Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерологичная индукция экспрессии дрожжевого TYI-элемента и возможности использования транспозон-несущих вирусоподобных частиц для переноса в дрожжи чужеродных генов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гетерологичная индукция экспрессии дрожжевого TYI-элемента и возможности использования транспозон-несущих вирусоподобных частиц для переноса в дрожжи чужеродных генов"

иб 11 мл?

На правах рукописи

Кидготко Оксана Валерьевна

ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ИНДУКЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ДРОЖЖЕВОГО ТУ1-ЭЛЕМЕНТА И ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТРАНСПОЗОН-НЕСУЩИХ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ДЛЯ ПЕРЕНОСА В ДРОЖЖИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ. 03.00.04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики высших организмов ИОГсн РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Шуппе Н. Г. Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук СТойлла Тыну Риховмч

2. Кандидат биологических наук Перевозчиков Андреи Петрович Ведущая организация: кафедра генетики и селекции бнолого-почвенного

факультета СПбГУ.

4Г л2

Зашита состоится Ф I. в час.

на заседании диссертационного совета К 001.23.01 при ПИИ экспериментальной медицины РАМН. Адрес: IУ7.Я76, Санкт-Перербург, ул. Академика Павлова. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИ ЮМ РАМН. Адрес: 197 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.

Автореферат раюслан ^^1490

Ученый секретарь диссертационного совета К.001.23.01 д. б. н. Куликова С). Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди различных классов мобильных генетических элементов, обнаруженных в клетках эукариот, особый интерес представляют ретротранспоюпы, сходные по ряду признаков с провнрусами ретровнрусов позвоночных и использующие для своей транспозиции механизм обратной транскрипции. Благодаря этому сходству ретротранспозоны таких широко используемых в генетике организмов, как ОгозорЬМа melanogaster и дрожжи БассИаготусез сегеУ151ае, могут служить моделью для исследования механизмов регуляции основных энзиматическнх процессов, обеспечивающих жизненный цикл ретроэлементов - образования вирусоподобных частиц (ВПЧ) и обратной транскрипции. В настоящее времл изучение этих механизмов стало особенно актуальным в связи с распространением вируса иммунодефицита человека (1ШЧ) и других патологических ретровирусов, поиском путей борьбы с ними. Кроме того, сами ретротранспозоны достаточно широко распространены в природе (они описаны у большинства генетически изученных эукариотических организмов) и играют важную роль в эволюции геномов.

Для исследования цикла транспозиции дрожжевого ТуI-элемента в 1985 году двумя независимыми группами исследователей была предложена модельная система, которая позволяет искусственно индуцировать его транспозиции путем трансформации дрожжевых клеток рекомбинантными плазмидами, содержащими Ту1-элемснт под контролем сильного дрожжевого промотора (Воеке с! а1., 1985; МеНог е( а!.. 19X5). При этом в клетке индуцируется цикл ретротранспозицин ТуI, связанный с образованием ВПЧ, содержащих интермедиаты обратной транскрипции ТуI и активность обратной транскриптазы. Ранее ВПЧ были обнаружены в культурах клеток дрозофилы; в настоящее время есть основания предполагать, что их образование связано с транспозиционным циклом ретротранспозонов дрозофилы. Но изучение экспрессии индивидуальных регротранспозонов дрозофилы представляет ряд проблем, поскольку в ее геноме содержится множество семейств разнообразных мобильных элементов. В последнее время для изучения экспрессии резротранспозонов дрозофилы разрабатываются методические подходы, основанные на использовании в качестве модельных систем культур клеток других видов дрозофилы И дрожжей-сахаромицетов. Такие исследования несколько лет назад были начаты в лаборатории молекулярной генетики высших организмов (ЛМГВО) ИОГен РАИ (Резник и др., 1988; 1990) и продолжаются в настоящее время. Было показано, что резротранспозон дрозофилы вызывает активацию образования в дрожжевой клетке ВПЧ ТуI-элемента (Резник и др., 1988, 1990). Механизм индукции

ретротранспозиции ТуI к настоящему времени недостаточно исследован. В свят с этим представляется актуальным исследование роли конкретных белков, в частности, обратной траискриптазы п индукции ретротранспозиции. Одним из распространенных методов и1учепия механизмов рстротранснознцни является использование генетически маркированных Ту-элсментов. Предпринятое нами исследование экспрессии гена люциферлы Phoiinus pyralis, клонированного под начало второй открытой рамки считывания (OPCII) Ту1-элеме1па, аналогичной pol-гену рстровирусов, представляет как научный, так и практический интерес. Настоящая работа входит в общий цикл исследовании, посвященных механизмам ретротранспозиции, которые проводятся в ЛМГВО ИОГен РАН.

Цель и зид»чи исследования. Целью работы являлось изучение экспрессии регрогранспозонов дрозофилы в клетках дрожжей-сахаромицетов и гетерологичной активации экспрессии дрожжевого Ту1-элемон1а. поиск возможных механизмов этой активации. Конкретной задачей было исследование ВПЧ. образующихся в клетках, трансформированных плазмндными векторами, содержащими ретротранспозоны дрозофилы. Для изучения роли обратной транскрнптазы в механтме гетерологнчной индукции экспрессии дрожжевого Tyl-элемейта было предпринято исследование индукции транспозиционного цикла Ту I-элемента ретропнрусной обратной транскрннтазой, эффективно экспрсссирующсися п дрожжевой клетке. Специальной задачей работы являлось исследование экспрессии в дрожжах tena люцнфера зы, клонированного под начало второй открытой рамки считывания (OPCI I) Tyl-элемснта, и упаковки люциферлы в транснозон-несушне UII4.

Научная иовкша работ. Нами было предпринято шучение экспрессии в дрожжевой клетке трех различных ретрогранспозонов дрозофилы - copia. 17.6 и gypsy. Мы показали, что все три исследованных нами ретротранссозона дрозофилы индуцируют в клетках дрожжей образование ВПЧ, содержащих Ту I-элемент, независимо от тина дрожжевого промотора (конститутивного или нндуццбельного). направляющего их экспрессию. Ото позволяет предположить, что гстерологнчная индукция образования ВИЧ Ту1-»леченюм - закономерное явление для ретрогранспозонов дрозофилы несмотря на значительные различия в их структуре. Таким образом, данные по гетерологичной индукции экспрессии Ту 1 ретротранспозоном дрозофилы gypsy (Резник и др., I4S8: IW0) были подтверждены нами на более обширном материале. Кроме того, мы показали, что пмерологичная индукция образования ВПЧ является результатом экспрессии ретрогранспозонов дрозофилы.

Нами впервые была покатана активация транспозиционного цикла ТуI-элемента в клетках дрожжей, эксмрсссирующих обратную транскриитазу 1ШЧ. Выло установлено, что в клетках, трансформированных вектором, содержащим последовательность обратной транскрнптазы ВИЧ под высокоэффективным дрожжевым промотором САР, индуцируется не только образование ВПЧ, содержащих полноразмерный ТуI-элемент, но и собственно транспозиция геномных Ту I-элементов.

В работе впервые было предпринято исследование упаковки в ВПЧ гетерологнчного белка, синтезируемого под контролем ОРСП Ту1-элемента, хотя подобные конструкции ранее создавались (Ме|1ог е! а!.. 1985). Было показано, что ген люциферазы светляка РЬо11Пиз ругаИэ, клонированный под начало ОРС11 Ту1-элемента. успешно экспрессируется в дрожжах. При этом активность люциферазы регистрируется в клеточных фракциях, содержащих ВПЧ.

Научно-практическое значение. Результаты работы могут быть использованы в практических разработках по созданию эффективных систем гетерологнчной экспрессии в дрожжах. Результаты исследования активации транспозиционного цикла Ту!-элемента гетерологнчнымн ретротранспозонами и обратной транскриптазой ВИЧ Могут быть использованы в дальнейших исследованиях механизма индукции ретротранспозшши. Методический подход к экспрессии в дрожжах индивидуальных ретротранспоэонов дрозофилы требует развития, перспективы которого обсуждаются ниже.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 11 Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ноябрь-декабрь, 1991 года, Пущино-на-Оке), IV Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия" (ноябрь-декабрь 1992 года, Пущино-на-Оке) и на семинаре лаборатории молекулярной генетики высших организмов ИОГен РАН 18 декабря 1995 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 paбof ы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (главы 1, 2, 3 И 4), методической части (глава 5), результатов экспериментов (главы б И 7) и их обсуждения (глава 8), выводов и списка литературы. Работа изложена на 127 страницах и включает 5 таблиц и 13 рисунков. Список литературы содержит 137 наименований, нз них 10 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАЬОП,I.

Главы I. 2. X 4. ОЬЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

В главе I раздела "Обзор литературы" представлена общая характеристика ретротранспозонов, рассматривается их многообразие. В главе 2 обсуждаются Ту-элеменш дрожжей-сахаромицетов и наиболее подробно представлены литературные данные, посвященные исследованию Tyl-элемента. В главе 3 рассмотрена структура н особенности экспрессии рстротранспозонов дрозофилы. В главе 4 обсуждаются возможности использования дрожжевых векторов для исследования экспрессии ТуI и гетерологичных ретроэлементов.

Глава 5. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae DBY746 (MA I à leu2-3,112his3-1ura3-52trpI-289), FK08 (MATaGAl/leu2-3.l l2his4-5l9adel-IOOura3-52) и 9399-7B (MATaGAL'ura3-52his4d29). Штамм DBY746 был любезно предоставлен И. И. Арман (Институт молекулярной генетики РАН); F808 и 9399-7В - присланы д-ром Дж.Финком (Cambridge. Massachusetts). Для размножения и сохранения плазмид. трансформации и отбора рекомбннантных клонов использовали штамм Е. coli BMH7IIK (lac pro)uhi supE1'lacloX ЛМ15 pro').

В качестве исходною материала для конструирования векторов, содержащих ретротранспоэоны Drosopliila nielanogaster, использовали плазм иды pMA9| (Melloret al., 1983), любезно предоставленную нам д-ром С. Кингсман (Oxford, UK), и рМТ34 (Handa it al., 1987), предоставленную д-ром 1. Фукасавт (Keyo Medical University) Эти плазмиды предеггавляют собой многокопииные автономно реплицирующиеся вектора, содержащие точку начала репликации дрожжевой 2 мкм ДНК и селективные маркеры I.EU2 (рМА91) и URA3 (рМТ34). рМА91 содержит промоторную и терминаторную последовательности РОК (фосфоглицсраткнназы): рМТ34 - промоторную и терминаторную последовательности гена GAL7. Фрагменты ДНК, содержащие ретротранспоэоны gypsy (МДГ4), copia и 17,6, были выделены из плазмид pDMlll (Baycv et al. 19X4), pCBIR (Flavell, Brierly, 1986) и ptnC (Inoye et al., 1984) соответственно, имеющихся в коллекции ЛМГВО. Для экспрессии обратной транскрнптазы ВИЧ была использована плаэмида pAB24/RT (Barr et al., I9P7), любезно предоставленная нам д-ром Ф Барром (Chiron Corporation). Она представляет собой многокопийную автономно реплицирующуюся плазмиду, содержащую последовательность обратной транскриптазы ВИЧ под контролем дрожжевого промотора GAT. Дчя конструирования векторов экспрессии . гена

люциферазы Photinus pyrahs под контролем Ту 1-члененга мы использовали плазмнду pGTyH3 (Поеке et al., 19X5). предоставлению д-ром Дж. Финком. Эта штмнда относится к многокопнйньтм автономно реплицирующимся докторам и содержит элемент 1у1И (класса Ту 1 ) под промотором GALI, селективный маркер URA3 и участок 2 мкм ДНК с точкой начала репликации. Фрагмент ДНК, содержащий ген люциферазы, выделяли из плазмнды pD0432 (Ow et al., 1986), предоставленной д-ром С. Хоуэллсм (University of California, San Diego). Эта плазмида содержит промотор вируса C.tMV, геи люциферазы Photinus pyralis и терминатор нопалинсинтетазного гена, клонированные в рЬ'С'19.

Мы сконструировали две серии векторов: I. pMACD, pMACO, pMAI7D, рМАГЯ), pMAGD и рМАОО, содержащие мобильные элементы дрозофилы copia, 17,6 и gypsy соответственно под промотором PGK в прямой или в обратной ориентации rio отношению к промотору; 2. pMTCD, рМТСО, pMTI7D. pMTI70, pMTGD и pMTGO, содержащие те же мобильные элементы под промотором GAL7 в прямой или п обра тон ориентации. Фрагменты ДНК, содержащие ретрозрансчозоии дрошфилы, у которых бы;» почти полностью сохранен З'-длинный концевой повтор (ДКП) и частично - L'5-обласгь 5'ДКП, встраивали в сайты клонирования плазмид pMA9l (Bglll) и рМТ34 (Bglll), расположенные между промоторной и терминаторной последовательностями PGK. и GAL7 соответственно. Фрагмент 17,6, полученный рестрикцией исходной плазмнды Clal, встраивали в дрожжевые вектора по тупым концам, предварительно обработав ДНК 17,6 и векторов фрагментом Кленова. К фрагменту ДНК copia, у которого был делетнрован 171 нуклеотид с 5'кошш с помощью Bat31, присоединяли ВатН 1-лннкеры и встраивали в Bglll-сайгы рМА91 и рМТ34 по комплементарным липким концам. Фрагмент gypsy клонировали по комплементарным липким концам Bglll. Все последовательности, необходимые для транспозиции - сайт связывания тРНК-праймеров и сайт полиаденилнропания - были полностью сохранены при переклоннротпми ретротранспозонов в дрожжевые вектора. Конструирование векторов проводилось совместно с М. Ю. Фонштейном (ВНИИ генетики и селекинн промышленных микроорганизмов).

Для конструирования векторов, содержащих вставку гена люциферазы в начале OPCII Ту I-элемента, мы использовали следующую схему клонирования. ДНК ТуНЗ рестрнциропали Bglll (Bo-:ke et al , 1985), выделяли фрагмент размером !0,2 г. и. н. и лигировали этот фрагмент но липким концам, в результате чего вновь образовывались кольцевая плазмида, у которой отсутствовали два Bgl! 1-фрагмемта - 1,2 т. п. и. и 1,6 т. п. и., представляющие собой большую часть ОРС11 Ту!-элемента. Лигазнои смесью трансформировали нпамм BMH7II8 Е. coli, из трансформантов выделяли плазмндную

ДНК и с помошыэ рестрнкцнонного анализа отбирали плазмиды, содержащие только одни сайт U¡íll I (при рестрикции таких плазмид Bgll I образуется линейная ДНК размером 10.2 т. п. II.). Для дальнейшей работы была использована одна из таких плазмид pGTyH3-А20. ДНК плазмиды pDO-432 рестрицировали BamHl и выделяли фрагмент размером 1,9 т. п. н. Этот фрагмент лигировали с ьектсром pGTyH3-A20, рестрицированным Bglll. Лшазмой смесью трансформировали штамм BMH7II8 Е. coli и отбирали плазмиды со педиками последовательности гена люцифсра?Ы методом гибридизации колоний с радиоактивно меченым ВашН I-фрагментом pD0432 1,9 т. п. н. Из колоний, дающих положительный сигнал, выделяли ллазмидную ДНК. Ориентацию вставки определяли рсстрикцпонным анализом. Кодон ATG гена люциферазЫ расположен на 80 п. и. ниже сайта рестрикции BamHl. При встраивании BamHl-фрагмента pD0432 1,9т. п. н. в Bglll-caiiT последовательности ТуНЗ, находящийся в позиции 1699, по комплементарным липким концам трансляция с A't G-кодона люцлферазы должна происходить в одной фазе с OPCII Tyl-элемента. При этом полностью сохраняется полноразмериая последовательность OPCI и начало OPCI I Ту I.

Выделение цлазмидной ДНК, рестрикции, лигироваиие, электрофорез ДНК, гибридизпцию колоний проводили по стандартным методикам (Маннатис и др.. 1984). Фрагменты ДНК выделяли из легкоплавкой агарозы (Маииатис и др., 1984) или из обычного 0.7% агароэного геля экспресс-методом (Erringion et al., 1990). Для трансформации E.coli использовали метод длительного хранения компетентных клеток, описанный ь руководстве (Методы молекулярной генетики и генной инженерии / Отв. ред. Р. И. Салганнн; 1990). В работе применялись ферменты производства НПО "Фермент" (г. Вильнюс).

Условия культивирования дрожжей и состав сред были описаны ранее (Захаров И др., 1984). Трансформацию дрожжей проводили по Ито и др. (Ito et al., 1983) с использованием LiOAc. Для анализа нуклеиновых кислот из ВПЧ дрожжи выращиьаии на минимальной среде с добавлением 20 мг/л урацнла, гистидина, лейцина и триптофана (в зависимости от генотипа Штамма) при 26°С и аэрации до концентрации клеток 10* - 10' кл/мл. Для индукции промотора GAL1 или GAL7 клетки, выращенные на минимальной среде с глюкозой, отмывали стерильным буфером состава (1/15 М K.H¡PO(, 1/15 М КгНРО<; рН 7,2) и переносили в синтетическую среду, содержащую 20 г/л галактозы, а затем растили до удвоения концентрации клеток. Для изучения экспрессии обратной гранскриптазы ВИЧ выращивание дрожжевых трансформантов проводили по Барру и др. (ÍJan et al., 1987). Для измерения активности люциферазы трансформанты растили на

минимальной среде с соответствующими аминокислотными добавками при 30°С и аэрации до концентрации клеток I06 - 10' кл/мл.

Геномную ДНК из дрожжей выделяли по стандартной методике (Клонирование ДНК: Методы/ Под ред. Д. Гловера; ¡988). Суммарную РНК из дрожжей выделяли по методике, описанной в работе Добсона и др. (Dobson et al., 1984), с некоторыми модификациями. Поли(А)РНК выделяли из препаратов суммарной РНК на колонке с полн(1))сефароэой фирмы LKB-Farmacia по методу МакКензи (McKenzie et al., Н/5). Рестрнкционный анализ, электрофорез и блоттинг ДНК проводили по стандартным методикам (Маннатис и др., 1984). Блот-гибридизацию РНК осуществляли по стандартной Northern-процедуре (Маннатнс и др., 1984) с некоторыми модификациями, описанными ниже.

Выделение и очистку обратной транскриптазы из дрожжей проводили по Барру и др. (Barrel al., 1987). В экспериментах использовали обратную транскрипт азу из фракции, не растворимой в 0 - 30% (NH^SO«. Активность обратной транскриптазы определяли, как описано в работе Веронезе и др. (Veronese et al., 1986).

ВПЧ из дрожжевых клеток выделяли по методике, описанной ранее (Gaifinkel et al., 1985), с некоторыми модификациями. Клетки, выращенные в необходимом объеме минимальной синтетической среды (обычно 0,5 л) с галактозой или глюкозой до концентрации IU4 - I07 кл/мл, осаждали центрифугированием при 0°С 4000об/мин, ресусИендировали в 10-15 мл буфера: 10 шМ Трис.НС1, 10 тМ ЭДТА, 100 mM NaCI; pH 7,4; диэтилпнрокарбонат до 0,1% - и снова осаждали при тех же условиях. К суспензии клеток добавляли равный объем стеклянных шариков диаме+ром 0,5 мкм и разрушали на Vortex в течение 3 мин (3 раза по I мин с интервалами 30 - 40 с) с охлаждением суспензии во льду. Затем клетки ресуспендировали в 15 мл того же буфера и озвучивали 10 раз по 10 с на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1. Суспензию осаждали при 10000 об/мин при 0°С 20 мин и отбрасывали осадок. Супернатант центрифугировали при 18000 об/мин (40000 g) 20 мин, затем при 26000 об/мин (100000 g) 1 час. Осадки от второго цейтрйфуги{х5Вания (р100) использовали доя выделения нуклеиновых кислот. Для выделения нуклеиновых кислот осадки рЮО гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в 500 Мкл буфера состава: 20 тМ ТрисНС1, 10 тМ ЭДТА, - добавляли додецилсульфат Na до 1% и инкубировали 20 мин при комнатной температуре. Нуклеинвые кислоты экстрагировали равным объемом фенола, Насыщенного 0,1 М Трис-HCI pH 8,0, отбирали водную фазу и повторяли экстракцию смесыо равных объемов фенола и хлороформа, а затем хлороформом. К водной фазе добавляли два обьема 96% этанола и инкубировали при -20°С t час или в течение ночи. Нуклеиновые кислоты осаждали центрифугированием при 12000 об/мин 5 мин при комнатной температур».

осадок подсушивали и растпоряли в необходимом объеме стерильной деионизованной воды. Для 6;гог-г ниридизашш нуклеиновые кислоты из ВИЧ разделяли в (% агарозном t еле. содержащем формальдегид в концентрации 2,2 М, в 25 шМ Na-фосфатном буфере pH 7,0. Для намерения на электрофорез пробы (10 мкг на I дорожку) растворяли в буфере состава: I2Í шМ Nu-фосфатный буфер, 50% формамид, 0,4% бромфеноловый синий -rrpoi рена.ш 15 мин при 55"С. сразу помешали в лед и добавляли формальдегид до 2,2 N1. После эдекрофорста нуклеиновые кислоты переносили на ннтроцеллюлозный фильтр (Schlcilier&SchuU) согласно стандартной методике Norihern-гибрндизации (Маниатис и др., 1984). Лналотчную процедуру осуществляли для блот-гибрндизацин суммарной и иоли(Л) i'ilK (см. р.ыше). Для гибридизации использовали радиоактивно меченые зонды: pDMIII. pCHiK, pinC (для идентификации последовательностей ретротранспозонов дрогофилм), Х1ю1-фрагмент плазмиды p(ns32 [I0J (для идентификации последовательности Ту I-элемента) и UumHi-фрагменг pD0432 (для идентификации последовательности тена люцнферазьг). В качестве маркера размеров использовали фрагменты ДНК" фага лямбда, рестрнцированной Hindi If. В качестве зонда для маркерных фрагментов использовали радиоактивно меченую нативную ДНК фага лямбда.

Для измерения активности люциферазы клетки ресуспендировали. в буфере L.EB -luciferase extraction buffer (Rüssel et al.. 1991) состава: 0,1 N1 K-фосфатный буфер pH 7,8: I мМ днтиотреитол: I мМ феннлметилсульфонилфлюорид (PMSK) - и разрушали стеклянными шариками, как описано выше. Суспензию не озвучивали, осаждали при 15000 g 15 миг. н отбрасывали осадок. Из супернатанта отбирали пробу на измерение активности люциферазы, а из остальной его части последовательным центрифугированием при 40000 g И ККЮ00 g получали фракции р40 и plOü. Для измерения активности люциферазы эти фракции гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и суспендировали в 40 мкл буфера LEB. Перед измерением к пробам добавляли буфер LAB -luciferase assay buffer (Rüssel et al., 19У1) состава: 25 мМ K-фосфатный буфер pH 7,8, 8 мМ MgCI¡. !% Тритон Х-100. I мМ ЭДТА. I дитиотрейтол - до конечного объема 40« мк.. и I мкл 100 мМ АТФ. Затем в реакционную смесь вносили 10 мкл I мМ D-люцифернна (Sigma) и немедленно измеряли пиковую эмиссию света на люмннометре LKB-I250 (не более 1 мин после добавления субстрата). Концентрацию белка в анализируемых пробах определяли спектрофотометрнческим методом Брэдфорда (Bradford. 1976).

Статистическую оценку достоверности результатов проводили по ¡-критерию Стьюдента (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 6. Гетерологичн.'я индукция образования ВПЧ и транспозиции Ту I-элемента.

Для изучения экспрессии трех ретротранспозонов дрозофилы - gvpsy ( МДГ4), 17,6 н copia - мы сконструировали два типа дрох.жевых векторов, содержащих данны.: мобильные элементы под конститутивным промотором РОК (на основе плазмиды рМА9|) или под индуцибельным промотором GAL7 (на основе плазмнды рМТ 3А). И обоих типах конструкции были представлены мобильные элементы как в прямой, так и в обратной ориентации по отношению к промотору. Векторами, сконструированными на основе плаэмиды рМА91, трансформировали дрожжевой штамм DBY746; векторами на основе рМТ34 - штамм F808, способный расти на среде с галактозой. Кроме того, были получены контрольные трансформанты DBY746::pMA9l (ТрМА) и F808::pMT34 (ТрМГ). Таким образом, нами было исследовано 14 типов дрожжевых трансформантоп. Митотическая стабильность гшазмид у всех исследованных нами трансформантоп составляла В среднем 87 - 90%. Каких-либо закономерностей в ее повышении или снижении не наблюдалось. Для исследования ВПЧ отбирали по три независимых трансформанта каждого типа. Трансформированные клетки DBY746 выращивали на среде с глюкозой; F8UÜ - на среде с галактозой (с индукцией промотора GAL7) или с глюкозой (без индукции) - и выделяли из них фракции р!00, как описано выше (гл. 5). Нуклеиновые кислоты из ВПЧ после электрофореза и блоггинга гибриднзовалн с мечеными зондами на мобильные элементы - pCBI8 (copia), plnC (17.6) и pDM 111 (gypsy). Ни для одного из исследованных нами трансформантов не была выявлена гибридизация со специфическими зондами на ретротранспозоны дрозофилы. Следовательно, ВПЧ, образующиеся В клетках трансформантов, не содержат последовательное гей ретротранспозонов дрозофилы. Для изучения гетерологнчной индукции ТуI-элемента ретротранспозонаМи дрозофилы нуклеиновые кислоты из ВПЧ всех полученных нами трансформантов DBY746 и F808 после электрофореза и блоттинга гибридизовали с радиоахтйвно меченым зондом На Ту 1-элемент. Положительная гибридизация нуклеиновых кислот из ВПЧ со специфическим зондом на ТуI-элемент наблюдалась только ДЛЯ трансформантов, содержащих плазмйды с ретротранспозонами дрозофилы в прямой ориентации по отношению к дрожжевому промотору. Длина гибридизуюше»:ся последовательности составляла 5.9 т. п. н., чго соответствует полноразмерному Ту 1-элеменгу. В случае обратной ориентации элемента по отношению к промотору гибридизация с зочдом на Tyl-элемент не выявлялась. ВПЧ из трансформантоп F808 содержали последовательности, тибридизукпциеся с зондом на ТуМлемент, только н том случае, когда трансформанты выращивали на среде с галактозой, т. е., в условиях

индукции промотора GAL7. Так как ВИЧ, содержащих ретротраиспоээны дрозофилы, обнаружен») in-, было, необходимо было установить, экспрессируются ли у полученных нами трансформантов ретротранспозоны дрозофилы. Для этого был выбран copia-элсменг. наиболее сходный по структуре И последовательности с Ту I-элементом. Из трансформантоя рМАСГ) выделяли поли(А)РНК и после электрофореза и блоттинга гиСрилиювал» ее с зондом на copia (рСВ18). У трансформантоя pMACD была выявлена мРНК, гнбриднзующуюся со специфическим зондом. Следовательно, мы можем предполагать, что ретротранспозоны дрозофилы, по крайней мере элемент copia, экспрессируются в дрожжах. Гетерологичную индукцию Ту!-элемента регротрапепозонами дрозофилы мы наблюдали только в том случае, когда ретротрзнспозон был клонирован в прямой ориентации по отношению к промотору, и только в условиях индукции в случае нчдуцибельиого промотора. Во всех остальных случаях ВПЧ, содержащие Tyl-элемент, не образуются. Исходя из этих данных, мы можем предположить, что индукция образования В!"1Ч, содержащих Tyl-элемент, является результатом экспрессии ретротранспоЗонов дрозофилы.

Для исследования роли обратной транскриптазы в механизме гетерологичной индукции Ту I-элемента Мы использовали систему, обеспечивающую высокий уровень экспрессии в клетке обратной транскриптазы ВИЧ (Ватт et al., I987J. Штамм DBY746 трансформировали плазмидой pAB24/RT. Чтобы проверить адекватность нашей системы описанной Ьарром с соавторами, мы оценивали экспрессию обратной транскриптазы в данном штамме дрожжей по двум параметрам: наличию в' клетке мРНК обратной транскриптазы и обратнотранскриптазнои активности. Для этого ПолщА)РНК, выделенную ид трансформантов DBY74tj;:pAB24/RT, госле электрофореза и блоттинга гибридизовали с ВатШ-фрагментом плазмиды pAB24/RT, содержащим последовательность обратной транскриптазы, а также промотора и терминатора GAP. В качестве контроля использовали полн(А)РНК, выделенную из нетрансформнрованных клеток DBY746. В клетках, трансформированных плазмидой pAB24/RT, была выявлена последовательность длиной 3,0 т. п. п., гнбридйзукнцайся с зондом. В нетрансформнрованных клетках последовательности, гибридизующнеся с зондом, не выявлялись. Кроме того, мы определили активность обратной транскриптазы в клетках DBY746, трансформированных плазмидой pAB24/RT, И в нетрансформнрованных клетках DBY746. Активность обратной транскриптазы измеряли По Включению меченого [JH]dTTP с использованием экзогенной матрицы poly(iA)/o¡igo(dT). В трансформированных клетках регистрировался высокий уровень активности обратной транскриптазы, сравнимый с полученным Барром с соавторами. Таким образом.

«спользованнык нами штамм позволяет успешно экспрессировать обратную -ранскриптазу ВИЧ.

Для исследования гетерологнчной индукции экспрессии ТуI-элемента обратной ранскриптазой ВИЧ нз трансформантов DBY746::pAB24/RT и нетрансформированных леток DBY746 выделяли фракцию ВИЧ и анализировали нуклеиновые кислоты методом «iorthern-гибрндизации со специфическим зондом на Ту I-элемент. Полученные 1езультаты показывают, что во фракции ВПЧ содержится РНК, соответствующая одноразмерному ТуI элементу. Для анализа транспозиций Tyl-элемента геномную ДНК, ыделенную из независимых клонов трансформантов DBY746::pAB24/RT и етрансформированных клеток DBY746 в качестве контроля, обрабатывали рестриктазой coRI, разделяли в агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозный фильтр, который ибридизовалн со специфическим зондом на ТуI. Мы наблюдали, что в клетках, рансформированных pAB24/RT, произошли транспозиции Tyl-элемента. так как азмеры фрагментов ДНК из независимых клонов трансформантов, гибридизующихся с оСЛедовательностью Tyl-элемента. различались. В нетрансформированных клетках IBY746 транспозиции геномных Tyl-элементов не выявлялись. Таким образом, репрессирующаяся в дрожжевой клетке обратнзя транскриптаза ВИЧ индуцирует элный цикл транспозиции геномных ТуI-элементов.

Глава 7. Экспрессия гена люциферазы Photirtus pyralis, клонированного под начало PCI 1 Tyl-элемента, в ВПЧ дрожжевых грансформантов.

В литературе оПИсан ряд систем, позволяющих экспрессировать гетерологичные гены 1Д контролем Tyl-элемента (Adams et al., 1987; Bowen et а!., 1984; Dobson et al., 1984; ¡allm el al., 1987; Mellor el al., 1985). Было показано, что при использовании для этой ли векторов, с которых гетерологнчная мРНК в трансформированных клетках 1анслируется в одной фазе с OPCI Tyl-элемента, полученный гибридный белок сковывается в ВПЧ (Adams et al., 1987; Malim et al., 1987). Упаковка в ВПЧ терологичного белка, синтезируемого в одной фазе с OPC1I Tyl-элемента, ранее не слсдовалась, хотя было показано, что в этом случае может быть получена эффективная спрессия (Mellor et а!., 1985). Для исследования упаковки в Ту1-Несущие ВПЧ терологичного белка - люциферазы светляка Photinus pyralis - на основе многокопийной тономно реплицирующейся плазмиды рОТуНЗ мы сконструировали три вектора: }ТуНЗ-А20, pGTyH3-lucl7 и pGTyH3-luc!8. pGTyH3-A20 является частично легированным производным pGTyH3 и содержит OPCI Н Начало ОРСП Tyl-элемента. 5ТуНЗ-А20 был использован нами как исходный вектор для клонирования гена

люциферазы Phclinus pyralis из pD0432 под начало OPC1I 1 уI. С этой целы полноразмерную кодирующую последовательность гена люцифераЗы, представляющу" собой BamHl-фрагмент плазмиды pD0432, встраивали в уникальный сайт Bgti I рОТуН; А20. Таким образом мы получили два вектора - pOTyH3-lucl7 и pOTyH3-lucl8. pOTyH3-lucl7 ген люцйферазы клонирован под начало OPCII Ту-элемента; в рОТуН: lue 18 этот ген встроен в обратной ориентации по отношению к направлению трансляции OPCI1. Дрожжевой штамм 9399-7В, способный расти На среде с галактозо! трансформировали плазмндами pGTyH3-A20 (в качестве контроля), рОТуНЗ-1ис17 рОТуНЗ-luclB. Трансформанты (Т-А20, T-lucl7 и T-Iucl8) выращивали на среде галактозой (с индукцией промотора GALI) или на среде с глюкозой (без индукции), экспериментах использовали по три независимых трансформанта для каждого вариат конструкции. Активность люцифераэы измеряли в трех фракциях: клеточных лизатах осадках после центрифугирования этих лизатов при 40000 g и при 100000 g, обозначеинь нами как р40 и р100 соответственно. Фракции р100, как было показано ранее, долж! содержать ВПЧ (Garfinkel et al., 1985). Активность люциферазЫ измеряли соглас) методике, описанной Расселом и Др. для определения активности люциферазЫ в клетк; Дрожжей (Rüssel et al., 1991). Результаты измерения представлены в таблице, контрольных трансформантов Т-А20 и T-Iucl8 как без индукции, так и в у слови, индукции активность люциферазЫ не выявлялась. Из таблицы видно, что з-рансформантоэ Т-1ис|7, выращенные на среде с галактозой, активность Люцифера: достоверно выше, чем у тех же трансформантов, выращенных на ергде с глюкозой (б индукции). Следовательно, ген люцйферазы экспресснруется под контролем ОРС11 Т> элемента у трансформантов Tluci7. Максимальные значения активности люцнфера: (колонка 2) сравнимы с полученными Расселом с соавторами (Rüssel et al., 199 Максимальная активность люцйферазы у трансформантов T-lucl7 в условиях индукц промотора наблюдается по фракции р40. Чтобы проверить, содержат ли ВПЧ мРК люциферазЫ, мы провели гибридизационнЫй анализ нуклеиновых кислот из pl полученных нами трансформантов. Очень слабую гибридизацию со специфическ зондом на люцяферазу наблюдали для нуклеиновых кислот из ВПЧ T-lucl7 и T-luc Размер гибридиэующегося фрагмента соответствовал 3,3 т. п. И., что ожидается i гибридной конструкции TYA/TYB/ltic. Так как во фракции р100 содержится Pf люцйферазы и регистрируется ее активность, хотя ее значения на порядок ниже, чем в р мы можем считать, что Некоторая часть ЛюциферазЫ, экспрессирующейся под контро/ ОРС II Ту-элемента, находится и ВПЧ. Так как максимальная активность ферме! наблюдается в постмитохондриальной фракции р40, можно предположить, что в кле

образуется два типа ВПЧ, оказывающиеся в разных фракциях при использованном нами методе выделения.

Таблица. Активность люниферазы в клетках штамма 9399-7В, трансформированных плазмндон рОТу113-1ис17.

Фракция лизат р40 рЮО

Ulum/мг1: 1 т 3

с индукцией •4. 276 13, 67Х 0, 475

4, 70S 14,312 0, 625

8, 406 15, 625 0, 529

nil1 5. 796 14, 538 0, 543

без индукции 0, 011 0. 050 0,021

0, 017 0, 020 0, 055

0, 067 0,025 0, 043

шг 0, 032 0, 032 0, 039

d- 5. 764 14, 506 0, 504

Разность d (I) достоверна при Р " 95%, разности d (2) и d (3) - при Р = 99, 9%. Достоверность разности оценивали по t-крнтерию Стьюдента (Лакни и др., 1990).

Примечания: I - приведены значения пиковой активности люниферазы в условных единицах люминесценции (Ulum) в пересчете на 1 мг белка; 2 - средние данные для 3-х независимых трансформантов; d' - разность значений активности с индукцией и без индукции.

Г лава X. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей работе изучалась экспрессия 3-х ретротранспозонов дрозофилы - copia, 17,6 и gypsy - в клетках дрожжей-сахаромицетов. Для этого мы использовали модельную :исгему, разработанную ра.чее для искусственной индукции транспозиций Tyl-элемента Boeke et al., 1985; Mellor et al., 1985). Впервые попытка воспроизведения транспозиционного цикла ретротранспозона gypsy была предпринята Резник с :оавторамн (Резник и др., 1988; 1990). Они показали, что в клетках, трансформированных

и

плазмидой, содержащей элемент gypsy под дрожжевым промотором РОК, образуются ВПЧ, не содержащие последовательностей ДНК и РНК gypsy и белков, кодируемых этим ретротранспозоном, но содержащие ДНК, РНК и обратную транскриптаэу Tyl-элемента. В настоящей работе для экспрессии ? дрожжах ретротранспоэонов дрозофилы были использованы два типа промоторов - конститутивный (PGK) и индуцибельный (GAL7). Мы сконструировали вектора, содержащие последовательности ДНК ретротранспоэонов как в прямой, так и в обратной ориентации по отношению к дрожжевым промоторам, и проанализировали нуклеиновые кислоты из ВПЧ клеток, трансформированных сконструированными нами плазмидами. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ВПЧ, образующиеся в клетках трансформантов, не содержат никаких последовательностей, гомологичных ретротранспозонам дрозофилы. Отрицательный результат в каждом случае стабильно воспроизводился для 3-х независимых трансформантов. При этом все три исследованных ретротрансцозона дрозофилы индуцировали в клетках дрожжей образование ВПЧ, содержащих геномные Tyl-элемситы. Эта индукция наблюдалась только в том случае, когда ретоотранспозон дрозофилы было клонирован в прямой ориентации по отношению к дрожжевому промотору, и только в условиях индукции в случае использования нндуцибельиого промотора. Поэтому мы можем утверждать, что образование ВПЧ является следствием экспрессии ретротранспозонов дрозофилы. Вопрос о механизме репрессии транспозиции и ее индукции был давно поставлен различными исследователями и до сих пор окончательно не разрешен. Известно, Что в обычной дрожжевой клетке, несмотря на весьма сильную транскрипцию геномных копий Tyl-элемента и избыточность его РНК, транспозиция ТуI практически не Наблюдается. В описанных нами случаях образование ВПЧ, содержащих Tyl-элемент, индуцировалось тремя различными ретротранспозонами дрозофилы, значительно различающимися по структуре и последовательности. Так, ( элемент copia относится k.copia-rpynne ретротранспозонов, а 17,6 и gypsy - к gypsy-rpynne. Эти две группы ретротранспозонов различаются по порядку расположения доменов, а также имеют ряд других Принципиальных различий (Sandmeyer et al., 1990). Последовательности обратных- транскриптаз различных ретроэлементов достаточно консервативны, и все они в той или иной степени гомологичны последовательностям обратных транскриптаз ретровйрусов. Поэтому можно предположить, что имение обратная транскриптаза ретротранспозонов играет определенную роль в запуске транспозиционного цикла Ту)-элемента. Резник с соавторами была продемонстрировав зависимость стадии, до которой индуцируется транспозиционный цикл Ту 1, oí актвности обратной транскрнптазы в клетке при его гомо- и гетерологичиой ш-дукцш

(Резник и др., 1990). Ретротранспозэн gypsy индуцирует цикл Ту 1-элемента только до стадии образования ВПЧ (при этом транспозиция геномных Tyl-элементов не происходит), а активность обратной транскриптазы в клетках, трансформированных плазмидой с элементом gypsy под дрожжевым промотором, в 5 раз ниже, чем при введении в клетку экзогенного Tyl. Таким образом, данные, полученные Резник с соавторами (Резник и др., 1988; 1990) и в настоящей работе, позволяют предложить нетрадиционный методический подход к исследованию механизмов регуляции ретротранспозиции Tyl, оснозанный на ее гетерологичной индукции. Такой подход позволяет выделить роль конкретны* белков, участвующих в запуске цикла ретротранспозиции. Поэтому следующим шагом предпринятого нами исследования было Изучение роли обратной транскриптазы в этом процессе. Для этого мы использовали систему, обеспечивающую высокий уровень экспрессии в дрожжах обратной транскриптазы ВИЧ (Вагг et al., 1987). Мы показали, что в клетках дрожжей, экспрессирующих обратную транскриптаэу ВИЧ, наблюдается образование ВПЧ, содержащих полноразмерный Tyl-элемент, и транспозиция геномных Tyl-элементов. Можно предположить, что экспрессирующаяся обратная транскриптаза, используя в качестве матриц имеющиеся в клетке полй(А)РНК Tyl, образует соответствующие транспозиционные интермедиаты, встраивающиеся затем в геном. При этом ВПЧ, образующиеся в клетке, должны представлять собой иуклеопротеиновые комплексы обратная гранскриптаза-мРНК Tyl, которые могут отличаться по своим свойствам и структурной организации от ВПЧ, индуцируемых экзогенным Ту!-элементом. Так как теоретически в том И в другом случае общее соотношение белков и РНК в ВПЧ должно быть одинаковым, частицы, образуемые обратной транскриптазой ВИЧ и геномными Tyl, Попадают в одну й ту же фракцию при использованном нами методе выделения. Однако, известно, что для образования ВПЧ необходимы структурные белки, кодируемые 0РС1 Ту. Поэтому можно Предположить другой механизм: высокий уровень эбратиотранскриптазной активности в клетке запускает обычный цикл ретротранспозиции Tyl. Возможно, дейсгГВуют оба эти механизма, так как существует обратная связь между активностью обратной транскриптазы и Индукцией гранспозициомного цикла Tyl (Резник и др., 1990).

Для анализа белков, составляющих ВПЧ, различными исследователями была показана юзможность использования маркерных гетерологичных генов (в частности, альфа-2-штерферона человека и env-rena HIVI), клонированных таким образом, что их кспрессия направлялась OPCI Tyl (Adams et al., 1987; Malim et al., 1987) или OPC11 Tyl-лемента (Mellor et al., 1985). В первом случае гетерологичный белок, синтезирующийся а

дрожжевых клетках, упаковывается ь ВПЧ, что значительно облегчает его очистку. В случае экспрессии гена альфа-2-ннтерферона, клонированного под начало OPCII, ВПЧ не исследовались, хотя в клетках была зарегистрирована достаточно высокая активность альфа-2-интерферона (Mellor et al., 1985). Мы предприняли исследование упаковки в ВПЧ гена люциферазы Photinus pyralis, клонированного под начало OPCII Tyl-элеменга. Активность люциферазы достаточно легко тестируется, в связи с чем ген люциферазы в последнее время активно используется в качестве маркерного, в основном, в растительных системах, кроме того, была показана достаточно высокая экспрессия этого гена в дрожжах-сахаромицетах (Rüssel et al.. 1991). Высокая активность люциферазы была обнаружена нами в клетках, трансформированных вектором рОТуНЗ-1ис17, содержащим ген lue, клонированный в прямой ориентации по отношению к направлению трансляции с OPCII. Активность наблюдалась главным образом в клеточной постмитохондриальной фракции, обозначенной нами как р40 согласно условиям ее выделения. Абсолютны« значения активности люциферазы в этой фракции были сравнимы с полученным» Рэсселом с соавторами для конструкций, содержащих ген люциферазы под контроле» промоторов L-A (белка киллерных частиц дрожжей) И полиовируса (Rüssel et al., 1991) Активность регистрировалась только в клегках, выращенных на среде с галактозой, ti есть, в условиях индукции промотора GALI. ВПЧ, содержащие гибридные белк! TYB/люцифсраза. по-видимому, попадают в более "тяжелую" фракцию, так как могу содержать непроцессированные формы гибридного белка в связи с повреждение» последовательности Tyl-протеазы в процессе клонирования. Это предположение требую серьезной экспреиментальной проверки, в частности, иммунологического анализа белко из обеих фракций.

ВЫВОДЫ

I. Образование в клетках дрожжей ВПЧ, содержащих полноразмерный Tyl-элемент, индуцируется ретротранспоэонами Drosopliila melanogaster copia, '7,6 и gypsy (МДГ4) под конститутивным или нндуцибельным дрожжевыми промоторами только в том случае, когда ретротранспозон клонирован в прямой ориентации по отношению к промотору, а 1ри использовании нндуцмбельного промотора - только и условиях его индукции, Следовательно, активация образования транспозон-несущих ВПЧ дрожжей является результатом экспрессии ретротранспозонов дрозофилы.

!. Экпрессия обратно!! транскриптазы ВИЧ в дрожжах активирует транспозиционный 1Икл геномных Tyl-элеменгов.

I. Сконструирован вектор, позволяющий получить высокий уровень экспрессии гена юцнферазы Phoiinus pyralis. клонированного под начало OPCII Tyl-элемента дрож>м;н. . В клетках дрожжей-сахаромицетов, трансформированных вектором, содержащим ген юцнферазы Phoiinus p\ralis, клонированный под начало ОРС!1 Tyl-элемента под онтролем индуцибельного дрожжевого промотора. активность люциферазы егнстрируется только в условиях индукции промотора главным образом в остмитохондриальнои клеточной фракции и во фракции, содержащей ВПЧ.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кидготко О. В., Резник Н.Л., Шуппе Н. Г. Изучение возможностей практическо использования дрожжевых векторов экспрессии, содержащих ретротранспозоны. - Т< докл. 11 Всесоюзной планово-отчетной конференции по направлению "Генная и клеточн ннженерня"(ноябрь - декабрь 1991 г., Пущино-иа-Оке). - М., 1992.

2. Кидготко О.В., Резник Н.Л., Свирская Л.И., Шуппе Н.Г. Создание систс позволяющих получать высокий уровень экспрессии чужеродных генов в дрожжах. - Т докл. Всероссийской планово-отчетной конференции по направлению "Генная клеточная инженерИя"(ноябрь-декабрь 1992 г.. Пущино-на-Оке). - М., 1993. - с.93.

3. Резник Н.Л., Кидготко О.В., Шуппе Н.Г. Активация транспозиционного цикла 1 элемента обратной транскриптазой вируса иммунодефицита человека в дрожа Saccharomyces cerevlsiae. - Доклады Академии Наук СССР, 1991, т.31й, 3, с. 739-742.

4. Резник Н. Л., Кидготко О. В., Шуппе Н. Г. Гетерологичная индукг ретротранспозиции Tyl: обратная транскриптаза играет ключевую роль в запуске ци> ретротранспозиции. - Генетика, в печати.

Тип. Mbutf'i.jatSt тир go (9/,j-9b'