Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

УФ-индуцированные структурно-функциональные модификации гемоглобина человека в присутствии оксидов азота и углерода

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Калаева, Елена Анатольевна

Общая характеристика работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура, физико-химические и функциональные свойства гемоглобина человека

1.2.Некоторые свойства и биологическая роль оксида азота и оксида углерода

1.2.1. Оксид азота

1.2.2. Оксид углерода

1.3.Влияние оксида азота и оксида углерода на структуру и свойства молекул гемоглобина 28 1.3.1 .Особенности структуры и физико-химических свойств нитрозогемоглобина 29 1.3.2. Особенности структуры и физико-химических свойств карбоксигемоглобина человека

1.4. Влияние УФ-излучения на структуру и функциональные характеристики сложных белков

1.4.1. Действие различных видов оптического излучения на нитрозогемоглобин

1.4.2. Структурные изменения в молекулах карбоксигемоглобина человека, индуцированные УФ-излучением

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Получение растворов оксигемоглобина человека

2.2. Получение растворов карбоксигемоглобина человека

2.3. Получение растворов нитрозогемоглобина человека

2.4. Облучение растворов карбокси- и нитрозогемоглобина человека

2.5. Диск-электрофорез карбокси- и нитрозогемоглобина в полиакриламидном геле

2.6. Регистрация электронных спектров поглощения растворов карбокси

ГЛАВА 4. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НАТИВНОГО И УФ-ОБЛУЧЕННОГО НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ

4Л. Спектральные свойства нативных и УФ-облученных растворов нитрозогемоглобина человека

4.2. Хроматографические характеристики нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

4.3. Электрофоретические свойства нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

4.4. Исследование природы электрофоретических фракций нативного и фотомодифицированного нитрозогемоглобина человека

4.4.1. Спектральные характеристики электрофоретических фракций нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

4.4.2. Хроматографические свойства электрофоретических фракций нативного и УФ-облученного нитрозогемоглобина человека

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ БЕЛКОВЫХ СМЕСЕЙ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ КАРБОКСИ- И НИТРОЗОГЕМОГЛОБИНА

5.1. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и карбоксигемоглобина человека

5.2. Функциональные характеристики нативных и УФ-облученных смесей окси- и нитрозогемоглобина человека

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Калаева, Елена Анатольевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оксид азота и оксид углерода обладают большей, по сравнению с кислородом, аффиностью к железу гемоглобина и образуют с ним прочные комплексы. Это обусловливает сходство многих свойств HbNO и НЬСО: они имеют близкие спектральные характеристики; их молекулы более компактны по сравнению с НЬ02 ; в присутствии карбокси- и нитрозоформ нарушается функциональная активность оксигемоглобина.

Однако лиганды, различные по своей природе, оказывают существенное влияние на свойства гемопротеида и особенности протекания реакций при воздействии экзогенных факторов, в том числе и УФ-излучения, на биомолекулы.

Образцы тотальных карбокси- и нитрозогемоглобина человека проявляли довольно высокую устойчивость к действию малых и средних доз УФ-облучения (151906 Дж/м2). На основании анализа спектральных свойств исследуемых гемопротеидов было сделано заключение о локальных конформационных перестройках в области активного центра гемоглобина (вероятно, связанных с частичной фотодиссоциацией аксиального лиганда) и об обратимых процессах сворачивания белковой глобулы. Скрытые УФ-повреждения апобелкового компонента макромолекул НЬСО и HbNO индуцировали ослабление и разрыв субъединичных контактов в тетрамерах. НЬСО проявлял большую чувствительность к действию УФ-излучения в дозе 151 Дж/м2, чем HbNO. На его электрофореграммах были обнаружены 2 минорные фракции, не характерные для интактных образцов. Эта доза облучения оказала более эффективное воздействие и на функциональные свойства смесей НЬ02 с НЬСО по сравнению со смесями НЬ02 и HbNO. Возможно, устойчивость HbNO к действию малых доз УФ-радиации определяется прочностью связи гем-NO и жесткостью структуры апобелка. Воздействие УФ-радиации в больших дозах (1359 - 4530 Дж/м ) индуцировало необратимые изменения структуры молекул карбокси- и нитрозогемоглобина человека и накопление метгемоглобина в фотомодифицированных образцах. Следует отметить, что метгемоглобиноб-разование интенсивнее проходило в образцах УФ-облученного нитрозогемоглобина. Вероятно, жесткая структура глобина, обеспечивающая устойчивость к действию малых доз УФ-света, неспособна проявлять защитный эффект апобелка по отношению к гему при действии больших доз УФ-излучения. Механизмы процессов, приводящих к переходу гемового железа в Ре+3-форму, для НЬСО и HbNO были различными. Так, исходя из значений константы скорости фотоокисления гема и константы равновесия НЬСО, можно предположить, что аккумуляция MtHb в УФ-модифицированных растворах указанной формы гемопротеида происходила равномерно. Одновременно с образованием окисленной формы гембелка, вероятно, имела место оксигенация части молекул фото диссоциированного НЬСО и появление оксигемоглобина в растворах. Таким образом, облученные образцы карбоксигемоглобина человека представляют собой смесь способных ко взаимопереходам НЬСО, НЬ02 и MtHb и продуктов их фотомодификации, количественное соотношение которых зависит от дозы УФ-света.

Механизм образования MtHb в процессе фотомодификации растворов нитрозогемоглобина, на наш взгляд, отличается от описанного для НЬСО УФ-индуцированного окисления гема. Исходя из анализа данных литературы и результатов собственных исследований, можно выдвинуть гипотезу о том, что переход HbNO в метформу осуществляется не за счет непосредственного фотоокисления НЬ, а в результате реакций между гемовой частью НЬ, N0 и 02 (Борисенко и др., 1997). Поскольку облучение происходит в аэрируемой среде, то фотодиссоциация N0 сопровождается генерацией N02", (Fe2+)Hb02 и активных форм кислорода. Взаимодействие (Fe2+)Hb02 с N0 или Fe2+(Hb) с N02~ приводит к образованию MtHb в растворе облученного белка. Окисление гемоглобина, индуцированное N02", является пероксидзависимым и ускоряется начальным присутствием MtHb (Титов, Петренко, 1999). Реакция приобретает автокаталитический характер, поскольку (Fe3+)Hb[H202] -комплекс, будучи двухэквивалентным окислите

125 лем, способен окислить две молекулы нитрита. Возможно, именно этот процесс делает метгемоглобинобразование в растворах УФ-облученного HbNO необратимым и препятствует накоплению НЬ02 в образцах белка. Наше предположение подтверждают следующие данные: после облучения HbNO УФ-светом в дозе 1359 Дж/м происходит резкое необратимое изменение спектральных, хроматографических и кинетико-термодинамических характеристик, указывающее на экспоненциальное усиление процессов фотоокисления и связанных с ним изменений структуры апобелка. Вместе с тем, константа скорости фотоокисления гема оставалась меньше исходной, а константа равновесия увеличилась незначительно, что указывает на низкую интенсивность процессов фотоокисления гема.

Таким образом, суммируя изложенное выше, можно заключить, что НЬСО человека проявляет большую чувствительность к воздействию малых доз УФ-радиации, однако, изменения, происходящие в структуре его молекул, носят частично обратимый характер. Нитрозогемоглобин, устойчивый к воздействию УФ-света в дозах 151-453 л

Дж/м , вследствие жесткости структуры его апобелкового компонента, по этой же причине подвержен значительным необратимым модификациям, индуцированным большими дозами УФ-радиации (135СМ530 Дж/м2) и связанными с высокой реакционной способностью его лиганда. Мы предлагаем следующую схему процессов УФ-превращений молекул НЬСО и HbNO человека (рис. 16).

Схема процессов УФ-превращений молекул карбокси- и нитрозогемогобина человека

УФ-облучение

151-453 Дж/м2

А>300 нм А<300 нм /

CO-Fe2+Hb-AH iI миграция энергии А

Fe: частичная фотодиссоциация лиганда, ослабление субъединичных контактов, локальные конформационные перестройки апобелка

151-453 Дж/м2

Х>300 нм А<300 нм NO-Fe НЬ-АН tI

НЬ + со

906-1359 Дж/м2

О,; Н,0 Y генерация активных форм кислорода

Fe )НЬ02 ; (Fe2+)HbCO ; (Fe3+)Hb

2265-4530 Дж/м2 продукты фотомодификации (Fe2+)HbCO, (Fe2+)Hb02 и (Fe3+)Hb миграция энергии А

Fe2+)Hb + NO

906-1359 Дж/м2

Fe2+)Hb02

Fe2+)Hb; NO; NO, (Fe3+)Hb

1359-4530 | Дж/м2 (Fe3+)Hb + H202 I

Fe3+)Hb[H2OJ + 2N02 1

Fe3+)Hb + 2HOONO

2(Fe2+)Hb02 или

2(Fe2+)Hb

2(Fe3+)Hb[ H202] + 2N02 необратимая фотомодификация третичной и четвертичной структуры белка,переход в новую конформацию, изменение размеров молекул, накопление метгемоглобина в образце

Рис. 16.