Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитопатическое действие и апоптоз при полиовирусной инфекции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Цитопатическое действие и апоптоз при полиовирусной инфекции"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

РГБ ОД

Белов Георгий Александрович

ЦИТОПАТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ И АПОПТОЗ ПРИ ПОЛИОВИРУСНОЙ

ИНФЕКЦИИ

03.00.06 — вирусология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

МОСКВА

2000

Работа выполнена в отделе взаимодействия вируса с клеткой НИИ физи химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Член-корреспондент РАН, член-корреспондент РАМН, професс доктор биологических наук В.И. АГОЛ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор II. П. Родионова.

Доктор медицинских наук, профессор А. Д. Альтштейн.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМН.

Защита диссертации состоится <15» ноября 2000 г. в_час. на заседг

Диссертационного Совета Д 053.05.70 при Московском Государства: Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы Г< МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факул! МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «_» октября 2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор химических наук Ю. Ф.Дрыгин

2

р $14-и -1, О

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Пикорнавирусы и, в частности, полиовирус являются возбудителями многих важных заболеваний человека и животных. Этим во многом объясняется пристальный интерес, который уделяют исследователи этой группе вирусов на протяжении долгого времени. В течение последнего десятилетия достигнуты значительные успехи в понимании молекулярно-биологических основ репродукции пикорнавирусов и вызываемых ими изменений физиологических процессов в зараженной клетке. Вместе с тем, до создания полной картины взаимодействия этих вирусов с клеткой еще далеко. Так, относительно недавно было обнаружено, что полиовирусная инфекция может в определенных условиях проявляться не только обычным цитопатическим действием (ЦПД), но и приводить к активации программируемой клеточной смерти - апоптоза. Изучение развития и регуляции этих двух типов гибели клеток, индуцируемых полиовирусной инфекцией, имеет важное значение как с точки зрения патогенеза заболевания, так и с точки зрения общебиологпческих закономерностей. Смерть зараженной клетки от апоптоза или ЦПД имеет разные последствия для организма. При апоптозе остатки погибшей клетки, сохраняющие целостность мембраны, фагоцитируются окружающими клетками; напротив, ЦПД сопровождается лизисом клеток и выходом внутриклеточного содержимого в межклеточное пространство, что приводит к развитию воспалительной реакции и активации иммунного ответа. Следовательно, по крайней мере формально, ЦПД, также как и апоптоз, может рассматриваться как защитная реакция зараженной клетки, направленная в конечном счете на предотвращение распространения вирусной инфекции. Между тем, сам механизм развития изменений, происходящих в клетке при ЦПД, остается во многом неизученным. Исследование индукции и подавления апоптозной программы вирусом полиомиелита, обладающим относительно небольшим геномом, позволяет получить новые данные о регуляции этого процесса, имеющего важнейшее значение для развития и нормального функционирования многоклеточных организмов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данного исследования являлось изучение динамики развития полиовирус-индуцированного апоптоза и ЦПД с точки зрения морфологических и биохимических критериев. Особое внимание было уделено ранним ядерным изменениям, происходящим в зараженных полиовирусом клетках. Ранее в нашей лаборатории было показано, что полиовирусная инфекция в непермиссивных условиях обладает апоптоз-индуцирующим действием, в то же время, нормальное течение инфекции переводит клетку в так называемое анти-апоптозное состояние, при котором индукция апоптоза подавлена. В данной работе была предпринята попытка определить, во-первых, точку перехода между этими состояниями, во-вторых, охарактеризовать процессы, происходящие при полиовирус-индуцированном апоптозе и ЦПД. С этой целью клетки, зараженные полиовирусом в различных условиях, изучали с помощью светового, люминесцентного и электронного микроскопов, кроме того, исследовали действие различных ингибиторов на развитие вирусной инфекции, определяли активацию апоптоз-специфичных протеаз (каспаз), а также деградацию ядерного хроматина. Для изучения влияния на развитие полиовирус-индуцированного апоптоза баланса внутриклеточных про- и анти-апоптозных факторов были получены клетки НеЬа с повышенной экспрессией гена Ьс1-2. Исследование ядерных изменений, происходящих при ЦПД, проводили на клетках НеЬа, экспрессирующих искусственные ядерные белки.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

В настоящей работе показано, что в течение первых 2-2,5 ч после заражение полиовирусом клетки Не1л находятся в про-апоптозном состоянии, причем вероятность развития апоптоза приближается к 100% в конце этого этапа развитш инфекции. Однако реализоваться это состояние может только при услови* подавления дальнейшего размножения вируса. Если же ход инфекции н< прерываеся, то клетки теряют способность к активации апоптозной программы I переходят в анти-апоптозное состояние. Установлено, что в осуществленш полиовирус-индуцированного апоптоза принимают участие так называемые БЕУО специфические каспазы и химотрипсин-подобные протеазы. Впервые показан;

бытрое в течение 1 ч после начала инфекции нарушение ядерно-цитоплазматического транспорта, вызываемого полиовирусной инфекцией.

ПУБЛИКАЦИИ И АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи. Результаты настоящей работы были доложены на X международной конференции «Молекулярная биология пикорнавирусов» 1998г. Йена, (Германия), на международных семинарах по программе INTAS в 1999г в Нимегене, (Нидерланды), и в Пущино в 2000 г, а также на юбилейной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М. П. Чумакова проходившей в 1999 г. В Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова., и на семинарах в этом институте.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста и содержит

традиционные разделы. В диссертации содержится_рисунков. Список литературы

включает _источник.

Использованные сокращения ЦПД- цитопатическое действие. CHI- циклогексимид

DEVD-pNA-Asp-Glu-Val-Asp-яара-нитроанилин

EGFP - enhanced green fluorescent protein, улучшенный зеленый флуоресцентный белок

GFP - green fluorescent protein, зеленый флуоресцентный белок NLS - nuclear localization signal, сигнал ядерной локализации TLCK - ^-тозил-L-Lys хлорметил кетон ТРСК - ЛГ-тозил-L-Phe хлорметил кетон

zVAD-fmk - бензилоксикарбонил-Уа1-А1а-Азр-(ОМе)-фторметилкетон

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Плазмиды и клонирование.

pLPC-bcl2: получена от П. М. Чумакова (Институт Молекулярной Биологии, Москва). Плазмида предназначена для получения рекомбинантного ретровирусногс вектора. Содержит два LTR вируса лейкоза мышей Молони, сигнал упаковки, z также ген устойчивости к пуромицину под контролем левого LTR и ген bcl-2 по,£ контролем промотора цитомегаловируса.

pLPC-puro: из pLPC-bcl2 с помощью BamHI и Xhol был вырезан ген Ьс12, выступающие 5' концы вектора застроены фрагментом Klenow ДНК полимеразы I Е. coli и лигированы ДНК-лигазой фага Т4.

pEGFP-NLS: получена от А. Б. Вартапетяна (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, Москва). Содержит ген EGFP с присоединенной к С-конц> последовательностью NLS большого Т-антигена SV40.

pEGFP-NLS-2xGFPp: также получена от А. Б. Вартапетяна. Содержит 2 дополнительные копии модифицированного GFP, присоединенные с сохранением рамки к С-концу последовательности EGFP-NLS.

Работы по клонированию осуществляли по стандартным методикам с использованием

штамма Е. coli ТОРЮ (Invitrogen).

Вестерн-блоттинг.

после лизиса в присутствии ингибиторов протеаз клетки либо обрабатывала ультразвуком, либо пропускали несколько раз через иглу туберкулинового шприце (Beckton-Dickinson). Измеряли содержание белка по Лоури и, выровняв количестве белка, наносили образцы на гель для денатурирующего белкового фореза. После проведения фореза белки переносили на мембрану PVPF (Amersham-Pharmacia-Biotech). Детекцию белков проводили, используя соответствующие антитела к системы ECL или ECL+ (Amersham-Pharmacia-Biotech).

Определение каспаз.

Для колориметрического определения БЕХ/О-специфической актишюсти в клетках использовали кит Аро-А1еЛ СРР32 (С1оп1есЬ). Рекомбинантные каспазы 3, 7, ]1 8 и специфические колориметрические субстраты для них были предоставлены Ю. Лазебнпком. Для обнаружения ингибирующен активности, эти каспазы добавляли к лизатам из зараженных полиовирусом клеток. Концентрация каспаз соответствовала предварительно определенной линейной области зависимости сигнала от количества фермента. Изменение оптической плотности определяли при 405 нм.

Культура клеток.

Штамм НеЬа 83, названный НеЬа-В, получен путем приспособления исходной культуры НеЬа БЗ к росту на нормальной бычьей сыворотке. Трапсфекция и селекция клеток.

Для получения стабильно-трансформированных клеточных линий использовали 2 метода - метод кальций-фосфатного преципитата и метод заражения ретровирусными векторами. С помощью первого метода получены линии НеЬа/ЕОРР-ЫЬЗ и НеЬа/ЗхОРР-ЫЬЗ, с помощью второго- НсЬа/Ьс12 и НеЬа/риго.

Получение линий НеЬа/ЕОРР-Г^ЬЗ и НеЬа/ЗхОРР->ШЗ: Через 24ч после добавления в ростовую среду к клеткам СаР04-преципитата, содержавшего ДНК плазмид ЕОРР-ЫЬЗ или ЗхОРР-ИЬЗ, производили смену среды. Еще через 24 ч клетки рассевалп в соотношении 1:20 на новые флаконы, и на следующие сутки заменяли среду на селективную, содержавшую 400 мкг/мл С-418. После селекции трансформированных клеток в течение 2х недель устойчивые к антибиотику клоны объединяли и в дальнейшем культивтровали совместно.

Получение линий НеЬа/Ьс1-2 и НеЬа/риго: С номощыо метода СаРОд преципитата плазмидами рЬРС-Ьс12 и рЦРС-риго трансфицировали упаковывающую линию РЬостх-атрЬо. Эта линия, полученная из человеческих клеток 293Т, экспрессирует белки, позволяющие упаковывать в ретровирус-подобные частицы РНК, несущие соответствующие сигналы вируса лейкоза мышей Молони. Через 48 ч

с клеток отбирали ростовую среду, содержавшую такие частицы, и заражали ими культуру HeLa-B. Через 48 ч после заражения клетки высевали на селективную среду, содержавшую 1,5 мкг/мл пуромицина. Через неделю устойчивые клоны объединяли и затем культивировали совместно.

Более подробно методика кальций-фосфатной трансфекции и использования клеток Phoenix описана на сайте:

http://www.stanford.edu/group/nolan/phx_helper_free.html Световая микроскопия.

Клетки окрашивали красителем Hoechst 33342 и фиксировали фиксатором Safe Fix (Curtin Matheson Scientific). Препараты исследовали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Leica DMLS. Для количественной оценки ядерных изменений несколько полей в препарате фотографировали при увеличении 200х, слайды проецировали на экран и считали не менее 800 ядер для каждого образца. Цитоплазматический блеббинг и количество мертвых клеток определяли с помощью светового микроскопа, на суспензии клеток, окрашенных 1% метиленовым синим. Электронная микроскопия.

Клетки, снятые с субстрата, фиксировали последовательно 2,5%-ным глутаровым альдегидом, 1%-ным OSO4 и заключали в EPPON-812. Ультратонкие срезы исследовали с помощью электронных микроскопов Philips СМ 100 или JEM-1200-II. Работы по электронной микроскопии выполнены в Институте микробиологии Унивенситета г. Базеля (Швейцария). Анализ ДНК.

Суспензию клеток обрабатывали 0,5% Тритоном-ХЮО 20 мин при 0 °С. После осаждения ядер и клеточного дебриса супернатант депротеинизировали фенолом с добавлением SDS до конечной концентрации 1%. После переосаждения и обработки РНКазой А ДНК анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

'удьба клетки на ранней стадии инфекции.

Заражение клеток НеЬа полиовирусом в обычных условиях приводит к развитию в течение нескольких часов так называемого цитопатического эффекта. С другой стороны, как было показано ранее в нашей лаборатории, если вирусную инфекцию прервать на ранних стадиях, то в зараженных клетках развивается апоптоз. Чтобы изучить динамику развития вероятности гибели зараженных клеток от апоптоза, через различные интервалы времени после начала нфекции добавляли ингибиторы репродукции вируса и затем, по прошествии пределенного времени, подсчитывали количество апоптозных и неапоптозных ядер.

Результаты, полученные при использовании такого ингибитора репликации олиовируса как гуанидинНО (рис. 1), показывают, что апоптоз развивается в начительной (более 40%) доле клеток, даже если ингибитор был добавлен дновременно с началом инфекции, и, следовательно, репликация вирусной РНК ыла полностью подавлена. Если же ингибитор добавляли не одновременно, а через ,5-2 ч после начала инфекции, то количество апоптозных клеток существенно озрастало (до 70-80% при добавлении ингибитора через 2 ч после начала нфекции). Таким образом, на ранней стадии полиовирусной инфекции интезируются про-апоптозные факторы, причем, до определенного момента, оличество этих факторов увеличивается, и вероятность развития апоптоза в нфицированной клетке повышается.

добавление гуанидина, ч после заражения

•ис. 1 Количество апоптозных ядер ыло подсчитано через 6 ч (—♦—)и ерез 12 ( Д ) ч после заражения

Использованная в вышеописанных опытах концентрация гуанидина не влияла на эффективность трансляции вирусной РНК, однако, стабильность исходных

вирусных матриц в клетке неизвестна, поэтому, чтобы более строго контролировать синтез вирусных про-апоптозных факторов, аналогичные опыты были поставлены с ингибитором трансляции циклогсксимидом. Концентрация циклогексимида 10 мкг/мл обеспечивала -90% ингибнрование синтеза белка, не вызывая при этом апоптотических изменений в неинфицированных клетках г течение периода наблюдения. Размножение вируса при этом былс подавлено более чем в 1000. Если циклогексимид добавляли одновременно с начало!», инфекции, то апоптоз развивался лишь в небольшом числе клеток (рис. 2) даже через 12 часов, если лее вирусную инфекцию не прерывали в течение некоторогс времени, то вероятность развития апоптоза быстро возрастала, так что пр! добавлении циклогексимида через 2 ч после начала инфекции, через 12 част инкубации, апоптоз развивался практически во всех клетках. Сравнение результате! опытов по блокированию размножения вируса циклогексимидом и гуанпдино1> приводит к следующим выводам: а) для накопления вирусных про-апоптознъп факторов необходима трансляция вирусного генома, так как количество анонтозныз клеток при добавлении ингибиторов одновременно с началом инфекции 6ыл< существенно выше в случае гуанидина, чем циклогексимида, б) В начальный перио; вирусной инфекции преимущественно накапливаются нро-апоптозные факторы причем их количество в течение первых 2 ч быстро возрастает.

Переход клеток из про- в анти-апоптозное состояние.

Несмотря на то что, как было описано выше, в начальный период инфекши интенсивно накапливаются нро-апоптозные факторы, продуктивная инфекция клето НеЬа полиовирусом приводит к развитию ЦПД, а не апоптоза. Чтобы определит

добавление CHI, ч после заражения

Рис. 2 Количество апоптозных ядер было подсчитано через 6 ч ( $ )и через 12 (—В—) ч после заражения

очку, в которой происходит переключение между двумя путями гибели клетки, зучалн эффект добавления цнклогекспмида (10 мкг мл) на более поздних сроках нфекшюнного цикла. Как видно на рис. 3 с, добавление цнклогекспмнда

ис. 3 Окраска ядер красителем Hoechst 33342 после инкубации в течение 8 ч. [>

сазывают на ядра с признаками ЦПД, указывают на апонтозныс ядра, а) инкубация в )нсутствии 10 мкг мл CHI, Ь) продуктивная полиовирусиая инфекция, с) CHI (10 <г. мл) добавлен через 1,5 ч после заражения, d) CHI (10 мкг мл) добавлен через 2ч юле заражения, е) CHI (10 мкг/ мл) добавлен через 2,5 ч после заражения, f) CHI Омкг мл) добавлен через 3 ч после заражения

?рез 1,5 ч после начала инфекции приводило к развитию через 8 ч в большинстве четок типичной ядерной картины аноптоза с конденсацией п фрагментацией

ядерного хроматина. В препаратах, где ингибитор был добавлен через 1,5 ч практически не встречалось ядер, обладающих признаками ЦПД, тогда как есл1 циклогексимид добавляли через 2 ч (рис. 3 с1), таких ядер становилось несколью больше. При добавлении ингибитора через 2,5 ч (рис. 3 е) резко уменьшалос) количество типичных апоптозных ядер и, соответственно, возрастало количестве ядер с признаками ЦПД. В образцах же, где инфекция была прервана через 3 > после начала (рис. 3 О, почти все ядра имели признаки, характерные для ЦПД.

Препараты, описанные в предыдущем разделе, были исследованы и ( помощью электронного микроскопа. Когда циклогексимид добавляли через 1,5 ■ после начала инфекции, в большинстве ядер хроматин был сконденсирован ( фрагментирован на округлые тельца, потерявшие связь < ядерной мембраной, что характерно для апоптоза Продление инфекции на 0,5 ч приводило к появлению 1 препаратах клеток как с признаками апоптоза, так и ЦПД Для ЦПД характерно смещение сильно деформированной ядра к периферии клетки, частичная конденсат» хроматина, сохраняющего, тем не менее, связь с ядерно! мембраной, и увеличение перинуклеарного пространства Если же вирус размножался в течение 3 ч, то практическ! все клетки в препарате обладали типичным наборо> признаков ЦПД и были неотличимы от клеток, в которы? инфекция шла в течение б ч.

Характерной чертой развития апоптоза являете} деградация ядерной ДНК до олигонуклеосомньи фрагментов. Изучение такой деградации а препаратах, I которым циклогексимид добавляли через различны« интервалы времени после заражения, позволило наглядне показать прерывание развития апоптознон программы через 2,5 ч после начал; инфекции (рис. 4). В пробах, к которым циклогексимид добавляли через 1,5 или 2 1 после начала инфекции, через 6ч инкубации наблюдалась характерная для апоптоз;

CHI, время добавления после заражения, ч

Рис. 4 Деградация ядерной ДНК. Клетки инкубировали в теч. 6 ч после заражения. Время добавления CHI указано над

дорожками.

(еградация клеточной ДНК. Если же ингибитор добавляли через 2,5 ч, то через 6ч 1еградации ДНК обнаружить не удавалось.

Другой подход к изучению перехода между про- и антн-апоптозным остоянием в зараженной иолиовирусом культуре состоял в наблюдении за развитием .поптоза, вызываемого ингибитором протеинкиназ стауроспорином. В концентрации гпМ это вещество обладает свойством вызывать апоптоз и подавляющем количестве :леток НеЬа через 4 ч инкубации. Если стауроспорин добавляли за 2 ч до начала шфекции и фиксировали клетки через 2 ч после заражения вирусом, то, как и [редполагалось, экспрессия антн-апоптозных факторов оказалась недостаточной для [редотвращення апоптоза, если же ингибитор добавляли за 1 ч до начала ннфекиип [ затем давали вирусу размножаться в течение 3 ч, то есть время инкубации со тауроспорином составляло те же 4 ч, то развитие апоптоза было существенно вдавлено. Следует подчеркнуть, что размножение вируса было одинаковым, :езависимо от срока добавления стауроспорина, хотя и существенно меньшим, чем ;рп заражении необработанной ингибитором культуры.

Результаты описанных выше опытов приводят к выводу, что в середине нфекционного цикла (в промежутке между 2-3 ч после начала инфекции) в клетках 1еЬа в результате размножения вируса происходит существенное изменение баланса ро- и анти-апоптозных факторов, приводящее к прерыванию развития апоптозной рограммы, смене потенциального типа смерти клеток с апоптоза на ЦПД и переходу леток из про- в анти-апоптозное состояние.

Синетика развития ЦПД.

Изучение препаратов зараженных клеток, находящихся в точке перехода [ежду про- и анти-апоптозным состоянием, (2-3 ч после начала инфекции) показало, то в это время в ядрах практически невозможно заметить какие-либо изменения как ри световой, так и при электронной микроскопии. Незначительные изменения юрмы начинают проявляться в некоторых ядрах лишь к концу 3-го часа инфекции. I концу четвертого часа деформация становится хорошо заметна в большинстве дер, а к концу 5 часа в препарате появляются типичные для развившегося ЦПД есяцеобразные ядра, в это же время заканчивается и округление клеток,

начинающееся к концу 4 часа инфекции. Полное развитие ЦПД в клетках НеЬа занимает около 8 ч. Таким образом, выбор между двумя разными механизмами гибели происходит в клетках, которые на морфологическом уровне еше практически неотличимы от незараженной культуры, а развитие как апоптоза, так и ЦПД требуег

дальнейших биохимических реакций, занимающих несколько часов (рис. 5).

- реализация

активация программы гибели г

г г программы

1111

добавление ингибиторов Рис.5 Схема изменения типа смерти клетки при развитии полиовирусной инфекции.

НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИОВИРУС-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА И ЦПД

Апоптоз. Каспазы.

Одной из наиболее характерных черт апоптоза, вызываемого практически любыми индукторами, является активация особых цистеиновых протеаз - каспаз. Не оказался исключением и апоптоз, возникающий при абортивной инфекции полиовирусо>: клеток НеЬа. Это было доказано тем, что гУАО^шк, специфический ингибнтор каспаз широкого действия, проникающий в живые клетки, предотвращал развитие апоптоза, вызываемого заражением клеток НеЬа полиовирусом в присутствие гуанидина. В то же время, гУАО-Гшк, не нарушал развития пермиссивной инфекции не влияя ни на ранние морфологические изменения в ядрах, ни на общук продукцию вируса. Следует, однако, отметить, что развитие некоторых характерные для ЦПД ядерных изменений в присутствии гУАИ^тк несколько отставалс (примерно на 1 ч) от появления таковых в отсутствии ингибитора.

Для более точного определения типа каспаз, активирующихся при полиовирус индуцированном апоптозе, использовали специфические хромогенные субстраты.

Клетки НеЬа заражали полновнрусом и добавляли

циклогексимнд через 1,5 2 и 3 ч после начала инфекции. В экстрактах, полученных после инкубации клеток в течение 4 и 6 ч после начала ннфекцин, обнаружили активность,

расщепляющую Ас-ПЕУБ-рМА

(субстрат для каспаз 3 н 7) (рис. 6). Присутствие в экстракте гУАО-йпк полностью подавляло ЭЕУО-специфнческнй сигнал.

Добавление цнклогексимида к клеткам через 3 ч после начала инфекции не предотвращало развития ЦПД. Изучение лизатов из таких клеток также показало наличие Ас-БЕУВ-рМА расщепляющей активности. Ее уровень варьировал в разных экспериментах, но всегда был ниже соответствующего уровня в тех образцах, где развивался апоптоз.

Еще более низкий, но все же отличный от фонового уровень 0Е\'0-специфического сигнала был обнаружен в зараженных клетках при продуктивной инфекции. Однако, из-за ограничений, присущих самому методу, в настоящее время мы не можем определить, действительно ли есть некоторая активация каспаз во всех зараженных клетках, либо это отражение наличия небольшого количества апоптозных клеток в зараженной культуре.

Поиск ингибиторов каспаз в зараженной культуре.

Существенно более низкий уровень БЕУБ-специфической активности в зараженных клетках в пермнсснвных условиях мог, по крайней мере, отчасти, объясняться тем, что при полновнруснон инфекции вырабатываются ингибнтор(ы) каспаз. Чтобы проверить эту гипотезу, экстракты, полученные из зараженных клеток через 2, 4, и 6 ч после начала инфекции (в качестве контроля использовали лизат нз

0 2 4 5 8

время после заражения, ч

Рис. 6 DEVD-специфическая активность в клетках HeLa при полиовирусном апоптозе и ЦПД. Условные единицы представляют собой разность удельной активности лизатов (нМ DEVD-pNA/мкг белка) в отсутствии и присутствии zVAD-fmk. Ц CHI добавлен через 2 ч после заражения; □ CHI добавлен через 3 ч после заражения; © продуктивная инфекция; О контрольные клетки

незараженных клеток), добавляли либо к очищенным рекомбинантным каспазам 3, 7 или 8, либо к экстракту из клеток, в которых развивался апоптоз, вызванный прерыванием полиовнрусной инфекции циклогексимндом через 2 ч после начала. Концентрации экзогенных каспаз и количество лизата из апоптозных клеток соответствовало линейной области зависимости сигнала от количества ферментов. В пределах чувствительности метода какого-либо подавления активности каспаз обнаружено не было. Это говорит о том, что прерывание выполнения апоптозной программы полиовирусом происходит на стадии, предшествующей активации, по крайней мере проверенных каспаз. Нельзя исключить, что на ранних этапах полновируснои инфекции индуцируется появление ингибиторов других инициаторных каспаз, которые не были проверены в данном опыте.

Сериновые протеазы.

Нам удалось показать, что в развитии завершающих стадии полновирус-индуцированного апоптоза принимают участие и сериновые протеазы. Так, абортивная инфекция клеток НеЬа полиовирусом в присутствии гидрохлорида гуанидина, приводит, как уже было описано, к развитию типичного апоптоза. Если же к инфицированным клеткам добавляли, помимо гуанидина, ингибитор химотрипсин-подобных протеаз ТРСК, в концентрациях 5 либо 10 мкг/мл, что само по себе не является токсичным для клеток и практически не влияет на выход вируса, то в развитии апоптоза были обнаружены следующие отличня: при обеих концентрациях ингибитора в большинстве ядер не происходила фрагментация ядерного хроматина на отдельные круглые тельца, напротив, конденсированный хроматин обычно представлял собой цельное образование. Кроме того, ТРСК либо полностью предотвращал деградацию ядерной ДНК до олпгонуклеосомных фрагментов, либо, при более низкой концентрации, на форезе можно было видеть некоторое количество ДНК, деградировавшей до относительно высокомолекулярных фрагментов (рис. 7).

В то же время, количество клеток, содержащих ядра с конденсированным хроматином, практически не менялось при добавлении этого ингибитора, также он не оказал и заметного влияния на развитие такой характерного морфологического проявления апоптоза как цитоплазматическнй блеббииг.

Добавление к инфицированным клеткам помимо гидрохлорида гуанидина и ТРСК также и специфического ингибитора каспаз широкого спектра действия полностью подавляло какие-либо проявления апоптоза, что позволило сделать вывод о том, что сериновая протеаза(ы), являющаяся мишенью действия ТРСК, начинает действовать после активации каспаз.

Влияние баланса клеточных про и анти-апоптозных факторов на развитие полиовирус-индуцированного апоптоза.

Ранее было показано, что повышенная экспрессия онкогена Ьс1-2 эффективно подавляет развитие апоптоза, вызываемого некоторыми РНК-содержащимн вирусами. Для того, чтобы изучить влияние Ьс!-2 на апоптоз, вызываемый абортивной полиовнрусной инфекцией, мы получили штамм клеток НеЬа-В с повышенной экспрессией Ьс1-2 (НеЬа-Ьс12). Оказалось, что и апоптоз, вызываемый полиовнрусной инфекцией в непермиссивиых условиях в присутствии циклогексимида развивался в клетках линии НеЬа-Ьс12 гораздо медленней чем в клетках контрольной культуры. Следует особо отметить, что задержка апоптоза не приводила к развитию ЦПД в инфицированных клетках, как можно было бы ожидать, если бы выбор между апоптозом и ЦПД был обусловлен лишь относительной скоростью развития этих процессов. Инкубация клеток НеЬа-Ьс12, зараженных полиовирусом в присутствии циклогексимида в течение 24 ч приводила к их гибели от апоптоза. Таким образом, опыты с культурой, обладающей

ТРСК(мкг/мл)

Рис.7 Подавление деградации ядерной ДНК в присутствии ТРСК. Зараженные полиовирусом клетки инкубировали в течение 10 ч в присутствии гуанидина (100 мкг/ мл) и ТРСК (концентрация указана над дорожками)_

повышенной экспрессией гена Ьс1-2, еще раз подтверждают, что в начале инфекционного цикла клетки находятся в про-апоптозном состоянии и что для развития в них ЦПД необходимо нормальное течение инфекции.

ЦПД

Ядерно-цчтоплазматический транспорт.

Энтеровирусы вызывают нарушения в ядсрно-цнтоплазматическом транспорте.

Нам удалось показать, что уже на самых ранних этапах размножения вируса (пе позже, чем через 1 ч после заражения) в клетке происходят существенные нарушения системы импорта и удержания в ядре белков, имеющих так называемый классический сигнал ядерной локализации.

Для того, чтобы изучать влияние полновпруснои инфекции на ядерпо-цитоплазматичеекпй транспорт, были получены клетки, экснресспрующпе ЕОРР-МЬБ, искусственный ядерный белок, состоящий из ЕОРР, с присоединенным к С-концу сигналом ядерной локализации большого Т-антигена БУ-ДО. В подавляющем болыннстве таких клеток зеленая флуоресценция была локализована в ядрах. Если такую культуру заражали полповирусом, с разной множественностью, от 10 до 100 БОЕ/клетку, то после 1 ч инкубации в значительной доле клеток флуоресценция была видна пе только в ядре, по и в цитоплазме, в то время, как в контрольной культуре никакого перераспределения флуоресценции не было (рис. 8 а.Ь,с).

контроль ЮБОЕ/клетка ЮОБОЕ/клетка

Рис.8 Линии НеЬа/ЕОРР-МЬЗ и НсЬа/ЗхОРР-ЫЬЗ заражали полиовирусом с чножествениостыо 10 БОЕ/клетка (В и Е) и 100 БОЕ/клетка (С и Р) и инкубировали в течение 1 часа. Контрольные клетки обрабатывали так же, как и заражаемые, но без гобавлсния вируса.

Молекулярный вес ЕОРР-МЬЗ составляет примерно 31,4 кБа, в то же время, известно, что верхний предел массы белковых молекул, способных к пассивной шффузни через ядерные поры, лежит в границах 50-60 КБа. Чтобы выяснить, чожет ли полиовирусная инфекция вызвать выход из ядра белков, превышающих этот размер, была создана конструкция (рЕСРР-МЬ5-2хСРРр), в которой к С-концу юследовательностн ЕСРР-1^ЬЗ были присоединены с сохранением рамки 2 гена ЗРРр, так что белковый продукт (ЗОРР-Ш.З) этой рамки считывания имел массу жоло 90 кБа. Была получена линия НеЕа/ЗОРР-МЬЗ, стабильно [■расформированная этой конструкцией. В этом случае ядерная локализация шленого белка была еще более строгой, чем п случае ЕОРР-КЕБ. Заражение такой

культуры полиовирусом с высокой множественностью (100 БОЕ/клетка) приводило к такому же быстрому, через 1 ч инкубации после начала инфекции, как и для культуры HeLa/EGFP-NLS, появлению зеленой флуоресценции в цитоплазме (рис.8 F). Если же использовали низкую множественность (10 БОЕ/клетка), то появление флуоресценции в цитоплазме было более замедленным, и в большинстве клеток четко определялось через 2 ч после начала инфекции, хотя в некотором количестве клеток это явление было четко заметно и через 1 ч после начала инкубации (рис. 8 D).

Аналогичные опыты по заражению линий HeLa/EGFP-NLS и HeLa/3GFP-NLS были проведены и с другим представителем энтеровирусов, вирусом Коксаки ВЗ. Его влияние на выход ядерных белков в цитоплазму было такими же, как и у полиовируса.

Появление ядерных белков в цитоплазме не связано с их деградацией.

Можно было бы предположить, что причиной выхода использованных нами производных EGFP в цитоплазму является их протеолитическая деградация, вызываемая полиовирусной инфекцией. Однако, анализ этих белков из зараженных и контрольных клеток в Western блоте, показал отсутствие признаков протеолиза, как в случае заражения полиовирусом, так и вирусом Коксаки ВЗ.

Таким образом, можно сделать вывод, что уже в первые часы после начала инфекции ядро зараженной клетки претерпевает существенные структурные изменения. В нем либо изменяются свойства ядерных пор так, что они становятся способны свободно пропускать молекулы в полтора раза большие, чем при обычных условиях, либо в ядерной оболочке появляются какие-то другие повреждения, позволяющие выходить таким молекулам из ядра. Другое возможное объяснение, заключающееся в том, что полиовирусная инфекция блокирует активный импорт через ядерные поры, а флуоресцентный материал, видимый в цитоплазме зараженных клеток, это вновь синтезированные белки, не попавшие в ядро, кажется маловероятным, так как, во-первых, полиовирусная инфекция вызывает быстрое v глубокое угнетение трансляции и транскрипции клеточных РНК, а во-вторых, в это!»

лучае вряд ли бы можно было наблюдать разницу в скорости появления зеленого вечения в цитоплазме зараженных с низкой множественностью клеток, кспрессирующих ЕОРР-МЬЗ и ЗхСРР-ЫЬБ, так как оба этих гена заклонированы в динаковый вектор с одинаковым промотором.

Тем не менее, этот вопрос, конечно, нуждается в более прямом исследовании.

Влияние циклогексимида, гидрохлорида гуанидина и г-УАЛ-йпк на выход дерных белков при полиовирусной инфекции.

Начало полиовирусной инфекции условно можно разделить на три этапа: . адсорбция и взаимодействие вируса с клеточными рецепторами, . трансляция родительской РНК, . начало репликации вирусных геномов.

тобы выяснить, какая из этих стадий отвечает за индукцию обнаруженных арушений ядерно-цитоплазматического транспорта, мы исследовали влияние на этот роцесс некоторых ингибиторов.

идрохлорид гуанидина в концентрации 100 мкг/мл является очень сильным нгибитором репликации полиовируса, не оказывая при этом заметного влияния на етаболизм клетки. Однако, присутствие этого вещества заметно не влияло на эявление в цитоплазме ядерных производных ЕОРР при инфекции как клеток е1д/ЕСРР-МЬЗ, так и НеЬа/ЗОРР-МЬЗ. Таким образом, репликация вирусной НК в этих условиях оказалась не нужна для появления ядерных изменений (рис. 9 ). В, С и й, Н).

вирус+ вирус+ вирус+

гуанидин-НСХ гУАО-йпк СНШУАО-Ттк

Рис.9 Линии НеЬа/ЕОРР-МЕБ и НсЕа/ЗхОРР-МЬЗ заражали нолиовирусом множественностью 500 БОЕ.клетку и инкубировали в течение 1 часа в нрнсутстви; ингибиторов (где указано). Контрольные клетки обрабатывали как и заражаемые, но бе добапления вируса.

Чтобы подавить трансляцию, использовали циклогексимид в концентрации 101 мкг/мл. Такая концентрация этого ингибитора не только эффективно подавляе трансляцию, но и вызывает в клетках ИсЬа быстрый и массовый апоитоз. Для того чтобы избежать наложения этих двух эффектов, действие циклогексимида изучали присутствии 100 мкМ хУАБ-Гшк. Следует отмстить, что сам гУАО-£тк, как : гуанидин-НС1 не оказывал влияния на выход ЕОРР^ЬБ и ЗхОРР-Ь1Ь8 в цитоплазм (рис. 9 ср. В, Б и О, I), что позволяет считать маловероятным участие каспаз в это] процессе. Комбинация же циклогексимида и г-УАБ-1шк полностью предотвращал появление в цитоплазме зараженных клеток флуоресцирующего материала (рис. ср. А, Е и Р, Л). Эти данные позволяют сделать следующие выводы: а) несмотря н то, что изменения в состоянии ядра регистрируются очень быстро после начал инфекции, взаимодействия вирусных частиц с рецепторами клетки недостаточно дл

их индукции; 6) для запуска ранних ядерных изменений необходима трансляция попавшей в клетку вирусной РНК.

Вирус везикулярного стоматита также вызывает ранний выход в цитоплазму ЕОРР^Ьв, но не ЭхОРР^ЬБ.

Чтобы узнать, не является ли обнаруженный нами феномен общим для развития инфекции разных групп вирусов, клетки НеЬа/ЕОРР-МЬЗ и Не1_а ЛЗОРР-^ЬБ заражали вирусом везикулярного стоматита, представителем семейства К11аЬс]оут(1ае, обладающим негативным РНК-геномом. Оказалось, что этот вирус гоже способен индуцировать выход ЕОРР-ЫЪБ из ядер зараженных клеток до юявления признаков ЦПД, различимых с помощью флуоресцентного микроскопа. Вместе с тем, процесс этот развивается более медленно, чем в случае полиовнрусной шфекции. Так, уверенно констатировать появление флуоресцентного материала в штоплазме большинства зараженных клеток при вносимой множественности шфекции 60 БОЕ/клетку можно было лишь через 2 ч после начала инфекции, (роме того, нам не удалось документировать выход ЗхОРР-ЫЬБ из ядер, не [меющих видимых признаков ЦПД. Во всех случаях, когда зеленая флуоресценция юявлялась в цитоплазме этих клеток, их ядра содержали уже сильно :онденсированный хроматин. Следует подчеркнуть, что и при инфекции вирусом езикулярного стоматита, протеолитической деградации ни БОБР-ЬИ-Б, ни ЗхОРР-ГЬБ не происходило.

Несмотря на явные отличия, сам факт того, что при инфекции такими разными вирусами имеет место сходство в нарушении локализации ядерных белков (для клеток НеЬа/ЕОРР-МЬБ), говорит о том что, возможно, изменения ядерно-итоплазматического транспорта являются частью какого-то общего механизма ответа клетки на вирусную инфекцию.

ВЫВОДЫ:

1) Установлено, что в течение первых 2-2,5 ч после заражения полиовирусо клетках НеЬа происходит запуск апоптозной программы, в осуществле которой принимают участие ОЕУВ-специфические каспазы и химотриш подобные протеазы.

2) Дальнейшее развитие инфекции прерывает выполнение апоптозной ирограм переводит клетки в антиапоптозное состояние и приводит к их гибели от ЦПД

3) При энтеровирусной инфекции обнаружен ранний выход в цитоплазму ядер белков массой по крайней мере до 90 К Да, не связанный с утратой сип ядерной локализации. Продемонстрирован выход ядерного белка массой 30 ] при инфекции клеток НеЬа вирусом везикулярного стоматита.

4) Высказано предположение, что обнаруженные ранние ядерные измене являются частью неизвестного общего ответа клетки на вирусную инфекцию.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю благодарность моему научному руководителю, профессору В Аголу за возможность пройти настоящую научную школу. Я глубоко признак также Л. И. Романовой, Е. А. Тольской и М. С. Колесниковой, в сотрудничест которыми были выполнены исследования по полиовирус-индуцированному апош Не могу не отметить огромную помощь, которую оказали нам Курт Бинц и Д Эггер из Базельского Института Микробиологии. Изучение влияния полиовиру! инфекции на ядерно-цитоплазматический транспорт было бы невозмоможно сотрудничества с группой под руководством А. Б. Вартапетяна. Особенно хоч отметить вклад А. Г. Евстафьевой и Ю. П. Рубцова.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

.. Agol V. I., Belov G. A., Bienz К., Egger D., Kolesnikova M. S., Raikhlin N. Т., Romanova L. I., Smirnova E. A., Tolskaya E. A. (1998). Two types of death of poliovirus-infected cells: caspase involvement in the apoptosis but not cvtopathic effect. Virology 252, 343-353.

!. Agol V.I., Belov G.A., Bienz K., Egger D., Kolesnikova M.S., Romanova L.I., Sladkova L.V., and Tolskaya E.A. (2000) Competing Death Programs in Poliovirus-infected Cells: Commitment Switch in the Mid of Infectious Cycle. J.Virol., 74, 5534-5541.

!. Belov, G.A., Evstafieva A.G., Rubtsov Yu.P., Mikitas O.V., Vartapetian А.В., and Agol V.I. (2000) Early Alteration of Nucleocytoplasmic Traffic Induced by Some RNA Viruses. Virology v. 275 pp 244-248

L Belov G.A., Romanova L.I.., Tolskaya E.A., Kolesnikova M. S., Egger D., Bienz K., Agol V.I. Apoptosis induced in Hela cells by non-permissiv poliovirus infection is caspase-dependent and sensitive to TPCK, an inhibitor of chymotrypsine-like proteases. Xth Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Jena, Germany, 5-11 September, 1998., Pit.

i. А. Белов, К. Bienz, D. Egger, Л. И. Романова, Л. В. Сладкова, М. С. Колесникова, Е. А. Тольская, В. И. Агол. ЦПД и апоптоз при полиовнрусной инфекции. Научная конференция "Актуальные проблемы медицинской вирусологии", посвященная 90-летию со дня рождения М. П. Чумакова, ноябрь 1999 г. стр. 78.