Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЦИС-элементы и транс-факторы, принимающие участие во внутренней инициации трансляции РНК полиовируса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "ЦИС-элементы и транс-факторы, принимающие участие во внутренней инициации трансляции РНК полиовируса"

п

V

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 576.858:577.217

ПЕСТОВА Татьяна Васильевна

ЦИС-ЭЛЕМЕНТЫ И ТРАНС-ФАКТОРЫ, ПРИНИМАЮЩИЕ УЧАСТИЕ ВО ВНУТРЕННЕЙ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ РНК ПОЛИОВИРУСА

Специальность 03.00.03 — вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

Работа выполнена в Институте флоиюо-яимичеокой биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

чл.-кофр. РАМН, профессор В. И. Агол

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук И. В. Скарлат доктор химически« наук И. Н. Шатский

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится .« ' » ^дд^ г ,в / / час_ на

заседания Специализированного Ученого совета Д 05l3l.05.0i7 при Московском Государственяом Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: ГСП '11119890, .Москва, 'В-21314, Ленинские горы, МГУ, корпус «А», к. 536.

С диссертацшои можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

ан « / »

Автореферат разослан « 7 » ИЛЛ^Р! 1992 г.

Ученый секретарь епециалжировадшого совета кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время для описания механизма инициации трансляций эукариотиче ских мРНК используется сканирующая модель, предложенная Н.Козак. В соответствии с этой моделью, 40s рибосомная субчастица связывается с кэпированным Б'-концевым районом мРНК, вторичная структура которого предварительно расплетается факторами инициации трансляции eiF-4P, еГР-4А и elF-4B. Связавшаяся с матрицей 40s субчастица сканирует 6'-нетранслируемую область (НТО) РНК до встречи с первым AUG кодовом, находящемся в благоприятном нуклеотидном окружении, после чего к ней присоединяется 60S рибосомная субчастица, и образовавшийся 80s комплекс начинает непосредственный синтез балка. Эта модель предъявляет, таким образом, определенные требования к структуре мРНК эукариот. В частности, подавляющее большинство эукариотических матриц кэпированн, моноцисгронны, содержат относительно короткие (50-1БО нуклеотидов) 5*-НТО, а инициация происходит обычно на первом от Б'-конца AUG. В связи с этим большой интерес представляет» исследование механизма инициации трансляции некэпированных РНК пикорнавирусов (мелких FHK-содержалих вирусов животных, включающих, в частности, энтеро-, рино-, кардио- и афтовирусы), 5'-НТО которых имеют длину от 600 до 1200 нуклеотидов и содержат до 11 AUG триплетов, предшествующих- инициаторному AUG. Инициация трансляции таких РНК происходит в результате кэп-независимого связывания 40s рибосомной субчастицы с внутренним .участком б'-нетранслируемой зоны. Однако, детали такого механизма eme во многом не ясны.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение цис-действугацих элементов и транс-действующих клеточных факторов, ответственных за осуществление инициации трансляции РНК вируса полиомиелита (гошэряавируса, относящегося к роду энтеровирусов) по механизму внутренней посадки рибосомы.

В задачу работ входило:

1. Путей направленного мутагенеза ввести нуклеотидные замевы в различные рйоны б'ЧЕГО рщ вируса полиомиелита и исследовать трансляционную активноть полученных конструкций ln vi tro в екотрактах клеток Hele, асцитной карциномы Кребс-2 и кроличьем ретикулоцитном лизате.

2. Исследовать влияние данных замен в 5'-НТО на фенотип вируса полиомиелита <i» viva в клетках HeLa.

3. При помощи метода УФ-сшивания охарактеризовать белки экстракта клеток Hela, взаимодействующие с Б'-нетранслируемой зоной ИШ пслиовнруса.

•4. Частично очистить и функционально охарактеризовать вти белки.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате настоящей работы выявлена важная роль в инициации трансляции на полиошрустой матрице полипиримидинбогатой области и последнего консервативного aug-586 кодона, являнцихся частью характерного для Б'-НТО всех пикоряавиру'свых РНК структурного елемента Ул-Хт-АШ; (где Y - пиримидин, X - любой нуклеотид, a m колеблется от 15 до 25). Показано специфическое взаимодействие Б'-НТО РНК вируса полиомиелита с клеточным белком с молекулярной массой 67 КД (р57). Цроведбна частичная очистка белка р57 из клеток асцитной карциномы Кребс-2. Установлена идентичность белка р57 и описанного в литературе ядерного белка рРТВ (Garoia-Bianoo ct al., 1989, Gil at al., 1991, Patton et al., 1991). предполокительго принимающего участив в сплайсинге. Получены указания на возможную роль р57 в кап-независимой внутренней инициации трансляции на голиовирусной РНК. Полученные в работе данные, расширяющие наши знания о механизме квп-независимой внутренней инициации на РНК полиовируса, используются в курсе лекций на кафедре вирусологии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова-

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международном симпозиума го молекулярной и клеточной- биологии "Трансляционный контроль" в Колорадо, США 1991, а также на совместном заседании лаборатории "Взаимодействие вируса с клеткой" НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ

им. М.В.Ломоносова и лаборатории биохимии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАШ, Москва 1992.

Публикации. По томе диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: оглавление, введение, обзор литературы (4 главы), описание методов исследования, -изложение полученных результатов и их обсуждение, вывода и список литературы. Диссертация включает рисунка и таблица.. Список литературы включает

источников отечественной и зарубеккой литературы.

вируса полиомиелита.

1) Влияние мутирования полигоримядинбогвтой области Б'-НТО полиовирусной FHK на трансляцию in vitro в экстрактах клеток НеЪа и Креос-2.

Б'-НТО полиотзируса типа 1 составляет 742 нуклеотида и содержит 8 AUG триплетов, предшествующих шицлаторному кодону aug-743. Она обладает ярко выраженной вторичной структурой, консервативной для всех трех сэротшгов вируса (Piiipenko et ai., 1Э89), (рис. 1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование цис-дсйсгвукщнх элементов 5•-НТО ' РНК

Рис.1 Фрагмент вторичной структуры б' -НТО РНК шлиОЕируса.

Полипиркмидинбогатая область

структурного мотива Уп-Хп-лис обозначена отрезком толстой сплошной линии ( АТС-триплет данного элемента -символом #, о инициаторный кодон аш-743 - символом ».

область

Для З'-концевой части Б'-НГО всех пикорнавирусных РНК характерен структурный элемент Yn-Xm-AUG (где У - пиримидин, х - любой нуклеотид, a m колеблется от 1Б до 26 для различных вирусов), выделенный на рис. 1. С целью изучения функциональной ролл олигопиримидинового тракта данного структурного элемента на основе плазмиды pBS(KS+) была получена конструкция ppvi(м)-5'-Р1, содержавшая под транскрипционным контролем промотора фага ТЗ последовательность Б'-НТО полиовирусной РНК (нуклеотидн 70-742) и район, кодирующий предшественник структурных белков Р1 (нуклеотидн 743-3380), оканчивающийся терминирующим кодоном UGA. Выбор последовательности, кодирующей Р1, в качестве репортерного •гена позволил сохранить возможные естественные дальние взаимодействия между Б'-НГО и кодирующим районом РНК, и таким образом, избежать нежелательных неспецифических эффектов. Систематические нуклеотидные замены. вводились в олигопиримидиновый тракт (нуклеотиды ББЭ-Б75) при помощи метода направленного мутагенеза с использованием синтетических олигодезоксирибонуклеотидов (табл.1). Трансляцию полиовирусных РНК tn vitro в экстрактах клеток Hela и КрэСс-2 проводили в экспериментально подобранных условиях, оптимальных для трансляции РНК дикого типа. При этом концентрация•ионов калия составляла 90 мМ, а ионов магния - 1,7 мМ. При трансляции в лизате ретикулоцитов кролика (ЛРК) фирмы Promega оптимальными оказались условия, предложенные фирмой.

Влияние нуклеотвдных замен в голширимидиновом тракте на трансляцию полировирусной РНК в экстракте клеток НеЪа представлено на рис.2. Результаты количественной сценки трансляционной активности мутннтных полиовирусных РНК, полученные при помощи лазерного сканирования радиоавтографов, представлены в табл.1. Как видно из полученных данных, замены в З'-концевой части (нуклеотиды 666-573) олигопиримидинового тракта практически не влияли на эффективность трансляции (мутанты 5, 6, 8 и Э) в экстракте клеток HeLa, в то время как замены в 5'-концевой части (нуклеотиды 559-565) значительно снижали синтез белка Р1 (мутанты 1, 2, 3, 4, 7 и 10), при этом наиболее сильно сказывались замены в последовательности ииисс (нуклеотиды 559-5S3). ' Попытка восстановить эту последовательность на 4 нуклеотида ближе к

Таблица 1. Нуклеотидные замены, введенные в ■олигопиримидиновый тракт Б'-НТО полиовирусной РНК, и их-влияние на' матричную активность в экстрактах клеток НеЬа, Крэбс-2 и ЛРК.

Эффективность трансляции {%)

Название мутанта Нуклеотвднвя последовательность в экстрзктеНеЬа

Дикий тип 55батошисстлгаА[лдша(дг575 100

1 556.. 16

2 553.. ...575 11

3 556.. 9

4 556.. ...575 43

5 • 556.. 96

6 556.. ........са..во ...575 70

7 556.. .ах.....ос. .со ...575 8

а 556.. ........сс. .са ...575 104

9 556.. ..........и.00 и..575 88

10 556.. ....00...со... ...575 4

3'-концу 5'-НТО полиовирусной РНК в мутанте 10 (дикий тип -сиоиииссишиАишиАШб, мутант ю - ансштссотисстлтиАот), при этом сохранив звмэны в Б62 и Б63 положениях! характерные для мутанта 3, не привела к увеличению эффективности трансляции мутанта 10 по сравнению с мутантом 3. По-видимому, это указывает на важность позиции олигопиримидинового тракта относительно других цис-дэйствуящих элементов Б'-ИГО полиовирусной РНК. В отличие от трансляции в экстракте клеток НеЬа, производные голиовирусной РНК, имекщие мутации в олигопиримидиновой области, транслировались с одинаковой эффективностью в экстракте клеток Кребс-2 и кроличьем ретикулоцитном лизате (табл.1). Отметим, что описанная тканеспецифическая разница в чувстчительности к мутациям полипирикидинбогатой области полиовирусной РНК-сохранялась при использовании различных партий экстракта.

м- iv! : 3 4 5 4 7 8 !ЮМ

Рис.2 Трансляция мутентннх полговирусных РНК в экстракте клетор НеЬа. Трансляцию проводили при 30°С в течение 60 мин. Концентрация РНК составляла- 1,5 мкг на 25 мкл экстракта. Трек "и" соответствует продуктам трансляции РНК дикогс типа. Цифры 1-10 обозначают названия мутантов I

ос

соответствии с таОл.1. Треки "М" содержат 5-меченж полиовирусные белки, синтезируемые в зараженных вирус с» клетках НеЬа. Грек соответствует экстракту,

инкубированному без добавления вкзогенной РНК. Положение не голе полиозирусного белка Р1 (97 кД) указано справа.

2) Влияние мутирования полипиримидинбогатой области Б'-ШЧ на жизнеспособность полиовируса.

Для выяснения влияния полипиримидинбогатой области Б'-НГС РНК на кизнеспособность вируса нуклеотидкые замены, соответствовавшие последовательностям мутантов 1, 2, 3, 5, 6 и £ (табл.1) при помощи метода направленного мутагенеза были введень в голноразмврнш инфекционные клоны полиовирусной кДНК. Инфекционность вирусных РНК тестировалась в культуре клетор НеЬаШЭ. Вирусы, РНК которых содержала замены в 3'-концевой часта олигопиримидинового тракта (мутанты Б, 6 и В, табл.1), обладал! крупнобляшечным фенотипом, а их титры но отличались от титрг вируса дикого типа штамма На1юпеу (рис.3). -

Вирусные РНК, содержавшие замены в Б'-концевой облает! олигапиршидинового блока (мутанты 1, 2 и 3, табл.1), обладал! очень низкой инфекционностью и давали вирус, обладавши* мелкобляшечнкм фенотипом. После многократного пассированш мутанта 3 (табл.1) удалось получить ревертанты с устойчивы» крупнобляшечным фенотипом. . Сиквэнироввние РНК ревертанто! показало, что ыутантная последовательность • оиотошннгаииАШШ заменялась на сисшиссишиАотии (в трех случаях) или нг сггашишотшАиши (в одном). По-видимому, критическим дш

е

&ремя (ч)

'Рис.3 Кривые одноциклового размножения в клетках НеЬаШЭ полиовируса дикого типа штамма uahoney я мутантов с заменами в полшшримидиновой области (см. табл.1). Мутант б , мутант 8 -({]) , мутант 6 - ф , в клетках HeLaR13.

жизнеспособности полиовируса является наличие пиримидина в положении 562 (и или с), причем скорее всего, наличие с в этом положении предпочтительнее, чем присутствие и. Наличие пиримидина в положении 563 не являлось обязательным условием нормального размножения полиовируса в клетках HeLaK19.

3) Влияние мутирования кодона AUG-586 на трансляцию полиовирусной РНК в экстрактах клеток HeLa и Кребс-2.

По опубликованным литературным данным, полиовирусный aug-5S&-' кодон, являющийся частью структурного элемента yn-xm-aug, важен для эффективной инициации трансляции на вирусной матрице: его замена на aua приводила к трехкратному падению матричной активности в экстрактах клеток НеЪа (Pelletier et ai., 1988). Мы исследовали трансляционную активности полиовирусной РНК с заменой а-586 на g (aug-»-gug) в экстракте клеток hela и Кребс-2.

Производные. полиовирусной РНК быш получены на основе описанной ранее плазмида р!У1 (в)-5'-Р1. Мутацию вводили при помощи" синтетического олигодеэоксирибонуклвотида. Результаты трансляции в вкстрактах клеток ВеЬа и Кребс-2 представлены на ^ис.4.

Замена Аис586 на СТО, сохранявшая локальную вторичную структуру РНК, приводила к трехкратному падении матричной активности полиовирусной матрицы в экстракте клеток НеЬа, однако, не оказывала никакого влияния ка активность в вкстракте клеток Кребс-2. Сходное поведение мутантов по олигопирииидановому блоку и А1гс-586 (являвдимся компонентами структурного алемента Уп-Хш-АШ) в различных трансляционных системах можно рассматривать как дополнительное свидетельство функциональной связи мввду этими цис-действуицими элементами Б'-НТО РНК полиовирусв.

А

• A-5S6-G

Б

«/V&S6-G

PI -

Р1-.

1 234-567 8

1 2 3 4 5 6 7 6

Рис.4 Трансляция полиовирусной РНК, содержащей замену А(586)-»0, в экстрактах клеток НеЬа(А) и ,Кре0с-2(Б). Трансляцию проводили при 30°С в течение 60 мин. Для каждого рпепарата РНК трансляцию проводили при концентрациях матрицы 0,5, 1,0, 1,5 и 2,0 мкг на 25 мкл экстракта.

"4) Влияние изменения нуклеотидного•.контекста aug5s6 на трансляцию полиовирусной РНК в экстракте клеток HeLa и на жизнеспособность вируса.

В Б'-НТО РНК полиовирусв типа 1 (штамм liahoney) инициаторному кодону aug-743 предшествует еще 8 aug, не узнаваемых 4qs рибосомной субчастицей в качестве инициаторных. Последний, восьмой aug586 , консервативный для всех трех capoтипов полиовирусв, /является, как указывалось выше, компонентом структурного элемента Yn-Xm-AUGG, характерного для

всех пикорнввирусов. При этом вакно, что данный АШ кодон полио-и риновирусных РНК не является инициаторным, в то время как у кардио- и афтовирусов с него начинается непосредственный синтез вирусных по'липептидов. Существенно, однако, что Агга-586 в полио-и риновирусных РНК, в отличие от кардио- и афтовирусных, имеет неоптимальный контекст. В настоящей работе исследовалось влияние изменения контекста Аис58в на более благоприятный (лоолисо) на трансляции полиовирусной РНК в экстракте клеток НеЬа. аш-586 образует открытую рэмку считывания для белка с молекулярной массой 7,2 кД, перерывающуюся на 38 нуклеотидов с открытой рамкой считывания, начинающейся с шшцнаторного кодона Аис-743.

wt

(CUUAUGG)

Yn-Xm

AUG743

□d 97kDa

"3 ' 97kDa

mut

(ACCAUGG)

yn-xm

-S=>

aug743 Г7Г

AUG5S4 [

Рис. Б Влияние

17.2 kDa изменения нуклеотидного

—— 7.2 kDa

1 2

контекста AUG586

на

трансляцию полиовирусной РНК в экстракте клеток НеЬа. Сегменты 5'-НТО полиовирусной РНК дикого типа (wt) и мутантной формы (mut) изображены схематически для показа открытых рамок считавишя-и* потенциальных продуктов трансляции. Концентрация РНК составляла 1,5 мкг на 25 мкл экстракта. Трансляцию проводили при 30°С в течение 60 мин. Треки 1 и 2 соответствуют трансляции дикой и мутантной форм полиовирусной РНК, соответственно.

Однако, до сих пор попытки обнаружить данный полипептид при нормальных условиях трансляции РНК дикого типа in vitro не увенчались успехом ни в одной лаборатории. Как показано на рис.Б, изменение нуклвотидаого контекста AUC585 на более благоприятный привело к синтезу короткого полипегггада с молекелярной массой около 7 кД в экстрактах клеток Hela.

Уровень трансляции данного полипептида практически не изменялся в интервале концентраций ионов магния от 1,4 до 2,4 мМ (рис.6), в то время как уровень трансляции с инициаторного кодона AUG-743 при этом значительно снижался- Можно предположить, что

Мд

I

£ ЕЕЕЕЕ

V чз со о см чг

" —: {У СУ ГУ

97kDa

7.2 kDa

5-,

1-

О- о-

1.4

1—I—Г

2.4 тМ

1

Рис.6 Влияние

2 3 4 5

концентрации

6 I

ионов

магния на эффективность

инициации трансляции с AUG743 и AUG586 мутантной полиовирусной РНК в экстракте клеток Hela. Трансляцию проводили при 30°С в течение ,60 мин. Концентрация РНК составляла 1,5 мкг на 25 мкл экстракта. На графике представлена зависимость эффективности трансляции на AUG586 (-о-) и AUG743 (-•—) от концентрации ионов магния, оцененная относительно эффективности трансляции полипэптида р7,2 при 1,4 мМ магния.

описанный ранее сходный по размеру полипептид, синтезировавшийся in uttT-o при высокой концентрации ионов магния, мог быть результатом трансляции на последнем консервативном полиовирусном кодоне AUC586 (Knauert and EfirenTeld, 1979).

Таким образом, AUG-586 является важным цис-действующим элементом, мутация которого приводит к резкому снижению эффективности трансляции в вкстракте клеток Hela, а замена естественного нуклеотидного контекста на более благоприятный делает возможной инициацию трансляции с этого кодона.

Далее мы исслэдсвли влияние изменения контекста AUG586 на жизнеспособность вируса в клетках НеЬан1Э. Замена нуклеотидного контекста AU0686 приводила к получению вируса, обладавшего стабильным Мэлкобляшечным фенотипом, при атом титр мутантного вируса был снижен на 2-3 порядка ло сравнению с титром вируса дикого типа (рис.7).. Однако, полшгептид с молекулярной массой 7 кД при исследовании полиовирусных белков, синтезирующихся in vivo, обнаружен не был, что могло быть следствием его быстрой деградации в клетках HeLa.

А

0 12 4 6 8 Рис.7 Одноцикловые кривые размножения полиовируса дикого типа--

.штамма МаЪопеу (-»-) и мутанта, содержащего замены в нуклеотидном

контексте Аиа586 ( —о—), в клетках ВеЬаН19 - (А). Фенотип

полиовируса дикого типа (1) и мугвнтного вируса (2) - (Б).

6) Влияние введения дополнительных AUG триплетов в положения 611, 614 и 683 РНК нолиовируса на трансляцию в экстрактах клеток HeLa и КреСс-2.

Если, как указывалось выше, инициация трансляции кардао- и афговирусов происходит на AUG кодоне, являющемся чвстью структурного элемента Yn-Xm-AUG, то инициация трансляции полиовирусной РНК происходит на AUGV43, отстоящем от этого структурного элемента на расстояние приблизительно 1Б0 нуклеотидов. Этот участок не является высоко консервативным, и кроме того, монет быть деле тирован без ущерба для кизнеспособности вируса. Таким образом, для описания трансляции Полиовирусной-РНК в настоящее время предложен механизм, согласно которому связывание матрицы рибосомной 40s субчастицвй происходит на участке от 140-го по приблизительно БЭО-ый нуклеотид, а оставшийся участок, те саше 1Б0 нуклеотидов, сканируется рибосомой до встречи с AUG743. Для выяснения роли сканирования в иницкаторном процессе на полиовирусной матрице в неконсервативный район 5'-НТО были введены дополнительные AUG в той .ке рамке считывания, что и AUG743. Новые AUG кодоны вводили в положения 611, 614 и 683. Положение aug-61 1 во вторичной структуре было аналогичным положению ишщиаторного риновирусного кодона. В то же время, в соответствии с литературными данными, основанными на сравнении . нуюгеотидных последовательностей, риновирусному инициаторному кодону должен соответствовать AUG614. Дополнительные лис кодоны вводились в хорошем "козаковском" контексте. Все производные полиовирусной РНК были получены на основе конструкции pFVi (М)-5'~ л Р1, содержавшей под транскрипционным контролем промотора фага ТЗ фрагмент полио'вирусного генома (70-3380) с делецией 794 нуклеотидов (12482042) в районе, кодирующем предшественник структурных белков pi. При этом ожидаемая молекулярная масса 'белкового продукта, при инициации трансляции на AUG743 составляла 20,2 кД, на AUG683 -22,5 кД,.на AUG614 - 24,9 кД, а на AUG611 - 25,1 кД. Результатты трансляции мутантных полиовирусных РНК в экстракте клеток HeLa представлены на рис.8.

Yn-Xm

nt. 683 nt. 743

AUCAUGG AUAAilSG Г-5-У-

AUUAUGG . AUAAUGG(ivf)

cfl=>

АЦ&

zJL

aug-4

U kDa -fl—1 24.9 kDa ~ft~~122.5kDa 120.2 kDa '

AUG-.3.4

(AUG-2.3.4)

(AUG-l^H)

D-' Э-,

24.9 kD 22.5 kD 20.2 kD

•25.1 kD

--22.5 kD

20.2 kB

1 2 3" 21

J 4 AUG: 2 3 4 1 3 4

2.8 Влияние введения дополнительных aug кодонов в позиции 611, 4~й 683 5'-НТО FHK полиовируса на трансляцию вирусной матрицы в стракте клеток Hela. (А) - сегмент б'-НТО голиовирусной РНК эбрэкэн схематически для показа открытых рамок считывания и пекулярной массы потенциальных продуктов трансляции. Трансляцию эбодили при 30°С в течение 60 мин. Концентрация РНК Для каждого шврвта составляла 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 л 2,5 мкг на 25 мкл з тракта (Б). (В) - количественная оценка относительной ансляционной активности различных. aus кодонов, полученная на jobs сканирования радиоавтографов при помощи лазерного зситометра.

При трансляции в экстракте клеток HeLa конструкции, содержавшей aug-683 в aug-743, инициация с кодона aug-743 была в ' 2 раза выше, чем с кодона ¿ug683. При комбинации кодонов 614, 683 и 743 соотношение белковых: продуктов опять было в пользу полипептида, соответствовавшего aug743. Таким образом, aug614 в aug683 не предотвращали инициации на естественном полиовирусноы aug743. Цреобладалцим продуктом трансляции РНК, содержавшей лис триплеты в позициях 611, 683 и 743, был белок, соответствовавший кодону AUG611. Такое преимущество- инициации трансляции с кодона aug611 по сравнении с соседним aug614 не могло быть объяснено различиями в нуклеотидном контексте. Однако, и в атом случав Инициация с кодона aug743 продолжалась и была более эффективной, чем с кодона AUG683. Принципиально аналогичные результаты были получены и при трансляции в экстракте клеток Кребс-2. Полученные результаты не могли быть полностью описаны в рамках сканирующей модели инициации трансляции.

6) Влияние .введения стабильной шпилечной структуры в положение 627 полиовирусной РНК на трансляцию в экстрактах клеток HeLa в Кребс-2.

Для дальнейшего изучения роли сканирования в зшициаторном лроцесое нв полиовирусной РНК в неконсервативный район ее Б'-НТО в положение 627 была введена стабильная шпилечная структура с энергией -50 ккал/моль (рис. 9 А). Шпилька вводилась в две конструкции, (М)-5'-лЯ, одна из которых содержала только нативный инициаторный кодон AUG743, а другая содержала также дополнительный АШкодои в положении 683. Введение шпильки по-разному влияло ва трансляцию с кодонов aug-743 и aug-683 (рис. 9 Б) в' экстракте клеток Кребс-2. При атом, инициация с кодона aug-683 снижалась приблизительно на 7056, а с; кодона АШ743 -практически, не изменялась- Качественно' аналогичный эффект был получен и при трансляции в экстракте клеток HeLa. Таким образом, из полученных данных следует, что наряду со сканированием в выборе шициогорного ; полиовирусного кодона может быть задействован дополнительный . механизм, обеспечивающий прямую посадку 40S рибосомной субчастицы

А

N

а « 2! / <0 к

АО

гг^и>а

20.2 кСЮ

АЦ5-743

А1КЗ-743 + 54«. 5ТЕМ

а1к5-683/743

А1Хэ-693/743 + 54«. ЭТЕМ

Б

II

I

>1

1 2 3 А 5 6 7 8 9 Ю 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рис.9 (А) - элемент вторичной структуры Б'-НТО полиовирусной РНК и стабильный шпилечный элемент, встроенный в положении 627. (Б)-влияние стабильной шпилечной структуры на трансляцию с АисбвЗ-~й Аио743 полиовирусной РНК в экстракте клэток Кребс-2. Концентрация РНК для каждого препарата составляла 0,5, 1,0, 1,6, 2,0, и 2,5 мкг на 25 мкл экстракта. (В) - количественная оценка относительной трансляционной активности АШг кодонов, полученная по результатам лазерного сканирования радиоавтографов.

л

на этот кодон. G другой стороаа, полученные результаты могут объясняться и тем, что 40s рибосомная субчастица не емеет точного' места старта сканирования таким образом, может начать его с разданных точек внутри неконсервативного участка длиной 1Е0 ° нуклэотидов 5'-НТО полиовирусной РНК. Результаты проведенных экспериментов не позволяют сделать выбор между этими двумя возможными объяснениями.

2. Изучение клеточных . транс-факторов, специфически взаимодействуш с 5'-НТО полиовирусной РНК.

1) Исследование белков клеток НеХа, взаимодействующих с Б'-НГО РНК полиовирусв.

За последние года в литературе накоплены данные о том, что в кэп-независимый механизм инициации трансляции пикорнавирусных РНК вовлечен ряд транс-действующих клеточных факторов. Использование

оо

метода УФ-стшб0Ейя ""Р-мечешх фрагментов вирусных РНК с белками различия фракций бвлок-сянгеэируадих систем позволило выявить клеточные компоненты, специфически взаимодействующие с различными районами Б'-НЮ. Так, был описан белок р52 клеток HeLa, специфически связыващийоя с рейоном ББ9-624 Б'-НГО полиовирусной РНК (líeerowitoh «t al., 1989), и белок р57(Б8) клеток Крвбс-2 И ретикулоцитов кролика, специфически взаимодействующий с фрагментом 250-488 Б'-НГО РНК вируса энцефаломиокардита (ЕЭМК) (BorovjJagin o-t а.!., 1990, Jang and. WÓJnmer, 1990).

В настоящей работе при помощи метода УФ-сшивок проведено исследование белков экстракта клеток Hela, взаимодействущих с фрагментом 70-627 полиовирусной РНК. Как видно из рис.10, с данным фрагментом взаимодействовал широкий спектр клеточных белков с молекулярной массой от 30 до 120 кД. Для выяснения специфичности взаимодействия были приведены эксперименты по конкуренции полиовирусной РНК и кроличьей рибосомной РНК за связывание с этими белками. После добавления к пробе для УФ-сшивания, содержавшей экстракт клеток HeLa, возрастающих количеств немеченой кроличьей рибосомной РНК связывание с 32Р-мвчаным фрагментом полиовирусной РНК практически всех белков, за исключением белка с молекулярной массой 57 кД, прогрессивно

о

уменьшалось (рис.10). При этом беле р57 комигрировал с белком р57, специфически взаимодействующим с фрагментом 260-488 ГТО ВЭМК. Идентичность в тих. белков била подтверждена в опытах по конкуренции'. Добавление немеченого фрагмента 260-488 РНК ВЭМК в пробу для УФ-сшивания практически полностью подавляло связывание белка р57 о фрагментом полиовирусной РНК (рис.10).

70-627 Б'-НТО полиовирусной РНК. (А) - в присутствии возрастающих количеств кроличьей рРНК (трек 2-1 мкг, трек 3-2 мкг, трек 4 - 3 мкг рРНК на 25 мкл пробы). Трек 1 - белки экстракта клеток НеЬа, взаимодействующие с фрагментом 260-488 РНК ВЭМК. (Б)- в присутствии фрагмента 260-488 РНК вируса енцефаломиокардита (трек 1 - без добавления конкурентной РНК, трек 2 - в присутствии 0,4 мкг на 25 мкл пробы фрагмента 260-488 РНК ВЭМК).

Так как, в соответствии с литературными данными, белой р57, по-видимому, играет важную роль в инициации трансляции РНК ВЭЫК, в настоящей работе в экспериментах по конкуренции исследована роль белка р57 в инициации трансляции на полиовирусной матрице. Добавление в трансляционную смесь

возрастающих количеств кроличье* рРНК ве приводило к сшивнию эффектишости трансляции шяиовируснай матрицы (рас.11), в то' время как добавдвнве фрагмента 260-488 РЦК ВЭМК в соотношении 6:1 и 10:1 (всего 0,4 s С,8 мкг на 25 мкл экстракта) практически полностью ингнбиров&ш трансляцию ПОЛИОВИРУСНОЙ РНК (рис.11). Описанное ингиСирузцэе действие фрагмента 260-488 РНК ВЭМК на трансляцию подиовируаной РНК было весьма специфично: добавление такого же количества данного йрагывнта к трансляционной смеси практически не сказываюсь на вффекпшностн трансляции глобиновой (рис.11). Таким образом, продемонстрирована корреляция между способностью годКЖЩруоной РНК связывать белок р57 и направлять белковый синтез, позволяющая сделать предположение о возможности участия белка р57 в процессе квп-нвзависимой инициации трансляции но РНК полиовируса.

1 2 3 4 5 6

и!........

Б 12 3

! ' ■ Globin ——— -

Рис.11 (А) - влияние кроличьей рибосомной РНК и фрагмента 260-488 ■РНК ВЭМК на трансляцию полиовирусной РНК В. экстракте клеток Hela. Трек 1 - продукт трансляции полиовирусной РНК в otcí -;твии конкурента, треки 2, 3, 4 - в присутствии, соответственно, 1,5, 2,0 и 2,5 мкг кроличйёй рибосомной РНК, треки 5, 6 - в присутствии, соотв., 0,4 .и 0,8 мкг фрагмента 260-4US РНК ВЭМК. (Б)- влияние фрагмента 260-488 РНК ВЭМК на трансляции глобиновой мРНК. Грек 1 - продукт трансляции глобиновой РНК в отсутствии конкурента, треки 2 и 3 - в присуствш 0,4 и 0,8 мкг фр:."мента 260-488 РНК ВЭМК.

2) Некоторые свойства и частичная очистка белка р57 из клеток Крэбс-2.

Простота выращиваячя клеток, возможность получения их в большом количестве и относительная дешевизна определили выбор клеток асцятной карциномы мышей Кребс-2 в качестве источника для выделения белка р57. За процессом выделения следили по УФ-

сшиванию фракционируемы! белков с Р-меченым фрагментом 2S0-488 Б'-НТО РНК ВЭМК. Основная часть цитоплазматического белка р57 была ассоциирована с рибосомами. Промывка рибосом осуществлялась ступенчато с использованием двух концентраций KCl - 0,2 и 0,5 М. Такой метод позволил добиться частичной очистки белке уже на этой стадии. Относительное содержание белка было вначительно вше во фракции, полученной о использованием 0,2 М KCl, которвя и была использована для последующей очистки.

TJ О о

У о

ю — Ö о

О О О

м

V ю

о см о О

J 1-:_I

DEAE Р-11

Рис.12 Очистка белка р57 из клеток асцитной карцинош кребс-2.

В качестве второго этапа использовалось фракционирование сульфатом аммония. При этом белок р57 оказывался во Фракции, осаждаемой между 25 и 40J6 насыщения сульфата аммония. Данную фракцию диализовали против буфера, содеркавшенго 0,1 М К01,-"*й* наносили на колонку с ДЭАЭ-цэллюлозой. Белок р5? не связывался с носителем (рис.12). Далее фракцию, содержавшую р57, наносили на колонку с фосфоцоллшгазой (р-11). при ступенчатой элюции р57 обнаруживался во фракции, элкируёмой буфером с 0,4 М KCl

(рис. 12).Эту фракцию диализовали и концентрировали. Полученный препарат был значительо обогащен белком р57, при этом чистота' белка, оцениваемая по УФ-сшшанию, превышала 95%.

На радиоавтографах белок р57 появлялся в виде дублета, а при хорошем разрешении - в виде триплета и даже квадруплета. Нам не удалось разделить различные формы р57, что может свидетельствовать об их очень высокой гомологии. Интересно отметить отличие между белками из клеток НеЬа и Кребс-2. В случае белка из клеток Кребс-2 соотношение между различными формами смещено в сторону низкомолекулярных, в то время как для белка из клеток НеЬа оно сдвинуто в пользу более высокомолекулярных форм. Важно также подчеркнуть, что частично очищенный белок р57 ооладал более низкой специфичностью по сравнению с белком, находящемся в экстракте. Это обстоятельство может объясняться тем, что р57 функционирует в экстракте в составе высокомолекулярного комплекса с другими белками, повышающими специфичность связывания р57 с мРНК.

3) Возможная идентичность белка рБ7 и ядерного полипиримидин-тракт-связывввдего белка рРГВ.

Сходные физико-химические свойства, проявляемые на идентичных стадиях очистки, сходная специфичность, а именно обязательное наличие олигопиримидинового 'тракта во всех РНК пробах, идентичность молекулярного веса и, наконец, появление на радиоавтографах после УФ-сшивания в виде дублета позволили сделать предположение о возможной родственной связи между р57 и ядерным полипиримидин-тракт-связываицим белком рРТВ (Garoia-B3.an.oo et аг., 1989, вП et а\., 1991, Ра-Поп е-ь а.1., 1991). Для проверки гипотезы была использована иммунная сыворотка против экспрессированного в е.ооХ 1 белка рРТВ клеток НеЬа, а также против его ы-концевого 20-члёкного пептида, любезно предоставленные д-ром Аной Гил. Результаты иммунопреципитации показаны на рис.13. Использованные иммунные сыворотки специфически преципитиравали белок р57 из экстракта клеток НеЪа, а также частично очищенный белок р57 из клеток Кребс-2. Полученные данные свидетельствуют если не об идентичности данных белков, то по крайней мере, об их высокой родственной связи.

к ф

НеЬа р5 7

I 5 я 5- 5 II 5 * д- т> I

1 ч з* 2. % 1? ^ а | % I |

97.4 кОа-

69 кОа- л-.

46кОа—

I

□ р57

30 кОа----

Рис. 13 Взаимодействие белков экстракта клеток НеЬа я очищенного из клеток Кребс-2 белка р57 с иммунной сывороткой против белка рРГВ, а также с преиммунной сывороткой.

4) Влияние иммунной сыворотки против белка рРГВ на трансляцию РНК вируса полиомиелита.

Обработка трансляционной смеси иммунной сывороткой против белка рРГВ, а также против его 20-членного пептида оказывала ингибирующее действие на трансляцию полиовирусной РНК, аналогичное описанному выше действию р57-связывающего фрагмента" 260-488 РНК ВЗМК <рис.14). При этом для синтеза полиовирусной РНК использовалась описанная выше плезмида рР71 (М)-5'-йР1, кодирущая полипептид л Р1 с молекулярным весом 20 кД. В то же время обработка иммунной сывороткой трансляционной смеси не оказывала никакого влияния на трансляцию глобиновой мРНК.

ДР1 -

-globinj

Poliovirus 1 (M) B-globin

Рис. 14 Влияние обработки трансляционной смеси иммунной сывороткой против Оелка рРТВ и его 20-членного пептида на трансляцию полиовирусной и глобиновой матричных РНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Известно, что участок Б'-НТО полновирусной РНК мевду 140 и 590 нуклеотидами является ответственным за осуществление кэп-независимого связывания 40s рибосомной субчастицы с голиовирусной матрицей. Вблизи 3*-границы • этого участка расположен характерный для всех пикорнавирусов элемент Yn-Xm-AUG (где Y-пиримидин, х-любой нуклэотид, а т. колеблется от 15 до 25). Проведенное в данной работе мутирование полипиримидинового тракта и aug-586 данного структурного элемента выявило важную роль этих компонентов в инициации трансляции на полиовирусной РНК. aug-586 не обладает оптимальным нуклэотидным контекстом и не является инициаторным кодоном РНК полиов1фуса. Как показали наши исследования, изменение нуклвотидного контекста aug-586 на более благоприятный сделало возможной инициацию белкового синтеза на этом кодоне. Возможность инициации белкового синтеза с aug-586 свидетельствовала о том, что 40s рибосомная субчастица непосредственно связывается с районом кодона AUG-586 или с участком РНК, расположенным ближе к 5'-концу матрицы. В связи с этим возникает вопрос, если рибосома связывается с участком полиовирусной РНК от 140 по 590 нуклэотид, то как она достигает естественного полиовирусного инициаторного кодона AUG-743. Для исследования, данного процесса в настоящей работе были .получены производные полиовирусной РНК, содержавшие дополнительные aug кодоны и стабильную шпилечную структуру на участке от 590 по 743 нуклеотид. Введение дополнительных AUG и стабильной шпильки не предотвратило инициации на AUG-743. Таким образом, полученные

результаты не могли Сыть в полной мере описаны в рамках сканирующей модели, и, по-видимому, помимо сканирования данного участка полиовирусной РНК в процесс инициация еэ трансляции может быть вовлечен дополнительный механизм, обеспечивающий непосредственное связывание 40s рибосомной субчастицы с AUG743.

В последнее время в литературе появились данные, свидетельствующие о том* что в процесс кап-независимой инициации трансляции на полиовирусной матрице помимо цис-действующих элементов матрицы вовлечены такие транс-действующие клеточные факторы. В данной работе с помощью метода УФ-сшивания белков экстракта клеток Hela с фрагментом 70-627 Б'-НТО полиовирусной РНК удалось выявить специфически взаимодействующий с

использованным фрагментом белок р57 клеток НеЬа, идентичный описанному ранее в литературе белку р57, взаимодействующему с 5'-НТО вируса энцефаломиокардита. Нами также проведена частичная очистка этого белка из клеток КреСс-2 и установлена его идентичность описанному в литературе ядерному полипиримидин-трвкт-связнващему Сэлку рРТВ, предположительно принимающему участие в сплайсинге. Обработка антителами к белку pFTB, ' трансляционной смеси приводила к специфическому ингиоированию инициации трансляции на полиовирусной матрице, что позволило сделать предположение о возможной роли белка р57 в кэп-независимой инициации трансляции на полиовирусной матрице, вывода.

1. При помощи направленного мутагенеза выявлена важная роль в инициации трансляции на полиовирусной РНК полипиримидинОогатой области и последнего консервативного AUG-586 кодона, являющихся частью характерного для Б'-НТО всех пикорнавирусных РНК структурного элемента Yn-Xm-AUG.

2. Показана возможность инициации трансляции с кодона aug-586 при замене его естественного нуклеотидного контекста на более благоприятный.

3. Результаты введения дополнительных AUG триплетов . р-неконсервативный район (нуклэотида 590-742) 5'-НТО полиовирусной РНК, а также стабильной шпилечной структуры с энергией -£/Г ккал/моль в положение 627 дали указание на возможности, существования наряду со сканированием дополнительного механизм;..

. обеспечивающего прямую посадку 4OS рибосомной субчастицы на полиовирусный шицваторвнй кодон aug-743 .

4. При помог® метода Уф-сшивания показано специфическое взаимодействие Б'-НТО полиовирусной РНК с белком рБ7 клеток НеЬа, идентичным описанному в литературе белку р57, взаимодействующему с 5* -НТО вируса енцефалоыиокардита.

5. Проведена частичная очистка белка р57 из клеток Кребс-2 и установлена идентичность р57 и описанного в литературе ядерного белка рРТВ, предположительно принимающего участив в сплайсинге.

6. Получены указания на возможную роль р57 в кап-независимой инициации трансляции на полиовирусной матрице.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ГО ТБМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1) Jang, S.K., Pestova, I.V., Hellen, C.U.T., and Wiimier, E. 1990. Gap-independent translation of pioornavirus HNAs: вtruoture and function of the internal riboeomal entry Bite. Enayme. 44: £92-309.

2) Peetova, T."V., Hellen, C.U.T., and Wimmer, E. 1991. Translation of poliovinjв RHA: role of an eBBential oie-aotirjg oligopyrimidine element within the 5' nontranslated region and involvement of a cellular 57-kilodolton protein. J. Virology. 65: 6194-6204.

3) Jang, S.K.,' Peetova, 1.7., Witherell, G., and Wimmer, E. Cap-independent translation of pioornavirus RNAs: Struoture and funotion of the internal riboBomal entry site. Abstracts ot Keyetone Symposia on Holeoular and Oellular Biology "Tranelational oontrol", Colorado (1991).

4) Hellen, O.U.T., Peetova, T.V., and Wimmer, E. StudieB on the Initiation of Poliovirus Protein BynthesiB. Abstracts of Symposia "Europio'91 ". Canterbury, England (1991), Б4.

5) E. Winner, Hellen, O.U.T., Witherell, G., Sohmid, M., Peetova, T.V., Molla, A., Paul, A.V., Shin, S.H., Alexander, 1. and Gil,A. Cap-independent translation of pioornavirusee: Proof for internal ribOBOinal entry, and ois- and trans-aoting elements involved in the funotion of the internal riboeomal entry Bite (3RES). AbBtraotB of the Third International Positive Btrand SNA Bimposium, Clearwater, PL, USA (1992), Б5-6.

6) Wimmer, E., Hellen, C.U.T., Jang, S.K., bitterest, Ы.,

Bolls, A., Peetova, T.T., faul, A., and ffitheroll, ß. Funotion of the IKES element of pioornavirus. AbetraotB of the International Meetings on Biology, Workshop on "The Regulation of ¡Translation in Animal Viruß-Infeated Cello". Spain <1991), p.18-19.

7) Winmer, E., Hellen, C.U.T., Witherell, G., Sohmid, M., PeBtova, T., Holla, A., Jaul, A.7., Shin, S.H., Gil, A., Jang, S.K. Cap-independent translation of pioomaviruBes - Proof for internal ribOBOin&l entity, and ois- and trans-aoting ■ elements involved in the funotion of. internal riboBomal entry site. Meeting on TranBlational Control. Cold Spring Harbor. USA (1992), p.2.