Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аттенуация вируса энцефаломиелита мышей Тейлера путем модификации его 5-нетранслируемой области

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хитрина, Елена Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Механизм инициации трансляции эукариотических мРНК.

2.2. Особенности первичной структуры генома пикорнавирусов.

2.3. Элементы 5-НТО пикорнавирусов, обеспечивающие внутреннее присоединение рибосом к матрице.

2.4. Белковый аппарат внутренней инициации трансляции.

2.5. Вирус энцефаломиелита мышей Тейлера. Фенотипические и структурные особенности.

2.6. Молекулярные основы различной биологической активности ВЭМТ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Ферменты и реактивы.

3.2. Плазмиды.!.

3.3. Бактериальные штаммы.

3.4. Синтетические олигонуклеотиды.

3.5. Базовые методы молекулярного клонирования.

3.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК с использованием Т7 ДНК полимеразы.

3.7. Конструирование мутантных кДНК ВЭМТ.

3.8. Получение полноразмерных транскриптов.

3.9. Трансфекция и получение вирусных стоков.

3.10. Определение бляшкообразующего фенотипа.

3.11. Определение кинетики размножения мутантных вирусов в одноцикловом опыте.

3.12. Определение матричной активности мутантных РНК.

3.13. Исследование нейровирулентности.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Геномная структура и бляшкообразующий фенотип мутантных вирусов энцефаломиелита мышей Тейлера.

4.2. Исследование нейровирулентности мутантных ВЭМТ с геномными перестройками в области О AT.

4.3. Геномная структура мутантов ВЭМТ с неинициаторным AUG в стартовом окне и их свойства in vitro.

4.4. Исследование нейровирулентности мутантов ВЭМТ с неинициаторным AUG в стартовом окне.

4.5. Структура генома вирусов, выделенных из ЦНС животных, зараженных мутантами ВЭМТ.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1. Олигопиримидин/AUG тандем является цис-активным элементом, зависимым от хозяина.

5.2. Функционально-структурные требования для ОАТ.

5.3. Точечные мутации в трансляционном стартовом окне аттенуируют вирус энцефаломиелита мышей Тейлера.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аттенуация вируса энцефаломиелита мышей Тейлера путем модификации его 5-нетранслируемой области"

Изучение механизмов реализации генетической информации - одна из основных задач молекулярной биологии. Экспрессия гена осуществляется посредством транскрипции и трансляции. Регуляция трансляции эукариотических мРНК, несмотря на большую научную значимость, до сих пор остается недостаточно изученной. Особый интерес представляет стадия инициации трансляции. До недавнего времени полагали, что инициация трансляции всех эукариотических мРНК осуществляется по общему механизму, предложенному Marilyn Kozak (Kozak, 1978; 1981). Согласно этому механизму, 40S рибосомальная субъединица присоединяется к мРНК вблизи 5-конца через взаимодействие ряда факторов инициации трансляции с концевой кэп-структурой на 5'-конце. После этого 40S рибосомальная субъединица сканирует матрицу в 3 -направлении до первого AUG-кодона в оптимальном контексте (IlyXXAUGG, где Пу - пурин, X - любой нуклеотид). На этом AUG-кодоне происходит сборка рибосомы и начинается синтез белка.

Однако в настоящее время выявлены мРНК (примерно 10% от общего числа), для которых вышеуказанная модель инициации трансляции не подходит. Эти мРНК либо не имеют кэп-структуры на 5'-конце, либо AUG-кодону, с которого начинается синтез белка, предшествует протяженная 5'-нетранс лиру ем ая область (5'НТО) с многочисленными AUG-кодонами в благоприятном для инициации белкового синтеза контексте, которые, тем не менее, как инициаторные не используются. К этим мРНК относятся и пикорнавирусные РНК. Инициация трансляции некоторых мРНК данного класса, в том числе и пикорнавирусных РНК, осуществляется по кэп-независимому механизму посадки рибосомы на внутренний участок матрицы.

Эксперименты, проведенные несколькими группами исследователей, позволили выделить в 5-НТО пикорнавирусов три цис-действующих элемента, обеспечивающих посадку рибосомы на внутренний участок РНК (Jang et al., 1988, 1989; Pelletier et al., 1988a, b; Pelletier and Sonenberg, 1988, 1989; Pilipenko et al., 1992, 1994). Это IRES (от английского Internal Ribosome Entry Site), олигопиримидин/AUG тандем (OAT) и стартовое окно (CO) - место продуктивного контакта рибосомы с матрицей. IRESbi пикорнавирусов подразделяют на три класса, не имеющих почти ничего общего между собой на уровне первичной и вторичной структур. Олигопиримидин/AUG тандем - это участок 5-НТО мРНК вблизи З'-границы IRESa, включающий олигопиримидиновый блок и AUG-триплет (инициаторный у кардио- и афтовирусов и молчащий у энтеро- и риновирусов), разделенные слабоструктурированным спейсером. О AT перекрывается со стартовым окном. Стартовое окно - стерически лимитируемый участок РНК, с нуклеотидами которого рибосома образует продуктивный контакт, после чего рибосома начинает движение вдоль матрицы: трансляцию - при наличии в стартовом окне инициаторного код она или сканирование - при его отсутствии.

Роль олигопиримидин/AUG тандема, как цис-действующего элемента, впервые была подробно исследована Пилипенко с соавторами. Было показано, что мутационные изменения (делеции, нуклеотидные замены) в области олигопиримидинового блока, вставки различной протяженности в спейсер между частями тандема существенно снижают жизнеспособность мутантных полиовирусов и матричную активность соответствующих мРНК в системах in vitro и in vivo (Pilipenko et al., 1992). Однако те же самые генетические изменения в области ОАТ другого представителя пикорнавирусов, вируса энцефаломиелита мышей Тейлера (ВЭМТ), незначительно сказываются на матричной активности вирусной РНК в тех же бесклеточных системах (Кребс-2 и лизат ретикулоцитов кролика) и на репродуктивной способности вируса в культуре клеток ВНК-21 (Pilipenko et al., 1994). Консервация олигопиримидин/АИО-тандема у всех представителей кардиовирусов позволяет предположить, что О AT ВЭМТ может быть необходим в других трансляционных системах, например в нервной ткани мышей.

ВЭМТ принадлежит к роду кардиовирусов семейства пикорнавирусов. Штаммы этого вируса разделяют на две подгруппы на основании их биологической активности: GDVII-подгруппа - высоковирулентные штаммы (GDVII, FA) вызывают у мышей острый, обычно фатальный энцефаломиелит; ТО-подгруппа - слабовирулентные штаммы (BeAn, DA, ТО) вызывают у мышей острый энцефаломиелит, переходящий в хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, близкое по своим характеристикам к рассеяному склерозу человека. Согласно данным литературы, детерминанты, определяющие различия в биологической активности штаммов вируса Тейлера, картируются, главным образом, в области, кодирующей капсидные белки. Однако ряд наблюдений свидетельствует о том, что 5'-нетранслируемая область пикорнавирусов также содержит нейроспецифические детерминанты. Это было показано как для полиовируса (Svitkin et al., 1988; 1990; Slobodskaya et al., 1996), так и для ВЭМТ (Fu et al., 1990b; Banyopadhyay et al., 1993).

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было изучение зависимости биологических свойств ВЭМТ (штамм GDVII) от структуры участка 5'-НТО, включающего олигопиримидиновый блок и инициаторный AUG. В задачи исследования входило: 1) изучение нейропатогенности мутантных вирусов Тейлера с геномными перестройками (нуклеотидными заменами и делениями) в области олигопиримидинового блока и со вставками между олигопиримидиновым блоком и AUG-кодоном, сконструированных ранее в нашей лаборатории; 2) получение и изучение биологических свойств нового класса мутантов ВЭМТ с 27-нуклеотидной вставкой между элементами тандема (олигопиримидиновый блок и AUG), в которую внесен новый неинициаторный AUG в различных контекстах, локализующийся в пределах стартового окна и выполняющий функцию второго элемента тандема олигопиримидин/ AUG.

Научная новизна и практическая ценность работы. Данные, полученные при изучении нейровирулентности мутантов ВЭМТ, свидетельствуют о важности тандема олигопиримидинового блока и AUG-кодона для эффективной репродукции вируса в нервной ткани мышей. Различные генетические перестройки в области ОАТ снижают (частично или полностью) нейровирулентность вируса энцефаломиелита мышей Тейлера. Однако те же самые генетические изменения незначительно сказываются на репродуктивной способности вируса в культуре ткани и на матричной активности соответствующих вирусных РНК в некоторых бесклеточных системах трансляции. Сравнительный анализ результатов, полученных при изучении мутантов ВЭМТ в системах in vitro и in vivo, позволяет говорить о тканеспецифической роли тандема олигопиримидин/AUG, обусловленной, вероятно, наличием (отсутствием) ряда транс-факторов, обеспечивающих внутреннюю посадку рибосом при инициации трансляции. Полученные результаты открывают новые перспективы как для изучения фундаментальных аспектов механизма внутренней инициации трансляции, так и для дальнейших попыток в разработке живых вакцин.

Изучение биологических свойств мутантов Тейлера со вставкой между элементами тандема, в которую внесен новый неинициаторный AUG в различных неоптимальных контекстах показало, что мутанты, имеющие разные неоптимальные контексты AUG, расположенного в стартовом окне, обладая одинаковой степенью аттенуации (судя по PD50), могут приводить к развитию различной клинической картины у заболевших животных. Одни мутанты вызывают глубокие параличи с очень высоким уровнем смертности (иногда 100%), в то время как другие - заболевание средней тяжести, заканчивающееся в большинстве случаев полным выздоровлением. Таким образом, впервые показано, что точечные мутации в 5 -НТО вирусной РНК могут по-разному влиять на способность вируса вызывать заболевание, с одной стороны, и на течение и исход вирусной инфекции, с другой. Не исключено, что подобное свойство присуще не только вирусу Тейлера, но и другим вирусам, патогенным для человека и животных, и это обстоятельство должно быть принято во внимание при разработке новых подходов к диагностике вирусных заболеваний и лабораторной идентификации вирусов.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы работы были доложены на VTII-ой конференции «Молекулярная биология пикорнавирусов» (Финляндия, 1994), на Х-том международном конгрессе вирусологов (Иерусалим, Израиль, 1996), на Х-ой конференции «Молекулярная биология пикорнавирусов» (Германия, 1998), на научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии», посвященной 90-летию со дня рождения М. П. Чумакова (Москва, 1999) и на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Хитрина, Елена Васильевна

выводы

1) Исследованы биологические свойства ренее полученных и вновь сконструированных мутантов вируса энцефаломиелита мышей Тейлера, несущих мутации в 3'-концевой части 5' нетранс лиру емой области, включающей олигопиримидиновый блок и инициаторный AUG-кодон.

2) Необходимость в олигопиримидин/AUG тандеме для ВЭМТ зависит от особенностей клетки-хозяина. Различные мутационные изменения (делеции, вставки, нуклеотидные замены) в области олигопиримидин/AUG тандема, незначительно сказываясь на матричной активности вирусной РНК в бесклеточных системах и на репродуктивной способности вируса в культуре ткани, существенно снижают нейровирулентность мутантных ВЭМТ.

3) Для эффективного функционирования тандема в нервной ткани достаточно блока из пяти пиримидинов (либо бокс А, либо бокс А ), а расстояние между боксом А(А') и AUG-триплетом должно быть в пределах 16-28 нуклеотидов (оптимум 21 нуклеотид). В качестве второго элемента в олигопиримидин/AUG тандеме предпочтительнее иметь инициаторный AUG-кодон.

4) Аттенуирующие точечные мутации в регуляторном элементе 5 -НТО генома ВЭМТ могут по разному влиять на способность вируса вызывать заболевание, с одной стороны, и на течение и исход вирусной инфекции, с другой. При одинаковой способности вызывать заболевание (судя по величине PD50) одни мутанты, содержащие в стартовом окне неинициаторный AUG с гуаниловым остатком в положении +4, вызывают глубокие параличи с очень высоким уровнем летальности, другие, содержащие в положении +4 цитидиловый или уридиловый остатки, вызывают заболевания средней тяжести, заканчивающиеся в большинстве случаев полным клиническим выздоровлением

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признательна моим научным руководителям, профессору В. И. Аголу и в.н.с. Е. В. Пилипенко, за предложенную тему работы и возможность пройти настоящую научную школу. Я благодарна также А. П. Г мылю, С. В. Масловой, Е. Г. Викторовой, в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биохимии, поддержку и содействие которых я ощущала постоянно.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хитрина, Елена Васильевна, Москва

1. Блинов, В. М., Пилипенко, Е. В., Романова, Л. И., Синяков, А. Н., Маслова,

2. С. В., Агол, В. И. (1988). Сравнение вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого сегмента РНК нейровирулентного и аттенуированного штаммов вируса полиомиелита. Доклады АН СССР 298, 1004-1006.

3. Пилипенко, Е. В., Маслова, С. В., Агол, В. И. (1992). Вероятная компактная структура г^ис-активного трансляционного элемента в 5'-нетранслируемой зоне генома'энтеровирусов и риновирусов. Мол. Биол. 26, 565-572.

4. Abramson, R., Dever, Т. Е., Lawson, G., Ray, В. K.,Thach, R.E., and Merrick, W. С. (1987). The ATP-dependent interaction of eukaryotic initiation factors with mRNA. /. Biol. Chem. 262, 3826-3832.

5. Abastado, J. P., Miller, P. F., Jackson, В. M., and Hinnebusch, A. G. (1991). Suppression of ribosomal reinitiation at upstream open reading frames in amino acid-starved cells form the basis for GCN4 translational control. Mol. Cell. Biol. 11, 486-496.

6. Agol, V. I. (1991). The 5'-untranslated region of picornaviral genomes. Adv. Virus Res. 40, 103-180.

7. Ambros, V., and Baltimore, D. (1978). Protein is linked to the 5' end of poliovirus RNA by a phosphodiester linkage to tyrosine. J. Biol. Chem. 253, 52635266.

8. Bandyopadhyay, P. K., Wang, C., and Lipton, H. L. (1992). Cap-independent translation by the 5' untranslated region of Theiler's murine encephalomyelitis virus. /. Virol. 66, 6249-6256.

9. Bandyopadhyay, P. K., Pritchard K. J., and Lipton H. L. (1993). A three-nucleitide insertion in the H stem-loop of the 5' untranslated region of Theiler's virus attenuates neurovirulence. J. Virol. 67, 3691-3695.

10. Benne, R.s and Hershey, J. W. B. (1976). Purification and characterization of initiation factor IF-E3 from rabbit reticulocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 3005-3009.

11. Bienkowska-Szewczyk K., and Ehrenfeld E. (1988). An internal 5'-noncoding region required for translation of poliovirus RNA in vitro. J. Virol. 62, 3068-3072.

12. Blak D. N., Stephenson P., Rowlands D. J., and Brown, F. (1979). Sequense and location of the poli С tract in aphto and cardiovirus RNA. Nucl. Acids Res. 6, 2381-2390.

13. Blyn, L. В., Towner, J. S., Semler, B. L., and Ehrenfeld, E. (1997). Requirement of poly(rC) binding protein 2 for translation of poliovirus RNA. J. Virol. 71, 6243-6246.

14. Borman, A., and Jackson, R. J. (1992). Initiation of translation of human rhinovirus RNA: mapping the internal ribosomal entry site. Virology 188, 685696.

15. Borman, A., Howell, M. Т., Patton, J., and Jackson, R. J. (1993). The involvement of a spliceosome component in internal initiation of human rhinuvirus RNA translation./. Gen. Virol. 74, 1775-1788.

16. Borovjagin, A. V., Evstafieva, A. G., Ugarova, T. Y., and Shatsky, I. N. (1990). A factor that specifically binds to the 5'-untranslated region of encephalomyocarditis virus RNA. FEBS Lett. 261, 237-340.

17. Brown, F., Newman, J., Stott, J., Porter, A., Frisby, D., Newton, C., Carey, N., and Fellner, P. (1974). Poly(C) in animal viral RNAs. Nature (London). 251, 342-344.

18. Brown, B. A. and Ehrenfeld, E. (1979). Translation of poliovirus RNA in vitro: Changes in cleavage pattern and initiation sites by ribosomal salt wash. Virology 97, 396-405.

19. Brown, E. A., Day, S. P., Jansen, R. W., and Lemon, S. M. (1991). The 5' nontranslated region of hepatitis A virus: secondary structure and elements required for translation in vitro. J. Virol. 65, 5828-5838.

20. Buckley, В., and Ehrenfeld, E. (1987). The cap-binding protein complex in uninfected and poliovirus-infected HeLa cells. J. Biol. Chem. 262, 13599-13606.

21. Calenoff, M. A., Badshah, С. S., Dal Canto, M. C., Lipton, H. L., and Rundell, M. K. (1995). The leader polypeptide of Theiler's virus is essential for neurovirulence but not for virus growth in BHK cells. J.Virol. 69, 5544-5549.

22. Chen, H. H., Kong, W. P., Zhang, L., Ward, P. L., and Roos, R. P. (1995). A picornavirai protein synhesized out of fram with the polyprotein plays a key role in a virus-induced immune-mediated demyelinating disease. Nature Medicine 1, 927-931.

23. Dasso, M. C., Milburn, S. C., Hershey, J. W. В., and Jackson, R. J. (1990). Selection of the 5'-proximal translation initiation site is influenced by mRNA and eIF-2 concentrations. Eur. J. Biochem. 187, 361-371.

24. Dorner, A. J., Rothberg, P. G., and Wimmer, E. (1981). The fate of VPg during in vitro translation of poliovirus RNA. FEBS Lett. 132, 219-223.

25. Dorner, A. J., Semler, B. L., Jackson, R. J., Hanecak, R., Duprey, E., and Wimmer, E. (1984). In vitro translation of poliovirus RNA: utilization of internal initiation sites in reticulocyte lysate. J. Virol. 50, 507-514.

26. Del Angel, R. M., Papavassiliou, A. G., Fernandez-Tomas, C., Silverstein, S. J., and Racaniello, V. R. (1989). Cell proteins bind to multiple sites within the 5'-untranslated region of poliovirus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 82998303.

27. Devaney, M. A., Vakharia, V. N., Lloyd, R. E., Ehrenfeld, E., and Grubman, M. J. (1988). Leader protein of foot-and- mouth disease virus is requied for cleavageof the p220 component of the cap-binding protein complex. J. Virol 62, 44074409.

28. Dever, Т. E., Feng, L., Wek, R. C., Cigan, A. M., Donhue, T. F., and Hinnebusch, A. G. (1992). Phosphorylation of initiation factor 2 alpha by protein kinase GCN2 mediates gene-specific translational control of GCN4 in yeast. Cell 68, 585-596.

29. Ehrenfeld, E. (1984). Picornavirus inhibition of host cell protein synthesis. Compr. Virol. 19, 177-221.

30. Etchison, D., and Fout, S. (1985). Human rhinovirus 14 infection of HeLa cells results in the proteolytic cleavage of the p220 cap-binding complex subunit and inactivates globin mRNA translation in vitro. J. Virol. 54, 634-638.

31. Forss, S., Strebel, K., Beck, E., and Schaller, H. (1984). Nucleotide sequence and genome organization of foot-and-mouth disease virus. Nucleic Acids Res. 12, 6587-6601.

32. Fu, J., Rodrigues, M., and Roos, R. P. (1990a). Strains from both Theiler's virus subgroups encode a determinant for demyelination. /. Virol. 64, 6345-6348.

33. Fu, J., Stein, S., Rosenstein, L., Bodwell, Т., Routbort, M., Semler, B. L., and Roos, R. P. (1990b). Neurovirulence determinants of genetically engineered Theiler viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 4125-4129.

34. Glass, M. J., and Summers, D. F. (1992). A cis-acting element within the hepatitis A virus 5'-non-coding region required for in vitro translation. Virus Res. 26, 15-31.

35. Gottlieb, E., and Steitz, J. A. (1989b). The RNA binding protein La influences both the accuracy and the efficiency of RNA polymerase III transcription in vitro. EMBO J. 8, 841-850.

36. Gottlieb, E., and Steitz, J. A. (1989a). Function of the mammalian La protein: evidence for its action in transcription termination by RNA polymerase III. EMBO J. 8, 851-861.

37. Goumans, H., Thomas, A., Verhoeven, A., Voorma, H. O., and Benne, R. (1980). Therole of eIF-4C in protein synthesis initiation complex formation. Biochem. Biophys. Acta. 608, 39-46.

38. Grant, R. A. Filman, D. J., Fujinami, R. S., Icenogle, J. P., and Hogle, J. M. (1992). Three-dimensional structure of Theiler's virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2061-2065.

39. Haller, A. A., and Semler, B. L. (1995). Stem-loop structure synergy in binding cellular proteins to the 5' noncoding region of poliovirus RNA. Virology 206, 923934.

40. Hellen, C. U. T, Pestova, Т. V., Litterst, M., and Wimmer, E. (1994). The cellular polypeptide p57 (pyrimidine tract-binding protein) binds to multiple sites in the poliovirus 5' nontranslatcd region. J. Virol. 68, 941-950.

41. Hewlett, M. J., Rose, J. K., and Baltimore, D. (1976). 5'-terminal structure of poliovirus polyribosomal RNA is pUp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 327-330.

42. Hinnebusch, A. G., Jackson, В. M., and Mueller, P. P. (1988). Evidence for regulation of reinitiation in translational control of GCN4 mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7279-7283.

43. Hunt, T. (1985). False starts-in translational control of gene expression. Nature (London). 316, 580-581.

44. Hunt, S. L., Hsuan, J. J., Totty, N., and Jackson, R. J. (1999). unr, a cellular cytoplasmic RNA-binding protein with five cold shock domains, is required for intenal initiation of translation of human rhinovirus RNA. Genes Dev. 13, 437448.

45. Hunt, S. L, and Jackson, R. J. (1999). Polypyrimidine tract-binding protein (PTB) is necessary, but not sufficient, for efficient internal initiation of translation of human rhinovirus-2. RNA 5, 344 359.

46. Hyypia, Т., Horsnell, C., Maaronen, M., Khan, M., Kalkkinen, N., Auvinen, P., Kinnunen, L., and Stanway, G. (1992). A distinct picornavirus group identified by sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8847-8851.

47. Jackson, R. J.,and Hunt, S. L. (1983). Preparation and use of nuclease treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic mRNA. Methods Enzymol. 96, 50-74.

48. Jackson, R. J., Hunt, S. L., Gibbs, C. L., and Kaminski, A. (1994). Internal initiation of translation of picornavirus RNAs. Mol. Biol. Rep. 19, 147-159.

49. Jackson, R. J, and Kaminski, A. (1995). Internal initiatinn of translation in eukaryotes: the picornavirus paradigm and beyond. RNA 1, 985-1000.

50. Jakob, J., and Roos, R. (1996). Molecular determinants of Theiler's murine encephalomyelitis- induced disease. J. NeuroVirol. 2, 70-77.

51. Jang, S. K., Davies, M. V., Kaufman, R. J., and Wimmer, E. (1989). Initiation of protein synthesis by internal entry of rebosomes into the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo. /, Virol. 63, 1651-1660.

52. Jang, S. K., and Wimmer, E. (1990). Cap-independent translation of encephalomyocarditis virus RNA: structural elements of the internal ribosomalentry site and essential binding of a cellular 57 kDa protein. Genes Dev. 4, 15601572.

53. Jarousse, N., Grant, R. A., Hogle, J. M., Zhang, L., Senkowski, A., Roos, R. P., Michiels, Т., Brahic, M., and McAllister, A. (1994). A single amino acid change determines the persistence of a chimeric Theiler's virus. J. Virol. 68, 3364-3368.

54. Jarousse, N., Martinat, C., Syan, S., Brahic, M., and McAllister, A. (1996). Role of VP2 amino acid 141 in tropism of Theiler's virus within the central nervous system. J. Virol. 70, 8213-8217.

55. Kaminski, A., Hunt, S. L., Patton, J. G., and Jackson, R. J. (1995). Direct evidence that polypyrimidine tract binding protein (PTD) is essential for internal initiation of translation of encephalomyocarditis virus RNA. RNA 1, 924-938.

56. Kaminski, A., and Jacksori, R. J. (1998). The polypyrimidine tract binding protein (PTB) requirement for internal initiation of translation of cardiovirus RNAs is conditional rather than absolute. RNA 4, 626-638.

57. I<ozak, M. (1978). How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell 15, 1109-1123.

58. ICozak, M. (1981). Mechanism of mRNA recognition by eukaryotic ribosomes during initiation of protein synthesis. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 93, 81-123.

59. Kozak, M. (1984a). Compilation and analisis of sequences upstream from the translationai start site in eukaryotic mRNAs. Nucl. Acids Res. 12, 857-871.

60. Kozak, M. (1984b). Selection of initiation sites by eucaryotic ribosomes: effect of inserting AUG triplets upstream from the coding sequence for preproinsulin. Nucl. Acids Res. 12, 3873-3893.

61. Kozak, M. (1986a). Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44, 283-292.

62. I<ozak, M. (1986b). Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83, 2850-2854.

63. Kozak, M. (1989a). The scanning model for translation: an update. J. Cell. Biol. 108, 229-241.

64. Kozak, M. (1990). Downstream secondary structure facilitates recognition of initiator codons by eukaryotic ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 83018305.

65. Kong, W. P., and Roos, R. P. (1991). Alternative translation initiation site in the DA strain of Theiler's murine encephalomyelitis virus. J. Virol. 65, 3395-3399.

66. Kong, W. P., Ghadt, G. D., and Roos, R. P. (1994). Involvement of cardiovirus leader in host cell-restricted virus expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1796-1800.

67. Kuge, S., and Nomoto, A. (1987). Construction of viable deletion and insertion mutants of the Sabin strain of type 1 poliovirus: Function of the 5' noncoding sequence in viral replication. J. Virol. 61, 1478-1487.

68. Kunkel, T. A. (1985). Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phcnotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492.

69. Lamphear, B. J., Kirchweger, R., Skern, Т., and Rhoands, R.E. (1995). Mepping of functional domains in eukaryotic protein synthesis initiation factor 4G (eIF4G) with picornaviral proteases. J. Biol. Chem. 270, 21975-21983.

70. Lee, Y. F., Nomoto, A., Detjen, M. В., and Wimmer, E. (1977). A protein covalently linked to poliovirus genome RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5963.

71. Lee, K. A. W., Edery, I., and Sonenberg, N. (1985). Isolation and structural characterization of cap-binding proteins from polio virus-infected HeLa cells. J. Virol. 54, 515-524.

72. Lehrich, J. R., Arnason, B. G. W., and Hochberg, F. H. (1976). Demyelinative myelopathy in mice induced by the DA virus. J. Neurol. Sci. 29, 149-160.

73. Lipton, H. L. (1975). Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect. Immun. 11, 1147-1155.

74. Lipton, H. L., Twaddle, G., and Jelachich, M., L. (1995). The predominant virus antigen burden is present in macrophages in Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV)-indused demyelinating disease. . J. Virol. 69, 2525-2533.

75. Lipton, H. L., and Jelachich, M., L. (1997). Molecular pathogenesis of Theiler's murine encephalomyelitis virus-induced demyelinating disease in mice. Intervirol. 40, 143-152.

76. Luo, M., Cunheng, H., Toth, K. S., Zhang, С. X., and Lipton, H. L. (1992). Three-dimensional structure of Theiler's murine encephalomyelitis virus (BeAn strain). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 2409-2413.

77. Luo, M., Toth, K. S., Zhou, L., Pritchard, A., and Lipton, H. (1996). The structure of a highly virulent Theiler's murine encephalomyelitis virus (GDVII) and implications for determinants of viral persistence. Virology 220, 246-250.

78. Luz, N., and Beck, E. (1990). A cellular 57 kDa protein binds to two regions of the internal translation initiation region of foot-and-mouth disease virus. FEBS Lett. 269, 311-314.

79. Luz, N., and Beck, E. (1991). Interaction of a cellular 57-kilodalton protein with the internal translation initiation site of foot-and-mouth disease virus. J. Virol. 65, 6486-6494.

80. Macejak, D. C., and Sarnow, P. (1991). Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature 353, 90-94.

81. Mader, S., Lee, H., Pause, A., and Sonenberg, N. (1995). The translation initiation factor eIF-4E bind to a common motif shared by the translation factoreIF-4gamma and the translational repressors, 4E-binding proteins. Mol. Cell. Biol. 15, 4990-4997.

82. Martinat, C., Jarousse, N. Prevost, M. C., and Brahic, M. (1999). The GDVII strain of Theiler's virus spreads via axonal transport. J. Virol. 73, 6093-6098.

83. McCright, I. J., Tsunoda, I., Whitby, F. G., and Fujinami, R. S. (1999). Theiler's viruses with mutation in loop I of VP1 lead to altered tropism and pathogenesis. J. Virol. 73, 2814-2824.

84. Mccrc vitch, K., Nicholson, R., and Sonenberg, N. (1991). In vitro mutational analisis of cis-acting RNA translational elements within the poliovirus type 2 5'-untranslated region. J. Virol. 65, 5895-5901.

85. Merrick, W. S. (1992). Mechanism and regulation of eukaryotic protein synthesis. Microbiol. Rev. 56, 291-315.

86. Meyer, K., Petersen, A., Niepmann, M., and Beck, E. (1995). Interaction of eukaryotic initiation factor eIF-4B with a picornavirus internal translation initiation site. J. Virol. 69, 2819-2824.

87. Met hot, N. Pause, A., Hershey, J. W. В., and Sonenberg, N. (1994). The translation initiation factor eIF-4B contains an RNA binding region that is distinct and independent from its ribonucleoprotein consensus sequence. Mol. Cell. Biol. 14, 2307-2316.

88. Methot, N., Pickett, G., Keene, J. D., and Sonenberg, N. (1996). In vitro RNA selection identifies RNA ligands that specifically bind to eukaryotic translation initiation factor 4B: the role of the RNA recognition motif. RNA. 2, 38-50.

89. Nakaya, K., Ranu, R. S., and Wool, I. G. (1974). Dissociation of skeletal muscle ribosomes from normal and diabetic animals by initiation factors eIF-3. Biochem. Biophys. Res. Commun. 59, 237-242.

90. Naranda, Т., Strong, W. В., Menaya, J., Fabbri, B. J., and Hershey, J. W. B. (1994). Two structural domains of initiation factor eIF-4B are involved in binding to RNA. J. Biol. Chem. 269, 14465-14472.

91. Nicholson, R., Pelletier, J., Le, S.-Y., and Sonenberg, N. (1991). Structural and functional analysis of the ribosome landing pad of poliovirus type 2: in vivo translational studies. J. Virol. 65, 5886-5894.

92. Palmenberg, A. C. (1989). Sequence alignments of picornaviral capsid proteins, in Molecular Aspects of Picornavirus Infection and Detection. Semler, B. L. and Ehrenfeld, E., eds. American Society of Microbiology, Washington, DC, 211-242.

93. Pelletier, J., and Sonenberg, N. (1985). Insertion mutagenesis to increase secondary structure within the 5' noncording region of a eucaryotic mRNA reduces translational efficiency. Cell 40, 515-526.

94. Pelletier, J., and Sonenberg, N. (1988). Internal initiation of translation of eucaryotic mRNA directed by a sequence dirived from poliovirus RNA. Nature 334, 320-325.

95. Pelletier, J., Kaplan, G., Racanielo, V. R., and Sonenberg, N. (1988a). Translational efficiency of poliovirus mRNA: Mapping inhibitory cis-akting elements within the 5' noncoding region. J. Virol. 62, 2219-2227.

96. Pelletier, J., Kaplan, G., Racanielo, V. R., and Sonenberg, N. (1988b). Cap-independent translation of poliovirus mRNA is conferred by sequence elements within the 5' noncording region. Mol. Cell. Biol. 8, 1103-1112.

97. Pelletier, J., and Sonenberg, N. (1989). Internal binding of eucaryotic ribosomes on poliovirus RNA: translation in HeLa cell extracts. J. Virol. 63, 441-444.

98. Peter son, D. Т., Merrick, W.C., and Safer, B. (1979). Binding and release of radiolabeled eukaryotic initiation factors 2 and 3 during SOS initiation complex formation. J. Biol. Chem. 254, 2509-2510.

99. Pestova, Т. V., Hellen, C. U. Т., and Shatsky, I. N. (1996a). Canonical eukaryotic initiation factors determine initiatinn of translation by internal ribosomal entry. Mol Cell. Biol. 16, 6859-6869.

100. Pestova, Т. V., Lomakin, J. В., Lee, J. H., Choi, S. K., Dever, Т. E., and Hellen, C. U. T. (2000). The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature 403, 332-335.

101. Pever, D. C., Borkowski, J., Calenoff, M., Oh, С. K., Ostrowski, В., and Lipton, H. L. (1988). Insights into Theiler's virus neurovirulence based on a genomic comparison of the neurovirulent GDVII and virulent BeAn strains. Virology 164, 1-12.

102. Pilipenko, E. V., Blinov, V. M., Chernov, В. K., Dmitrieva, Т. M., and Agol, V. I. (1989b). Conservation of the secondary structure elements of the 5'-untranslated region of cardio- and aphthovirus RNAs. Nucl. Acids Res. 17, 57015711.

103. Pilipenko, E. V., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Svitkin, Y. V., Sinyakov, A. N. Agol, V. I. (1992). Prokaryotic-like cis element in the cap-independent internal initiation of translation on picornavirus RNA. Cell 68, 119-131.

104. Pilipenko, E. V., Pestova, Т. V., Kolupaeva, V. G., Khitrina, E. V., Poperechnaya, A. N., Agol, V.I., and Hellen, C. U. T. (2000). A cell cycle-dependent protein serves as a template-specific translation initiation factor. Genes. Dev. 14, 2028-2045.

105. Ray, B. 1С., T. G. Kramer, M. H. Cladaras, J. A. Grifo, R. D. Abramson, W. C. Merrick, and R. E. Thach. (1985). ATP-dependent unwinding of messenger RNA structure by eukaryotic initiation factors. J. Biol. Chem. 260, 7651-7658.

106. Reed, L. J., and Muench, H. (1938). A simple method of estimaing fifty per cent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497.

107. Rodriguez, M., and Roos, R. P. (1992). Pathogenesis of early and late disease in mice infected with Theiler's virus, using intratypic recombinant GDVII/DA Viruses. J. Virol. 66, 217-225.

108. Rivera, V. M., Welsh, D., and Maizel, J. V. (1988). Comparative sequence analysis of the 5' noncoding region of the enteroviruses and rhinoviruses. Virology 165, 42-50.

109. Rozen, F., Edery, I., Meerovitch, K., Dever, Т. E., Merrick, W.C., and Sonenberg, N. (1990). Bidirectional RNA helicase activity of eukaryotic translation initiation factors 4A and 4F. Mol. Cell. Biol. 10, 1134-1144.

110. Roos, R., Casteel, N. (1992). Determinants of neurological disease induced by Theiler's murine encephalomyelitis virus. In: Roos R. P. (Ed), Molecular Neurovirology: Pathogenesis of Central Nervous System Infections. Humana Press: Totowa, NJ, 283-318.

111. Rossi, С. P., Delcroix, M., Huitinga, I., McAllister, A., van Rooijen, N., Claassen, E., and Brahik, M. (1997). Role of macrophages during Theiler's virus infection. J. Virol. 71, 3336-3340.

112. Sangar, D. V., Rowlands, D. J., Harris, T. J. R., and Brown, F. (1977). Protein covalently linked to foot-and-mouth disease virus RNA. Nature 268, 648650.

113. Sedman, S. A., Gelembiuk, G. W., and Mertz, J. E. (1990). Translation initiation at a downstream AUG occurs with increased efficiency when the upstream AUG is located very close to the 5' cap. J. Virol. 64, 453-457.

114. Slobodskaya, O. R., Gmyl, A. P., Maslova, S. V., Tolskaya, E. A., Victorova, E. G., and Agol, V. I. (1996). Poliovirus neurovirulence depends on the presence of a cryptic AUG upstream of the initiator codon. Virology 221, 141-145.

115. Sonenberg, N., Morgan, M. A., Merrick, W.C., and Shatkin, A. J. (1978) A polypeptide in eukaryotic initiation factors that crosslinks specifically to the 5'-terminal cap in mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 4843-4847.

116. Staehelin, Т., Trachsel, H., Erni, В., Boschetti, A., and Schreier, M. H. (1975). The mechanism of initiation of mammalian protein synthesis. FEBS Proc. Meet. 39, 309-323.

117. Stan way, G., Hughes, P. J., Mountford, R. C., Minor, P. D., and Almond, J. W. (1984). The complete nucleotide sequence of a common cold virus: human rhinovirus 14. Nucleic Acids Res. 12, 7859-7875.

118. Scheper, G. S., Thomas, A. A. M., and Voorma, H. O. (1991). The 5' untranslated region of encephalomyocarditis virus contains a sequence for very efficient binding of eucaryotic initiation factor eIF2/2B. Biochem. Biophys. Acta 1089, 220-226.

119. Scheper, G. S., Voorma, H. O., and Thomas, A. A. M. (1992). Eucaryotic initiation factors-4E and -4F stimulate 5' cap-dependent as well as internal initiation of protein synsesis. /. Biol. Ckem. 267, 7269-7274.

120. Scheper, G. S., Voorma, H. O., and Thomas, A. A. M. (1994). Binding of eukaryotic initiation factor-2 and trans-acting factors to the 5' untranslated region of encephalomyocarditis virus RNA. Biochem. 76, 801-809.

121. Svitkin, Y. V., Maslova, S. V., and Agol, V. I. (1985). The genomes of attenuated and virulent poliovirus strains differ in their in vitro translation efficiencies. Virology 147, 243-252.

122. Svitkin, Y. V., Pestova, Т. V., Maslova, S. V., and Agol, V. I. (1988). Point mutations modify the response of poliovirus RNA to a translation initiation factor: a comparison of neurovirulent and attenuated strains. Virology 166, 394-404.

123. Svitkin, Y. V., Cammack, N., Minor, P. D., and Almond, J. W. (1990). Translation deficiency of the Sabin type 3 poliovirus genome: association with an attenuating mutation C472-^U. Virology 175, 103-109.

124. Tangy, F., McAllister, A., Aubert, C., and Brahic, M. (1991). Determinants of persistence and demyelination of the DA strain of Theiler's virus are found only in the VP1 gene. /. Virol. 65, 1616-1618.

125. Trachel, H., Erni, В., Schreier, M. H., and Staehelin, T. (1977). Initiation of mammalian protein synthesis: the assembly of the initiation complex with purified initiation favtors. J. Mol. Biol. 116, 755-767.

126. Trono, D., Andino, R., and Baltimore, D. (1988a). An RNA sequence of hundreds of nucleotides at the 5' end of poliovirus RNA is involved in allowing viral protein synthesis. J. Virol. 62, 2291-2299.

127. Trono, D., Pelletier, J., Sonenberg, N., and Baltimore, D. (1988b). Translation in mammalian cells of a gene linked to the poliovirus 5' noncoding region. Science 241, 445-448.

128. Wada, Y., Pierce M. L., Fujinami R. S. (1994). Importance of a amino acid 101 within the capsid protein VP1 for modulating of Theiler's virus-induced disease. /. Virol. 68, 1219-1223.

129. Walter, B. L., Nguyen, J. H. C., Ehrenfeld, E., and Semler, B. L. (1999). Differential utilization of poly(rC) binding protein 2 in translation directed by picornavirus IRES elements. RNA. 5, 1570-1585.

130. Witherell, G. W., Gil, A., and Wimmer, E. (1993). Interaction of polypyrimidine tract binding protein with the encephalomyocarditis virus mRNA internal ribosomal entry site. Biochem. 32, 8268-8275.

131. Wimmer, E., Hellen, C. U. T.and Cao, X. (1993). Genetics of poliovirus. Annu. Rev. Genet. 27, 353-436.

132. Zhang, L., Senkowski, A., Shim, В., and Roos, R. P. (1993). Chimeric cDNA studies of Theiler's murine encephalomyelitis virus neurovirulence. J. Virol. 67, 4404-4408.

133. Zhou, L., Green, T. J., Lipton, H. L., and Luo, M. (1997). Role of sialyloligosaccharide binding in Theiler's virus persistence. /. Virol. 71, 97019712.