Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Природа спонтанного синтеза РНК QB репликазой

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Природа спонтанного синтеза РНК QB репликазой"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

На правах рукописи УДК 547.963.3

ЧЕТВЕРИНА Елена Владимировна

ПРИРОДА СПОНТАННОГО СИНТЕЗА РНК ОР РЕПЛИКАЗОЙ

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

РГБ ОД

Биологическим факультет

Работа выполнена в Институте белка РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, академик А.С.СПИРИН

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, член-корреспондент РАН А.А.КРАЕВСКИЙ доктор биологических наук С.Ю.МОРОЗОВ

Ведущая организация:

Кардиологический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится "¿?/ " ёх^п^с ¿7ДА 1994 г. в Я час Зймин на заседании Специализированного ученого совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "(У "¿/ьа1994 г.

/

Ученый секретарь

Специализированного совета , .' /

кандидат химических наук ' В.Н.Каграманов

ОБ1ДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Qß репликаза - единственная РНК-зависимая РНК полимераза, которую можно выделить в чистом виде и в больших количествах без потери активности и которая способна эффективно синтезировать РНК вне клетки. Помимо геномной РНК фага Qß, Qß репликаза способна размножать in vitro много разных малых РНК - RQ РНК (от "Replicated by Qß replicase"). Синтез этих РНК, так же как и Qß РНК, происходит экспоненциально при молярном избытке Qß репликазы и приводит к образованию однонитевых (+) и (-) цепей в приблизительно равных количествах.

Происхождение RQ РНК не было известно. RQ РНК "спонтанно" (то есть, в отсутствие добавленной матрицы) синтезируются в инкубационной смеси, содержащей очищенную Qß репликазу и субстраты - ATP, GTP, СТР и UTP. Это наблюдение дало основание для концепции "de novo синтеза", постулирующей, что реплицирующиеся матрицы способны возникать путем случайной полимеризации нуклеотидов за время инкубации (в пределах нескольких часов) и что их образование в пробирке является, таким образом, моделью быстрого самозарождения жизни. С другой стороны, тот факт, что нуклеотидные последовательности некоторых из спонтанно синтезированных RQ РНК обладают значительной гомологией с геномом Qß фага, дал основание для "гипотезы вариантов", согласно которой RQ РНК являются делеционными вариантами Qß РНК, образующимися в инфицированных клетках за счет ошибок репликации и попадающими в реакционную смесь in vitro в виде примесей в препарате Qß репликазы.

Изучение природы спонтанного синтеза важно для выяснения такого важного вопроса биологии как самозарождение жизни, а также для понимания механизма фаговой инфекции, поскольку RQ РНК были обнаружены в клетках Escherichia coli, зараженных фагом Qß. Было неизвестно, возникают ли эти РНК в зараженной клетке каждый раз заново или способны передаваться от клетки к клетке и играют ли они какую-либо роль в развитии инфекционного процесса.

Вопрос о природе спонтанного синтеза РНК имеет и важный пракгичзский аспект. Со времени открытия Qß репликазы исследователи стреышись использовать ее уникальную способность к эффективному синтезу РНК in vitro для размножения мРНК и для высокочувствительной диагностики. Был найден способ преодоления матричной специфичности Qß репликазы -путем встраивания чужеродной последовательности в эффективно

реплицирующиеся РНК. Однако все попытки использования Qp репликазы в практических целях заканчивались неудачей, так как спонтанно синтезирумые РНК всегда размножались лучше, чем добавленные рекомбинантные матрицы. Если верна гипотеза de novo синтеза, то от спонтанного синтеза РНК невозможно освободиться в принципе и, следовательно, невозможно практическое использование Qp репликазы.

Цель исследования. Целью данной работы было выяснение причин спонтанного синтеза РНК, обнаружение источника RQ РНК и исследование возможных функций этих РНК.

Задачи исследования. В работе решались следующие задачи:

(1) Получить препарат Qp репликазы, свободный от примесей RQ РНК.

(2) Сравнить первичные структуры спонтанно синтезированных RQ РНК со структурами известных нуклеотидных последовательностей.

(3) Сравнить первичные структуры RQ РНК, спонтанно синтезированных в различных лабораториях.

(4) Выяснить, содержатся ли RQ РНК в препаратах Qp фага.

(5) Создать метод подсчета числа активных молекул RQ РНК путем выращивания молекулярных колоний в иммобилизованных средах.

(6) Выяснить, влияет ли RQ120 РНК, комплементарная Qp РНК, на ее репликацию и трансляцию.

Научная новизна работы. Исследование природы спонтанного синтеза РНК Qp репликазой позволило установить, что неверна ни одна из выдвинутых прежде гипотез о его происхождении. Обнаружено, что вопреки гипотезе de novo синтеза "спонтанный" синтез РНК направляется матрицами. Выяснено, что вопреки гипотезе вариантов не все RQ РНК происходят or Qp РНК, а эффективность репликации RQ РНК не зависит от на!ичия фагоспецифических последовательностей. Установлено, что RQ РНК являются природными сателлитами Qp фага. Выяснено, что спонтанный синтез вызывается RQ РНК, попадающими в реакционную смесь из воздуха. Обнаружено, что RQ РНК могут подавлять репликацию и трансляцию геномной РНК фага Qp по антисмысловому механизму. Создан метод клонирования РНК in vitro путем выращивания молекулярных колоний в иммобилизованной среде.

Практическое значение работы. Установление причин спонтанного синтеза РНК in vitro позволило предложить способы его преодоления, что

делает возможным практическое использование Qp репликазы для эффективного размножения заданных РНК. Предложенная техника молекулярных колоний может быть использована в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и медицины для клонирования нуклеиновых кислот in vitro и обнаружения (диагностики) единичных молекул нуклеиновых кислот в анализируемых образцах.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международных конференциях "Frontiers in Bioprocessing II" (Боулдер, Колорадо, США, 1990) и "Genetic Recombination and Defective Interfering Particles in RNA Viruses" (Мадрид, Испания, 1994), на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994). Диссертация апробирована на заседании кафедры молекулярной биологии МГУ (Москва, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и поданы заявки на получение российского и американского патентов.

Структура диссертации. Диссертация включает введение и четыре основные части: обзор литературы "Матрице-зависимый и спонтанный синтез РНК Ор репликазой", "Методы", "Результаты экспериментов", "Обсуждение результатов". Диссертация завершается выводами и списком литературы (186 ссылок). Работа изложена на 171 страницах машинописного текста и иллюстрирована 33 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Препараты Ор репликазы не содержат примесей активных ИО РНК

Стандартный способ очистки 0(5 репликазы включает 3 хроматографии на ионообменных колонках (с ДЭАЭ-целлюлозой, фосфоцеллюлозой и ДЭАЭ-сефадексом), при каждой из которых 0(5 репликаза хорошо отделяется как от РНК, так и от рибонуклеопротеидных комплексов. Проведенные нами эксперименты показали, что препараты Ор репликазы, полученные таким способом, не содержат примесей активных ЯО РНК. Этот вывод основан на следующих результатах.

(1) Все попытки освободить препарат Ор репликазы от вероятных примесей ВО РНК не привели к увеличению лаг-периода спонтанного синтеза. Вопреки тому, что сообщалось ранее, удаление РНК-связывающего белка

из препарата Qß репликазы с помощью хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой при суб-денатурирующих концентрациях (2 М) мочевины не не уменьшило интенсивность спонтанного синтеза РНК. (Qß репликаза, лишенная белка S1, почти так же эффективно реплицирует RQ РНК, как и интактный фермент, состоящий из субъединицы фагового происхождения и трех клеточных белков: рибосомного белка S1 и факторов элонгации EF-Tu, EFTS.)

(2) Набор продуктов спонтанного синтеза, полученных с использованием одного и того же препарата фермента, не воспроизводился. Мы обратили внимание на то, что набор спонтанно синтезируемых RQ РНК зависел не от того, какой препарат Qß репликазы использовался в эксперименте, а от того, с какими RQ РНК в это время работали в данном помещении.

(3) Спонтанный синтез в первом эксперименте (до этого работы с RQ РНК в нашей группе не проводились) не наблюдался в течение 4 часов, что значительно больше, чем время, необходимое для синтеза детектируемых количеств RQ РНК, начиная с единственной активной молекулы.

Эти наблюдения дали основания для предположения, что причиной спонтанного синтеза были не примеси РНК в препарате Qß репликазы, а какой-то наружный источник RQ РНК.

2. Синтез RQ РНК направляется матрицами

Было секвенировано четыре вида RQ РНК, спонтанно появлявшихся в виде мажорных компонентов в наших экспериментах: RQ87, RQ120, RQ135, RQ223 (число в наименовании РНК обозначает длину ее последовательности в нуклеотцдах). Определение первичной структуры RQ120 и RQ135 РНК подробно описано в диссертационной работе А.В.Мунишкина, выполненной в нашей группе. Оказалось, что эти RQ РНК гомологичны другим РНК, встречающимся в клетках Е. coli. RQ120 РНК содержит участок длиной 80 нт, почти идентичный 5'-концевому участку цистрона белка оболочки Qß РНК, а также участок длиной 33 нт, почти идентичный З'-концевому участку аспартиловой тРНК E.coli. RQ135 РНК целиком состоит из нескольких кусков, гомологичных разным участкам рибосомной 23S РНК и цистрона О-белка фага X (район Orr). Отсюда следовал вывод, что данные РНК не могли образоваться de novo путем случайной полимеризации нуклеотидов.

Гипотезе de novo синтеза противоречит также тот факт, что две другие "спонтанно" выросшие РНК, RQ87 и RQ223, оказались идентичными соответственно, "миниварианту", впервые выделенному из продукта спонтанного синтеза в лаборатории М. Айгена, и "мидиварианту", впервьк

выделенному из продуктов спонтанного синтеза РНК в лаборатории С. Шпигельмана и независимо обнаруженному в продуктах спонтанного синтеза в лаборатории М. Айгена. Более того, недавно секвенированная в лаборатории М. Айгена "SV-7" РНК оказалась практически идентичной нашей RQ135 РНК. Иными словами, в разных лабораториях спонтанно синтезируются одни и те же RQ РНК. Это заставляет сделать вывод, что синтез RQ РНК направляется матрицами и должен быть общий источник всех этих RQ РНК в разных лабораториях.

Полученные факты плохо согласуются и с гипотезой вариантов, так как наличие значительных гомологий с клеточными РНК (в случае RQ120 и RQ135) и отсутствие гомологий с Qß РНК (в случае RQ135) противоречат происхождению этих РНК путем делеций фагового генома. Очевидно, данные RQ РНК возникли в результате рекомбинаций между РНК, присутствующими в инфицированных клетках Е. coli.

3. RQ РНК содержатся в Qß фаге

Оказалось, что, хотя набор спонтанно синтезируемых RQ РНК и не воспроизводим, он не случаен. В первых наших экспериментах мажорным продуктом спонтанного синтеза была RQ120 РНК. Некоторое время спустя набор продуктов спонтанного синтеза резко изменился (рис. 1); это совпало по времени с проведением работ по выращиванию фага Qß дикого типа и препаративному выделению Qß РНК. Мы предположили, что источником новых RQ РНК мог быть Qß фаг. Это могло бы объяснить и сходство RQ РНК, синтезированных спонтанно в разных лабораториях. Действительно, во всех случаях Qß фаг дикого типа был получен из одного и того же источника - из лаборатории проф. И. Ватанабе (университет Кейо, Токио, Япония).

Рис. 1. Изменение набора спонтанно синтезируемых НО РНК в зависимости от времени постанов»« эксперимента. ЯО

РНК, синтезированные спонтанно одним и тем же препаратом Ор репликазы (1) в первом эксперименте; (2) 4 месяца спустя (после первого выращивания 0|3 фага) ; (Э) 1 год спустя. Продукты синтеза окрашены этидиум бромидом после электрофореза в полиакриламидном геле.

<~ RQ223

дуплекс *■ RQ223 * RQ135

1 2 к К1 1 2 3 К2

Й0135 ,4 КСП20>

Ш587 -I

Рис. 2. Обнаружение ИО РНК в (Зр фаге. (А) Низкомолекулярные РНК, выявляемые в препарате С5р РНК с помощыо З'-концевого мечения. Авторадиограф, полученный после электрофореза в 10% ПААГ 2 мг ар РНК, меченой [5'-32Р]рСр (1) без добавления и (2) с добавлением по 0,1 мкг РЮ120 РНК и Р0135 РНК. Стрелками указано положение немеченых НО РНК, выросших спонтанно в предыдущих экспериментах. (Б) Репликация низкомолекулярных РНК, выделенных из ОР фага. Окрашенные толуидиновым синим продукты репликации, полученные (1) без добавления матрицы, (2) с добавлением ] пкг смеси низкомолекулярных РНК, выделенных из Ор РНК. и (3) с добавлением 1 пкг РНК, элюированной из полосы, совпадающей с («3223 РНК. К1 и К2 - 1 мкг РЮ135 и 1ЭД223 РНК, соответственно.

В препарате РНК, выделенной из Ор фага, нам удалось обнаружить РНК, совпадающие по подвижности при гель-электрофорезе с ЯО РНК, растущими спонтанно [рис. 2А(1)]. Для этого 3' концы РНК были помечены с помощью Т4 РНК лигазы и [5'-32Р]рСр. Это позволило избавиться от фона, создаваемого продуктами деградации ор РНК. Как правило, 3' концы, образующиеся при деградации РНК, блокированы фосфатными группами и не могут быть мечены таким способом. Кроме того, интенсивность З'-концевого мечения не зависит от размеров РНК, а пропорциональна их молярной концентрации.

На рис. 2А(2) видно, что 110120 РНК и ЯС}135 РНК, выделенные из продуктов спонтанного синтеза и добавленные к препарату Ор РНК перед мечением, мигрировали при электрофорезе с точно той же скоростью, что и соответствующие эндогенные РНК. Зная точное количество добавленных Р)0 РНК, мы рассчитали приближенное молярное соотношение разных РНК, содержащихся в Ор фаге, исходя из относительного увеличения интенсивности соответствующих полос на авторадиографе. Молярное содержание РНК, по подвижности совпадающих с ВС587, Я(Э120, 130135 и 130223 РНК, составило, соответственно, 20%, 5%, 15% и 10% от содержания геномной РНК. Таким образом, суммарное содержание этих РНК в фаге сопоставимо (по молям) с содержанием (Эр РНК.

Эндогенные низкомолекулярные РНК остаются связанными с Qp РНК-белковым комплексом даже после удаления более 90% белка оболочки с помощью обработки препарата Qp фага додецилсульфатом натрия и пропускания смеси через сахарозную подушку. Вероятно, эти РНК включены в фаговые частицы. Частицы, содержащие низкомолекулярные РНК, не отличаются от инфекционных фаговых частиц по скорости седиментации в градиенте сахарозы и по плавучей плотности в градиенте CsCI.

Было показано, что эндогенные низкомолекулярные РНК, выделенные из препарата Qp фага, эффективно реплицируются Qp репликазой. Для этого РНК, меченые [5'-32Р]рСр, элюировали из геля, многократно разводили и использовали в качестве матриц в Qp-репликазной реакции in vitro (рис.2Б). Чтобы понизить взаимную конкуренцию между матрицами и помехи их размножению со стороны спонтанного синтеза, реакцию осуществляли в среде, иммобилизованной с помощью агарозы (см. ниже). В течение 1 ч инкубации в реакциях, инициированных Ю-6 мкг РНК, получали около 10 мкг продукта, или в 107 раз больше, что могло произойти только при экспоненциальном размножении (так как время одного цикла репликации 2030 сек, при линейном размножении количество РНК могло увеличиться не более, чем в 100-200 раз). Важно, что набор синтезированных РНК соответствовал набору добавленных матриц. Так, в образце 2, в который была добавлена нефракционированная смесь низкомолекулярных РНК из Qp фага, выросли такие же по подвижности РНК и в той же пропорции, как в исходной смеси [ср. рис. 2А(1)], за исключением РНК,. совпадающей с RQ135 РНК, которой синтезировалось меньше. (Особое поведение этой РНК связано, по-видимому, с тем, что RQ135 РНК может находиться в двух конформациях, причем после денатурации большинство мрлекул RQ135 РНК переходят в более стабильную, но неактивную конформауию.)

Таким образом, Qp фаг дикого типа содержит в значительных количествах реплицирующиеся РНК, пё размеру идентичные спонтанно синтезирующимся RQ РНК. Следовательйо, Qp фаг мог быть источником RQ РНК, синтезирующихся спонтанно как в нашей группе, так и в других лабораториях.

4. Спонтанный синтез RQ РНК вызывается воздушным загрязнением

Хотя вероятный источник спонтанно синтезирующихся RQ РНК был

установлен, оставалось неясным, как RQ РНК оказываются в реакционной

смеси даже в тех случаях, когда исключены загрязнения через Qp репликазу, растворы и посуду. Поскольку даже одиночные молекулы RQ РНК способны

быстро размножаться до больших количеств, для установления источника загрязнения мы разработали метод, позволяющий прямо подсчитывать число активных молекул ЯС) РНК. Идея метода заключается в том, чтобы осуществлять размножение ИЗ РНК не в жидкой среде (где потомство каждой молекулы может распространяться по всему реакционному объему благодаря конвекции и перемешиванию), а в иммобилизованной среде, в которой потомство каждой реплицирующейся молекулы будет оставаться в той зоне реакционного объема, где исходно находилась родительская молекула, формируя, таким образом, "колонию". В качестве иммобилизующего агента была выбрана легкоплавкая агароза, которая, во-первых, не ингибирует Ор репликазу, а, во-вторых, остается жидкой при температуре ниже 37°С, что позволяет смешивать ее с ор репликазой без риска инактивации фермента.

ИО РНК размножали в среде, состоящей из двух слоев агарозы. Сначала формировали слой, содержащий нуклеотиды, на который наслаивали агарозу, содержащую Ор репликазу. Начало реакции размножения конролировапось скоростью диффузии нуклеотидов в ферментный слой, причем рост ИО РНК преимущественно происходил на границе раздела двух слоев. Колонии ВО РНК выявляли путем окрашивания агарозы этидиум бромидом. Результаты представлены на рис. 3. Флуоресцирующие пятна отсутствовали, если агарозу окрашивали сразу после застывания ферментного слоя (рис. ЗА), однако дальнейшая инкубация окрашенной агарозы в течение 1 ч приводила к появлению флуоресцирующих пятен (рис. ЗБ). Таким образом, появление флуоресцирующих пятен зависит от времени, то есть действительно является результатом синтеза РНК, причем колонии растут несмотря на присутствие этидиум бромида. На рис. 3 (В, Г) показаны две чашки Петри, которые после заливания субстратного слоя были оставлены на рабочем столе в течение 1 ч. Разница состояла только в том, что чашка В все это время была закрыта крышкой, а чашка Г оставалась открытой. Затем в обе чашки заливали ферментный слой и инкубацию продолжали в течение еще 1 ч, после чего агарозу окрашивали этидиум бромидом. Видно, что как число различимых колоний, так и общая интенсивность синтеза РНК существенно выше на чашке Г. Поскольку обе чашки приготавливали в идентичных условиях, причиной большего числа колоний на чашке Г могла быть только дополнительная экспозиция субстратного слоя на воздух. Число спонтанно образующихся колоний РНК удавалось понизить, если эксперимент проводили в помещении, в котором ранее с ЙО РНК не работали (рис. ЗД).

А

Б

В

Г

д

Рис. 3. Доказательство присутствия активных ПО РНК в лабораторном воздухе. (А)

Верхний слой агарозы, содержащий ОР репликазу, был залит немедленно после затвердевания нижнего слоя, содержащего субстраты, и сразу окрашен этидиум бромидом. (Б) Тот же гель после 1 ч инкубации при комнатной температуре. (В) Верхний слой агарозы был залит после 1 ч инкубации нижнего слоя в закрытой чашке Петри и окрашен этидиум бромодом спустя еще 1 ч инкубации при комнатной температуре. (Г) Как (В), с той разницей, что перед заливкой верхнего слоя чашку держали на лабораторном столе открытой в течение 1 ч. (Д) Как (В), с той разницей, что чашку заливали в комнате, где раньше с ИО РНК не работали.

Эти эксперименты показывают, что молекулы ПО РНК могут попадать в (инфицировать) реакционную смесь из воздуха и размножаться в ней, создавая ложное впечатление спонтанного синтеза РНК. Таким же образом может загрязняться не только готовая реакционная смесь, но и используемые для ее приготовления растворы и посуда. Отсюда понятно, как можно снизить помехи со стороны спонтанного синтеза размножению добавленных в реакционную смесь матриц и уменьшит:> конкуренцию между одновременно добавленными матрицами. Решение состоит в иммобилизации реакционной среды. В этом случае каждая молекула РСЗ РНК размножается только в той зоне реакционного объема, куда она исходно попала, и не мешает размножению молекул в других зонах. Действительно, как видно на рис. 2Б, использование среды, иммобилизованной агарозой, позволяет размножить относительно слабо реплицирующуюся И3120 РНК даже в присутствии значительно более эффективных матриц, таких как П0135 РНК и 1^0223 РНК.

5. Клонирование молекул RQ РНК in vitro

В описанных ниже экспериментах показано, что размножение RQ РНК в иммобилизованной среде может быть использовано для их клонирования in vitro. Проблема диффузности и перекрывания колоний, свойственная методу с двумя агарозными слоями (п.4), была преодолена путем замены субстратного слоя агарозы на нейлоновый мембранный фильтр, смоченный раствором субстратов. Нейлоновая мембрана обратимо связывает нуклеиновые кислоты и, тем самым, препятствует их диффузии. Кроме того, поскольку часть РНК связывается с мембраной в процессе размножения, не нужна дополнительная стадия переноса колоний. Сразу по окончании инкубации мембрану использовали для анализа колоний по включению меченых субстратов или по гибридизации с мечеными зондами. В то же время, поскольку значительная часть РНК остается в агарозном слое с ферментом, можно приготавливать реплики с использованием новых мембран.

На рис. 4 представлены результаты эксперимента, демонстрирующего, что число колоний зависит от числа посеянных молекул RQ РНК. В среду вводили приближенно известные количества RQ87(-) РНК, приготовленные путем разведений препарата, полученного транскрипцией плазмиды с помощью Т7 РНК-полимеразы. Выросшие колонии RQ87 РНК обнаруживали путем гибридизации с [32Р]-меченой RQ87(-) РНК. Видно, что в опытных образцах 2 и 3, куда было добавлено 200 и 400 молекул RQ87(-) РНК, соответственно, число В(387-специфичных колоний больше, чем в контрольном образце 1 (где колонии RQ87 РНК выросли спонтанно). На оригинальных авторадиографах образцов 1, 2 и 3 было обнаружено, соответственно, 47, 96 и 151 колоний. Таким образом, в образцах 2 и 3 оказалось, соответственно, на 49 и 104 колонии больше, чем в контрольном образце, что составляет »25% от числа добавленных молекул. Эта величина варьировала в разных экспериментах от 10% до 40%, в зависимости от того, какие виды RQ РНК использовали для посева. Таким образом, число колоний RQ РНК пропорционально и близко к числу посеянных молекул. Наблюдаемый выход колоний молекул RQ РНК сравним с долей жизнеспособных (бляшкообразующих) частиц в препаратах Qp фага дикого типа.

На рис. 5 представлены результаты эксперимента, демонстрирующего идентичность колоний посеянным молекулам RQ РНК. Была посеяна смесь, содержащая по «400 молекул RQ87 и RQ135 РНК (нижний ряд). (В верхнем ряду показаны результаты контрольного эксперимента, где РНК не была добавлена.) Выросшие колонии идентифицировали путем гибридизации с мечеными RQ87 и RQ135 РНК. Видно, что разные колонии содержат разные RQ

Рис. 4. Зависимость числа колоний от числа посеянных молекул ИО РНК. Колонии Я(387 РНК, выросшие спонтанно (1) и после добавления »200 молекул (2) и »400 молекул (3) Я087(—) РНК путем растирания 5 мкл соответствующего разведения РНК по поверхности агарозного слоя перед накладыванием мембраны, смоченной субстратным раствором. Колонии были обнаружены путем гибридизации субстратной мембраны с [32Р]-меченой РЮ87(-) РНК.

РНК. Видно также, что среди спонтанно выросших колоний (в контрольном эксперименте) преобладают колонии П(287 РНК, что естественно, так как в это время Я087 РНК интенсивно использовали в экспериментах.

Рис. 5. Идентификация колоний ЙО РНК в смешанных посевах. Колонии РНК, выросшие в течение 30 мин спонтанно (верхний ряд) и после добавления смеси, содержащей по »400 молекул Р0135(-) и Я087(-) РНК, в субстратный раствор перед смачиванием мембраны. Колонии были обнаружены путем (1) гибридизации субстратной мембраны с [32Р]-меченой 35{—) РНК, (2) гибридизации мембраны-реплики с 132Р]- меченой Я087(-) РНК.

Таким образом, число и идентичность выросших колоний соответствуют числу и идентичности посеянных молекул ЙО РНК. Это указывает на то, что каждая колония представляет собой потомство единственной молекулы ЯО РНК. Иными словами, имеет место истинное клонирование молекул.

6. Эффективность репликации [?(} РНК не зависит от наличия фагоспецифических последовательностей

Проведенные нами эксперименты показали, что РЮ135 РНК, не имеющая гомологии с ар РНК, хорошо размножается (Эр репликазой. Более того, в тех случаях, когда она синтезируется спонтанно (а, следовательно, когда ее исходная концентрация очень мала), ИС)135 РНК эффективно вытесняет из продуктов синтеза добавленную РС1120 РНК, имеющую в своем составе 80-членный фрагмент йр РНК.

I , *.'

4

4

и?

с** ?

I**

- 2123456789 10

BQ223-i

дуплекс RQ223-»

RQ135-

BQ223h

дуплекс , RQ223

RQ135-

** Ьт шш

123456789 10

Рис. 6. .Сравнение эффективности репликации 110135 и (¡0223 РНК

(А) и (Б) - два независимых эксперимента по исследованию прямой конкуренции между Я0135 и И0223 РНК, взятых в соотношении (1) 0 :1; (2) 0,001 : 1; (3) 0,01 :1; (4) 0,1 :1; (5) 1 : 1; (6) 1 :0,1; (7) 1 ; 0,01; (8) 1 ; 0,001; (9) 1 : 0 и (10) 0,001 : 0. Единица (1) соответствует 8 нМ ПО РНК. Каждая пробирка содержала 250 нМ 0|) репликазу и была инкубирована в течение 30 мин при 37°С. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях. (А) Авторадиограф геля; (Б) гель, окрашенный этидиум бромидом.

С целью прямого сравнения матричной активности RQ135 РНК и самой эффективной из ранее известных матриц Qß репликазы RQ223 РНК ("мидивариант"), которая имеет два участка гомологии с Qß РНК (причем одному из них отводилась роль специфического "промотора", а другому -"центра инициации"), эти РНК смешивали в разной пропорции и сравнивали их количество в продуктах репликации, инициированной полученной смесью (рис. 6). Побеждала та RQ РНК, которой было взято больше. В то же время, при соотношении матриц 1:1 в одном эксперименте преимущество было на стороне RQ223 РНК, а в другом - на стороне RQ135 РНК. Иными словами, обе RQ РНК являются приблизительно одинаково эффективными матрицами Qß репликазы.

Отсюда следует, что нет какой-то особенной фагоспецифической последовательности, которая бы отвечала за узнавание матрицы Qß репликазой и присутствие которой необходимо для эффективной репликации.

7. RQ120 РНК ингибирует репликацию и трансляцию Qß РНК

Благодаря наличию в составе (-)-цепи RQ120 РНК 80-нуклеотидного участка, гомологичного (+)-цвпи геномной РНК фага Qß, (+)-цепь RQ120 РНК является естественной антисмысловой РНК по отношению к (+)-цели Qß РНК, а (-)-цепь RQ120 РНК является антисмысловой по отношению к (-)-цепи Qß РНК.

Добавление RQ120 РНК в репликационную смесь приводит к значительному падению синтеза Qß РНК (рис. 7). Этот факт не может быть объяснен простой конкуренцией между матрицами за Qß репликазу, так как RQ120 РНК не влияет на синтез RQ223 РНК, синтезированной в этом эксперименте спонтанно. Репликация подавляется в равной степени при добавлении как (+)-, так и (-)-цепей RQ120 РНК, указывая, что в ингибировании принимают участие не только добавленные, но и вновь синтезированные молекулы.

Рис. 7. ROI 20 РНК ингкбирует репликацию Qß РНК. Авторадиограф полиакриламионого геля после разделения РНК, синтезированной в течение 30 мин при 37"С. (1): Спонтанный синтез в присутствии 5 мкг Qß репликазы; (2): (1) + 0,5 мкг (+)-цепи Qß РНК; (3): (2) + 1 mktHF; (4): (2) + 0,1 MKTRQ120(-) РНК; (5): (2) + 0,1 мкг RQ120(+) РНК; (6): (3) + 0,1 мкг RQ120(-) РНК; (7): (3) + 0,1 мкг RQ120(+) РНК. HF - клеточный белок Е. coli, требующийся для синтеза (-)-цепи Qß РНК.

Эксперименты по трансляции Qp РНК показали, что (+)-цепь RQ120 РНК, комплементарная смысловой цепи Qp РНК, но не (-)-цепь, гомологичная ей, ингибирует синтез фагоспецифических белков (рис. 8). Этот факт прямо указывает на то, что причиной наблюдаемого эффекта является взаимодействие между РНК по комплементарным участкам. В то же время, эффект является аплостерическим в том смысле, что ингибируется трансляция не только цистрона белка оболочки, к которому RQ120(+) РНК комплементарна, но и следующего за ним цистрона каталитической субъединицы Qp репликазы. Вероятным объяснением является то, что взаимодействие с RQ120 РНК так изменяет третичную структуру Qp РНК, что подавляет инициацию трансляции на обоих цистронах.

Важно отметить, что ингибирующее действие RQ120 РНК на репликацию и трансляцию Qp РНК наблюдалось без предварительного отжига этих молекул. Это позволяет предположить, что сходным действием RQ120 РНК может обладать и ¡n vivo. Так как многие RQ РНК имеют участки, комплементарные Qp РНК, и присутствуют в фаге, они могли бы влиять на развитие Qp фага, придавая фаговой инфекции более умеренный характер, что выгодно как клеткам, так и самому фагу.

дуплекс Qß РНК

Qß РНК

Б M1 1 2 3 4 М2

SI

Ш'Ш

*- Вер

А2-» RT-»

w EF-Tu — <- EF-Ts

О

О 10 20 30

Время инкубации^ мин

Рис. 8. RQ120(+) РНК ингибирует трансляцию Qp РНК. (А) Кинетика включения [35S]-метионина. Трансляция 1 мкг Qp РНК (1) в присутствии 0,1 мкг RQ120(~) РНК, (2) в отсутствие RQ120 РНК, (3) в присутствии 0,1 мкг RQ120(+) РНК. (4) Включение метки в отсутствие добавленной матрицы. (Б) Авторадиограф образцов, подвергнутых электрофорезу в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия после 60 мин трансляции. Нумерация образцов (1-4) как в (А); по краям - маркеры, окрашенные кумасси G250: М1 - белки Qp фага (А2 - белок созревания, RT - "read-through" белок, CP - белок оболочки), М2 - субъединицы Qp репликазы (Rep - каталитическая субъединица, кодируемая геномом Qp фага).

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что неверны обе выдвинутые прежде гипотезы о происхождении спонтанного синтеза РНК. Оказалось, что RQ РНК могут образовываться путем рекомбинации предсуществующих РНК, как фаговой, так и клеточных; что RQ РНК, похожие на те, что вырастают спонтанно в реакциях in vitro, содержатся в Qp фаге, то есть, являются природными сателлитами Qp фага; и что активные в репликации RQ РНК содержатся в лабораторном воздухе и могут попадать из воздуха в реакционную смесь, создавая впечатление, что РНК синтезируются спонтанно. Эти факты хорошо объясняют все казавшиеся загадочными свойства спонтанного синтеза РНК.

Получены указания на то, что сателлитные РНК Qp фага обладают свойствами дефектных интерферирующих геномов и могут подавлять репликацию и трансляцию геномной РНК по механизму действия антисмысловых РНК.

Наконец, изучение природы спонтанного синтеза RQ РНК привело к созданию метода клонирования РНК in vitro путем выращивания молекулярных колоний в иммобилизованных средах.

выводы

1. Показано, что спонтанный синтез РНК наблюдается даже при использовании препаратов Ор репликазы, не содержащих примесей активных РЮ РНК.

2. С помощью сравнения первичных структур спонтанно синтезированных ЯО РНК со структурами известных нуклеотидных последовательностей показано, что их синтез направляется матрицами.

3. С помощью сравнения первичных структур продемонстрирована идентичность [30 РНК, спонтанно синтезированных в разных лабораториях.

4. С помощью З'-концевого мечения РНК показано, что в очищенном препарате (Эр фага содержатся интактные низкомолекулярные РНК, идентичные по размеру мажорным 140 РНК, синтезируемым спонтанно в разных лабораториях.

5. Показано, что низкомолекулярные РНК, содержащиеся в Ор фаге, способны к экспоненциальному размножению (Эр репликазой, то есть, являются ЯО РНК. Сделан вывод, что ЯО РНК являются сателлитными РНК Ор фага и что Ор фаг является источником идентичных ЯО РНК, обнаруживаемых в продуктах спонтанного синтеза в разных лабораториях.

6. Обнаружено, что при размножении в иммобилизованной среде, содержащей очищенную Ор репликазу и нуклеозидтрифосфаты, молекулы [30 РНК растут в виде колоний.

7. С помощью метода молекулярных колоний показано, что активные в репликации молекулы [30 РНК содержатся в лабораторном воздухе и способны инфицировать бесклеточную систему репликации, создавая впечатление спонтанного синтеза РНК.

8. Продемонстрировано, что число и идентичность молекулярных колоний соответствуют числу и идентичности посеянных молекул ЙО РНК, то. есть, что имеет место истинное молекулярное клонирование.

9. Показано, что ЯС|135 РНК, целиком составленная из участков, гомологичных чужеродным последовательностям, является не менее эффективной матрицей Ор репликазы, чем [30 РНК, гомологичные геномной РНК фага Ор. Сделан вывод, что эффективность репликации не зависит от наличия фагоспецифических последовательностей.

10. Показано, что [30120 РНК, содержащая протяженный участок, комплементарный Ор РНК, специфически ингибирует репликацию и трансляцию Ор РНК. Предположено, что сателлитные РНК фага Ор могут подавлять его размножение по механизму действия антисмысловых РНК.

Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

1. Munishkin A.V., Voronin L.A., Ugarov V.I., Bondareva L.A., Chetverina H.V., Chetverin A.B. Efficient templates for Qp replicase are formed by recombination from heterologous sequences. - J. Mol. Biol., 1991, v. 221, p. 463-472.

2. Chetverin A.B., Chetverina H.V., Munishkin A.V. On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qp replicase. - J. Mol. Biol., 1991, v. 222, p. 3-9.

3. Chetverin A.B., Voronin L.A., Munishkin A.V., Bondareva L. A., Chetverina H.V., Ugarov V.I. Recombination in replicating RNAs. - In: Frontiers in Bioprocessing II (Todd, P., Sikdar, S. K. and Bier, M., eds.), American Chemical Society, Washington, DC, 1992, p.44-49.

4. Четверин А. Б., Четверина E. В. Способ размножения, экспрессии, диагностики и клонирования нуклеиновых кислот в иммобилизованных средах. Заявка на патент No. 92-000528/13 (046209), 1992.

5. Chetverin А. В., Chetverina Н. V. Method for amplification and expression of nucleic acids in solid media and its applications for nucleic acid cloning and diagnostics. U.S. Patent Application No. 07/966,713, 1992.

6. Chetverina H.V., Chetverin A.B. Cloning of RNA molecules in vitro. -Nucleic Acids Res., 1993, v. 21, p. 2349-2353.

17.05.94 г. Зак.йШР. Tro. 100 экз. Уч.-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН