Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфизм вирусоподобных частиц ретротранспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Полиморфизм вирусоподобных частиц ретротранспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей"

Российская Академия Наук

Институт Общей Генетики им. Н.И. Вавилова

Золотова Лариса Игоревна

ПОЛИМОРФИЗМ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В КЛЕТКАХ ДРОЗОФИЛЫ И ДРОЖЖЕЙ

03.00.15 - генетика

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 575.11: 595. 773. 4

Автореферат

Москва -1997

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики высших организмов Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.

Научный руководитель: доктор биологических наук Н.Г. Шуппе

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Г.Д. Засухина доктор биологических наук В.Г. Митрофанов

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится "_" _1997 года в_часов

на заседании специализированного совета Д002.49.01 при Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (117809, ГСП-1, Москва В-333, ул. Губкина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

Автореферат разослан "__"___ 1997 г,

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Полухина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Ретротранспозоны представляют собой класс мобильных элементов, схожих с ретровирусами позвоночных по структуре и функциональным свойствам [Finnegan, 1989]. Ретротранспозоны имеют обширное распространение, и по-видимому, в отличие от ретровиру-сов, присутствуют во всех эукариотических организмах. Обладая способностью вызывать генные перестройки, они являются немаловажным фактором эволюции. К настоящему времени открыто большое число семейств ретротранспозонов, каждый из которых имеет структурные особенности и функциональные различия [Arkhipova, 1995]. Широко изучаются механизмы вызываемых ими перестроек генома. Известно, что ретротранспозоны распространяются путем вертикальной передачи, однако, в последние годы накапливаются данные, свидетельствующие о возможности горизон-тального переноса [Kim, 1994; Song, 1994]. В жизненный цикл ретротранспозонов входит стадия образования вирусоподобных частиц (ВПЧ), в которых происходит обратная транскрипция последовательности ретротранспозона. Именно ВПЧ являются фактором передачи ретротранспозонов fShiba, Saigo 1983]. Морфологические особенности ВПЧ, стадии их формирования, локализация в клетке, сходство и различия ВПЧ различных семейств ретротранспозонов - все эти аспекты требуют изучения.

Научная новизна и практическая ценность работы

Ретротранспозоны могут быть использованы для создания новых векторов, а также как модельная система для изучения регуляции экспрессии эукариотических генов. Изучение структуры и особенностей функционирования ВПЧ, как важнейшего этапа жизненного цикла ретротранспозонов необходимо для понимания эволюции ретроэле-ментов. В данной работе впервые ставятся задачи идентификации и

ультраструктурной характеристики ВПЧ ретротранспозонов. Возможность морфологической идентификации может оказаться полезной для решения генно-инженерных проблем, диагностики ретровирусных инфекций и биотехнологических процессов.

Цель и задачи исследования

Целью работы является изучение этапа ретротранспозиции, связанного с ВПЧ. Важнейшей задачей при этом становится идентификация и ультраструктурная характеристика ВПЧ различных семейств ретротранспозонов в клетках культуры ОгоэорЬПа те1аподаз1ег и дрожжей ЗассЬаготусеэ сегеу'^ае. Основной проблемой в решении этой задачи для ВПЧ дрозофилы является наличие в клетках вирусов не ретровирусной природы, и одновременно нескольких семейств ретротранспозонов. При фракционировании частиц известными методами ВПЧ и вирусы совыделяются в одной фракции, поэтому выделить ВПЧ конкретного семейства ретротранспозонов до настоящего времени не удавалось. Решение данной проблемы возможно с помощью нового метода фракционирования электрофорезом. Для изучения ретротранспозонов дрожжей препятствием служит другая проблема - необходимость индукции транспозиции трансформацией плазмидой, содержащей последовательность ретротранспозона. При этом происходит индукция транспозиции как эндогенных, так и транс-позонов плазмиды. Одной из задач работы являлось изучение ВПЧ экзогенных ретротранспозонов при использовании вр1-3 мутантного штамма дрожжей, в клетках которого' не происходит индукции эндогенных элементов.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались на научном семинаре "Молекулярные механизмы генетических процессов" Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН ( 23.11. 1996). Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 85 страницах и иллюстрирована 21 рисунком. Список литературы включает 84 работы, в том числе 74 на иностранных языках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация ВПЧ, фракционированных электрофорезом

В работе использовались линии клеток двух видов дрозофилы: D. viriiis- 79fDv3g [Hooks, 1975], D. melanogaster- 67j25D [Flavell, 1986]. Выделение ВПЧ из клеток дрозофилы проводили по модифицированной методике Wray и Stabblefield [Wray и Stabblefield, 1970]. Фракцию ВПЧ очищали при помощи высокоскоростного равновесного центрифугирования в градиенте сахарозы 20-60% по модифицированному методу Shiba и Saigo [Shiba и Saigo, 1983]. Осадок очищенных ВПЧ суспендировали на льду в буферном растворе для нанесения (90 мМ трис-борат РН 8,9; 0,05 (w/v) бромфеноловый синий). После получения однородной суспензии, ВПЧ сразу же наносили в карман горизонтального 1% агарозного геля, приготовленного на 90 мМ трис-боратном буфере РН 8,9, без добавления ЭДТА. Электрофорез проводили при 1 V/см при 4еС в течении не менее, чем 16 часов для оптимального разделений полос ВПЧ. Для предотвращения формирования нежелательного градиента РН была предусмотрена ре-

циркуляция электрофорезного буферного раствора. В карман геля

»

шириной 1 см наносили препарат ВПЧ, выделенный из 3x10 клеток (10-15 мг по белку). Локализацию ВПЧ ретротранспозона определяли по гибридизации с [32Р] меченой ДНК плазмиды, содержащий, ретро-транспозон. Используемая в работе плазмида pi7V-59, содержащая полноразмерную копию ретроэлемента 7V1, описана в работе [Андрианов, 1994]. Вектор pDm 111, содержащий полноразмерный gypsy, описан в работе [Резник,1988]. Плазмида рСВ18, содержащая ретротранспозон copia, получена от Flavell [Flavell, 1986]. Схемы плазмид, используемых в работе, представлены на рис.1. Для блот-гибридизации ВПЧ были разрушены последовательным вымачиванием геля в течении 15 мин в 100 мМ ЭДТА РН 8,0 и в течении 15 мин в дистиллированной воде. Затем нуклеиновые кислоты были непосредственно перенесены на нейлоновую мембрану (PALL) с использованием стандартных методов блоттинга [Маниатис,1984]. Реовирусы выявляются . при окраске бромидом этидия (1 мг/ мл) в виде полос. Для получения препаратов частиц после фракционирования электрофорезом, в зоне геля, содержащей ВПЧ, делали надрезы скальпелем, куда помещали сетки с формваровой пленкой на 10 мин, после чего их вынимали и окрашивали методом негативного контрастирования 1% водным раствором уранилацетата. Препараты просматривали в электронном микроскопе JEM-100CX при ускоряющем напряжении 80kV и инструментальном увеличении 60000. Размеры частиц измеряли на фотопластинках, доверительные интервалы изменчивости диаметров ВПЧ определяли на 2 уровне вероятности безошибочных прогнозов Ь=0,95 с помощью критерия Стьюдента.

TYAPr ïntRT

рРТХ

TYA

рРТХ-А9

ОРС

Рг Int

RT

ОРС1

ОРС2

рев-is

ОРСЗ^

Рг RT lnt|,.r£>

ОРС1 ...°-РС2„_ОРСЗа,.

Pr RT Int

Dm-111

pf7V-59

Рис. 1. Схема строения плазмид, используемых в работе.

На рис.2 представлен результат фракционирования очищенной-фракции ВПЧ из клеток D.melanogaster. В секции А приведен гель, окрашенный бромидом этндия. На дорожке 1 фракционированы на-тивные ВПЧ. Окраска выявляет две полосы, соответствующие частицам реовирусов. ВПЧ ретротранспозонов остаются невидимыми из-за их существенно меньшей копийности, и могут быть локализованыпо-сле блот-гибридизации с [32Р]-меченой ДНК соответствующегозонда. На дорожке 2 фракционированы нуклеиновые кислоты, освобожденные из частиц после обработки их фенолом. Видимые полосы соответствуют двухцепочечной РНК реовирусов [Алаторцев, 1983]. В секции Б и В представлены результаты Саузерн-блот гибридизаций фильтра, полученного с геля, приведенного в секции А. В качестве зондов использованы 1,8 т.п.н. Hind -Pst внутренний фрагмент copia, меченый [32Р] и 7 т.п.н. Xho внутренний фрагмент gypsy, меченый

РИС.^Фракционирование ВПЧ рстрогранспозонов дрозофилы: А,Б,В- ВПЧ из клеток D.melànogaster, линии 67j25D; Г, Д - из клеток D.virilis, линии 79r?Dv3g.

A. Гель окрашенный бромидом этидия: дорожка 1 - нативные ВИЧ, выделенные из 3)4 0 клеток (стрелки указывают локализацию частиц реовирусов); дорожка 2 - нуклеиновые кислоты из ВПЧ после обработки фенольной депротеинизацигй.

Б, Бяоттинт по Саузерну геля, приведенного в секции А, с последующей гибридизацией с [ ■"PJ-мечснным 1,8 т.п.н. HindIII - PstI внутренним фрагментом copia. Стрелка указывает локализацию частиц copia ка дорожке 1. Полоса размеров 5,4 т.п.н. соответствует двухцепочеч-ной линейной ДНК copia, освобожденной из частиц поело обработки фенолом.

B. Перегибридизация фильтра, приведенного в секции Б, с рР]-меченым 7 т.п.н. Xhol-внутренним фрагментом gypsy, после удаления зовда copia. Стрелка указывает на локализацию частиц gypsy на дорожке 1. Полосы на дорожке 2 соответствуют ДНК-РНК гибридным формам gypsy.

Г. Гель, окрашенный бромидом этидия (стрелки указывают локализацию реовирусов): дорожка 1 - ВПН>выделенные из кАотегок, обработанные хлороформом; дорожка 2 - нативные ВПЧ ич такого же количества клеток.

Д. Блоттинг по Саузерну геля, приведенного в секции Г. с последующей гибридизацией с р>]-меченной ДНК плазмиды pf7v-59. Полоса размером 7 т.п.н. на дорожке 1, соответствует двухцепочечнойДНКТу!, освобожденной из частиц после обработки хлороформом.

S

[с2Р] (рис.2,Б и В, соответственно). Полосы гибридизаций на дорожках (рис.2, Б1 и В1), отмеченные стрелками, соответствуют зонам миграции нативных частиц copia и gypsy. Разрушение частиц фенолом приводит к исчезновению этих полос и появлению других, соответствующих по подвижности. ДНК формам copia и gypsy, освобожденных из частиц [Flavell, 1986]. При соблюдении постоянных условий : РН элек-трофорезного буферного раствора, ионной силы, напряженности электрического поля и концетрации агарозы, подвижность ВПЧ является постоянной величиной. Локализация частиц, единожды выявленная блот-гибридизацией, в дальнейшем определяется по обычным маркерам молекулярной массы. В выбранных условиях электрофореза (рис.2) частицы copia мигрируют с той же скоростью, что и двухцепочечные молекулы ДНК размером 1,8 т.п.н., а частицам gypsy соответствуют молекулы ДНК размером 5,4 т.п.н. Постоянная локализация частиц дает возможность выделять их из геля для ультраструктурного исследования. Для этого в определенные в предварительных экспериментах зоны геля были помещены сетки с подложкой на 10 мин. Препараты, полученные методом электрофоретического фракционирования были использованы для электронно- микроскопического анализа. Фотографии частиц copia, gypsy и реовирусов из клеток D.melanogaster приведены на рис.3 (А,Б,В,Г). В зоне геля, соответствующей ретротранспозону copia, обнаружены частицы округлой формы диаметром 50*3 нм (рис.3,А) и соответствуют описаниям, приведенным в литературе [Shiba, Saigo, 1983]. Центрально расположенная, негативно окрашенная сердцевина имеет диаметр 27±3 нм, толщина капсида колеблется от 10 до 13 нм. Поверхность частицы выглядит плотной и гладкой, наружная оболочка отсутствует. Схема строения частицы copia приводится на рис.4,А.

Электронные микрофотографии вирусных частиц из клеток культуры Drosophila melanigaster. Частицы окрашены методом негативного контрастирования. Увеличение: 300 ООО.

A. ВПЧ copia, Б. ВПЧ gypsy,, имеющие наружную оболочку,

B. капсиды gypsy, Г. реовирусы.

Ю

в

Рис.4. Схема строения вирусных частиц : А- ВПЧ copia и Ту1, Б- ВПЧ gypsy и Tv1, В- Капсиды gypsy и 7V1, Г- реовирусы. Обозначения: 1 -сердцевина вирусной частицы, 2-капсид, 3-внешняя оболочка.

ВПЧ gypsy, выделенные из геля разделяются на два типа. Первый тип-округлые частицы, диаметром 67±3 нм (рис.З.Б), имеют внешнюю оболочку, толщиной около 8-9 нм. Вероятно, внешняя оболочка имеет мембранное происхождение и образуется при почковании частиц от клеточных мембран. Второй тип - икосаэдрические капсиды 50±3 нм (рис.3,В), лишенные наружной оболочки. Стенки капси-дов, окрашенные негативно, толщиной около 7 нм, имеют регулярно расположенные утолщения. Диаметр электронноплотной сердцевины 35±3 нм, в этой структуре имеются неравномерные светлые вкрапления, что свидетельствует о сохранности нуклейпротеида. Схема строения ВПЧ gypsy приведена на рис.4,Б; капсидов - на рис.4,В. Количество капсидов в несколько раз превышало количество частиц с внешней оболочкой. Реовирусы, выделенные тем же способом из полос на геле, окрашенных бромидом этидия, имеют диаметр 57±3 нм, правильную округлую форму, сердцевину диаметром 38*3нм, двуслойный капсид (рис.3,Г) толщиной около 10-12 нм. Вирусные частицы компактные, с характерной плотной наружной поверхностью . Схема строения частиц реовирусов приводится на рис.4,Г.

На рис.2, Г и Д представлен результат фракционирования ВПЧ ретротранспозона TV1 из клеток D.virilis. Ретротранспозон Tv1 обнаружен сравнительно недавно имеет три открытых рамки считывания и относится к группе gypsy. ВПЧ Tv1 содержат ДНК размером 7 т.п.н. [Андрианов, 1994]. В выбранных условиях фракционирования электрофорезом частицы Tv1 входят в гель на расстояние 1-2 мм. Tv1 также, как и gypsy, выделяется в двух формах. Частицы TV1 первого типа, сферической формы, имеют диаметр Б8*3нм (рис.5, А), и кроме капсида имеют наружную оболочку, толщиной около 8-10 нм. Как и вслучае gypsy, частиц первого типа в несколько раз меньше, чем кап-сидов, лишенных внешней оболочки. Капсиды Tv1, диаметром 52±3 нм, икосаздричесхой формы, также имеют регулярно расположенные утолщения, несколько менее выраженные, чем у капсидов gypsy. Толщина капсида около 7 нм, окрашивается негативно (рис.5,В). Диаметр сердцевины 36+3 нм. Строение обеих форм Tv1 соответствуют схемам, приведенным на рис.4,Б и В. Оба типа частиц gypsy также присутствуют в клетках D.virilis, и имеют размеры и морфологию совершенно аналогичную таковым для ВПЧ, выделенных из клеток D.melanogaster (рис.3,Б,В). Вероятно, в жизненный цикл ретротранс-позонов gypsy и Tv1 может входить и внеклеточная стадия, что отражается на их структуре и свойствах. Это вполне согласуется с данными, свидетельствующими в пользу предположения о способности ВПЧ ретротранспозонов переносить генетический материал [Song,1984]. Следует отметить, что как в средовых, так и в цитоплазматических фракциях содержались все описанные типы частиц.

Изучение ВПЧ ретротранспозонов показало наличие полиморфизма этих структур [Arkhipova,1S95], Полиморфизм может быть вызван двумя причинами. Первой причиной является наличие нескольких семейств ретротранспозонов в одной клетке. Вторая при-

?ik:5. Электронные микрофотографии вирусных частиц из клеток культуры Drosophila virilis. Частицы окрашены методом негативного контрастирования. Увеличение: 300 ООО.

A.'ВПЧ Tv1, имеющие наружную оболочку, Б. капсидыТИ,

B. ВПЧ gypsy, имеющие наружную оболочку, Г. капсиды gypsy, Д.реовирусы.

Ш5

riV^

чина состоит в том, что ВПЧ каждого семейства проходят несколько этапов созревания. Ретротранспозоны, имеющие три открытых рамки считывания, должны быть представлены двумя типами частиц: белковыми капсидами и полноценными ретровирусными частицами, имеющими внешнюю липмдосодержащую оболочку. Можно предположить, что они соответствуют разным стадиям ретротранспозиции. По аналогии сретровирусами, возможно, что ВПЧ, имеющие наружную оболочку, представляют собой зрелые, инфекционные частицы. Вероятно, в капсидах ретротранспозонов происходят промежуточные стадии развития: обратная транскрипция РНК и процессинг белков [Gorelova,198S]. Такое предположение требует дальнейшей проверки путем более подробного фракционирования частиц. Образование и аккумуляция частиц ретротранспозонов определенного типа не всегда приводит к завершению цикла ретротранспозиции. В клетках дрозофилы постоянно присутствуют ВПЧ ретротранспозонов [Shiba, Saigo, 1983; Gorelova,1988]. Однако, транспозиция ретротранспозонов происходит с заметной частотой только в момент адаптации клеток эмбрионов к условиям роста в культуре [Di Franco, 1992]. В пересеваемой клеточной культуре, а также в клетках соматических тканей дрозофилы транспозиция происходит крайне редко [Junakovic, 1988]. Эти факты свидетельствуют о существовании механизмов, регулирующих ретротранспозицию. Ингибирование процесса ретротранспозиции может происходить на нескольких стадиях созревания частиц. При этом должна наблюдаться аккумуляция незрелых частиц, содержащих определенный промежуточный продукт обратной транскрипции. Действительно, во фракции ВПЧ клеток дрозофилы количество капсидов в несколько раз превышает количество частиц, имеющих внешнюю оболочку. Изучение интермедиатов обратной транскрипции в составе ВПЧ различных ретротранспозонов выявило

различия между семействами. ВПЧ copia содержат преимущественно одноцепочечную РНК форму элемента [Shiba, Saigo, 1983]. МДГ1 представлен, в основном, РНК-ДНК гибридными формами [Goreiova,1988], ВПЧ Tv1 D.virilis и Ту1 дрожжей содержат почти исключительно линейную двухцепочечную ДНК форму [Андрианов, 1994; Eichinger, 1987]. Эти данные можно объяснить, исходя из предположения о существовании нескольких механизмов регуляции ретротранспозиции, причем каждое семейство ретротранспозонов может контролироваться специфическим механизмом.

Реовирусы, геном которых представлен двухиепочечной РНК [Алаторцев, 1980], при окраске бромидом этидия мигрируют в геле в виде двух полос (рис.2,Г). Из зон геля, соответствующих реовирусам, выделены частицы, размером 59*3 нм (рис.3, Г, рис.5, Д). Реовирусы имеют округлую форму, электронноплотную сердцевину диаметром 36±3 нм, двухслойный капсид толщиной 10-12 нм. Вирусные частицы компактные, с характерной плотной внешней поверхностью: Для дополнительной идентификации было использовано различие в чувствительности реовирусов и ретровирусоподобных частиц к органическим растворителям. Реовирусы устойчивы к такому воздействию, так как их капсиды не содержат липидов, в отличие от ретровирусов, оболочки которых разрушаются в присутствии даже следовых количеств органических растворителей [Drayna,1982]. Обработка хлороформом приводит к высвобождению нуклеиновых кислот из ВПЧ Tv1 и gypsy, но не разрушает реовирусы (рис.2,Г,Д). Фракции, обработанные хлороформом, содержат только 59 нм частицы, и не имеют ВПЧ диаметром 68 нм. Следует отметить, что одинаковые вирусные частицы имеют однотипную ультраструктуру, окрашиваются практически одинаково, что позволяет идентифицировать их на электронной микрофотографии фракций. При описанном способе контрастирова-

ния удается выявить максимальное количество ультраструктурных особенностей вирусных частиц, доступных с помощью электронного микроскопа.

Идентификация индуцированных ВПЧ.

Для изучения ретротранспозиции в клетках дрожжей используется метод индукции. Дрожжевые клетки трансформируют мультико-пийным вектором, содержащим Ту1 под контролем сильного дрожжевого промотора, в данном случае используется промотор дрожжевого гена фосфоглицераткиназы. Это приводит к индукции транспозиции и аккумуляции ВПЧ в цитоплазме. В работе использовались штаммы DBY746 (МАТа Ieu2-3,112 his3-1 ura3-52 trpl-289) из лабораторной коллекции и FY417 (МАТа spt3-203 :: TRP1 trpl 63 ura3-52 leu2D1), полученный от Ф. Укнстона (F.Winston). Дрожжезая экспрессионная плазмида рРТХ, несущая копию ретротранспозона Ту1, описана в работе [Резник,1988]. Вектор рРТХ-А9, содержащий первую рамку Ту1, был получен делецией внутренних Bgl II фрагментов из плазмиды рРТХ [Резник, Золотова, 1995]. Плазмида pPGX, содержащая gypsy, сконструирована в нашей лаборатории [Резник, 1988]. Плазмида pAB24/RT4 представляет собой последовательность обратной тран-скриптазы вируса'иммунодефицита человека (ВИЧ) под контролем сильного дрожжевого промотора глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеказы (GAPDH) [Вагг,1987]. Схемы плазмид приведены на рис.1. На рис.6, А, представлены ВПЧ, полученные в клетках штамма DBY746 индукцией трансформацией плазмидой рРТХ. Гете-рологичные элементы индуцируют образование частиц эндогенного Ту1 ретроэлемента в дрожжах S.cerevisiae, это явление получило название гетерологичной индукции [Резник, 1988]. Аккумуляцию ВПЧ Ту1 вызывает введение в клетку последовательности обратной тран-скриптазы, что было показано в опытах с трансформацией клеток

плазмидой pAB24/RT4, содержащей последовательность обратной транскриптазы ВИЧ (рис. 6,Б) [Резник, Кидгоко, 1995]. Индукция частиц эндогенных ретроэлементов затрудняет идентификацию экзогенных ВПЧ. Поэтому штаммы дрожжей дикого типа не подходят для изучения, и в нашей работе использовался sptS-мутантный дрожжевой штамм FY417, так как в spt-3 мутантных клетках невозможно образование собственных частиц Ту1-элемента [Воеке,1986]. Клетки штамма Fy417, были трансформированы плазмидами рРТХ и рРТХ-А9. Не-процессированный белок ТуА, экспрессируемый плазмидой рРТХ-А9, способен образовывать нестабильные частицы, не содержащие ферментов, кодируемых второй рамкой (ТуА-частицы) [MulJer,1987; Adams, 1987]. Саузерн-блот-анализ нуклеиновых кислот из фракций ВПЧ клеток, трансформированных рРТХ и рРТХ-А9, позволил идентифицировать эти частицы как ВПЧ Ту1 и ТуА, соответственно [Резник, Золотова 1995]. В данной работе был проведен сравнительный ультраструктурный анализ. Очищенные ВПЧ выделяли из трансформированных клеток, как описано в "Материалах и методах". В качестве контроля использовались нетрансформированные клетки, в которых ВПЧ не выявлялись. Электронномикроскопический анализ показал, что ВПЧ Ту1 представляют собой сферические частицы, с центрально расположенной сердцевиной, размер которых варьирует от 36 до 59 нм (рис.7,В). Капсид однослойный, толщиной 5-7 нм окрашивается негативно. Сердцевина расположена центрально, также негативно окрашена. В целом, морфологические характеристики, совпадают с полученными для ВПЧ Ту из обычных штаммов [Рзник, Кидгот-ко, 1995; Mellor, 1985], и сданными, имеющимися в литературе, включая и такую их особенность, как большая вариабильность частиц [Kingsman, 1992]. Полученные изображения ВПЧ Ту1 схематически могут быть изображены аналогично ВПЧ ретроэлемента copia из кле-

РиоБ-Электронные микрофотографии вирусных частиц из клеток дрожжей БассЬаготусез сегеу!51ае.

№

. .да

:>%Я. V?!"

А. ВПЧ из клеток штамма ОВУ742г трансформированных плазмидой рРТХ.

Б. ВПЧ из клеток штамма ОВУ742, трансформированных плазмидой рАВ24/НТ4.

• ' I

А

->

**>• г „ ЧЩ^» <«£», % } л

. ^ *

Рис.7 ~~

В. ВПЧ из клеток зр13-мутантного штамма, трансформированных плазмидой рРТХ.

Г. ВПЧ из клеток зр13-мутантного штамма, трансформированных плазмидой рРТХ-А9.

Д. ВПЧ из клеток зр13-мутантного штамма, трансформированных

ППЯ'ЗЛ^МЛОЙ пРГ^У ? II

ток дрозофилы (рис.4,А) и отнесены к одному типу ВПЧ, что соответствует их структурному сходству. Частицы ТуА имеют меньший диаметр, 33-38 нм (рис.7,Г), более однородны по размеру. Большинство этих частиц имеют нарушения структуры, что свидетельствует о их нестабильности. Эти особенности соответствуют результатам, полученным на обычных дрожжевых штаммах [Kingsman, 1992]. Можно предполагать, что за исключением образования ВПЧ собственного Ту1, эр13-мутантный штамм, не отличается от нормальных штаммов по характеру реакции на индукцию, и может рассматриваться, как удобная модельная система для изучения ретротранспозиции.

Электронно - микроскопический анализ фракции ВПЧ штамма Fy417, трансформированного дрожжевым экспрессионным вектором pPGX, содержащим полноразмерный gypsy показал, что в трансформированных клетках образуются гомогенные сферические частицы диаметром около 45 нм, по характеру окрашивания напоминающие gypsy - капсиды, обнаруженные в культуре клеток дрозофилы. Капсид толщиной около 3 нм окрашивается негативно (рис.7,Д). Сердцевинка расположена центрально, не дает негативного окрашивания. ВПЧ gypsy, полученные в клетках дрожжей зр13-мутантного штамма выявляются сходным образом с gypsy-капсидами в клетках дрозофилы: имеют близкие размеры и характер окрашивания (рис.4,В). Получение ВПЧ gypsy в клетках sptS-мутантных дрожжей позволяет надеятся, что эта система будет удобна для изучения явления гетерологичной индукции. Способность данного семейства ретротранспозонов самостоятельно направлять синтез частиц также может быть изучена путем экспрессии в spt-З мутантных штаммах дрожжей. Полученные нами результаты показали способность gypsy обеспечивать синтез кап-сидов, сходных с gypsy капсидами из клеток дрозофилы, кроме того предварительные данные Саузерн-блот- гибридизации с gypsy-

зондом, показали наличие небольшого количества ДНК gypsy длиной 7 т.л.н. в ВПЧ из клеток 8р13-мутантных дрожжей, трансформированных pPGX. Изучение механизмов контроля ретротранспозиции возможно на основе комплементарного взаимодействия различных семейств ретротранспозонов. Возможность комплементарного взаимодействия неродственных семейств ретротранспозонов была показана в отношении Ту1 элемента дрожжей. Запуск цикла ретротранспозиции Ту1 элемента удалось индуцировать путем экспрессии ретротранспозонов дрозофилы: copia, gypsy, 17,6. Более подробное изучение показало, что индуцирущим фактором является наличие последовательности обратной транскриптазы [Резник, Кидготко, 1995]. Вероятно, в случаях активизации ретротранспозиции, например, в первичных клеточных культурах, также имеет место комплементарное взаимодействие различных семейств ретротранспозонов. При комплементарном взаимодействии, возможно образование гибридных частиц, включающих нуклеиновые кислоты и белки различных ретротранспозонов. Сочетание методов фракционирования частиц с Вестерн:блот гибридизацией и окраской антителами, полученными на отдельные домены ретротранспозонов. представляется адекватным методом проверки данной гипотезы.

Обсуждение

Полученные результаты подтверждают возможность и эффективность использования метода электронной микроскопии для изучения ВПЧ ретротранспозонов. Однако, как и всякий метод, он имеет определенную область применения, и нуждается в сочетании с методами биохимии и молекулярной генетики. В противном случае, результаты могут быть малоинформативными, и даже приводить к артефактам. Знание морфологии ВПЧ ретротранспозонов позволяет из-

учать стадии и этапы ретротранспозиции, механизмы клеточной регуляции цикла ретротранспозонов. Кроме того, метод позволяет получить визуальное представление о влиянии ретротранспозиции на клетку-хозяина. Разработка модельных систем для изучения транспозиции ретроэлементов также нуждается в визуальном контроле. Недостаточное количество модельных систем до сих пор является затруднением для исследования ретротранспозиции. Наиболее сложной задачей в изучении структуры ВПЧ является их идентификация. Существует несколько подходов к решению этой задачи: использование иммунологических методов; фракционирование; система контролем, позволяющих определять объект методом исключения; метод индукции. Для использовании иммунологического метода необходимо получение высокоспецифических антител, что не является простой задачей, так как требует относительно больших количеств чистых белков ВПЧ. Это достижимо только при помощи искусственного синтеза таких белков, что увеличивает затраты и усложняет использование иммунологических методов. Метод индукции с использованием трансформации плазмидой, содержащей гетерологичный ретротранс-позон, также вызывает затруднения из-за возможности различных ин-терпре таций полученных результатов. В данной работе предлагаются результаты использования новых достаточно простых и доступных методов идентификации для изучения ретротранспозонов. Первый метод- электрофоретическое фракционирование, представляет собой сочетание различных методов, обычно применяемых в качестве самостоятельных. Метод основан на способности ВПЧ под действием электрического тока при определенном значении рН, диффундировать в агарозном геле на определенное расстояние. При этом структура ВПЧ хорошо сохраняется. Один и тот же препарат может быть использован и для гибридизации с зондами и для электронной микро-

скопии. Это позволяет получить однозначную и разностороннюю информацию о строении и составе ВПЧ конкретного семейства ретро-транспозонов. Вероятно, электрофоретическое фракционирование найдет свое место и в вирусологии для идентификации вирусов различных таксономических групп. Второй метод является разновидностью метода индукции с тем различием, что в данной системе, используя spt-З мутантный дрожжевой штамм, исключается индукция эндогенного ретротранспозона. При этом появляется возможность изучать частицы только экзогенного интересующего ретротранспозона.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый метод разделения ВПЧ ретротранспозо-нов-электрофоретическое фракционирование. Данным методом выделены и идентифицированы ВПЧ ретротранспозонов copia и gypsy из клеточной культуры D.melanogaster и ВПЧ ретротранспозона Tv1 и gypsy из клеток D.virilis.

2. Ретротранспозоны Tv1 и gypsy образуют два типа частиц: сферические частицы диаметром около 70 нм, имеющие наружную оболочку, и икосаэдрические капсиды диаметром около 50 нм, лишенные оболочки.

3. Наличие двух форм частиц отражает различные этапы ретро-транспозиции и свидетельствует в пользу существования внеклеточной стадии развития ВПЧ ретротранспозонов TV1 и gypsy.

4. Показана возможность изучения ретротранспозиции экзогенных ретротранспозонов в Бр13-мутантном штамме дрожжей S.cerevisiae. ВПЧ дрожжевого ретротранспозона Ту1 в мутантах не отличаются от полученных в нормальных клетках. Возможна индукция экспрессии ВПЧ не только дрожжевых, но и гетерологичных ретротранспозонов.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Андрианов Б.В., Золотова Л.И., Горелова Т.В., Клицунова Н.В., Шуппе Н.Г. Идентификация и ультраструктурная характеристика вирусоподобных частиц ретротранспозона Ту1 в клетках Огозоро1а утПэ II Докл.Акад.наук. 1994. Т. 339. N.1. С.127-129.

2. Резник Н.Л., Золотова Л.И., Шуппе Н.Г. Индукция вирусоподобных частиц Ту1 мини-Ту1 элементом в 5рВ-мутантном штамме ЗассЬаготусез сегеу|8|'ае //Докл. Акад. наук. 1995. Т.340. N.1. С.138-140.

3. Резник Н.Л., Кидготко О.В., Золотова Л.И., Шуппе Н.Г. Гетероло-гичная индукция ретротранспозиции Ту1: обратная транскриптаза играет ключевую роль в запуске цикла ретротранспозиции // Генетика. 1995. Т. 12. С. 19-26.

4. Золотова Л И., Андрианов Б.В., Горелова Т.В., Клицунова Н..В.., Резник Н.Л., Шуппе Н.Г. Полиморфизм вирусоподобных частиц ретро-транспозонов в клетках дрозофилы и дрожжей // Генетика. 1996. Т. 32. №11.0.1529-1535.