в ходе дифференцировки в течение 6 суток не менее, чем в 2 раза. Праймеры Р36 и Р48 не обнаруживали изменений в спектрах поли(А)+РНК при дифференцировке клеток F9. Данные, представленные на рис. 6, хорошо воспроизводились в трех'

f-.z гисимкх экспериментах.

В табл. 3 представлены результаты по секвенированию диффнренциально представленных полос кДНК 1,3,4,5,7 и полос 6,8 6) . При сравнении секвенированных последовательностей с :>-1эой данных GenBank мы обнаружили, что полоса 1 соответствует с/'Н;. альфа-1-коллагена тип IV мыши, полоса 3 - мРНК Tete 1 мыши ¡"-¡омплекс-ассоциированный пептид, экспрессирующийся в ■ емиькиках), полоса 5 - мРНК ламинина А мыши и полосы 6 и 8 - 28S рГ-Hi. мыши. Определенные нами последовательности теминированных соответствующие полосам 4 и 7, не были обнаружены в базе данных GenBank.

Для того, чтобы подтвердить правильность соотнесения терминированного олигонуклеотида из полосы 5 к мРНК ламинина А (рис. 6), мы удлинили олигонуклеотид, добавив 0.2 мкМ dTTP при синтезе терминированной кДНК обратной транскриптазой. В этих условиях вторая дифференциально представленная полоса была получена на расстоянии трех нуклеотидсв от первой, и первичная структура этого олигонуклеотида снова соответствовала мРНК ламинина А мыши. Подход, связанный с "удлинением" терминированного олигонуклеотида, может быть применен не только для идентификации мЕ'пК, соответствующих коротким дифференциально экспрессирующимся продуктам синтеза кДНК, но и для последующего синтеза праймеров длиной 18-25 нуклеотидов для RT-PCR или зондов для клонирования кДНК/генов в кДНК- или геномных библиотеках.

Среди определенных нами дэРНК мРНК альфа-1-коллагена типа IV и мРНК ламинина А - хорошо известные маркеры дифференцированных клеток F9 (Goodfellow, 1984), a Tete 1 мРНК, описанная в работе 8arvf„nick et al. (1989), - новый маркер дифференцировки клеток

, г:

г

с -

5

!

Г

„и,1

^ N С-.1:

Ч' V. :1

*** I:-: и "

г:''] ;

- ш *.

5 - - а ~ ; 5 __ ггг 2--

я**

• ' -л

* 8

а.

<14

'» 1« '35 П> ИЗ М1

133 1 г з 1гз ■ 2 з 123 1 г з > г з

. Рис. 6. Изменения в спектре терминированных оли'гонуклео-тидов, синтезированных обратной транскриптазой на матрицах поли(А)+РНК из 'недифференцированных клеток эмбриональной карциномы мыши Г9 (1) и клеток, обработанных з течение 1-суток (2) и б суток (3) смесью ретиноевой кислоты (0,2 мнМ) и дибутирил-сАМР (1 мМ) с праймеров Р36, Р55",.Г6, Р35, Р37, Р43 и Р48. 'сЦ-Т)п -маркер длины олиго сКТ)п, где п = 12, 13, 14 и т.д..ра

Табя.з Идентификация РНК мыли, экслрессирусщкся в ходе дифференцирсоки клеткок Г9 в соответствии с данньми Фингерпринтинга РНК (рис.6)

I • I ДиОФе- I I Международный жмзр N I Последовательность тещи- I ренци- I Иденийициро- I последовательности, поло1 нированюя кЛНК (5*—>з•) и I альная I ванная РНК или I в скобках укаэаю пасы I найденный комплементарный 1экспрес-1 ее белковый I жжение кмдшементар-I ей участок мРНК (3'<—5')а I сия I продукт I юго участка мРНК

1 Т0СТ0С5ТСдддадсдсададссссддсд1 ТССАСССАСдССТССССТСТСООаСССОСА + альфа-1(альфа-2) коллаген тип IV <304448 (403-430)

3 ТССТСССССасадсс! СССАССОССССТСССА + Т-комплекс ассо- Н28821 даировзяый пептид, экспрессирувдийся в семенниках (Тс1с1) (1465-1479)

4 д ТССТ0АСССдаддаасддс1 + не найдена -

5 ТССТСАСССса^ази6 С;ССАСТССССТА(ТСА) + Ламинш а Х07737 (552-566)

6 50 ТССТСССССдааадасдддссдд1 ссссссссссостСтссссссссА - 283 рРНК Х00525 (1277-1300)

7 а Т0СГСССССддсддсдадасддсд1 + не найдена -

8 Т0СТСАСССдсвададддсддссссс1 ТССАСТОСССССТСТССССССССЗОСА - 285 рРНК Х00525 (4554-4581)

а Последовательность использованного праймера и найденной комплементарной мРНК, обозначены бзлышми буквами; некомшкментарныэ мРКК основания в гоаймере подчеркнуть; секвеницованкая последовательность терминированной кПШ обззтаченз маленькими буквами; в случае неоднозначности определения первичной структуры два зожньк нуклзотида указана в одном месте.

скобках обоэачена последовательность тогосы 5 посла ее удлинения в присутствии о.2мкМ аттр.

?9. Последовательности полос 4 и 7 также представляют собой неизвестные маркеры дифференцировки. Таким образом, метод фингерпринтинга РНК в применении к дифференцировке клеток К9 позволил эффективно выявить ранее неизвестные дэРНК (рис. 6, полосы 4 и 7), без какой-либо информации о свойствах белков, кодируемых этими мРНК. Одновременное обнаружение неизвестных маркеров дифференцировки клеток Г9 наряду с .известными является убедительным доказательством применимости метода фингерпринтинга полиСа)*" к поиску дэРНК.

выводи

■ 1. Установлено, что аллиламиновые 5-производные с!сШТР являются эффективными терминаторнкми субстратами обратных транскриптаз М-М1ЛГ, АМУ и Н1У-1, а олигонуклеотиды, терминированные этими производными, по сравнению с нетерминированными олигонуклеотидами обладают более чем в 1003 раз большей устойчивостью к 3'-5' экзонуклеазному действию фосфодиэстеразы I и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I.

2. Показано, что эффективность синтеза кДНК обратными транскриптазами с неполностью комплементарных матрице праймеров, содержащих единичные нуклеотидные замены, зависит от положения некомплементарного остатка и становится в общем случае тем больше, чем ближе расположен этот некомплементарный нуклеотиц к 5'-концу праймера. Однако, возрастание эффективности некомплементарного праймирования в зависимости от положения замены происходит не монотонно и определяется окружающей некомплементарный нуклеотид последовательностью.

3. Разработан новый метод фингерпринтинга РНК для сравнительного анализа относительных концентраций индивидуальных мРНК в препаратах поли(А)*РНК. Метод состоит в синтезе обратной транскриптазой М-МЬУ на матрице поли(А)+РНК коротких терминированных кДНК-продуктов дискретной длины, соответствующих индивидуальным мРНК и сравнении электрофореграмм распределения и интенсивностей полученных терминированных олигонуклеотидов. Последующее определение первичной структуры олигонуклеотидоз из дифференциально представленных полос позволяет идентифицировать как описанные, так и неизвестные дэРНК.

4. Разработанный метод был применен для анализа дэРНК в различных тканях человека в норме и при патологии. Обнаружены три

известные и две новые последовательности мРНК, • экспрессирующиеся в фетальной, но не в циррозной или нормальной печени.

5. С помощью разработанного метода анализировали дэРНК в ходе дифференцировки клеток эмбриональной карциномы мыши F9 и обнаружили дифференциальную экспрессию генов альфа-коллагена, ламинина А и гена Tctc-1, а также двух новых генов, в разной степени повышающих свою экспрессию в ходе дифференцировки.

Список публикаций по теме диссертации 1. Beabealashvili R.S., Chenchik А.А., Diatchenko L.B. Analysis of poly(A) RNA in mammalian cells // The 1991 San Diego conference "Human Genome", Poster Presentation Abstracts.- 1991,-p.61.

2. Савочкина JI. П., Дьяченко Л. Б., Лукин М.А. , Александрова Л.А. Аналоги нуклеотидов, модифицированные по сахарному остатку и пиримидиновому основанию, в реакции синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой из Thermus aquabicus// Молекулярная .--биология. 1992. - Т. 26,- ВЫП. 1,- С. 191-200.

3. Ченчик А.А., Бибилашвили Р.Ш., Дьяченко Л.Б. Количественный анализ индивидуальных РНК в препаратах поли(А)н"РНК клеток млекопитающих // Молекулярная биология. - 1992. - Т. 26.-Вып. 5,- С.1181-1194.

4. Cjjenchik A.A., Diachenko L.B., Beabealashvili R.S. Analysis of poly(A)+RNA patterns in human tissues // FEBS Letters. - 1993,- V.321.— N.l. - P.98-101.

5. Chenchik A.A., Diachenko L.B. Beabealashvili R.S. Application of poly(A)+RNA patterns method for searching of fiii'i'erentially expressed genes // FEBS Letters. - 1993.- V.324.-

' N.2.-P.136-139.

Э.з SpijJJD