Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)

Рубан, Михаил Константинович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)"

004619292

Рубан Михаил Константинович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ МОДИФИКАЦИИ ГЕМОГЛОБИНА, ИНДУЦИРОВАННЫЕ ОКСИДОМ АЗОТА (II)

03.01.02. - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 0 ЯНВ 2011

Воронеж - 2010

004619292

Работа выполнена в Воронежском государственном университете

Научный руководитель доктор биологических наук,

доцент Вашанов Геннадий Афанасьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Попова Татьяна Николаевна

кандидат биологических наук, доцент Рохас-Риоха Ирина Евгеньевна

Ведущая организация Воронежская государственная медицинская

академия им. H.H. Бурденко

Защита состоится 28 декабря 2010 года в 13:30 на заседании диссертационного совета Д 212.038.03 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, г. Воронеж, Университетская пл., д. 1, Биолого-почвенный факультет, ауд. 59.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке Воронежского государственного университета.

Автореферат разослан^/" ноября 2010 года

2^ноября;

Ученый секретарь диссертационного совета

Грабович М.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время исследователями активно обсуждаются возможные механизмы взаимодействия молекул гемоглобина (НЬ) человека и животных с оксидом азота (II) (N0). Это связано с тем, что в 90-е годы прошлого века существовало противоречие, связанное с открытием функции эндогенного N0 как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе. Несмотря на присуждение за это Нобелевской премии, многие ученые продолжали утверждать, что весь N0 в кровеносном русле должен быть мгновенно связан молекулами НЬ. Это инициировало интерес к изучению механизмов взаимодействия НЬ и N0. Благодаря усилиям многочисленных исследователей стало ясно, что биохимия и биофизика взаимодействия НЬ и N0 гораздо сложней и далеко не ограничивается лишь теми реакциями, в которых N0 необратимо связывается, теряя способность выполнять вазодилататорную функцию и лишая гемоглобин кисло-родтранспортных свойств. Однако, несмотря на большое число публикаций, посвященных взаимодействию НЬ с N0, отмечается противоречивость поступающих данных, сложность их интерпретации, а также необходимость постоянного пересмотра существующих гипотез. Это связано, прежде всего, с высокой реакционной способностью свободнорадикальной молекулы N0 и широкими возможностями атома азота для образования различных 140-производных. Кроме того, при исследовании взаимодействия N0 и НЬ зачастую не учитывается аллостери-ческая природа гембелка. В связи с этим дискуссионными остаются вопросы взаимодействия различных лигандных форм НЬ с N0 и физиологическая значимость продуктов их реакции, роль мембраносвязанного НЬ в метаболизме N0, функции МО-производных НЬ в различных физиологических и патологических процессах и другие проблемы. Активно обсуждается возможность участия нитрозогемоглобина в регуляции тонуса кровеносных сосудов, однако механизмы образования молекул 8ЫО-НЬ, диссоциации из них N0 и экспорта вазоактивных молекул из эритроцитов еще не ясны. Ответы на эти и иные вопросы можно получить при дополнительных исследованиях структурно-функциональных модификаций молекулы НЬ, индуцированных N0 различных концентраций.

Достаточно глубоко изученная и методически легко доступная молекула НЬ является удобной моделью для исследования влияния различных агентов на ферменты, поскольку ее простетическую группу - гем - можно рассматривать как аналог активного центра. Кроме того, на примере НЬ можно проследить роль отдельных компонентов (белкового и неорганического) в ходе ответной реакции на воздействие физико-химических факторов и их взаимовлияние друг на друга. С другой стороны, получение новых знаний по указанным проблемам важно для медицины и экологии, поскольку фармакологическое действие ряда нитрит- и нитратсодержащих препаратов основано на их способности генерировать N0, а повышенные концентрации N0 в атмосферном воздухе, помимо острых и хронических отравлений, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечнососудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию оксидов азота (водители автотранспорта, работники химической промышленности, автостоянок, автозаправок и сотрудники ГИБДД). Транспорт такого экзогенного N0 также осуществляется гемоглобином.

Таким образом, исследование структурно-функциональных модификаций НЬ, индуцированных N0, имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы. Основной целью данной работы явилось изучение структурно-функциональных модификаций НЬ, индуцированных N0.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование спектральных характеристик растворов гемнитрозилгемог-лобина в диапазоне длин волн 240-900 нм.

2. Отработку подхода, позволяющего анализировать тонкую структуру спектра растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне поглощения энергии квантов апобелком.

3. Изучение влияния оксида азота (II) различных концентраций на спектральные и кислородсвязывающие характеристики окси-, дезокси- и метгемогло-бина.

4. Регистрацию и анализ спектров поглощения мембраносвязанного гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-600 нм.

5. Исследование спектральных и кислород связывающих характеристик молекул полигемоглобина с различным содержанием МО-производных гембелка.

Научная новизна. Зарегистрированы и проанализированы электронные спектры поглощения гемнитрозилгемоглобина (НЬЫО) в диапазоне длин волн 240-320 и 600-900 нм. В отношении НЬ>Ю применен разработанный нами метод анализа тонкой структуры спектров поглощения, позволивший идентифицировать 8 характеристических точек в его спектре в диапазоне длин волн 240-320 нм и установить вклад каждой из ароматических аминокислот в спектр поглощения НЬ.

Предложена гипотеза, согласно которой в НЬ связь между азотом проксимальных гистидинов апобелка 1НяР8) и железом гемов влияет на стабильность окислительно-восстановительного состояния Ре2+. Напряжение или разрыв этой связи, индуцированные лигандами, способствуют окислению Ре . На основании этой гипотезы предложен механизм реакции, согласно которому в частично нит-розилированном дезоксигемоглобине N0 приводит к образованию гемов с таким максимально низким сродством к лиганду, при котором возможна внутримолекулярная перегруппировка N0 к 811-группам Суя/ЙЗ с образованием Б-нитрозогемоглобина (8Ж)-НЬ).

Установлено, что присутствие в составе полигемоглобина (ро1уНЬ) N0-производных гембелка различных концентраций приводит к разнонаправленным изменениям кислородсвязывающих свойств образцов. На основании полученных экспериментальных данных предположено, что в качестве перспективного кисло-родтранспортного кровезаменителя с вазорегуляторной функцией можно использовать ро1уНЬ с низким содержанием МО-производных НЬ в составе ассоциата.

Получены данные о спектрах поглощения мембраносвязанного гемнитрозилгемоглобина человека в диапазоне длин волн 240-600 нм.

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы сведения расширяют современные теоретические представления о модификации структуры и функций НЬ при взаимодействии с низкомолекулярными лигандами. Предложенный механизм образования БЫО-НЬ может стать практической основой для

разработки новых терапевтических методов лечения патологий, связанных с N0, а также методов регулирования кислородтранспортной функции НЬ.

Выводы, полученные при изучении структурно-функциональных свойств ро1уНЬ с различным числом ЫО-производных в составе образца, необходимо принимать во внимание при разработке кислородтранспортных кровезаменителей на основе химически модифицированного НЬ, не вызывающих гипертонию.

Данные, полученные при анализе электронных спектров поглощения НЬЫО в широком диапазоне длин волн (240-900 им), могут быть использованы исследователями как справочные при изучении взаимодействия НЬ с N0.

Экспериментальные данные могут быть полезны при обсуждении вопросов экологической и медицинской биофизики, прогнозирования поведения белковых систем в условиях экологической нагрузки, в частности, при повышенном содержании оксидов азота в атмосфере, а также при использовании методов терапии, связанных с лекарственными препаратами - донорами оксида азота (II).

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета при проведении практических занятий, в ходе выполнения дипломных работ и магистерских диссертаций.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском конкурсном отборе инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции «Инновационное малое предпринимательство в приоритетных направлениях науки и высоких технологий» (Москва, 2006); Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего», проводимой в рамках международного форума Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, 2006); XX Съезде Всероссийского физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007); 16-й Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); 1-ой Международной научной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Москва, 2009); 9-м Съезде Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2010); научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2006, 2007, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оксид азота (II) является эффективным модулятором структурно-функциональных свойств окси-, дезокси- и метгемоглобина, проявляя как окислительно-восстановительные свойства, так и функции аллостерического эффектора.

2. В частично нитрозилированном гемоглобине (при концентрациях ли-ганда < Р50) N0 модулирует связь железа гемов с азотом проксимальных гис-тидинов апобелка таким образом, что становится возможной внутримолекулярная перегруппировка N0 к БН-группам Суэ/&3.

3. Хромофорами гемнитрозилгемоглобина, ответственными за наличие идентифицированных нами максимумов поглощения в диапазоне длин волн 240-

320 нм являются: фенилаланин (256,5, 260,5, 265,0 и 268,5 нм), триптофан (273,0, 279,0 и 291,0 нм) и тирозин (285,0 нм).

4. Полигемоглобин с низким содержанием NO-производных гембелка, включающий, по-видимому, в качестве NO-производных в большей степени S-нитрозогемоглобин, рекомендован как образец для получения кровезаменителя, не вызывающего гипертонию.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из раздела «Введение», 5 глав, «Заключения» и «Выводов». Включает 179 страниц машинописного текста, 6 таблиц и 58 рисунков. Список цитируемой литературы состоит из 163 источников, из них 50 отечественных и 113 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В главе представлен обзор основных работ, посвященных анализу структурно-функциональных свойств молекулы НЬ человека. Приводятся современные сведения о физико-химических свойствах, механизме синтеза и физиологической роли NO в организме человека, а также о взаимодействии НЬ с NO.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Растворы НЬ, суспензии эритроцитарных мембран получали из крови взрослых здоровых доноров. В качестве источников NO использовали газ (Linde, Россия), объемная доля NO в котором > 99,85 %, а также растворы нитрозоци-стеина, полученные согласно методу, описанному Монгиным и соавт. (А.А. Мон-гин и др., 1998). Растворы дитионита натрия готовили из кристаллического препарата фирмы «Merck» (Германия). Для формирования полимерных молекул НЬ использовали 25 %-й водный раствор глутарового альдегида («Reanal», Венгрия). Растворы тирозина, триптофана, фенилаланина и гистидина готовили, используя препараты фирмы «Ajinomoto» (Япония).

Электронные спектры поглощения регистрировали на UV/VIS спектрофотометре Shimadzu UV-2401PC (Shimadzu, Япония). В экспериментах использовали кварцевые кюветы с различной длиной оптического пути (от 1 до 10 мм). Обработку данных проводили с использованием компьютерных программ UVProbe 2.21 (Shimadzu, Япония) и Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft, США).

Оксигемоглобин (НЬ02) в концентрациях 10"5-10"3 моль/л в Na-фосфатном буфере (рН 7,4) выделяли с использованием метода (D. Drabkin, 1946; Л.А. Блю-менфельд, 1957).

Дезоксигемоглобин (deoxyHb) получали вакуумированием растворов ПЬ02 в тонометре со стандартной кварцевой кюветой в основании. Вакуумирование осуществляли на установке, разработанной на кафедре биофизики и биотехнологии ВГУ (В.Г. Артюхов, Г.А. Вашанов, 1990). Для специфических исследований deoxyHb получали, добавляя к НЬ02 дитионит натрия.

Метгемоглобин (MtHb) получали, инкубируя растворы НЬ02 с нитритом натрия в равных молярных соотношениях.

Полностью нитрозилированный Hb (HbNO) получали, инкубируя в тонометре раствор deoxyHb в атмосфере NO в течение 10 мин при 25 °С.

О наличии в растворе той или иной лигандной формы НЬ судили по изменению спектров поглощения. Для вычисления процентного содержания окси-, де-

зокси- и метгемоглобина использовалась эмпирическая система уравнений (JI.K. Стусь, Е.Д. Розанова, 1992; А. Zwart et al., 1981).

Растворы NO получали, насыщая предварительно дегазированный Na-фосфатный буферный раствор (0,1 моль/л, pH 7,4) газообразным N0. Полностью насыщенный газом буфер содержит 2 ммоль NO (S. Herold, G. Rock, 2003). При необходимости разбавляли раствор NO дегазированным буферным раствором. Раствор N0 добавляли к Hb с помощью прецизионных газонепроницаемых микрошприцов с тефлоновыми плунжерами (тип Gastight) (Hamilton, Швейцария).

Для получения deoxyHb при изучении его взаимодействия с N0 различных концентраций к раствору НЬ02 добавляли небольшой избыток дитионита натрия. Далее титровали deoxyHb раствором N0. Образцы инкубировали в течение 10 мин при 25 °С и периодическом перемешивании.

При исследовании изменений спектральных характеристик HbNO, индуцированных оксигенацией, атмосферу N0 удаляли из тонометра продувкой гелия (объемная доля Не в баллоне 99,99 %). Далее с помощью установки с вакуумметром раствор дегазировали и в тонометр порциями закачивали воздух, инкубируя систему в течение 10 мин при 25 °С и периодическом перемешивании.

При исследовании изменений спектральных характеристик частично нитро-зилированного гемоглобина (ЧНГ), индуцированных оксигенацией, добавляли к раствору deoxyHb расчетную концентрацию раствора N0 так, чтобы соотношение Гем:ЫО составляло 20:1. Далее в тонометр с помощью микрошприцов добавляли порциями воздух. Образцы инкубировали в течение 10 мин при 25 °С.

При исследовании изменений спектральных характеристик НЬ02, индуцированных N0, к НЬ02 добавляли различные объемы раствора с N0. Инкубировали образцы в течение 10 мин при 25 °С и периодическом перемешивании.

Для изучения реакции MtHb с N0 в аэробных условиях проводили те же манипуляции, что и для реакции НЬ02 с NO. В экспериментах с анаэробными условиями вакуумировали раствор MtHb, заполняли тонометр гелием и титровали MtHb раствором с N0.

Регистрацию кривых диссоциации оксигемоглобина (КДО) осуществляли спектрофотометрическим методом, описанным О.Б. Столяр и соавт. (1979). Величину константы Хилла (а) определяли как тангенс угла наклона графика в координатах Хилла в точке полунасыщения (Ч. Кантор, П. Шиммел, 1985).

PolyHb получали, добавляя к раствору НЬ02 глутаровый альдегид в соотношении компонентов 1:16 соответственно (F. D'Agnillo, Т.М. Chang, 1998). Очистку polyHb проводили методом колоночной гель-хроматографии (колонка 59,5x2,0 см, Toyopearl HW-60 (Япония)). В качестве элюирующего раствора использовали охлажденный Na-фосфатный буфер (0,1 моль/л, pH 7,4).

Тени эритроцитов получали по методу Доджа (J.T. Dodge et al., 1963).

Статистическую обработку результатов исследований проводили традиционным способом с использованием t-критерия при 5 %-ном уровне значимости.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ РАСТВОРОВ

ГЕМНИТРОЗИЛГЕМОГЛОБИНА В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН

240-900 НМ

Используя различные подходы, на первом этапе диссертационной работы был

осуществлен детальный анализ спектров поглощения растворов гемнитрозилге-моглобина (ПЫЧО), являющегося основным МО-производным НЬ в связи с высоким сродством N0 к атомам железа его гемов.

Полученные нами данные о спектральных характеристиках НЬЫО, НЬ02, с1еоху11Ь и МШЬ в диапазоне 240-900 нм представлены в табл. 1.

Таблица 1

Спектральные характеристики растворов НЮ2, с!еохуНЬ, МШЬ и НЬЫО в диапазоне 240-900 нм

лига иные формы НЬ 240-320 нм 320-400 нм 400-450 нм

/, 11М £Х10' м1™1 >, ни ЕХ105 ЛГ'ст"1 >, нм ЕХЮ5 м1™1

НЬОг 274,0 27,5 345,0 22,0 415,0 101,0

ШиуНЬ 269,0 23,4 355,0-370,0 26,0 430,0 1042

М(НЪ 274,0 233 345,0-373,0 28,5 405,5 121,0

НЬ(Рс+)\0 267,5 18,5 353,0 17,6 417,5 | 97,1

лига иные формы НЬ 450-560нм 560-650 нм 650-900 нм

/, нм гхЮ5 М*ст4 >, нм £Х1(У 1УГ'ст' Х,нм ЕХ10" ЛГ'ст"1

НЬОг 541,5 11,0 576,5 1 12,0 — —

ГкюхуНЬ 554,0 10,0 585,0-590,0 3,8 758,0 0381

МШЬ 499,0 7,0 629,0 2,8 — —

НЬ(Ге2>() 544,0 9,2 572,0 9,1 744,0 0245

Можно заключить, что во всем исследуемом диапазоне спектр поглощения №>N0 имеет характерные Л,,шх и которые отличаются от таковых для спектров НЮ2, с!еохуНЬ и МШЬ. В литературных источниках нами не обнаружены сведения о спектрах поглощения №N0 в диапазоне длин волн 600-900 нм. При регистрации спектров в данном диапазоне нами идентифицирована одна полоса ПОГЛОЩеНИЯ С Лщах = 744 нм. Примечательно, что в указанном диапазоне у всех исследуемых лигандных форм НЬ молярные коэффициенты поглощения ниже почти в 102 раз, чем в УФ-диапазоне и в области а-, ¡5- и у-полос. Поэтому для регистрации спектров поглощения в диапазоне длин волн 600-900 нм необходимо использовать растворы, концентрация НЬ в которых в 102 раз больше, чем при регистрации спектров в диапазоне длин волн 450-650 нм. Полученные нами сведения позволяют расширить диапазон используемых концентраций растворов различных структурных форм НЬ при исследовании их методами, основанными на спектральных различиях в дальней красной и ближней ИК-области спектра. Кроме того, становится возможным применять эти методы для изучения структурно-функциональных модификаций гембелка в составе эритроцитов и цельной крови.

Поскольку в диапазоне поглощения 450-650 нм спектр №N0 визуально сходен со спектром НЬ02 и данная область является достаточно информативной при исследовании структурно-функциональных модификаций НЬ, мы проанализировали ее более детально (рис. 1).

^ 1ш* — 576,0 п

чк = 7,0 наклоны = -1,45

Рис. 1. Электронные спектры поглощения в области а- и уЗ-полос: 1 - НЪО; 2 - НЬN0

Важную роль в проявлении функциональных свойств НЬ играет его белковая часть. Тестом на структурные перестройки апобелка, индуцированные N0, может служить регистрация спектральных характеристик НЫ*Ю в УФ-области, где наиболее информативным является диапазон 240-320 нм с полосами, обусловленными в основном поглощением энергии квантов тирозином, триптофаном, фенилаланином и гистидином. Нами были зарегистрированы спектры поглощения растворов НЫТО в диапазоне 240-320 нм. На рис. 2 показан спектр поглощения НЫЧО, а также его первая производная, демонстрирующие наличие слабо выраженных и, возможно, скрытых максимумов, для идентификации которых могут потребоваться особые подходы.

Рис. 2. Раствор НЬМО (30 мкмоль/л): 1 - электронный спектр поглощения; 2 -первая производная спектра поглощения (по вспомогательной оси); средние величины по 5 донорам

•0,002

-0,007

•0,012

305 I, пт

Мы получили модельный спектр на основе спектра реальной системы. Расчет величин стандартной ошибки для модели по отношению к спектру поглощения раствора ПЬЫО позволил выявить 8 характеристических точек в спектре (рис. 3), которые могут быть использованы как контрольные при изучении влияния различных физико-химических факторов на НЬЫО.

Рис. 3. Величины стандартной ошибки для модели по отношению к спектру поглощения раствора №N0 в диапазоне длин волн 255-305 нм

.0,0012 1 Чтобы выявить связь между иденти-

>-пт фицированными характеристическими точками и хромофорами определенных типов, был реконструирован спектр раствора НЬ с использованием полученных нами данных о спектрах поглощения отдельных ароматических аминокислот (ААК), входящих в его состав. На рис. 4 показан

0,0004

вклад в поглощение каждой из ААК в соотношениях эквивалентных их содержанию в молекуле НЬ в пересчете на четыре субъединицы белка.

Рис. 4. Реконструкция спектра поглощения раствора НЬ: 1 - триптофан (6); 2 -тирозин (12); 3 - фенилаланин (30); 4 - гис-тидин (38)

Для сравнения характеристических точек реального спектра и реконструкции мы рассчитали величины стандартной ошибки для модели по отношению к реконструированному спектру поглощения НЬ в

диапазоне длин волн 240-300 нм (рис. 5).

281,5

,288,5

700

!257,5

263.5

¡240,5 251.5 | .1 272,0 зоГ Ч (^Г\|272 {

-1300

Рис. 5. Величины остаточной стандартной ошибки для модели по отношению к реконструированному спектру поглощения раствора НЬ в диапазоне длин волн 240-300 нм

Далее мы сопоставили идентифицированные нами характеристические точки в спектре поглощения раствора НЬМО с максимумами, характерными для реконструкции спектра

НЬ, а также с максимумами, выявленными нами (данные не представлены) в спектре НЬС>2 в диапазоне длин волн 240-320 нм. Сравнительный анализ показал, что в спектре раствора НЬЫО максимумы 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм обусловлены поглощением энергии квантов остатками фенилаланина; максимумы 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов остатками триптофана; поглощение энергии квантов остатками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм (табл. 2).

Таблица 2

Характеристические точки спектров поглощения ААК, реконструкции спектра гем-белка, НЬ02 в растворе и ПЫЧО в растворе; смещение характеристических точек

Осрисц Л,нм

Не'

Ик1 241,5 247,0 251,5 2575 2635 2670 - - - - -

Туг1 - - - - - - - 2750 - 2815 -

ТФ' - - - - - - 2715 - 2795 - 28^5

НЬ«2 24Ц5 2465 2515 2575 2635 - 2720 - - 2815 2885

НЬОг3 24X0 247^ 2535 259,0 265,0 2685 2735 - 2795 28Ф,0 2915

НЬЫО4 - - 2565 2605 265,0 2685 273,0 - 2795 285,0 291,0

НЬОг-НЬ» +1,5 +ио +15 +15 +15 - +15 - - +25 +3,0

НЬШ-НЬ» - - +5,0 +3,0 +15 - +1,0 - - +35 +25

Примечания: 1 - характеристические точки спектра поглощения ААК; 2 -характеристические точки реконструкции спектра поглощения НЬ (НЬ*); 3 - характеристические точки спектра поглощения НЬ02; 4 - характеристические точки спектра поглощения {№N0; НЬ02-НЬ* - смещение характеристических точек раствора ПЬ02 относительно реконструкции спектра гембелка; НЫМО-НЬ" -смещение характеристических точек раствора ПЬЫО относительно реконструкции спектра гембелка.

Таким образом, представленные в настоящем разделе сведения позволяют идентифицировать различные лигандные формы НЬ в образцах и на основании анализа их спектральных свойств выявлять структурные переходы в молекулах гембелка.

ГЛАВА 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИ-, ДЕЗОКСИ- И МЕТГЕМОГЛОБИНА С ОКСИДОМ АЗОТА (II)

Целью следующего этапа диссертационной работы явилось изучение структурно-функциональных модификаций НЬ02, ёеохуНЬ и МШЬ при взаимодействии с N0 различных концентраций.

Нами показано, что с увеличением концентрации N0 происходит окисление

раствора НЬ02 до МШЬ (рис. 6).

Рис. 6. Спектры поглощения, отражающие взаимодействие НЬ02 с N0: 1 - НЬ02 (140 мкмоль/л по гему); 2-7 мкмоль/л N0; 3 - 17,5 мкмоль/л N0; 4 -140 мкмоль/л N0

Повышение концентрации N0 в растворе до соотношений НЬ:Ж) = 1:12,5 (по гему) в наших экспериментах приводило к восстановлению МШЬ до №N0 (рис. 7).

Рис. 7. Спектры поглощения, отражающие процесс титрования раствора НЬ02 (140 мкмоль/л по гему) N0: 1-140 мкмоль/л N0; 2 - 350 мкмоль/л N0; 3 -1750 мкмоль/л N0

Таким образом, Ре3+-гемы, образующиеся в 11Ь02 при его взаимодействии с N0, восстанавливаются при повышении концентрации лиганда. Для проверки этого предположения мы провели эксперименты, в которых раствор МШЬ в аэробных и анаэробных условиях титровали раствором с N0, регистрируя спектральные характеристики полученных об-

А. пп1

450 482 514 546 578 610 642

/„ П1П

разцов. Нами показано, что, несмотря на высокие соотношения Hb.NO (~ 1:3 по гему), в аэробных условиях добавление различных концентраций N0 приводит к незначительному изменению спектров поглощения МШЬ (рис.8).

Рис. 8. Дифференциальные спектры поглощения относительно МШЬ (160 мкмоль/л по гему, по основной оси): 1—60 мкмоль/л N0; 2-125 мкмоль/л N0; 3-180 мкмоль/л N0; 4 -500 мкмоль/л N0; 5 - дифференциальный спектр, полученный при вычитании из спектра НЬЫО спектра МШЬ (по вспомогательной оси)

-0,01

-0,05

-0,02

Это, по-видимому, связано с наличием в буферном растворе 02, который преобразует большую часть N0 в нитрит-ионы, поскольку скорость взаимодействия N0 с 02 (~ 106 моль'хс"1) выше, чем N0 с МШЬ (~ Ю'-Ю3 моль"'хс'). Поэтому в эксперименте с анаэробными условиями МШЬ в большей степени преобразовывался в №N0, чем в присутствии 02 (рис. 9).

455 480 505 530 555 580 605

630 "A, nm

Рис. 9. Спектры поглощения раствора MtHb в анаэробных условиях, титрованного раствором с NO: 1 - раствор MtHb в атмосфере гелия (160 мкмоль/л по гему); 2

- 60 мкмоль/л N0; 3-180 мкмоль/NO л; 4

- 400 мкмоль/л N0; 5 - 500 мкмоль/л N0

Таким образом, по отношению к НЬ02 и MtHb NO проявляет окислительно-восстановительные свойства.

При изучении изменений спектров поглощения deoxyHb в диапазоне 450-650 нм, индуцированных N0 различных концентраций, выявлен переход deoxyHb в HbNO, а также обратимые изменения спектров в области максимума поглощения 629,0 нм, характерного для MtHb. Это побудило нас остановиться на исследовании взаимодействия deoxyHb с NO различных концентраций более детально.

При оксигенации deoxyHb его спектры поглощения в диапазоне 390-450 нм

пересекаются в одной точке при Л = 420 нм, называемой изосбестической точкой (рис. 10). Ее наличие свидетельствует о взаимном переходе в системе в основном только двух лигандных форм - deoxyHb в НЬ02.

Рис. 10. Дифференциальные спектры поглощения относительно deoxyHb, отражающие процесс его оксигенации

AD 0,55

0,35 0,15 -0,05 -0,25 -0,45 -0,65 -0,85 -1,05 -1,25

(И> НЬ

^««1=410,5 nm

нзосбестаческая точка

При постепенном насыщении ёеохуНЬ N0 изосбестическая точка в спектрах отсутствовала (рис. 11), что может быть следствием образования промежуточной лигандной формы (например, МШЬ) в ходе реакции.

Рис. 11. Дифференциальные спектры поглощения относительно (1еохуНЬ, отражающие процесс его нитрозиляции

Для проверки предположения о метгемоглобинобразовании, мы изучили изменения интенсивности поглощения при Яида = 629 нм (максимум МШЬ, табл. 1) в ходе реакции с1еохуНЬ с N0 различных концентраций. На рис. 12 показано, что с ростом концентрации N0 происходит постепенное увеличение интенсивности поглощения при Л„,ах = 629 нм, максимальное значение которой приходилось на концентрации N0, соответствующие значению полунасыщения гембелка лигандом (Р50). Дальнейшее увеличение концентрации N0 приводит к снижению значений поглощения при Л^ = 629 нм.

06ц

0,046

0,04 0,034 0,028

Г*1

Рис. 12. Зависимость изменения поглощения при Ятю = 629 нм от соотношения Гем(Ре2+):Ж). Концентрация гемоглобина в растворе 140 мкмоль/л (по гему)

20:1 10:1 5:1

2:1 1:1 1:5 Гем(Ре2*):ГТО

На основании полученных нами данных и сведений литературы, мы полагаем, что в ходе реакции ёеохуНЬ с N0 различных концентраций на начальных ее этапах (при концентрациях N0 < Р50, когда гембе-лок находится в Т-состоянии) в реакционной системе образуются молекулы частично нитрозилированного гемоглобина с «-N0 темами, находящимися в пограничном пяти-/шестикоординационном состоянии. По-видимому, в связи с транс-лигандным эффектом N0, индуцирующим, в конечном итоге, значительное ослабление или разрыв связи между атомом Ре2+ ЫО-гема и азотом проксимального гистидина, происходит дестабилизация и окисление атома железа 1ЧО-гемов. Повышение концентрации N0, приводящее к переходу молекулы НЬ из Т- в II-состояние, восстанавливает ее шестикоординационное состояние, а также Ре3+-гемы, образуя НЬ(Ре2+)4(КО)4.

В физиологических условиях концентрация N0 в кровеносном русле значительно ниже количества внутриэритроцитарного НЬ (.1.5. 81ат1ег й а1., 1997). Таким образом, НЬ в эритроцитах будет частично нитрозилирован. В связи с этим, нам представлялось необходимым изучить кислородтранспортные характеристики частично нитрозилированного гемоглобина (ЧНГ). Мы исследовали изменения спектров поглощения ЧНГ (Гем(Ре2+):ЫО = 20:1) в ходе оксигенации.

Показано, что после добавления 4, 8 и 20 мкмоль/л 02 изосбестические точки в спектрах находятся, соответственно, при 407, 410 и 416 нм (рис. 13). Последующие добавления 36-264 мкмоль/л 02 приводят к появлению изосбестической

точки в области 420 нм.

Рис. 13. Оксигенация ЧНГ (Гем(Ре2+):Ш = 20:1). Пунктирные -спектры при добавлении 4, 8 и 20 мкмоль/л 02; сплошные - спектры при добавлении 36-264 мкмоль/л 02

На рис. 14 изображены дифференциальные спектры ЧНГ относительно с1еохуНЬ в диапазоне 405^25 нм. Максимум 413,5 нм (тонкая линия, треугольный маркер, 0 мкмоль/л 02) близок к величине максимума дифференциального спектра НЪЫО относительно с!еохуНЬ (415,0 нм). Он свидетельствует о наличии молекул N0, связанных с темами. Начальные этапы оксиге-нации (рис. 14, толстые линии, 4, 8 и 20 мкмоль/л 02) приводили к постепенному исчезновению максимума при 413,5 нм, что может быть следствием перегруппировки молекул N0 от гемов к БН-группам Сув/ЙЗ гембелка.

Рис. 14. Дифференциальные спектры поглощения относительно с1еохуНЬ, отражающие процесс ок-сигенации ЧНГ. Цифрами на спектрах обозначена концентрация добавленного 02 воздуха (мкмоль/л)

При последующих добавлениях 02 (рис. 14, тонкие линии, концентрации 02 36-264 мкмоль/л) появлялась изосбестическая точка в области 420 нм (круглый маркер), свидетельствуя о полной перегруппировке молекул N0 от гемов к БН-группам Сув/ЙЗ, и обнаруживался максимум при 410,5 нм, характерный для дифференциального спектра НЬ02, доказывающий, что далее происходит насыщение кислородом вакантных гемов.

При изучении изменений спектральных характеристик полностью нитрози-лированного НЬ, индуцированных оксигенацией, был выявлен сдвиг характерного для него Л,пах = 417,5 нм в коротковолновую область к значению 409,5 нм, что свидетельствует об окислении №N0 и накоплении в растворе МШЬ. Согласно данным литературы, механизм этой реакции включает в себя две стадии. Сначала происходит связывание нитрозила с кислородом с образованием пероксинитрита,

координирующегося с железом гемов через азот. Далее следует диссоциация пе-роксинитрита и/или его преобразование до нитрата (S. Herold, G. Rock, 2003).

Таким образом, анализ изменений спектров поглощения позволил нам предположить, что процесс оксигенации ЧНГ может сопровождаться внутримолекулярным переходом NO от гемовых группировок к SH-группам Cys/593. В ходе регистрации КДО ЧНГ установлено, что частичная нитрозиляция Hb, при которой соотношение молекул TeM(Fe2+):NO составляло 20:1, соответственно, приводила к достоверному увеличению сродства Hb к 02 по отношению к контролю: величина полунасыщения лигандом (P5Ü) уменьшалась с 18,7±1,6 до 8,1±1,2 мм рт.ст., а константа Хилла (а) - с 2,7±0,2 до 2,1±0,1. С одной стороны, к увеличению сродства остальных субъединиц к 02 может приводить образование гемина в одной из or-субъединиц тетрамера, обусловленное значительным напряжением или разрывом связи железа гема с проксимальным гистидином из-за транс-лигандного эффекта NO (R.E. Benesch et al., 1965). С другой стороны, согласно литературным данным, S-нитрозогемоглобин также обладает повышенным сродством к 02 вследствие стабилизации R-конформации гембелка (С. Bonaventura et al., 1999). Снижение величины а свидетельствует об уменьшении кооперативного взаимодействия субъединиц в ходе оксигенации, что, возможно, связано с большей структурной жесткостью молекулы ЧНГ, обусловленной наличием в одной из его ¿г-субъединиц гемина или связыванием молекул NO с SH-группами Cys/03,

Оксигенация ЧНГ при соотношении TeM(Fe2+):NO = 5:1 приводила к резкому сдвигу КДО вправо, что свидетельствует о снижении сродства гембелка к 02. В данном случае КДО имели не S-образную, а почти гиперболическую форму, значение Р50 повысилось с 18,7±1,6 до 33,4±2,2, а а снизилась с 2,7±0,2 до 1,7±0,2.

Таким образом, повышение концентрации N0 в растворе резко изменяло функциональные свойства Hb. Согласно литературным данным, похожие эффекты наблюдались при увеличении в растворе оксигемоглобина концентрации MtHb (В.Г. Артюхов [и др.], 1997). Кроме того, ранее нами было показано, что при концентрациях N0, близких к значению Р50, количество окисленных гемов в ЧНГ максимально. Очевидно, это будет приводить к снижению сродства ЧНГ к 02.

При последующих увеличениях концентрации N0 в растворе зарегистрировать КДО ЧНГ не удалось, что, по-видимому, связано со значительным накоплением MtHb в ходе реакции оксигенации.

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ NO-ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ГЕМНИТРОЗИЛГЕМОГЛОБИНА

Исследование структуры и функций полигемоглобина (polyHb) является весьма актуальным, поскольку он привлекателен в качестве источника для получения перспективных кислородтранспортных кровезаменителей. Однако применение polyHb, состоящего из нативных тетрамеров гембелка, приводит к резкому сужению кровеносных сосудов, что обусловлено связыванием полигемоглобином эндотелиального NO (M.G. Scott et al., 1997). Опираясь на экспериментальные данные, полученные в диссертационной работе, мы предполагаем, что, возможно, решением данной проблемы будет включение в состав polyHb NO-производных

гембелка с нитрозованными ЯП-группами Суэ/ЙЗ или с небольшим числом нит-розилированных гемовых группировок. Для проверки этого предположения мы исследовали ро1уНЬ с соотношением молекул НЬ-МО-производпые и НЪ02 = 1:4 и 2:3, соответственно, и сравнили их свойства с ро1уНЬ, состоящим из пяти тетра-меров НЬ02. В качестве NO-пpoизвoднoгo НЬ использован продукт взаимодействия (1еохуНЬ с 8-нитрозоцистеином (Суя-ЫО). Методом гель-хроматографии показано, что молекулярные массы образцов Ро1уНЬ, образованных из окси- и МО-производных гембелка, в наших экспериментах составили 311,2±3,2 и 310,3±7,2 соответственно, что свидетельствует об объединении пяти тетрамеров НЮ2 и МО-производных гембелка.

С целью выявления структурных перестроек, вызванных включением в состав ро1уНЬ различного количества молекул МО-производных гембелка, нами зарегистрированы электронные спектры поглощения этих образцов (табл. 3).

Таблица 3

Спектральные характеристики нативного оксигемоглобина и полигемоглобина различного состава в диапазоне длин волн 320-650 нм.

Структурные формы НЬ 320-400 нм 400-450нм 450-560нм 560-650 нм

Л, нм Я, нм Л, нм Л, нм

охуНЬ 345,0 415,0 541,5 5764

ро1у-охуНЪ 344,0 408,5 539,5 575,0

ро1уНЬ НЬ:Ж> = 4:1 352,0 416,0 538,0 573,5

НЬ:Ж) = 3:2 353,0 417,5 538,0 574,0

Выявлено, что при соотношении молекул НЬ-МО-производные:НЬ02 = 1:4 происходит сдвиг максимума полосы Соре к значению 416,0 нм, что доказывает образование частично нитрозилированного ро1уНЬ. При увеличении количества ТТО-производных НЬ в составе ро1уНЬ до соотношения 2:3 максимум полосы Соре сдвигается к 417,5 нм, свидетельствуя об увеличении количества НЬЫО в составе ро1уНЬ. Примечательно, что введение в состав ро1уНЬ молекул МО-производных гембелка при всех соотношениях приводило к увеличению числа тетрамеров с окисленными темами. Об этом свидетельствует увеличение степени выраженности максимума поглощения при 629,0 нм. Это, по-видимому, связано с реакцией окисления, проходящей между нитрозилами МО-производных гембелка и молекулами 02, находящимися в растворе и в составе ро1уНЬ. Целесообразность использования таких образцов в качестве кровезаменителя с функцией донора N0 можно протестировать, измеряя параметры основных кислородсвязывающих характеристик ро1уНЬ, полученного из окси- и МО-производных гембелка.

Регистрация КДО показала, что при минимальном соотношении НЬ-МО-производпые: НЬ02 = 1:4 происходит сдвиг сатурационной кривой влево относительно ро1у-охуНЬ. Значения Р50 и а для этих образцов составили 6,7±1,3 и 1,9±0,2, соответственно, уменьшаясь относительно таковых, выявленных для ро1у-охуНЬ (Р50 = 12,2±0,5; а = 2,1±0,2). Такие изменения кислородсвязывающих характеристик ро1уНЬ с низким содержанием МО-производных гембелка, по-видимому, подобны описанным изменениями основных параметров КДО ЧНГ по

сравнению с нативным гембелком. Это дает нам основание полагать, что уменьшение значения Р50 и а может быть связано с образованием в качестве NO-производного в большей степени S-нитрозогемоглобина, который обладает более жесткой структурой и повышенным сродством к 02 вследствие стабилизации R-конформации гембелка (С. Bonaventura et al., 1999).

КДО polyHb, образованного при соотношении НЬ-Ж)-производные:НЬ02 = 2:3, имели нетипичную форму. Значения Р50 и а при этом составили 37,7±1,6 и 1,4±0,2 соответственно. Такое резкое снижение сродства polyHb к 02 и уменьшение значения а, по-видимому, обусловлены увеличением количества молекул N0, связанных с гемовыми группировками Hb. Ранее нами было показано, что при этом происходит практически полное нарушение кислородсвязывающих свойств тетрамерных образцов вследствие накопления в ходе оксигенации MtHb. Следовательно, накоплением метформы гембелка в составе polyHb с большим содержанием NO-производных-НЬ в ходе оксигенации можно объяснить практически полное нарушение кислородтранспортной функции в таких образцах. Кроме того, этот процесс, очевидно, сопровождается разобщением функционирования субъединиц в тетрамерах, что сказывается на снижении значения константы Хилла.

На основании литературных данных и проведенных нами экспериментов, можно заключить, что из исследованных нами образцов в качестве кислород-транспортного кровезаменителя с функцией донора N0 целесообразно использовать polyHb с меньшим содержанием NO-производных гембелка.

В литературе нами не обнаружены данные о спектральных характеристиках нитрозилированного мембраносвязанного гемоглобина, который, как полагают, может быть посредником при экспорте N0 за пределы эритроцита (J.R. Pawloski et al., 2001). В связи с этим мы провели эксперименты, в которых суспензию теней эритроцитов инкубировали в атмосфере NO и регистрировали спектральные характеристики реакционной системы в широком диапазоне длин волн. Полученные нами данные о спектрах поглощения теней эритроцитов могут быть использованы в качестве справочных при изучении механизмов экспорта N0 из эритроцитов (табл. 4).

Таблица 4

Спектральные характеристики внутриэритроцитарного и мембраносвязанного окси-, дезокси- и гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 250-650 нм

Лигандные формы внутриэритроцитарн. и мембраносвяз. Hb 240-320 нм 320-400нм 400-450нм 450-560нм 560-650нм

Я, нм Я, нм Я, нм Я, нм Я, нм

ньо2 внутр. 274,0 345,0 415,0 541,5 576,5

мембр. 274,0 345,0 414,5 541,0 576,5

DeoxyHb внутр. 269,0 355,0-370,0 430,0 554,0 585,0-590,0

мембр. 266,0-276,0 350,0-365,0 430,0 554,5 585,0-595,0

Hb(Fe2+)NO внутр. 267,5 353,0 417,5 544,0 572,0

мембр. 263,0-276,0 352,0 417,5 545,5 573,0

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения настоящей диссертационной работы, а также анализ литературных сведений позволяют заключить, что структурно-функциональные изменения молекулы гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II), определяются, главным образом, концентрацией N0 и О2 в растворе, структурной формой гембелка, а также наличием в составе гемоглобина аллострически регулируемых активных центров - гемов и БН-групп остатков Су593/?.

С одной стороны, неспаренный электрон N0, переменная валентность атомов железа гемоглобина и наличие 02 в растворе или в связанном с гембелком состоянии обусловливают протекание окислительно-восстановительных реакций между этими молекулами. С другой стороны, в анаэробных условиях при субса-турационных концентрациях N0 сказывается транс-лигандный эффект по отношению к гемам, приводящий к конформационным изменениям в гемоглобине на уровне третичной структуры. Во всех исследованных нами реакциях структурно-функциональные модификации окси-, дезокси- и метгемоглобином, индуцированные оксидом азота (II), находили отражение в отклонении спектральных и ки-слородсвязывающих характеристик от таковых параметров нативных образцов.

С использованием метода моделирования спектров поглощения нами выявлены 8 характеристических точек (X, нм) в спектре гемнитрозилгемоглобина в диапазоне 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов индольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фенольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

Экспериментальные данные показали, что взаимодействие НЬ02 и N0 приводит к образованию МШЬ. Мы предполагаем существование как минимум двух механизмов взаимодействия N0 с НЬ02. Первый - обусловлен взаимодействием молекул N0 сначала с растворенным 02 с образованием нитрит-ионов, которые окисляют гемовые группировки белка, преобразуясь в нитрат-ионы. Второй механизм начинается реакцией молекул N0 с кислородом НЬ02, или замещением в НЬ02 кислорода на N0. Далее вследствие отрыва одного электрона от атома Ре2+ гемов образуется МШЬ и пероксинитрит. Таким образом, с одной стороны, в реакции НЬ02 и N0 атомы железа гемов окисляются при участии кислорода. С другой стороны, нами показано, что образующийся при этом МШЬ может восстанавливаться при повышении концентрации N0 с образованием НЬЫО.

В экспериментах с МШЬ N0 выступает в роли восстановителя. Согласно данным литературы, соединение НЬ(Ре3+)>10 относительно не очень стабильно и в присутствии избытка N0 подвергается восстановительной нитрозиляции с образованием НЬ(Ре2+)ЫО (Т.О. Тгау1ог, У.Б. БЬагша, 1992). В экспериментах с анаэробными условиями МШЬ полностью в №N0. Поскольку в растворе скорость взаимодействия N0 с 02 выше, чем N0 с МШЬ, то в аэробных условиях в реакционной смеси НЬЫО спектральным методом обнаруживался в небольших количествах.

В отличие от НЬ02 и МШЬ, с которыми N0 вступает в окислительно-восстановительные реакции, при взаимодействии (1еохуНЪ с N0 в определенных

условиях сказывается транс-лигандный эффект последнего. Так, нами установлено, что на начальных этапах взаимодействия deoxyHb с N0 в реакционной системе накапливаются молекулы ЧНГ с окисленными гемовыми группировками, максимальный выход которых наблюдается при концентрациях N0, соответствующих давлению полунасыщения гембелка лигандом (Р50). Согласно литературным данным (R. Hille et al., 1979), при концентрациях NO ниже или близких к Р5Ц в а-N0 гемах транс-лигандный эффект вызывает значительное напряжение или разрыв связи между атомом железа гема и азотом проксимального гистидина (Fe-Nf), что приводит к образованию пятикоординационных яг-NO гемов с низким сродством к лиганду. Анализируя этот эффект, необходимо учитывать известные из литературы данные о том, что молекулы 02 тоже модулируют связь Fe-N,; в а-субъединицах, напряжение которой нарастает к точке перехода гембелка в R-состояние (R. Hille et al., 1979). Сопоставляя литературные сведения и полученные нами данные, мы выдвигаем следующую гипотезу. Взаимодействие N0 с одной или двумя or-субъединицами дезоксигемоглобина вызывает сильное напряжение или разрыв связей Fe-Nf, что приводит ог-ферро-гемы в такое состояние, при котором значительно повышается вероятность их окисления. Возможно, именно этим эффектом объясняется известный из литературы факт, что молекула Hb в состоянии полунасыщения лигандом проявляет наименьшую устойчивость к окислению, поэтому для минимизации промежутка времени, в котором вероятность окисления атомов железа максимальна, происходит ускорения ассоциации и диссоциации лигандов в области Р5() за счет кооперативного взаимодействия субъединиц Hb (Л.И. Иржак, 1975). Таким образом, с транс-лигандным влиянием N0 связано выявленное нами в ходе изучения реакции ассоциации этого лиганда с deoxyHb накопление MtHb, максимальное количество которого было при концентрациях NO, близких к Р50. Повышение концентрации N0 индуцировало переход молекулы гемоглобина из Т- в R- шестикоординационное состояние (с невозмущенной связью Fe-N£), а также восстанавливало Fe3+-reMbi до Hb(Fe2+)4(N0)4.

По-видимому, в эритроцитах именно ЧНГ в Т-состоянии является наиболее вероятным переносчиком N0. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности преобразования в ходе оксигенации ЧНГ в S-нитрозогемоглобин. Согласно сведениям литературы, при Т—>R переходе Hb повышается реакционная способность SH-групп остатков Cys-/£)3 его апобелка, расположенных вблизи ß-гемов (L. Jia et al., 1996). С другой стороны, известно, что при концентрациях, меньших Р5о, N0 может совершать внутримолекулярные переходы между а- и ß-гемами (R. Hille et al., 1979). Кроме того, ранее мы обсудили механизм окисления гемовых группировок NO из-за нарушения связи Fe-Nf or-субъединиц в ЧНГ. Как известно, очень устойчивые комплексы Hb(Fe2+)NO становятся обратимыми, когда железо в гемоглобине окислено до Fe3+ (A.A. Недоспасов, 1998). Таким образом, в ЧНГ возможны такие состояния молекулы, при которых происходит внутримолекулярная перегруппировка N0 от гемов к SH-группам Cys/ЗД Hb (т.е. образуется SNO-Hb). Кроме того, нами показано, что частичная нитрозиляция deoxyHb приводит к повышению сродства гембелка к 02 и снижению кооперативного взаимодействия субъединиц. Это может быть связано как с образованием ге-мина в ar-субъединицах тетрамера вследствие значительного напряжения или раз-

рыва связи Fe-Nf из-за транс-лигандного эффекта N0, так и с образованием S-нитрозогемоглобина, поскольку, как известно, в этом случае наблюдается затруднение осуществления His-/?146 стабилизации Т-состояния гембелка (С. Bonaventura et al., 1999). Следовательно, в случае нитрозации SH-групп Cysß)3 молекула N0 может играть роль аллостерического эффектора, повышая сродство гемоглобина к кислороду. При образовании пятикоординационных or-NO геминов N0 является модулятором состояния активного центра, что также приводит к изменению сродства гембелка к кислороду. С другой стороны, ассоциация и диссоциация молекулы 02 изменяет сродство Cys/ЙЗ к N0: в R-состоянии оно выше, чем в Т-состоянии. В этом случае кислород выступает в роли аллостерического модулятора, а активными центрами по отношению к NO в молекуле гемоглобина являются SH-группы Cys/93. Таким образом, обсуждаемые механизмы могут обусловливать главную функцию гемоглобина - роль сенсора, чувствительного к потребностям в кислороде клеток и тканей, способного не только транспортировать 02 и С02, но и регулировать скорость кровотока путем диссоциации определенного количества NO, повышая эффективность газообмена.

Базируясь на данных, полученных в ходе изучения взаимодействия тетра-мерного Hb с NO мы предположили, что polyHb, в составе которых будут присутствовать молекулы NO-производных Hb, могут оказаться эффективными кисло-родтранспортными кровезаменителями, не вызывающими гипертонию. Нами показано, что при соотношениях компонентов polyHb НЬ-ЫО-производные:НЬ02 = 1:4, по-видимому, основным NO-производным является SNO-Hb, а повышение соотношения компонентов до 2:3 приводит к увеличению доли HbNO. Об этом свидетельствует повышение сродства образцов к 02 в первом случае и резкое его снижение во втором. Таким образом, для получения кислородтранспортного кровезаменителя на основе polyHb с функцией донора N0 мы рекомендуем использовать polyHb с низким содержанием NO-производных. По нашему мнению, такой polyHb будет в кровеносном русле, подобно ЧНГ, в ходе циклов оксигенации-дезоксигенации преобразовываться в SNO-Hb, передавая N0 при переходе тетра-меров в Т-состояние на тиолсодержащие молекулы плазмы (альбумин, глутатион и др.) или непосредственно на растворимую гуанилатциклазу, предотвращая тем самым гипертонию.

На основании полученных нами экспериментальных данных и литературных сведений предложены обобщающие схемы: на рис. 15 отображена схема возможных реакций различных структурных форм гемоглобина с N0 и NO-производными в организме; на рис. 16 показан механизм гипоксической вазоди-латации, действующий в микроциркуляторном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II).

N0., + -N0 + 02 + Н/)

НЬ(Ре2+02)4 -

N0 + 02—

- НЬ(Ре3+ЫОО)4 О

- ¿рН _

-ОЫОО I ' 0Ш0Н^М03

НЬ(ог Ге3+)(Ре2+02)3(Су8у®3-N0)

ОН + Ш

НЬ(Ре3+)4^1

ГКО

НЬ(Ре3+>Ю)4

НЬ(Ре2+ЫО+)4 ^

-N0

■НЬ(Ре2+)4 -::^гНЬ(Ре2+)з(аРс2+ЫО) / НЬ(аРе3+ЫО)2(уа7е2+)у-^^НЬСРе^О).

2NO

НЬ(«Ре3^0)2(Д7е2+)2 ~-^НЬ(оРе3+)2(/5Ре2+)2

Рис. 15. Схема процессов взаимодействия гемоглобина с оксидом азота (II)

\2И

Рис. 16. Механизм гипоксической вазодилатации, действующий в микроциркуляторном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II)

ВЫВОДЫ

1. Идентифицированы 8 максимумов в спектре №N0 в диапазоне длин волн 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм обусловлены поглощением энергии квантов ин-дольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фенольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

2. Установлено, что при взаимодействии с оксигемоглобином N0 меняет валентное состояние атома железа, выступая в роли окислителя. Реакция проходит при участии растворенного или связанного с гембелком кислорода через промежуточное образование питрит-иона и пероксинитрита.

3. Показано, что в анаэробных условиях N0 полностью восстанавливает гемо-вые группировки метгемоглобина, преобразуя его в гемнитрозилгемоглобин. В аэробных условиях кислород конкурирует с метгемоглобином за связывание с N0.

4. При инкубации дезоксигемоглобина с N0 в концентрациях < Р50 в ог-цепях гембелка транс-лигандный эффект индуцирует резкое ослабление или разрыв связи между атомом железа 1Ч0-гема и азотом (Ыг) проксимального гистидина (№зР8). Следствием этого явилось образование в гембелке Ре3т-МО-гемов с максимальным их количеством в области Р50. Дальнейшее увеличение концентрации N0 приводило к восстановлению геминов в аг-субъединицах и образованию полностью нитрозилированного гемоглобина.

5. Методами спектрофотометрии и регистрации кривых диссоциации НЬ показано, что оксигенация частично нитрозилированного гемоглобина индуцирует внутримолекулярный переход N0 от ог-гемов к БН-группам Сув/ЙЗ, что, по-видимому, обусловлено транс-лигандным эффектом N0, индуцирующим окисление атомов железа гемов и образование ог-субъединиц в Т-состоянии с наименьшим сродством к лиганду, а также повышением сродства БН-групп Суя/393 к N0 при переходе тетрамера в Я-состояние.

6. Оксид азота (II) модифицирует кислородсвязывающие характеристики НЬ. При низких концентрациях N0 (Гем:Ы0 = 20:1) сродство НЬ к 02 повышается, что может быть связано как с накоплением сг-геминов, так и с образованием БКО-НЬ. Увеличение концентрации N0 приводит к резкому снижению сродства НЬ к 02, обусловленному накоплением МШЬ.

7. Полимеризация НЬ02 увеличивает сродство тетрамеров к 02. Введение в состав ро1уНЬ ЫО-производных гембелка при соотношении компонентов НЬ-МО-производные:НЬ02 = 1:4 и 2:3 приводило в первом случае к дальнейшему повышению сродства ро1уНЬ к 02, а во втором - к резкому снижению кислородсвязы-вающих характеристик образцов.

8. Установлено, что в образцах полигемоглобина с соотношением компонентов НЬ-МО-производные:НЬ02 = 1:4 в качестве ЫО-производных в большей степени образуется Б-нитрозогемоглобин, а при соотношении компонентов 2:3 -гемнитрозилгемоглобин.

9. Показано, что положения максимумов в спектрах поглощения мембраносвя-занного окси-, дезокси и гемнитрозилгемоглобина практически идентичны таковым для спектров внутриэритроцитарного гембелка.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рубан М.К. Структурно-функциональные изменения молекул полигемоглобина человека, индуцированные оксидом азота (II) / М.К. Рубан, Г.А. Вашанов // Вестн. Воронеж, гос. ун-та. Сер.: Химия. Биология. Фармация. — Воронеж, 2006,— №2, — С. 162-165.

2. Рубан М.К. Структурно-функциональные изменения молекул гемоглобина и полигемоглобина, индуцированные оксидом азота / М.К. Рубан // Всероссийская конференция в рамках конкурсного отбора инновационных проектов аспирантов и студентов по приоритетному направлению «Живые системы» : Киров, 5-6 октября 2006 г. : сборник докладов. — ВятГУ. — Киров, 2006. — С. 128-132.

3. Рубан М.К. Изменения кислородсвязывающих свойств полигемоглобина человека, индуцированные оксидом азота (II) / М.К. Рубан, Г.А. Вашанов // XX съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова : М., 4-8 июня 2007 г. : тез. докл. — М., 2007. — С. 395.

4. Вашанов Г.А. Исследование спектров поглощения растворов гемоглобина человека в диапазоне длин волн 240-320 нм / Г.А. Вашанов, И.А. Лавриненко, М.К. Рубан // Физиология и психофизиология мотиваций : межрегион, сб. науч. работ. — Воронеж, 2007. — Вып. № 8. — С. 31-32.

5. Рубан М.К. Структурно-функциональные модификации частично нитрозили-рованного гемоглобина, индуцированные оксигенацией / М.К. Рубан // Ломо-носов-2009. Секция Биология : тез. докл. междунар. конф. студ., аспирантов и молодых ученых. —М., 2009. — С. 31-34.

6. Рубан М.К. Взаимодействие дезоксигемоглобина с оксидом азота (II) / М.К. Рубан, Г.А. Вашанов, И.А. Лавриненко // Системный анализ и управление в биомедицинских системах : журн. практ. и теор.биологии и медицины .— Воронеж, 2009. — Т. 8, № 1. — С. 226-229.

7. Рубан М.К. Структурно-функциональные модификации нитрозилированного гемоглобина, индуцированные оксигенацией / М.К. Рубан, Г.А. Вашанов, И.А. Лавриненко // Вестник Воронежского государственного университета. Сер. Химия. Биология. Фармация. —Воронеж, 2010. — № 1. — С. 56-61.

8. Рубан М.К. Влияние оксида азота (II) на кислородсвязывающие характеристики растворов гемоглобина и полигемоглобина человека / М.К. Рубан, Г.А. Вашанов, И.А. Лавриненко // Девятый Съезд Белорусского общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» : Минск, Беларусь, 23-25 июня 2010 г. : тез. докл. междунар. науч. конф. — Минск, 2010. — С. 229-231.

Статьи №1,7 опубликованы в изданиях, входящих в список ВАК РФ.

Отпечатано в РА «Оптовик Черноземья» Воронеж, ул. Ленина, 73 Подписано в печать 24.11.2010. Формат 60x84/16. Усл. п. л. 1,4. Тираж 100. Заказ 1089.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рубан, Михаил Константинович

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И

ТЕРМИНОВ.:.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно-функциональные свойства молекулы гемоглобина человека.

1.1.1. Структура молекулы гемоглобина человека.

1.1.2. Спектральные характеристики гемоглобина человека.

1.1.3. Связывание и перенос лигандов.

1.2. Физико-химические свойства и биологическое действие оксида азота (II).

1.2.1. Физико-химические свойства оксида азота (II).

1.2.2. Синтез и физиологическая роль N0 в организме.

1.2.3. Депонирование и эффекторный механизм действия N0.

1.2.4. Роль N0 в патологических процессах в организме.

1.2.5. Пероксинитрит.

1.2.6. Взаимодействие N0 с гемоглобином.

1.2.7. Взаимодействие гемоглобина и N0 в кровеносном русле.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Регистрация электронных спектров поглощения.

2.2.2. Получение растворов оксигемоглобина.

2.2.3. Получение растворов дезоксигемоглобина.

2.2.4. Получение растворов метгемоглобина.

2.2.5. Получение растворов полностью нитрозилированного гемоглобина.

2.2.6. Получение раствора, насыщенного газообразным N0.

2.2.7. Взаимодействие N0 различных концентраций с дезоксигемоглобином.

2.2.8. Оксигенация полностью нитрозилированного гемоглобина.

2.2.9. Оксигенация частично нитрозилированного гемоглобина.

2.2.10. Взаимодействие N0 различных концентраций с раствором оксигемоглобина.

2.2.11. Взаимодействие N0 различных концентраций с раствором метгемоглобина.

2.2.12. Методика регистрации кривых диссоциации оксигемоглобина.

2.2.13. Определение величины константы Хилла.

2.2.14. Получение растворов полигемоглобина.

2:2.15. Получение растворов ТЧО-производных гемоглобина с использованием нитрозоцистеина.

2.2116; Получение теней эритроцитов.

2.2.17. Статистическая обработка;результатов экспериментов:.

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ РАСТВОРОВ

ГЕМНИТРОЗИЛТЕМОТЛОБИНА В ДИАПАЗОНЕ ДЛИН ВОЛН

240-900 НМ

3.1. Спектральные характеристики растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне 240-900 нм

3.2. Анализ спектров поглощения оксигемоглобина и гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 450-650 нм.

3.3. Исследование спектров поглощения растворов гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 нм.

ГЛАВА 4. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИ-, ДЕЗОКСИ- И

МЕТГЕМОГЛОБИНА С ОКСИДОМ АЗОТА (II).

4Л . Исследование изменений спектров поглощения растворов оксигемоглобина, индуцированных N0 различных концентраций:.

4.2. Исследование изменений спектров поглощения растворов метгемоглобина, индуцированных NO различных концентраций.

4.3. Исследование изменений спектров поглощения растворов дезоксигемоглобина, индуцированных NO различных концентраций.

4.4. Исследование изменений спектров поглощения растворов частично нитрозилированного гемоглобина, индуцированных оксигенацией.

4.5. Исследование изменений спектров поглощения растворов полностью нитрозилированного гемоглобина, индуцированных оксигенацией.

4.6. Исследование кислородсвязывающих характеристик растворов дезоксигемоглобина, инкубированных с NO различных концентраций.

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИГЕМОГЛОБИНА С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ N0-ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА. СПЕКТРАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ГЕМНИТРОЗИЛГЕМОГЛОБИНА.

5.1. Структурно-функциональные характеристики полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.1.1. Спектральные характеристики полигемоглобина, образованного из тетрамеров оксигемоглобина.

5.1.2. Изучение кислородсвязывающих свойств полигемоглобина, образованного из окси-формы гембелка.

5.1.3. Спектральные характеристики полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.1.4. Изучение кислородсвязывающих свойств полигемоглобина, образованного из окси- и NO-производных гембелка.

5.2. Спектральные характеристики полностью нитрозилированного мембраносвязанного гемоглобина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II)"

механизмы образования молекул Б>Ю-НЬ, диссоциации из них N0 и экспорта вазоактивных молекул из эритроцитов еще не ясны [62, 88, 104, 124, 158]. Ответы на эти и иные вопросы можно получить при дополнительных исследованиях структурно-функциональных модификаций молекулы НЬ, индуцированных N0 различных концентраций.

При изучении влияния N0 на структурно-функциональные свойства различных лигандных форм НЬ часто пользуются методом абсорбционной спек-трофотометрии в видимом и УФ-диапазоне длин волн [38, 62, 145, 149]. Имеющиеся в литературе данные в основном относятся к исследованию спектральных свойств Ж)-производных гемоглобина в видимом диапазоне длин волн (380-600 нм). Однако нами не обнаружены данные о спектральных характеристиках МО-производных гемоглобина в дальней красной и ближней ИК-области спектра (600-900 нм). Кроме того, не ясна роль боковых групп ароматических аминокислот Ж)-производных гемоглобина в поглощении УФ-света в диапазоне 240-380 нм. Получение сведений по этим вопросам, возможно, будет полезным для разработки новых методик анализа структуры белков, в частности N0-производных гемоглобина.

Достаточно глубоко изученная и методически легко доступная молекула гемоглобина является удобной моделью для исследования влияния различных агентов на ферменты, поскольку ее простетическую группу - гем - можно рассматривать как аналог активного центра. Кроме того, на примере гемоглобина можно проследить роль отдельных компонентов (белкового и неорганического) в ходе ответной реакции на воздействие физико-химических факторов и их взаимовлияние друг на друга. С другой стороны, получение новых сведений по указанным проблемам важно для медицины и экологии, поскольку фармакологическое действие ряда нитрит- и нитратсодержащих препаратов основано на их способности генерировать N0, а повышенные концентрации N0 в атмосферном воздухе, помимо острых и хронических отравлений, способствуют развитию заболеваний дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной и др. систем, особенно у лиц, постоянно подвергающихся воздействию оксидов азота водители автотранспорта, работники химической промышленности, автостоянок, автозаправок и сотрудники ГИБДД). Транспорт такого экзогенного N0 также осуществляется гемоглобином.

Таким образом, исследование структурно-функциональных модификаций гемоглобина, индуцированных N0, имеет важное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи диссертационной работы. Основной целью данной работы явилось изучение структурно-функциональных модификаций гемоглобина, индуцированных оксидом азота (II).

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование спектральных характеристик растворов гемнитрозил-гемоглобина в диапазоне длин волн 240-900-нм.

3. Изучение влияния оксида азота (II) различных концентраций на спектральные и кислородсвязывающие характеристики окси-, дезокси- и мет-гемоглобина.

5. Исследование спектральных и кислородсвязывающих характеристик молекул полигемоглобина с различным содержанием КО-производных гембел-ка.

Научная новизна. Зарегистрированы и проанализированы электронные спектры поглощения гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 и 600-900 нм. В отношении гемнитрозилгемоглобина применен разработанный нами метод анализа тонкой структуры спектров поглощения, позволивший идентифицировать 8 характеристических точек в спектре раствора' гемнитрозилгемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 нм и установить вклад каждой из ароматических аминокислот в спектр поглощения белка.

Предложена гипотеза, согласно которой в гемоглобине связь между азотом проксимальных гистидинов апобелка (Nc HisF8) и железом гемов влияет на стабильность окислительно-восстановительного состояния Fe . Напряжение или разрыв этой связи, индуцированные лигандами, способствуют окислению Fe . На основании этой гипотезы предложен механизм реакции, согласно которому в частично нитрозилированном дезоксигемоглобине NO приводит к образованию a-Fe -NO-гемов с таким максимально низким сродством к лиганду, при котором возможна внутримолекулярная перегруппировка NO к SH-группам Cys/593 с образованием S-нитрозогемоглобина.

Установлено, что присутствие в составе полигемоглобина NO-производных гембелка различных концентраций приводит к разнонаправленным изменениям кислородсвязывающих свойств образцов. На основании полученных экспериментальных данных предположено, что в качестве перспективного кислородтранспортного кровезаменителя» с вазорегуляторной функцией можно использовать полигемоглобин с низким содержанием NO-производных гембелка в составе ассоциата.

Получены данные о спектрах поглощения мембраносвязанного гемнитро-зилгемоглобина человека в диапазоне длин волн 240-600 нм. *

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы сведения расширяют и дополняют современные теоретические представления о модификации структуры и функций гемоглобина при взаимодействии с низкомолекулярными лигандами. Предложенный механизм образования S-нитрозогемоглобина может стать практической основой при разработке новых и усовершенствовании уже существующих терапевтических методов лечения патологий, связанных с дисфункциями эндогенного NO, а также методов регулирования кислородтранспортной функции гемоглобина.

Экспериментальные данные, полученные при изучении структурно-функциональных свойств полигемоглобина с различным числом NO-производных в составе образца, необходимо принимать во внимание при разработке кислородтранспортных кровезаменителей на основе химически: модифицированного гемоглобина, не вызывающих гипертонию.

Данные, полученные: при проведении детального анализа электронных спектров поглощения гемнитрозилгемоглобина в широком диапазоне длин волн. (240-900 нм), могут быть использованы исследователями как справочные при изучении взаимодействия гемоглобина с оксидом азота; (II).

Материалы диссертационной- работы могут быть полезны, при; обсуждении вопросов экологической и медицинской биофизики, прогнозирования; поведения белковых систем в условиях экологической; нагрузки, в частности, при повышенном, содержании оксидов азота в атмосфере, а также при- использовании методов-терапии, связанных с лекарственными препаратами - донорами оксида азота (II).

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнешш диссертаци-оннойг работы, используются« в учебном процессе кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета^ при проведении! практических занятий, в ходе выполнения дипломных, работ и магистерских диссертаций:

Апробация работы. Материалы* диссертационной«работы доложены и обсуждены на Всероссийском конкурсном отборе инновационных проектов аспирантов и студентов, по приоритетному направлению «Живые системы» (Киров, 2006); Федеральной школе-конференции «Инновационное: малое предпринимательство в приоритетных направлениях науки ивысоких технологий» (Москва, 2006); Международной? школе-конференции- молодых ученых «Биотехнология будущего», проводимой - в рамках; международного форума; Симпозиума «ЕС-Россия: перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе» (Санкт-Петербург, 2006); XX Съезде Всероссийского физиологического общества им. И.ГГ. Павлова (Москва, 2007); 16-й Международной научной конференции студентов^ аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009); 1-ой Международной; научной школе «Наноматериалы и нанотех-нологии в живых системах» (Москва, 2009); 9-м Съезде Белорусского общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2010); научных сессиях Воронежского государственного университета (Воронеж, 2006, 2007, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 5 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

2. В частично нитрозилированном гемоглобине (при концентрациях ли-ганда < Р50) N0 модулирует связь железа гемов с азотом (Ъ1г) проксимальных гистидинов апобелка таким образом, что становится возможной внутримолекулярная перегруппировка N0 к БН-группам Суз/593.

3. Хромофорами гемнитрозилгемоглобина, ответственными за наличие идентифицированных нами максимумов поглощения в диапазоне длин волн 240-320 нм являются: фенилаланин (256,5, 260,5, 265,0 и 268,5 нм), триптофан (273,0, 279,0 и 291,0 нм) и тирозин (285,0 нм).

4. Полигемоглобин с низким содержанием МО-производных гембелка, включающий, по-видимому, в качестве Ж>производных в большей степени Б-нитрозогемоглобин, рекомендован как образец для получения кровезаменителя, не вызывающего гипертонию.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Рубан, Михаил Константинович

выводы

1. Идентифицировано 8 максимумов в спектре НЫЧО в диапазоне длин волн 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов индольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фенольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

2. Установлено, что при взаимодействии с оксигемоглобином N0 меняет валентное состояние атома железа, выступая в роли окислителя. Реакция протекает при участии растворенного или связанного с гембелком кислорода через промежуточное образование нитрит-иона и пероксинитрита.

3. Показано, что в анаэробных условиях N0 полностью восстанавливает гемовые группировки метгемоглобина, преобразуя его в гемнитрозил-гемоглобин. В аэробных условиях кислород конкурирует с метгемоглобином за связывание с N0.

4. При инкубации дезоксигемоглобина с N0 в концентрациях < Р50 в «-цепях гембелка транс-лигандный эффект индуцирует резкое ослабление или разрыв связи между атомом железа Ж)-гема и азотом (К^) проксималь

• о 4. ного гистидина (Н18Р8). Следствием этого явилось образование Ре -N0-гемов с максимальным их выходом в области Р50. Дальнейшее увеличение концентрации N0 приводило к восстановлению геминов в «-субъединицах и образованию полностью нитрозилированного гемоглобина.

5. Методами спектрофотометрии и регистрации кривых диссоциации НЬ показано, что оксигенация частично нитрозилированного гемоглобина индуцирует внутримолекулярный переход N0 от а-гемов к БН-группам Суб/Ш, что, по-видимому, обусловлено транс-лигандным эффектом N0, индуцирующим окисление атомов железа гемов и образование а-субъединиц в

Т-состоянии с наименьшим сродством к лиганду, а также повышением сродства БН-групп СуБ/593 к N0 при переходе тетрамера в Л-состояние.

6. Оксид азота (II) модифицирует кислородсвязывающие характеристики НЬ. При низких концентрациях N0 (Гем:1ЧО = 20:1) сродство НЬ к 02 повышается, что может быть связано как с накоплением а-геминов, так и с образованием 81Ч0-НЬ. Увеличение концентрации N0 приводит к резкому снижению сродства НЬ к 02, обусловленному накоплением МШЬ.

7. Полимеризация НЬ02 увеличивала сродство тетрамеров к 02. Введение в состав ро1уНЬ МО-производных гембелка при соотношении компонентов НЬ02:Ж)-производные-НЪ 4:1 и 3:2 приводило в первом случае к дальнейшему повышению сродства ро1уНЬ к 02, а во втором — к резкому снижению кислородсвязывающих характеристик образцов.

8. Установлено, что в образцах полигемоглобина с соотношением компонентов НЮ2:Ж)-производные гембелка = 4:1 в качестве МО-производных в большей степени образуется Э-нитрозогемоглобин, а при соотношении компонентов 3:2 - гемнитрозилгемоглобин.

9. Показано, что положения максимумов в спектрах поглощения мем-браносвязанных окси-, дезокси и гемнитрозилгемоглобина практически идентичны таковым для спектров внутриэритроцитарного гембелка.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, полученные в ходе выполнения настоящей диссертационной работы, а также анализ литературных сведений позволяют заключить, что структурно-функциональные изменения молекулы гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II), определяются, главным образом, концентрацией N0 и Ог в растворе, структурной формой гембелка, а также наличием в составе гемоглобина аллострически регулируемых активных центров - гемов и 8Н-групп остатков Суз93Д

С одной стороны, неспаренный электрон N0, переменная валентность атомов железа гемоглобина и наличие 02 в растворе или в связанном с гембел-ком состоянии обусловливают протекание окислительно-восстановительных реакций между этими молекулами. С другой стороны, в анаэробных условиях при субсатурационных концентрациях N0 сказывается транс-лигандный эффект, приводящий к конформационным изменениям в гемоглобине на уровне третичной структуры. Во всех исследованных нами реакциях структурно-функциональные модификации окси-, дезокси- и метгемоглобином, индуцированные оксидом азота (II), находили отражение в отклонении спектральных и кислородсвязывающих характеристик от таковых параметров нативных образцов.

С использованием метода моделирования спектров поглощения нами выявлены 8 характеристических точек (А,, нм) в спектре гемнитрозилгемоглобина в диапазоне 240-320 нм: максимумы при 256,5 нм, 260,5 нм, 265,0 нм, 268,5 нм связаны с поглощением квантов света бензольными кольцами фенилаланина; максимумы при 273,0 нм, 279,0 нм и 291,0 нм связаны с поглощением энергии квантов индольными кольцами триптофана; поглощение энергии квантов фе-нольными группировками тирозина приводит к возникновению максимума при 285,0 нм.

Реакция оксигемоглобина с N0 известна как способ инактивации свобод-норадикальной молекулы N0 в кровеносном русле, а также причина метгемог-лобинобразования [83, 144, 157]. Данные наших экспериментов подтверждают имеющиеся в литературе сведения о том, что реакция оксигемоглобина и N0 приводит к образованию метгемоглобина и нитрат-иона (N03""). Мы предполагаем существование как минимум двух механизмов взаимодействия N0 с НЬ02. Первый - обусловлен взаимодействием молекул N0 сначала с растворенным Ог с образованием нитрит-ионов (Ж)2)5 которые окисляют гемовые группировки белка, преобразуясь в нитрат-ионы (ТМОз-). Второй механизм начинается реакцией молекул N0 с кислородом НЮ2, или замещением в НЬ02 кислорода на N0. Далее вследствие отрыва одного электрона от атома Ре2+ гемов образуется метгемоглобин и пероксинитрит (ОЖ)СГ), диссоциирующий без изменений или в виде нитрат-иона. Таким образом, с одной стороны, в реакции оксигемоглобина и N0 атомы железа гемов окисляются при участии кислорода. С другой стороны, нами показано, что образующийся при этом метгемоглобин может восстанавливаться при повышении концентрации N0 с образованием гемнит-розилгемоглобина и, по-видимому, нитрит-иона (ИОг-)

В экспериментах с метгемоглобином оксид азота (II) выступает в роли восстановителя. Согласно литературным данным, образующийся нитрозильный комплекс НЬ(Ре3+)>Ю легко переходит в НЬ(Ре2+)1ЧО+ вследствие переноса

О I электронной плотности неспаренного электрона от N0 к Бе [113, 159]. Таким в Л I образом, соединение НЬ(Ре )1Ч0 относительно не очень стабильно и в присутствии избытка N0 подвергается восстановительной нитрозиляции с образованием НЬ(Ре2+)ТчЮ. В анаэробных условиях используемые нами концентрации метгемоглобина полностью и относительно быстро преобразовывались в гем-нитрозилгемоглобин. Поскольку в растворе скорость взаимодействия N0 с Ог (~ 106 моль^хс"1) выше, чем N0 с МШЪ (~ Ю'-Ю3 моль^хс"1), то в аэробных условиях в реакционной смеси гемнитрозилгемоглобин спектральным методом обнаруживался в небольших количествах.

Согласно литературным данным, в кровеносном русле реакция эндотели-ального N0 с внутриэритроцитарным НЬОг ограничена рядом физиологических барьеров [110, 115]. С другой стороны, доказана вазодилатирующая способность эритроцитов в условиях гипоксии, свидетельствующая о присутствии внутри клетки компонентов, не только сохраняющих N0, но и способных экспортировать его при необходимости за пределы эритроцита [123, 128, 141]. Источником МО-производных в эритроцитах может быть небольшая часть эндоте-лиального N0, которая все же проникает в эритроциты через физиологические барьеры. Кроме того, возможно, молекулы N0 синтезируются внутри эритроцитов в условиях гипоксии при участии дезоксигемоглобина и МО-производных, например нитрит-ионов.

В отличие от окси- и метгемоглобина, с которыми N0 вступает преимущественно в окислительно-восстановительные реакции, при взаимодействии дезоксигемоглобина с N0 в определенных условиях сказывался транс-лигандный эффект последнего. Так, нами установлено, что на начальных этапах взаимодействия дезоксигемоглобина с N0, когда гембелок еще пребывает в Т-состоянии, в реакционной системе накапливаются молекулы частично нитрози-лированного гемоглобина с окисленными гемовыми группировками, максимальный выход которых наблюдается при концентрациях N0, соответствующих давлению полунасыщения гембелка лигандом (Рбо)- Согласно литературным данным [96], при концентрациях N0 ниже или близких к Р50 в «-N0 гемах транс-лигандный эффект вызывает значительное напряжение или разрыв связи между атомом железа гема и азотом проксимального гистидина (Ре-Ы^.), что приводит к образованию пятикоординационных «-N0 гемов с низким сродством к лиганду. Анализируя этот эффект, необходимо учитывать известные из литературы данные о том, что связь Ре-Ы^ в определенной степени напряжена даже в нелигандированных а-цепях дезоксигемоглобина [152]. Кроме того, молекулы кислорода тоже усиливают возмущение связи Ре-Мс в а-субъединицах, которое нарастает к точке перехода гембелка в Я-состояние [96]. Сопоставляя литературные сведения и полученные нами данные, мы выдвигаем следующую гипотезу. Взаимодействие N0 с одной или двумя а-субъединицами дезоксигемоглобина вызывает сильное напряжение или разрыв связей Ре-Мй что приводит а-ферро-гемы в такое состояние, при котором значительно повышается вероятность их окисления. Возможно, именно этим эффектом объясняется известный из литературы факт, что молекула гемоглобина в состоянии полунасыщения лигандом проявляет наименьшую устойчивость к окислению, поэтому для минимизации промежутка времени, в котором вероятность окисления атомов железа максимальна, происходит ускорения ассоциации и диссоциации ли-гандов в области Р50 за счет кооперативного взаимодействия субъединиц гемоглобина [22]. Таким образом, с транс-лигандным влиянием NO связано выявленное нами в ходе изучения реакции ассоциации этого лиганда с дезоксиге-моглобином накопление метгемоглобина, максимальное количество которого было при концентрации N0, близкой к Р5о. Повышение концентрации NO индуцировало переход молекулы гемоглобина из Т- в R- шестикоординационное л I состояние (с невозмущенной связью Fe-NQ, а также восстанавливало Fe -гемы до Hb(Fe2+)4(NO)4.

Известно, что в физиологических условиях гемоглобин в кровеносном русле только частично нитрозилирован, поскольку соотношение Гем:Ж) в крови составляет ~ 1000:1 [62, 149]. По-видимому, в эритроцитах именно частично нитрозилированный гемоглобин в Т-состоянии является наиболее вероятным переносчиком N0. Полученные нами данные свидетельствуют о возможности преобразования в ходе оксигенации частично нитрозилированного гемнитро-зилгемоглобина в S-нитрозогемоглобин. Согласно сведениям литературы, при Т—>R переходе гемоглобина повышается реакционная способность SH-rpynn остатков Cys-/393 его апобелка, расположенных вблизи /?-гемов [149]. С другой стороны, известно, что при концентрациях, меньших Р50, NO может совершать внутримолекулярные переходы между а- и /?-гемами [96]. Кроме того, ранее мы обсудили механизм окисления гемовых группировок оксидом азота (И) из-за нарушения связи Fe-N^ а-субъединиц в частично нитрозилированном гемоглобине. Как известно, очень устойчивые комплексы Hb(Fe2+)NO становятся обратимыми, когда железо в гемоглобине окислено до Fe3+ [35]. Таким образом, в частично нитрозилированном гемоглобине возможны такие состояния молекулы, при которых происходит внутримолекулярная перегруппировка NO от гемов к Суз/593 гемоглобина с замещением Нь их ^-сульфгидрильных групп и отрывом одного электрона (т.е. образуется 8КЮ+-НЬ). Кроме того, нами показано, что частичная нитрозиляция дезоксигемоглобина приводит к повышению сродства гембелка к кислороду и снижению кооперативного взаимодействия субъединиц. Это может быть связано как с образованием гемина в а-субъединицах тетрамера вследствие значительного напряжения или разрыва связи Ре-М^ из-за транс-лигандного эффекта N0 [61], так и с образованием Б-нитрозогемоглобина, поскольку, как известно, в этом случае наблюдается затруднение осуществления Нлз-/?146 стабилизации Т-состояния гембелка [79, 142]. Следовательно, в случае нитрозации БН-групп Су8/393 молекула N0 может играть роль аллостерического эффектора, повышая сродство гемоглобина к кислороду. При образовании пятикоординационных «-N0 геминов N0 является модулятором состояния активного центра, что также приводит к изменению сродства гембелка к кислороду. С другой стороны, ассоциация и диссоциация молекулы 02 изменяет сродство Суз/393 к N0: в Ы-состоянии оно выше, чем в Т-состоянии. В этом случае кислород выступает в роли аллостерического модулятора, а активными центрами по отношению к N0 в молекуле гемоглобина являются ЭИ-группы Суз/393. Таким образом, обсуждаемые механизмы могут обусловливать главную функцию гемоглобина - роль сенсора, чувствительного к потребностям в кислороде клеток и тканей, способного не только транспортировать Ог и СОг, но и регулировать скорость кровотока путем диссоциации определенного количества N0, повышая эффективность газообмена [149].

Базируясь на данных, полученных в ходе изучения взаимодействия тет-рамерного гемоглобина с N0 мы предположили, что полигемоглобины, в составе которых будут присутствовать молекулы МО-производных гемоглобина, могут оказаться эффективными кислородтранспортными кровезаменителями, не вызывающими гипертонию. Нами показано, что при низких соотношениях компонентов полигемоглобина НЬОг:НЬ->Ю-производные = 4:1, по-видимому, основным МО-производным является БМО-НЪ, а увеличение соотношения компонентов до 3:2 приводит к увеличению доли гемнитрозилгемоглобина (№N0). Об этом свидетельствует повышение сродства образцов к кислороду в первом случае и резкое его снижение — во втором. Таким образом, для получения кислородтранспортного кровезаменителя на основе полигемоглобина с функцией донора N0 необходимо использовать низкие соотношения НЮггЖ)-производные. По нашему мнению, такой полигемоглобин будет в кровеносном русле, подобно частично нитрозилированному гемоглобину, в ходе циклов ок-сигенации-дезоксигенации преобразовываться в 8Ж)-НЪ, передавая N0 при переходе тетрамеров в Т-состояние на тиолсодержащие молекулы плазмы (альбумин, глутатион и др.) или непосредственно на растворимую гуанилатциклазу, предотвращая тем самым гипертонию.

На основании полученных нами экспериментальных данных и литературных сведений предложены обобщающие схемы: на рис. 57 отображены возможные реакции различных структурных форм гемоглобина с N0 и N0-производными в организме; на рис. 58 показан механизм гипоксической вазо-дилатации, действующий в микроциркуляторном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II).

Ш2 + Н*—-N0 + 02+н20

N0 + 02-^

НЬ(Ре3+ШО)4 О * ожюо: *

-■V

N03 + 02 + Н20

НЬ(аГе3+)(Ее2+02)3(Су8^93^0)

ОН + Ж)

ОШОН^ИОз

НЬ(Ре3+)4

НЬ(Ре3+ЫО)4

НЬ(Ре2+>ГО+)4

-НЬ(Ре2+)4 / ЯЪ(аРе3+т)2(/^о1+)у-Ш*-ЯЪ(¥е2+Ш)4

2Ш

Н„0 1

Рис. 57. Схема процессов взаимодействия гемоглобина с оксидом азота (II) легкие сердце капилляры

2. За время, пока частично нытрозилированный гемоглобин в Т-состоянии достигнет легких, из-за мощного транс-лигандого эффекта N0 в нитрозилированной аРе2+Ж)-субъединице происходит разрыв связи Ре2+ гема с азотом проксимального гистидина, что приводит к образованию

НЬх(аЕе3+1ЧО)(аРе2+)(у0Ре2+)2 с низким сродством к N0.

1. В условиях локальной гипоксии в капиллярах часть гемоглобина в эритроцитах может в значительной степени дезоксигенироваться, переходя в Т-состояние. При этом уже в капиллярах НЬ может взаимодейсвовать с N0, образуя частично нитрозилированный НЬ:

НЬт(<*Ее2+Ш)(б^е2+)(^е2+)2 который по системному кровообращению в таком виде транспортируется к тканям.

4. В условиях локальной гипоксии в определенном участке ткани Б-нитрозооксигемоглобин дезоксигенируется. При этом сродство N0 к атому серы СуБ/ФЗ понижается пропорционально степени перехода НЬ в Т-состояние. Молекулы N0 передаются на тиолсодержащие соединения эритроцитов и экспортируются за пределы клетки, усиливая кровоснабжение в гипоксическом участке.

НЪх(огРе3+)(«Ге2+)(убР е2+)2Су$/Ш-8Н + ^N0 + 02

3. В легких при оксигенации НЬ02 переходите Я-со стояние, при котором повышается активность 8Н-групп его Су8уФЗ. Происходит внутримолекулярная перегруппировка N0 от а-Ре3+-гема к атому серы СузуФЗ с образованием 8-нитрозооксигемоглобина

НЬк(аЕе3+)(«Ре2+02)(у6Ге2+02)2Су8^3^0,

Рис. 58. Механизм гипоксической вазодилатации, действующий в ми кро циркуля торном русле в условиях локальной гипоксии определенной области ткани при участии гемоглобина и оксида азота (II)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рубан, Михаил Константинович, Воронеж

1. Артюхов В.Г. Биофизика. / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. -Воронеж, 1994. с. 287-288.

2. Артюхов В.Г. Гемопротеиды: закономерности фотохимических превращений в условиях различного микроокружения. / В.Г. Артюхов. Воронеж : Изд-во Воронеж, ун-та, 1995. - 280 с.

3. Артюхов В.Г. Оптические методы исследования биологических систем и объектов / В.Г. Артюхов, М.С. Бутурлакин, В.П. Шмелев. Воронеж : Изд.-во Воронеж, ун-та, 1980. - 116 с.

4. Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия: учеб. для вузов / Н.С. Ахме-тов. 4-е изд. - М. : Высш. шк. : Изд. центр «Академия», 2001. - 743 е., ил.

5. Берштейн И.Я. Спектрофотометрический анализ в органической химии / И.Я. Берштейн, Ю.Л. Каминский. Л.: Химия, 1986. - 200 с.

6. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода / Л.А. Блюменфельд. — М. : Советская наука, 1957. — 134 с.

7. Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики / Л.А. Блюменфельд. -М. : Наука : ГИ физ.-мат.лит., 1977. 336 с.

8. Ванин А.Ф. Оксид азота регулятор клеточного метаболизма / А.Ф. Ванин // Соросовский образовательный журнал. - 2001. - Т. 7, № 11. - С. 7-12.

9. Ванин А.Ф. Оксид азота и его обнаружение в биосистемах методом электронного парамагнитного резонанса / А.Ф. Ванин // Успехи физических наук. 2000. - Т. 170. - С. 455-458.

10. П.Вашанов Г.А. Роль субъединичных контактов в проявлении структурно-функциональных свойств гемоглобина в условиях различного микроокружения: дис. . д-ра биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2004. 347 с.

11. Вашанов Г.А. Физико-химические и функциональные свойства гибридных макромолекул гемоглобина человека / Г.А. Вашанов, В.Г. Артюхов // Вестн. Воронеж, гос. ун-та. Сер. Химия. Биология. 2000. - № 2. - С. 94-99.

12. Вейсблут М. Физика гемоглобина / М. Вейсблут // Структура и связь. М., 1969.-С. 19-22.

13. Верболович П.А. Железо в животном организме / П.А. Верболович, А.Б. Утешев Алма-Ата : Наука, 1967. - 266 с.

14. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов : учебник для вузов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. 2-е изд., пе-рераб. и доп. - М. : Дрофа, 2006. - 285 с.

15. Волынец В.Ф. Аналитическая химия азота / В.Ф. Волынец, М.П. Волынец. -М. : Наука, 1977. -307 с.

16. Волькенштейн М.В. Биофизика / М.В. Волькенштейн. М. : Наука, 1988. -592 с.

17. Глинка Н.Л. Общая химия : учеб. пособие для нехим. спец. вузов / Н.Л. Глинка ; под ред. В.А. Рабиновича. 20-е изд. - Л. : Химия, 1979. - 720 с.

18. Детерман Г. Гель-хроматография. Гель-фильтрация. Гель-проникающая хроматография. Молекулярные сита: Пер. с нем. / Г. Детерман. 1970. - 252 с.

19. Зеленин К.Н. Оксид азота (II): новые возможности давно известной молекулы / К.Н. Зеленин // Соросовский образовательный журнал. 1997. - № 10. -С. 105-110.

20. Иваницкий Г.Р. Переливание крови: против, за и альтернатива / Г.Р. Ива-ницкий // Наука и жизнь. 1999. - № 2.

21. Иржак Л.И. Гемоглобины и их свойства / Л.И. Иржак. М. : Наука, 1975. -240 с.

22. Калаева Е.А. УФ-индуцированные структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в присутствии оксидов азота и углерода: дис. . канд. биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2001. 188 с.

23. Кантор Ч. Биофизическая химия: в 3 т. / Ч. Кантор, П. Шиммел. М. : Мир, 1985.-312 с.

24. Козлова И.Е. УФ-чувствительность молекул гемоглобина с различным субъединичным составом : дис. . канд. биол. наук: 03.00.02 : Воронеж, 2000. -152 с.

25. Коржуев П.А. Гемоглобин. Сравнительная физиология и биохимия / П.А. Коржуев. М. : Наука, 1964. -288 с.

26. Кузнецова Н.П. Повышение кислородтранспортной эффективности гемоглобина при его химической модификации / Н.П. Кузнецова, JI.P. Гудкин, Р.Н. Мишаева // Биохимия. 1996. - Т. 61, вып. 4. - С. 680-689.

27. Лакин Г.Ф. Биометрия : учеб. пособие для биол. спец. Вузов : 4-е изд., пере-раб. и доп. / Г.Ф. Лакин. М. : Высш. шк., 1990. - 352 с.

28. Лидин P.A. Химические свойства неорганических веществ: учеб. пособие для вузов: 3-е изд., испр. / P.A. Лидин, В.А. Молочко, Л.Л. Андреева ; под ред. P.A. Лидина. М. : Химия, 2000. - 480 с.

29. Манойлов С.Е. Первичные механизмы биологического действия проникающей радиации / С.Е. Манойлов Л.: Медицина, Ленингр. отд-ние, 1968. — 184 с.

30. Меныцикова Е.Б. Оксид азота и NO-синтазы в организме млекопитающих при различных функциональных состояниях / Е.Б. Меньщикова, Н.К. Зен-ков, В.П. Реутов // Биохимия. 2000. - Т. 65, вып. 4. - С. 485-503.

31. Методы изучения метаболизма оксида азота / Т.В. Звягина и др.// Вестник гигиены и эпидемиологии. 2001. - Том 5, № 2, С. 128-137.

32. Монгин A.A. Деполяризация изолированных нервных окончаний мозга донорами оксида азота: мембранные механизмы. / A.A. Монгин, П.И. Недвец-кий, C.B. Федорович // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 6. - С. 787-796.

33. Недоспасов A.A. Биогенные оксиды азота / A.A. Недоспасов, Н.В. Беда // Природа. 2005. - № 7. - С. 35-42.

34. Недоспасов A.A. Биогенный оксид азота в конкурентных отношениях / A.A. Недоспасов // Биохимия. 1998. - Т. 63, вып. 7. - С. 881-904.

35. Образование N0' в процессе окисления ферроформ гемоглобина нитритом /

36. A.Н. Осипов, Г.Г. Борисенко, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. 2007. - Т. 47. - С. 259-292.

37. Рабинович В.А. Краткий химический справочник : изд. 2-е, испр. и доп. /

38. B.А. Рабинович, З.Я. Хавин. Ленинград : «Химия», 1978. - 392 с.

39. Раевский К.С. Оксид азота — новый физиологический мессенджер: возможная роль при патологии центральной нервной системы /К.С. Раевский // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1997. - Т. 123, № 5. с. 484-490.

40. Рифкинд Д.М. Гемоглобин и миоглобин / Д.М. Рифкинд // Неорганическая биохимия. М.: Мир, 1978. - Т. 2. - С. 256-338.

41. Розенберг Г.Я. Проблемы создания искусственной крови / Г.Я. Розенберг, К.Н. Макаров // ЖВХО им. Менделеева. 1985. - Т.30. - С.387-394.

42. Сосунов A.A. Оксид азота как межклеточный посредник / A.A. Сосунов // Соросовский образовательный журнал. 2000. - Т. 6, № 12, С. 27-34

43. Стародуб Н.Ф. Радиационное поражение гемоглобина / Н.Ф. Стародуб, Г.М. Рекун, И.М. Шурьян. Киев : Наукова думка, 1976. - 132 с.

44. Стародуб, Н.Ф. Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / Н.Ф. Стародуб, В.И. Назаренко. Киев : Наукова думка, 1987.-200 с.

45. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков / В.М. Степанов. М.: Высшая школа, 1996. - 336 с.

46. Степуро И.И. Восстановление нитрита гликозилированными аминокислотами и гликозилированным альбумином / И.И. Степуро, Н.А. Чайковская, В.В. Виноградов // Биохимия. 1999. - Т. 64, вып. 1. - С. 106-110.

47. Столяр О.Б. Молекулярные механизмы биологического действия ионизирующих излучений / О.Б. Столяр, О.И. Петренко, В.Н. Коробов // Львов, 1979. С. 64-75.

48. Стусь Л.К. Осцилляция некоторых лигандированных форм гемоглобина при хранении крови / Л.К. Стусь, Е.Д. Розанова // Биофизика. 1992. - Т. 37, вып. 2. - С. 387-388.

49. Уайт А. Основы биохимии : в 3 т. / А. Уайт и др. ; под ред. Ю.А. Овчинникова-М. : Мир, 1981. Т. 3.-726 с.

50. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам / Р. Чанг ; пер. с англ. М.Г. Гольдфельда ; под ред. Ю.Ш. Мошковского. Москва : изд-во «Мир», 1980. - 662 с.

51. Якубке Х.-Д. Аминоксилоты. Пептиды. Белки / Х.-Д. Якубке, X. Эшкайт. -М. : Мир, 1985.-456 с.

52. A multi-wavelength spectrophotometric method for the simultaneous determination of five haemoglobin derivatives / A. Zwart et al. // J. Clin. Chem. Clin. Bio-chem. 1981. - Vol. 19, № 7. - P. 457-63.

53. A role for endothelin and nitric oxide in the pressor response to diasprin cross-linked hemoglobin / S.C. Schultz et al. // J. Lab. Clin. Med. 1993. - Vol. 122. -P. 301-308.

54. Alayash A.I. Peroxynitrite-mediated heme oxidation and protein modification of native and chemically modified hemoglobins / A.I. Alayash, B.A. Ryan, R.E. Ca-shon // Arch. Biochem. Biophys. 1998. - Vol. 349, № 1. - P. 65-73.

55. Alderton W.K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition / W.K. Alderton, C.E. Cooper, R.G. Knowles // The Biochemical Journal. 2001. - Vol. 357.-P. 593-615.

56. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide / J.S. Beckman et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87, № 4. - P. 1620-1624.

57. Arnone A. Structure of inositol hexaphosphate-human deoxyhaemoglobin complex / A. Arnone, M.F. Perutz // Nature. 1974. - Vol. 249. - P. 34-36.

58. Beckman J.S. Peroxynitrite versus hydroxyl radical: the role of nitric oxide in su-peroxide-dependent cerebral injury / J.S. Beckman // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1994.-Vol. 17, Issue 738.-P. 69-75.

59. Benesch R. The interaction of hemoglobin and its subunits with 2,3-diphosphoglycerate / R. Benesch, R.E. Benesch, Y. Enoki // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. Vol. 61, № 3. - P. 1102-1106.

60. Benesch R.E. Subunit exchange and ligand binding: a new hypothesis for the mechanism of oxygenation of hemoglobin / R.E. Benesch, R. Benesch, G. Miacduff // Proc. N. A. S. Biochemistry. 1965. - Vol. 54. - P. 535-542.

61. Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiological oxygen gradient / J.S. Stamler et al. // Science. 1997. - Vol. 276. - P. 2034-2037.

62. Blood substitutes: evolution and future applications / M.G. Scott et al. // 1997. -Clinical Chemistry. Vol. 43, №. 9.

63. Bolton W. Three dimensional Fourier synthesis of horse deoxyhaemoglobin at 2,8 Angstrom units resolution / W. Bolton, M.F. Perutz // Nature. 1970. V. 228, № 5271.-P. 551-552.

64. Bonaventura J., Lance V.P. Nitric oxide, invertebrates and hemoglobin / J. Bonaventura, V.P. Lance // Amer. Zool. 2001. - Vol. 41. - P. 346-359.

65. Cassoly R. Conformation, co-operativity and ligand binding in human hemoglobin /R. Cassoly, Q.H. Gibson//J. Mol. Biol. 1975. - Vol. 91. - P. 301-313.

66. Cassoly R. Use of nitric oxide as a probe for assessing the formation of asymmetrical hemoglobin hybrids an attempted comparison between aNO/?NOadeoxy/?ieoxy, a2NQ^deoxy and ^ deoxy^No hybrids / R Cassoly // The Journal Of Biological

67. Chemistry. 1978. - Vol. 253, № 10. - P. 3602-3606.

68. Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell disease. / C.D. Reiter et al. // Nat. Med. 2002. - Vol. 8, № 12.-P. 1383-1389.

69. Chang T.M.S. Future prospects for artificial blood / T.M.S. Chang // Tibtech. -1999.-Vol. 17.-P. 61-67.

70. Crawford J.H. Vasoactivity of S-nitrosohemoglobin: role of oxygen, heme, and NO oxidation states / J.H. Crawford, R.C. White, R.P. Patel // Blood. 2003. -Vol. 101, № 11. - P. 4408-4415.

71. Culotta E. NO news is good news / E. Culotta, D.E. Koshland Jr. // Science.1997. Vol. 258, Issue 5090. - P. 1862-1865.

72. D'Agnillo F. Polyhemoglobin superoxide dismutase - catalase as a blood substitute with antioxidant properties / F. D'Agnillo, T.M. Chang // Nat. Biotechnol.1998. Vol. 16, № 7. - P. 667-671.

73. Denicola A. Diffusion 'of peroxynitrite across erythrocyte membranes / A. Denicola, J.M Souza, R. Radi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. -P. 3566-3571.

74. Di Iorio E.E. Hemoglobins / E.E. Di Iorio // Methods in enzymology. 1981. - V. 76.-P. 57-58.

75. Diffusion-limited reaction of free nitric oxide with erythrocytes / X. Liu et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 30. - P. 18709-18713.

76. Dodge J.T. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes / J.T. Dodge, C. Mitchell, D.J. Hanahan // Arch. Bi-ochem. Biophys. 1963. -V. 100. - P. 119-30.

77. Drablcin D.L. The chromatographic and optical properties of hemoglobin of man in comparison those of other species / D.L. Drabkin // J. Biol. Chem. 1946. - V. 164.-P. 703-723.

78. Effects of S-nitrosation on oxygen binding by normal and sickle cell hemoglobin / C. Bonaventura et al. // Journal Of Biological Chemistry. 1999. - Vol. 274, № 35.-P. 24742-24748.

79. Electron Paramagnetic Resonance and Oxygen Binding Studies of a-Nitrosyl Hemoglobin. A novel oxygen carrier having no-assisted allosteric functions / T. Yonetani et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273, № 32. - P. 20323-20333.

80. Endotheliumderived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide / L.J. Ignarro et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - Vol. 84. -P. 9265-9269.

81. Erythrocyte consumption of nitric oxide: competition experiment and Model Analysis / M.W. Vaughn et. al // Nitric oxide: biology and chemistry. 2001. -Vol. 5, № l.-P. 18-31.

82. Evidence for a multifactorial process involved in the impaired flow response to nitric oxide in hypertensive patients with endothelial dysfunction / M. Kelm et al. // Hypertension. 1996. - Vol. 3, Pt 1. - P. 346-353.

83. Functional coupling of oxygen binding and vasoactivity in S-nitrosohemoglobin / T.J. McMahon et al. // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 16738-16745.

84. Gaston B. Nitric oxide and thiol groups / B. Gaston // Biochim. Biophys. Acta. -1999. Vol. 1411. - P. 323-333.

85. Gibson Q.H. Cooperative nitric oxide binding by manganese hemoglobin. Implications for the role of steric control in hemoglobin ligation / Q.H. Gibson, B.M. Hoffman // The Journal Of Biological Chemistry. 1979. - Vol. 254, № 11. - P. 4691-4697.

86. Gladwin M.T. NO contest: nitrite versus S-nitroso-hemoglobin / M.T. Gladwin, A.N. Schechter// Circulation Research. 2004. - Vol. 94. - P. 851-855.

87. Gow A.J. Reaction between nitric oxide and haemoglobin under physiological conditions / A.J. Gow, J.S. Stamler // Nature (London). 1998. - Vol. 391. - P. 169-173.

88. Gross S.S. Physiological reactions of nitric oxide and hemoglobin: a radical rethink / S.S. Gross, P. Lane // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 9967-9969.

89. Guest C.R. Picosecond absorption studies on the photodissociation of a- and ft-nitrosyl hemoglobin monomers / C.R. Guest, L.J. Noe // Biophys. J. 1988. -Vol. 54.-P. 731-736.

90. Han T.H. Nitric oxide reaction with red blood cells and hemoglobin under heterogeneous conditions / T.H. Han et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. - Vol. 99.-P. 7763-7768.

91. Hausladen A. Nitrosative stress: metabolic pathway involving the flavohemoglo-bin / A. Hausladen, A.J. Gow, J.S. Stamler // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. -Vol. 95.-P. 14100-14105.

92. Herold S. Kinetic and mechanistic studies of the NO center dot-mediated oxidation of oxymyoglobin and oxyhemoglobin / S. Herold, M. Exner, T. Nauser // Biochemistry-US.-2001.-Vol. 40.-P. 3385-3395.

93. Herold S. Reactions of deoxy-, oxy-, and methemoglobin with nitrogen monoxide. Mechanistic studies of the S-nitrosothiol formation under different mixing conditions / S. Herold, G. Rock // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 6623-6634.

94. Hille R. Chain equivalence in reaction of nitric oxide with hemoglobin / R. Hille, G. Palmer, J.S. Olson // The Journal Or Biological Chemistry. 1977. - Vol. 252, № l.-P. 403-405.

95. Hille R. Spectral transitions of nitrosyl hemes during ligand-binding to hemoglobin / R. Hille, J.S. Olson, G. Palmer // J. Biol. Chem. 1979. - Vol. 254. - P. 2110-2120.

96. Identification of residues responsible for the alkaline Bohr effect in haemoglobin / M.F. Perutz et al. // Nature. 1969. - Vol. 222. - P. 1240-1246.

97. Ignarro L.J. Nitric Oxide Biology and Pathobiology / L.J. Ignarro // San Diego : Academic Press. 2000.99.1mai K. Allosteric Effects in Haemoglobin / K. Imai // Cambridge University Press, Cambridge. 1982.

98. Increased vascular resistance with hemoglobin-based oxygen carriers / J.R. Hess et al. // Artif. Cells. Blood. Substit. Immobil. Biotechnol. 1994. - Vol. 22. -P. 361-372.

99. Influence of globin structures on the state of the heme. Ferrous low spin derivatives / M.F. Perutz et al. // Biochemistry. 1976. - Vol. 15. - P. 378-387.

100. John M.E. Nitric oxide induced conformational changes in opossum hemoglobin / M.E. John, M.R. Waterman // The Journal Of Biological Chemistry. 1979. - Vol. 254, № 23. - P. 11953-11957.

101. Kim-Shapiro D.B. Hemoglobin-nitric oxide cooperativity: is NO the third respiratory ligand? / D.B. Kim-Shapiro // Free Radic. Biol. Med. 2004. - Vol. 36. -P. 402-412.

102. Kim-Shapiro D.B. Unraveling the reactions of nitric oxide, nitrite, and hemoglobin in physiology and therapeutics / D.B. Kim-Shapiro, A.N. Schechter, M.T. Gladwin // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2006. - Vol. 26. - P. 697-705.

103. Kinetics of increased deformability of deoxygenated sickle cells upon oxygenation. / Z. Huang et al. // Biophys. J. 2003. - Vol. 85. - P. 2374 -2383.

104. Kon H. Paramagnetic resonance study of nitric oxide hemoglobin / H. Kon // The Journal Of Biological Chemistry. 1968. - Vol. 243, №. 16. - 4350-4357.

105. Kosaka H. Mechanism of autocatalytic oxidation of oxyhemoglobin by nitrite / H. Kosaka, I. Tyuma // Environmental Health Perspectives. 1987 Vol. 73. - P. 147-151.

106. Koshland D.E. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits / D.E. Koshland Jr, G. Nemethy, D. Filmer // Biochemistry. 1966. - Vol. 5, № 1. - P. 365-385.

107. Lancaster J.R. Jr. Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide / J.R. Jr. Lancaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91.-P. 8137-8141.

108. Liao J.C. Intravascular flow decreases erythrocyte consumption of nitric oxide / J.C. Liao // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 8757-8761.

109. Lundberg J.O. NO generation from nitrite and its role in vascular control / J.O. Lundberg, E. Weitzberg // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2005. - Vol. 25. -P. 915-922

110. Lymar S.V. Role of compartmentation in promoting toxicity of leukocyte-generated strong oxidants / S.V. Lymar, J.K. Hurst // Chem. Res. Toxicol. 1995.- Vol. 8, № 6. -P. 833-840.

111. Miller M.R. Recent developments in nitric oxide donor drugs / M.R. Miller, I.L. Megson // British Journal of Pharmacology. 2007. - P. 1-17.

112. Modulation of nitric oxide bioavailability by erythrocytes / K.T. Huang et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. Vol. 98. - P. 11771-11776.

113. Moffat J.K. Structure and functional properties of chemically modified horse hemoglobin. X-ray studies / J.K. Moffat // J. Mol. Biol. 1971. - Vol. - 58, № 1. -P. 79-88.

114. Monod J. On the nature of allosteric transitions: a plausible model / J. Monod, J. Wyman, Jp. Changeux // J. Mol. Biol. 1965. - Vol. 12. - P. 88-118.

115. Moore E.G. Cooperativity in the dissociation of nitric oxide from hemoglobin / E.G. Moore, Q.H. Gibson // J. Biol. Chem. 1976. - Vol. 251. - P. 2788-2794.

116. Muirhead H. Three dimensional Fourier synthesis of human deoxyhaemoglobin at 3,5 Angstrom units / H. Muirhead, J. Greer // Nature. 1970. Vol. 228, № 5271.-P. 516-519.

117. Nathan C. Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls / C. Nathan, Q. Xie.- Cell. 1994. - Vol. 78. - 915-918.

118. Nishide H. Facilitated oxygen transport with modified and encapsulated hemoglobins across non-lowing solution membrane / H. Nishide, X.S. Chen, E. Tsu-chida // Artif. Cells. Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 1997. - Vol. 25. - № 4.-P. 335-346.

119. Nitric oxide determinations: much ado about NO-thing? / Han Moshage // Clinical Chemistry. 1997. - Vol. 43, №. 4. - P: 553-556.

120. Nitric oxide in the human respiratory cycle / TJ. McMahon et al. // Nat. Med. 2002. Vol.8. P. 711 717.

121. Nitric oxide, hemoglobin; and hypoxic vasodilation / A.J. Gow // American journal of respiratory cell and molecular biology. 2005. - Vol. 32. - P. 479-482.

122. Nolan V.G. Hemolysis-associated priapism in sickle cell disease / V.G. Nolan et al. // Blood. 2005. - Vol. 106, № 9.-P. 3264-3267.

123. Optically active absorption bands of hemoglobin and its subunits / S. Beychok et al // Ji Biol. Chem.- 1967. Vol: 242, ;№H'0: - P; 2460-2462.

124. Peroxynitrite, a cloaked oxidant formed by nitric oxide and superoxide / W.H. Koppenol ct al. // Chcm. Res. Toxicol. 1992. - Vol. 5. - P. 834-842.

125. Peroxynitrite-dependent tryptophan nitration / B. Alvarez et al. // Chem. Res. ToxicoL -.1996; Voli 9j № 2. - P. 390-396;

126. Peroxynitrite-mediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase / H. Ischiropoulos et al-.-// Arch. Biochem. Biophys. 1992. - Vol. 298, № 2. - P: 431-437.

127. Perutz M.F. In Molecular basis of Blood diseases : ed. G. Stammatayanopoulus / M.F. Perutz // Saunders, Philadelphia. 1987. P. 127-178.

128. Perutz M.F. Regulation of oxygen affinity of hemoglobin: influence of structure of the globin on the heme iron / M.F. Perutz // Annu. Rev. Biochem. 1979; -Vol. 48.-P. 327-386.

129. Perutz M.F. Stereochemistry of cooperative effects in haemoglobin / M.F. Pe-rutz // Nature. 1970. - Vol. 228. - P. 726-734.

130. Pulmonary hypertension as a risk factor for death in patients with sickle cell disease / M.T. Gladwin et al. // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350. - P. 886-895.

131. Rapoport S. The regulation of glycolysis in mammalian erythrocytes / S. Rapo-port//Essays Biochem. 1968. - Vol. 4. - P. 69-103.

132. Rates of nitric oxide dissociation from hemoglobin / F. Azizi et al. // Free Rad-ic. Biol. Med. 2005. - Vol. 39. - P. 145-151.

133. Reaction mechanism between nitric oxide and glutathione mediated by Fe(III) myoglobin / G. Reichenbach et al. // Nitric Oxide: Biol. Chem. 2001. - Vol. 5. -P. 395-401.

134. Reaction of nitric oxide with heme proteins and model compounds of hemoglobin / V.S. Sharma et al. // Biochemistry. 1987. - Vol. 26. - P. 3837-3843.

135. Red blood cell nitric oxide as an endocrine vasoregulator: a potential role in congestive heart failure / B. Datta et al. // Circulation. 2004. - Vol. 109. - P. 1339-1342.

136. Relative role of heme nitrosylation and ^-cysteine 93 nitrosation in the transport and metabolism of nitric oxide by hemoglobin in the human circulation / M.T. Gladwin et al. // Biochemistry. 2000. - Vol. 97, № 18. - P. 9943-9948.

137. Riggs A. Functional properties of hemoglobins / A. Riggs // Physiol. Rev. -1965. Vol. 45, № 4. - P. 619-673.

138. Role of thiols in the targeting of S-nitroso thiols to red blood cells / D. Pietra-forte et al. //Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 7177-7185.

139. Routes to S-nitroso-hemoglobin formation with heme redox and preferential reactivity in the beta subunits / B.P. Luchsinger et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-Vol. 100.-P. 461-466.

140. Salhany J.M. Spectral-kinetic heterogeneity in reactions of nitrosyr hemoglobin / J.M. Salhany, S. Ogawa, R.G. Shulman // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. -Vol. 71, №9.-P. 3359-3362.

141. Schechter A.N. Hemoglobin research and the origins of molecular medicine / A.N. Schechter//Blood.-2008.-Vol. 112,№ 10.-P. 3927-3938.

142. Sharma V.S. The dissociation of NO from nitrosylhemoglobin / V.S. Sharma, H.M. Ranney // J. Biol. Chem. 1978. - Vol. 253. - P. 6467-6472.

143. S-nitrosohaemoglobin: dynamic activity of blood involved in vascular control / L. Jia et al. //Nature. 1996. - Vol. 380. - P. 221-226.

144. Stamler J.S. Biochemistry of nitric oxide and its redoxactivated forms / J.S. Stamler, D.J. Singel, J. Loscalzo // Science. 1992. - Vol. 258. - P. 1898-1902.

145. Stamler J.S. Redox signaling: nitrosylation and related target interactions of nitric oxide / J.S. Stamler // Cell. 1994. - Vol. 78, № 6. - P. 931-936.

146. Sugita Y. Differences in spectra of alpha and beta chains of hemoglobin between isolated state and in tetramer / Y. Sugita // J. Biol. Chem. 1975. - Vol. 250, №4.-P. 1251-1256.

147. The biological chemistry of nitric oxide as it pertains to the extrapulmonary effects of inhaled nitric oxide / A.J. Gow // Proc. Am. Thorac. Soc. 2006. - Vol. 3. -P. 150-152.

148. The case of the missing NO-hemoglobin: spectral changes suggestive of heme redox reactions reflect changes in NO-heme geometry / A. Fago et. al // PNAS. -2003.-Vol. 100, №.21.-P. 12087-12092.

149. The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin a novel mechanism of human disease / R.P. Rother et al. // JAMA. — 2005. - Vol. 293. - P. 1653-1662.

150. The Nobel prize in physiology or medicine / G. Hansson et al. // Stockholm, Sweden: The Nobel Committee for Physiology or Medicine at the Karolinska Institute. 1998.

151. The oxyhemoglobin reaction of nitric oxide / A.J. Gow et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 9027-9032.

152. Transport and peripheral bioactivities of nitrogen oxides carried by red blood cell hemoglobin: role in oxygen delivery / P. Sonveaux et al. // Physiology. —2007.-Vol. 22.-P. 97-112.

153. Traylor T.G. Why NO? / T.G. Traylor, V.S. Sharma // Biochemistry. 1992. -Vol. 31.-P. 2847-2849.

154. Vanin A.F. Iron catalyzes both decomposition and synthesis of S-nitrosothiols: optical and electron paramagnetic resonance studies / A.F. Vanin, I.V. Malenkova, V.A. Serezhenkov // Nitric oxide: Biology and Chemistry. 1997. - Vol. 1, № 3. -P. 191-203.

155. Wallis J.P. Nitric oxide and blood: a review / J.P. Wallis // Transfusion medicine.-2005.-Vol. 15.-P. 1-11.

156. Wang J.H. Synthetic biochemical models / J.H. Wang // Account Chem. Res. -1970.-Vol.3.-P. 90-95.

157. Zweier J.L. Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems / J.L. Zweier, A. Samouilov, P. Kuppusamy // Biochem. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1411.-P. 250-262.

Информация о работе

Рубан, Михаил Константинович
кандидата биологических наук
Воронеж, 2010
ВАК 03.01.02

Диссертация

Структурно-функциональные модификации гемоглобина, индуцированные оксидом азота (II) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы