Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекции"
На правах рукописи
Кондратова Анна Анатольевна
Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекции
03.00.07 - микробиология 03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2009
0034В2184
003462184
Работа выполнена в Лернеровском научно-исследовательском институте при Кливлендской клинике, Кливленд, США
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Гудков Андрей Владимирович
Официальные оппоненты:
- доктор биологических наук, профессор Тарантул Вячеслав Залманович;
- доктор медицинских наук Белый Юрий Федорович
Ведущая организация:
ГУ научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
Защита диссертации состоится « Д. ^срЫграл ^009 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098 г. Москва, ул. Гамалеи, 18)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН
Автореферат разослан
2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного с< доктор медицинских наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность проблемы.
В процессе инфекции патогенные микроорганизмы, размножающиеся в тканях хозяина, нарушают нормальное протекание физиологических процессов, что приводит к развитию различных заболеваний и может повлечь за собой гибель всего организма. Организм хозяина обладает широким арсеналом защитных антиинфекционных средств, включая врожденный и приобретенный иммунитет (системный ответ) и различные виды клеточного ответа, что в большинстве случаев позволяет организму эффективно справляться с инфекцией. В свою очередь, в процессе эволюции патогенные микроорганизмы приобрели способность к защите от антиинфекционных процессов, развивающихся в пораженном организме.
Запрограммированная клеточная смерть, или апоптоз, является одним из видов клеточного ответа, направленного на борьбу с внутриклеточными паразитами, такими как микоплазмы, токсоплазмы, факультативные (сальмонеллы, листерии) и облигатные (хламидии, риккетсии, эрлихии) внутриклеточные бактерии, вирусы. Подавление проапоптотической программы клетки-хозяина необходимо для успешного размножения внутриклеточных паразитов. Исследования взаимодействия внутриклеточных паразитов с клеткой-хозяином привели к обнаружению вирусных и бактериальных белков, обладающих антиапоптотическими свойствами (большой Т-антиген, Е6, vFLIP, IAP, р35, CPAF и др.) (Kimura Т et at, 1981; Cole ST, Danos О, 1987; Rezaee SA tet al., 2006;Ying S, 2008; Hacker G et al.,2006). В то же время, поскольку мишенями патогенных белковых факторов микроорганизмов зачастую являются ключевые участки проапоптотических сигнальных каскадов клетки-хозяина, изучение защитных механизмов патогенных микроорганизмов привело к открытию новых сигнальных каскадов, вовлеченных в апоптоз (р53, Jenkins JR et al., 1984; Akt, Staal SP, 1987).
Методы профилактики и лечения инфекционных заболеваний включают как стимуляцию защитных средств организма-хозяина (интерфероны, вакцинация, иммуномодулирующая терапия), так и непосредственное воздействие на патогенные микроорганизмы, ведущее к их уничтожению либо препятствующее быстрому размножению патогена (антибиотики, бактериостатики, антивирусные препараты) (Anderson RM, May RM, 1985; Morens DM et al., 2004). Высокая способность к изменчивости позволяет микроорганизмам адаптироваться к действию лекарственных препаратов, что приводит к необходимости разработки во многих случаях принципиально новых,
как более универсальных, так и более специфических, терапевтических подходов, что в свою очередь требует всестороннего изучения процессов, происходящих в пораженном организме на системном, клеточном и молекулярном уровнях. Следует отметить, что препараты, направленные на модификацию процессов, происходящих в организме-хозяине (например, активацию апоптоза в инфицированных клетках (КибсИп^ С1. й а1., 2002)), менее зависят от изменчивости микроорганизма и поэтому являются более универсальными.
Наиболее простыми по строению патогенными микроорганизмами являются вирусы, что делает их привлекательной моделью для изучения отношения «паразит-хозяин» на молекулярном уровне. В данной работе в качестве экспериментальной модели для изучения про- и антиинфекционных механизмов при взаимодействии патогена с клеткой-хозяином был выбран полиовирус — представитель семейства пикорнавирусов. РНК-содержащие пикорнавирусы являются самыми мелкими из известных вирусов с относительно простым и хорошо изученым репликативным циклом. Анти-апоптотические свойства полиовируса были продемонстрированы в нескольких работах (ТоЬкауа ЕА е1 а1., 1995; Agol VI е1 а!., 2000; Коуаша АН е! а1., 2001; Ве1оу СА е1 а1., 2003), однако молекулярные механизмы этих явлений остались невыясненными.
Пикорнавирусы являются причиной множества заболеваний человека и животных, включая вирусные менингиты, гепатит А, респираторные вирусные инфекции и полиомиелит. Несмотря на широкий спектр вызываемых ими патологий, пикорнавирусы обладают поразительным сходством в строении и функциях неструктурных белков, принимающих участие в репликационных процессах. Разнообразие клинических проявлений инфекции определяется строением структурных - капсидных - белков, взаимодействующих с тканеспецифическими рецепторами организма-хозяина. Исследование анти-апоптотических механизмов, связанных с неструктурными белками полиовируса, и обнаружение с их помощью новых терапевтических мишеней, может иметь, таким образом, значение не только для борьбы с такими инфекциями, находящимися на стадии их ликвидации, как полиомиелит, в том числе и вакцинассоциированный, но и для разработки методов терапии инфекций, вызываемых другими членами семейства пикорнавирусов. В то же время, разработанные в данной экспериментальной модели методы исследования молекулярных аспектов взаимодействия внутриклеточных паразитов с клеткой-хозяином могут быть применены для поиска терапевтических мишеней для борьбы с инфекциями, вызываемыми другими вирулентными микроорганизмами.
Цель работы: исследование молекулярных механизмов защиты патогенного микроорганизма от внутриклеточного ответа на инфекцию в модельной системе полиовирусной инфекции и апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли TNFa.
В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
1. Определение полиовирусных белков, защищающих клетки млекопитающих от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли.
2. Изучение механизмов анти-апоптотического действия обнаруженных белков полиовируса на клетках млекопитающих.
3. Определение клеточных мишеней полиовирусных белков с использованием дрожжевой двухгибридной системы.
4. Изучение влияния обнаруженных белков-мишеней на апоптоз и развитие полиовирусной инфекции.
Научная новизна работы.
Разработана новая методика скринирования генома микроорганизмов для поиска антиапоптотических белковых факторов и определения их клеточных мишеней.
Впервые продемонстрирована способность вируса полиомиелита ингибировать апоптоз, индуцируемый фактором некроза опухоли в клетках млекопитающих. Определены полиовирусные белки, выполняющие эту функцию - неструктурные белки ЗА и 2В.
Показано, что экзогенная экспрессия единственного полиовирусного белка ЗА, так же как и инфекция клеток млекопитающих полноразмерным вирусом полиомиелита, приводит к исчезновению рецептора фактора некроза опухоли TNFR1 с клеточной поверхности, что в свою очередь приводит к блокировке апоптотического сигнального каскада в самом его начале и способствует таким образом эффективному развитию полиовирусной инфекции.
Для определения молекулярных механизмов элиминации рецептора фактора некроза опухоли с клеточной поверхности был произведен поиск клеточных мишеней полиовирусного белка ЗА с применением дрожжевой двухгибридной системы, в результате чего обнаружены новые клеточные мишени полиовирусного белка ЗА -белки LISI и пирин.
Показано, что взаимодействие полиовирусного белка ЗА с клеточным компонентом динеинового моторного комплекса LISI блокирует клеточный везикулярный транспорт белков на этапе «эндоплазматический ретикулум - аппарат Гольджи», и таким образом ингибирует транспорт как секреторных, так и плазматических белков.
Изучение другой клеточной мишени полиовирусного белка ЗА - клеточного белка пирин, обладающего кверцетиназой
активностью, - позволило разработать модель механизма устойчивости вируса полиомиелита к действию антивирусного флавоноида кверцетина.
Впервые обнаружены новые анти-апоптотические и про-инфекционные свойства полиовирусного белка ЗА и раскрыты их молекулярные механизмы.
Практическая значимость работы.
Методы, разработанные на модели полиовируса, могут быть применены в отношении других микроорганизмов для поиска их анти-апоптотических и про-инфекционных факторов и определения соответствующих клеточных мишеней.
Выявленные про-инфекционные механизмы действия неструктурного белка полиовируса ЗА могут быть использованы для дальнейшего изучения гомологичных белков других членов семейства пикорнавирусов и разработки новых терапевтических средств и стратегий для лечения широкого круга заболеваний, вызываемых пикорнавирусами.
Обнаруженные клеточные мишени полиовирусного белка ЗА могут быть использованы при разработке методов активации апоптоза в инфицированных клетках, что является одной из перспективных стратегий терапии инфекционных заболеваний, в частности, не поддающихся традиционным методам лечения (например, с использованием антибиотиков).
Апробация диссертации.
Материалы диссертации были доложены на 3-ей конференции по программированной клеточной смерти в Колд Спринг Харборе (Колд Спринг Харбор, Нью Йорк, сентябрь-октябрь 1999 г.), семинаре департмента молекулярной генетики Университета штата Иллинойс в Чикаго (Чикаго, 2000г.), семинаре департмента молекулярной биологии Лернеровского научно-исследовательского института (Кливленд, 2003г.), конференции по везикулярному транспорту унтверситета Кейс Вестерн Резерв (Сандаски, Огайо, август 2004 г.), интердепартментальном митинге Кливлендской клиники (Кливленд, март 2007 г.). Апробация диссертации состоялась 13 октября 2008 года на научной конференции отдела медицинской микробиологии и отдела природно-очаговых инфекций в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 8 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы цитирует 149 работ.
Основное содержание работы.
Материалы и методы исследования:
Материалы: кДНК вируса полиомиелита штамма I типа (Махони); клеточные линии HeLa, NIH3T3 и НЕК293; бактериальный штамм E.coli Е5 для наращивания плазмидной ДНК; репортерный штамм дрожжей S.cerevisiae ВЕ42; ретро- и лентивирусные системы упаковки вирусов.
1. Микробиологические методы: введение рекомбинантной ДНК в дрожжах и бактериях (химическая трансформация, электропорация); экспрессия рекомбинантных белков в бактериальных и дрожжевых клетках; выделение рекомбинантной ДНК из бактериальных и дрожжевых лизатов, очистка рекомбинантных белков из бактерий методом аффинной хроматографии, культивирование и селекция клонов дрожжей; анализ активности и экспрессии репортерных генов (бета-галактидаза, люцифераза) в дрожжевых клетках; использование дрожжевой двухгибридной системы для идентификации и клонирования белков; получение ретро- и лентивирусных инфецирующих частиц; инфецирование клеток ретро-, ленти и полиовирусами; определение вирусного титра; микроскопия (световая, флуоресцентная, конфокальная).
2. Методы молекулярной биологии и генная инженерия: клонирование - дизайнирование и создание конструкций для экспрессии рекомбинантных белков in vivo и in vitro в клетках прокариот, низших и высших эукариот, анализ рекомбинантной ДНК, рестрикция, секвенирование, лигирование, полимеразная цепная реакция, ревертирование, вестерн-блот, Нозерн-блот, электрофорез ДНК и белков, иммунопреципитация, анализ сдвига электрофорезной активности олигонуклеотидов, in vitro и in vivo мечение белков и нуклеиновых кислот с использованием радиоизотопов.
3. Методы клеточной биологии: иммуногибридизация клеток млекопитающих in situ; детекция апоптоза методом окраски ДНК in situ; введение экзогенной ДНК в клетки млекопитающих; экспрессия флуоресцентных белков с различными сигналами внутриклеточной локализации; детекция эндо- и экзогенных белков с использованием методов микроскопии; метод иммуноцитофлуоресцентного анализа.
4. Статистические методы: обработка экспериментальных результатов с использованим пакета статистических программ Sigma Plot.
1. Определение белков полиовируса, защищающих клетки млекопитающих от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли.
Геном полиовируса представлен одноцепочечной РНК, выполняющей также функцию мРНК, на которой происходит синтез
вирусного полипептида. В процессе трансляции растущая цепь подвергается автопротеолизу, который протекает через промежуточные формы, функции которых отличны от функций конечных продуктов; в результате последовательного протеолитического расщепления полипротеина образовывается более десятка структурных и неструктурных белков полиовируса (Рис.1).
Мини-библиотека для экспрессии возможных неструктурных полиовирусных белков была сконструирована на основе ретровирусного экспрессионного вектора ЬХвГЧ; в библиотеку вошли белки 2А, 2В, 2ВС, 2С, ЗА, ЗАВ, ЗС и ЗСБ; белки были тагированы последовательностью НА.
Рис.1. Схема клонирования индивидуальных пептидов в ретровирусный экспрессионный вектор LXSN.
Полученные конструкции вводились в клетки NIH3T3 и HeLa, высокочувствительные к TNFa, ретровирусной инфекцией; эффективность инфекции контролировалась одновременным введением конструкции для экспрессии GFP (соотношение концентраций 10:1) и составляла более 60%. Через 24 часа после последней инфекции клетки, экспрессировавшие полиовирусные белки, и контрольные клетки, инфицированные вирусом, несущим пустой вектор, обрабатывались TNFa в присутствии ингибитора белкового синтеза циклогексемида (CHI) в концентрациях, не токсичных в отсутствие TNFa.
Количество выживших клеток определялось методом окрашивания метиленовой синькой. Обработка клеток, инфицированных пустым вектором, приводила к гибели более 80% клеток. Полиовирусный белок ЗА действовал как мощный ингибитор ЮТа -индуцированного апоптоза, что было сравнимо по эффективности с действием известного анти-апоптотического белка Ьс12. Среди остальных 8 проверенных полиовирусных белков, только 2В обладал заметным защитным действием в этих экспериментальных условиях (рис.2б). Экспрессия полиовирусных белков была проверена методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфически распознающих эпитоп НА (рис.2а).
Рис.2. Экспрессия полиовирусных белков ЗА и 2В защищает клетки N1113X3 от ТОТа -индуцированного апоптоза. (а) Вестерн блоттинг НА-тагированных белков 2В, 2ВС, 2С и ЗА; (б,в) относительная выживаемость клеток, экспрессирующих различые белки полиовируса, после обработки Т№а в присутствии СШ (б) или протеазы 2А (в).
Чтобы проверить, приводит ли подавление кэп-зависимой трансляции в результате активности полиовирусной протеазы 2А к повышению чувствительности клеток к ТЫТа-индуцированному апоптозу, клетки, экспрессирующие 2А под контролем промотера ЬТЛ, были обработаны ТЫРа. Как и предполагалось, экспрессия вирусной протеазы 2А делала клетки более чувствительными к ТО Р и- зав и с и м о му апоптозу. Ко-экспрессия ЗА защищала клетки, что моделирует события, которые могут происходить при ПВ инфекции (рис.2в).
2. Изучение механизмов анти-апоптотического действия полиовирусных белков ЗА и 2В.
Полиовирусные белки 2В и ЗА блокируют везикулярный белковый транспорт между эндоплазматическим ретикуломом (ЭР) и аппаратом Гольджи, а также секрецию белков, что одновременно приводит к разрушению аппарата Гольджи фоес1епз Ж, Кн1^аагс1 К., 1995). Следовательно, механизм защитного действия белков ЗА и 2В против апоптоза, индуцированного ТЫРа, может быть связан с их влиянием на белковый транспорт.
Для наблюдения за воздействием 2В и ЗА на белковый траффик между ЭР и аппаратом Гольджи была использована экспрессионная конструкция рОРР_Со1§1 (С1оп1есЬ), позволяющая экспрессировать флуоресцентный белок вРР с пришитым к нему сигналом локализации в аппатате Гольджи (в дальнейшем обозначаемый Со^-ОРР). Плазмиды для экспрессии 2В, ЗА и 2С были ко-трансфецированы с рОРРОо^ в пропорции 10:1 в клеточных линиях НеЬа, МНЗТЗ и НЕК239Т, и внутриклекточная локализация Оо1»1-СРР регистрировалась через 24 часа методом флуоресцентной микрофотографии. Экспрессия 2В, 2С и ЗА детектировалась методом Вестрен-блоттинга антителами к НА-олигопептиду, пришитому к полиовирусным белкам. 2В и ЗА удерживали Оо^ьОРР в ЭР, в то время как одновременная экспрессия 2С не препятствует транспорту Оо^-вРР в аппарат Гольджи (рис.4а). Подавление белкового транспорта экспрессией ЗА было показано также для химерного белка Бесг-ОРР (белок вРР, несущий сигнал секреции) и для тотального белка, секретируемого клеткой в среду (рис. 3 б,в).
а 6 в
(Зо|д|_(Зрр Зесг-врр вектор ЗА БФА
Рис.3. Влияние экспрессии полиовирусиых белков на белковый транспорт из ЭР в аппарат Гольджи. (а) Экспрессия 2В и ЗА задерживает вновь синтезированный Оо^-йРР в ЭР, экспрессия 2С не препятствует транспорту Оо^-йРР из ЭР в Гольджи; (б) экспрессия ЗА задерживает вновь синтезированный Бест-ОРР в ЭР; (в) экспрессия ЗА и обработка брефельдином А препятствует секреции тотального белка из клетки.
Нам не удалось получить клоны, стабильно экспрессирующие белок 2В (как в клетках млекопитающих, так и в клетках дрожжей -что препятствовало в дальнейшем определению клеточных мишеней ПВ белков в дрожжевой двухгибридной системе). Токсичность белка 2В связана, по-видимому, с его способностью к пермеабилизации клеточных мембран. Поэтому дальнейшие исследования были сконцентрированы на изучении активности белка ЗА.
Активность фактора некроза опухоли инициируется его связыванием со специфическим клеточным рецептором ТЫРЯ!. Для
оценки количества ТЫРЮ на поверхности клеток, экспрессирующих белок ЗА, был применен метод цитофлуоресцентного анализа с использованием антител к ТЫРИЛ. В качестве положительного контроля была использована предобработка (2ч.) брефельдином А (БФА) - дрожжевом метаболитом, являющимся мощным ингибитором секреции. Под воздействием брефельдина А происходит дезинтеграция мембранных пузырьков, отпочковывающихся от эндоплазматического ретикулума и направляющихся в аппарат Гольджи. Обратный поток мембран и белков из аппарата Гольджи в ЭР не затрагивается, в результате чего происходит перераспределение мембран и белков аппарата Гольджи в эндоплазматический ретикулум. Экспрессия ЗА, также как и обработка клеток БФА, существенно снижала количество ТЫРИЛ на клеточной поверхности (Рис.4). Уменьшение количества ТЫРИЛ на поверхности многих клеток, экспрессирующих ЗА, было сравнимо с уменьшением под действием БФА ; более того, количество ТЫРЮ на поверхности значительной части клеток, экспрессирующих ЗА, было сравнимо с негативным контролем. ЗА и брефельдин А вызывали уменьшение ТЫИИ на поверхности клеточной мембраны, но не влияли на общее количество этого белка в клетке (рис.4д). Отсюда следует, что молекулы Т№Ш были задержаны внутри клетки на пути к клеточной поверхности, предположительно, вследствие нарушений белкового транспорта между ЭР и аппаратом Гольджи.
¡/v; üz
в —
В
к #
Рис.4. Обработка брефельдином А и экспрессия ЗА приводят к исчезновению TNFR1 , но не FAS рецептора, с клеточной поверхности, (а)
Цитометрический анализ живых клеток НЕК293, трансфецированных вектором либо ЗА-экспрессирующей плазмидой, или предобработанных брефельдином А в течение 3 часов. Клетки были проинкубированы с антителами против TNFRI или
FAS и вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем (сплошная линия), либо только со вторичными антителами (пунктирная линия). Абсцисса - интенсивность флуоресценции, ордината - количество клеток; (б) то же для клеток HeLa, селектированных на G418 в течение 48ч.; (в,г) количественная обработка результатов экспериментов, представленных на рис. 5 а,б соответственно; (д) Вестерн-блотинг на лизатах клеток HeLa, инфецированных пустой и ЗА-экспрессирующей конструкцией; (е) экспрессия ЗА или обработка брефельдином А защищает клетки HeLa от TNOa-, но не FAS-индуцированного апоптоза.
Ни экспрессия ЗА, ни обработка брефельдином А не защищала клетки HeLa от FAS-индуцированного апоптоза (рис. 4е). В хорошем соответствии с этим наблюдением, как ЗА, так и брефельдин А не оказывали существенного влияния на количество FAS рецептора на поверхности клеток HeLa и НЕК293 (рис. 4а-г). Разница в ответе TNFR1 и FAS рецепторов на ингибирование белкового транспорта может быть связана со стабильностью этих рецепторов. Действительно, согласно литературным данным, время полужизни TNFR1 на поверхности клеток составляет около 2 часов, в то время как время полужизни FAS рецептора - более 8 часов (Watanabe, N et al., 1988).
Исчезновение TNFR1 с клеточной поверхности наблюдалось не только в результате изолированной экспрессии ЗА, но и во время инфекции интактным полиовирусом. Метод цитофлуоресцентного анализа был использован для определения стабильности TNFR1 и FAS на поверхности клеток HeLa, инфецированных полиовирусом (рис.5). Количество TNFR1 существенно уменьшалось уже через 2 часа от начала инфекции, так что через 4 часа TNFR1 практически полностью исчезал с плазматической мембраны. В соответствии с результатами, полученными для белка ЗА, было детектировано только незначительное уменьшение количества FAS-рецептора через 4 часа после начала инфекции; уменьшение в 2 раза наблюдалось после 8 часов инфекции.
Полио, ч. 0 1 2 4 6 8
Рис. 5. Временная зависимость исчезновения TNF и FAS рецепторов с поверхности клеток HeLa во время ПВ инфекции, (а) Цитометрический анализ живых клеток HeLa, инфецированных полиовирусом; (б) количественная обработка результатов этих экспериментов.
Устойчивость клеток к TNFa -индуцированному апоптозу часто связана с активацией и транслокацией в ядро анти-апоптотического транскрипционного фактора NFkB (Schütze S et al., 2008). Мы продемонстрировали, что как при экспрессии ЗА, так и при полиовируснрй инфекции не происходит деградация NFkB -связывающего фактора 1кВа и не происходит транслокации NFkB в ядро в ответ на TNFa (данные не показаны), что указывает на то, что сигнальный каскад нарушен выше деградации 1кВа, и таким образом косвенно подтверждает данные об убирании рецптора TNFR1 с клеточной поверхности.
3. Определение клеточных мишеней полиовирусных белков с использованием дрожжевой двухгибридной системы.
ЗА (KS) GST GST-лирин GST-LIS1 н/связ. ИП
3A-Flag и/спец, а/т анти-USI а/т лизат н/связ. ИП
3A-Flag пирин-НА н/спец. а/т анти-НА а/т н/связ. ИП
nupUH'HA—> 1
полно н/спец. а/т анти-пирин а/т н/связ. ИП
Рис. 6. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и LISI, (a) GST
пулл-даун in vitro; (б,в,г) коиммунопреципитация in vivo: (б) клетки НЕК293 экспрессирующие ЗА-Flag, ИП с анти-LISl антителами; (в) клетки НЕК293 и НЕК293-пирин-НА экспрессирующие ЗА-Flag, ИП с анти-НА антителами; (г) клетки HeLa, инфицированные полиовирусом, ИП с анти-пирин антителами.
Мы предположили, что анти-апоптотические свойства полиовирусного белка ЗА опосредованы его взаимодействиями с белками клетки-хозяина. Поиск клеточных белков, взаимодействующих с ЗА, был проведен с применением дрожжевой двухгибридной системы
(Finley and Brent, 1995). В результате скрининга были изолированы И различных клонов; по результатам секвенирования 8 из них оказались С-концевыми фрагментами кДНК пирина (наиболее длинный фрагмент: 630-1318 bp, NM_003662, g¡:66363695), оставшиеся 3 кодировали С-концевые фрагменты snRNP В' (small nuclear ribonucleoprotein, фрагмент 224-723, NM_198216, g¡:38150006), альфа-L-фукозидазы (597-1107 bp, NM_000147, gi:l 19360347) и LISI (lissencephaly-l, он же альфа субъединица ацетилгидролазы плателет-активирующего фактора, изоформа Ib (PAFAH1B1), 771-1233 bp) (NM_000430, gi:6031206]).
Взаимодействие ЗА с белками LISI и пирин было подтверждено в нескольких независимых экспериментах. Для подтверждения результатов двугибридного скрининга была проанализирована способность белков LISI и пирин образовывать комплексы с ЗА in vivo методами иммунопреципитации в клеточных лизатах и in vitro на белках, очищенных после синтеза в бактериях и в кроличьем ретикулоцитном лизате (рис.ба-в). Также была проанализировано образование комплекса между пирином и ЗА в клетках, инфицированных полиовирусом (рис.бг).
Таким образом, было продемонстрировано, что полиовирусный белок ЗА взаимодействует с клеточными белками LISI и пирин in vitro и в человеческих клетках НЕК.293 и HeLa.
4. Изучение влияния обнаруженных белков-мишеней на апоптоз и развитие полиовирусной инфекции.
4.1. Взаимодействие полиовирусного белка ЗА с компонентом динеинового моторного комплекса LISI и его влияние на везикулярный транспорт рецептора фактора некроза опухоли TNFR1.
В клетках млекопитающих вновь синтезированные белки транспортируются в различные клеточные компартменты с помощью специальной транспортной системы. Белки аппарата Гольджи и плазматической мембраны, а также секреторные белки, синтезируются внутри эндоплазматического ретикулума, заключатся в мембранные пузырьки и направляются в аппарат Гольджи для дальнейшей сортировки и транспортировки. Процесс транспортировки мембранных пузырьков (везикул) от ЭР к аппарату Гольджи осуществляется при помощи динеинового моторного комплекса. В свою очередь, от аппарата Гольджи отпочковываются мембранные пузырьки с белками, предназначенными для возвращения в ЭР; эти пузырьки переносятся обратно в ЭР с помощью кинезинового моторного комплекса. Нарушения динеинового мотора приводят к остановке транспорта из
ЭР, дезинтеграции аппарата Гольджи и перераспределению его мембран и ассоциированных белков в ЭР.
LISI является составляющей динеинового моторного комплекса и участвует в везикулярном транспорте между ЭР и аппаратом Гольджи, следовательно, LISI может быть вовлечен в транслокацию рецептора фактора некроза опухоли на плазматическую мембрану. Поскольку ЗА влияет на транспорт TNFR1, экспрессия ЗА может влиять на внутриклеточные функции LISI. Иммуноцитография гиперэкспрессированных белков LISI и ЗА продемонстрировала колокализацию этих белков в клетке (рис. 7а). Белок ЗА, в соответствии с его известным свойством связываться с цитоплазматической поверхностью эндоплазматического ретикулума, имел картину локализации, которая хорошо повторяла контуры ЭР (7а, верхняя панель). LISI, как и ожидалось, практически отсутствовал в ЭР (7а, нижняя панель). Однако при одновременной экспрессии ЗА и LISI наблюдалась колокализация этих белков и изменение их внутриклеточного распределения, по-видимому вызванного их взаимодействием (рис. 76).
1БНЕЗ ЙНБ ЗР ЗА ЗР+ЗА
Ш 1 ^Н ЗА о/э ' ь, Шк
|---- ЭР
ЗР US! ^ЧИШ LISI Н W^J о/э tk Щ ■ 3A+US1 | о/э
ЗА USI . 3A+USI
% к %
Рис. 7. Ко-локализация LISI и ЗА. Клетки NIH3T3 были трансфецированы плазмидами, экспрессирующими ЗА, LISI, и их комбинацией, зафиксированы и окрашены с использованием антител, специфически узнающих ЗА, LISI, альфа-тубулин и ЭР маркер GRP94, и вторичных антител, коньюгированных флуоресцентными красителями. Микрофотографии сделаны методом конфокальной микроскопии.
Ингибирование полиовирусным белком ЗА белкового транспорта из ЭР в Гольджи является хорошо установленным фактом. Поскольку ЗА связывается с LISI, увеличение количества LISI в клетке может влиять на блокирование ЭР-Гольджи транспорта белком ЗА. Действительно, в контрольных НЕК293 с введенным флуоресцентным
белком Golgi-GFP (рис.8), этот белок локализуется в аппарате Гольджи (плотная, зачастую серповидная, структура возле клеточного ядра).
При котрансфекции Golgi-GFP с LISI видимых изменений в локализации Golgi-GFP не происходило. Гиперэкспрессия ЗА вызывала перераспределение Golgi-GFP в ЭР. При одновременном введении ЗА и LISI, в подавляющем большинстве клеток восстанавливалась исходная локализация Golgi-GFP. При обработке брефельдином А, Golgi-GFP накопливался в эндоплазматическом ретикулуме, приводя к той же картине распределения Golgi-GFP, что и экспрессия ЗА. Однако, экспрессия LISI не снимала вызываемую БФА аккумуляцию Golgi-GFP в ЭР, что указывает на отличие механизма блокировки везикулярного
транспорта белком ЗА по сравнению с БФА.
Рис. 8. LISI снимает блокировку транспорта Golgi-GFP, вызванную экспрессией ЗА. Клетки НЕК293 были котрансфецированы празмидами, экспрессирующими ЗА, LISI и Golgi-GFP; БФА был добавлен через 24 ч. на ЗОмин.
вектор ЗА БФА
вектор 100%
ЗА 7%
anti-Flag j anti-HA | ЗА-НА
//
3A+LIS1 45%
anti-LISl anti-HA
Рис. 9. Гиперкпрессия LISI препятствует уменьшению
количества TNFR1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА. (а)
Цитофлуориметрический анализ живых клеток НЕК293,
экспрессирующих ЗА, LISI и их комбинацию; (б) ВБ лизатов клеток НЕК293, экспрессирующих ЗА-НА и LISI-Flag; (в) ВБ лизатов клеток НЕК293, экспрессирующих ЗА-НА, с антителами, специфически
распознающими эндогенный LIS 1.
Если LISI является клеточной мишенью ЗА, убирание TNFR1 рецептора с поверхности клеток, экспрессирующих ЗА, может быть предотвращено гиперэкспрессией LISI в этих клетках. Действительно, в то время как ЗА существенно понижал количество TNFR1 (до 7%) на поверхности клеток, LISI практически не влиял на представленность TNFR1 (95%); добавление в трансфекционную смесь равных количеств ЗА и LISI-экспрессирующих конструкций понижало способность ЗА
убирать TNFR1 с поверхности клеток (до 45%) (рис. 9а). Вестерн блоттинг продемонстрировал, что гиперэкспрессия ЗА не влияет на количество эндогенного LISI в клетке (рис. 9в), равно как и добавление экзогенного LISI не приводит к деградации либо, напротив, стабилизации ЗА (Рис. 96).
Эти наблюдения демонстрируют, что взаимодействие между ЗА и LISI оказывает влияние на везикулярный транспорт, и позволяют сделать предположение, что LISI является по крайней мере одной из клеточных мишеней полиовирусного белка ЗА, воздействие на которую приводит к задержке в ЭР белков, несущих сигнал дальнейшей транспортировки к плазматической мембране.
LISI, цитоплазматический белок размером около 45 кДа, состоящий из 411 аминокислот, принадлежит к семейству белков, содержащих WD40 повторы (участки длиной около 40 аминокислот, обогащенные триптофаном и остатками аспартатной кислоты). WD40 повторы - широко распространенная структура, как правило, вовлеченная во множественные белок-белковые взаимодействия. Домены LisH и сс участвуют в гомодимеризации LISI. С-концевой фрагмент LISI, найденный в двухгибридном скрининге, соответствует аминокислотам 137-410 и содержит шесть из семи WD40 повторов.
Рис. 10. Делеционные мутанты LISI, (а) Доменная структура белка LISI и схема делеционных мутантов N99 и С137; (б) N99 и С137 убирают TNFR1 с поверхности клеток НЕК293; (в) ИП: белковые комплексы из экстрактов клеток НЕК293, экспрессирующих LIS 1-НА и LISI-FLAG либо делеционные мутанты N99
и С137, тагированные FLAG-пептидом, были иммунопреципитированы с использованием анти-FLAG антител; преципитат был проинкубирован с антителами, узнающими НА олигопептид.
LISI является одним из важнейших регуляторных компонентов динеинового комплекса (Hirokawa N, Takemura R., 2004). Мутации LISI приводят к фенотипу, очень сходному с фенотипом, возникающим в результате мутаций различных компонентов динеина. Особенности строения LISI дают основания ожидать, что экспрессия его различных доменов могут оказывать влияние на клеточные процессы, связанные с белковым транспортом.
Если ЗА блокирует транспорт через взаимодействие с LISI, то ингибирование LISI ЗА-независимым образом должно приводить к таким же эффектам, как и экспрессия ЗА. Для проверки этой гипотезы были сконструированы N- и С- концевые делеционные мутанты LISI, тагированные FLAG-последовательностью (Рис. 10а). N99 состоял из первых 99 аминокислот LIS, охватывая таким образом LisH и сс область белка, вовлеченные в гомодимеризацию LISI. С137 соответствовал транскрипту клона, взаимодействовавшего с ЗА в дрожжевой двугибридной системе, и состоял из последних 6 WD40 повторов - основной части домена, посредством которого LISI участвует во множественных белок-белковых взаимодействиях, в частности, с динеин/динактиновым комплексом и с апьфа-тубулином микротрубочек. Проверка экспрессии полученных конструкций была сделана методом Вестерн блоттинга (рис.Юв).
Влияние делеционных мутантов LISI на представленность TNFR1 на клеточной поверхности было проанализирована с помощью метода цитоиммунофлуоресцентного анализа. Оверэкспрессия LISI в клетках НЕК293 не оказывала существенного влияния на количество TNFR1 на клеточной поверхности. В то же время, полипептиды N99 и С137 значительно уменьшали количество поверхностного TNFR1 (до 25% и 30%, соответственно), что было сравнимо с эффектом ЗА в этих экспериментах (рис. 106).
Эти результаты показывают, что N- и С- концевые делеционные мутанты белка LISI обладают доминантно-негативными свойствами в отношении полноразмерного белка, нарушая процесс белкового транспорта к плазматической мембране. Активность полипептида N99 можно объяснить его способностью связывать эндогенный LISI и препятствовать его нормальной гомодимеризации. Действительно, белок LISI-НА образовывал комплекс с LISI-Flag и с N99-Flag конструкциями (рис. 10в). Комплекс между LIS1-HA и C137-FIag детектировался существенно слабее, что может указывать на то, что LIS1-HA и C137-Flag являются участниками более крупного комплекса, и взамодействие между ними непрямое. Полипептид N99 может
конкурировать с димеризацией пояноразмерного LISI и тем самым влиять на его активность. С137, возможно, конкурирует с LISI за взаимодействие с другими участниками везикулярного транспорта, такими, как динеин или тубулин, которые связываются с WD40-доменом LIS 1.
Таким образом, одним из возможных механизмов действия ЗА на белковый транспорт является образование комплекса между ЗА и LISI, что препятствует гомодимеризации LISI, приводит к потери функциональности LISI и нарушениям везикулярного белкового транспорта.
4.2. Изучение взаимодействия полиовирусного белка ЗА с кверцетиназой пирин и значения этого взаимодействия для полиовирусной инфекции.
зита-яирин г иитпплазма ядпп
Рис. 11. Внутриклеточное распределение пирина. (а) детекция пирина в ядерной и цитоплазматической фракциях клеток НеЬа, Ьс13 - контроль чистоты цит. фракции; (б) ко-локализация пирина с ЗА в клетках НеЬа, экспрессирующих пирин-НА, инфицированных полиовирусом (верхняя панель - неинфицированные клетки, нижняя панель - 3 часа после ПВ инфекции; (в) внутриклеточное распределение пирина между ядром и цитоплазмой во время ПВ инфекции; (г) перераспределение пирина в область ЭР в клетках НеЬа, экспрессирующих ЗА: стрелкой отмечена клетка, не трансфецированная ЗА; окраска антителами, специфически распознающими ЗА и пирин. Микрофотографии сделаны методом конфокальной микроскопии с использованием 20 и 40-кратного объективов (в,г соотв.).
Пирин - высококонсервативный белок с молекулярным весом около 32кДа, состоящий из 290 аминокислот, экспрессирующийся во всех тканях, в том числе на высоком уровне в печени и сердце. Пирин был первоначально охарактеризован как ядерный белок (ОесЬепс! Я е1 а1., 1999), в то время как известно, что белок ЗА локализован в цитоплазме. Хотя мы продемонстрировали, что ЗА взаимодействует с
пирином in vitro и в клеточных лизатах, необходимо было показать, могут ли эти два белка находиться в одном и том же компартменте клетки, чтобы образовывать комплекс. Мы проанализировали присутствие пирина в цитоплазматичском и ядерном экстрактах клеток HeLa методом Вестерн-блоттинга. Пирин был детектирован в обеих фракциях (рис. 11а). Таким образом, пирин не является исключительно ядерным белком, в противоположность Ьс13, который служил положительным контролем.
Известно, что при полиовирусной инфекции внутриклеточная локализация белков может меняться: некоторые цитоплазматические белки мигрируют в ядро, и наоборот. Чтобы проанализировать влияние полиовирусной инфекции на внутриклеточное распределение пирина, клетки HeLa, экспрессирующие НА-пирин, были заражены полиовирусом, зафиксированы и проанализированы методом иммуноцитостейнинга. Как видно из рис. 116, пирин колокализован с полиовируснум белком ЗА в ПВ-инфецированных клетках HeLa. В неинфецированных клетках, пирин был обнаружен как в ядре, так и в цитоплазме; при ПВ инфекции, наблюдалась тенденция перераспределения пирина в область локализации белка ЗА (эндоплазматический ретикулум) (рис. 11 б,в).
В 2005 году была продемонстрирована способность пирина окислять кверцетин (Adams М, Jia Z., 2005). Кверцетин явяется одним из наиболее распространенных флавоноидов, присутствующих в овощах и фруктах, регулярно употребляемых в пищу (лук, острый перец, брокколи, леттук, яблоки, клюква, брусника, смородина, черешня, красный виноград), а также в гречневой крупе, чае и красном вине. Кверцетин и продукты его метаболизма обладают анти-инфламматорным действием, а также ингибируют экспрессию молекул, принимающих участие в клеточной адгезии (тем самым, в частности, препятствуя развитию атеросклероза). Кверцетин является близким структурным гомологом 3-метилкверцетина - мощного ингибитора полиовирусной репликации. Было показано, что кверцетин способен ингибировать другие вирусные инфекции.
Из предыдущих работ было известно, что в отличие от производного кверцетина, 3-метилкверцетина, который значительно снижает эффективность ПВ инфекции в клетках HeLa, кверцетин в концентрациях ниже бмкМ не подавляет полиовирусную инфекцию в этих клетках (Castrillo JL, Carrasco L., 1987). Мы сравнили влияние различных доз кверсетина на протекание полиовирусной инфекции в клеточных линиях эпителиального происхождения HeLa, NKE и НЕК293 и экспрессию пирина в этих клеточных лининях.
Ингибиторный эффект кверцетина на репликацию полиовируса оценивали определяя титр вируса (рис.12д) и методом Вестерн-
блоттинга с антителами, специфичными к полиовирусным белкам (рис. 12а,б). Клетки HeLa, NKE и НЕК293 были инфецированы полиовирусом (МИ 1) в течение 24 часов в присутствии кверцетина в различных концентрациях. Обработка клеток кверцетином снижала накопление полиовирусных белков в клетках НЕК293 и NKE. Таким образом, кверцетин не влияла на репликацию полиовируса в клетках HeLa в концентрациях ниже бмкМ, но ингибировала полиовирусную инфекцию более чем в 5 раз в клетках НЕК293 и NKE начиная с концентрации 2мкМ (рис. 12в).
а НЕК293 HeLa NKE
hsP90 -><т*. « » - - ., #«•« •
капсид Г, jßb Ш
кверц. (цМ) - 2 6 - - 2 6 - -26-guanHCI - - - + - - - + - -- +
полно (ч.) 333333335555
б
го
к ч 120 1
§ I 100 . . .
I 1 || I
t ГО
о *
кверц. (цМ) - 2 6 - - 2 6 - -26-guanHCI - - - + -- - + - ..+
полио(ч.) 333333335555
Рис. 12. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину зависит от типа клеточной линии, (а,б) Экспрессия капсидного белка полиовируса в клетках НЕК293, HeLa и NKE, инфицированных в течение 24 ч. (МИ 1) в присутствии кверцетина, Hsp90 - контроль нагрузки, гуанидин HCl (ImM) -позитивный контроль подавления ПВ инфекции; (в,г) экспрессия пирина в клетках HeLa, NKE и НЕК293; (г,д) титр полиовируса в клетках HeLa и NKE, инфецированных в течение 24 ч. (МИ 1) в присутствии кверцетина.
Оценка количества пирина в клетках HeLa, NKE и НЕК293 была сделана методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфически распознающих пирин. Экспрессия пирина была в 4-5 раз выше в HeLa по сравнению с NKE и НЕК293 (рис. 12в,г). Таким образом, количество пирина хорошо коррелирует с устойчивостью полиовирусной инфекции к обработке кверцетином в этих клеточных линиях.
Для того, чтобы проверить эффект пирина на репликацию полиовируса при обработке кверцетином и исключить влияние
HeLa НЕК293 NKE
hspSO
NKE. + + + + .... HeLa - - ..++++
кверц. (цМ) - 2 3 6 - 2 3 6
особенностей конкретной клеточной линии на кверситиназную активность пирина, а также на эффективность репликации полиовируса, пирин был гиперэкспрессирован либо подавлен методом РНК-интерференции в клетках МКЕ и НеЬа, соответственно. Экзогенный пирин или пирин-специфическая э^Ы'А были введены в клетки лентивирусной инфекцией. Полученные клеточные линии 1^КЕ_Ртп и НеЬа_з1Ртп были инфецированы полиовирусом (МИ 10) одновременно с контрольными линиями ЫКЕ вектор и НеЬа з1Ьис (с введенными в них пустым вектором и контрольной 5|'ЯЫА к гену люциферазы светлячка) в течение 3-4 часов. Различные концентрации кверцетина были добалены за 1 час до инфекции. Эффективность полиовирусной репликации оценивалась методом Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфических к капсидному белку полиовируса. Уровень экспрессии пирина оценивался Вестерн-блоттингом с использованием антител к пирину.
НКЕ МЕртп
пирин ЗА/ЗАВ кверц. (цМ)
2 20 - 2 20 - 2
полиовирус: 4 ч
Не1_э_8|Р1г[п Не|_э
^ V*" щю щяц
+ + - -
2 6-2
полиовирус: Зч.
кверц. (|иМ)
т в, с г
э1Р1пп (цМ) кверц. (цМ)
полиовирус: Зч.
Рис. 13.
- 2 6 - 2 6
полиовирус: Зч.
Изменение количества пирина в клетках модулирует устойчивость полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина. (а) ВБ
тотальных белковых экстрактов (10 мкг белка) из клеток НеЬа, ЖЕ и МКЕртп, инфецированных полиовирусом (МИ 10) в течение 4 часов. 2 мкМ и 20мкМ кверцетина было добавлено за 3 часа до инфекции. Антитела к актину - контроль нагрузки; (б,в) ВБ тотальных белковых экстрактов клеток НеЬа_5И-ис и НеЬа_з1Ртп, инфицированых ПВ (МИ 10) в течение 3 часов; №р90 - контроль нагрузки; (г) титрации полиовируса из среды через 3 часа после инфекции (МИ 10) клеток НеЬа_51Ртп и контрольных клеток НеЬаз&ис. Кверцетин в концентрациях 2мкМ либо бмкМ был добавлен за 1 час до ПВ инфекции.
Как видно из рис. 13а, гиперэкспрессия пирина в клетках ЫКЕ приводит к повышению устойчивости полиовирусной репликации к ингибиторному эффекту низких доз кверцетина. Повышенное
количество пирина само по себе не приводило к увеличению репликации полиовируса, следовательно, резистентность полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина коррелирует с уровнем пирина в этих клетках. С другой стороны, в результате понижения уровня пирина в клетках НеЬа, устойчивость полиовируса к кверцетину существенно уменьшалась (рис. 136). Действительно, обработка клеток НеЬа_з1Ьис в течение полиовирусной инфекции кверцетином в концентрации 2мкМ не меняла количества капсидного белка; кверцетин в концентрации бмкМ снижал количество капсида в 1,5 раза. В то же время, в клетках НеЬа_з1Ршп (количество пирина в которых было снижено более чем в 10 раз) обработка кверцетином в концентрации 2мкМ снижала капсидный белок в 3 раза; использование концентрации бмкМ приводило к практически полному подавлению полиовирусной инфекции. Результаты Вестерн-блоттинга были подтверждены титрацией полиовируса, собранного с клеток НеЬа_51Ьис и НеЬа_з!Ршп, обработанных различными концентрациями кверцетина. Таким образом, чувствительность полиовирусной инфекции к обработке кверцетином в клетках НеЬа и ЫКЕ зависит от количества пирина в этих клетках. /
Flag-nupuH-HIS + + + +
ЗД-На - - + +
энти-Flag аб + + + +
н/связ. + - + -
ИП - + - +
Flag-nupuH-HIS-> - «i
ЗА" МА ^ -явюдеьля. ■.*'
Рис. 14, Кверцетиназная активность пирина in vitro, (а) Кверцетиназная активность пирина пропорциональна количеству пирина; (б) присутствие ЗА не меняет кверцетиназную активность пирина; (в) ВБ комплексов, использованных для измерения кверцетиназной активности пирина в (а,б).
Кверцетиназная активность была детектирована для пирина, выделенного из E.coli и человеческих клеток (2005). Поскольку полиовирусный белок ЗА не присутствует в неинфицированной клетке и таким образом не является частью пиринового белкового комплекса, обладающего кверцетиназной активностью, связывание с ЗА может привести к изменению этой активности. Кверцетиназная активность пирина была измерена в лизатах клеток HeLa, экспрессирующих пирин, тагированный HIS- и Flag-последовательностями, и/или ЗА (тагированный НА-эпитопом). Белковые комплексы, содержащие пирин, были очищены методом аффинной хроматографии на никелевой
колонке из цитоплазматических лизатов; кверцетиназная активность пирина измерена in vitro по изменению абсорбции кверцетина методом калориметрии (длина волны 384 нм). Кверцетиназная активность пирина была пропорциональна количеству этого белка (рис. 14а), образование комплекса с ЗА не влияло на кверцетиназную активность пирина (рис. 146,в).
Таким образом, эффективность подавления кверцетином полиовирусной инфекции в различных клетках зависит от уровня экспрессии пирина в этих клетках. ЗА образует комплекс с пирином, в то же время, кверцетиназная активность пирина остается на прежнем уровне. На основании экспериментов по колокализации можно предположить, что повышенная локальная концентрация пирина защищает полиовирус от деструктивного воздействия кверцетина в местах репликации полиовируса; таким образом, кверсетиназная активность пирина создает благоприятные условия для полиовирусной инфекции.
Взятые вместе, результаты данной работы демонстрируют многофункциональный характер роли полиовирусного белка ЗА в подавлении анти-вирусных систем организма (рис. 15).
кверцетин
выживание (NFkB)
ITNFR1 >TNFa
:_/'-'
апоптоз (каспаза 8)
Гольджи
Рис. 15. Модель взаимодействия полиовирусного белка ЗА с клеточными белками пирин и LISI. Репликация полиовируса происходит на мембранных пузырьках, отпочковывающихся от эндоплазматического ретикулума (ЭР). Белок ЗА препятствует нормальному транспорту мембранных пузырьков
вдоль микротрубочек (МТ), нарушая взаимодействие LISI с другими компонентами динеинового моторного комплекса (ДМ). Вновь синтезированные рецепторы фактора некроза опухоли (TNFR1) не достигают плазматической мембраны (ПМ), в результате чего короткоживущий TNFR1 быстро исчезает с поверхности клетки. Таким образом, ЗА предотвращает активацию TNFR1. Поскольку в ходе ПВ инфекции происходит отключение кэп-зависимой трансляции, анти-апоптотический сигнальный каскад, связянный с активацией NFkB и его мишеней, заблокирован. Связывание TNFR1 с его лигандом, TNFa, должно приводить, в таком случае, к запуску апоптотической программы с последующим поглощением клетки, производящей вирус, макрофагами. Блокировка везикулярного транспорта полиовирусным белком ЗА дает возможность полиовирусу развится и выйти во внеклеточное пространство, лизировав клетку-хозяина. Взаимодействие ЗА с кверцетиназой пирин повышает локальную концентрацию пирина в местах репликации полиовируса, что дает возможность эффективной деактивации этого токсичного для полиовируса флавоноида.
Выводы.
1. Впервые была продемонстрирована способность полиовирусных белков ЗА и 2В защищать клетки млекопитающих от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли.
2. Было показано, что экзогенная экспрессия единственного полиовирусного белка ЗА, также как и инфекция полноразмерным вирусом полиомиелита, приводит к исчезновению рецептора фактора некроза опухоли TNFR1 с поверхности клеток млекопитающих, что в свою очередь приводит к блокировке апоптотического сигнального каскада и способствует таким образом развитию полиовирусной инфекции.
3. В результате проведенного скрининга с использованием дрожжевой двухгибридной системы были обнаружены новые клеточные мишени полиовирусного белка ЗА - белки LISI и пирин.
4. Было охарактеризовано взаимодействие полиовирусного белка ЗА с клеточными белками LISI и пирин in vivo (детектированы комплексы и показана колокализация в клетках млекопитающих) и in vitro (показано прямое взаимодействие очищенных белков).
5. Впервые продемонстрирован молекулярный механизм ингибирования клеточного везикулярного транспорта белков полиовирусным белком ЗА через взаимодействие с компонентом динеинового моторного комплекса LISI; показано, что введение в клетку доминантно-негативных форм белка LISI вызывает аналогичные нарушения везикулярного транспорта, в то время как одновременная экспрессия белков LISI и ЗА снимает блокировку транспорта, вызываемую экспрессией белка ЗА .
6. Раскрыт механизм устойчивости вируса полиомиелита к действию антивирусного флавоноида кверцетина засчет
взаимодействия полиовирусного белка ЗА с клеточным белком пирин, являющимся кверцетиназой.
7. На основе полученных в данной работе результатов, предложена новая модель анти-апоптотического и про-инфекционного действия полиовирусного белка ЗА.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Kondratova A, Gudkov A., Neznanov N. 1999. Anti-apoptotic properties of polioviral proteins 2B, 2BC, 2C, ЗА and ЗАВ. Abstracts of the third Cold Spring Harbor Meeting on "Programm Cell Death", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, Sept.29-Oct.3,1999, США.
2. Neznanov N., Chumakov K., Gudkov A., Kondratova A. Polioviral proteins 2B and ЗА inhibit cell death induced by polioviral protease 2A. Abstracts of the third Cold Spring Harbor Meeting on "Programm Cell Death", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, Sept.29-Oct.3,1999, США.
3. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Angres B, Zhumabayeva B, Agol VI, Gudkov AV. 2001. Poliovirus protein ЗА inhibits tumor necrosis factor (TNF)-induced apoptosis by eliminating the TNF receptor from the cell surface. J Virol. 2001 Nov; 75(21):10409-20.
4. Kondratova AA, Neznanov N, Kondratov RV, Gudkov AV. 2005. Poliovirus protein ЗА binds and inactivates LIS1, causing block of membrane protein trafficking and deregulation of cell division. Cell Cycle. 2005 0ct;4(10): 1403-10. Epub 2005 Oct 20.
5. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Neznanova L, Kondratov R, Banerjee AK, Gudkov AV. 2008. Quercetinase pirin makes poliovirus replication resistant to flavonoid quercetin. DNA Cell Biol. 2008 Apr;27(4): 191-8.
ООО «ВНИПР» 127644, Москва, Клязьминская ул., Д.15 (495) 486-80-76 зак.№5454 от 19.01.2009 г. тираж 100 экз
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кондратова, Анна Анатольевна
Список сокращений.
Введение.
I. Обзор литературы.
1.1. Пикорнавирусы.
1.2. Полиовирус.
1.2.2. Полиовирусная РНК.
1.2.3. Белки полиовируса.
1.2.4. Полиовирусный белок ЗА.
1.3. Апоптоз.
1.3.1. Общая характеристика.
1.3.2. Апоптоз, индуцируемый прямой стимуляцией «рецепторов смерти» TNFR и FAS.
1.4. Везикулярный белковый транспорт.
1.4.1. Общая схема.
1.4.2.Цитоскелет и молекулярные моторы в мембранном транспорте белков.
1.4.3. Динеин и аппарат Гольджи.
1.4.4. Разрушение аппарата Гольджи под воздействием дрожжевого метаболита брефельдина А.
1.5. LISI и его роль в регуляции функций динеина.
1.6. Клеточные функции пирина.
1.7. Биоактивность кверцетина.
II. Материалы и методы.
II. 1. Работа с культурами эукариотических клеток.
II. 1.1. Клеточные линии, использованные в работе, и их культивирование.
II.1.2. Трансфекция.
II. 1.3. Упаковка лентивярусных частиц.
II. 1.4. Очистка вирионов и трансдукция.
II.1.5. Определение эффективного титра вирусных частиц и множественности заражения клеток.
II.2. Работа с плазмидной ДНК и клонирование.
11.2.1. Получение химически компетентных клеток E.coli.
11.2.2. Трансформация химически компетентных клеток E.coli.
11.2.3. Препаративное и аналитическое выделение плазмидной ДНК.
11.2.4. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции.
11.2.5. Фракционирование и извлечение ДНК из агарозных гелей.
11.2.6. Цитирование ДНК.
11.2.7. Векторы и плазмидные конструкции, использованные в работе.
11.2.8. Получение конструкций, экспрессирующих полипептиды полиовируса.
11.2.9. Получение конструкций, экспрессирующих полноразмерные пирин и LISI и фрагменты LISI.
11.2.10. Получение конструкций для экспрессии РНК-шпилек для РНК-интерференции.
II.4. Методы выделения и анализа белков.
11.4.1. Получение тотальных клеточных лизатов.
11.4.2. Приготовление ядерных экстрактов.
11.4.3. Измерение концентрации белка по методу Бредфорда.
11.4.4. Фракционирование белков, перенос на мембрану и иммунодетекция.
11.4.5. Иммунопреципитация.
11.4.6. Иммунофлуоресценция.
11.4.7. Очистка белков методом аффинной хроматографии с исользованием GST (GST-ny л л-дау н).
11.4.8. Измерение кверцетиназной активности пирина.
11.5. Экспрессия белков in vitro.
11.6. Индукция апоптоза с использованием TNFa и антител к FAS.
11.7. Анализ ДНК-белковых взаимодействий методом сдвига электрофорезной подвижности.
11.8. Метод цитофлуоресцентного анализа.
11.9. Дрожжевая двугибридная система.
III. Результаты и обсуждение.
III. 1. Полиовирусные белки 2В и ЗА блокируют апоптоз, индуцированный фактором некроза опухоли. Ингибирование везикулярного транспорта белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи как потенциальный молекулярный механизм.
III. 1.1. Получение мини-библиотеки плазмид, экспрессирующих неструктурные белки полиовируса.
III. 1.2. Полиовирусные белки ЗА и 2В снижают чувствительность клеток HeLa и NIH3T3 к воздействию фактора некроза опухоли TNFa в присутствии ингибитора белкового синтеза или полиовирусной протеазы 2А.
III. 1.3. ПВ белки 2В и ЗА подавляют везикулярный транспорт белков между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи.
III.2. Полиовирусный белок ЗА ингибирует TNF-зависимый апоптоз засчёт умеьшения количества TNF рецептора на клеточной поверности.
III.2.1. Белок ЗА и брефельдин А уменьшают количество TNFR1 на клеточной поверхности.
111.2.2. Полиовирусная инфекция подавляет деградацию 1кВа в ответ на обработку TNFa.
111.2.3. TNFR1 быстро исчезает с клеточной поверхности во время полиовирусной инфекции.
II.2.4. Обработка TNFa не вызывает активацию NFkB в присутствии ЗА и брефельдина А.
111.3. Поиск клеточных интеракторов полиовирусного белка ЗА методом скринирования библиотеки кДНК в дрожжевой двухгибридной системе.
III.3.1. Изолирование клеточных белков, взаимодействующих с полиовирусным белком ЗА в дрожжевой двухгибридной системе.
III.3.2. Подтверждение взаимодействия ЗА с пирином и LISI in vitro и in vivo.
111.4. LISI как клеточный интерактор ЗА.
111.4.1. Ко-локализация LISI и ЗА в клетке.
111.3.2. Гиперэкспрессия белка LISI снимает ингибирование белкового транспорта из ЭР в Гольджи полиовирусным белком ЗА.
111.3.3. Гиперэкспрессия LISI препятствует уменьшению количества TNFR1 на клеточной поверхности, вызываемого ЗА.
111.3.4. Экспрессия N- и С-концевых делеционных мутантов LISI уменьшает количество TNFR1 на клеточной поверхности.
III.4. Пирин как клеточный интерактор ЗА.
111.4.1. Ко-локализация ЗА и пирина в клетках HeLa, зараженных полиовирусом.
111.4.2. Чувствительность полиовирусной инфекции к кверцетину коррелирует с экспрессией пирина в различных клеточных линиях.
111.4.3. Кверцетин в высокой концентрации ингибирует развитие полиовирусной инфекции в клетках HeLa.
П.4.4. Изменение количества пирина в клетках за счет гиперэкспрессии либо подавления методом РНК-интерференции модулирует устойчивость полиовирусной инфекции к воздействию кверцетина.
Ш.4.5. Белок ЗА не меняет кверцетиназную активность пирина.
IV. Модель молекулярных механизмов подавления анти-инфекционных защитных систем клетки-хозяина в экспериментальной полиовирусной инфекции.
Выводы.
Благодарности.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярные механизмы подавления антиинфекционных защитных систем клетки-хозяина на модели экспериментальной полиовирусной инфекции"
В процессе инфекции патогенный микроорганизм наносит повреждения органам и тканям организма-хозяина, что приводит к нарушению их функций и может повлечь за собой гибель всего организма. Организм-хозяин обладает широким арсеналом защитных анти-инфекционных средств, включая врожденный и приобретенный иммунный ответ на уровне организма и запрограммированную клеточную смерть (апоптоз) на уровне отдельной клетки, что в большинстве случаев позволяет организму эффективно справляться с инфекцией. В свою очередь, в процессе эволюции патогенные микроорганизмы приобрели способность к защите от анти-инфекционных процессов, развивающихся в пораженном организме 1,2.
Запрограммированная клеточная смерть, или апоптоз, является одним из методов борьбы организма-хозяина с внутриклеточными паразитами, такими как микоплазмы, токсоплазмы, облигатные внутриклеточные бактерии (хламидии, риккетсии) и вирусы. Подавление про-апоптотической программы клетки-хозяина необходимо для успешного размножения внутриклеточных паразитических микроорганизмов как на стадии репликации, так и на стадии высвобождения вновь образованных микроорганизмов (в особенности для микроорганизмов, имеющих литическую стадию развития, сопряженную с разрывом мембраны клетки-хозяина) 3"5. Действительно, в процессе изучения взаимодействия внутриклеточных паразитов с клеткой-хозяином были обнаружены как вирусные, так и бактериальные белки, обладающие анти-апоптотическими свойствами (большой Т-антиген, Е6, уБЫР, 1АР, р35, Е1В и др.). 6' 7 С другой стороны, поскольку активность белковых факторов микроорганизмов зачастую направлена на ключевые участки антиинфекционных систем и про-апоптотических сигнальных каскадов клетки-хозяина, изучение защитных механизмов патогенных микроорганизмов приводит к открытию новых сигнальных каскадов, вовлеченных в апоптоз, а также к более глубокому пониманию других важных аспектов клеточной физиологии.
Терапевтические анти-инфекционные методы включают стимуляцию защитных средств организма-хозяина (вакцинация, неспецифическая иммунная терапия) и непосредственное воздействие на патогенные микроорганизмы, ведущее к уничтожению либо препятствующее быстрому размножению патогена (антибиотики, бактериостатики, антивирусные препараты). Высокая способность к изменчивости позволяет микроорганизмам адаптироваться к действию лекарственных препаратов, что приводит к необходимости разработки во многих случаях принципиально новых, как более универсальных, так и более специфических, терапевтических подходов, что в свою очередь требует всестороннего изучения процессов, происходящих в пораженном организме на системном, клеточном и молекулярном уровнях. Следует отметить, что препараты, направленные на модификацию процессов, происходящих в организме-хозяине (например, активацию апоптоза в инфицированных клетках), менее зависят от изменчивости микроорганизма и потому более универсальны.
Наиболее простыми по стороению патогенными микроорганизмами являются вирусы, что делает их привлекательной моделью для изучения отношения «паразит-хозяин» на молекулярном уровне. Действительно, анти-апоптотические свойства были обнаружены для белков многих ДНК-содержащих вирусов, что привело к открытию таких важных про- и анти-апоптотических клеточных белков, как р53 и Akt8'9.
Перед началом данной работы были опубликованы данные об анти-апоптотических свойствах полиовируса (семейство РНК-содержащих пикорнавирусов), однако молекулярные механизмы этих процессов были неизвестны 10-12 Позднее было показано, что течение полиовирусной инфекции сопровождается активацией элементов клеточной апоптотической машины, однако полного развития апоптотической программы не происходит, что свидетельствует о наличии анти-апоптотических факторов в арсенале полиовируса 13. Аналогичные феномены были описаны для других членов семейства пикорнавирусов (вирусов Кокзаки , гепатита А, энцефаломиокардита и др.) 14~16. Пикорнавирусы являются самыми маленькими из известных вирусов, кодируя менее 20 белков. Таким образом, полиовирусная инфекция представляла собой новую удобную модель для изучения про- и анти-апоптотических механизмов при взаимодействии патогена с клеткой-хозяином.
Активации внутриклеточных апоптотических путей происходит в ответ на патологические изменения, производимые патогеном в клетке-хозяине, а также засчет активации специфических "рецепторов смерти" , на плазматической мембране клетки цитокинами, выделяемыми организмом в ответ на инфламматорные сигналы. Пермессивная полиовирусная инфекция приводит первоначально к запуску про-апоптотических механизмов в результате активности полиовирусных протеаз 2А, ЗС и, возможно, других белков, что сопровождается выбросом цитохрома С. Однако уже через 1,5 часа после начала инфекции сравнительно быстая апоптотическая программа подавляется и в клетке развивается более медленный цитопатический эффект, в результате чего вирус имеет достаточно времени для полного развития и производства потомства. Развитие цитопатического эффекта заканчивается лизисом клетки-хозяина и выпуском вновь синтезированных вирусных частиц 12. Экспонирование внутреннего содержимого клетки является инфламматорным стимулом. Нами было сделано предположение, что полиовирус, наряду с описанной выше способностью предотвращать развитие апоптоза, вызванного внутриклеточными стимулами, может обладать защитным механизмом против апоптоза, вызываемого активацией рецептора фактора некроза опухоли - ТОТЬи.
Действительно, стимуляция TNFR1 его лигандом, TNFD, приводит к одновременному запуску про- и антиапоптотических сигнальных каскадов. Анти-апоптотический путь связан с активацией NFkB с последующим синтезом его транскрипционных мишеней, которые ингибируют развитие апоптоза в клетке 17. Полиовирусная инфекция сопровождается подавлением кэп-зависимого белкового синтеза в результате активности протеазы 2А 18; таким образом, в клетке, зараженной полиовирусом, заблокирована анти-апоптотическая ветвь каскада, вызываемого активацией TNFR1, что делает клетку высокочувствительной к TNFa-индуцируемому апоптозу.
Данная работа посвящена изучению молекулярных механизмов подавления анти-инфекционных защитных систем клетки-хозяина в экспериментальной полиовирусной инфекции, направленных в частности против апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли. В ходе исследования были поставлены следующие задачи:
1. Определение полиовирусных белков, защищающих клетки HeLa и НЕК293 от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли в присутствии ингибитора белкового синтеза циклогексимида.
2. Изучение способности полиовирусных белков ЗА и 2В ингибировать транспорт TNF рецептора (TNFR) на клеточную поверхность.
3. Определение клеточных мишеней белка ЗА с использованием дрожжевой двухгибридной системы.
4. Исследование механизма ингибирования транспорта TNFR за счет взаимодействия ЗА с компонентом динеинового моторного комплекса LISI.
5. Изучение влияния уровня экспрессии обнаруженной клеточной мишени ЗА - кверцетиназы пирин - на протекание ПВ инфекции.
I. Обзор литературы. 1.1. Пикорнавирусы.
Семейство пикорнавирусов (Picomaviridae. от исп pico — малая величина и сокр. англ. RNA — рибонуклеиновая кислота ) объединяет лишённые внешней мембранной оболочки вирусы, содержащие одно цепочечную геномную РНК положительной полярности, заключенную в белковый икосаэдный капсид (IV группа по системе классификации вирусов по Балтимору 19 Пикорнавирусы являются самыми маленькими из известных вирусов (размер капсида менее 30 нм, размер генома - 7-9 тысяч нуклеиновых оснований). Размножение пикорнавирусов происходит в цитоплазме клеток бактерий, растений, животных и человека. Пикорнавирусы подразделяются на 9 родов; двумя основными категориями являются энтеровирусы и риновирусы. Каждый род пикорнавирусов представлен множеством серотипов (Табл. 1).
Таблица 1. Семейство пикорнавирусов 118
Род Вид (* - видовой тип) Серотипы
Энтеровирус Энтеровирус быка 2 (BEV-1, BEV-2)
Энтеровирус человека А 21 (Кокзаки А, энтеровирусы)
Энтеровирус человека В 57 {Кокзаки В, энтеровирусы, эховирусы, др.)
Энтеровирус человека С 14 (Кокзаки А, энтеровирусы)
Энтеровирус человека 0 3 (EV-68, EV-70, EV-94)
Полиовирус* 3{PV-1, PV-2, PV-3)
Энтеровирус свиньи А 1 (PEV-8)
Энтеровирус свиньи В 2 (PEV-9, PEV-10)
Энтеровирус обезьяны А 1 (SEV-A1)
Риновирус Риновирус человека А* 74
Риновирус человека В 25
Гепатовирус Вирус гепатита А* 1 (HAV)
Вирус энцефаломиелита птиц 1 (AEV)
Кардиовирус Вирус энцефаломиокардита* 1 (EMCV)
Тейловирус (энцефаломиелит) 5 (TMEV, VHEV, TLV.SAFV-1, SAFV-2)
Афто вирус Вирус ящура* 7 (О, А, С, SAT-1, SAT-2, SAT-3, Asia-1
Вирус ринита лошади А 1 (ERAV)
Пареховирус Пареховирус человека* 6 (HPeV-1, HPeV-2, HPeV-3, HPeV-4, HPeV-5, HPeV-6)
Вирус Льганган 3
Эрбовирус Вирус ринита лошади В* 3 (ERBV-1, ERBV-2, ERBV-3)
Кобувирус Вирус Айчи* 1 (AiV)
Кобувирус быка 1 (BKV)
Тешовирус Тешовирус свиньи* 11 (PTV-1.PTV-11)
Риновирусы (от греч. rhis — нос) - наиболее распространенные инфекционные агенты, поражающие человека - являются причиной 30-50% случаев острых респираторных заболеваний (катаров верхних дыхательных путей). Известно около 100 серотипов риновирусов человека групп А и Б. Риновирус распространяется воздушно-капельным и контактным (с контаминированных поверхностей, в том числе при персональных контактах) путями. После попадания в организм человека, риновирус связывается с рецептором ICAM-1 (intracellular adhesion molecule -1) клеток респираторного эпителия верхних респираторных путей в течение 15 минут; инкубационный период длится 8-10 часов. Нижние респираторные пути поражаются реже, поскольку вирус плохо растет при температуре 37°С 21.
Энтеровирусы (от греч. enteron — кишка) поражают кишечник человека и позвоночных животных, откуда они могут распространяться и поражать другие органы. Частота энтеровирусных инфекций во всем мире достигает несколький сотен миллионов случаев в год; инфекции вызывают широкий спектр заболеваний, от обычной простуды до миокардита и асептрического менингита. К энтеровирусам относятся вирусы полиомиелита (3 серотипа), вызывающие поражение центральной нервной системы и параличи, эховирусы - наиболее частая причина асептического менингита, вирусы Коксаки (группы А и Б, 30 серотипов) — возбудители энцефаломиокардита новорожденных, перикардита, конъюнктивита и других болезней человека; вирусы Коксаки группы Б поражают производящие инсулин вета-клетки панкреатической железы и могут вызывать дибет 1-го типа, а также служат причиной простудных заболеваний, осложненных кишечными расстройствами 22.
К пикорнавирусам относятся также вирусы ящура, гепатита А, энцефаломиокардита и др. При всем многообразии вызываемых заболеваний, не-структурные белки пикорнавирусов разных видов отличаются поразительным сходством. Многообразие заболеваний является следствием отличий в строении капсидных белков, которое и определяет спектр потенциальных клеток-хозяев через наличие специфических рецепторов на поверхности этих клеток, с которыми способен провзаимодействовать данный вирус. Так, геном вируса Кокзаки А21 имеет высокий уровень идентичности с полиовирусом, однако вирус Кокзаки А21 поражает верхние дыхательные пути, в то время как развитие полиовирусной инфекции приводит к
23 24 поражению моторных нейронов ' . Действительно, рецептор вируса Кокзаки А21 (1САМ-1) экспрессируется клетками эндотелия, в то время как рецептор полиовируса СБ155 присутствует, в частности, на поверхности моторных
25 нейронов спинного мозга . Трансгенные мыши, экспрессирующие 1САМ-1 человека во всех тканях, подвержены заражению вирусом Кокзаки А21. Было продемонстрировано, что инфекция этих трансгенных мышей вирусом Кокзаки А21 приводит к поражению ЦНС и развитию полиомиелита 26. В другой работе было показано, что химерный вирус, имеющий капсид полиовируса и репликационные белки вируса Кокзаки А кластера С (С-САУ), неировирулентен в мышах, трансгенно экспрессирующих СБ15 5 27. Таким образом, высокогомологичные неструктурные белки различных типов пикорнавирусов имеют сходные функции.
Филогенетический анализ аминокислотной и нуклеотидной последовательностей полиовируса дает основания предположить, что полиовирус эволюционировал от предшественника вируса Кокзаки А кластера С засчет мутаций в капсидных белках, позволивших заражать клетки, экспрессирующие CD 155. Некоторые исследователи полагают, что прекращение вакцинации против современного полиовируса, находящегося на грани исчезновения из человеческой популяции, может создать условия для возникновения нового полиовирус-подобного вируса на основе C-CAV путем
27 переключения рецепторов (ICAM-1 на CD 155)
Разнообразие капсидов не ограничивается экспрессией , молекул, распознаваемых различными рецепторами: к примеру, капсид энтеровирусов обеспечивает кислотоустойчивость, что позволяет вирусам этого вида проходить через желудок и поражать кишечник 28. Таким образом, определенные риновирусы и вирусы Кокзаки, взаимодействующие с общим рецептором на поверхности эпителиальных клеток, поражают различные виды эпителия.
1.2. Полиовирус.
Полиовирус принадлежит к роду энтеровирусов - вирусов, местом жизнедеятельности которых является кишечный тракт. В семействе полиовируса встречаются три серотипа: Махони, Лансинга и Сабина. Все три серотипа могут заражать приматов, 2-ой серотип заражает также мышей 13. Основные характеристики полиовируса являются общими для всех серотипов. Данная работа была выполнена на генетическом материале полиовируса 1-го типа (Махони).
Полиовирус представляет собой плотно упакованную РНК, окружённую тонкой белковой оболочкой (липидный слой отсутствует). Вирион имеет форму икосаэдра; диаметр частицы равен приблизительно 30 нм 29.
Полиовирус проникает в клетку, взаимодействуя со специфическими рецепторами на плазматической мембране (С0155) Во время взаимодействия вирус подвергается конформационным изменениям, в результате которых вирусный геном переносится в цитоплазму и освобождается от белковой оболочки. Используя аппарат белкового синтеза клетки-хозяина, вирусная РНК образует полисомы, на которых начинается синтез полиовирусного полипротеина. В результате автокаталитического расщепления полипротеина образуются белки, при помощи которых начинается репликация полиовирусного генома и дальнейший протеолиз вновь синтезированных пол и протеинов. Репликация полиовирусной РНК происходит на цитоплазматической поверхности мембранных пузырьков, образующихся во время инфекции из мембран секреторного пути (аппарат Гольджи, ЭР) при участии образовавшихся белков. По мере увеличения концентрации вирусных белков происходит упаковка плюс-РНК в вирионы, которые высвобождаются из клетки в результате её литического разрушения 30.
Таблица 2. Временная последовательность событий, происходящих в течение ПВ иифекнии.
Время после инфекции Событие
-30 минут Резкое подавление клеточного белкового синтеза
-1-2 часа Резкое подавление клеточного синтеза макромолекул, аггрегация хроматина
-2,5-3 часа Начало синтеза вирусных белков; вакуолизация цитоплазмы
3-4 часа Пермиабилизация плазматической мембраны
4-6 часов Сборка вирионов в цитоплазме
6-10 часов Лизис клетки, выпуск вирусных частиц
Полный цикл размножения занимает от 5 до 10 часов, в зависимости от таких факторов, как рН, температура, тип клетки-хозяина, метаболическое состояние клетки и число частиц, заражающих одну клетку. Временная последовательность событий, происходящих в течение ПВ инфекции, приведена в Таблице 1.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кондратова, Анна Анатольевна
Выводы.
1. Полиовирусные белки ЗА и 2В защищают клетки HeLa и NIH3T3 от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухоли в присутствии ингибитора белкового синтеза циклогексимида.
2. Короткоживущий рецептор TNFR, в противоположность долгоживущему FAS рецептору, исчезает с поверхности клеток, экспрессирующих ЗА либо инфецированных полиовирусом.
3. Полиовирусный белок ЗА образует комплексы и ко-локализуется с клеточными белками LISI и пирин.
4. ЗА ингибирует везикулярный транспорт белков через взаимодействие с компонентом динеинового моторного комплекса LIS 1.
5. Уровень экспрессии пирина в клетках коррелирует с устойчивостью полиовируса к воздействию флавоноида кверцетина, обладающего противовирусной активностью.
Благодарности.
Хочу поблагодарить своего научного руководителя Андрея Владимировича Гудкова за предоставление интереснейшей темы для разработки.
Свою искреннюю благодарность хочу выразить Николаю Незнанову за ценные советы в ходе работы, предоставленные реактивы и моральную поддержку.
Слова особой признательности хотела бы высказать в адрес Романа Кондратова, который научил меня многим методам и без чьей поддержки эту работу было бы трудно выполнить.
Я благодарю Наталью Тарарову и Александра Бойко за критические замечания и стимулирующие дискуссии, а также Ольгу Гурьянову и Ольгу Разоренову за помощь в подготовке материалов к защите. Я благодарна членам лабораторий Е.И.Фроловой, П.М.Чумакова и А.В.Гудкова за поддержку, а также всем, кто мне помогал в ходе работы.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1. Kondratova A, Gudkov A., Neznanov N. 1999. Anti-apoptotic properties of polioviral proteins 2B, 2BC, 2C, ЗА and ЗАВ. Abstracts of the third Cold Spring-Harbor Meeting on "Programm Cell Death", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, Sept.29-Oct.3, 1999, США.
2. Neznanov N., Chumakov K., Gudkov A., Kondratova A. Polioviral proteins 2B and ЗА inhibit cell death induced by polioviral protease 2 A. Abstracts of the third Cold Spring Harbor Meeting on "Programm Cell Death", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, Sept.29-Oct.3, 1999, США.
3. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Angres B, Zhumabayeva B, Agol VI, Gudkov AV. 2001. Poliovirus protein ЗА inhibits tumor necrosis factor (TNF)-induced apoptosis by eliminating the TNF receptor from the cell surface. J Virol. 2001 Nov;75(21):10409-20.
4. Kondratova AA, Neznanov N, Kondratov RV, Gudkov AV. 2005. Poliovirus protein ЗА binds and inactivates LIS1, causing block of membrane protein trafficking and deregulation of cell division. Cell Cycle. 2005 0ct;4(10): 1403-10. Epub 2005 Oct 20.
5. Neznanov N, Kondratova A, Chumakov KM, Neznanova L, Kondratov R, Baneijee AK, Gudkov AV. 2008. Quercetinase pirin makes poliovirus replication resistant to flavonoid quercetin. DNA Cell Biol. 2008 Apr;27(4):l 91-8.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кондратова, Анна Анатольевна, Москва
1. Labbe, К. & Saleh, M. Cell death in the host response to infection. Cell Death Differ 15, 1339-49 (2008).
2. Marques, J.T. & Carthew, R.W. A call to arms: coevolution of animal viruses and host innate immune responses. Trends Genet 23, 359-64 (2007).
3. McLean, J.E., Ruck, A., Shirazian, A., Pooyaei-Mehr, F. & Zakeri, Z.F. Viral manipulation of cell death. Curr Pharm Des 14, 198-220 (2008).
4. Hay, S. & Kannourakis, G. A time to kill: viral manipulation of the cell death program. J Gen Virol 83, 1547-64 (2002).
5. Luder, C.G., Gross, U. & Lopes, M.F. Intracellular protozoan parasites and apoptosis: diverse strategies to modulate parasite-host interactions. Trends Parasitol 17, 480-6 (2001).
6. Ying, S. et al. Premature apoptosis of Chlamydia-infected cells disrupts chlamydial development. J Infect Dis 198, 1536-44 (2008).
7. Hacker, G., Kirschnek, S. & Fischer, S.F. Apoptosis in infectious disease: how bacteria interfere with the apoptotic apparatus. MedMicrobiol Immunol 195, 11-9 (2006).
8. Bellacosa, A. et al. Structure, expression and chromosomal mapping of c-akt: relationship to v-akt and its implications. Oncogene 8, 745-54 (1993).
9. O'Reilly, D.R. p53 and transformation by SV40. Biol Cell 57, 187-96 (1986).
10. Tolskaya, E.A. et al. Apoptosis-inducing and apoptosis-preventing functions of poliovirus. J Virol 69, 1181-9(1995).
11. Agol, V.I. et al. Two types of death of poliovirus-infected cells: caspase involvement in the apoptosis but not cytopathic effect. Virology 252, 343-53 (1998).
12. Agol, V.I. et al. Competing death programs in poliovirus-infected cells: commitment switch in the middle of the infectious cyclc. J Virol 74, 5534-41 (2000).
13. Belov, G.A. et al. The major apoptotic pathway activated and suppressed by poliovirus. J Virol 77, 45-56 (2003).
14. Seko, Y. et al. Role of Fas/FasL pathway in the activation of infiltrating cells in murine acute myocarditis caused by Coxsackievirus B3. J Am Coll Cardiol 39, 1399-403 (2002).
15. Brack, K., Frings, W., Dotzauer, A. & Vallbracht, A. A cytopathogenic, apoptosis-inducing variant of hepatitis A virus. J Virol 72, 3370-6 (1998).
16. Tanaka, N. et al. Type I interferons are essential mediators of apoptotic death in virally infected cells. Genes Cells 3, 29-37 (1998).
17. Natoli, G., Costanzo, A., Guido, F., Moretti, F. & Levrero, M. Apoptotic, non-apoptotic, and anti-apoptotic pathways of tumor necrosis factor signalling. Biochem Pharmacol 56, 915-20 (1998).
18. Krausslich, H.G., Nicklin, M.J., Toyoda, H., Etchison, D. & Wimmer, E. Poliovirus proteinase 2A induces cleavage of eucaryotic initiation factor 4F polypeptide p220. J Virol 61,2711-8(1987).
19. Baltimore, D. The strategy of RNA viruses. Harvey Lect 70 Series, 57-74 (1974).
20. Eggers, H.J. Accomplishments and challenges in picornavirology as observed by a medical doctor. Clin Diagn Virol 9, 67-76 (1998).
21. Mackay, I.M. Human rhinoviruses: the cold wars resume. J Clin Virol 42, 297-320 (2008).
22. Lukashev, A.N. Role of recombination in evolution of enteroviruses. Rev Med Virol 15, 157-67(2005).
23. Nathanson, N. The pathogenesis of poliomyelitis: what we don't know. Adv Virus Res 71, 1-50 (2008).
24. Racaniello, V.R. One hundred years of poliovirus pathogenesis. Virology 344, 9-16 (2006).
25. Staunton, D.E. et al. A cell adhesion molecule, ICAM-1, is the major surfacc rcccptor for rhinoviruses. Cell 56, 849-53 (1989).
26. Dufresne, A.T. & Gromeier, M. A nonpolio enterovirus with respiratory tropism causes poliomyelitis in intercellular adhesion molecule 1 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 13636-41 (2004).
27. Jiang, P. et al. Evidence for emergence of diverse polioviruses from C-cluster coxsackie A viruses and implications for global poliovirus eradication. Proc Natl Acad Sei U S A 104, 9457-62 (2007).
28. Marlin, S.D. et al. A soluble form of intercellular adhesion molecule-1 inhibits rhinovirus infection. Nature 344, 70-2 (1990).
29. Berstein, H.D. & Baltimore, D. Poliovirus mutant that contains a cold-sensitive defect in viral RNA synthesis. J Virol 62, 2922-8 (1988).
30. Lidskii, P.V. & Agol, V.l. How the poliovirus changes a cell., Vopr Virusol 51, 4-11 (2006).
31. Schmid, M. & Wimmer, E. IRES-controlled protein synthesis and genome replication of poliovirus. Arch Virol Suppl 9, 279-89 (1994).
32. Toyoda, H. et al. Complete nucleotide sequences of all three poliovirus serotype genomes. Implication for genetic relationship, gene function and antigenic determinants. J Mol Biol 174, 561-85 (1984).
33. Brown, D.M., Cornell, C.T., Tran, G.P., Nguyen, J.H. & Seniler, B.L. An authentic 3' noncoding region is necessary for efficient poliovirus replication. J Virol 79, 11962-73 (2005).
34. Silvestri, L.S., Pariila, J.M., Morasco, B.J., Ogram, S.A. & Flanegan, J.B. Relationship between poliovirus negative-strand RNA synthesis and the length of the 3' poly(A) tail. Virology 345, 509-19 (2006).
35. Ehrenfeld, E. & Seniler, B.L. Anatomy of the poliovirus internal ribosome entry site. Curr Top Microbiol Immunol 203, 65-83 (1995).
36. Toyoda, H. et al. Host factors required for internal initiation of translation on poliovirus RNA.^rc/z Virol 138, 1-15 (1994).
37. Hallcr, A.A., Nguyen, J.H. & Semler, B.L. Minimum internal ribosome entry site required for poliovirus infectivity. J Virol 61, 7461-71 (1993).
38. Pallansch, M.A. et al. Protein processing map of poliovirus. J Virol 49, 873-80 (1984).
39. Jürgens, C.K. et al. 2Apro is a multifunctional protein that regulates the stability, translation and replication of poliovirus RNA. Virology 345, 346-57 (2006).
40. Donnelly, M.L. et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. ./Gen Virol 82, 1013-25 (2001).
41. Donnelly, M.L., Gani, D., Flint, M., Monaghan, S. & Ryan, M.D. The clcavage activities of aphthovirus and cardiovirus 2A proteins. J Gen Virol 78 ( Pt 1), 13-21 (1997).
42. Belov, G.A. & Ehrenfeld, E. Involvement of cellular membrane traffic proteins in poliovirus replication. Cell Cycle 6, 36-8 (2007).
43. Jürgens, C. & Flanegan, J.B. Initiation of poliovirus negative-strand RNA synthesis requires precursor forms of p2 proteins. J Virol 77, 1075-83 (2003).
44. Sandoval, I.V. & Carrasco, L. Poliovirus infection and expression of the poliovirus protein 2B provoke the disassembly of the Golgi complex, the organelle target for the antipoliovirus drug Ro-090179. J Virol 71, 4679-93 (1997).
45. Aldabe, R., Barco, A. & Carrasco, L. Membrane permeabilization by poliovirus proteins 2B and 2BC. J Biol Chem 111, 23134-7 (1996).
46. Wessels, E. et al. Effects of Picornavirus ЗА Proteins on Protein Transport and GBF1-dependent COP-I recruitment. J Virol 80, 11852-60 (2006).
47. Rodriguez, P.L. & Carrasco, L. Poliovirus protein 2C has ATPase and GTPase activities. J Biol Chem 268, 8105-10 (1993).
48. Pfister, Т., Jones, K.W. & Wimmer, E. A cysteine-rich motif in poliovirus protein 2C(ATPase) is involved in RNA replication and binds zinc in vitro. J Virol 74, 334-43 (2000).
49. Teterina, N.L. et al. Evidence for functional protein interactions required for poliovirus RNA replication. J Virol 80, 5327-37 (2006).
50. Vance, L.M., Moscufo, N., Chow, M. & Heinz, B.A. Poliovirus 2C region functions during encapsidation of viral RNA. J Virol 71, 8759-65 (1997).
51. Strauss, D.M. & Wuttke, D.S. Characterization of protein-protein interactions critical for poliovirus replication: analysis of ЗАВ and VPg binding to the RNA-dependent RNA polymerase. J Virol 81, 6369-78 (2007).
52. Lama, J., Sanz, M.A. & Rodriguez, P.L. A role for ЗАВ protein in poliovirus genome replication. J Biol Chem 270, 14430-8 (1995).
53. Paul, A.V. et al. Biochemical and genetic studies of the VPg uridylylation reaction catalyzed by the RNA polymerase of poliovirus. J Virol 77, 891-904 (2003).
54. Doedens, J.R., Giddings, Т.Н., Jr. & Kirkegaard, K. Inhibition of endoplasmic reticulum-to-Golgi traffic by poliovirus protein ЗА: genetic and ultrastructural analysis. J Virol 71, 9054-64 (1997),
55. Harris, K.S., Reddigari, S.R., Nickiin, M.J., Hammerle, Т. & Wimmer, E. Purification and characterization of poliovirus polypeptide 3CD, a proteinase and a precursor for RNA polymerase. J Virol 66, 7481-9 (1992).
56. Paul, A.V., Cao, X., Harris, K.S., Lama, J. & Wimmer, E. Studies with poliovirus polymerase 3Dpol. Stimulation of poly(U) synthesis in vitro by purified poliovirus protein ЗАВ .J Biol Chem 269, 29173-81 (1994).
57. Belov, G.A., Fogg, M.H. & Ehrenfeld, E. Poliovirus proteins induce membrane association of GTPase ADP-ribosylation factor. J Virol 79, 7207-16 (2005).
58. Fujita, K. et al. Membrane topography of the hydrophobic anchor sequence of poliovirus ЗА and ЗАВ proteins and the functional effect of ЗА/ЗАВ membrane association upon RNA replication. Biochemistry 46, 5185-99 (2007).
59. Kerr, J.F., Wyllie, A.H. & Currie, A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 26, 239-57 (1972).
60. Kumar, S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death Differ 14, 32-43 (2007).
61. Yuan, J., Shaham, S., Ledoux, S., Ellis, H.M. & Horvitz, H.R. The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 beta-converting enzyme. Cell 75, 641-52(1993).
62. Fadok, V.A. et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages. J Immunol 148, 2207-16 (1992).
63. Kluck, R.M., Bossy-Wetzel, E., Green, D.R. & Newmeyer, D.D. The release of cytochrome с from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis. Science 275, 1132-6(1997).
64. Yang, J. et al. Prevention of apoptosis by Bcl-2: release of cytochrome с from mitochondria blocked. Science 275, 1129-32 (1997).
65. Vaseva, A.V. & Moll, U.M. The mitochondrial p53 pathway. Biochim Biophys Acta (2008).
66. Wallach, D., Kang, T.B. & Kovalenko, A. The extrinsic cell death pathway and the elan mortel. Cell Death Differ 15, 1533-41 (2008).
67. Ghobrial, I.M., Witzig, T.E. & Adjei, A.A. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J Clin 55, 178-94 (2005).
68. Kirsch, D.G. et al. Caspase-3-dependent cleavage of Bcl-2 promotes release of cytochrome c. J Biol Chem 274, 21155-61 (1999).
69. Whiteside, T.L. The role of death receptor ligands in shaping tumor microenvironment. Immunol Invest 36, 25-46 (2007).
70. Choi, C. & Benveniste, E.N. Fas ligand/Fas system in the brain: regulator of immune and apoptotic responses. Brain Res Brain Res Rev 44, 65-81 (2004).
71. Zhou, T., Mountz, J.D. & Kimberly, R.P. Immunobiology of tumor necrosis factor receptor superfamily. Immunol Res 26, 323-36 (2002).
72. Schneider, P. & Tschopp, J. Apoptosis induced by death receptors. Pharm Acta Helv 74, 281-6 (2000).
73. Ihnatko, R. & Kubes, M. TNF signaling: early events and phosphorylation. Gen Physiol Biophys 26, 159-67(2007).
74. Wallach, D. et al. Tumor necrosis factor receptor and Fas signaling mechanisms. Annu Rev Immunol17, 331-67(1999).
75. Baud, V. & Karin, M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Cell Biol 11,372-7 (2001).
76. Schutze, S., Tchikov, V. & Schncider-Brachert, W. Regulation of TNFR1 and CD95 signalling by receptor compartmentalization. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 655-62 (2008).
77. Grivennikov, S.I., Kuprash, D.V., Liu, Z.G. & Nedospasov, S.A. Intracellular signals and events activated by cytokines of the tumor necrosis factor superfamily: From simple paradigms to complex mechanisms. Int Rev Cytol 252, 129-61 (2006).
78. Gilmore, T.D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene 25, 6680-4 (2006).
79. Boutros, T., Chevet, E. & Metrakos, P. Mitogen-activated protein (MAP) kinase/MAP kinase phosphatase regulation: roles in cell growth, death, and cancer. Pharmacol Rev 60, 261-310 (2008).
80. Cho, S.G. & Choi, E.J. Apoptotic signaling pathways: caspases and stress-activatcd protein kinases .J Biochem Mol Biol 35, 24-7 (2002).
81. Gloire, G., Charlier, E. & Piette, J. Regulation of CD95/APO-l/Fas-induced apoptosis by protein phosphatases. Biochem Pharmacol 76, 1451-8 (2008).
82. Wajant, H. CD95L/FasL and TRAIL in tumour surveillance and cancer therapy. Cancer Treat Res 130, 141-65 (2006).
83. Charette, S.J., Lambert, H. & Landry, J. A kinase-independent function of Askl in caspase-independent cell death. J Biol Chem 276, 36071-4 (2001).
84. Lee, M.C., Miller, E.A., Goldberg, J., Orci, L. & Scliekman, R. Bi-directional protein transport between the ER and Golgi. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 87-123 (2004).
85. Wickner, W. & Schekman, R. Protein translocation across biological membranes. Science 310, 1452-6(2005).
86. Schekman, R. Merging cultures in the study of membrane traffic. Nat Cell Biol 6, 483-6 (2004).
87. Ross, J.L., Ali, M.Y. & Warshaw, D.M. Cargo transport: molecular motors navigate a complex cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol 20, 41-7 (2008).
88. Hirokawa, N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science 279, 519-26 (1998).
89. Vaughan, K.T. Microtubule plus ends, motors, and traffic of Golgi membranes. Biochim Biophys Acta 1744, 316-24 (2005).
90. Thyberg, J. & Moskalewski, S. Role of microtubules in the organization of the Golgi complex. Exp Cell Res 246, 263-79 (1999).
91. Kamal, A. & Goldstein, L.S. Principles of cargo attachment to cytoplasmic motor proteins. Curr Opin Cell Biol 14, 63-8 (2002).
92. Sannerud, R., Saraste, J. & Goud, B. Retrograde traffic in the biosynthetic-secretory route: pathways and machinery. Curr Opin Cell Biol 15, 438-45 (2003).
93. Burkhardt, J.K. The role of microtubule-based motor proteins in maintaining the structure and function of the Golgi complex. Biochim Biophys Acta 1404, 113-26 (1998).
94. Ho, W.C., Allan, V.J., van Meer, G., Berger, E.G. & Kreis, T.E. Reclustering of scattered Golgi elements occurs along microtubules. Eur J Cell Biol 48, 250-63 (1989).
95. Corthesy-Theulaz, I., Pauloin, A. & Pfeffer, S.R. Cytoplasmic dynein participates in the centrosomal localization of the Golgi complex. J Cell Biol 118, 1333-45 (1992).
96. Presley, J.F. et al. ER-to-Golgi transport visualized in living cells. Nature 389, 81-51997).
97. Burkhardt, J.K., Echeverri, C.J., Nilsson, T. & Vallee, R.B. Overexpression of the dynamitin (p50) subunit of the dynactin complex disrupts dynein-dependent maintenance of membrane organelle distribution. J Cell Biol 139, 469-84 (1997).
98. Dinter, A. & Berger, E.G. Golgi-disturbing agents. Histochem Cell Biol 109, 571-901998).
99. Peyroche, A. et al. Brefeldin A acts to stabilize an abortive ARF-GDP-Sec7 domain protein complex: involvement of specific residues of the Sec7 domain. Mol Cell 3, 275-851999).
100. Niu, T.K., Pfeifer, A.C., Lippincott-Schwartz, J. & Jackson, C.L. Dynamics of GBF1, a Brefeldin A-sensitive Arfl exchange factor at the Golgi. Mol Biol Cell 16, 1213-22 (2005).
101. Cardoso, C. et al. Clinical and molecular basis of classical lissencephaly: Mutations in the LIS1 gene (PAFAH1B1). HumMutat 19, 4-15 (2002).
102. Hirotsune, S. et al. Graded reduction of Pafahlbl (Lisl) activity results in neuronal migration defects and early embryonic lethality. Nat Genet 19, 333-9 (1998).
103. Smith, D.S. et al. Regulation of cytoplasmic dynein behaviour and microtubule organization by mammalian Lisl. Nat Cell Biol 2, 767-75 (2000).
104. Faulkner, N.E. et al. A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function. Nat Cell Biol 2, 784-91 (2000).
105. Vallee, R.B., Tai, C. & Faulkner, N.E. LIS1: cellular function of a disease-causing gene. Trends Cell Biol 11, 155-60 (2001).
106. Sapir, T., Elbaum, M. & Reiner, O. Reduction of microtubule catastrophe events by LIS1, platelet-activating factor acetylhydrolase subunit. EMBOJ16, 6977-84 (1997).
107. Li, S. et al. Cytoplasmic dynein's mitotic spindle pole localization requires a functional anapliase-promoting complex, gamma-tubulin, and NUDF/LIS1 in Aspergillus nidulans. Mol Biol Cell 16, 3591-605 (2005).
108. Li, J., Lee, W.L. & Cooper, J.A. NudEL targets dynein to microtubule ends through LISl. Nat Cell Biol 7, 686-90 (2005).
109. Yingling, J. et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LISl for precise spindle orientation and symmetric division. Cell 132, 474-86 (2008).
110. Yamada, M. et al. LISl and NDEL1 coordinate the plus-end-directed transport of cytoplasmic dynein. EMBOJ 27, 2471-83 (2008).
111. Morris, N.R., Efimov, V.P. & Xiang, X. Nuclear migration, nucleokinesis and lissenccphaly. Trends Cell Biol 8, 467-70 (1998).
112. Kawauchi, T. & Hoshino, M. Molecular pathways regulating cytoskeletal organization and morphological changes in migrating neurons. Dev Neurosci 30, 36-46 (2008).
113. Tanaka, T. et al. Lisl and doublecortin function with dynein to mediate coupling of the nucleus to the centrosome in neuronal migration. J Cell Biol 165,709-21 (2004).
114. Wendler, W.M., Kremmer, E., Forster, R. & Winnacker, E.L. Identification of pirin, a novel highly conserved nuclear protein. J Biol Chem 272, 8482-9 (1997).
115. Zeng, Q. et al. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human pirin. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 59, 1496-8 (2003).
116. Pang, H. et al. Crystal structure of human pirin: an iron-binding nuclear protein and transcription cofactor. J Biol Chem 279, 1491-8 (2004).
117. Dechend, R. et al. The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between NF-kappaB/Rel and nuclear co-regulators. Oncogene 18, 3316-23 (1999).
118. Orzaez, D., de Jong, A.J. & Woltering, E.J. A tomato homologue of the human protein PIRIN is induced during programmed cell death. Plant Mol Biol 46, 459-68 (2001).
119. Adams, M. & Jia, Z. Structural and biochemical analysis reveal pirins to possess quercetinase activity. J Biol Chem 280, 28675-82 (2005).
120. Soo, P.C. et al. Pirin regulates pyruvate catabolism by interacting with the pyruvate dehydrogenase El subunit and modulating pyruvate dehydrogenase activity. J Bacteriol 189, 109-18(2007).
121. Bergman, A.C. et al. Protein kinase-dependent ovcrexpression of the nuclear protein pirin in c-JUN and RAS transformed fibroblasts. Cell Mol Life Sci 55, 467-71 (1999).
122. Slimestad, R., Fossen, T. & Vagen, I.M. Onions: a source of unique dietary flavonoids. J Agric Food Chem 55, 10067-80 (2007).
123. Bischoff, S.C. Quercetin: potentials in the prevention and therapy of disease. Curr Opin ClinNutrMetab Care 11, 733-40 (2008).
124. Murakami, A., Ashida, H. & Terao, J. Multitargetcd cancer prevention by quercetin. Cancer Lett 269, 315-25 (2008).
125. Boots, A.W., Haenen, G.R. & Bast, A. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical. Eur J Pharmacol 585, 325-37 (2008).
126. Terao, J., Kawai, Y. & Murota, K. Vegetable flavonoids and cardiovascular disease. Asia Pac J Clin Nutr 17 SuppI 1, 291-3 (2008).
127. Davis, J.M., Murphy, E.A., McClellan, J.L., Carmichael, M.D. & Gangemi, J.D. Quercetin reduces susceptibility to influenza infection following stressful exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 295, R505-9 (2008).
128. Dimova, S. et al. Safety-assessment of 3-melhoxyquercetin as an antirhinoviral compound for nasal application: effect on ciliary beat frequency. IntJ Pharm 263, 95-103 (2003).
129. Ohnishi, E. & Bannai, H. Quercetin potentiates TNF-induced antiviral activity. Antiviral Res 22,327-31 (1993).
130. Kumazawa, Y., Kawaguchi, K. & Takimoto, H. Immunomodulating effects of flavonoids on acute and chronic inflammatory responses caused by tumor necrosis factor alpha. Curr Pharm Des 12, 4271-9 (2006).
131. Kaul, T.N., Middleton, E., Jr. & Ogra, P.L. Antiviral effect of flavonoids on human viruses. J Med Virol 15, 71-9 (1985).
132. Inoue, M., Hayatsu, H. & Tanooka, H. Concentration effect of bisulfite on the inactivation of transforming activity of DNA. Chem Biol Interact 5, 85-95 (1972).
133. Silva, J.M. et al. Second-generation shRNA libraries covering the mouse and human genomes. Nat Genet 31, 1281-8 (2005).
134. Doedens, J.R. & Kirkegaard, K. Inhibition of cellular protein secretion by poliovirus proteins 2B and 3A. EMBOJU, 894-907 (1995).
135. Arai, H., Koizumi, H., Aoki, J. & Inoue, K. Platelet-activating factor acetylhydrolase (PAF-AH). JBiochem 131, 635-40 (2002).
136. Leventer, R.J., Cardoso, C., Ledbetter, D.H. & Dobyns, W.B. LIS1: from cortical malformation to essential protein of ccllular dynamics. Trends Neurosci 24, 489-92 (2001).
137. Liang, Y. et al. Nudel functions in membrane traffic mainly through association with Lisl and cytoplasmic dynein. J Cell Biol 164, 557-66 (2004).
138. Dujardin, D.L. et al. A role for cytoplasmic dynein and LIS1 in directed cell movement. J Cell Biol 163, 1205-11 (2003).
139. Hirose, H. ct al. Implication of ZW10 in membrane trafficking between the endoplasmic reticulum and Golgi. EMBOJ 23, 1267-78 (2004).
140. Levy, J.R. & Holzbaur, E.L. Cytoplasmic dynein/dynactin function and dysfunction in motor neurons. Int J Dev Neurosci 24, 103-11 (2006).
141. Castrillo, J.L., Vanden Berghe, D. & Carrasco, L. 3-Methylquercetin is a potent and selective inhibitor of poliovirus RNA synthesis. Virology 152, 219-27 (1986).
142. Krippner-Heidenreich, A. et al. Control of receptor-induced signaling complex formation by the kinetics of ligand/receptor interaction. J Biol Chem 277, 44155-63 (2002).
143. Webb, S.D., Sherratt, J.A. & Fish, R.G. Cells behaving badly: a theoretical model for the Fas/FasL system in tumour immunology. Math Biosci 179, 113-29 (2002).
144. Tucker, T.A. & Schwiebert, L.M. CD40 ligation decreases its protein half-life at the cell surface. Eur J Immunol 38, 864-9 (2008).
145. Semler, B. L., and E. Wimmer. 2002. Molecular Biology of Picornaviruses. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
146. Finley, R. L., Jr., and Brent, R. (1995). Interaction trap cloning with yeast. In DNA Cloning 2, Expression Systems: A Practical Approach, B. D. Hames and D. M. Glover, eds. (Oxford: Oxford University Press), pp. 169-203.
-
Кондратова, Анна Анатольевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2009
-
ВАК 03.00.07
- ЦИС-элементы и транс-факторы, принимающие участие во внутренней инициации трансляции РНК полиовируса
- Роль иммунокомпетентных клеток и противовирусных антител в патогенезе экспериментального полиомиелита (типа 2) у мышей
- Цитопатическое действие и апоптоз при полиовирусной инфекции
- Нейроспецифичные детермгаанты З'-концевой части 5'-петранслируемой области вируса полиомиелита
- Влияние полиовирусной инфекции на нуклеоцитоплазматический транспорт
