Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и свойства РНК-векторов для репликации и экспрессии матричных РНК в бесклеточных системах

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и свойства РНК-векторов для репликации и экспрессии матричных РНК в бесклеточных системах"

РГБ ОД

1 Б 01П В05

На правах рукописи УДК 547.963.3

УГАРОВ Виктор Иванович

КОНСТРУИРОВАНИЕ И СВОЙСТВА РНК-ВЕКТОРОВ ДЛЯ РЕПЛИКАЦИИ И ЭКСПРЕССИИ МАТРИЧНЫХ РНК В БЕСКЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМАХ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Институте белка РАН Научный руководитель:

кандидат биологических наук А.Б.ЧЕТВЕРИН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю. Л.ДОРОХОВ

доктор биологических наук, профессор Н.И. МАТВИЕНКО

Ведущая организация:

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита диссертации состоится " /У " //ОЛ 1995 г.

в /О час ОС? мин на заседании диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском государственном университете им. М. В. Локоносова. по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы,

МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Создание эффективных бесклеточных систем для синтеза и экспрессии РНК является актуальной проблемой молекулярной биологии и биотехнологии. Одним из наиболее перспективных направлений является использование для этой цели репродуктивной системы фага QP - РНК-содержащего бактериального вируса.

С одной стороны, Q/3 репликаза является единственной известной РНК-зависимой РНК полимеразой, позволяющей экспоненциально размножать РНК in vitro. Экспоненциальный синтез РНК наблюдается при молярном избытке фермента и обеспечивается способностью Q/3 репликазы использовать в качестве матрицы не только исходные однонитевые РНК, но и однонитевые же комплементарные копии. Использованию репликазы для синтеза заданных РНК in vitro препятствовала ее узкая матричная специфичность. В то же время, помимо Q/3 РНК существует целый класс РНК небольшого размера - природных сателлитов фага Q/3 (RQ РНК, длиной 80-250 нт), которые размножаются in vitro даже быстрее, чем Q/3 РНК. Было установлено, что RQ РНК могут служить в качестве . векторов для размножения коротких (до 100 нт) чужеродных последовательностей, но более длинные вставки лишают RQ-вектор способности к размножению Q/3 репликазой in vitro. Выяснение причин неспособности RQ-векторов нести длинные чужеродные последовательности важно для понимания механизма репликации РНК, а преодоление этого ограничения имеет большой практический интерес, поскольку позволило бы размножать любые матрицы для бесклеточных систем трансляции и осуществлять клонирование генов in vitro с помощью недавно изобретенной техники молекулярных колоний.

С другой стороны, геномная РНК Q/3 фага (Q/3 РНК) является одной из наиболее эффективных матриц для трасляции in vitro и -в силу этого - одним из излюбленных объектов молекулярной биологии. Недавно было продемонстрировано, что трансляция чужеродных мРНК, вставленных в Qfi РНК вместо цистрона белка оболочки, усиливается на 1-2 порядка. Однако практическому использованию Q/3 РНК в качестве трансляционного вектора мешают ее большой размер (более 4000 нт) и сопутствующий синтез фаговых белков. Поэтому важно было выяснить, могут ли RQ РНК и редуцированные варианты Q/3 РНК служить эффективными векторами

для трансляции мРНК в бесклеточных системах. Решение этой задачи имеет особое значение для повышения эффективности проточных систем трансляции (CFCF-систем), используемых для препаративного синтеза индивидуальных белков вне клетки.

Цель исследования. Целью данной работы явилось создание РНК-векторов на основе RQ РНК и делеционных вариантов Qß РНК для репликации, трансляции и сопряженной репликации-трансляции мРНК и исследование их свойств в бесклеточных системах.

Задачи исследования, в работе решались следующие задачи:

(1) Клонирование в виде кЛНК под Т7 промотором (+) и (-) версий нескольких RQ РНК.

(2) Конструирование РНК-векторов на основе наиболее эффективной е репликации RQ РНК. и делегированной Qß РНК (¿Qß РНК) и исследование их способности к репликации.

(3) Конструирование на основе полученных векторов рекомбинантных РНК, несуших ряд клеточных мРНК (RQ-мРНК и AQ(3-mPHK, соответственно).

(4) Исследование свойств RQ-мРНК в бесклеточных системах репликации, трансляции и сопряженной репликации-трансляции из Escherichia coli.

(5) Определение влияния 5'- и 3- концевых участков RQ-вектора на эффективность репликации и трансляции RQ-mPHK.

(6) Сравнение эффективности RQ- и AQß-векторов в трансляции мРНК in vitro.

Научная новизна работы. Выделена новая эффективно реплицирующаяся RQ РНК. На ее основе создан вектор для внеклеточного размножения и экспрессии мРНК.. Впервые осуществлена сопряженная репликация-трансляция мРНК in vitro. Выяснена причина и преодолена неспособность RQ-вектора, несущего длинные чужеродные вставки, размножаться Qß репликазой в бесклеточной системе. Продемонстрирована способность RQ РНК служить эффективным вектором для внеклеточной экспрессии мРНК, а также синергизм процессов репликации и трансляции RQ-mPHK. Обнаружен эффект защиты mFHK в составе RQ-вектора от эндогенных рибонуклеаз и установлена роль взаимодействия Б'- и 3'-концевых участков вектора в этом эффекте. Получен делеционный вариант Qß РНК длиной 620 нуклеотидов (AQß РНК), в котором сохранены 5'- и 3'-концевые участки фагового генома. Обнаружена исключительно

- з -

высокая эффективность AQ/3 РНК в качестве вектора для внеклеточной трансляции мРНК, достигаемая благодаря необычно длительной линейной фазе кинетики белкового синтеза. Установлено, что причиной этого эффекта является повышенная устойчивость к рибонуклеазам AQ/3-mPHK, ассоциированной с транслирующими рибосомами. Продемонстрирована высокая

эффективность трансляции AQ|3-мРНК в протечных белоксинтезирующих реакторах.

Практическое значение работы. Полученные в данной работе РНК-векторы могут быть использованы для создания высокопродуктивных систем трансляции и сопряженных систем репликации-трансляции. P.Q-векторы могут быть также использованы для клонирования генов и тестирования различных биологически значимых последовательностей с помощью техники • молекулярных колоний. Помимо этого, RQ-мРНК могут служить в качестве модельных матриц для изучения репликации, трансляции и сопряжения репликации - трансляции in vitro. Таким образом, предложенные РНК-векторы могут найти широкое применение в различных областях молекулярной биологии, биотехнологии и медицины.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на международной конференции "Frontiers in Bioprocecsing II" (Боулдер, Колорадо, США, 1990),Первой Германо-Российской летней школе по бкеклеточным системам (Берлин, Германия, 1994) и на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1993, 1994). Диссертация апробирована на заседании Отдела структуры и функций рибосом Института белка РАН (Пущино, 1995).

Публикации. Материалы диссертации изложены в 8 опубликованных работах и подана заявка на получение международного патента.

Структура диссертации. Диссертация включает введение и четыре основные части: обзор литературы "Реплицирующиеся РНК как потенциальные векторы для экспрессии и размножения чужеродных последовательностей", "Материалы и методы", "Результаты экспериментов", "Обсуждение результатов".

Диссертация завершается выводами и списком литературы ( /¿У ссылок) . Работа изложена на страницах машинописного текста и

иллюстрирована 31 рисунками.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование РНК-векторов и рекомбинантных мРНК

Первый тип РНК-вектора был создан на основе RQ РНК. С целью свободного генетического манипулирования с RQ последовательностями их переводили в форму кДНК в составе плазмидных векторов. Исходные RQ РНК были выделены из продуктов «спонтанного» синтеза, осуществляемого Qß репликазой в отсутствие добавленной матрицы. Как показано в нашей группе, этот синтез направлется сателлитными РНК фага Qß, попадающими в реакционную смесь из воздуха. Сначала (+) и (-) версии кДНК-копий четырех выделенных RQ РНК (RQ87, RQ120, RQ135 и RQ223; число в обозначении РНК означает ее длину в нуклеотидах) клонировали в составе ДНК фага М13тр18. Полученные рекомбинантные клоны М13 ДНК использовали в качестве матриц в полимеразной цепной реакции (PCR) с целью введения промотора Т7 РНК-полимеразы точно перед последовательностью RQ кДНК. PCR-фрагменты клонировали в составе плазмиды pUClß и секвенировали. После расщепления полученных рекомбинантных плазмид по сайту Smal их использовали в качестве матриц для получения точных копий соответствующих RQ РНК. Полученные транскрипты были столь же эффективны в репликации, что и исходные RQ РНК.

Две из клонированных RQ РНК (RQ135 и RQ223) обладали наибольшей и приблизительно одинаковой скоростью репликации in vitro. Для конструирования репликационного вектора была выбрана более короткая RQ135 РНК (клон RQ135-1), впервые выделенная и изученная нами.

Чужеродные последовательности встраивали в одну из внутренних петель (-)-цепи RQ135-1 РНК (рис. 1А) с тем, чтобы максимально сохранить ее вторичную структуру и, следовательно, способность к репликации. Для этого в последовательности RQ135-1 кДНК был образован сайт Xhol (CTCGAG) путем введения, с помощью олигонуклеотидного мутагенеза и PCR, двух точечных мутаций (Т53 -> С и А54 -> Т). Мутантная RQ РНК, полученная с помощью транскрипции, обладала такой же репликационной активностью, что и исходная RQ135-i(-) РНК.

С целью проверки способности мутантной RQ135-1 РНК служить вектором для размножения чужеродных последовательностей, в сайг Xhol встроили полилинкер длиной 22 нт, содержащий сайты рестрикции Sali, Hindlll и BamHI. Полученная с помощью

транскрипции RQ РНК, несущая такую вставку, сохранила способность к эффективной репликации in vitro.

Рекомбинантные RQ-мРНК были получены путем независимого встраивания в мутантную RQ135-1 кДНК по сайту xhol фрагментов

и А

С G

CG и и

G*C G А

U-А и С

A*U G'C

G*C C'G

G'C G'C А G'C U'A

А С G'C

G'C A'U

и-и—- -U-G и и C'G

A'U—- ■—GeC G U C-U

G'C C'G G'C U-C

G'C G'C C'G C'G

G'C U-G--- ---С 'G- -A--C А

A'U G-U-U- ■U-A'U-' U-G-G'C

G U C *G A'U G'C

с и С А G'C G'C

А Т C'G G'C / А

* С C'G С А 5' \

и C'G С А 3

[ 36 | НСТ-ген (234НТ) | '

ГзтТ

САТ-ген (657нт)

I

U'A A'U cg

G'C G С A U

Рис.,1. Конструирование рекомбинантных RQ-мРНК (А) Место введения мутаций в структуру RQ135-K-) РНК с целью генерации сайта Xhol. (Б) Схема фрагмента плазмиды pUC18, содержащего RQ135-1 (-) кДНК под Т7 промотором с указанием последовательности полилинкера (вверху) и схематичным изображением генов (внизу) встроенных в сайт Xhol. '

ДНК, содержащих гены человеческого кальцитонина (HCT) и бактериальных дигидрофолатредуктазы (DHFR) и хлорамфеникол-ацегилгрансферазы (CAT) (Рис. 1Е).

Второй тип РНК-вектора был создан на основе генома фага Q/3 путем делеции большей части его внутренней последовательности (рис. 2А). Используя неполную рестрикцию с помощью рестриктазы Alul (сайт AGCT) были получены обширные делеции в Q/3 кДНК, содержащейся под Т7 промотором в плазмиде pQß7. После лигирования и размножения делегированных вариантов pQ/37, из них по сайтам Sali, фланкирующим последовательность Qß кДНК, вырезали фрагмент, содержащий под Т7 промотором делегированный вариант Qß кДНК длиной 620нт. Фрагмент встроили по сайту Sali в плазмиду pUC18. При транскрипции полученной плазмиды (pAQ/3), расщепленной по сайту Smal, синтезировалась ÜQ/3 РНК, содержащая 5'-концевой фрагмент исходного генома длиной 126 нт и 3'-концевой фрагмент длиной 494 нт (рис. 2А). Полученная рекомбинантная плазмида (pAQ/J) Содержала уникальные сайты рестрикции SacI, SnaBI и BssHII в позициях 206, 222 и 260 нт последовательности ДQ/3 кДНК, соответственно. Тест на репликацию

б -

T7 промотор

Qß (4216нт)

--GGGG" А БЕЛОК -

Т7 промотор

ч

-GGGG-

Sacll^aV BssH11 (222)

Smal -CCCGGG--

Smal

-CCCGGG-

15 DHFR-ген (480нт) 22

36 НСТ-ген (234нт) 240

37

САТ-ген (657нт)

93

Рис.2. Схема конструирования (А) ÜQ/3 РНК и (Б) ÜQß-мРНК.

показал, что Qß репликаза не узнает йQß РНК в качестве матрицы. Этот результат ожидался, так как репликаза не узнает и Qß РНК в отсутствие специального белка £". coli - «хозяйского фактора» (HF) . Однако, в отличие от Qß РНК, репликаза не узнает LQß РНК и в присутствии HF, что также объяснимо, поскольку делегированные области Qß РНК содержат участки связывания HF.

Рекомбинатные üQß-мРНК были получены путем встраивания в сайт SnaBI ÜQß кДНК фрагментов ДНК, содержащих гены HCT, DHFR и CAT (рис. 2Б).

2. RQ-мРНК способна к эффективной репликации при сопряжении с трансляцией. Синергизм процессов репликации и трансляции

В отличие от RQ-вектора, несущего короткую вставку, рекомбинантная RQ-МРНК (несущая DHFR мРНК в составе RQ135-i(-) РНК) оказалась способной лишь к однократному прочтению очищенной Qß репликазой in vitro. При этом как ( + )-, так и (-)-цепь RQ-мРНК (полярность цепи соответствует смысловой и антисмысловой ориентации DHFR мРНК, соответственно) узнается ферментом весьма эффективно, но вновь синтезированная цепь оказывается в дуплексе с матрицей, что полностью блокирует дальнейшую репликацию.

Однако оказалось, что в присутствии полной «S100» системы трансляции из Е. coli (содержащей промытые солью рибосомы и

Рис.3. Анализ (+)- и (-)-цепей ИО-БНЕК мРНК в продуктах репликации. (А) Синтез РНК на К(2-ОНЕЩ + ) мРНК очишенной 0/3 репликазой в отсутствие системы трансляции (1), в присутствии полной системы трансляции в отсутствие (2) ив присутствии (3) 0. 5 мМ пуромицина, а также в присутствии неполной системы трансляции, лишенной белковой фракции БЮО (4) или рибосом (5). (Б) Кинетика синтеза (+)-цепей (о) и (-)-цепей (•) КО-БНЕИ мРНК в сопряженной системе репликации-трансляции. Указана радиоактивность полос, вырезанных из геля.

«3100» фракцию клеточных белков, не осаждаемых при 100.ООО д) синтез ИО-мРНК многократно усиливается. В отличие от чистой системы репликации, значительная доля продуктов репликации находится в одноцепочечном состоянии.

С целью анализа состава продуктов репликации было проведено раздельное определение (+)- и (-)-цепей КО-ВНЕИ мРНК путем отжига с избытком немеченой (+)-цепи (рис. 3). При этом новосинтезированные (меченые) (-)-цепи вовлекаются в дуплекс, а (+)-цепи остаются в однонитевом состоянии. Оказалось, что в реакции, инициированной (+)-цепью ко-БНЕИ мРНК в присутствии полной системы трансляции, синтезируются не только комплементарные (-)-цепи, но и (+)-цепи, причем количество продукта нарастает со временем (рис. ЗА, 2). В то же время, в чистой системе репликации (рис. ЗА, 1), а также в отсутствие рибосом (рис. ЗА, 4) или ЭЮО фракции (рис. ЗА, 5) или в присутствии ингибитора белкового синтеза пуромицина (рис. ЗА, 3) репликация сводится к синтезу только (-)-цепей и синтез РНК останавливается вскоре после начала реакции. В отличие от ИО-мРНК, присутствие сопряженной системы трансляции (как в присутствии, так и в отсутствие пуромицина) не влияет на

репликацию исходного RQ-вектора, лишенного последовательности МРНК.

Таким образом, наблюдаемая стимуляция синтеза РНК в присутствии системы трансляции является следствием вовлечения смысловых (+)-цепей RQ-мРНК в процесс трансляции. Это защищает их от отжига с комплементарными (-)-цепями и тем самым разблокирует репликацию.

Этот вывод подтверждается наблюдением, что в присутствии сопряженной системы трансляции репликация происходит асимметрично, с преимущественным синтезом ( + )-цепей (рис. ЗЕ). Действительно, вовлечение (+)-цепей RQ-мРНК в процесс трансляции должно выводить их из репликации и, следовательно, подавлять синтез (-)-цепей. Таким образом, репликация RQ-мРНК в сопряженной системе весьма напоминает эффективное и асимметричное размножение генома Q/3 фага во внутриклеточных условиях.

Анализ продуктов синтеза белка в сопряженной системе репликации-трансляции показал, что одновременно с увеличением вновь синтезированных (+) цепей RQ-мРНК увеличивается и выход белка, причем пропорционально количеству добавленной Q/3 репликазы. Иными словами, имеет место взаимное усиление (синергизм) процессов репликации и трансляции in vitro.

3. RQ-вектор увеличивает эффективность трансляции иРНК и ее стабильность

Оказалось, что RQ-вектор не только придает мРНК способность к размножению Qß репликазой, но и значительно улучшает их трансляцию в бесклвточной системе. На рис. 4 видно, что трансляция RQ-DHFR И RQ-CAT мРНК в <S30» системе из E.coli (приготовленной на основе грубого клеточного экстракта) дает, соответствено, в 3 и 13 раз больше белка, чем трансляция исходных DHFR и САТ мРНК. Анализ целостности РНК показал, что повышенный выход белка кореллирует с приблизительно 5-кратным увеличением времени жизни мРНК в составе RQ-вектора.

Таким образом, RQ-вектор защищает мРНК от деградации эндогенными рибонуклеазами. Этот эффект можно было бы объяснить наличием в структуре RQ-вектора и, в частности, в его 3'-концевой части стабильных шпилек (рис. 1А), так как известно, что шпилечные структуры в 3' -концевой нетранслируемой области защищают мРНК от экзонуклеаз, играющих основную роль в деградации РНК in vivo.

10 20 Время, мин

200

100

10 20 Время, мин

Рис.4. Экспрессия RQ-DHFR и RQ-CAT мРНК в бесклеточной системе трансляции на основе грубого («S30») экстракта E.coli. Вверху: кинетика включения [ 3]метионина с использованием в качестве матриц RQ-мРНК (1) и контрольных DHFR- и САТ-мРНК (2). Внизу: электрофоретический анализ кинетики деградации соответствующих RQ-мРНК (1) и контрольных мРНК (2) в системе трансляции. Транскрипты матриц использованы в качестве маркеров (Т). Интенсивные полосы вверху геля - рибосомные РНК.

Чтобы проверить это предположение, мы исследовали деградацию в S30 системе трансляции укороченных вариантов RQ-DHFR мРНК, лишенных 3'-концевой части RQ-вектора ( ДЗ' RQ-DHFR мРНК) и 5'-концевой его части (ДЗ'RQ-DHFR мРНК). Оказалось, что удаление любой из этих частей резко дестабилизирует структуру РНК (рис. 5А). Отсюда следует, что 5'- и 3'-концевые участки RQ-вектора взаимодействуют между собой (что подтверждает структуру, изображенную на рис. 1А), и именно это взаимодействие (а не наличие стабильных шпилек в 3'-концевой нетранслируемой области) играет главную роль в защите RQ-мРНК от экзонуклеаз.

В то же время, вопреки ожидаемому, удаление как 5'-, так и 3' -концевой части RQ-вектора улучшает трансляцию DHFR мРНК. Этот эффект связан с увеличением начальной скорости трансляции, без

• »

- 10 -

1 ОНРИ 2 ЯО-ОНЯН 3 ДЗ'1ЧСЗ-ОНРВ 4 Д5'1ЧС5-ОНРР?

Т 0' 2' 5'10' 30' ТО' 2' 540' 30' ТО' 2' 5'10' 30' Т 0' 2' 5' 10' 30'

УВЙВ £ «•••в

30 -

£

20 ->

10 -

------■ 2

10

20

30

Время, мин

Рис.5. (А! Кинетика деградации при трансляции в БЗО системе исходной ОНЕИ мРНК (1), полноразмерной ЕО-БНЕИ мРНК (2) и ¡Ю-ВНЕИ мРНК, лишенной 3'-концевого (3) и 5'-концевого (4) фрагмента К0135-1(-) РНК. (Т) - маркерные,. транскрипты соответствующих мРНК. (Б) Кинетика включения [ Б]метионина в синтезируемый белок при трансляции тех же матриц в БЗО системе.

заметного изменения ее продолжительности (рис. 5Б). Вероятно, замедленная трансляция БНИ? мРНК в составе полноценнного ИО-вектора отражает более медленную стадию инициации и является следствием стерических помех для посадки рибосом со стороны жесткой структуры .1*0 РНК. Действительно, в ид-ОНГК РНК район Шайна-Дальгарно ( БО) находится всего в нескольких нуклеотидах от векторной последовательности. Чтобы проверить это предположение, была исследована трансляция двух производных Ш2-ПНЕК РНК, содержащих вставки длиной 4 нт и 22 нт между ББ-районом и 5' -участком ИО-вектора. Как и ожидалось, это привело к увеличению скорости трансляции рекомбинантной мРНК. Таким образом, генетическое манипулирование 5'- нетранслируемой областью открывает путь к созданию более эффективных реплицирующихся шэ-мРНК.

Из изложенного следует, что увеличение эффективности трансляции мРНК в составе ИО-вектора нельзя объяснить только защитой мРНК от рибонуклеаз, тем более что ИО-вектор по-разному влияет' на трансляцию разных матриц, хотя их время жизни увеличивается в равной степени (рис. 4). Поэтому трансляция ИО-мРНК была исследована в Б100 системе, свободной от большей

части клеточных рибонуклеаз. Оказалось, что в начале реакции, когда деградация матриц незначительна, скорость синтеза белка на

дар-нст

Время, мин

AQP-DHFR

О 30 60 90 Время, мин

ДОр-САТ

30 60 90 Время, мин

120

5' 10' 20' 30' 60'

AQJj-DHFR мРНК

• RQ-DHFR мРНК

Рис.6. Экспрессия Д<2|3-мРНК, RQ-иРНК и исходных мРНК в S30 системе. Вверху, кинетика включения [3 5]метионина в синтезируемый белок. Внизу: кинетика деградации AQ/3-DHFR (слева) и RQ-DHFR мРНК ( справа) при трансляции в S30 системе.

RQ-DHFR РНК практически равна скорости синтеза на контрольной DHFR мРНК. В то же время, начальные скорости трансляции RQ-CAT и CAT мРНК различаются в S раз. Возможно, эта разница обусловлена различиями в последовательности нетранслируемых областей соответствующих кРНК-вставок (рис. 1Б) .

4. hQfi-вектор пролонгирует внеклеточную экспрессию мРНК

На рис. 6 видно, что Д<2|3-вектор в еще большей степени улучшает трансляцию мРНК, чем RQ-вектор. По сравнению с исходными мРНК выход белка возрастает от 12 (НСТ мРНК) ДО 75 раз (CAT мРНК), а по сравнению с RQ-мРНК - в 5-10 раз. Достигается это, в основном, за счет значительно более продожительной линейной фазы кинетики белкового синтеза. Синтез в S30 системе продолжается до 1 часа, что значительно дольше, чем при трансляции всех до сих пор тестированных мРНК, включая геномную РНК фага Q/3, на основе которой создан Д0/3-вектор. Более того, синтез белка на ДО(3-мРНК идет с постоянной скоростью даже после того, как большая часть этой РНК деградирована (рис. В).

Чтобы выяснить причину такого необычного поведения ДО/З-мРНК в трансляции, был проведен, с помощью центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, сравнительный анализ целостности ДО/З-САТ РНК. и ИО-САТ РНК в составе транслирующих рибосом и в свободном (не связанном с рибосомами) состоянии после 10 мин трансляции (на линейном участке кинетики трансляции обеих матриц) и после 30 мин (когда синтез на ИО-САТ РНК уже прекратился, а синтез на Д£)/3-САТ РНК еще продолжается с прежней скоростью).

Как видно на рис. 7, лишь небольшая доля мРНК находится в составе цолирибосом ( то есть, участвует в трансляции) и скорость ее деградации существенно отличается от таковой свободной мРНК, составляющей около 90% всей добавленной мРНК и остающейся наверху сахарозного градиента.

Неожиданно оказалось, что скорость деградации ЛО-мРНК в составе транслирующих рибосом значительно выше, чем в свободном виде, и близка к скорости деградации свободной 3'ЛИО-мЯНК (ср. рис. Вероятно, транслирующие рибосомы разворачивают

структуру ИО-вектора и препятствуют взаимодействию его 3- и -концевых частей, играющему основную роль в защите ИО-мРНК от экзонуклеаз. Это объяснение согласуется с фактом затрудненной инициации трансляции на ИО-иРНК (см. раздел 3).

Напротив, транслирующие рибосомы стабилизируют ДО/З-мРНК, вероятно, защищая ее от эндорибонуклеаз. Отсутствие дестабилизирующего эффекта рибосом объясняется, по-зидимому, тем, что устойчивость свободной Д£)/3-мРНК от экзонуклеаз обусловлена не взаимодействием 3'- и 5'-концевых частей, а тем, что 3'-конец РНК спрятан в третичной структуре ДО/3-вектора, подобно тому, как это наблюдается для 0/3 РНК в отсутствие НЕ. В пользу этого предположения говорит непособность 0/3 репликазы инициировать на ДО/8 РНК (см. раздел 1).

Высокая эффективность &013-вектора в экспрессии мРНК делает перспективным его использование для крупномасштабного синтеза белка вне клетки. Так, трансляция ДО/З-САТ РНК в СЕСЕ-реакторе продолжается с постоянной скоростью в течение 40 ч (для сравнения, трансляция ЛО-САТ мРНК затухает к 20 ч реакции) и дает к этому времени в 7 раз более высокий выход белка, чем при использовании ио-вектора. В то же время, способность ИО-мРНК к репликации в бесклеточной системе открывает перспективы использования 1?о-векторов для внеклеточного клонирования генов с помощью техники молекулярных колоний, а также для исследования

Номера фракции 1 2 3 4 5 6 7

—- мРНК

Я(3-САТ 30 мин

г5§

О

4к

1-3 1 2

X 11

' Т " |—-—I— I „ I

2 3._ 4 5 .6

Номера фракции""

1 2 3 4 5 6 7

А

_РО-САТ_ мРНК

5 6 7

Номера фракций 1 2 3 4 5 6 7

Р |

лсде-сл г

мРНК" "

2 3 4 5 6

Номера фракций 1 2 3 4 5 6 7

Рис.7. Распределение ультрафиолетового поглощения (сплошная линия) и радиоактивности (пунктирная линия) во фракциях сахарозного градиента после центрифугирования образцов ЭЗО системы трансляции, программируемой [3 Р]К<2-САТ мРНК (А) и [ Р ] ДО/З-мРНК. (Б), отобранных после 10 мин (слева) и 30 мин инкубации (справа). Внизу: электрофоретический анализ меченой РНК во фракциях градиента.

механизмов репликации РНК и ее сопряжения с трансляцией.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и клонированы в виде кДНК под Т7 промотором ( + )- и (-)-цепи четырех сателлитных РНК 0|3 фага (ИО РНК).

2. На основе одной из наиболее эффективно реплицирующихся ИО РНК - Ш2 135 РНК - создан вектор для репликации и трансляции мРНК.

3. Выяснено, что рекомбинантные 110-мРНК не способны к размножению очищенной ОЭ репликазой из-за образования дуплекса между матрицей и растущей цепью. Показано, что в присутствии сопряженной системы трансляции 1?0-мРНК приобретает способность к репликации за счет вовлечения (+)-цепей в процесс трансляции, что предотвращает образование дуплекса и делает репликацию асимметричной. Продемонстрирован синергизм процесса: увеличение благодаря сопряженной трансляции количества синтезированных Qfi репликазой (+) цепей ИО-мРНК приводит к увеличению количества синтезированного белка.

4. Показано, что ИО-вектор повышает эффективность трансляции мРНК, в частности, за счет защиты мРНК от эндогенных рибонуклеаз.

5. На функциональном уровне продемонстрировано взаимодействие 5'- и 3'-концевых частей Р,0-вектора в составе КО-мРНК; удаление любой из них приводит к резкому изменению стабильности и эффективности трансляции ЯО-мРНК в бесклеточной системе.

6. Путем делеции обширной внутренней области генома фага 0/3 создан высокоэффективный вектор для внеклеточной экспрессии мРНК (ЛОР РНК). Показано, что Л0(3-вектор защищает мРНК от действия рибонуклеаз в составе транслирующих рибосом, что многократно увеличивает продолжительность трансляции к увеличивает выход белка на 1-2 порядка.

Основные материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Chetverin A.B., Voronin L.A., Munishkin A.V., Bondareva L.A., Chetverina H.V., Ugarov V.l. Recombination in replicating RNAs. - Abstracts of Conference "Frontiers in Bioprocessing II", University of Colorado, Boulder, 1990, p. 38.

2. Munishkin A.V., Voronin L.A., Ugarov V.l., Bondareva L.A., Chetverina H.V., Chetverin A.B. Efficient templates for Qß replicase are formed by recombination from heterologous sequences. - J. Mol. Biol., 3991, v. 221, p. 463-472.

3. Chetverin A.B., Voronin L.A., Munishkin A.V., Bondareva L.A., Chetverina H.V., Ugarov V.l. Recombination in replicating RNAs. - In: Frontiers in Bioprocessing II (Todd, P., Sikdar, S.K. and Bier, M., eds), American Chemical Society, Washington, DC, 1992, p. 44-49.

4. Morozov I.Yu., Ugarov V.l., Chetverin A.B., Spirin A.S. Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system.- Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993, v.90, p. 9325-9329.

5. Ugarov V.l., Morozov I.Yu., Jung G.Y., Chetverin A.B., Spirin A.S. Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems. - FEBS Lett., 1994, v. 341, p. 131-134.

6. Morozov I.Yu., Ugarov V.l., Chetverin A.B., Spirin A.S. Synergism in replication and translation of messenger RNA in a cell-free system.- Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, 1994, p. 22.

7. Ugarov V.l., Morozov I.Yu., Jung G.Y., Chetverin A.B., Spirin A.S. Expression and stability of recombinant RQ-mRNAs in cell-free translation systems. - Abstracts of the First German-Russian Summerschool on in vitro Systems, Technical University, Berlin, 1994, p. 23.

8. Spirin A.S., Kramer F.R., Wu Y., Zhang D., Chetverin A.B., Volianik E. , Ryabova L.A., Kurnasov O.V., Morozov I.Y., Ugarov V.l. Coupled replication-translation methods and kits for protein synthesis. - International patent application. Publication No. WO 94/06928, 1994.