Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реплицирующиеся РНК-векторы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Реплицирующиеся РНК-векторы"

рГ Б ОД 1 О АПР ¡385

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БЕЛКА

На правах рукописи УДК 547.963.3

ЧЕТВЕРИН Александр Борисович

РЕПЛИЦИРУЮЩИЕСЯ РНК-ВЕКТОРЫ

03.00.03 - молекулярная биология

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино • 1995

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор биологических наук, академик А.С.Спирин

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, член-корреспондент РАМН В.И.Агол доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Н.В.Каверин доктор химических наук С.К.Василенко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ :

Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Защита состоится -/6 1995 г. в /у.-^О часов на заседании

диссертационного совета Д.053.05.70 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899 Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Диссертация в виде научного доклада разослана 23 995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

1. Введение

Главной целью настоящей работы было создание бесклеточной системы размножения и экспрессии генетического материала на основе системы репродукции Qß фага — РНК-содержащего вируса, паразитирующего на клетках Escherichia coli.

В традиционных методах в качестве носителя генетического материала (вектора) используется ДНК (обычно это плазмида или геном ДНК-содержащего вируса), а размножение и экспрессия генов осуществляется в живых клетках (in vivo). Для этого рекомбинантную ДНК (вектор со встроенным геном) вводят в клетку, где она размножается и экспрес-сируется наряду с клеточной ДНК.

В нашем подходе в качестве вектора используется РНК. Это позволяет размножать генетический материал непосредственно в форме, пригодной для трансляции. В то же время, выполнение всех процедур вне клетки позволяет значительно сократить их число и продолжительность, получать продукт сразу в чистом виде, осуществлять полный контроль процессов со стороны экспериментатора и снять все ограничения, налагаемые живой клеткой.

Выбор Qß фага был обусловлен тем, что это единственный вирус, для которого известна эффективная бесклеточная система репликации. Qß репликаза (РНК-зависимая РНК полимераза фага Qß) может быть легко очищена в препаративных количествах и способна долго работать в бесклеточной системе без потери активности. Более того, Qß репликаза много эффективнее других ферментов, применяемых для размножения нуклеиновых кислот in vitro, например, в цепной реакции полимеризации ДНК (PCR). Qß репликаза позволяет получать до 1010 копий матричной РНК за 10 мин инкубации в изотермических условиях, тогда как PCR производит лишь около 107 копий ДНК за несколько часов и требует специального оборудования для осуществления температурных циклов.

Высокая производительность Qß репликазы является следствием экспоненциальной кинетики синтеза РНК. Матрицей для фермента служит однонитевая РНК, прочитывание которой приводит к образованию однонитевой же комплементарной копии. Так как, в отличие от PCR, дуплекса между матрицей и вновь синтезированной цепью не образуется, очередной цикл репликации наступает сразу же по завершении

предыдущего цикла. Поскольку и исходная РНК, и ее комплементарная копия служат матрицами в следующем цикле репликации, число матриц (N) нарастает в соответствии с формулой N=2n, где п — число прошедших циклов. Экспоненциальная кинетика наблюдается, пока молярная концентрация матриц не сравняется с молярной концентрацией активного фермента.

Уникальные свойства .Qp репликазы были обнаружены 30 лет назад1. Однако, несмотря на очевидные преимущества, ее использование не получило широкого распространения из-за двух трудностей, казавшихся непреодолимыми. Прежде всего, это матричная специфичность фермента. Оказалось, что Qp репликаза не способна экпоненци-ально размножать какие-либо РНК за исключением геномной РНК фага QP и особого класса негеномных РНК неизвестного происхождения. Эти РНК были названы нами RQ РНК (от "Replicable by Qp replicase"). RQ РНК размножаются даже быстрее, чем Qp РНК, и самопроизвольно синтезируются в процессе реакции независимо от добавления матрицы. Иными словами, Qp репликазная реакция оказалась неконтролируемой. В этом заключалась вторая трудность.

В 1983 г. появилось сенсационное сообщение, что матричная специфичность Qp репликазы может быть преодолена путем встраивания чужеродной РНК в последовательность RQ РНК2. Иными словами, было показано, что RQ РНК может служить вектором для размножения чужеродной последовательности. Хотя реплицирующаяся рекомбинант-ная РНК содержала всего лишь 10-нуклеотидную вставку, этот успех был воспринят как рождение технологии рекомбинантных РНК3. Однако впоследствии оказалось, что лишь рекомбинантные РНК, несущие относительно короткие вставки (до 30-50 нт), являются эффективными матрицами Qp репликазы, тогда как длинные вставки (размером с мРНК) лишают RQ РНК способности к экспоненциальному размножению.

Стало очевидным, что достижение поставленной нами цели требует детального изучения ряда фундамёнтальных свойств репродукционной системы Qp фага. Какие свойства РНК важны для ее эффективной репликации? Почему длинные вставки препятствуют репликации RQ РНК-вектора и как преодолеть этот эффект? Каково происхождение RQ РНК, спонтанно синтезирующихся в Qp репликазной реакции? Можно ли

1 Haruna I. and Spíegelman S. (1965) Science 150, 884-8S6.

2 Miele E. A., Mills D. R. and Kramer F. R. (1983) J. Mol. Bio!. 171, 281-295.

3 Lewin R. (1983) Sc/ence222, 1313-1315.

исключить спонтанный синтез и каким образом? Ответы на эти, а также другие вопросы, возникшие уже в процессе работы, важны не только для практического использования Qß репликазы, но и для более глубокого понимания механизма вирусной инфекции.

Представленные, здесь результаты получены совместно с другими сотрудниками Института белка Российской академии наук. Автор благодарен за плодотворную работу своим коллегам, в разное время работавшим в возглавляемой им группе биохимии вирусных РНК: А. В. Мунишкину, Е. В. Четвериной, В. И. Угарову, Л. А. Воронину, Л. А. Бондаревой, А. А. Волкову, Н. Г. Берестовской, Е. Е. Максимову и А. А. Веприцкому, а также В. Д. Васильеву (группа электронной микроскопии) и И. Ю. Морозову (группа механизмов биосинтеза белка). Особенно признателен научному консультанту академику А. С. Спирину за постоянную поддержку, интерес и обсуждение результатов. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Государственной программы "Новейшие методы биоинженерии", Российского фонда фундаментальных исследований (грант 93-04-6550) и Международного научного фонда (грант МТО-ООО).

2. Структура Qß репликазы

Ранее было известно, что молекула Qß репликазы состоит из четырех субъединиц, только одна из которых (R) кодируется геномом Qß фага4'5. Три другие субъединицы являются белками Е. coli, в норме участвующими в синтезе белка. Это факторы элонгации EF-Tu и EF-Ts6 и рибосомный белок S17. Было однако неясно, какова общая структура четырехсубъединичной молекулы фермента.

Чтобы решить этот вопрос, мы исследовали структуру Qß репликазы методом электронной микроскопии (Берестовская и др., 1987; Beres-towskaya et at., 1988)8. Практически гомогенные препараты Qß репликазы (рис. 1), использованные в этой и других наших работах, выделяли по

4 Kondo М„ Gallerani R. and Weissmann С. (1970) Nature 228, 525-527.

5 Kamen R. (1970) Nature 220, 527-533.

6 Blumenthal Т., Landers Т. A. and Weber К. (1972) Proc. Natt. Acad. Sei. USA 69, 13131317.

7 Wahba A. J., Miller M. J., Niveleau A., Landers T. A., Carmichael G. C., Weber K., Hawley D. A. and Slobin L. I. (1974) J. Bio/. Chem. 249, 3314-3310.

8 Полные ссылки на наши работы приведены в конце диссертации (стр. 48).

Рис. 1. Гель-электрофорез очищенного препарата Qß репли-казы в присутствии додецилсульфата натрия.

модифицированной методике Блюменталя9.'0 из клеток Е coli, зараженных фагом QßamB86 с нонсенс-мутацией во второй половине цистрона белка оболочки11 или трансформированных плазмидой pREP12, несущей ген субъединицы R (любезно предоставленными Палменберг, Шекпи и Кэсбергом из Висконсин-ского университета).

EF-Tu-»

EF-Ts«¿ай»

Важным моментом оказался подбор состава

буфера, обеспечивающего сохранение интактной структуры фермента при высушивании препарата и в то же время исключающего образование солевого осадка на подложке. Лучшие результаты были получены при использовании буфера, содержащего 5 мМ MgCI2 и 200 мМ ацетат аммония.

По результатам проведенных экспериментов предложена трехмерная модель структуры (рис. 2А), согласующаяся с тремя основными типами электронно-микроскопических изображений QP репликазы (рис. 2Б, а-в). Характерной особенностью структуры является построение молекулы из двух неравных субчастиц, ассоциированных вогнутыми поверхностями таким образом, что угол между их продольными осями составляет 60°. Каждая из субчастиц имеет удлиненную форму с соотношением осей приблизительно 2:1.

Судя по размерам изображений, меньшая субчастица состоит из EF-Tu и EF-Ts, которые формируют ее "тело" и "голову" соответственно. Большая субчастица состоит из двух приблизительно равных частей и образована, очевидно, фагоспецифической субъединицей R и белком S1. На некоторых изображениях видны молекулы, диссоциированные на субчастицы в процессе приготовления образца (рис. 2Б, г). Это согласуется с сообщением, что Qp репликаза диссоциирует на субкомплексы R • S1 и EF-Tu • EF-Ts при понижении ионной силы5.

В целом молекула Qp репликазы является компактной изомерной молекулой с диаметром около 100А. Суммарный объем молекулы, оце-

9 Blumenthal Т. (1979) Methods Enzymol. 60, 628-638.

10Четверина Е. В. (1994) Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, МГУ, Москва.

1,Palmenberg A. and Kaesberg P. (1973) J. Virol. 11, 603-605.

12Shaklee P. N., Miglietta J. J., Palmenberg A. C. and Kaesberg P. (1988) Virology 163, 209-213.

Рис. 2. Структура Q|i репликазы. (А) Трехмерная модель молекулы. Три проекции модели, соответствующие основным типам изображений, показанных на рис. 2Б. (Б) Основные типы электронно-микроскопических изображений (а, б, в) молекул Qp репликазы, негативно-контрастированных уранилацетатом, и изображения молекул, диссоциированных на две субчастицы (г). Большие субчастицы отмечены стрелками.

ненный из модели (=300 нм3), совпадает с величиной 290 нм3, вычисленной из молекулярной массы составляющих субъединиц (199.958 Да).

Одной из особенностей структуры Q(3 репликазы является ее необычная стабильность, несмотря на неустойчивость составляющих компонентов. EF-Tu получил свое название ("unstable") из-за нестабильности в отсутствие фактора EF-Ts или гуаниловых нуклеотидов, а субъединица R вообще не способна сохранять нативную структуру вне реликазного комплекса13. Проведенные эксперименты позволили выяснить, что подобным же образом ведет себя белок S1.

13Blumenthal Т. and Carmichael G. (1979) Ann. Rev. Biochem. 48, 525-545.

На рис. 2 видно, что все субъединицы (Эр репликазы (включая следовательно, и белок Б1) имеют глобулярную конформацию с линей ными размерами в пределах 100А. Весьма неожиданное наблюдение поскольку из предыдущих исследований белка в растворе и в соста ве изолированных рибосом было известно, что этот белок имеет сильнс вытянутую форму при длине 210-280А, что сравнимо с максимальным! размерами рибосомы14.

С целью локализации этого белка в молекуле Ор репликазы мь обработали фермент моноспецифическими антителами к Однако комплексов антител с репликазой получить не удалось, так как така? обработка приводила к удалению белка Б1 из молекулы фермента Одновременно, Б1 терял глобулярную конформацию. На электронны) микрофотографиях обнаруживались уменьшенные молекулы репликазь и комплексы антител с нитевидными структурами, представляющимк собой, по-видимому, развернутые молекулы белка (Берестовская к ДР., 1987).

Присутствие в молекуле РНК-полимеразы субъединиц, в норме участвующих в синтезе белка, является одной из многих загадок Ор репликазы. Белок не нужен для копирования каких-либо матриц Ор репликазы, кроме (+) цепи Ор РНК. Предположение, что комплекс ЕР-Ти • ЕР-Тэ может участвовать • в связывании З'-конца матриц 0(3 репликазы подобно связыванию аминоацил-тРНК и поставлять СТР для инициации синтеза РНК, было подвергнуто сомнению в последующих экспериментах13. Пока очевидно только то, что ассоциация субъединии приводит к их взаимной стабилизации. Возможная роль клеточных субъединиц Ор репликазы в связывании 5'-конца растущей цепи РНК и е сопряжении репликации и трансляции РНК будет обсуждена ниже.

3. Структура ВО РНК

Другой загадкой Ор репликазы является ее матричная специфичность, которую отличают три главные особенности.

Во-первых, специфичность фермента проявляется парадоксальным образом. С одной стороны, Ор репликаза не размножает не только

,4Subramanian A. R. (1983) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology (Cohn W. E., ed.), Academic Press, New York, vol. 30, pp. 101-142.

RQ120—>

RQ87—>

А

RQ223 (+)-цепь _> RQ135 (-)-цепь —>

дуплекс —>

дуплекс

Рис. 3. Многообразие RQ РНК. (A) RQ РНК, спонтанно синтезированные одним и тем же препаратом репликазы в разных экспериментах (Chetverin et а/., 1991). (Б) Разделение RQ120 РНК на комплементарные цепи (Munish-kin eta!., 1988).

Б

1

клеточные РНК, но и геномные РНК родственных фагов, структура которых гомологична структуре Q(3 РНК15. Более того, даже (+) цепь Qp РНК не является матрицей для очищенной Qp репликазы в отсутствие дополнительного клеточного белка HF ("host factor")16.17. Это указывает на то, что фермент обладает строгой специфичностью, характерной для всех вирусных РНК-полимераз. С другой стороны, Qp репликаза эффективно размножает, помимо Qp РНК, много разных RQ РНК (рис. ЗА) в отсутствие HF и даже белка S118. Отсюда следует, что все RQ РНК должны обладать структурным свойством, роднящим их с (-) цепью QP РНК и с ее (+) цепью в присутствии HF и отличающим от других РНК.

Во-вторых, при репликации RQ РНК (рис. 35) и Qp РНК в присутствии насыщающих концентраций HF19 комплементарные цепи образуются в приблизительно равных (с точностью 5-10%) количествах. Учитывая, что даже малые различия в скорости синтеза должны привести в условиях экспоненциального размножения к большим различиям в количестве синтезированных цепей, следует сделать вывод, что указанное структурное свойство должно быть практически идентичным для (+) и (-) цепей одной и той же реплицирующейся РНК.

В-третьих, о специфичности данного фермента можно говорить только в смысле его способности размножать определенные РНК экспо-

15Haruna I. and Spiegelman S. (1965) Proc, Natl. Acad. Sci. USA. 54, 579-587.

16Eikhom T. S., Stockley D. and Spiegelman S. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 59, 18231840.

>7Franze de Fernandez M. T., Eoyang L. and August J. T. (1968) Nature 219, 588-590.

1sMills D. R., NishiharaT., Dobkin C., Kramer F. R., Cole P. E. and Spiegelman S. (1977) In Nucleic Acid-Protein Recognition (Vogel H. J., ed.), Academic Press, New York, pp. 533547.

19Kamen R. (1975) In RNA Phages (Zinder N. D., ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 203-234.

ненциапьно. Дело в том, что Ор репликаза узнает и считывав! практически любую однонитевую РНК и даже ДНК, и известны способы усиления этой способности: введение в З'-конец матрицы олиго(С) или олиго(с1С), а также использование рибо- или дезоксирибо-олигонуклео-тидных затравок, ионов Мп2+ или повышенной концентрации ОТР13. Однако, во всех этих случаях вместо репликации наблюдается однократное копирование матрицы, а анализ состояния продукта реакции показывает, что он находится в дуплексе с матрицей20-22.

Таким образом, специфичность Ор репликазы не равнозначна ее способности узнавать матрицу, а главная особенность реплицирующихся РНК состоит в их способности оставаться в однонитевом состоянии в процессе репликации. Одним из факторов, препятствующих образованию дуплекса, является стабильная вторичная структура ИО РНК23.24, но не это является определяющим обстоятельством. Так, РНК вироида веретенообразности картофеля не способна к экспоненциальной репликации25, хотя и обладает очень стабильной вторичной структурой26.

Итак, искомое структурное свойство должно наблюдаться у всех реплицирующихся РНК, быть почти идентичным у комплементарных цепей и препятствовать образованию дуплекса между комплементарными цепями в процессе репликации. Мы попытались обнаружить это свойство путем сравнения структур эффективных матриц (Эр репликазы.

К началу нашей работы в 1985 г. были известны первичные структуры трех ЯО РНК — "мидиварианта" М0У-127 (Р(322328), "микроварианта"29 (РЮ115) и "нановарианта" У\/8-130 (И091), а также (Эр РНК31. Мы выделили из продуктов спонтанного синтеза и секвенировапи четыре вида РЮ РНК, два из которых: ИО120 (МитэИкт е/а/., 1988) и

20Mitsunari Y. and Hon К. (1973) J. Biochem. 74, 263-271.

21 Palmenberg A. and Kaesberg P. (1974) Proc. Natl. Acad. Sei USA 71, 1371-1375.

22Feix G. (1976) Nature 259, 593-594.

23Priano C., Kramer F. R. and Mills D. R. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 52, 321-330.

24Axelrod V. D., Brown E., Priano C. and Mills D. R. (1991) Virology 184, 595-608.

250wens R. A. and Diener T. 0. (1977) Virology 79, 109-120.

26Gross H. J., Domdey H., Lossow С., Jank P., Raba M., Alberty H.and Sänger H. L. (1978)

Nature 273, 203-206.

27Mills D. R., Kramer F. R. and Spiegelman S. (1973) Science 180, 916-927.

28Число после символа RQ указывает длину последовательности РНК в нуклеотидах.

29Mills D. R., Kramer F. R., Dobkin С., Nishihara T. and Spiegelman S. (1975) Proc. Natt.

Acad. Sei USA 72, 4252-4256.

30Schaffner W., Ruegg K. J. and Weissmann C. (1977) J. Mol. Bio!. 117, 877-907.

31Mekler P. (1981) Ph.D. Thesis, University of Zürich.

130135 (Миш^кт 1991) — оказались новыми. Причем Р0135 РНК

оказалась столь же эффективной матрицей Ор репликазы, как и наиболее эффективная из ранее известных — Р0223 РНК.

Сравнение первичных структур не выявило общих черт, за исключением рррССО... на 5'-конце и ...СССАон на З'-конце. Это свидетельствовало против гипотезы о существовании внутреннего промотора Ор репликазы32 и указывало на то, что сходство между реплицирующимися РНК следует искать на уровне вторичной и/или третичной структуры.

Однако, не обладали сходством и опубликованные гипотетические вторичные структуры разных ИО РНК, рассчитанные с использованием формального критерия минимума свободной энергии. Предсказанные вторичные структуры комплементарных цепей, за исключением цепей Я0223 РНК, также сильно различались229'30. К аналогичному результату привело использование программы М. Цукера РСРОШ33, построенной на том же принципе, для расчета вторичной структуры комплементарных цепей Я0120 РНК (Четверин и Воронин, 1987). Более того, предсказанные структуры противоречили результатам зондирования РНК с помощью рибонукпеаз, специфичных к одно- и двутяжным участкам (Мунишкин и др., 1987; Четверин и Воронин, 1987).

Поэтому для предсказания вторичных структур РО РНК мы применили другой подход, основанный на следующих правилах (Четверин и Воронин, 1987):

(1) Шпильки образуются по принципу ближних взаимодействий. Это согласуется с известными свойствами вторичной структуры тРНК34 и обеспечивает возможность формирования окончательной вторичной структуры в процессе репликации по мере синтеза соответствующих участков РНК, тем самым способствуя сохранению ее однонитевого состояния.

(2) Где возможно, шпильки объединяются попарно с образованием непрерывной двойной спирали аналогично тому, как в молекуле тРНК объединены антикодоновая и дигидроуридиловая шпильки34. Образование единого гидрофобного ядра, формируемого стекингованными основаниями, должно стабилизировать каждую из объединенных

32Nishihara T., Mills D. R. and Kramer F. R. (1983) J. Biochem. 93, 669-674.

33Zuker M. and Stiegler P. (1981) Nucleic Acids Res. 9, 133-148.

34Rich A. and RajBhandary.U. L. (1976) Ann. Rev. Biochem. 45, 805-860.

13(3120(-) ИМ

Й0120(+) ЯМ

и-А А'0

и и о-и

С1 '0 С«0

с с 3' 'С и*А

с А А' •и А»и

А А 3- •с е.с

С' А" и-А

С' •3 Г- '3 с*о

У' 'А А с О.с

V 1 'А и и и и

0' •С 3- с се

С' • з С' '3 и*А

с А и с С А

и' ■ЗС^иНиЗ и иззисо

3- •С---3— -С-- ---А*и

С' •5 О.с

С' о.с

С' ■ а О.С

и - / А

А С

и*А С

А«и 0 А

АС А • А

СО С'З

СА З'С й в

А*и А*и и й

о*с з-с и и

и*А А*и с-з

со с*з с-з

о*с з-и и*А

А А. А А и*А

со з-с е-с

и»А с-а с*з

ио в А Ц'З

С'ОАССА АСААААЗС А

А*и----А—з---С---3'С

РЮ135(-) ЯЫА

1 2

V А О* и А

С 3 С 3

С з - и 120 —* А А с 3

3 с 3 А и С 3 С

и А 15-и С-12С © 3 А и А

А и О.С • о.с А и

3 " со • с.о 3 С

о с о*с О о.с 3 с

3 А с с и*А 110-0»С-125 125 —* * и*А О.С 3 с с и

3 с А*и § А*и в с

и-и- —'и 3 и СО СО А А с А- —А-А

А • и - —3 3 в с и АО А С 3 С—-А.и

з-с С 3 3 с и с О А 3 С с 3 з-с

з-с 3 с с 3 С'О-130 1 со С 3 3 С С'С

3-е 3-- — " 3- -А--С А 130 131 и-о--и--с 3— —с А 3-е

А-и 0 и-и -И-А и- и-з-а.с 1||| О'С-С-А-А и-А- А-А С А-и

з и с с А и О.с 0«С А и С 3 А

С Ч ? А 3 с о.с II а*с з С и Б А

А с 3 с / А /А 3 С с 3 и

г 3 С 5' \ •«> 5' \ и 3 с 3

с 3 Г А 3 ' з • и 3 с 3

'„' А и А

А « ш А и

С 3 С 3

3 С 3 с

3 с 135 с с

А А и

о.с о.с о.с

С'З

с-г с-з

А А

л с

з ' и и

Я0135(+) ЯЫА

3

Рис. 4. Модели вторичных структур 130120 и И0135 РНК. Концевая спираль выделена жирным шрифтом. В центре — результаты зондирования (-)-цепи И0135 РНК рибонук-леазой из фасоли, специфичной к однотяжным структурам (1), и рибонуклеазой из яда кобры, специфичной к двутяжным структурам (2).

шпилек35.

З53енгер В. (1987) Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. "Мир" Москва.

(3) Внутри двуспиральных участков допускаются нестандартные пары G:U, G:A и C:U, способные образовывать по две водородных связи без существенных искажений конформации спирали36 и часто наблюдаемые в тРНК34 и рибосомных 5S РНК37, а также А:С противостояние, присутствие которого в двойной спирали не снижает ее стабильности38.

Построение по этим правилам вторичных структур комплементарных цепей RQ120 и RQ135 РНК оставляет свободными инвариантные 5'-концевой олиго(С) и З'-концевой олиго(С) участки, которые могут быть спарены между собой с образованием короткого черешка молекулы. Такой черешок вряд ли может существовать сам по себе, однако во всех случаях он непосредственно примыкает к одной из шпилек и может образовывать с ней единую двойную спираль, подобно спирали, образуемой в молекуле тРНК акцепторным черешком и ТРС-шпилькой34.

Предсказанные таким образом вторичные структуры RQ120 и RQ135 РНК показаны на рис. 4. В отличие от структур, предсказываемых по программе Цукера, они согласуются с результатами рибонуклеазного зондирования (Мунишкин и др., 1987; Munishkin et ai, 1988, 1991). В частности, подтверждено существование концевых двойных спиралей, образуемых черешком молекулы и примыкающей шпилькой, а в случае RQ120 РНК показано, что черешок сохраняется даже в присутствии 7М мочевины при 50°С (Мунишкин и др., 1987). Не исключено, что концевая спираль стабилизирована третичными взаимодействиями в месте сочленения с черешком.

Применение тех же правил к другим RQ РНК приводит к структу-. рам, показанным на рис. 5. Во всех случаях наблюдается концевая спираль, образуемая черешком молекулы длиной 3-5 пар оснований и примыкающей шпилькой.

Концевая спираль имеет признаки искомого структурного свойства реплицирующихся РНК. Она могла бы служить универсальным структурным элементом, узнаваемым Qp репликазой при инициации на З'-конце матрицы. Важно, что структура концевых спиралей комплементарных цепей идентична, за исключением ориентации бокового "выроста", образуемого всей остальной молекулой (рис. 4). Это могло бы

36Cr¡ck F. Н. С. (1966) J. Mol. Biol. 19, 548-555.

37Спирин А. С. (1986) Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез

белка. "Высфая школа", Москва.

38Lomant A. J. and Fresco J. R. (1975) In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology (Cohrí W. E., ed.), Academic Press, New York, vol. 15, pp. 185-218.

Я077(-)

Р.087(+)

ноэ1(+)

!=1С)99(+)

и с

в а

с»«с

Ц'А

О'С

О'С

СА А С

А С г и

С с О'С

А С А»и

и-и О'С

СА-- --О'С

О-С-и' --С'С

о«с •А»и

р.с А С

/ А 11'А-С

р* \ со-и

3 ' О'С

С'С

О'С

и 'А

О'С

и а а а

с о а й в а и с

и й'с с в с а с а

А и а*и с а и 0 с а

и с и«а А*и с и С'О с с

С'О о'с и*А а«и со а с

со с'в и«А са и*А р с с'й

С'С о'с О'С св С'О а а и-а

¿.•и с'о и-о и'А С'О са а'а

и и сс са со с'в и-О А с'с с'о

А'Ц А и с'о С'О и*А 0-0 с 0 сс и-а

с-и о и с'в и-о с'о С'О—и с- —сс— --о'с

и*А о и с-и А'Ц с'о О'С—с— —и'а-си-о-и .

СА-- -а и- —и-й • А*и а а О'С и'а о-и

О'С-- -с- -а- —и*а А*и с с О'С в'с о-и

в'С сс о-и—с— -и а / а с'в о'с

О'С о'с О'С—АА- -с с 5' \ с в в'с

/ А сс О'С са 3' с а'и

\ о'с О'С сс о'с

3 1 сс / А о'с о'с

о'с 5' \ о'с Л с

Л О 3' с'о с'о а а а и и с а и с и а

Я0115(-)

Я0116(-

Н0188(+)

ил АС

ц'а й и

са и и

со Я С

0«с с в

а'ч и•й

с-и О-С'

. »11 С А

со с-и

С'О ее

а с с-г

а'ц о'с

а*и а^с

л«и г-с

и о А'Ч

и*А-----А А—

0.с-------и----

о'с

о-с / а

5' \

3'

А С С А

сс

А«и

-сс -С'в А»и А С

са-с ся-и сс с.о

О'С и*А й'С с и

и А А А А А

и 0 А А и А

и и О'С в ' А в А

и и си С А'Ц А'и

с с Ц'А в С О'С СС и с

С'О О'С в'С О'С Й'С и ' Й

со С'О А*и О'С О'С 11'А

С'О в'С А»и С'О С'О в'С

со С'в А*и о-и СС С'О

со и»А О-А А'О А-0 С'в

А*и А А АО А-Й в'С и

А С—А --С'О--- -СС А А й-А СС и

А С—0 --и-А-Ои -Й'С и-о и'А А'Ц А

О'С СС О'С А'Ц СС А'и С'в и'А

О'С О'С А'Ц О'С А С О'С и-с и-в

О'С в'С в'С О'С-Ои А- -и-С и-о— ---и-о

/ А в'С С'в о-и---- о-и— -ев —и-в

5' \ СС СС О'С I . А»и А'и и-о

3' СС са О'С I А'Ц О'С и-в

А в А'и / А I са О'С с с

А Ц'А 5' \ I С'О С'в О'С

С'в 3' I С'О С'О и«А

в С I С'О О'С Св

А и I I I I I С С С А и'А си С С С с с и*А и в и с С'О СС в'С С'О А»и в с и

И0223+1(-)

0Р(+)

1 1 в'С

1 С I А*и

1 0 С I С'О

1 А 0 I й'С

1 С с А С I С'О

и 1 в с А-и I в'С

С 1 С'О С'О I С'в

СО 1 А'Ц О'С I и-А

СО 1 С'й С'в I С А

СО 1 С'О А'Ч I С'в

СО 1 и*А С'в 1 А-в

СО 1 С'в в'С —С'О

СО 1 О'С А-иСииООС'О

а'ц— 1.1'А— -СО- --и»А СС

а«и--- ---О'С СО С'й СС

а С О'С со С'в и'А

О'С О'С и*А А»и СС

О'С О'С 0—АА -С'О С С С'О

О'С СС С'О-А -и*А и-о СС

а О'С и-с С'О О'С А-и

\ в'С сс а-с С'О С'О

3' с и сс С'О в'С в'С

с и со й'С О'С А

а«и А 0 А*и А

С'О А а в'С

и-А С и

С С А и

с и С

и и и А со со со со

со i а*и С

о'с—а

о>с-ис О.с О.с / а

1 М32(- )

а 0

а с

с а

с'о

о'с

а'ц

1 и-а

0 с'о

и а*и

■с'о а'ц 1 1

са са а 0

с'в о'с а с

са 0'с--а а

с'в са--с- —с'о

и-в о'с с- 'й

с'й о'с и« 'а

св о'с 0« 'с

св / а о'с

; а 5" \ й'с

1 и 3' 0" 'с

1 с а с

1 и а а

с в

Рис. 5. Модели вторичных структур известных реплицирующихся РНК.

»

объяснить тот факт, что комплементарные цепи каждой реплицирующейся РНК являются одинаково эффективными матрицами Qß репликазы. Наконец, концевая спираль могла бы служить "замком", запирающим матрицу в подобие кольцевой структуры и тем самым препятствовать ее отжигу с растущей цепью в процессе репликации.

Чтобы объяснить, каким образом Qß РНК удерживается в однонитевом состоянии в процессе репликации, было предположено39'40 что репликационный комплекс может иметь вид "бабочки" (рис. 6А). В соответствии с этой моделью, Qß репликаза постоянно связана с З'-концом матрицы и с 5'-концом синтезируемой цепи. Одновременно, растущий З'-конец синтезируемой цепи и копируемый участок матрицы связаны в активном центре репликазы. В результате образуется двух-кольцевая структура, что налагает топологические ограничения на образование длинной межцепочечной спирали.

Действительно, Qß репликаза играет активную роль в предотвращении образования дуплекса, так как ее денатурация приводит к немедленному отжигу растущей цепи с матрицей39. Однако, комплекса репликазы с З'-концом реплицирующихся матриц обнаружить не удалось30'41. В то же время, если 3'- и 5'-концы матрицы удерживаются вместе спиральным замком, матричное кольцо могло бы существовать и в отсутствие связывания З'-конца Qß репликазой. Единственным дополнительным требованием было бы удержание репликазой 5'-конца растущей цепи, чтобы могло образоваться второе кольцр (рис. 65).

Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали способность Qß репликазы связывать PPP(G)„, с образования которого начинается синтез растущей цепи. Олиго(С)-5'-трифосфаты разной длины синтези-

39Weissmann С., Feix G. and Slor H. (1968) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 33, 83100.

""Robertson H. D. (1975) In RNA Phages (Zinder N. D„ ed.), Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 113-145.

41 Meyer F., Weber H. and Weissmann С. (1981) J. Mol. Biol. 153, 631-660.

Рис. 6. Модели репликации РНК Q|l репликазой. (А) Модель "бабочки". (Б) Модель спирального замка.

г

ровали путем инкубации Ор реплика-зы с [у-32р] СТР в присутствии смеси ПО РНК и, после экстракции фенолом, разделяли с помощью НР1.С-хроматографии на ОЕАЕ-колонке. Длину полученных олиго(О) определяли с помощью электрофореза в секвенирующем геле.

На рис. 7 видно, что Ор репли-каза действительно образует комплекс с олиго(С), не разрушающийся при фильтровании через нитроцел-люлозную мембрану. ОТР (рррС) связывается с кажущейся константой 5 • 103 М"1, что согласуется с величиной константы Михаэлиса для СТР в Ор репликазной реакции (2-Ю-4 М)42. Динуклеотид рррСС связывается с Ор репликазой почти на 2 порядка прочнее, чем СТР. Прочность комплекса репликазы с рррвСС несколько выше (кажущаяся константа связывания «106 М-1) и сравнима с прочностью комплекса аминоацил-тРНК • Ти ■ йТР (КЙа ю7 М-1)43. Дальнейшее удлинение олиго(б) мало сказывается на прочности комплекса. Полученные результаты согласуются с наблюдениями, что, в отличие от З'-концевых фрагментов, Ор репликаза способна прочно связывать 5'-концевые фрагменты ЯО РНК30, и что З'-концевые фрагменты связываются репликазой только в условиях инициации (то есть, в присутствии СТР и Мд2+, когда разрешен синтез рррССС, способного гибридизоваться с З'-концевым СССА)30.41.

Интересно, что, строго параллельно увеличению сродства к Ор репликазе, растет сродство ррр(0)/7 к ЕР-Ти при увеличении п от 1 до 3 (рис. 7). Это позволяет предположить, что ЕР-Ти участвует в связывании олиго(О) репликазой и, таким образом, функциональная роль ЕР-Ти в репликазном комплексе могла бы состоять в удержании 5'-конца растущей цепи в процессе ее синтеза. При п > 3 сродство ррр(С)л к ЕР-Ти, в отличие от репликазы, падает. Причиной этого может быть либо то, что

42М^ипап У. апс) Ноп К. (1973) и. ВюсЬет. 74, 263-271.

'«Ага К., Каи/акйа М. апс! Каг1го У. (1974) Л ВюсЬет. 76, 293-306.

Длина ррр(С)п, п

Рис. 7. Зависимость логарифма кажущейся константы связывания олиго(С) с Ор репликазой (о) и комплексом ЕЯ-Ти-вОР (•) от длины олигонуклеотида (Четверина и Четве-рин, неопубликовано). Меченый ли-ганд смешивали с белком в буфере (50 мМ трис-НС1 рН 7.5, 6,5 мМ МдС12, 0,5 мМ БОТА и дитиотрейтол, 5% глицерин), инкубировали 1 ч при 0°С, смесь пропускали через фильтр НА\№ (0,45 цм) и фильтр дважды промывали тем же буфером.

свойства EF-Tu в составе репликазы отличаются от свойств свободного EF-Tu, либо то, что в связывании длинных фрагментов участвуют также и другие субъединицы фермента.

Итак, изучение структуры RQ РНК и свойств Qp репликазы позволило нам предложить модель "спирального замка" (Четверин и Воронин, 1987; Chetverin and Spirin, 1995). В соответствии с моделью, все реплицирующиеся РНК способны к формированию концевой спирали, состоящей из черешка молекулы, образуемого ее комплементарными концами, и примыкающей шпильки. С одной стороны, эта спираль служит элементом структуры матрицы, специфически узнаваемым Qp репликазой на стадии инициации, а, с другой стороны, удерживает матрицу в кольцевом состоянии на стадии элонгации, тем самым препятствуя ее отжигу с синтезируемой цепью (рис. 65). Отметим, что, в отличие от модели "бабочки", модель спирального замка допускает одновременный синтез нескольких цепей на одной матрице.

На рис. 5 видно, что концевая спираль может формироваться также геномной РНК фага MS2 и (+)-цепью Qp РНК, которые не являются матрицами Qp репликазы в обычных условиях. В то же время, наблюдается репликация (+)-цепи Qp РНК в присутствии HF16'17. Мы предполагаем, что, в отличие от RQ РНК, (+)-цепи геномных фаговых РНК обычно находятся в неактивной конформации, лишенной концевой спирали. Активная же конформация, содержащая концевую спираль, образуется при связывании геномной РНК со специфической репликазой41'44 и HF (в случае Qp РНК). Это могло бы объяснить причину строгой специфичности репликаз РНК-содержащих фагов в отношении геномных РНК.

4. Происхождение RQ РНК

Происхождение RQ РНК — одна из наиболее удивительных загадок репродукционной системы Qp фага. Помимо Qp фага, подобные РНК обнаружены только в случае родственного фага SP45.

Впервые RQ РНК были обнаружены в лаборатории Шпигельмана в экспериментах по многократному пересеву продуктов репликации Qp РНК в бесклеточной системе, содержащей частично очищенную Qp

44Vollenweider Н. J., Koller Т., Weber Н. and Weissmann С. (1976) J. Moi Biol. 101, 367377.

45Fukami Y. and Haruna I. (1979)M>/. Gen. Genet. 169, 173-181.

репликазу и меченые NTP46'47. Первую реакцию запускали добавлением РНК, выделенной из Qß фага. После инкубации в течение 5-20 мин часть инкубационной смеси переносили в новую среду, и так далее в течение нескольких десятков циклов. Продукты репликации анализировали по распределению метки в сахарозном градиенте и по способности трансфецировать протопласты Е. coli. После первого цикла продукты содержали значительное количество полноразмерной Qß РНК и обладали инфекционностью. При дальнейших пересевах количество полноразмерной Qß РНК и инфекционность продуктов постепенно падали. Исчезновение Qß РНК сопровождалось накоплением низкомолекулярных РНК, обладающих даже большей скоростью репликации, чем Qß РНК. Эти изменения происходили тем быстрее, чем меньшую часть инкубационной смеси использовали для инициации синтеза РНК в следующем цикле, то есть чем больше было разбавление продуктов, синтезированных в предыдущем цикле. Был сделан вывод, что при пересевах происходит эволюция Qß РНК за счет образования делецион-ных вариантов в результате ошибок репликации и селекции тех из них, которые обладают максимальной скоростью репликации. Соответственно, накапливающиеся малые РНК были названы "вариантами" Qß РНК.

Следующим шагом было обнаружение RQ РНК в экстрактах инфицированных клеток Е. co/¡*& . Было показано, что, в отличие от здоровых клеток, клетки, зараженные фагом Qß, содержат РНК с коэффициентом седиментации около 6S, способные размножаться Qß репликазой in vitro. бБ-фракция составляла около 10% клеточной РНК. На основании результатов лаборатории Шпигельмана было предположено49, что "6S РНК" представляют собой делеционные варианты, образовавшиеся при репликации Qß РНК in vivo. Однако оказалось, что даже наиболее чистые по тем временам препараты Qß репликазы содержали заметное количество 6S РНК, легко детектируемое по поглощению в ультрафиолете48. Этот факт мог поставить под сомнение выводы Шпигельмана и сотр., поскольку, если препараты Qß репликазы, используемые в их экспериментах, также содержали примесь 6S РНК, то вероятно, что никакой

46Mills D. R., Peterson R. I. and Spiegelman S. (1967) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 58, 217» 224.

47Spiegelman S., Pace N. R., Mills D. R., Levinsohn R., Eikhom T. S„ Taylor M. M., Peterson R. L. and Bishop D. H. L. (1968) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Bioi. 33, 101-124.

48Banerjee A. K., Rensing U. and August J. T. (1969) J. Moi. Bioi. 45, 181-193.

49Weissmann C., Billeter M. A., Goodman H. M., Hindley J. and Weber H. (1973) Ann. Rev. Biochem. 42, 303-328.

эволюции Qß РНК в делеционные варианты не происходило, а наблюдалось простое вытеснение Qß РНК предсуществовавшими реплицирующимися молекулами.

Позже было обнаружено, что если очищенный препарат Qß репли-казы достаточно долго (около 30 мин) инкубировать со всеми четырьмя NTP в отсутствие добавленной матрицы, то самопроизвольно синтезируются РНК, по размеру и другим характеристикам напоминающие "делеционные • варианты" и 6S РНК293050. Казалось очевидным, что этот спонтанный синтез вызывается примесями RQ РНК в препаратах Qß репликазы.

Таким образом, в начале 70-х годов сложилась следующая концепция о природе спонтанного синтеза РНК Qß репликазой: синтез вызывается примесями делеционных вариантов Qß РНК, образующихся в инфицированных клетках Е. coli из-за ошибок репликации, которые попадают в инкубационную смесь с препаратом Qß репликазы49. В дальнейшем мы будем называть эту концепцию "гипотезой вариантов". В пользу гипотезы вариантов говорил тот факт, что некоторые из спонтанно синтезированных RQ РНК обладали значительной гомологией с Qß РНК30.

Однако, в 1975 г. Зумпер и Луце сообщили, что спонтанный синтез RQ РНК наблюдается, даже если препарат Qß репликазы не содержит реплицирующихся молекул51. Авторы очистили Qß репликазу до состояния, когда добавление всего 5 молекул RQ РНК вызывало стимуляцию синтеза РНК над спонтанным уровнем. Тем не менее, даже после того, как объем инкубационной смеси (и, следовательно, количество добавленной Qß репликазы) был уменьшен в 10.000 раз, спонтанный синтез все равно наблюдался в каждом эксперименте.

Авторы выдвинули гипотезу "de novo синтеза", согласно которой Qß репликаза синтезирует RQ РНК безматрично (de novo) путем беспорядочной конденсации нуклеотидов. Некоторые из образовавшихся полинуклеотидов случайно оказываются способными к репликации и эволюционируют за время реакции в эффективно размножающиеся молекулы.

Если бы гипотеза de novo синтеза оказалась верной, Qß репликаз-ная реакция могла бы быть использована в качестве модели для

50Kacian D. L., Mills D. R., Kramer F. R. and Spiegelman S. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci

USA 69, 3038-3042.

51Sumper M. and Luce R. (1975) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 72., 162-166.

изучения процесса возникновения информационных молекул. Однако, это разрушило бы надежды на то, что Qß репликазную реакцию удастся сделать контролируемой, поскольку спонтанный синтез оказался бы в таком случае неотъемлемым свойством самой Qß репликазы.

Таким образом, выяснение происхождения RQ РНК имело принципиальное значение для решения вопроса о том, возможно ли использование Qß репликазы' для размножения чужеродных последовательностей.

4.1. RQ РНК образуются путем рекомбинации предсуществующих РНК

В первом эксперименте мы обнаружили спонтанный синтез РНК лишь после 4 ч инкубации, то есть значительно позже времени, необходимого для размножения до детектируемых количеств единственной молекулы RQ РНК (менее 1 ч52). Это позволяло предположить, что, как и в работе Зумпера и Луце51, наш препарат Qß репликазы был свободен от примесей RQ РНК. Об этом же свидетельствовал и тот факт, что набор RQ РНК, спонтанно синтезированных тем же препаратом фермента в разное время, существенно различался (рис. ЗА). Напрашивался вывод, что все эти RQ РНК возникли de novo.

Однако, определение первичной структуры*мажорной РНК, синтезированной в первом эксперименте (RQ120: Мунишкин и др., 1987), полностью исключило такую возможность (рис. 8А). Оказалось, что 2/3 этой РНК практически идентичны последней четверти цистрона белка оболочки фага Qß. Это однозначно указывало на то, что синтез RQ120 РНК направлялся матрицей. (Другой вопрос — как эта матрица оказалась в инкубационной смеси — будет рассмотрен ниже.)

Еще более неожиданный факт был обнаружен в результате сравнения RQ120 РНК с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank. Выяснилось, что остальная 1/3 этой РНК почти идентична ЗЗ-нуклеотидному З'-концевому фрагменту tRNA^ -£ coli (рис. 8А). Очевидно, RQ120 РНК возникла путем рекомбинации предсу-щес^вовавших последовательностей. Поскольку в репродукционном цикле Qß фага отсутствуют ДНК-интермедиаты53, нами был сделан вывод, что RQ120 РНК образовалась в результате прямой рекомбинации между молекулами Qß РНК и тРНК (Munishkin et а!., 1988).

52Biebricher С. К., Eigen М. and Luce R. (1981) J. Mol. Biol. 148, 391-410.

53Spiegelman S. and Haruna I. (1966) Proc. Natl. Acad. Sei USA. 55, 1539-1554.

TPHKf

RQ120(-) РНК

- сссдасоушиах..

Qß (+)РНК

174о конец цистрона белка оболочки

RQ135(+) РНК

. . .АСШиОС-

23S РНК

20

I I

23S РНК

i Iii

апдаяс qanefccqaoqafcpqccctgacmpc—лак... 130

• ••• •••••••• •••••••> !■!• • • | |

:-aa^nxiuu3OOMMausMO0G»ö0ccauii<X3UKxax3UUOTCce0—щгоошссс-сь

• ■ .ося^оотскшпуоояшсдсуистасшза^ссаи-сса^и..

23S РНК

. уиийюссссуспл>1иаядуиа-

39060

--шиэд^ссосшго^ааашгоосудвсссисык. •

мРНК 0-белКа фага X

В

А А

U с

G А

о-с в-и V'K и-и

о-с в-о

АО

л-о

оа

и-о ив

в-А в»С А С

А

А U A»U CG U-G C-G C'G CG

U'A>U A*U

CG

А С

С.о----А U

О,с-----и А

0*С 0«С 5' 3'

Л А

О С G А-20 G.C C«G G«C О'А 10-G«C A«ü C«G AG G-A C»G-30 O-G

GGG UCCGAA...

RQ135(+) РНК

А А

0 С G А

G.C

G-U-720 710-U.А 0«А G»C G-O A-G А- G G* А 700 U•G

1 О-в

. .AGG ACCGAA.

23S РНК

ю

Рис. 8. Сравнение структур RQ РНК со структурами предполагаемых предшественников. (А) Гомология RQ120(-) РНК с TPHKf" £ coli и Qß РНК. (Б) Гомология RQ135(+) РНК с 23S РНК £ coli и геномом фага X. Полные совпадения отмечены жирными точками, мелкие точки отмечают замены типа транзиций. (В) Структура предполагаемого предшественника RQ135 РНК, образованного рекомбинацией фрагментов 695-735 23S РНК и 39077-39105 генома фага X. Концевая спираль выделена жирным шрифтом. (Г) Гомологичные шпильки RQ135(+) РНК и 23S РНК. Совпадающие основания выделены жирным шрифтом. .■

Это было первым указанием на возможность рекомбинации между молекулами РНК в бактериальных системах. Хотя ранее было известно о наличии межмолекулярной рекомбинации у животных и растительных вирусов54.55, считалось, что не существует рекомбинаций между геномами РНК-содержащих бактериофагов56 и что "варианты" Qp РНК могут возникать только путем делеций фагового генома47.

Таким образом, результаты уже первого нашего эксперимента противоречили как гипотезе de novo синтеза, так и гипотезе вариантов. По-видимому, RQ120 РНК не присутствовала в препарате Qp репликазы, однако свойства первичной структуры этой РНК не оставляли сомнений в ее матричном происхождении. В то же время, RQ120 РНК не может рассматриваться в качестве "варианта" Qp РНК, так как лишь часть ее последовательности произошла из генома Qp фага.

К еще более неожиданному результату привел анализ RQ135 РНК (Munishkin et at., 1991). Оказалось, что вся ее последовательность состоит, из участков, гомологичных чужеродным РНК: рибосомной 23S РНК и мРНК, кодирующей О-белок фага X (рис. 8Б). Первичная структура RQ135 РНК может быть описана как результат трех последовательных рекомбинационных событий: рекомбинация последовательности фага X и внутреннего участка 23S РНК; инсерция участка, прилегающего к 5'-концу 23S РНК, и дупликация внутренней области полученной конструкции (Chetverin et а/., 1992). Важно, что уже продукт первой рекомбинации смог бы сформировать концевую,спираль и, таким образом, быть способным к репликации (рис. 8В).

Другое неожиданное наблюдение — слабая дивергенция структуры RQ РНК от структуры вероятных предшественников, что особенно очевидно в случае RQ120 РНК (рис. 8А). Последовательность RQ135 РНК мутирована в большей степени, однако ее вторичная структура очень близка ко вторичной структуре предшественников. Так, шпилька, участвующая в формировании концевой спирали RQ135 РНК, почти идентична шпильке 23S РНК, от которой она, по-видимому, произошла (рис. 8Г). Обе имеют одинаковые петли, а нуклеотидные различия наблюдаются только в черешках, причем все замены усиливают шпильку RQ135 РНК по сравнению с ее гомологом в 23S РНК.

^Агол В. И., Тольская Е. А. (1988) Молекулярная биология 22, 293-302.

55Lai М. М. (1992) Microbiol. Rev. 56, 61-79.

56Horiuchi К. (1975) In RNA Phages (Zinder N. D., ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 29-50.

Таким образом, одни и те же структурные элементы составляют как RQ РНК, так и нереплицирующиеся РНК, а структурные особенности RQ РНК возникают благодаря изменениям в пространственном расположении этих элементов в результате их рекомбинаций (Munishkin et at., 1991).

Полученные результаты позволили нам сделать следующие выводы:

(1) Рекомбинация между молекулами РНК есть общее свойство РНК-содержащих вирусов, в том числе бактериальных (фагов). Этот вывод был впоследствии подтвержден наблюдениями рекомбинации в геномах фагов Qß57 и фб58 in vivo.

(2) Межмолекулярная рекомбинация играет важную роль в образовании молекул RQ РНК. Этот вывод подтверждается обнаружением протяженных участков гомологии RQ223 (MDV-1) РНК с Qß РНК30 и большим сегментом генома фага фб (Chetverin and Spirin, 1995), а также RQ116 (SV11) РНК с (+)- и (-)-цепями RQ87 (MNV-11) РНК59.

(3) Qß РНК — не единственный источник RQ РНК. Поэтому неверно рассматривать RQ РНК как "варианты" Qß РНК. Интересно, что вероятными предшественниками RQ РНК являются те РНК, которые встречаются в клетках Е. coli в больших количествах: фаговые, транспортные, рибосомные. По-видимому, вероятность участия какой-либо РНК в рекомбинационном событии определяется ее концентрацией в клетке.

(4) Реплицируемость не является условием участия РНК в рекомбинационном процессе; не важна она и для того, чтобы продукт рекомбинации был способен к репликации. Так, хотя RQ135 РНК целиком состоит из фрагментов нереплицирующихся молекул, она является одной из наиболее эффективных матриц Qß репликазы (Munishkin et а!., 1991). Последним примером такого рода является RQ99 (MAR3) РНК, образованная путем дупликации З'-половины TPHKVal £ со//'60.

Рис. 9 суммирует доступную информацию о происхождении RQ РНК с известной первичной структурой.

57Palasingam K. and Shaklee P. N. (1992) J. Virol. 66, p. 2435-2442.

58Mindich L„ Qiao X., Onodera S., Gottlieb P. and Strassmann, J. (1992) J. Virol. 66, 26052610.

59Biebricher C. K. and Luce R. (1992) EMBOJ. 11, 5129-5135.

60Moody M. D., Burg J. L., DiFrancesco R., Lovern D., Stanick W., Lin-Goerke J., Mahdavi K., Wu Y. and Farrell M. P. (1994) Biochemistry 33, 13836-13847.

Е coll тРНК fР

Рис. 9. Схема вероятного происхождения известных RQ РНК.

4.2. RQ РНК— сателлиты Ofl фага

Если гипотеза de novo синтеза верна, то продукты независимых спонтанных реакций должны быть разными. С этим трудно согласовывалось сообщение Зумпера и Луце, что в большинстве спонтанных реакций они наблюдали образование одинаковых по размеру RQ РНК со сходными фингерпринтами51. В дальнейшем оказалось, что эти РНК очень похожи на MDV-1 (RQ223) РНК61, ранее обнаруженную в продуктах спонтанного синтеза в лаборатории Шпигельмана®0.

Есть и другие примеры спонтанного синтеза одинаковых RQ РНК в разных лабораториях (Chetverin and Spirin, 1995). Как видно на рис. 10, одна из RQ РНК, выделенных нами, также практически идентична MDV-1

61Biebricher С. К., Eigen М. and Luce R. (1981) J. Mot. Biol. 148, 369-390.

I f° , , f°

GGGGACCCCCCCGGAAGGGGGGGACGAGGUGCGGGCACCUCGUACGGGAGUUCGACCGUG RQ223+-| ( + )

GGGGACCCCCCCGGAAGGGGGGGACGAGGUGCGGGCACCDCGOACGGGAGDUCGACCGOG MDV-1(+)

80 100 120 I I I T I T

ACGAGUCACGGGCTJAGCGCUUUCGCGCUCUCCCAGGUGACGCCÜCGUGAAGAGGCGCGAC RQ223+1 (+) acgagucacgggcüagcgcuüücgcgcücücccaggügacgccucgügaagaggcgcgac MDV-1(+)

I r ■ I Г , r°

CUUCGUGCGÜÜÜCGGCGACGCACGAGAACCGCCACGCUGCÜUCGCAGCGUGGCCCCÜÜCG RQ223+ f (+)

CUUCGUGCGUUUCGGUGACGCACGAGAACCGCCACGCUGCUUCGCAGCGUGGCUCCUUCG MDV-1 (+)

200 220 I I I I

CGCAGCCCGCOGCGCGAGGOGACCCCCCGAAGGGGGGOüDCCCA RQ223+ ■) (+)

CGCAGCCCGCOGCGCGAGGOGACCCCCCGAAGGGGGG-OUCCCA M DV-1 (+)

Б

GGGUÜCAUAGCCÜAÜUCGGCUtJUÜ---GGGCCUUUUUCCCUCGCGUAGCUAGCUACGCGA RQ87_3(+)

GGGUUCAOA^CCDAUOCGGCOUUDAAAGGACCUOUÜDCCtpUCGCGUAGCyAGCOACGCGA MNV-11 (+)

20 40 60

GGUGACCCCCCGAAGGGGGGUUUCCCA RQ87_3(+)

GGUGACCCCtpCGAAGGGGG^UGCCCCA MNV-1 1(+)

80

В

40 : 60

I T l I I

GGGCUAACAGUGCGGOAACACGCACUGGAGGUCCGAAACCGGCGCGCGGGAGAUGCCUAG RQ135. ■) (+)

GGGCUGACAGUGCGGUAACACGCACUGGAGGUCCGAAACCGGCGCGCGGGGGAUGCCUAG SV-7

80 100 120 lililí GCAOCOCOCAAAOCCCOCGOAAAGGGACGCACGGGGGAOGCCOAGGCAOCCCUCAACUOC RQ 135. ■( (+)

GCAOCCCOCAACUCCCOCGOAAAGGGACGCACGGGGGAUGCCUAGGCAUCCCOCAACUOC SV-7

130

I

CGGUUGGAACCCCA RQ135_l(+)

••••••••••••••

CGGUUGGAACCCCA SV-7

Рис. 10. Сходство RQ РНК, независимо выделенных из продуктов спонтанного синтеза в разных лабораториях.

РНК, а другая является близким гомологом RQ87 (MNV-11) РНК, ранее секвенированной в лаборатории Бибрихера62. С другой стороны, последовательность SV-7 РНК, определенная в той же лаборатории59,

62Biebricher С. К. (1987) Co/d Spring Harbor Symp. Quant. Bio!. 52, 299-306.

почти точно совпадает с последовательностью R135.1 РНК, ранее опубликованной нами (Munishkin eta/., 1991).

RQ РНК, гомологичные тем, что были выделены в других лабораториях, появились в наших экспериментах после проведения работ с использованием штамма Qp фага дикого типа. До этого единственной мажорной РНК, синтезировавшейся спонтанно, была RQ120 РНК. Мы заподозрили, что источником новых RQ РНК стал этот штамм. В то время не было известно, могут ли RQ РНК переноситься Qp фагом от клетки к клетке или же они возникают в инфицированных клетках каждый раз заново30.

В отличие от инфицированных клеток Е со//'48, частицы Qp фага не содержат низкомолекулярные РНК в количествах, детектируемых стандартными методами (рис. 11А). Однако такие РНК выявляются после [32Р]рСр-мечения препарата QP РНК с помощью РНК-лигазы (рис. 11 Б). В отличие от окрашивания бромистым этидием, такое мечение выявляет только РНК с интактными З'-концами (что отличает их от большинства

дуплекс

QP РНК" QP РНК-

дуплекс

RQ223"

Молярное отношение к Qp РНК

0,10:1 RQ223-

0,15:1 RQ135-. 0,05:1 RQ120-*

0,20:1 RQ87

В 1 2 3

Рис. 11. Обнаружение НО РНК в 0(1 фаге. (А) Окрашивание бромистым этидием препарата РНК, выделенной из очищенного (Эр фага (2), и продуктов репликации, инициированной этим препаратом (1), после электрофореза в 2% агарозном геле. (Б) Низкомолекулярные РНК, выявляемые в препарате Ор РНК с помощью З'-концевого мечения. Радиоавтограф, полученный после электрофореза в 10% полиакриламидном геле Ор РНК, меченой [32Р]рСр без добавления (1) и с добавлением (2) Н0120 РНК и Р0135 РНК. Стрелками указано положение немеченых РО РНК, выросших спонтанно в предыдущих экспериментах. Молярное отношение НО РНК оценено по увеличению относительной интенсивности полос Р0120 РНК и Р0135 РНК. (В) Репликация низкомолекулярных РНК, выделенных из Ор фага. Окрашенные толуидиновым синим продукты репликации в 1,5% агарозе, полученные с добавлением =1 пг смеси низкомолекулярных РНК, выделенных из Ор РНК (2). В пределах 1 ч репликации количество РНК возросло в 106 - 107 раз. (1) и (3) - 1 мкг Р0135 и Н0223 РНК, соответственно.

продуктов деградации) и пропорционально их молярному, а не весовому содержанию.

Интересно, что низкомолекулярные РНК, обнаруженные в частицах Qß фага, неотличимы по подвижности при гель-электрофорезе от мажорных RQ РНК, спонтанно синтезированных в наших экспериментах (RQ223, RQ135, RQ120 и RQ87). Более того, эти РНК оказались способными к экспоненциальному размножению Qß репликазой (рис. 11В), то есть, они являются RQ РНК.

RQ РНК остаются ассоциированными с частицами Qß фага после того, как более 90% белка оболочки удалено с помощью обработки додецилсульфатом лития. Частицы, содержащие RQ РНК, неотличимы от инфекционных частиц при седиментации в градиентах сахарозы и CsCI; возможно, что RQ РНК содержатся в тех же частицах, что и геномная Qß РНК. Суммарное молярное содержание RQ РНК сравнимо с содержанием Qß РНК и не изменяется при многократном пассировании фага через свежие клетки £ coli, откуда следует, что RQ РНК могут переноситься фагом и размножаться вместе с ним (Chetverin eta!., 1991).

Таким образом, RQ РНК являются сателлитными РНК Qß фага. В то же время, тот факт, что некоторые из RQ РНК содержат участки, гомологичные Qß РНК, роднит их с дефектными вирусными геномами63. RQ РНК являются наименьшими из известных молекулярных паразитов. Неизвестно, играют ли они какую-либо роль в развитии инфекционного процесса или являются "эгоистическими" (selfish) молекулами, которые просто используют репродуктивную систему Qß фага для собственного воспроизведения. Неизвестно также, насколько эти РНК древние. Если (что весьма вероятно) Qß фаг был источником RQ223 (MDV-1) РНК, спонтанно синтезированной в разных лабораториях, то, по-видимому, RQ223 РНК уже содержалась в препарате Qß фага, выделенном Ватана-бе из сточных вод в 1964 году и вскоре после этого предоставленном им Шпигельману15, а также Вайссманну64, от которого и были получены образцы фага, используемые в нашей группе и в лаборатории Бибрихе-ра.

4.3. Причины спонтанного синтеза РНК

Приведенные выше результаты доказывали матричное происхож-

63Schlesinger S. (1988) In RNA Genetics (Domingo E., Holland J. J. and Alquist P., eds.),

CRC Press, New York, vol. 2, pp. 167-185.

64Weissmann C. and Feix G. (1966) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 55, 1264-1268.

дение мажорных RQ РНК, спонтанно синтезировавшихся в нашей группе и в других лабораториях. Оставалось, однако, неясным, каким образом матрицы оказывались в реакционной смеси, несмотря на все возможные предосторожности, предпринимаемые для исключения механических загрязнений (51; Chetverin et а/., 1991), а также на факты, свидетельствующие об отсутствии реплицирующихся РНК в препарате Qp репли-казы (5>; раздел 4.1).

Чтобы проверить возможность, что спонтанный синтез вызывается RQ РНК, прочно связанными с Qp репликазой и медленно диссоциирующими от нее в процессе инкубации, мы подвергли препарат фермента следующим видам обработки:

(1) количественное удаление РНК-связывающего белка S1 с помощью процедуры, после которой, как было заявлено, спонтанный синтез не наблюдается в течение до 24 ч инкубации65 (Четверина и Четверин, неопубликовано);

(2) очистка субъединиц Qp репликазы на колонке с DEAE-сефадексом в денатурирующих условиях (8 М мочевина и 0,2 М р-меркаптоэтанол) с последующей ренатурацией фермента66 (Волков и Четверин, неопубликовано);

(3) инкубация Qp репликазы в течение до 4-х дней при комнатной температуре в присутствии 35-кратного молярного избытка биотинили-рованной РНКазы А67 с последующим удалением РНКазы на колонке со стрептавидин-сефарозой (Волков, Максимов и Четверин, неопубликовано).

Однако, ни в одном случае от спонтанного синтеза РНК избавиться не удалось. Более того, ни кинетика реакции, ни набор синтезированных RQ РНК существенно не изменялись в результате обработки. Мы также заметили, что набор продуктов спонтанного синтеза зависит не от того, какой препарат фермента используется, а от того, с какими RQ РНК в данное время работают в помещении.

Чтобы установить непосредственный источник RQ РНК в реакционной смеси, мы разработали метод, позволяющий обнаруживать одиночные молекулы реплицирующихся РНК (Chetverin et а!., 1991; Четверин и Четверина, 1992; Chetverin and Chetverina, 1992). Для этого Qp репликаз-

65Hill D. and Blumenthal Т. (1983) Nature 301, 350-352.

66Blumenthal T. and Landers T. A. (1976) Biochemistry 15, 422-425.

67Контрольные эксперименты показали, что при эквимолярном соотношении биотини-лированной РНКазы А и RQ РНК последняя полностью деградирует до коротких олигонуклеотидов в пределах нескольких минут.

Рис. 12. Спонтанный рост РЮ РНК в виде колоний, окрашиваемых бромистым этиди-ем, в 35-мм чашках Петри. Детали см. в тексте.

ную реакцию проводили не в жидкой среде,' а в агарозном геле. Мы ожидали, что потомство каждой молекулы ЯО РНК будет оставаться в ограниченной зоне вокруг родительской матрицы, то есть образует колонию, а подсчет колоний позволит сказать, сколько молекул ИО РНК присутствовало в образце до застывания агарозы.

Чтобы предотвратить преждевременное размножение РНК, использовали два слоя агарозы. Нижний слой содержал МТР, а верхний слой, заливаемый после застывания нижнего, — (Эр репликазу. Таким образом, начало реакции размножения контролировалось диффузией субстратов в ферментный слой, а размножение РНК происходило на границе между слоями.

На рис. 12 (А и Б) показаны две чашки Петри, приготовленные в помещении, где часто работали с ЯО РНК. После заливки субстратного слоя чашки оставили на столе в течение 1 ч: чашку А закрытой, а чашку Б открытой. Затем в обе чашки залили ферментный слой и инкубировали их еще в течение 1 ч, после чего агарозу окрасили бромистым этидием.

На обеих чашках действительно видны колонии РНК, причем число различимых колоний и общая интенсивность флуоресценции значительно выше на чашке Б. Поскольку обе чашки приготавливали в идентичных условиях, причиной большего числа колоний на чашке Б могла быть только дополнительная ее экспозиция на воздух. На рис. 12В показана чашка, приготовленная в помещении, где до этого с Я<3 РНК не работали. В этом случае число колоний РНК еще меньше, чем на чашке А.

Эти эксперименты показывают, что молекулы ЯО РНК присутствуют в лабораторном воздухе и могут заражать реакционную смесь, создавая впечатление спонтанного синтеза. Таким образом, спонтанный

синтез РНК не является фатальной неизбежностью и может быть уменьшен или вовсе исключен, если обеспечена необходимая изоляция образца. Более того, результаты экспериментов подсказывают простой способ подавления помех размножению желательных матриц со стороны спонтанного синтеза РНК: осуществление реакций не в жидкости (как обычно), а в иммобилизованной среде. Это значительно снижает конкуренцию между матрицами, поскольку в этом случае их потомство не распространяется по всему объему (Chetverin et а!., 1991).

Способность RQ РНК распространяться по воздуху объясняет многие загадочные свойства спонтанного синтеза, такие, в частности, как невоспроизводимый и часто необычно долгий лаг-период5152, наличие синтеза в отсутствие добавленной матрицы или примесей RQ РНК в препарате Qp репликазы и идентичность RQ РНК, синтезированных в разных экспериментах.

Однако наши результаты не убедили сторонников гипотезы de novo синтеза68. В качестве главного аргумента они ссылаются на то, что спонтанный синтез РНК наблюдается после многочасового лаг-периода в запаянных капиллярах, куда нет доступа молекулам RQ РНК из воздуха69, и что РНК, синтезированные в этих условиях, значительно хуже реплицируются и короче, чем "оптимизированные" RQ РНК70.

Действительно, эти факты предполагают, что RQ РНК могут возникать в реакционной смеси при длительной инкубации, но значит ли это, что эти РНК образуются безматрично? Кроме образования de novo, известны другие медленные процессы возникновения реплицирующихся матриц Qp репликазы, такие как копирование ДНК, расплавление дуплекса RQ РНК и рекомбинация нереплицирующихся РНК (см. выше).

Бибрихер и Луце опубликовали последовательности кДНК некоторых низкомолекулярных РНК, спонтанно синтезированных после очень длительных лаг-периодов и заявили, что не обнаружено значительных гомологий при сравнении этих последовательностей с генбанком, Qp РНК и другими реплицирующимися РНК71. Транскрипты двух из этих кДНК оказались способными, до некоторой степени, к размножению Qp репликазой70.

68Biebricher С. К., Eigen М. and McCaskill J. S. (1993) J. Mol. Biol. 231, 175-179.

69McCask¡ll J. S. and Bauer G. J. (1993) Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 90, 4191-4195.

70Biebricher С. K. and Luce R. (1993) Biochemistry 32, 4848-4854.

71Дословно: "no significant sequence homologies were found when searching the E. co/i sequences of the Genbank, the Qp sequence, or the numerous other RNA species sequences replicated by Qp replicase" (70, стр. 4852).

сотис-------------сиисет<зсссисишис--------------------------сссссссзАСсказо-ииссссА

азотисАиАсссиАшазж^ллгососссии1ллтссси^ азиис-------------Сиисазссссииииисссис-САС----------------------------азооссииисссА

V V

с и

Рис. 13. Сравнение последовательностей низкомолекулярных РНК, спонтанно синтезированных после длительных лаг-периодов70, с последовательностью Я087 3 РНК (показана в центре).

Мы сравнили последовательности этих РНК с известными 130 РНК и обнаружили, что обе они гомологичны ВД87 (М(М\/-11) РНК, часто используемой в лаборатории авторов, а также независимо обнаруженной нами (рис. 13). Интересно, что каждая из этих РНК целиком состоит из нескольких участков 13(387 РНК и, следовательно, могла образоваться путем рекомбинации ее фрагментов, присутствовавших в реакционной смеси до запаивания капилляра. Не исключены, правда, и иные возможности. Например, в процессе длительной инкубации могла произойти "активация" уже готовых РНК путем спонтанного расплавления их дуплексов.

Таким образом, нет фактов, для объяснения которых следовало бы постулировать существование безматричного синтеза ИО РНК. Напротив, все известные свойства спонтанного синтеза РНК легко объяснимы установленными нами фактами: образование РС! РНК путем рекомбинации предсушествующих молекул, их присутствие в частицах СЗр фага и способность заражать реакционную смесь из воздуха. Во всяком случае, имеется достаточно оснований утверждать, что тот спонтанный синтез РНК, который до сих пор препятствовал практическому использованию Ор репликазы, является матрице-зависимым и может контролироваться экспериментатором.

5. НО РНК-векторы

Как показано выше, многие РЮ РНК являются природными реком-бинантами, включающими фрагменты чужеродных РНК. Это дает основание надеяться, что любая последовательность может быть сделана реплицйруемп", путем ее интеграции в состав последовательности ЯО РНК. Пос'.о ::у структура концевых участков ЯО РНК является, по-видимому, оиболее важной для репликации, вставлять чужеродные РНК следует во внутреннюю область молекулы, желательно в одну из ее петель, с тем, чтобы максимально сохранить нативную структуру ЯО РНК.

Принципиальная осуществимость такого подхода была впервые продемонстрирована в Колумбийском университете бывшими сотрудниками Шпигельмана2. Они вставили (А)10 в одну из внутренних петель MDV-1 (RQ223) РНК и показали, что полученная рекомбинантная молекула является столь же эффективной матрицей Q0 репликазы, как и исходная RQ РНК.

С тех пор разные вставки проверены на их способность реплицироваться в составе RQ223 РНК. Оказалось, что эта способность действительно не зависит от первичной структуры, но зависит от длины и — в определенной степени — от вторичной структуры вставки. Относительно короткие вставки (до 50 нт) хорошо размножаются в составе RQ РНК-вектора независимо от их вторичной структуры246072. Рекомбинантные RQ РНК со вставками от 50 до 150 нт способны к эффективному размножению, только если вставка способна к формированию стабильной вторичной структуры. Плохая репликация векторов, несущих слабо структурированные вставки, коррелирует с высоким содержанием дуплекса в продуктах реакции24.

Более длинные вставки лишают RQ РНК-векторы способности к экспоненциальному размножению очищенной Q0 репликазой. Сообщение об экспоненциальной репликации MDV-1 РНК, несущей мРНК хлор-амфениколацетилтрансферазы длиной 783 нт73 (MDV-CAT РНК), не подтвердилось в наших экспериментах (Morozov et а/., 1993). В то же время оказалось, что RQ-мРНК рекомбинанты реплицируются в клетках £ л?//'74.

5.1. Размножение RQ-мРНК in vitro

Для исследования свойств RQ РНК-векторов мы использовали искусственные рекомбинантные РНК, сконструированные на основе RQ 135.1 рнк (Morozov et а!., 1993). С этой целью в ДНК-копии (-)-цепи RQ135.! РНК, клонированной под Т7-промотором в плазмиде pUC18 между сайтами Hind\\\ и Sma I, были осуществлены направленные мутации Т53 -> С и А54 -> Т, приведшие к появлению уникального сайта рестрикции C;TCGAG (Xho I) в участке, соответствующем одной из петель РНК (рис. 14А). Мугантная RQ135.T РНК (полученная путем транс-

72Lizardi Р. М., Guerra С. Е., Lomeli Н., Tussie-Luna I. and Kramer F. R. (1988)

Bio/Technology 6, 1197-1202.

73Wu Y., Zhang D. Y. and Kramer F. R. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 11769-11773.

74Mills D. R. (1988) J. Moi. Biol. 200, 489-500.

Б

промотор_RQ135 ■■,(-) кДНК_

aaqctt I 1GGG clcgaq CCCbgg

Hind III Sma\

ft5) DHFR-ген (480 нт) 1221

137 I САТ-ген (657 нт) I 83 I

Рис. 14. РНК-вектор, изготовленный на основе RQ135 РНК. (А) Вторичная структура мутантной RQ135.,(~) РНК с указанием участка, соответствующего сайту рестрикции Xho I (выделен жирным шрифтом), и места вставки чужеродных последовательностей. (отмечено стрелкой). (Б) Hind\\\/ Sma l-сегмент плазмиды, несущей RQ135.,(-) кДНК под T7 промотором, и фрагменты, содержащие гены DHFR и CAT, вставленные по сайту Xho I. Начало и конец транскрибируемой области выделены заглавными буквами. Цифры указывают размеры участков ДНК в нуклеотидах.

крипции плазмиды, обработанной рестриктазой Sma I; рис. 14Б), а также рекомбинантная РНК, содержащая 22-нуклеотидную вставку в Xho I сайте, реплицировались приблизительно так же хорошо, как и исходная RQ135.1 РНК.

Однако, рекомбинантная RQ РНК, содержащая в том же сайте (+)-цепь мРНК дигидрофолатредуктазы, RQ-DHFR(+) РНК75 (рис. 14Б), оказалась неспособной к репликации очищенной Qß репликазой, также как и MDV-CAT РНК73. На рис. 15А видно, что в обоих случаях происходит быстрый синтез полноразмерной цепи, после чего реакция останавливается. Сходная картина наблюдается при использовании в качестве матрицы RQ-DHFR(-) РНК (рис. 15Б). В то же время видно, что внедрение DHFR мРНК в последовательность RQ РНК значительно улучшает ее считывание (рис. 15В, эксперименты 1 и 2).

Оказалось, что синтез РНК на RQ-DHFR матрице резко усиливается в присутствии полной бесклеточной системы трансляции из £ coli (рис. 15В, эксперименты 2 и 3). Это согласуется со способностью RQ-мРНК к репликации in vivo74, так как бесклеточная система трансляции содержит многие клеточные компоненты, отсутствующие в очищенном препарате Qß репликазы.

Быстрый ранний синтез на однонитевых (+)- и (-)-цепях RQ-DHFR РНК, полученных в результате транскрипции, указывает на то, что обе

А

и А

С G

C-G и U

G>C G А

U*A и . С

A-U G«C

G«C C*G

G*C G*C

G*C U»A

А С G«C

G«C A-U

и-и— -U-G и и С»Й

A»U— -G'C G U C-U

G-C OG G«C U-C

G*C G*C C*G C«G

G«C U-G--- ---С *G—А—С А

A*U G-U-U- U-A*U-U-G-G*C'

G U C»G A-U G-C

с с С А G«C G-C

и К C«G G»C / А

C«G С А 5' \

C.'G с А :

U'A

A«U

C'G

G»C

s с

A U

75Как и в случае Qß РНК, (+)-цепью RQ-mPHK является та, которая кодирует белок.

1 2

5' 15' 30' Б 5' 15' 30'

«— О о->

ее «а» «е# «- Д д-> Шт* о»

В

1 2 3

10' 30' 90' 10' 30' 90' 10' 30' 90'

о -» fí» щ.

Ц- ж» тт

Рис. 15. Репликация ЖЭ-мРНК. (А) Синтез РНК на ЯО-ОНРР (1) и МРУ-САТ РНК (2) в качестве матриц. (Б) Синтез РНК на (+)-цепи (1) и (-)-цепи (2) РО-ОНРЯ. (В) Синтез РНК на контрольной ОНРН-мРНК (1) и на ЯО-ОНРН(+) РНК (2,3) в отсутствие (1,2) и в присутствии (3) полной системы трансляции. Окраска толуидиновым синим. Стрелки указывают положение однонитевых (о) и двунитевых (д) форм РНК.

цепи являются хорошими матрицами для <Эр репликазы. Последующая же остановка синтеза означает, что считывание обеих матриц Ор репликазой приводит к их инактивации, по-видимому, в результате отжига с комплементарным продуктом.

Этот вывод подтверждается экспериментом, в котором за синтезом (+)- и (-)-цепей следили раздельно. С этой целью, меченые продукты синтеза расплавляли и отжигали с большим избытком немеченых (+)-цепей. При этом все (-)-цепи оказывались в дуплексе, а большая часть меченых (+)-цепей, сильно разбавленных немечеными, оказывалась в однонитевом состоянии и поэтому легко отделялась от (-)-цепей при гель-электрофорезе.

Как видно на рис. 16А (эксперимент 1), продукты Ор репликазной реакции, инициированной добавлением РЮ-ОНРР(+) РНК, состоят почти только из (-)-цепей. Отсюда следует, что (-)-цепь, синтези-не может использоваться ею в полученной с помощью

рованная очищенной Qp репликазой качестве матрицы, в отличие от (-)-цепи, транскрипции (рис. 15Б). В присутствии же системы трансляции Qp репликаза может использовать синтезированные ею (-)-цепи для синтеза (+)-цепей (рис. 16А, эксперимент 2). Иными словами, физическое состояние продукта, синтезированного Qp репликазой в отсутствие и в присутствии системы трансляции, качественно различно.

Способность RQ-мРНК эффективно реплицироваться ¡n vivo и в

А

10' 30' 90' 10' 30' 90' 10' 30' 90'

- - —» .«.- «е> щ» шш - — —

-и

о о*

О 30 60 90

Время репликации, мин

Рис. 16. Анализ (+)- и (-)-цепей RQ-DHFR РНК в продуктах репликации. (А) Синтез РНК на RQ-DHFR(+(-матрице очищенной Qp репликазой в отсутствие системы трансляции (1), в присутствии полной системы трансляции в отсутствие (2) и в присутствии (3) 0,5 мМ пуромицина, а также в присутствии неполной системы трансляции, лишенной белковой фракции S100 (4) или рибосом (5). (Б) Кинетика синтеза (+)-цепей (о) и (-)-цепей (•) RQ-DHFR РНК в сопряженной системе репликации-трансляции. Указана радиоактивность полос, вырезанных из геля (рис. 15А, эксперимент 2).

2

3

присутствии бесклеточной системы трансляции можно было бы объяснить наличием особого РНК-связывающего белка, взаимодействие с которым препятствует образованию дуплекса между матрицей и синтезируемой цепью. Однако, раздельное присутствие рибосом или растворимых белков Е. coli, содержащихся в SIOO-фракции, не оказывает влияния (рис. 16А, эксперименты 4 и 5). Более того, стимулирующий эффект системы трансляции исчезает в присутствии пуромицина — специфического ингибитора синтеза белка (рис. 16А, эксперимент 3). Отсюда следует, что усиление репликации RQ-DHFR РНК является результатом вовлечения (+)-цепей в процесс трансляции. Этот вывод подтверждается тем, что на репликацию исходного вектора (RQ135.1 РНК), не содержащего белок-кодирующей последовательности, не влияют ни трансляционная система, ни пуромицин (Morozov et а!., 1993).

Из изложенного следует, что стимуляция репликации RQ-mPHK является результатом трансляции (+)-цепи рибосомами, которые препятствуют ее отжигу с (-)-цепью. ЭтоУ вывод требует объяснения, поскольку, если трансляция (+)-цепей является единственным фактором, предотвращающим образование дуплекса, то вряд ли можно ожидать улучшения репликации.

В процессе копирования репликазой (-)-цепи RQ-mPHK рибосомы

могут начать трансляцию растущей (+)-цепи, не мешая ее элонгации, так как направление трансляции совпадает с направлением роста цепи. Однако, при копировании (+)-цепи возникает проблема, поскольку рибосомы прочитывают матрицу в 5' -> 3' направлении, то есть движутся навстречу Ор репликазе, и поэтому блокируют репликацию78. Следовательно, полноразмерная (-)-цепь может синтезироваться, только если рибосома инициирует на (+)-цепи после, но не до, ее копирования репликазой. В то же время, если копирование уже привело к образованию дуплекса, то рибосома не может помочь, так как она не способна ни транслировать, ни даже связывать двухцепочечные РНК77.

Следовательно, чтобы происходила наблюдаемая стимуляция репликации, необходимо, чтобы ИО-мРНК оставалась в однонитевом состоянии в течение всего времени элонгации цепи независимо от действия рибосом. Это означает, что структура ЯО-мРНК обладает основными свойствами реплицирующейся РНК, то есть способностью специфически узнаваться Ор репликазой и оставаться в однонитевом состоянии в процессе репликации. В то же время, в отсутствие трансляционной системы матрица образует дуплекс с новосинтезированной цепью, по-видимому, после ее синтеза, то есть на стадии терминации.

Терминация играет особую роль в репликации. Она включает безматричное З'-концевое аденилирование синтезированной цепи76 и является самой медленной стадией, занимая до 90% времени реплика-ционного цикла79. В процессе терминации синтезированная цепь покидает репликативный комплекс, который защищал ее от отжига с матрицей в течение элонгации. Вероятно, существует момент (например, после отсоединения цепи и до образования концевой спирали, которая скрепляет ее концы), когда новосинтезированной цепи разрешено образовать дуплекс с матрицей. В случае эффективных матриц (Зр репликазы этого не происходит, поскольку структура цепей стабилизирована сильной вторичной структурой24. Если же, как в случае с ЯО-мРНК, вторичная структура слаба, то образование дуплекса может быть предотвращено благодаря вовлечению (+)-цепей в сопряженный процесс трансляции.

Из этих рассуждений следует, что присутствие системы транс-

76Kolakofsky D. and Weissmann С. (1971) Nature New Biol. 231, 42-46.

77Спирин А. С., ГавриловаЛ. П. (1971) Рибосома, "Наука", Москва.

78Rensing U. and August J. Т. (1969) Nature 224, 853-856.

79Biebricher С. К., Eigen М. and Gardiner W. С. (1983) Biochemistry 22, 2544-2559.

ляции должно по-разному влиять на синтез (+)- и (-)-цепей. Во время синтеза (+)-цепи (то есть, при копировании (-)-цепи) ее связывание с рибосомой в любой момент репликационного цикла не мешает элонгации и предотвращает ее отжиг с матрицей на стадии терминации. Если же копируется (+)-цепь, ее связывание с рибосомой на стадии терминации благоприятно, поскольку предотвращает отжиг с новосин-тезированной (-)-цепью. Однако, посадка рибосом на стадии элонгации должна привести к аборту синтеза (-)-цепи. Это, в свою очередь, приведет к пониженному содержанию (-)-цепей в продуктах репликации по сравнению с (+)-цепями.

Именно такая картина наблюдается в экспериментах. Действительно, инициация трансляции цистрона белка оболочки Qp фага приводит к синтезу укороченных Qp (-)-цепей, размер которых равен расстоянию от З'-конца Qp(+) РНК до участка инициации трансляции76. В то же время, при размножении RQ-DHFR РНК в сопряженной системе репликации-трансляции in vitro ее (+)-цепи накапливаются в 5-кратном избытке над (-)-цепями (рис. 16Б). Иными словами, репликация RQ-мРНК характеризуется почти такой же асимметрией, как и репликация QP РНК in vivo1Э. Это сходство удивляет, так как в бесклеточной системе (+)-цепи RQ-мРНК не одеваются белком оболочки, что, как считалось, является главной причиной неравного содержания (+)- и (-)-цепей Qp РНК в зараженных клетках19. Более того, наблюдаемое сходство позволяет предположить, что механизм размножения RQ-мРНК в бесклеточной системе принципиально близок к механизму репликации генома Qp фага in vivo.

5.2. Экспрессия RQ-мРНК в бесклеточной системе

На рис. 17 видно, что трансляция RQ-DHFR и RQ-CAT РНК (полученных как показано на рис. 14Б) в бесклеточной системе дает значительно более высокий выход белка, чем трансляция контрольных DHFR-и САТ-мРНК. Таким образом, помимо приобретения способности к репликации, мРНК в составе молекулы RQ РНК-вектора становится высоко-экспрессируемой матрицей, что характерно для вирусных геномов. Интересно, что этот эффект наблюдается при использовании в качестве вектора RQ135.1 РНК, которая не имеет гомологии с Qp РНК, и, следовательно, не связан с присутствием вирус-специфических последовательностей (Ugarov eta!., 1994).

t о' 2' 5' 10' 30' т 0' 2' 5' 10' 30'

«m» w t— m** ФТ*> mm

tw in» ы ^aa» «ш* щт ът

— *--*

t 0' 2' 5' 1q' 30' t 0' 2' 5- 10' 30'

ш» tem* %зада w*s* sif'ä*» mm mt*

Ь«»» Ы-л w ЪШ im*

шт ■»—• maß **me »««*, ..

Рис. 17. Экспрессия RQ-DHFR и RQ-CAT РНК в бесклеточной системе трансляции, приготовленной из грубого ("30S") экстракта Е coli.

Вверху: кинетика включения [353]-метионина с использованием в качестве матриц RQ-mPHK (•) и контрольных DHFR- и CAT-мРНК (о).

Внизу: кинетика деградации соответствующих RQ-mPHK (1) и контрольных мРНК (2) в системе трансляции. Образцы, подвергнутый электрофорезу в полиакриламидном геле, окрашены толуидиновым синим. Исходные матрицы, приготовленные с помощью транскрипции, использованы в качестве маркеров (T). Интенсивные полосы вверху геля соответствуют рибосомным РНК.

Анализ целостности РНК в процессе трансляции в экстрактах Е coli показывает, что время жизни RQ-mPHK увеличено в 5-10 раз по сравнению с таковым исходных мРНК (рис. 17). Именно с этим, в большой степени, связан эффект усиления экспрессии. Очевидно, стабилизирующее действие является результатом устойчивости к рибонук-леазам самого RQ РНК-вектора. Известно, что главная роль в деградации РНК в бактериальных клетках принадлежит З'-экзорибонуклеазам и что стабильность мРНК увеличивается в присутствии двугяжных структур на З'-конце молекулы80.

Однако, высокая устойчивость RQ-mPHK не объясняется просто

80Belasco J. G. and Higgins С. F. (1988) Gene 72, 15-23.

т 0' 2' 5" 10' 20' 30

f^ffTf t

т 0' 2' 5' 10' 20' 30'

IM*

т 0' 2" 5' 10' 20' 30'

Рис. 18. Влияние 3'- и 5'-концевых фрагментов RQ РНК на стабильность мРНК в бесклеточной системе трансляции, приготовленной из грубого ("30S") экстракта Е. coli. Кинетика деградации DHFR-mPHK (1), RQ-DHFR РНК, лишенной З'-концевого фрагмента RQ135., РНК (2), RQ-DHFR РНК, лишенной 5'-концевого фрагмента RQ135., РНК (3), и целой RQ-DHFR РНК (4). Остальные детали см. в подписи к рис. 17.

наличием стабильных шпилек в З'-нетранслируемой области. Как видно на рис. 18, удаление из RQ-мРНК как 3'-, так и 5'-фрагмента RQ135.! РНК приводит к резкой дестабилизации молекулы. Это является еще одним свидетельством в пользу взаимодействия 3'- и 5'-концов в структуре RQ РНК (см. главу 3).

Рис. 19. Экспрессия RQ-DHFR и RQ-CAT РНК в бесклеточной системе трансляции, приготовленной из промытых солью рибосом и белковой фракции S100 Е. coli. Вверху: кинетика включения [355]-метионина с использованием в качестве матриц RQ-мРНК (•) и контрольных DHFR- и CAТ-мРНК (о).

Внизу: кинетика деградации соответствующих RQ-mPHK (1) и контрольных мРНК (2) в системе трансляции. Остальные детали см. в подписи к рис. 17.

120

et

ГС О.

30 60

Время, мин

Эффект ЯО РНК-вектора не всегда сводится только к защите мРНК от рибонуклеаз. На рис. 19 видно, что в бесклеточной системе, очищенной от большей части эндогенных РНКаз с помощью седиментации рибосом в растворе с высокой концентрацией соли, скорость трансляции ЯО-САТ РНК в 5-6 раз выше, чем контрольной САТ-мРНК. Этот эффект наблюдается даже в начале реакции, когда деградация РНК еще не существенна. Тот факт, что ИО РНК, чьим единственным предназначением была эффективная репликация и которая не кодирует какого-либо белка, способна усиливать трансляцию встроенного гена, является неожиданным. Возможно, одни и те же структурные особенности вектора (например, сближенность его 3'- и 5'-концов) могут благоприятствовать как процессу репликации, так и процессу трансляции.

Сопряжение трансляции РО-мРНК с репликацией приводит к дальнейшему увеличению выхода белка (рис. 20А). Этот эффект не сводится только к синтезу дополнительных (+)-цепей, поскольку наблюдается, даже если ЯО-мРНК добавлена в насыщающих количествах (то есть, когда дальнейшее добавление матрицы не стимулирует синтез белка)81. Наблюдаемая стимуляция не вызвана добавлением ЕР-Ти, ЕР-Тэ и белка в1, которые являются частью 0(3 репликазного комплекса и — одновременно — частью белок-синтезирующего аппарата, поскольку добавление Ор реп-ликазы не влияет на трансляцию контрольной мРНК (рис. 20Б).

Рис. 20. Экспрессия RQ-DhjFR РНК в бесклеточной системе трансляции, приготовленной из промытых солью рибосом и белковой фракции S100 £ coli. (А) Кинетика включения [353]-метионина в отсутствие (о) и в присутствии 1 мкг (•) и 2 мкг (■) Qß репликазы. (Б) Авторадиограф продуктов трансляции, синтезированных к 90 мин в реакциях, направляемых RQ-DHFR РНК (1,2) и контрольной DHFR-mPHK (3,4) в отсутствие (1,3) и в присутствии (2,4) 1 мкг Qß репликазы.

8,Ryabova L., Volianik Е., Kurnasov О., Spinn А., Wu Y. and Kramer F. R. (1994) j Bio!. Chem. 269, 1501-1505.

Было предположено, что эта стимуляция является результатом того, что в сопряженной системе репликации-трансляции рибосомы могут инициировать на растущих (+)-цепях RQ-мРНК, когда их третичная структура еще не сформирована и участок инициации открыт81. Однако, Qß репликаза стимулирует синтез белка, даже если добавлена в сопряженную систему репликации-транскрипции81, где также разрешена инициация на растущих цепях матрицы.

Мы предполагаем, что сопряжение между транслирующей рибосомой и Qß репликазой может быть более глубинным, чем сопряжение между трансляцией и транскрипцией. Известно, что белок S1 принимает участие в переключении между трансляцией и репликацией Qß РНК82 и что Qß репликаза может заменять EF-Tи и EF-Ts в синтезе белка83, то есть, специфически взаимодействовать с рибосомой. Возможно, одной из целей присутствия EF-Tu, EF-Ts и белка S1 в молекуле репликазы является тесное сопряжение и координация репликации и трансляции генома Qß фага, что, в частности, отражается на свойствах сопряженной репликации-трансляции RQ-mPHK.

Таким образом, внедрение мРНК в RQ РНК-вектор приводит к множественным эффектам. Это защищает мРНК от рибонуклеаз, увеличивает скорость трансляции некоторых мРНК, придает мРНК способность к размножению Qß репликазой в присутствии сопряженной системы трансляции и обеспечивает тесное сопряжение между репликацией и трансляцией мРНК. Эти разные эффекты обладают кумулятивным действием, увеличивая выход синтезированного белка на 1-2 порядка. Фактически, RQ РНК-вёкторы придают клеточным мРНК свойства вирусных геномов.

Распространено мнение, что низкая точность репликации может приводить к быстрой потере кодирующего потенциала мРНК. Действительно, из-за отсутствия механизмов редактирования частота ошибок при репликации РНК (10"3 - 1(H) на несколько порядков больше, чем при репликации ДНК84. В то же время, она не выше, чем при трансляции85. Кроме того, не каждая нуклеотидная замена приводит к появлению в белке нового аминокислотного отстатка и не каждая аминокислотная замена приводит к инактивации белка. Определение активности

82Van Duin J. (1988) In The Bacteriophages (Calendar R., ed.) Plenum Press, New York, pp.

117-167.

83Landers T. A., Blumenthal T. and Weber K. (1974) J. Biol. Chem. 249, 5801-5808.

84Drake J. W. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 4171-4175.

85Edelman P. and Gallant J. (1977) Cell 10, 131-137.

дигидрофолатредуктазы в сопряженной системе репликации-трансляции показало, что синтез новых (+)-цепей RQ-DHFR РНК не приводит к падению удельной активности синтезированного фермента (Morozov et at., 1993). Аналогичные результаты получены при исследовании сопряженной репликации-трансляции MDV-CAT РНК81.

5.3. Клонирование молекул РНК in vitro

Первая попытка клонировать молекулы RQ РНК in vitro была сделана в лаборатории Шпигельмана в 1968 году86. Авторы развели препарат RQ РНК так, чтобы на образец приходилась одна молекула, и наблюдали синтез РНК в приблизительно таком числе образцов, какое ожидалось из распределения Пуассона. Был сделан вывод, что единственная молекула RQ РНК может быть размножена Qp репликазой с образованием клона, то есть потомства одной родительской матрицы. Однако, справедливость этого вывода была поставлена под сомнение установленным впоследствии фактом, что синтез РНК может происходить и без добавления матрицы. Кроме того, было обнаружено, что лишь часть добавленных молекул RQ РНК активны в репликации (52 6Э; Chetve-rina and Chetverin, 1993). Таким образом, совпадение с пуассоновским распределением могло быть случайным.

Клонирование молекул РНК стало возможным благодаря технике молекулярных колоний, разработанной нами для демонстрации способности RQ РНК переноситься по воздуху (Chetverin et а/., 1991). Однако, в прежнем виде метод плохо подходил для клонирования молекул, так как, в отличие от бактериальных колоний и вирусных "бляшек", колонии получались довольно размытыми и часто перекрывались друг с другом. Причина тому — малый размер молекул RQ РНК по сравнению с бактериями и вирусными частицами. Чтобы затруднить диффузию молекул, один из слоев агарозы был заменен найлоновой мембраной, способной к обратимым взаимодействиям с РНК (Chetverina and Chetverin, 1993).

Результат виден на рис. 21. Колонии РНК стали значительно более четкими и сравнимыми по размерам с бактериальными колониями. Кроме того, поскольку молекулы РНК связываются с мембраной по мере их синтеза, мембрана может быть прямо использована для анализа колоний, минуя стадию переноса. При использовании в качестве субстратов [a-32P]NTP колонии становятся видимыми уже через 10 мин инкубации. К этому времени колонии содержат в среднем по 101° копий

86Levisohn R. and Spiegelman S. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 866-872.

Рис. 21. Рост колоний ЯО РНК □ .•сомпозитной среде, состоящей из слоя агарозы, содержащего Ор репликазу, и найлоновой мембраны, пропитанной субстратами. (а) Колонии, выросшие спонтанно в присутствии [а-32Р]СТР. Авторадиографы (1) мембраны, полученной в отсутствие репликазы в агарозном слое, (2) исходной (субстратной) мембраны и (3) мембраны-реплики, полученной с того же слоя агарозы, содержащего репликазу. (Б) Колонии, выросшие после посева =200 молекул Й087 РНК и выявленные с помощью гибридизации исходной мембраны (1) и реплики (2) с [32Р]Р087 РНК. Размер мембран 20 х 20 мм.

А

1 2 3

) ; •*

1 ч ь * i ii *J,i

1, »-' ' f » '

A, ^ ,

1 2

i* * •. i* дг^л

. e- •> j ^ <*» Л' r ?>

Ы-Pcf.

РНК, откуда следует, что время дупликации ЯО РНК составляет около 20 сек, то есть, такое же, как в жидких средах60.

Результаты, приведенные на рис. 22 и 23, подтверждают, что каждая колония представляет собой клон: число колоний пропорционально числу посеянных молекул, а в смешанных посевах разные виды 130 РНК обнаруживаются в разных колониях. В зависимости от вида Яй

РНК число колоний варьирует от 10 до 40% от расчетного числа посеянных молекул, что сопоставимо с долей жизнеспособных (бляшкообразую-щих) частиц в препаратах (Эр фага дикого типа (около 10%)87.

i 2 3

V <щ

Рис. 22. Зависимость числа колоний от числа посеянных молекул ЙО РНК. Колонии, выросшие спонтанно (1) и после посева =200 молекул (2) и =400 молекул (3) РЮ87 РНК и выявленные с помощью гибридизации субстратной мембраны с [32Р]Р087 РНК. Число обнаруженных колоний составило 47, 96 (+49) и 151 (+104), соответственно.

Рис. 23. Идентификация колоний ЯО РНК в смешанных посевах. Колонии, выросшие спонтанно (верхний ряд) и после посева «400 молекул Д01.35 РНК и =400 молекул 13087 РНК (нижний ряд) и выявленные с помощью гибридизации субстратной мембраны с [32Р]Й0135 РНК (1) и. мембраны-реплики с [32Р]Р087 РНК (2).

1 2 j У v.- ** I • * к

» -V4k ft 0. * . • v * *Jjb *« -J * it«

87Paranchych W. (1975) In RNA Phages (Zinder N. D., ed.), Cold Spring Harbor Laboratory

Таким образом, имеет место истинно молекулярное клонирование в отличие от традиционных методов, где клонируются не сами молекулы, а клетки или вирусы, их содержащие, и где рекомбинантные молекулы размножаются в клетках наряду с клеточными ДНК и РНК88. Каждая колония представляет собой препарат РНК, свободный от примесей других нуклеиновых кислот. Анализ колоний не требует осуществления стадий лизиса, депротеинизации и очистки. Наконец, колонии RQ РНК растут значительно быстрее, чем колонии клеток или вирусов.

6. Перспективы использования РНК-векторов

Реплицирующиеся РНК-векторы могут быть использованы во многих областях молекулярной биологии и биотехнологии. Особенно эффективно они могут быть применены в сочетании с техникой молекулярных колоний во всех случаях, где возникает необходимость обнаружения и исследования одиночных молекул РНК. В этой главе рассмотрены некоторые из возможных приложений РНК-векторов (Chetverin and Spirin, 1995).

6.1. Исследование механизма рекомбинации РНК

Исследование механизма рекомбинации РНК является важной проблемой молекулярной биологии и вирусологии. По-видимому, рекомбинация геномов играет существенную роль в эволюции РНК-содержащих вирусов5455. После обнаружения рекомбинантных РНК в составе Qp фага можно утверждать, что рекомбинация РНК является общим свойством РНК-содержащих вирусов всех типов организмов. Было также предположено, что экзон-интронная структура эукариотичес-ких генов возникла в результате рекомбинаций на уровне РНК89.

Существование реплицирующихся РНК-векторов предоставляет уникальную возможность для изучения механизма рекомбинации РНК in vitro. Так как частота рекомбинационных событий очень низка, их продукты могут быть обнаружены и исследованы лишь при наличии системы для их селективного размножения. Из-за отсутствия эффектив-

Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 85-111.

88Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual

(2nd edn.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

89Gilbert, W. (1986) Nature 319, 613.

ных бесклеточных сис- 5'-фрагмент ЯО РНК________Чужеродные довески

тем размножения РНК 5 3'

вирусов животных и рас- 3'-фрагмент РЮ РНК

тений рекомбинация Рекомбинация

РНК изучалась только на 5< 3'

целых вирусах или ИХ Чужеродная.вставка

дефектных частицах. В рис. 24. Схема эксперимента по рекомбинации РНК результате, все нежиз- ¡п уПго. неспособные • рекомби-

нанты (составляющие, по-видимому, основную часть продуктов рекомбинации) полностью выпадали из поля зрения экспериментаторов.

Нами предложена экспериментальная модель90, позволяющая снять это ограничение (рис. 24). В соответствии с моделью, для эксперимента используются взаимодополняющие фрагменты ЯО РНК, снабженные "довесками" из чужеродных последовательностей. Ни один из фрагментов не способен к экспоненциальному размножению (3|3 репликазой, пока в результате рекомбинации между ними не образовалась реплицирующаяся молекула, что обеспечивает позитивную селекцию рекомбинантов. Если рекомбинация произошла между чужеродными последовательностями, то образуется ЯО РНК, несущая чужеродную вставку. При размножении в слое иммобилизованной среды только такие молекулы будут образовывать колонии,"способные к гибридизации с зондами, комплементарными этой вставке. Поскольку любая короткая (до '50 нт) вставка может быть размножена ЯО РНК-вектором, можно изучать рекомбинацию между любыми видами чужеродных последовательностей.

Предлагаемая экспериментальная модель позволит установить, осуществляется ли рекомбинация репликазой, другими клеточными компонентами или самими молекулами РНК; выяснить структурные особенности РНК, способствующие рекомбинации, а также прямо проверить существующие модели рекомбинации РНК91"94. Есть основания предполагать, что принципиальный механизм рекомбинации должен

90Chetverin, A. B. (1993) Studying RNA recombination in the Q|3 system, international

Science Foundation, Grant MTO-OOO.

91Romanova, L. I., Blinov, V. M., Tolskaya, E. A., Viktorova, E. G., Kolesnikova, M. S.,

Guseva, E. A. & Agol, V. I. (1986) Virology 155, 202-213.

92Kuge, S., Saito, I. & Nomoto, A. (1986) J. Moi. Biol. 192, 473-487.

93King, A. M. Q. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 11705-11723.

94Kirkegaard, K. & Baltimore, D. (1986) Cell47, 433-443.

быть общим для разных вирусных систем. Так, наблюдается удивительное сходство между структурами Я0120 РНК (МитэЬкт et а!.% 1988) и дефектного генома вируса Синдбис95, паразитирующего на животных. Обе молекулы включают последовательность вирусного генома, к которой присоединен фрагмент аспартиловой тРНК таким образом, что З'-конец тРНК находится внутри рекомбинантной молекулы.

Мишень

Половинки кДНК-копии RQ-зонда

RQ РНК-зонд

Т7 РНК полимераза

6.2. Свехчувствительная диагностика нуклеиновых кислот

Исходно метод молекулярных колоний был использован нами для

обнаружения молекул ЯО д РНК в лабораторном воз-

духе. С некоторыми изменениями этот метод может быть применен для обнаружения одиночных молекул любых нуклеиновых кислот.

В этом случае, выращиванию колоний РНК должно предшествовать образование реплицирующегося Я(3 РНК-зонда, зависимое от присутствия в образце исследуемой РНК или ДНК (мишени)96. Вместо готового ЯС) РНК-зонда используют две половинки его ДНК-копии, одна из которых несет Т7 промотор. Если в образце присутствует мишень, она служит матрицей для синтеза полноразмерного ДНК-зонда с помощью ДНК-лигазы или ДНК-

Б

5':

Мишень-специфичная вставка

Мишень

^ЗНИИППИ ДНК полимераза

5'

RQ РНК-зонд

Q Т7 РНК полимераза

Мишень-специфичная вставка

Рис. 25. Схема мишень-зависимого образования реплицирующегося НО РНК-зонда с помощью ДНК-лигазы (А) и ДНК-полимеразы (Б).

95Monroe S. S. and Schlesinger S. (1983) Proc. Natt. Acad. Sei. USA 80, 3279-3283.

96Kramer F. R. and üzardi P. M. (1989) Natura 339, 401-402.

полимеразы (рис. 25). После этого образец вводится между мембраной, содержащей нуклеотидные субстраты, и слоем агарозы, содержащей Т7 РНК-полимеразу и Q(3 репликазу. ДНК-зонд используется Т7 РНК-полимеразой для синтеза РНК-копий, которые затем размножаются Qp репликазой с образованием колоний. В отличие от фоновых колоний, позитивные (мишень-зависимые) колонии способны гибридизоваться с меченым олигонуклеотидом, комплементарным мишень-специфичной вставке.

Реализация такого подхода означала бы создание абсолютного метода диагностики, так как он сделает возможным обнаружение единичных молекул мишени или ее фрагмента. Метод может быть использован для обнаружения и количественного определения вирусов, вироидов и вирусоидов, бактерий и других микроорганизмов или их останков, а также определенных генов или их мРНК, в том числе в отдельных клетках. Метод позволяет дискриминировать между ДНК и РНК эукариот путем использования зондов, специфичных к местам стыка интронов и экзонов (ДНК) или двух соседних экзонов (РНК). Метод может найти широкое применение в исследовании процессов раковой трансформации и дифференцировки клеток.

6.3. Селекция рибозимов

Селекция высокоэффективных рибозимов важна для изучения механизма их действия, а также для многочисленных приложений, где заданная мишень должна быть избирательно уничтожена без воздействия на другие РНК. Селекции предшествует создание смеси огромного числа вариантов молекул рибозима, лишь ничтожная доля которых обладает желательными свойствами. В настоящее время используют следующую стратегию выделения таких молекул97. Сначала смесь обогащают в нескольких последовательных' циклах селекции и размножения in vitro, после чего библиотеку «ДНК клонируют in vivo. Наконец, выделяют большое число индивидуальных клонов, которые раздельно размножают и анализируют.

Использование техники молекулярных колоний позволит значительно ускорить и упростить процедуру. Для этого всю исходную смесь рибозимов следует встроить в RQ РНК-вектор и полученные рекомби-нантные молекулы посеять на иммобилизованную среду, содержащую QP реПликазу. Активность полученных колоний реплицирующихся

97Burke, J. М. and Berzal-Herranz, А. (1993) FASEBJ. 7, 106-112.

рибозимов можно определять прямо in situ путем использования мембраны с ковалентно связанным РНК-субстратом.

6.4. Клонирование генов и белковая инженерия in vitro

Как отмечалось выше, RQ-мРНК могут быть размножены Q|3 репликазой, если их репликация сопряжена с трансляцией. Это создает предпосылки для внеклеточного клонирования генов. С этой целью RQ-мРНК следует размножать в слое иммобилизованной среды, содержащей Qp репликазу и бесклеточную систему трансляции. Колонии RQ-мРНК могут быть исследованы in situ на их способность синтезировать белки, выполняющие определенные ферментативные реакции или связывающие определенные лиганды, антитела или антигены.

Особенно привлекательно использование этого подхода для белковой инженерии. По сравнению с клонированием in vivo он обладает такими преимуществами, как легкость и быстрота скрининга и селекции клонов, чистота продуктов экспрессии, возможность получения белков, не совместимых с живой клеткой или содержащих неприродные или модифицированные аминокислоты, а также белков, чьи аналоги конститутивно синтезируются в клетке.

6.5. Использование РНК-векторов в непрерывных системах трансляции

Высокая эффективность экспрессии RQ-мРНК в бесклеточной системе репликации-трансляции делает перспективным использование этих РНК для препаративного синтеза белка в бесклеточных проточных реакторах. Высокая эффективность работы таких реакторов определяется постоянной подачей свежего субстратного раствора и удалением чистых продуктов синтеза путем ультрафильтрации через мембрану. При условии сохранения интакгности мРНК такие реакторы могут работать в течение многих часов, производя до 1 мг белка на 1 мл реакционного объема98". Постоянное воспроизводство (+)-цепей RQ-мРНК за счет репликации и повышенная стабильность мРНК в составе RQ РНК-вектора способны значительно повысить производительность проточных реакторов, что подтверждается в предварительных экспериментах81.

98Spirin, A. S., Baranov, V. I., Ryabova, L. A., Ovodov, S. Yu. and Alakhov, Yu. B. (1988)

Science 242, 1162-1164. "Spirin, A. S. (1992) in Frontiers in Bioprocessing II (Todd, P., Sikdar, S. K. and Bier, M„ eds.), American Chemical Society, Washington, DC, pp. 31-43.

Таким образом, использование RQ РНК-векторов делает возможным осуществление всех генетических процедур, включая размножение, клонирование и экспрессию генетического материала вне клетки. Поэтому можно говорить о реальных перспективах полностью бесклеточной биотехнологии, которая предоставит новые возможности для науки и практики.

7. Выводы

В настоящей диссертационной работе получены следующие основные результаты.

1. Установлено, что способность РНК к размножению QJ3 реплика-зой не зависит от наличия вирус-специфических последовательностей. На уровне вторичной структуры найден общий элемент реплицирующихся РНК (RQ РНК), который может служить для специфического узнавания Qp репликазой как (+)-, так и (-)-цепи РНК. Сформулирована и экспериментально подтверждена модель репликации РНК, обеспечивающая сохранение однонитевого состояния матрицы и растущей цепи в процессе репликации.

2. Обнаружено явление межмолекулярной рекомбинации РНК в бактериальных системах. Показано, что участие в рекомбинации не зависит от способности РНК к репликации и что участниками рекомбинации могут быть как вирусная РНК, так и РНК клетки-хозяина.

3. Обнаружены РНК-сателлиты Qp фага, ассоциированные с вирусными частицами. Показано, что эти РНК способны к репликации Qp репликазой in vitro, и продемонстрирована их способность ко-инфици-ровать клетки хозяина и размножаться вместе с Qp фагом in vivo.

4. Выяснена природа спонтанного синтеза РНК Qp репликазой. Показано, что этот синтез матрице-зависим и может вызываться RQ РНК, попадающими в реакционную смесь из воздуха. Это объясняет все особеьности спонтанного синтеза, ранее послужившие основанием для гипотезы о возможности возникновения реплицирующихся РНК de novo. Найдены эффективные способы преодоления негативного воздействия 1 спонтанного синтеза на размножение заданных РНК.

5. Показано, что RQ РНК могут служить векторами для размножения клеточных мРНК. Обнаружено, что RQ-мРНК не способны к размножению очищенной Qp репликазой, но размножаются ею в присутст-

вии работающей системы трансляции. Выяснено, что система трансляции стимулирует репликацию путем предотвращения образования дуплекса между матрицей и растущей цепью благодаря вовлечению (+)-цепей в синтез белка. Обнаружено, что это явление приводит к асимметрии репликации РНК, характерной для размножения РНК-содержащих фагов in vivo.

6. Показано, что RQ РНК могут быть использованы в качестве эффективных векторов для трансляции в бесклеточной системе. Включение мРНК в последовательность RQ РНК приводит к многократному увеличению выхода синтезируемого белка, прежде всего, благодаря, защите матрицы от деградации рибонуклеазами. Наибольший выход белка наблюдается в сопряженной системе репликации-трансляции. В этом случае эффективность экспрессии RQ-мРНК приближается к эффективности экспрессии вирусных геномов.

7. Предложен метод размножения РНК в иммобилизованных средах (метод молекулярных колоний). Продемонстрирована возможность обнаружения одиночных молекул реплицирующихся РНК и их клонирования in vitro.

Таким образом, на основе репродукционной системы Qp фага разработана эффективная система внеклеточного размножения, экспрессии и клонирования РНК, что создает предпосылки для развития полностью бесклеточной биотехнологии.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мунишкин А. В., Воронин Л. А., Четверин А. Б. (1987). Малая реплицирующаяся РНК, комплементарная участку цистрона белка оболочки фага Qp. Структура и биосинтез белков 1, 35-42.

2. Четверин А. Б., Воронин Л. А. (1987). Матричная специфичность Qp-репликазы: анализ структуры реплицирующихся РНК. Структурз и биосинтез белков 1, 43-52.

3. Берестовская Н. Г., Васильев В. Д., Волков А. А., Четверин А. Б. (1987). Электронная микроскопия Qp-репликазы. Структура и биосинтез белков 1, 53-61.

4. Berestowskaya, N. Н., Vasiliev, V. D., Volkov, A. A. and Chetverin, А. В.

(1988). Eléctron microscopy study of Qp replicase. FEBS Lett. 228, 263-267.

5. Munishkin, A. V., Voronin, L. A. and Chetverin, A. B. (1988). An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Qp replicase. Nature 333, 473-475.

6. Спирин А. С., Четверин А. Б., Воронин Л. А., Баранов В. И., Алахов Ю. Б. (1989). Биосинтез белка и перспективы бесклеточной биотехнологии. Вестник Академии наук СССР 11, 30-38.

7. Voronin, L. A., Munishkin А. V. and Chetverin А. В. (1989). Recombinant RNA molecules are produced in Qp phage-infected cells of E. coii. Abstracts of Conference "Modern Problems of Physico-Chemical Biology and Biotechnology", Nauka Publishing House, Alma-Ata, p. 51.

8. Munishkin, A. V., Voronin, L. A. and Chetverin, A. B. (1989). An in vivo recombinant RNA capable of autocatalytic synthesis by Qp replicase. Abstracts of FEBS Advanced Course "Trends in comparative Molecular Genetics", Czechoslovak Academy of Sciences, Prague, p. 38.

9. Chetverin А. В., Voronin, L. A., Munishkin", A. V., Bondareva, L. A., Chetverina, H. V. and Ugarov, V. I. (1990). Recombination in replicating RNAs. Abstracts of Conference "Frontiers in Bioprocessing II", University of Colorado, Boulder, p. 38.

10. Munishkin, A. V., Voronin, L. A., Ugarov, V. I., Bondareva, L. A., Chetverina, H. V. and Chetverin, A. B. (1991). Efficient templates for Qp replicase are formed by recombination from heterologous sequences. J. Moi. Bioi. 221, 463-472.

11. Chetverin, А. В., Chetverina, H. V. and Munishkin, A. V. (1991). On the nature of spontaneous RNA synthesis by Qp replicase. J. Moi. Bioi. 222, 3-9.

12. Спирин А. С., Четверин А. Б., Воронин Л. А., Баранов В. И., Алахов Ю. Б. (1991). Биосинтез белка и перспективы бесклеточной биотехнологии. Природа 5, 10-19.

13. Chetverin, А. В., Voronin, L. A., Munishkin, А. V., Bondareva, L. А., Chetverina, Н. V. and Ugarov, V. I. (1992). Recombination in replicating RNAs. In Frontiers in Bioprocessing // (Todd, P., Sikdar, S. K. and Bier, M., eds.), American Chemical Society, Washington, DC, pp. 44-49.

14. Четверин А. Б., Четверина E. B. (1992). Способ размножения и

способ экспрессии нуклеиновых кислот, среда для их осуществления. Заявка о выдаче Российского патента №92-000528.13 (046209); решение о выдаче патента от 4.04.94.

15. Cfietverin, А. В. and Chetverina, Н. V. (1992). Method for amplification and expression of nucleic acids in solid media and its applications for nucleic acid cloning and diagnostics. U.S. Patent Application No. 07/966,713.

16. Chetverina, H. V. and Chetverin, A. B. (1993). Cloning of RNA molecules//? vitro. Nucleic Acids Res. 21, 2349-2353.

17. Morozov, I. Yu., Ugarov, V. I., Chetverin, A. B. and Spirin, A. S. (1993). Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system. Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. 90, 9325-9329.

18. Chetverin, A. B. (1994). RNA recombination in the Q(3 phage system Abstracts of Workshop "Genetic Recombination and Defective Interfering Particles in RNA Viruses", Instituto Juan March, Madrid, p. 65.

19. Ugarov, V. I., Morozov, I. Yu., Jung, G. Y., Chetverin, A. B. and Spirin, A. S. (1994). Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cellfree translation systems. FEBS Lett. 341, 131-134.

20. Chetverin, A. B. (1994). Amplification and cloning of RNA in vitro. Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, p. 1.

21. Chetverin, A. B. (1994). Ultrasensitive diagnostics by molecular colony technique. Abstracts of the Third German-Russian Workshop on Biotechnology, Technical University, Berlin, p. 1.

22. Chetverina, E. V and Chetverin, A. B. (1994). Cell-free cloning. .of-RNA molecules. Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, p. 21.

23. Morozov, I. Yu. Ugarov, V. I., Chetverin, A. B. and Spirin, A. S. (1994). Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system. Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, p. 22.

24. Ugarov, V. I., Morozov, I. Yu., Jung, G. Y., Chetverin, A. B. and Spirin, A. S. (1994). Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cellfree translation systems. Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, p. 23.

25. Chetverin, А. В. and Spirin, A. S. (1995). Replicable RNA vectors: Prospects for cell-free gene amplification, expression and cloning. In Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology (Cohn, W. E. and Moldave, К., eds.), Academic Press, San Diego, Vol. 51, Chapter 6, in press.

Материалы диссертации представлены на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1987, 1988, 1990, 1993, 1994), международной конференции "Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), школе Федерации европейских биохимических обществ (Прага, 1989), II международной конференции "Горизонты биопроцессинга" (Боулдер, Колорадо, 1990), международном симпозиуме "Генетические рекомбинации и дефектные интерферирующие частицы РНК вирусов" (Мадрид, 1994), Первой Германо-Российской. школе по бесклеточным системам (Берлин, 1994), III Германо-Российском симпозиуме по биотехнологии (Берлин, 1994), а также доложены на научных семинарах в Московском университете (Москва, 1987), Институте органического синтеза Латвийской академии наук (Рига, 1988), Университете Колорадо (Боулдер, 1990), Йельском университете (Нью-Хейвен, 1990), исследовательской лаборатории фирмы Gene-Trak (Фрамингем, Массачусетс, 1990), Народном институте здоровья (Нью-Йорк, 1991), Институте канцерогенеза РАМН (Москва, 1993), Институте молекулярной генетики РАН (Москва, 1994), Институте молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, 1994), Институте биофизической химии Общества Макса Планка (Геттинген, 1994), исследовательской лаборатории фирмы Boehringer Mannheim (Пенцберг, 1995), Свободном университете (Берлин, 1995) и Институте молекулярной биотехнологии (Йена, 1995).

3.03.95 г. Зак.65!ЗР. Тир. £00 экз. Уч.-изд.л. 3,0 Отпечатано на ротапринте ю СНТИ ПНЦ РАН