Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурная и функциональная характеристика тандема олигопиримадин/AUG- нового трансляционного ЦНС-действующего элемента в геноме полиовируса

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Структурная и функциональная характеристика тандема олигопиримадин/AUG- нового трансляционного ЦНС-действующего элемента в геноме полиовируса"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА II ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. МЛ. ЧУМАКОВА

РГ8 ОД

? 7 ;''; 5 V-1 и

' • ' - на правах рукописи

УДК 576.852.23

Гмылъ Анатолий Петрович

Структурная и функциональная характеристика тандема олигопирими/цш /AUG - нового трансляционного .гр/с-действующего элемента в геноме нолионируса

03.00.06 - вирусология

автореферат диссертант! уча соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

1996

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН

Научный руководитель:

Член—корр. РАМН, доктор биологических наук, профессор В. И. АГОЛ

Официальные оппоненты:

Член —корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор Н. В. Каверин

Доктор биологических наук II. П. Родионова

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН

Защита состоится

/У Ш?1Ър

1996 г. в 10°о часов на заседании

диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан /У 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О. А. Медведкина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы

Проблема регуляции экспрессии гена является одной из наиболее важных л интересных. Регуляция экспрессии может осуществляться как на уровне трансляции, так и на ypomie транскрипции. Регуляция трансляции эукариотических мРНК остается недостаточно изученной, несмотря на большую научную значимость. Особенный интерес представляет механизм инициации трансляции эукариотических мРНК. Он определяет скорость трансляции, н, в конечном итоге, эффективность экспрессии генома. Для объяснения механизма инициации трансляции эукариотической мРНК была предложена сканирующая модель (Kozak, 1978; 1981). Согласно этой модели, рибосома связывается с молекулой мРНК вблизи 5'-конца, затем сканирует ее до первого AUG с подходящим нуклеотидным окружением, с которого и начинается синтез белка. Однако эта модель не может объяснить инициацию трансляции ряда эукариотических мРНК, имеющих протяженную 5'-нетранслируемую область (5НТО) с многочисленными AUG-триплетами, не являющимися инициаторными кодонами, в частности, инициацию трансляции полиовирусной РНК.

Для мРНК данного класса было выдвинуто предположение о существовании альтернативного кэп-независимого механизма инициации трансляции, заключающегося в присоединении 40S рибосомалыюй субъединицы (либо рибосомы) к внутреннему сегменту 5НТО мРНК. Данный тип инициации трансляции получил название внутренней, а цис-сегмент РНК, обеспечивающий посадку рибосомы, - IRES. Внутренняя инициация трансляции, вероятно, опосредована многоточечным взаимодействием рибосомы с IRESom. Выявление структурных и функциональных особенностей организации IRESa способствовало бы пониманию нового механизма инициации трансляции. Помимо фундаментального значения в понимании механизмов реализации генетической информации и ее регуляции, подобные исследования представляют и чисто практический интерес, поскольку внутреннее

связывание рибосом происходит при трансляции важной группы клеточных мРНК (онкогены, регуляторы развития и др.).

Удобным объектом для изучения внутренней инициации трансляции является вирус полиомиелита. Полиовирус является представителем семейства пикорнавирусов - небольших икосаэдрических вирусов, вызывающих различные заболевания у человека и животных. Геном полиовируса состоит из одной однонитевой молекулы РНК позитивной полярности длиной около 7500 нуклеотидов, иа которой осуществляется синтез всех вирус-специфических белков. Особенность РНК полиовируса -наличие протяженной (740 нуклеотидов) 5'-нетранслируемой области (5НТО). Именно на примере полиовируса впервые было доказано существование принципиально нового для эукариотических мРНК механизма внутренней инициации белкового синтеза.

Получение фундаментальных знаний о строении н функциональной значимости отдельных элементов 5НТО полиовируса способствовало бы детальному пониманию механизма внутренней инициации трансляции, что открывает перспективы в разработке новых живых вакцин н других противовирусных препаратов, как для полиовируса, так, возможно, и для других пикорнавирусов.

1.2. Цель и задачи исследования

Перед началом выполнения данной работы Е. В. Пилипенко с соавторамими было показано, что IRESbiBcex пикорнавирусов по сходству первичной и вторичной структур РНК делятся на две основные группы: в одну группу входяг все энтеро- и риновирусы, а в другую - кардно- и афтовирусы. Существенно различаясь по нуклеотидной последовательности и имея различные типы укладки IRESob, геномы всех пикорновирусов имеют вблизи 3' границы IRESob один общий, абсолютно консервативный элемент (названный нами ОАТ) - тандем, состоящий из олигопиримидинового блока и триплета AUG (молчащего - у энтеро- и риновирусной группы, шшццаторного - у кардио- и афтовирусной группы), разделенных между собой слабоструктурированным спейсером длиной 2024 иг. Поскольку, ОАТ яв.тяегся единственным общим для

пикорнавирусных IRESob элементом, мы предположили, что он принимает непосредственное участие в посадке рибосомы на внутренний участок РНК и поставили перед собой задачу структурно и функционально его охарактеризовать. Для решения этой задачи мы использовали следующий подход: (1) направленный мутагенез О AT РНК вируса полиомиелита типа 1 (штамм Mahoney) и исследование биохимических и биологических свойств модифицированных матриц в системах in vitro и in vivo-, (2) отбор и изучение вирусов-ревертантов с полным или частичным восстановлением функции поврежденного ОАТ; (3) на основе накопленных данных — структурная и функциональная характеристика этого элемента.

1.3. Научная новизна н практическая ценность работы

На основе полиовируса типа 1, штамм Mahoney (представителя энтеровирусов), было создано более 20 рекомбшгантиых геномов с делениями, вставками и точечными нуклеотидными заменами в области ОАТ. Были изучены матричные активности рекомбииантных РНК, инфекционность и бляшечный фенотип мутантов. Из ряда мутантных вирусов с ухудшенной репродуктивной способностью было отобрано и изучено более 40 различных псевдоревер-г-ттов с частичным восстановлением функциональной активности. Была определена первичная структура РНК всех ревертантов в районе ОАТ. lía основе эглх данных был охарактеризован новый трансляционный регуляторный цис-элемент РНК, определяющий эффективность внутренней инициации трансляции -тандем олигопиримидинового блока (комплементарного З'-концу 18S рйбосома/гькой РНК) и AUG (молчащего либо шшциаторного) на определенном (15-30 нуклеотидов) расстоянии от него. Выдвинута гипотеза о сходстве внутренней инициации трансляции эукариотических .мРНК с прокарнотической инициацией трансляции. При этом, у эукариотических матриц имеются два существенных отличия: во-первых, необходимо наличие протяженного дие-элемента (IRESa), и, во-вторых, AUG выступает в ролл сигнала, не обязательно означающего начало белкового синтеза (трансляция начинается только в том случае, когда AUG имеет инициаторный контекст). Поскольку все представители энтеровирусов

имеют одинаковую с полиовирусом структуру IRESa, вышеизложенные результаты были экстраполированы на всю группу, что в дальнейшем получило подтверждение в работах других авторов на отличных ст полиовируса объектах.

1.4. Апробация работы

Материалы работы были доложены и обсуждены на международных съездах, симпозиумах и конференциях: "Регуляция трансляции в вирус-инфицированных клетках животных" (Мадрид, 1991), "Биосинтез белков" (Пущино, 1991), "Трансляционный контроль" (Колд Спринг Харбор, 1992 и 1994), "Генетическая рекомбинация и дефектные интерферирующие частицы у РНК-содержащих вирусов" (Мадрид, 1994), "Молекулярная биология иикорнавирусов" (Корпилампи, Финляндия, 1994); на IX Международном Вирусологическом Конгрессе (Глазго, 1993), III Всероссийской конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино, 1993), а также на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

1.5. Структура диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из традиционных разделов.

Диссертация содержит 25 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 156 источников.

1.6. Использованные сокращения

5НТО - 5'-нетранслируемая область; IRES - внутренний сегмент присоединения рибосомы; ВЭМТ - вирус энцефаломиелита мышеи Тейлера; ОРС - открытая рамка считывания; RRL - ретикулоцитный лизат кроликов; нт - нуклеотид(ы); О AT - олнгопиримидин/AlJG тандем; КПЗМ - клетки почек зеленых мартышек.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние вставок внутри О AT гепома вируса полиомиелита на инфекциопиостъ и матричную активность мутантных траискриптов. Структура геномов и матричная активность отобранных ревертантов

' В полноразмерной кДНК лолиовируса в правой части олигопиримидинового блока был создан сайт для рестриктазы Pstl. Транскрипт pPVl/ОЗ, полученный с мутантной плазмиды, был инфекционным. Однако, средний размер бляшек уменьшился в два раза по сравнению с таковым у дикого типа (табл. 1).

Используя искусственно созданный PstI сайт, мы получили четыре мутантные плазмиды, содержащие различные синтетические вставки: р23Р, р23М, р39Р и рЗЭМ (табл. 1). В плазмиду р23М по имеющемуся во встроенном олигонуклсотиде сайту Bglll встроили дополнительно такой же 23 членный олигонуклеотид. В результате была получена плазмида р4в, содержащая вставку 46 нт (табл. 1).

Транскрипты 4-х (из 5-ти) вышеописанных инссрциопных мутантов оказались инфекционными при трансфекции клеток КПЗМ. В случае мутантов р23М и р23Р бляшки появлялись на третий день после трансфекции и имели средний размер около 1 мм (табл. 1); в случае конструкции рЗЭМ мельчайшие бляшки появлялись только на пятый день. При трансфекции транскриптом р46 единственная бляшка появилась на 14-й день. Несмотря на то, что трансфекщш транскриптом р39Р повторяли многократно, ни одной бляшки получено ие было.

После трансфекции транскриптом р23М была отобрана одна первичная мелкая бляшка. После двух последовательных клонирований из гетерогенного по размеру бляшек вирусного потомства было отобрано восемь крупнобляшечных клопов. Секвснирование участка РНК (от 400-го до 600-го нуклеотида) этих изолятов показало, что два генома (табл. 2) приобрели одинаковую трансверсию U^G, приводящую к появлению AUG. Геномы остальных ревертантов в результате делений потеряли полиостью (Р23М-( 10)27) или частично введенную вставку, порой вместе с

прилегающими к ней нуклеотидамн РНК дикого типа (табл. 2). Любопытно, что среди шести делеционных ревертантов не было одинаковых делений.

Из одной бляшки, образовавшейся после трансфекции транскриптом р23Р, было получено три крупнобляшечных клона. Геномы всех трех являются делециопными ревертантами, и снова нет одинаковых делений (табл. 2).

После трансфекции транскриптом р39М было отобрано четыре мельчайших бляшки (a-d). Вирусный материал каждой из бляшек использовали для заражения свежей культуры. После полной дегенерации клеток вирусный пул был клонирован на КПЗМ под агаровым покрытием. Из гетерогенного потомства каждой из четырех бляшек были отобраны относительно крупнобляшечные клоны. За исключением P39Md-44, геномы всех ревертантов, в результате транзиций G=>A (в трех различных местах вставки) приобрели один или два AUG внутри вставки (табл. 3). Геном вируса p39Md-44 потерял 26 З'-концевых нуклеотида вставки и два прилегающих к вставке уркдиловых остатка последовательности дикого типа. Некоторые ревертанты приобрели одну или две дополнительные точечные мутации.

Секвенирование РНК вируса из единственной бляшки, полученной после трансфекции транскриптом р46, показало, что он является делеционным ревертантом и в его геноме отсутствует вся введенная вставка вместе с примыкающим к ней остатком U (табл. 2). РНК, в геноме которых должны произойти некоторые изменения для получения инфекционного потомства, мы назвали квазн-инфекционными.

У ряда ревертантов была определена первичная структура всей 5НТО и никаких дополнительных мутаций, кроме перечисленных в табл. 2 и 3, обнаружено не было. Таким образом, именно вышеперечисленные реверсии обуславливают почти полное восстановление нарушенной в результате вставок, функции ОАТ.

Мы предполагали, что ОАТ является регуляторным трансляционным дяс-действующим элементом. Поэтому наблюдаемые биологически эффекты

Таблица 1. Мутаитные конструкции иолиовируса и некоторые их свойства

мутант

. нуклеотидная последовательность

ннфекци-онность

размер бляшек

матричная активность

расстояние между биксом А и АиО

рРУ1 МаЬ

РРУ1/03 рРУ1/РМ1 рРУ1/РМ2 рРУ1/РМЗ

рР\'1/03/Д4 рРУ1/03/Д6 рРУ1/03/Д7 рРУ1/03/Д8 рРУ1/03/Д10

рруг/оз/гзм

рРУ1/03/23Р рРУ1/03/39Р рРУ1/03/39М рР\71/03/4 б рРУ1/03/24Р

559 573

I . А

ТТТССТТТТА..............................................ТТТТА +

ТТТССТдсад..............................................ТТТТА +

ТаааСТТТТА..............................................ТТТТА

ТааааааааА..............................................ТТТТА

ТТТССТТТТА..............................................ТТТТА

(ааа^Т

ТТТССд..................................................ТТТТА +

ТТТСС...................................................-ТТТА +

ТТТСС...................................................— ТТА +

ТТТСС......................................................ТА

ТТТ........................................................ТА

ТТТССТТТТА^^а^даа^ада!!^...........................ТТТТА +

TTTCCaqatctaattcaataaaataaaaq.......................: . . .ТТТТА +

ТГГССада^^дааасасдсасссааадд^дд^с^да^.ад...........ТТТТА

TTTCCTgatcaggaaocgacctttgggtgcgtgttt(!cagatctg...........ТТТТА +

ГГТГСТТТТА^^а^даа^ада^^а^Ма^даа^адаЬ^даЪс^дТТТТА TTTCCTTTctttttgattgttgcttatggg.........................Т'ТТТА +

8.0

4.0

6.5 3.0 <1.0

1.0 1.0

<1.0

6.5

1.0

0.05 0.03 0. 02 0. 02

0.35 0.30 0.12 0.05 0.02 0.10 0.08 0.02 0.07 0.02 0.30

22

22

22

18 16 15 14

41 41 57 57 68 20

Замененные и вставленные нуклеотиды обозначены маленькими буквами, а делении - дефисами. Точки использованы для выравнивания. Размеры бляшек (мм) даны на третий день после траисфекции транскршпо.ч, за исключением рРУ1/'03/Д7 и рРУ1/03/39М:, в случае которых бляшки появились на 4-й и 5-й день, соответственно. - кваэи-инфекццонрые конструкции. (см. т<кст).. Матричная активность транскрипдоз определена в экстракте Кребс-2. В таблице приведено расстояние в нт между боксом А (1ШиСС, подчеркнуты ¿плотной линией) и ЛиС586 (в таблице не показан). Дополнительная копия бокса А в геноме рРУ1/03/39М подчеркнута пунктирной линией.

Таблица 2. Структура геномов и бляшечный фенотип ревертантов, отобранных из потомства мутантов р46, рРУ1/03, р23М и р23Р

название расстояние размер нуклеотидная последовательность "Т/дисТ бЛЯШМ<

PV1 Р46-24 PV1/03-(23)103 589 i 4- UUUCCUUUUA--------------------UUUAUUGUGGCtJGCUUAUGG 21 UUUCCUGCuG...................UUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 22 7.0

р23М Р23М-(7)21 Р23М-(7)58 Р23М-(7)60 Р23М-(5)17 Р23М-(5)18 F23M-(10)27 F23M-(8)53 Р23М-(8)57 UUUCCUUU'JAUIJUUAUUGAAUUAGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 41 UUUCCUUUUA------------AGAUCUGUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 29 UUUCCUUUUAUUUUAUUGAAUUAGAUCUGUUUUAUgGUGGCUGCUUACJGG 28 6.0 UUUCCUUUUAUU'JUAUUGAAUUAGAUCUGUUUUAUgGUGGCUGCUUAUGG 28 UUUCCUUUUAUUUUAUU----------------AUUGUGGCUGCUUAUGG 25 5.5 UUUCCUUUURU------------------UUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 23 UUUCCUUUUA-------------------UUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 22 6.5 UUUCCUUUUAUUUUAUUGA--------------AUUGUGGCUGCUUAUGG 27 8.0 UUUCCUUUUAUUU---------------------UUGUGGCUGCOUAUGG 20 6.5

р23Р Р23Р-14 Р23Р-15 Р23Р-16 UUUCCAGAUCUAAUUCAAUAAAAUAAAAGUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 41 UUUCCAGAUCU----------AAUAAAAGUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGG 31 5.5' UUUCCAGAUC----------------------UAUUGUGGCUGCUUAUGG 19 6.5 UUUCCAGAUCUA-------------------UUAUUGUGGCUGCUUAUGG 22 7.5

Бокс А (пенгапиримидиновая последовательность UUUCC) и AUG подчеркнуты. Спонтанные точечные замены и делении, обнаруженные в геномах ревертантов, обозначены жирными маленькими буквами и дефисами, соответственно. Остальные обозначения такие же, как в табл. 1.

Таблица Структура геномов и некоторые свойства ревертантов, отобранных из потомства мутанта рЗЭМ

название

нуклеотидная последовательность

расс /оянис между боксом а и аио

размер бляшек

матричная активность

РУ1

559 589

I 4.

иииссиииид...................................цццидоис-исссиссиидцсс

рЗЭМ Р39Ма-1 РЗЭМа-(1)39 Р39Ма-(1)40 РЗ 9Ма-2 РЗЭМа-3 РЗЭМа-(3)32 Р39Ма-(3)42 РЗЭМа-4 РЗЭМс-46 Р39МС-47 Р39Мс1-44 РЗЭМа-(45)50

РЗ 9МЬ-11

РЗЭМЬ-(11)28 Р39МЬ-(11)29 РЗЭМЬ-(12)31

иииссисАисАсоААссс-АСсиииссоисссисиииссАсдисисиииаАииоисссиссицАисс ЩтеЦСАиСАаСААСССАССиииССаиаСгиСЦииССАСАиСиСииООАииСиСССиЗСииАОСС ОиЦССЦСАиСАаОААСССАССЦииОсаЦбСдаацииССАСАиСиСииииАЦЦСиСССиОСЦЦАОСд иЦЦССаСАЦСАа5ААСССАССЦииССаи5ССЦаииЦССА5АиСицЦЦииАиибисССи0СииАаС0 ЦиОССиСАиСАОСААСССАСССииССаТОССиСииОССАадиСОСииииАииСиббСиССииАиСС уииссасАисдиСААсссАссиииссаиесзосцоиссАСАисисииоаАиасасссибсииАсгас иЦЦССиСАиСАцОААСССАССиииаСаЦаССРСииЦССАСАПСиСииииАиаСиСССигСииАРьС отигсосАисАиСААСссАссцииосашссиаоииссАОАосибииоиАиисисссиосциАисс иииССибАиСАССААСССАССиииаС-аШССиСаииССйСАиСЦС-ииОтаииСОаССиССииАиСС иь'иссисАасАссААсссАссиццссаиессиаициссдсдиеодицииАцаоисссиосииАцде иЦЦССиСАиСАСаААСС5АССиЦиССаиЗСаЦ0иииеСА5АиСиСЦиииАиЦССС5СиССииАиСС

иииссисАССАсоААСссАас--------------------------ииАиизас-ссиссииАиснз

теиссиоАисАссААСссАасоиассаиссгисииоссАОАасисицииАиисисссиссиивдсс

и

цицссцсАисАссААСсоА^ииисос^сацсиииссАСАисисиииаАиасисссиасицАийз

ЦЦиССиСАиСЛаЗААСССАСиЦЦ^ВСидСаиСиииССАСАЦСиСииииАииСидОСЦССиОАЦСд ЦООССиаАиСАССААСССАСг^иаССОиССЩЗОииССАСАиСиСииииАииСиСССиССииМСС иииссисАисАссААССс^^сиаатесиссатоиииссАСАисисииииАиосийссиссаиАигс

22

57 21 21 21 21 21 21 21 21 21 21 31 21

25

25 25 25

8.5

6.0

2.5 2.5 4.5 6.0

1. 00

6.5 0.27 5.0 0.17

0.26

0.15

0.08 0.13

2.0 0.05

Обозначения такие же, как в та^я. 1 и 2.

вставок между элементами тандема должны быть связаны с эффективностью инициации трансляции мутантных РНК.

Действительно, матричная активность мутантных транскриптов оказалась существенно ниже, чем матричная активность транскрипта дикого типа. При этом обнаружилась корреляция между инфекционностью и матричной активностью: транскрипты инфекционных мутантов р23Р, р23М и р39М транслируются в 3.5-5 раз эффективнее, чем транскрипт неинфекционного мутанта р39Р и квази-инфекционного мутанта р46 (табл. 1).

РНК всех ревертантов являются более эффективными матрицами, чем их родительские транскрипты (табл. 1 и 3; рис. 1). Тем не менее, некоторые РНК транслируются эффективнее, чем другие. При сравнении матричной активности РНК, имеющих делеции, оказалось, что она зависит от расстояния между двумя элементами тандема: олигопиримидиновым блоком (UUUCC, названным нами бокс А) и AUG —триплетом. Оптимальное расстояние (22 нуклеотида) соответствует РНК дикого типа. Изменение этого расстояния дриводит к уменьшению матричной активности

РАССТОЯНИЕ МЕЖДУ БОКСОМ А и AUG Рис. 1. Зависимость матричной активности РНК от расстояния между боксом А и AUG.

Квадраты, соединенные сплошной линией, соответствуют матричным активностям РНК Р23М и pPVl/Д серий (t, pPV1/A8; 2, pPVl/A7; 3, pPVl/Дб: 4, pPV1/A4; 5, P23M-(8)57, 6, P46-24; 7, PV1; 8, P23M-(5)!8; 9, -(5)57: 10, -(8)53: И, -(7)58: 12, -(7)21; 13, р23М). Кружки, соединенные пунктирной линией, соответствуют матричным активностям РНК р23Р серии (14, Р23Р-15: 15. -16, 16, -17, 17, р23Р). 18 и 19 - для РНК р2АР и PV1 /03-23, соответственно

Среди РНК, lie имеющих делеций, матричная активность зависит от положения нового AUG. У клонов серий РЗЭМа, РЗЭМс,. и P39Md она выше, чем у клонов серии Р39МЬ, то есть снова коррелирует с расстоянием между элементами тандема (табл. 3).

Однако, корреляция между матричной активностью РНК и расстоянием между элементами тандема не абсолютна, и имеются некоторые различия между разными группами ревертантон. Например,' ревертанты серии р23М выглядят несколько "предпочтительнее", чем ревертанты серий р39М и р23Р несмотря на то, что расстояние между элементами тандема у них одинаково (рис. 1; таб. 2 и 3). Более того, обнаруженные точечные мутации (помимо AUG-создающих) в ревертантах ' серии р39М приводят как к стимулированию матричной активности РНК, так н к улучшению биологических свойств вируса, хотя расстояние мелсду элементами тандема при этом не меняется (табл. 3). Было установлено, что обнаруженные точечные мутации в геномах ревертантов должны приводить к дестабилизации вторичной структуры в районе AUG-гриплета ОАТ. Вероятно с этим связано стимулирование матричной активности' таких РНК. На основании этого можно предположить, что для эффективного функционирования ОАТ AUG-триплет или A uG-coдержащий элемент (бокс В) должны быть относительно экспонированы.

Однако, в геномах энтеро- и риновирусных РНК молчащий AUG расположен в совершенной шпилечной структуре (Pilipenko et al., 1989а). Это находится в некотором противоречии со сделанным заключением. -

. Объяснение значения несларенных нуклеотидов дает концепция стартового окна, разработанная и экспериментально обоснованная для ВЭМТ в работе Pilipenko ct al. (1994). Предполагается, что многоточечная фиксация рибосомы на IRESe стерически лимитирует участок РНК (около 12-ти нт длиной) - стартовое окно, - с нуклеотидами которого рибосома может равновероятно образовать продуктивный контакт. После этого начинается движение . рибосомы вдоль РНК: трансляция (если внутри стартового окна имеется AUG в инициаторном контексте) или поиск стартового AUG. Были выявлены следующие свойства стартового окна (Pilipenko et al., 1994): 1) 3' граница стартового окна фиксирована

относительно IRESa (16-17 нт в случае ВЭМТ). Эффективность начала белкового синтеза зависит от положения AUG относительно 5' и 3' границ стартового окна. 2) Эффективность продуктивных контактов рибосомы со стартовым окном не зависит от нуклеотидной последовательности стартового окна. 3) Для функционирования стартового окна необходимо и достаточно наличия в нем нескольких неспаренных нуклеотидов, причем они могут находиться в любом участке стартового окна.

Хотя для полиовирусной РНК этот вопрос специально не исследовался, тем не менее, ряд данных позволяет сделать заключение, что, несмотря на различия в способах укладки IRESob у кардио- и энтеровирусов, концепция стартового окна является универсальной и позволяет объяснить накопление дестабилизирующих мутаций в геномах ревертантов сеии рЗЭМ, а также результат получешшй при трансляции РНК мутанта pPVl/ОЗ. Матричная активность этой РНК была ниже, чем матричная активность транскриптов слабоинфекционных инсерционных мутантов, и составляла лишь 5% от матричной активности РНК дикого типа (табл. 1), хотя расстояние между элементами тандема у них одинаково. Однако, в случае этого мутанта измененная нуклеотидная последовательность в спейсере между боксом А и AUG может образовать дуплекс с одноцепочечным сегментом РНК, предшествующим домену Е и входящим в стартовое окно полиовируса. Вероятно, образование этого дуплекса и является причиной 20-кратного ингибирования матричной активности мутантной РНК, поскольку стартовое окно мутанта не имеет неспаренных нуклеотидов, кроме одного, Cjgo- При пассировании PV1/03 удалось отобрать ревертант, PV1/03-(23)103, со значительно улучшенными бляшечным фенотипом (7.0 мм против 4.0 мм у PV1/03; табл. 2) и матричной активностью РНК (65% против 5% у PV1./03). Секвенирование РНК этого ревертанта показало, что в сегменте между положениями 450 и 720 имеется единственная нуклеотидная замена Ajg/^U (табл. 2),' приводящая к дестабилизации образующегося дуплекса и появлению неспаренных нуклеотидов внутри стартового окна.

2.2. Влияние делеций между элементами ОАТ на матричную активность и жизнеспособность вируса. Структура геномов и матричная активность отобранных ревертаитов

В геномах ревертаитов, отобранных из потомства ипсерционных мутантов, расстояние между элементами ОАТ варьировало в пределах 1931 нт. Далее мы определили минимально допустимое расстояние между боксом А и AUG.

Удаление TGCA (564-567) из генома pPVl/ОЗ давало инфекционный транскрипт (pPVl/03/Д4) (табл. 1). Более глубокое внедрение внутрь пиримидин-богатого участка у pPVl/03/ДЮ приводило к летальному фенотипу (табл. 1). Матричные активности РНК этих мутантов составляли 35% и 2% от таковой у РНК дикого типа. Как и можно было ожидать, удаление трех из четырех мутированных нуклеотидов из РНК PV1/03 в значительной степени восстанавливало, как матричную активность, так п репродуктивную способность вируса (табл. 1; мутант pPVl/03/M).

Для более точного определения минимально возможного расстояния между AUG585 и предшествующим олигопиримидиновым блоком UUUCC были получены три новых мутанта с делециями 6-ти, 7-ми, и 8-ми нуклеотидов между этими элементами. Первые два муганта (pPVl/Дб и рРУ1/Д7) были жизнеспособны, при этом размер вирусных бляшек й матричная активность их транскриптов прогрессивно снижались (табл. 1). РНК pPVl/Д8 была неэффективной матрицей при трансляции в бесклеточной системе и квази-инфекционной. Таким образом, минимальное расстояние между элементами ОАТ равно 15 нт.

Поскольку транскрипт рРУ1/Д8 при трансфекции стандартными дозами не давал вирусных бляшек, мы использовали более высокие дозы вносимого транскрипта [от 100 до 200 нг на флакон (обычно от 0.1 до 5 нг)]. В результате были отобраны 8 вирусных бляшек, появившихся после длительного периода инкубации (от 10 до 17 дней; табл. 4). Материал каждой из отобранных бляшек был использован для инфицирования свежей культуры. Если вирус плохо размножался, проводили дополнительный пассаж. Среди гетерогенных по размеру бляшек каждого

клона, былн отобраны относительно крупнобляшечные представители, и определена первичная структура сегмента РНК между позициями 450 и 720 (табл. 4).

По характеру изменений в геноме все ревертанты, кроме одного, можно было разделилить на три класса (рис. 2).

В класс 1 входили вирусные изоляты, в геноме которых в результате точечных замен образовался новый AUG на более подходящем расстоянии от бокса А. Новые AUG возникали через три (PV1/A8-82), либо через шесть нуклеотидов (PV1/A8-91 и PV1/A8-107) от AUG586. Таким образом, он находились на расстоянии 17 или 20 нуклеотидов от бокса А, соответственно (табл. 4). Любопытно, что кодон AUG в двух независимых клонах, PV1/A8-91 и PV1/A8-107, возник в результате сопряженных транзиций двух соседних нуклеотидов CA^UG.

Класс 2 составляли вирусы, в геноме которых длина снейсера между AUG5g6 и UUUCC элементом "подкорректирована" при помощи вставок двух (PV1/A8-106,'PV1/.A8-77 и PV1/A8-89) либо 9-ти (PV1/A8-88) нуклеотидов. В результате, расстояние между боксом А и AUG возросло с 14-ти до 16-ти и 23-х нуклеотидов, соответственно (табл. 4).

. Многие ревертанты описанных выше классов имели дополнительные точечные мутации.

Ревертанты класса 3 (PV1 /Д8-74 и PV1/A8-90) имели протяженные делении (156 и 152 нуклеотидов, соответственно). Выброшенный участок генома включает AUGsgg, консервативный для всех энтсровирусов домен Е, а также практически весь спейсер между этим доменом и инициаторным AUG743 (табл. 4; рис. 2). В случае этих вирусов вторым элементом тандема олигопиримидин/AUG является инициаторный AUG. Следует заметить, что мотив UUUCCпретерпел изменения у обоих ревертантов.

Один ревертант, PV1/A8-112, не относился ни к одному из описанных выше классов. Этот относительно мелкобляшечный, но генетически стабильный при пассировании вирус имел в участке генома от 160 до 740 нт две точечные мутации (табл. 4).

Таблица 4. Структура геномов и некоторые свойства ревертантов, отобранных из потомства мутанта рРУ1/'Д8

расстояние

между размер матричная

бляшка вирус нуклеотидная последовательность боксом А и бляшек активность

_ _AUG_

PV1 559 606 4 4. UUUCCUUaUAUUUUAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUGU. ill 747 4 4 . UA'JUUCAAUCAGACAAUUG'JAUCAUAAUGGG 22 9 1 .0

РУ1/Д8 ----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUGU. .UAUUUCMUCAGACAAUDGUAUCAUAAUGGG 14 - 0. 05

GD801 112 UUUCC---- ----UAUUGUGGCUuCUUAUGGUGACAAUCACAGAUUaU. .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 14 2 0. 28

GD803 91 UUUCC---- ----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGAugAUCACAGAUUGU. . UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 20 4 .5 0. 16

GD808 107 UUUCC---- ----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGAUgAUCACAGAUL'GU. .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 20 4 .5 0. 21

GD807 82 ооисс---- ----UAUUGUGaCUGCUUAUGaUGAUAAUCACAGACUGU. .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 17 3 . 5 0. 13

GD802 106 UUUCC---- ----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAAUCACAGgUUaU. A .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 16 5 .5 0. 54

GD804 77 UUUCC---- lau 1 ----UAUUGUGGCUGCUUAUGGUGACAADCACAGAUUaU. taul .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUA4TOG3 16 5 .5 0. 44

GD805 89 UUUCC---- ----UAUqgUGGCb'GCUUAUGGUGACAAUCACAGAU'JaU. . UAU'JUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 16 6 0. 51

88 UUUCC---- I uu 1 ----UAUUOTGGCUGCUUAUGG'JGACAAUCACAGAUl'aU. .UAUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 23 8 0 .9

90 L auacgcuau-1 . -AUUUCAAUCAGACAAUUGUAUCAUAAUGGG 23 0. 21

4 . ii

GD806 74 19 0

5 . 5 . 4

Внутренние AUG и аутентичный стартовый кодон подчеркнуты тонкой и двойной линиями, соответственно. Точки использованы для обозначения разрыва в нуклеотидной последовательности. Остальные детали, как в табл. 1 и 2. Вирусная РНК PV1/A8-91 дополнительно к нуклеотидным заменам, приведенным в таблице, имеет транзицию Agij^G.

КЛАСС 1 ТОЧЕЧНЫЕ МУТАЦИИ КЛАСС 2 ВСТАВКИ КЛАСС 3 ПРОТЯЖЕННЫЕ ДЕЛЕЦ ИИ

rvua*42 - о AOSAOG tviuwwr __ >иа AUG PVU.8-74 PV1/^8-80 О О 719 i"3 7,8 i" <-AUG3' V— '-AUG3' $68 661

2 nt iBWUen ГЛ/л*-«*,-77.-«« , „_ / N AUG 9 DT ln**rtlon 4 Aw

Рис. 2. Классы ревертантов квази-инфекционной РНК pPVl/A8.

Матричная активность РНК ревертантов квази-инфекциониого мутанта pPVl/Дв колебалась от 13 до 90% по отношению к таковой у РНК дикого типа (табл. 4). Таким образом, все реверсии приводили к существенному увеличению белок-синтезирующей активности (транскрипт с делецией 8 нт транслировался с эффективностью 5%; табл. 1). Следует отметить хорошую корреляцию между матричной активность^ РНК и размером вирусных бляшек (табл. 4). Однако, РНК вирусов PV1/A8-106, PV1 /А8-77 и РУ1/Д8-89 (по сути являющихся мутантами с делецией 6 нт) и РНК РУ1/Д8-112 (мутант Д8) имели более высокую матричнук активность по сравнению с таковыми у РНК РУ1/Д6-69 и транскриптом рРУ1/Д8, соответственно. Как уже обсуждалось, AUG —компонент ОАТ (но не весь ОАТ) в геноме цояиовируса расположен в совершенно!

шпилечной структуре. Делегирование нуклеотидов внутри спейсера ОАТ приводит к сближению доме.на Е с IRESom. В результате делении 8-ми нуклеотидов стартовое окно, ' которое по определимо находится на фиксированном расстоянии от IRESa, вероятно, полностью оказывается в двуцепочечной структуре домена Е (рис. 3). И, по-видимому, именно поэтому такой мутант имел квази-инфекционный фенотип и низкую матричную активность РНК. "Закрытие" сатртового окна, а не укорочение спейсера ОАТ как возможное объяснение биологических свойств мутанта pPVl/A8 является предпочтительным, так как у ревертапта этого мутанта, PV1 /Л8-112, расстояние между элементами ОАТ такое же, однако, появившиеся нуклеотидные замены, приводящие к дестабилизации домена Е (рис. 3), в б раз повысили матричную активность РНК, а вирус, хотя и мелкобляшечный, стал достаточно стабильным при пассировании. Таким образом, 5' концевую границу стартового окна в геноме полиовируса мы можем поместить в районе 9-10 нт от UUUCC, т. е. 16-17 нт от последнего консервативного домена D полиовирусного IRESa (рис. 3). Что касается 3' границы этого элемента, имеющихся экспериментальных данных, к сожалению, недостаточно для ее точной локализации. Тем не менее, мутации дестабилизирующие домен Е в геномах ревертантов мутанта pPVl /А8 (они должны приводить к появлению неспаренных нуклеотидов внутри границ стартового окна), позволяют нам поместить ее примерно через 22 после бокса А (рис. 3).

Следует особо отметить, что во вышеприведенном примере молчащий AUG по — прежнему оставался в двуцепочечной структуре домена Е, как и у вируса дикого типа, и при этом длина спейсера между боксом А и AUG не менялась. Реверсии приводили только к образованию неспаренных нуклеотидов внутри границ стартового окна. Таким образам, и в случае полиовируса IRES—связанная рибосома, вероятно, осуществляет первичный продуктивный контакт с неспаренными нуклеотидами стартового окна. Функциональная активность стартового окна мало зависит от его первичной структуры, однако следует учитывать, что окно перекрывается с ОАТ (оптимально, если AUG —компонент ОАТ находится вблизи 3' границы стартового окна).

pvi PVl/^8

и-л a-u a-u

с-а

a-u

a-u

U-A

a-u a-с

u-a

A-u.

¡PV1/a8-91 I Q A-U

1PW»»-TOT| ,»03.0-

c-a

u-a-o pvl/^9-106

a-u—cpvi/^e-e2

ДЕЛЕЦИЯ В-МИ НУКЛЕ0ТИДОВ

PVI/a.8-62 A <

-A

s auuoqauu 3'

s ткш> стартового окш -

PVV^-82 A-*

4 B

PV1/i8-e8 VI/..й 'v1m8-10q «1/^8-112

a pvv^e-ei * AuuaaAuu 3'

uuuccuuuuauuu

и и и с с и

Рис. 3. Предположительное расположение границ стартового окна в геноме полиовируса дикого типа (pPVl) и делеционного мутанта рРУ1/Д8. Положение стартового окна взято в жирную рамку со светлой штриховкой. При делении 8 —ми нуклеотидов 5' граница сместилась на двуцепочечную структуру домена Е; в результате в стартовом окне отсутствуют неспаренные нуклеотиды.

РНК ревертантов с новыми AUG (PV1 /Л8-82, -91 и -107) имели относительно низкую матричную активность, несмотря на то, что расстояние между боксом А и вновь приобретенным AUG равно 17 нт в случае PV1 /Л8-82 и 20 нт в двух других случаях (табл. 4).

Матричная активность РНК вируса РУ1/Д8-74 составляла 40% от таковой для вируса дикого типа, таким образом, это достаточно эффективная матрица. РНК второго протяженного делента, РУ1/Д8-90, — более слабая матрица (эффективность синтеза Р1 составляла 20%).

2.3. Изучение функциональной значимости О AT и его компонентов

Вышеизложенные результаты позволили сделать заключение, что тандем двух особым образом расположенных мотивов - бокса А и AUG (OAT) играет чрезвычайно важную роль в инициации трансляции на

полиовирусной РНК. Это заключение было проверено несколькими способами.

Несмотря на то, что при секвенировании 5НТО РНК псевдоревертантов не было найдено дополнительных изменений, кроме приводящих к восстановлению поврежденного ОАТ, нельзя было исключить наличия необнаруженных супресорных мутаций в кодирующем районе генома. Для проверки подобной возможности вместо нуклеотидов 567-568 в полиовирусную РНК была введена 22-х нуклеотидная вставка (pPVl/03/24P; табл. 1); вставка имела AUG через 20 нуклеотидов после бокса А и предположительно должна была находиться в одноцепочечном состоянии. Транскрипт р24Р был инфекционным и, в отличие от всех других транскриптов с протяженными вставками, давал крупнобляшечный вирус при первичной трансфекции. Как транскрипт, так и вирусная РНК, являлись достаточно эффективными матрицами при трансляции в экстракте клеток Кребс-2 (табл. 1). Этот результат подтверждал предположение, что AUG, помещенный на определенном расстоянии от олигопиримидинооого траста, необходим для эффективной работы IRESa.

Второй тест для проверки гипотезы заключался в следующем. Консервативный домен Е был полностью удален н конструкции pPVl/AE, что привело к утрате инфекционности (табл. 5). Однако, когда, описанный выше, AUG-содержащий линкер был встроен вместо домена Е, получили инфекционный транскрипт pPVl/AE24P, который давал крупнобляшечный вирус (табл. 5). Матричная активность этого транскрипта была сравнима с матричной активностью транскрипта р24Р. Встраивание этого же линкера, но в обратной ориентации (без AUG триплета), давало транскрипт, рРУ1/ДЕ24М, который при стандартных условиях трансфекции бляшек не давал, но был квазшшфекц ионным (у ревертангов восстанавливался ОАТ) (табл. 5). Таким образом, допустимы существенные перестройки в 5НТО полиовируса к 3' концу от бокса А, но только если па определенном расстоянии от него находится AUG.

Следующим шагом была направленная проверка функциональной значимости олигопиримидинового тракта. Эволюционная консервация бокса А давала основание предполагать, что он является функционально

важным. Для проверки этого предположения были получены три мутанта (pPVt/PMl, /РМ2 и /РМЗ), содержащие изменения в боксе А (табл. 1). Все три мутанта были нежизнеспособны, а матричная активность их транскриптов была приблизительно в 50 раз ниже, чем таковая у дикого типа (табл. r 1). Таким образом, UUUCC является существенно необходимым элементом для репродукции полиовируса в культуре клеток и трансляции его РНК. Более того, он не может быть отделен от предшествующего домена D IRESa полиовируса (мутант pPVl/PM3).

Таблица 5. Мутантные конструкции полиовируса с удаленным доменом Е и некоторые их свойства.

название нуклеотидная последовательность инфекци-ошгость размер бляшек матричи активно!

pPVl/AE 559 563 630 637 1 i Ii ТТТСС........................CCATCCGG - - 0 , . V.

pPVl/AE/24P TTTCCtttctttttqattqttgcttatqqCCATCCGG + 6.0 1 1 ,0(

pPVl/AE/24M TTTCCccataagcaacaatcaaaaagaaaCCATCCGG - - 0 . • К

pPVl-E35 TTTCCtt-tctttttgattgttgcttaCggCCATCCGG + hg 0. .2;

pPVl-EG6 TTTCCtttctttttgattgttgcttGtggCCATCCGG + 1.0 0, .3"

pPVl-EG3 TTTCCtttctttttqattcjttGTGCatqTCCATCCGG 4.5 0. .6'

pPVl-EG4P TTTCCtttctttttqattqttlTGGatqCCCATCCGG + 4.5 0 . 7 (

В конструкции pPVl/AE были удалены нт 564-629. Вместо удаленных нуклеотидов встроен членный синтетический олигонуклеотид (обозначен в таблице маленькими буквами) с f триплетом (в pPVl/AE24P), либо без AUG (в рРУ1,/ДЕ24М). Отличия в нуклеотщ последовательности синтетической вставки у мутантов pPVl-EG3, -EG4P, -EG5 и -EG6 отношению к pPVl /ДЕ24Р обозначены заглавными жирными буквами. Интактный и мутирова AUG подчеркнуты сплошной и пунктирной линиями, соответственно, hg - гетерогенный. Матри> активность транскриптов определена в экстракте Кребс-2 и приведена з таблице по отношени pPVl/AE24P. Остальные обозначения, как в табл. 1.

Далее на основе конструкции pPVl/AE24P было изучено влияние критического AUG на функцию ОАТ. Замена AUG на GUG (pPVl-EG6) приводила к резкому уменьшению размера бляшек и существенному ингибированию матричной активности мутантной РНК (табл. 4). Полученный вирус был нестабилен, и в его потомстве быстро накапливались истинные ревертанты. Замена AUG^ACG (pPVl-EG5) приводила к еще более существенной репрессии матричной активности. Транскрипт данного мутанта не давал бляшек на третий день после

трансфекции. Бляшки появлялись на 4-5 день и были гетерогенны по размеру, вероятно, из-за быстрых реверсий (табл. 4).

Несмотря на то, что в мутантах pPVl-EG5 и -EG6 отсутствовал триплет AUG, они сохранили инфекционность. Мы предположили, что это может быть связано с нуклеотидным окружением AUG (в pPVl-EG5 и -EG6 оно такое же, как и окружение AUG^gj в геноме вируса дикого типа; табл. 1 и 5). Когда контекст AUG был изменен (pPVl-EG3 и pPVl-EG4P), размер бляшек полученных вирусов и матричная активность их РНК также снизились, но в меньшей степени, чем при мутировании AUG (табл. 5). Результаты этих экспериментов показывают первостепенную важность AUG для функционирования ОАТ. Контекст этого триплета оказывает только модулирующее влияние, при этом окружение AUG565 (которое мы назвали боксом В) является оптимальным для репродукции вируса в культуре клеток и трансляции его РНК.

Полученные результаты свидетельствуют, что для нормального функционирования IRESa в полгювируснон РНК необходимо наличие A UG (критического либо инициаторного) на расстоянии 15-31 нт от бокса А.

Изменение нуклеотндной последовательности бокса А (мутанты pPVl/PMl и /РМ2; табл. 1) показало, что бокс А является абсолютно необходимым для кэп-независимого присоединения рибосомы к внутреннему участку РНК

Мы предполагаем, что олигопиримидиновый участок, бокс А, может комплементарно взаимодействовать с З'-концевым районом 18S рРНК. Возможность комплементарного взаимодействия бокса А с 3' концом рибосомалыюй РНК Î8S позволяет нам рассматривать его в качестве функционального аналога прокарнотической олигопуриновой последовательности Шайпа-Дальгарно (Shine-DalgariKi).

Мы ввели понятие нового регуляторного трансляц-донного элемента -тандема, состоящего из пентапиримидинового блока (бокса. А) и AUG— триплета на расстоянии 15 — 31 нт от него. Этот дас-элемент полновирусной РНК, названый нами ОАТ (тандем олигопиримидина и AUG), примыкает к З'-концу домена D полиовирусного IRESa то есть положение ОАТ относительно домена D является критическим..

2.4. Гипотетическая модель посадки рибосомы на полновирусную РНК

На основе вышеизложенного, можно предложить гипотетическую модель посадки рибосомы на внутренний участок полиовирусной РНК, которая включает следующие этапы (рис. 4): .

(О В результате многоточечного взаимодействия 40Б рибосомальной субъединицы с ШЕБом, вероятно, опосредованного клеточными факторами инициации трансляции (возможно, неизвестными), образуется продуктивный контакт между рибосомой и нуклеотидами внутри стартового окна, расположенного после 10-ти нт к 3' концу от мотива и1ШСС. Наличие неспаренных нуклеотндов в любом месте стартового окна является необходимым условием для образования продуктивного контакта.

СО ,

А В

С") ,

ires

(ПО

Рис. 4. Гипотетическая модель посадки рибосомы на внутренний участок РНК при инициации трансляции у вируса полиомиелита.

(ii) Затем 40S рибосомалытая субъединица узнает ОАТ, вероятно, посредством комплементарного взаимодействия вирусной и 18S рибосомалыгой РНК, возможно, при участии белковых факторов и транспортных РНК. Предполагается, что взаимодействие с ОАТ способствует стабилизации РНК/рибосомального комплекса.

(iii) После этого 40S рибосомальная субъедшшца начинает сканирование до первого AUG в подходящем контексте. Для инициации белкового синтеза может быть использован и AUG, являющийся элементом ОАТ, если он имеет подходящий контекст (по крайней мере в культуре клеток и бесклеточных системах трансляции) и если первичный продуктивный контакт произошел до этого кодона.

По этой модели, внутренняя инициация трансляции полиовирусной РНК сходна с инициацией трансляции у прокариот (которая, но сути, всегда внутренняя). Олигопиримидиновый компонент ОАТ выполняет функцию последовательности Шайна-Дальгарно. Однако, имеются и два существенных отличия: 1) требуется наличие протяженного и сложноорганизованого IRESa перед ОАТ; 2) AUG-кодои в составе ОАТ не всегда является стартовой точкой белкового синтеза.

ВЫВОДЫ

1. На основе анализа геномов ревертантов инсерционных и делеционных мутантов детально охарактеризован новый тип регуляторных трансляционных элементов PHIC - тандем олигопиримидин/AUG (ОАТ). Доказано функциональное значение элементов тандема и расстояния между ними.

2. Предложена модель консервативного комплементарного взаимодействия элементов тандема с 3' концевым участком 18S рибосомальной РНК.

3. Полученные данные указывают, что для эффективной инициации трансляции полиовирусной РНК необходимо наличие неспаренных оснований в районе, приблизительно между 10-м и 22-м нуклеотидами после мотива UUUCC (т. е., в стартовом окне).

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признателен чл.-корр. РАМН профессору В. И. Аголу, в лаборатории которого были выполнены все работы, при его неизменной поддержке и участии. Все исследования были выполнены в тесном сотрудничестве с Е. В. Пилипенко и С. В. Масловой, которым я весьма благодарен. Плодотворные научные дискуссии с В.И.Аголом и Е. В. Пилипенко способствовали формированию научных идей и новых концепций. Этот проект не был бы осуществлен без содействия и постоянной поддержки всех коллег по лаборатории.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Agol, V. I. Biinov, V. М., Gmyl, А. P., Maslova, S. V., Pestova, Т. V., Pilipenko, Е. V., Romanova, L. I., Svitkin, Y. V. (1989). 5'nontranslated region of the picornaviral genome: unusual translation control. Abs. Second Bilateral Symp. USSR-USA "Structure of eukaryotic genome and regulation of its expression". Tbilisi, p. 14-15.

2. Agol, V. I. Biinov,V. M., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Pestova, Т. V., Pilipenko, E. V., Romanova, L. I., Svitkin, Y. V. (1989). Translation control elements within the 5'-untranslated region of the picornaviral RNAs. Abs. of the International Symp. "Molecular Organization of Biological Structures". Moscow, June 19-24, p. 106.

3. Agol, V. I., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Pilipenko, E. V., Svitkin, Y. V. (1991). Towards understanding the mechanism of the internal binding of ribosomes to picornavirus RNAs. Abs. of the Workshop "The Regulation of Translation in Animal Virus-Infected Cells". Madrid, June 24-26, p. 15-16.

4. Agol, V. I., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Pilipenko, E. V., Svitkin, Y. V. (1991). AUG (cryptic or initiating) and appropriately spaced oHgopyrimidine block are involved in recognition of picornavirus RNAs by ribosomes. Abs. of the International Conference "Protein Biosynthesis". Pushino, August 26-September 3, p. 55.

5. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Svitkin, Y. V., Sinyakov, A. N.. Agol, V. I. (1992). Prokaryotic-like cis element in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. Cell 68, 119-131.

6. V. I. Agol, A. Gmyl, S. Maslova, E. Pilipenko, Y. Svitkin. (1992). Structural elements in poliovirus RNA required for its efficient translation. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York, 9-13 September, p. 5.

7. Gmyl, A. P., Pilipenko, E. V., Maslova, S. V., Belov, G. A., Agol, V. I. (1993). Functional and genetic plasticities of the poliovirus genome: quasi-infectious RNAs modified in the 5'-untranslated region yield a variety of pseudorevertants. J. Virol. 67, 6309-6316.

8. Gmyl, A. P., Pilipenko, E. V., Slobodskaya, O. R., Maslova, S. V., Tolskaya, E. A., Agol, V. I. (1993). Functional and genetic plasticity of the poliovirus genome. Abs. of the IXth International Congress of Virology. Glasgow, Scotland, 8-13August, p. 275.

9. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Huang, M., Brown, T. D. K., Agol, V. I. (1993). Differences in structural requirements for internal initiation of translation on cardiovirus and enterovirus RNA templates. Abs.

of the IXth International Congress of Virology. Glasgow, Scotland, 8-13 August, p. 72.

Ю.Агол В. И., Пестотза Т. В., Пилипенко Е. В., Гмыль А. П., Слободская

0. Р., Маслова С. В., (1993). Регуляторные элементы в 5'-нетранслируемой области генома полиовируса: конструирование новых штаммов вируса. Тезисы III Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия". Пущино-на-Оке, ноябрь-декабрь 1992г., с. 98.

И.Agol, V. I., Gmyl, А.Р., Pilipenko, Е. V. (1994). High frequency of deletions and insertions during reproduction of the picornavirus genomes Abs. of the Workshop "Genetic recombination and defective interfering particles in RNA viruses". Madrid, 21-23 March, p. 17.

12.Pilipenko, E. V., Gmvl, A. P., Maslova, S. V., Belov, G. A., Sinyakov, A. N., Huang, M., Brown, T. D. K., Agol, V. Г. (1994). Starting window, a distinct element in the cap-independent internal initiation of translation on picornaviral RNA. J. Mol. Biol., 241, 398-414.

13.Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Khitrina, E. V., Maslova, S. V., Slobodskaya, O. R., Agol, V. I. (1994). Host-dependent variations in the role of oligopyrimidine/AUG tandem for the reproduction of Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV). Abs. of the VTIIth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Korpilampi, Finland, 6-11 August.

14. Slobodskaya, O. R., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., To'iskaya, A., Agol, V.

1. (1994). Cis-elements of the 5'-noncoding region of poliovirus RNA modulating neurovirulence. Abs. of the VHIth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Korpilampi, Finland 6-11 August.

15.Gmyl, A. P., Pilipenko, E. V., Agol, V. I. (1994). A possible mechanism of rearrangements of the picornaviral genomes. Abs. of the VIHth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Korpilampi, Finland, 6-11 August.

16.Agol, V. I., Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Huang, M., Brown, T. D. K. (1994). Starting window, a novel cis-element involved in the internal initiation of picornavirus protein synthesis. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York, 24-28 August, p. 105.

17.Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Belov, G. A., Agol, V. I.

(1994). Host-dependence of template activities of the Theilef's murine encephalomyelitis virus (TMEV) RNAs with altered oligopyrimidine/AUG tandem. Abs. of the Meeting "Translational control". Cold Spring Harbor, New York, 24-28 August, p. 191.

18.Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Maslova, S.V., Khitrina, E.V., Agol, V. I.

(1995). Attenuation of Theiler's murine encephalomyelitis virus by modifications of the oligopyrimidine/AUG tandem, a host-dependent translational cis-element. J. Virol., 69, 864-870.

19.Pilipenko, E.V., Gmyl, A.P., Agol,V.I. (1995). A model for rearrangements in RNA genomes. Nucl. Acids Res. 23, 1870-1875.

20.Agol, V. I., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Pilipenko, E. V. Slobodskaya, O. R., Viktorova, E. G. (1995). Translational control of picornavirus neurovirulence: the oligopyrimidine/AUG tandem as host-dependent and IRES-dependent control element. Abs. of the IVth International Svmposium on Positive Strand RNA Viruses, Utrecht, The Netherlands, 25-30 May.