Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Нейроспецифичные детермгаанты З'-концевой части 5'-петранслируемой области вируса полиомиелита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Нейроспецифичные детермгаанты З'-концевой части 5'-петранслируемой области вируса полиомиелита"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ ИМ. М.П. ЧУМАКОВА

на нравах рукописи УДК 578.221

Слободская Ольга Романовна

Нейроспецнфичные детерминанты З'-концевой части 5'-нетранслируемой области вируса полиомиелита

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА

1998

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН

Научный руководитель:

Член-корр. РАН и РАМН, доктор биологических наук, профессор В. И. Агол

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор медицинских наук, профессор Ю. 3. Гендон

Доктор биологических наук Н. П. Родионова

Институт биологии гена РАН

Защита состоится «з » июня 1998 г. в часов на заседании диссертационного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, н/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.И.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан « » мая 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук /) О. А. Медведкина

ОБ1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание и 50-х годах штаммов полиовирусной вакцины опиралось на эмпирический, во многом интуитивный, подход. В последующие годы были полигоны обширные знания о строении и функционировании вируса полиомиелита и родственных ему других пикорнавирусоп. Известно, что вирусные детерминанты хозяннспецифичности определяют круг хозяев, клеточный тропизм, вирулентность и ряд других свойств вирусов. Изучение этих детерминант является важной частью исследований молекулярного патогенеза вирусных заболеваний. Частные особенности взаимодействия вирусов с клетками отражают как различные способы реализации вирусных генетических программ, так и особенности физиологии клеток разных тканей и разных видов животных. Картирование вирусных детерминант хозяинспецифичкости открывает возможность направленного изменения вирулентных свойств вирусов. Если локализовать и геноме пикорнавирусов детерминанты, необходимые для репликации в тканях, поражение которых приводит к появлению симптомов заболевания, то можно сконструировать аттенуированные штаммы, у которых детерминанты вирулентности необратимо модифицированы или удалены. Такие штаммы способны служить безопасной живой вакциной. Стадии взаимодействия вируса с клеткой, харакгерные для конкретной вирусной инфекции, могут быть мишенью лекарственных средств.

Одним из перспективных кандидатов для поиска тканеспецифичных детерминант является 5'-нетранслируемая область (5НТО) пикорнавирусной РНК. Участвуя в контроле репликации и трансляции вирусных РНК, 5НТО взаимодействует с клеточными факторами, набор которых различается в клетках разных тканей. Известны аттецуируютцие мутации вируса полиомиелита в регуляторном трансляционном элементе 5НТО - IRES (internal ribosome entry site). Участок 5HTO полиовируса длиной около 150 нт, расположенный к З'-концу от IRES, является характерным для энтероЕирусов и может, как и IRES, нести детерминанты энтеровирусной нейроснецифичности.

Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было картирование нейроспецифических детерминант в сегменте 5НТО полиовируса, расположенного к З'-концу от сайга внутренней посадки рибосомы IRES. Ранее в нашей лаборатории были выделены мутантные штаммы полиовируса, содержащие протяженные делении (-160 нт) в 5НТО (Pilipeako et al., 1992, Gmyl et al., 1993). Делении захватывали весь расположенный к З'-концу or IRES сегмент 5НТО, состоящий из нескольких структурных элементов. В задачи исследования входило изучение способности делешкшных мутантов размножаться в нервных клетках in vivo. Для выполнения этой задачи была разработана модель тестирования нейровпрулентности полиовируса на лабораторных мелких грызунах, хлопковых крысах и мышах. После того, как было определено, что делецин обладают сильным аттенунрующим действием, следующей задачей было выяснение роли каждого из структурных элементов, отсутствующих у делециопных мутантов, в проявлешш вирулентного фенотипа полиовируса. Для этого были созданы штаммы с мутациями соответствующих цые-элементов, изучена их иейровирулентность и охарактеризованы ревертанты, возникающие при репликации п ЦНС животных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе показано, что делецня З'-коицевой части 5НТО, в результате которой происходит сближепис IRES и ишщиаторного кодона AUG, приводит к аттснуации вируса полиомиелита. Установлено, что аттенуация мутантов с протяженными делениями не связана с отсутствием структурных элементов, образованных З'-концевой частью 5НТО. Впервые показано, что присутствие мотива, содержащего критический триплет AUG, поблизости от З'-границы IRES необходимо для эффективного размножетш полиовируса в нервных метках in vivo. Необходимость дополшггельных сигналов в области 5НТО, осуществляющей контроль инициации трансляции вирусных матриц, в нервных клетках, в отличие от других, указывает на различия в трансляционном аппарате данных клеток. Выполненное картирование нейроспецифических детерминант может

послужить основой для создания нерепертируемых аттенунрованпых штаммов вируса полиомиелита и других нейропатогенных энтеровирусов.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на IX международном вирусологическом конгрессе (Глазго, Великобритания, 1993), на VIII конференции "Молекулярная биология пикорнавирусов" (Коирилампи, Финляндия, 1994), на симпозиуме "РНК-реплнкоп" (Кобе, Япония, 1994), на IV международном симпозиуме "Позитивные РНК-вирусы" (Утрехт, Нидерланды, 1995), а также на семинарах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста и состоит из традиционных разделов. Диссертация содержит 12 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 181 источник.

Использованные сокращения. БОЕ - блящкообразующая единица; КПЗМ - почки африканской зеленой мартышки (первичная культура); нт -нуклеотид(ы); 5НТО - 5'-нетранслируемая область; ОПТ олигопнримидшговыи тракт; ОРС - открытая рамка считывания; ЦНС -центральная нервная система; 1RES - Internal Rjbosome Entry Site, внутренний участок присоединения рибосомы; тп - mouse-neurovirulent, нейровирулентный для мышей (штамм полиовируса); PD50 -paralytogenic dose, доза вируса (в БОЕ), вызывающая параличи или шбель 50% зараженных животных; Tg-PVR - линия мышей, экспрессирующих человеческий рецептор полиовируса, hPVR.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Картирование нейроспецифических детерминант в З'концевой части 5НТО полиовируса типа 1 штамма Mahoncy выполняли посредством создания мутаций п соответствующем участке полиовирусной РНК и исследования нейровирулентности полученных мутантов. Мутации - замены и делеции - вносили методом направленного мутагенеза в плазмнду, в которой был клонирован фрагмент полиовирусной кДНК с координатами 70-1131 (нумерация по последовательности РНК полиовируса типа 1). Фрагмент из этой плазмиды с желаемыми мутациями использовали для

сборки плазмиды, содержащей полиоразмерную копию полиовирусной РНК. В результате трансфекщш культивируемых клеток РНК, синтезированной на полноразмерных плазмидах, получали мутантные вирусы.

Нейровирулентность мутантов полиокируса исследовали на хлопковых крысах и линейных мышах C57B1/6J (питомник "Столбовая", Моск. обл.), а также на трансгснных мьпиах IQI-PVR Tg21, клетки которых экспрессировали человеческий рецептор для нолиовируса (Токийский ун-т, г. Токио). Группы трехнедельных животных но 4-5 хлопковых крыс или по 6-8 мышей заражали в головной мозг десятикратными разведениями вирусов. Нейровирулентность вирусов оценивали с помощью величины PD50, дозы вируса (БОЕ), которая вызывала параличи или гибель 50% животных. PD50 вычисляли по методу Reed and Muench (1938) и обычно соотносили с PD50 вирулентного контроля. Определение PD50 каждого мутанта выполняли не менее двух раз на мышах и, в некоторых случаях, один раз - на хлопковых крысах.

В соответствии со стандартными протоколами исследовали ряд параметров размножения вирусов в культивируемых клетках (кинетика размножения в одном цикле инфекции, ¿¿-фенотип и размер бляшек), а также матричную активность вирусной РНК в бесклеточной системе из клеток Кребс-2.

Результаты и обсуждение.

1. Выбор лабораторной модели для исследования нсйровирулентности полаовируса

В качестве исходного вируса, в генетическом контексте которого тестировали отдельные мутации на нормальных мышах и хлопковых крысах, в нашей работе был использован патогенный для мелких грызунов вариант штамма Mahoncy, называемый здесь Mali(L), (любезно предоставленный В. Ракаииелло) (Murray et al., 1988). Вирус Mah(L) вызывал у мышей полиомиелитоподобное заболевшше, проявляющееся в виде парезов или параличей конечностей и в 95% приводящее к гибели заболевших животных. Мы определили PD50 вируса Mali(L), которая

составила 1,2х105 БОЕ для нормальных мышей C57BI и 2х103 БОЕ для хлопковых крыс (Табл. 1).

Прежде, чем приступить к исследованию влияния сконструированных мутаций на нейровнрулентность, мы оценили диапазон возможного изменения вирулентности полиовируса. Для этого мы ввели известные аттенуирующие мутации в геном вируса Mah(L) посредством замены участка между позициями 70 и 987 на гомологичный от вакцинного штамма 1-го тина Sabinl. Полученный рскомбинант Mah(L)/Sab отличался от Mah(L) пятью нуклеотидными заменами, четыре из которых располагались в 5НТО (положения 21, 189, 480 и 674), а пятая приводила к аминокислотной замене Лб5—>S в капсидном белке VP4. Вирулентность Mah(L)/Sab была существенно снижена (Табл. 1). Таким образом, влияние точечных аттенуирующих мутаций штамма Sabinl, расположенных на участке РНК с 70 по 987 нт, практически незаметное при размножении вируса in vitro, приводило к существенному нарушению репликации вируса в ЦНС мелких грызунов (Табл. 1). Диапазон аттенуащш нейровирулентносш, равный соотношению PD50 атгенуированного и вирулентного штаммов, составил два порядка для мышей и более пяти порядков для хлопковых крыс.

Эти эксперименты показали, что мелкие грызуны могут являться

Таблица 1

Свойства вирусов Mah(L) и Mah(L)/Sab

Вирус Размер бляшек3 ts фенотип6 Урожай вируса® PD50" (для мышей) PD501' (для крыс)

Mah(L) 4,5 0,20 4, 0x1 О3 1, 2х105 2х103

Mah(L)/Sab 3,2 0, 07 4, 1x103 1, 6х107 >2x10"

Sabl н.о.л <0,0004 1,3x103 н.о. и.о.

а Н<з клетках 1Ш на 3-ий день после заражения.

0 Отношение урожая вируса в клетках НеЬа при 39,5°С к урожаю при Зб,5°С.

в БОЕ/клетка, в клетках НеЬа при 36,5°С через 7 ч после заражения.

г Выражены в БОЕ, титры определяли на КПЗМ. д и.о., не определяли.

моделью для изучения влияния мутаций в 5НТО на нейровирулентность полиовируса. Также было исследовано влияние нескольких ключевых мутаций на нейровирулентность полиовируса для Tg-PVR мышей.

2. Нейровирулентность мутантов с протяженными

делециями в 5НТО Ранее в лаборатории были изолированы возникшие естественным путем мутанты штамма Mahoney, содержащие протяженные делеции (>150 нт), захватившие З'-концевую часть 5НТО (Pilipcnko et al., 1992; Gmyl et al., 1993). Расстояние между двумя важными регуляторными элементами 5НТО, консервативным блоком пиримидинов 559UUUC и AUG, у этих вирусов было близко к оптимальному, только место критического 535AUG занял инициаторный 743AUG. Репродукция мутантов в ряде клеточных культур и матричная активность их РНК в бесклеточных системах трансляции была сравнима с репродукцией вируса дикого типа.

О Домен D

Э Mah(L)

9

6«2 V

Домен Е

О

ОПТ Спсйсер S

7«

-шаз'

Э Mah(L)/74 (Mah(l)/90)

602 (581) I

723

(7«)

О

3 Mah(L)/AE24P

CS2 030

ojuua /ixl—

743

-AUQ3*

О

Э MahfUtoS

VI«» 733 743

!_AU03'

о

3 Mah(L)/AES24P

662

4UUUQ ЛШ

7S3 743

LAUQS

о

3 Mah(L)/ziES47y

бег _ UjuucOIB™..

Рис. 1. Схематическое изображение участка 5НТО мутантов.

Таблица 2

Нейровирулентность делеционных мутантов

вирус1 Отн. аттенуация ь

норм мыши хл. крысы Tg-PVR мыши

/74 240 >1000 >3200

/90 >230 >13000

/Д154 107 >1000

/AS 1, 1 1

/ДЕ24Р 1, 8 1

MES24P 21 10 1

/AES47M 1, 0 5

/AES47P 1, 1

/EG4P >86

Mah(L)/Mah 1 1 1

а Нейровирулентность мутантов, сконструированных на основе Mah(L), исследовали на нормальных мышах и хлопковых крысах, а сконструированных на основе Mah - на трансгенных Tg-PVR мышах. 6 PD5o мутанта /PD50 вирулентного контроля.

Протяженные делении этих мутантов штамма Mahoney были перенесены нами в геном Mah(L), в результате чего были получены вирусы Mah(L)/74 и /90 (Рис. 1). Для животных оба мутанта с протяженными делениями оказались высоко аттенуированными (Табл. 2). Этот факт позволил нам предположить, что в утраченном участке РНК находятся детерминанты, необходимые для эффективной репликации полиовируса в ЦНС. У делеционных мутантов отсутствуют полностью или частично следуют i цю три структурных элемента РНК (Рис. 1): (1) олитотгримндиновый тракт, расположенный между доменами D и Е (ОПТ, irr 559-580), (2) консервативный элемент вторичной структуры PI1K, содержащий критический sgßAUG (домен Е, нт 581-618), и (3) спейсер, отделяющий инициаторный 743AUG от домена Е (спейсер S, нт 619-742). Наши дальнейшие усилия были направлены на выяснение вклада каждого из этих элементов в репликацию полиовируса in vivo. С этой целью были сконструированы и охарактеризованы мутанты, у которых, в отличие от Mah(L)/74 и /90 отсутствовали не три, а один или два из вышеперечисленных ^ис-элемеитов, а также ряд мутантов с точечными заменами.

3- Роль отдельных структурных элементов в аттенуации мутантов с протяженными делециями

Олигопиримиданоаый тракт. Пиримидин-богатый спейсер (Рис. 1) между доменами D и Е может быть условно разбит на две части. Одна часть представлена мотивом 559UUUC, находящимся на З'-грашщс IRES и консервирующимся у всех пикорнавирусов. К мотиву 559UUUC примыкает вариабельная часть ОПТ длиной около 10 lrr. У делсционных мутной Mah(L)/74 и /90 за 559UUUC следовал участок РНК, не отличающийся пиримидин-богатым составом. Чтобы определить вклад отсутствия вариабельной части ОПТ в геномах мутантов Mah(L)/74 /90 в их аттенуацию, мы сконструировали и охарактеризовали мутант МаЬ(Ь)/Д154. У мутанта МаЬ(Ь)/Д154 был делегирован участок РНК с коордшгатами 579-732. В результате, у Mah(L)/Д154, как и у описанных выше мутантов Mah(L)/74 и /90, отсутствовали домен Е и спейсер S, но, в отличие от указанных вирусов, весь ОПТ был сохранен неизмененным. Для мышей Mah(L)/A154 оказался высоко аттенуировашшм с PD5q всего в два раза ниже, чем у Mah(L)/74 (Табл. 2). На основании того, что сохранение ОПТ в геноме делеционного мутанта Mah(L)/A154 не привело к восстановлению вирулентности, можно заключить, что причиной аттенуации делецжншых мутантов Mah(L)/74 и 90 не являлось отсутствие вариабельной части ОПТ.

Домен Е. У З'-конца ОПТ находится элемент вторичной структуры полиовируспой 5НТО, домен Е (нт 581-618). Ранее было показано, что удаление домена Е летально для нолиовируса, так ,как влечет за собой исчезновение молчащего 586AUG, критически важного для инициации трансляции. Домен Е оказалось возможным удалить при условии вставки на его место синтетического 24-нт линкера, содержащего AUG в том же контексте, какой имеет sggAUG, в результате чего был получен вирус Mah(L) / АЕ24Р (Рис. 1). Судя по величине PD50 (Табл. 2), Mah(L)/ДЕ24Р оказался столь же вирулентным, как и родительский штамм Mah(L). Данное наблюдение позволило нам заключить, что участок РНК, формирующий домен Е, не несет шплх детерминант, за исключением критического ssgAUG, которые бы оказывали влияние на нейровирулентность поли овируса.

Спейсер S. Для энтеровирусов характерно наличие протяжешгого сегмента РНК, отделяющего инициаторный кодон от последнего консервативного домена Е вторичной структуры 5НТО. Этот спейсер является наиболее вариабельным по нуклеотидной последовательности участком 5НТО энтеровирусоп, сохраняя при этом длину в 126-130 нт. Чтобы определить, не содержатся ли в спейсере S детермшганты нейровирулентности полиовируса, мы сконструировали мутант Mah(L)/AS с делецией этого спенсера (Рис. 1). Было обнаружено, что Mah(L)/AS и Mah(L) имеют сходный уровень нейровирулентности (Табл. 2), что указывало на несущественную роль спейсера S в контроле этого фенотипа.

Нейровирилентностпъ мутантов с одновременной делецией домена Е и спейсера S. Приведенные выше дазшыс о вирулентности мутантов с делениями или домена Е [Mah(L)/AE24P] или спейсера S fMah(L)/AS] позволили нам предположить, что участок РНК, соответствующий этим двум цмс-элементам, не содержит детерминант, важных для размножения вируса в ЦПС, и что аттснуация мутантов Mah(L)/74 и /90 не обусловлена отсутствием этого участка в их геноме. Чтобы проверить эту гипотезу, мы сконструировали три мутанта, в геноме которых отсутствовали как домен Е, так и снейсср S. Вирусы Mah(L)/AES24P, Mah(L)/AES47M и Mab(L)/AES47P содержали одинаковую делению, включающую нт 564732 (Рис. 1). Наличие критического AUG в геноме этих мутантов, как и у мутанта Mah(L)/АЕ24Р, обеспечивал AUG-co держащий синтетический линкер. Инициаторный и критический кодоны AUG у мутанта Mah(L)/AES24P разделяли 11 нт. У вирусов Mah(L)/AES47P и /AES47M это расстояние было увеличено до 34 нт за счет вставки дополнительного 23-нт синтетического линкера. Mah(L)/AES47P и /AES47M различались ориентацией последнего линкера (Рис. 1).

Два мутанта Mah(L)/AES47P и /AES47M обладали такой же вирулентностью, как и родительский штамм Mah(L) (Табл. 2).Данное наблюдение указывало на то, что все элементы, определяющие вирулентный фенотип, присутствуют в геноме этих вирусов. Мутант Mah(L)/AES24P оказался частично аттенуировашиым. Для мышей и хлопков!>1х крыс его

PD50 была, соответственно, в 21 и 10 раз больше, чем PD50 исходного вируса.

Результаты исследования мутантов Mali(L)/AES47M и /AES47P подтвердили, что нейровирулентность полиовируса не изменяется, если участок РНК между критическим и шшциаторным AUG, составляющий домен Е и спенсер S, удален и замещен фрагментом чужеродной РНК длиной 34 нт. Однако, когда два AUG разделяли лишь 11 нт [как у мутанта Mah(L)/AES24P], что привело к сближению иннциаторного AUG и консервативных регуляторных элементов, расположенных к 5'-концу от него, уровень репликации полиовируса в клетках ЦНС был снижен. Разная, хотя в обоих случаях небольшая, степень относительной аттенуации Mah(L)/AES24P для мышей и хлопковых крыс свидетельствовала, что требования к взаимному расположению цис-элементов 5НТО полиовируса у разных хозяев несколько различаются.

Роль контекста криптического AUG. Между IRES и шшциаторным AUG у всех исследованных вирулентных штаммов находился молчащий AUG, а у всех высокоаттенуировшшых - инициаторный AUG. Будет ли кодон AUG молчащим или шшциаторным определяется, в частности, контекстом этого кодона. Чтобы попять, важно ли для эффективного размножения полиовируса in vivo, чтобы AUG, расположенный к З'-концу от IRES, был в любом нешшциагорном контексте или важен конкретный контекст 586AUG, мы исследовали мутант Mah(L)/EG4P, который отличался от вирулентного вируса Mah(L)/AE24P пятью точечными заменами в окружении критического AUG (Рис. 2). Тест на нейровирулентность выявил явное отличие между двумя мутантами. При заражении мышей Mah(L)/EG4P оказался на два порядка более аттенуированным, чем Mah(L)/AE24P (Табл. 2).

Mah(L)/ДЕ24Р sssUUUCCUUUCUUUUUGAUUGUUGCUUAUGGCC

Hah(L)/EG4P 559UUUCCUUUCUUUUUGAUUGUUUUGGAUGCCC

Рис. 2. Структура генома Mah(L)/AE24P и Mah(L)/EG4P, отличающихся окружением криптического кодона AUG. Нуклеотиды Mah(L)/EG4P, отличающиеся от Mah(L)/ДЕ24Р, выделены жирным шрифтом. Криптический AUG подчеркнут.

Сильное аттенуирующее действие изменения контекста критического AUG свидетельствовало о важной роли ближайшего окружения критического 586AUG в репликации полиовируса в клетках нервной ткани.

Нсйровирнлентпостъ мутантов для To-PVR мышей. Для исследования влияния некоторых мутации на нейропирулентность полиовируса для Tg-PVR мышей мы ввели эти мутации в геном немодифицированного штамма Mahoney (мутанты Mali/74, /AES24P, /AES47M, /АЕ24Р и /AS). Два эксперимента на Tg-PVR мышах были проведены в лаборатории А. Номото (Токийский университет). Результаты этих опытов были близки к полученным на нормальных мышах (Табл. 2), но вклад некоторых мутаций несколько отличался. Так, PD50 мутанта с протяжешюй делецией Mah/74 оказалась выше, чем у Mah(L)/74. Мутант Mah/AES24P, в отличие от Mah(L)/AES24P, был вирулентен, как вирус дикого типа, a Mah/AES47M, в отличие от Mah(L)/AES47M, оказался частично аттеиуированным с PD50 в пять раз выше PD50(Mah) (Табл. 2).

Вариацтг РП50 могли быть следствием различий в патогенезе полиовирусной инфекции нормальных и трансгепных мышей, связанных с использованием полиовирусом различных рецепторов на клетках ЦПС нормальных и Tg-PVR мышей. Несмотря на небольшие различия результатов опытов на нормальных и Tg-PVR мышах, подтверждается основной вывод о том, что протяженная делеция мутанта Mah/74 приводит к подавлению репликации полиовируса в клетках ЦНС. Минимальный геном, обеспечивший репликацию в ЦНС Tg-PVR мышей на уровне вируса дикого типа, содержался в мутанте Mali/AES24P. Эти заключения, сделашше для Tg-PVR мышей, могут быть экстраполированы и на человека, так как практически все известные аттенуирующие мутации полиовируса обладают сходным действием при инфекции трансгенных мышей, обезьян и человека.

4. Нейровирулентность вирусов с мутациями в ОПТ

Мы исследовали влияние на нейровирулентность мутаций в вариабельной части ОПТ в геномном контексте вируса дикого типа. Мутанты Mah(L)/03, /ЕХА2, /ЕХА4, различающиеся числом и положением точечных замен в ОПТ в геномном контексте вируса дикого

типа, оказались аттенуированными в разной степени (Табл. 3). Мы не обнаружили прямой зависимости аттенуирующего эффекта мутаций от числа введенных замен. Так, вирус МаЬ(Ю/ЕХА2 с заменой двух нт был более аттенуированпым, чем МаМО/ОЗ с четырьмя точечными заменами. РВ5о мутантов МаЬ(Ь)/03 и /ЕХА4, различающихся положением четырех одинаковых точечных замен, отличалась на порядок. Реверищ, приводящие к восстановлению вирулентности изолятов мутанта МаЬ(Ь)/03 (ревертанты тОЗ-4, -10, -12), в двух случаях из трех не приводили к восстановлению пиримидинового состава данного участка РНК (Табл. 3).

Фенотип этих мутантов по ОПТ можно объяснить в рамках модели, согласно которой эффективность репликации в ЦНС зависит, в том числе, от структурированности участка РНК, по положению соответствующего ОПТ. Расчеты вторичной структуры РНК показали, что у вируса дикого типа этот участок неструктурирован, тогда как у мутантов по ОПТ вероятно образование структуры типа шпильки между доменами Б и Е. Точечные реверсии изолятов гОЗ в сайте исходной мутации или в расположенном рядом участке приводили к восстановлению вирулентности и дестабилизировали предсказшшую шпильку.

Таблица 3

Структура генома и нейровирулентность вирусов олигопиримидиновом тракте с мутациями в

Вирус Нуклеотидная последовательность* Отн. аттену-ация6

МаЬ (Ь) 559 582 1 4, шисстгаилииштиисшесипсиидтсс 1,0

/03 гОЗ-4 ......ОСАв..................... 19

4, 2

гОЗ-Ю ......ЙСАб.............а....... 3, 5

гОЗ-12 0,2

/ЕХА2 .....СС........................ 40

/ЕХА4 145

а В нуклеотидной последовательности мутантов поставлены точки вместо нт, идентичных МаЬ(Ю, дефисы - вместо делетированных нт. Строчными жирными буквами указаны реверсии. 5 РО50 мутанта/РБю МйЬ(Ь) для нормальных ыышей.

i Таким образом, некоторые изменения в составе вариабельной части ОПТ в геномном контексте вируса дикого типа могут значительно снизить нсйровирулентность полиовируса, вероятно, за счет нарушения пространственной организации структурных элементов 5НТО.

5. Репродукция мутантов в культивируемых клетках.

Одной из наших задач было определить, отражают ли какие-нибудь свойства мутантов in zntro уровень их нейровирулентности. Для этого мы исследовали размножение вирусов в культивируемых клетках HeLa и человеческой нейробластомы SK-N-MC, бляшечный и ts фенотипы мутантов.

Урожай как вирулентных, так и атгенуировашшх мутантов, в каждой из клеточных культур был приблизительно одинаков, отличаясь не более, чем в три раза от урожая Mah(L) (Табл. 4). В то же время в клетках SK-N-MC продукция вакцшгного штамма Sabinl была более, чем ¡га два порядка ниже, чем выход Mah(L) (Табл. 4). Отличия в кинетике размножения мутантов заключались в том, что в обеих культурах аттенуированные штаммы Mah(L)/74, /90, /Д154 имели удлиненный на 1-2 часа латентный период по сравнешпо с Mah(L).

На клетках RD аттенуированные мутанты Mah(L)/74, /90, /Д154 и /EG4P образовывали блянгки в ~3 раза меньшего размера, чем Mah(L) Однако размер бляшек аттепуированных мутантов по ОПТ, Mah(L)/EXA2 и /ЕХА4, практически не отличался от размера бляшек вируса дикого тина. (Табл. 4). Ни один из исследованных мутантов не обладал ¿«-фенотипом (Табл. 4).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что все исследованные мутанты, в том числе и высокоаттепуированные, эффективно размножаются в культивируемых клетках разного происхождения, как экстраневрального (IleLa, RD), так и неврального (SK-N-MC).

6. Матричная активность мутантных РНК in vitro.

Матричную активность геномных РНК определяли в бесклеточных экстрактах из клеток асцитной карциномы Кребс-2. Эффективность

, Таблица 4

Свойства мутантных вирусов

Вирус Нейровиру- Размер Урожай в Урожай в Матричная

лентность3 бляшек0 НеЬав SK-N-MC" Фенотип1- активность РНК1

Mah(L) + + 4,5 4, 0x10" 270 0,20 1,00

Mah(L)/74 - 1,6 2, бхЮ3 150 0,23 0,46

Mah(L)/90 - 1,6 1, ЗхЮ3 70 0,13 0,18

Mah(L)/Д154 - 1,6 4, ЗхЮ3 110 0,26 0, 33

Mah(L)/EG4P - 1,4 2,1х103 н.о. 0,20 н.о.

Mah(L)/ЕХА4 - 3,1 н.о. н.о. н.о. 0,40

Mah(L)/ЕХА2 -+ 4,3 н.о. н.о. н.о. н.о.

Mah(L)/03 + н.о. н.о. н.о. н.о. 0, 20

r03-4 ++ н.о. н.о. н.о. н.о. 0,55

гОЗ-Ю + + н.о. н.о. н.о. н.о. 0,55

r03-12 ++ н.о. н.о. н.о. н.о. 0, 60

Mah(L)/AES24P + 3,3 3,3x1О3 270 0,16 0, 24

Mah(L)/AES47M ++ 3,7 4,5x10' 190 0, 14 0,33

Mah(L)/AES47P ++ 3,7 4, 5х103 н.о. 0, 17 0,34

Mah(L)/ДЕ24Р ++ 3,1 3, 2х103 210 0,25 0,26

Mah(L)/AS + + 3,4 2,7х103 н.о. 0, 26 1, 59

Sabl н. о .e н.о. 1, ЗхЮ3 2 <0,0004 Н.О.

а Для нормальных мьшей.

0 Размер бляшек (мм) на монослое клеток ЯИ на 3-ий день после инфекции.

в БОЕ/клетка при Зб,5°С, в клетках НеЬа через 7 ч или в клетках нейробластомы человека БК-Ы-МС через 24 ч

после заражения. г Урожай вируса при 39, 5°/урожай при 36,5°С (НеЪа).

" Радиоактивность предшественника Р1, синтезированного на данной РНК, нормализованная по отношению к

аналогичному показателю МаЬ(Ь). " и.о., не определяли.

трансляции PIIK всех мутантов, как вирулентных, так и аттенуированных, за исключением Mah(L)/AS, была снижена в сравнешш с таковой Mah(L).

РНК едшгственного мутанта Mah(L)/AS с делецней, затрагивающей только спейсер S, обладала необычно высокой белоксиитезирующей активностью, - превысила уровень активности РНК дикого типа в -1,5 раза (Табл. 4).

Только у Mah(L)/03 и его ревертантов можно было отметить наличие прямой корреляции между нейровирулеил гостью и эффективностью трансляции геномной РНК. У этого вируса реверсии, сопровождавшиеся увеличением вирулентности, приводили также и к увеличешпо белоксиитезирующей активности РНК (Табл. 4).

Таким образом, за исключением Mah(L)/03 и его рецертантов, мы не обнаружили корреляции между уровнем нейровирулентности вирусов и матричной активностью их РНК в исследованной бесклеточной системе трансляции.

7. Детерминанты нейровирулентности/аттенуации

Суммируем результаты картирования детерминант

нейровирулентности и ее аттенуации в З'-концевой части 5I1TO вируса полиомиелита. Мы показали, что протяженные делении этого участка 5НТО, возникшие в результате естественных peBepcirii, захватывающие около 160 нт и приводящие к сближению стартового кодона ОРС полиовирусного полипротеина и IRES приводят к потере нейровирулентности. Участок РНК, отсутствующий у аттенуированных мутантов, включал консервативный домен вторичной структуры 5НТО (домен Е), содержащий критический кодон 586AUG, и два спейсера, фланкирующих этот домен с 5'- (ОПТ) и с З'-конца (спейсер S). В результате исследования вирусов, несущих мутации в отдельных структурных элементах З'-концевой части 5НТО, мы определили, какие из этих элементов являются важными для репликации в Ц11С.

Олигопиримидиновый тракт (ОПТ). Отсутствие нуклеотидной последовательности переменной части ОПТ практически не влияло на нейровирулентность мутантов с протяженными делениями [Mah(L)/74 и/90 по сравнению с Mah(L)/А154] (Табл. 5), и, следовательно, не было

Таблица 5

Структура генома и нейровирулентность мутантов "Вирус3 Структура генома6Нейровирулентность

(5'—>3' )

ОПТ AUG E S

/74 - - - - высокоаттен.

/90 - - - - высокоаттен.

/Д154 + - - - высокоаттен.

/03 * + + + частично аттен.

/ЕХА2 * + + + аттен.

/ЕХА4 * + + + высокоаттен.

/EG4P + + * - + высокоаттен.

/ДЕ2 4Р + + - + вирулентный

MS + + + - вирулентный

вирул. для Тд-Р^/И мышей,

/AES24P + + част, аттен. для н.мышей и хл. крыс вирул. для норм, мышей,

MES47M + + - - част, аттен. для Тд-Рта мышей

/AES47P + + - - вирулентный

Mah(L)/Mah + + + + вирулентный

'Нейровирулентность мутантов, сконструированных на основе Mah(L), исследовали на нормальных мышах и хлопковых крысах, а сконструированных на основе МаЬ - на трансгенных Tg-FVR мышах.

0 Показано наличие ( + ), модификация (*) или отсутствие (-) в геноме вирусов ОПТ, криптического AUG (* - в измененном контексте), расположенного между IRES и инициаторным кодоном, домена Е и спейсера S.

причиной аттенуации этих мутантов. Одной из возможных причин толерантности полиовируса к нарушению последовательности ОПТ был измененный геномный контекст данной мутации, а именно отсутствие у дгшных мутантов сегмента 5IITO, расположенного к З'-концу от IRES.

Модификация вариабельной части ОПТ имела иной эффект, чем ее удаление. Так, замены пиримидииов на пурины в переменной части ОПТ в геномном контексте вируса дикого типа аттенуировали нейровирулентность полиовируса [Mah(L)/03, /ЕХА2, /ЕХА4] (Табл. 5). Причиной аттенуации мутантов по ОПТ было, вероятно, изменение шоричной структуры соответствующего участка РНК и, вследствие этого, уменьшение расстояния между цис-элементами 5НТО.

йомен Е и спейсер S. У мутантов, у которых был удален одни из двух цг/с-элементов, домен Е или спенсер S [/АЕ24Р, /ДБ], или оба этих элемента сразу [/AES47P, /AES47M], вирулентность для нормальных мышей сохранялась на уровне, характерном для вируса дикого тина (Табл. 5). Это свидетельствовало о том, что сегмент РНК, соответствуют!!!! домену Е и спейсеру S и включаюнцш около 140 нт, нейроспецифнческих детерминант не содержит. Однако мы столкнулись с тем, что уровень нейровирулентности двух мутантов /AES24P и /AES47M, у которых также удалены домен Е и спейсер S, снижен для некоторых хозяев в пределах одного порядка PDjo- Так, Mah(L)/AES24P был частично аттенуирован для нормальных мышей и хлопковых крыс, a Mah/AES47M был частично аттенуирован для Tg-PVR мышей (Табл. 5). Различия в структуре генома у мутантов /AES24P и /AES47M заключались в длине и составе спейсерного участка между критическим и инициаторным AUG (Рис. 1). Одним из возможных объяснений наблюдаемых небольших вариаций PD50 этих вирусов может быть разброс экспериментальных результатов. С другой стороны, возможно, существуют некие, хотя и не жесткие, требования, несколько различающиеся у разных хозяев, к длине и/или структуре участка РНК между двумя AUG.

Мотив, содержащий криптический AUG. Нами было замечено, что в геноме всех вирулентных мутантов между IRES и инициаторным AUG расположен неннициаторный, криптический AUG (Табл. 5). Расположение кодона AUG, открывающего основную ОРС полно вирусного полипротеина, поблизости or IRES [Mah(L)/74, /90, /Д154] приводило к аттенуации полиовируса. Важность расположения критического AUG между IRES и инициаторным 743AUG продемонстрировал мутант Mah/AES24P. Вирулентный для Tg-PVR мышей, как вирус дикого типа, и лишь частично аттенуированный для нормальных мышей и хлопковых крыс (Табл. 5), он отличался от высокоаттенуированного Mah/74 небольшой AUG-содержащей вставкой между IRES н 743AUG (Рис. 1). Критическая роль для нейровирулентности мотива, содержащего критический AUG, подтвердилась тем, что изменение ближайшего окружения этого AUG аттенуировало вирус [Mah(L)/' KG4PJ почти в такой же степени, как и

расположение инициаторного AUG у З'-граниды 1RES (Табл. 5). Возможно, распознаваемым сигналом в процессе вирусной репродукции в ЦНС является октануклеотид 583CUUAUGG, консервация которого в геномах энтеро- и риновирусов была отмечена десять лет назад (Kuge and Nomoto, 1987).

8. Возможный механизм экспресии детерминант нейровирулентности

Одна из известных функций 5НТО полиовируса - контроль инициации трансляции вирусной PIIK. Инициацию трансляции вирусной матрицы обеспечивает внутренний участок 5НТО длиной около 450 нт (1RES). 1RES взаимодействует с рибосомой, вероятно, в нескольких местах, в этом процессе участвуют как канонические, так и неканонические факторы инициации трансляции. Для эффективной инициации трансляции полиовирусной РНК около З'-границы 1RES в области стартового окна (где образуется продуктивный контакт рибосомы с матрицей) должен находиться молчапцш AUG (Pelletier et al., 1988; Pilipenko et al., 1992). Критический 586AUG может отсутствовать, если его место рядом с 1RES занимает иницнаторный AUG, открывающий ОРС полиовирусного полипротеина, что и произошло в геноме дслеционных мутантов. Трансляционный аппарат культивируемых клеток относительно толерантен к изменениям нуклеотидной последовательности в области стартового окна и довольствуется как критическим, так и нннциаторным AUG. В настоящей работе показано, что перемещение ишщиаторного кодона в позицию, обычно занимаемую молчащим AUG, нарушает репликацию полиовируса в ЦНС.

Наши результаты также свидетельствуют, что в эффективной репликации полиовируса в ЦНС важную роль играет консервативный мотив, включающий критический jggAUG. Этот мотив мог бы служить сигналом узнавания для неканошиеского клеточного фактора инициации трансляции. Роль взаимодействия, опосредованного з^ДиО-содержащим мотивом, может быть критической в тех клетках, в которых взаимодействие 1RES с рибосомой слабее. В пользу предположения о том, что клетки ЦНС дефицитны по какому-то из факторов, обеспечивающему ассоциацию рибосомы с полновирусным TRES (Svitkin et al., 1985, 1988)

свидетельствует сильное атсенуирующее действие точечных мутаций в IRES вакцинных штаммов полиовируса (Kawamura et al., 1989; Macadam et al., 1993; Westrop et al., 1989). Взаимодействие факторов с IRES и мотивом, содержащим -,r(;AUG, в шпщиации трансляции происходит, возможно, лишь при должной пространственной ориентации всех участников процесса. Вероятно, правильному пространственному расположению соответствует неструктурированное состояние сегмента РНК между IRES и мотивом, содержащим jggAUG, что и обеспечивает пиримидин-богатый состав ОПТ. Различное для разных хозяев модулирующее действие структуры участка между критическим и стартовым AUG свидетельствует о том, что, возможно, в разных клетках-мишенях реализуются разные способы «доставки» рибосомы от IRES на иннциаторный кодон. Таким образом, перспективным направлением в изучении механизма экспрессии нейроспецифических детерминант полиовирусной РНК, определенных в настоящей работе, представляется поиск неканонических факторов, участвующих в инициации трансляции полиовирусной РНК в нервных клетках ЦНС.

В заключение можно отметить, что после соответствующих испытаний подход, описанный в этой работе, может быть использован для создания безопасных вакцинных штаммов. Реверсии к вирулентности делеционных вариантов очень маловероятны, так как для этого в геноме должна появиться вставка, в результате которой на нужном расстоянии от IRES окажется AUG в определенном контексте. Подход, разработанный для вируса полиомиелита, может оправдать себя при создании вакцинных штаммов и других, родственных полиовирусу, патогенных энтеровирусов.

ВЫВОДЫ

1. Протяженная деления З'-коицевой части 5НТО вируса полиомиелита, захватывающая три структурных элемента 5IITO - вариабельную часть олигопиримидинового тракта, домен Е и спейсер S - и приводящая к сближению стартового кодона вирусного нолипротеина и IRES, является высокоаттенуирующей мутацией.

2. В результате исследования нейровирулентности мутантов с делениями шцщБИдуальных структурных элементов показано, что аттенуацня мутантов с протяжешшми делениями не обусловлена отсутствием этих

трех элементов как таковых. Для эффективной репликации иолиовируса в ЦНС требуется наличие между IRES и ишщиаторным кодоном мотива, содержащего кринтическнй 586AUG.

3. Изменения состава вариабельно!! части олигоииримидинового тракта могут существенно «шжать нейровирулентность полиовируса, возмоясно, за счет нарушения должной пространственной ориентации трансляционных элементов РНК.

4. Уровень нейровнрулентности штаммов полиовируса, несущих мутации в З'-кощевой части 5НТО, не коррелирует с уровнем их репродукции в культивируемых клетках, а также с матричной активностью их РНК в бесклеточной системе из клеток Кребс-2.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признательна моему научному руководителю, профессору В. И. Аголу за возможность пройти настоящую научную школу и многому научиться. Я благодарна также А. П. Гмылю, С. В. Масловой, Е. А. Тольской и М. С. Колесниковой, в сотрудничестве с которыми была выполнена часть исследований. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории, поддержку и содействие которых я ощущала постоянно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Gmyl A. P., Pilipenko Е. V., Slobodskaya О. R., Maslova S. V., Tolskaya Е. A., Agol V. I. (1993). Functional and genetic plasticity of the poliovirus genome. Abs. of the IXth International Congress of Virology. Glasgow, Scotland, 8-13 August, p. 275.

2. Агол В. И., Пестова Т. В., Пилнпенко Е. В., Гмыль А. П., Слободская О. Р. (1993). Регуляторные элементы в 5'-нетранслируемой области генома полиовируса: конструировать новых штаммов вируса. Тезисы III Всероссийской планово-отчетной конференции «Генная и клеточная инженерия». Пущино-на-Оке, ноябрь-декабрь 1992., с. 98.

3. Pilipenko Е., Gmyl A., Khitrina Е., Maslova S., Slobodskaya О., Agol V. (1994). Host-dependent variations in the role of oligopirimidine/AUG tandem for the reproduction of Theiler's murine encephalomyelitis virus (TMEV). Abs. of the VHth Meeting of the Europ. Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. Koprilampi, Finland, 6-11 August.

4. Slobodskaya O., Gmyl A., Maslova S., Tolskaya E., Agol V. (1994). Си-elements of the 5'-noncodind region of poliovirus RNA modulating