Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование и исследование структуры мультислойных пленок, содержащих нуклеиновые кислоты

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Формирование и исследование структуры мультислойных пленок, содержащих нуклеиновые кислоты"

Р Г Б ОД

МОСКОВСКШ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.32

СУХОРУКОВ Глеб Борисович

ФОРМИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРЫ МУЛЬТИСЛОИНЫХ ПЛЕНОК, СОДЕРЖАЩИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре биофизики физического ^факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и в Институте кристаллографии РАН.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор В.И.ЛОБЫШЕВ Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.И.ИВАНОВ

доктор физико-математических наук, доцент Г.С.ПЛОТНИКОВ Ведущая организация:

Институт общей физики Российской Академии Наук.

Защита состоится 9 иЮН&» 1994 г. з I? в аудитории СОРЯ на заседании специализированного совета КЗ ОФТТ (К.053.05.77) в МГУ им. Ломоносова по адресу: 113899, ГСП, Москва, Воробьевы горы, МГУ Физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Физического факультета Московского государственного университета.

Автореферат разослан мая 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат физ.-мат. наук Т.М.Козлова

/

/

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш. Тема настоящей работы, посвященной зрмированию и исследованию структуры мультислойных пленок )мпл8Ксов нуклеиновых кислот с катионными амфифильными молекулами

поликатионами, находится в фокусе целого ряда как ащаментальных проблем биофизики, молекулярной биологии и ¡дйцины, так и прикладных разработок - создание новых юсенсоров, специфических сорбентов и ион-селективных мембран.

Фундаментальные задачи биофизики в этой области связаны, »-первых, с выяснением пространственной организации и 'нкционирования комплексов ДНК с гистонами, протаминами и другими шовными белками,во-вторых, с изучением нуклеиново-липидных ;аимодействий, необходимого, в частности, для понимания структуры функции ДНК-мембранного контакта. Алифатические амины и их ■алкилзамещенные в отличии от природных липидов имеют более остов молекулярное строение. В них существенно легче :ентифицировать группы и типы взаимодействий, ответственные за разование комплекса с нуклеиновами кислотами. Результаты следования этих систем и развитые при этом методы и подходы гут быть впоследствии использованы для изучения комплексов . клеиновая кислота - природный липид.

Интерес со стороны молекулярной биологии и медицины в этой ласти обусловлен тем, что природные и синтетические нуклеиновые слоты, образовавшие комплекс с амфифильными молекулами, иобретают особые свойства, позволяющие им проходить через эточные мембраны. Увеличёние проникновения нуклеиновых кислот возь клеточные мембраны способствует решению таких вдаментальных задач медицины как, например, блокирование врезденных генов или замена их нормальными.

Использование мультислойных пленок для исследования зимодействия нуклеиновых кислот с катионными амфифильными яекулами и поликатионами имеет ряд преимуществ по сравнению с Пением этих комплексов в растворе (в таких системах как мицелла зерхностно-активного вещества - полинуклеотид и полиамин -вивуклеотид). Эти преимущества заключаются в возможности

привлечения прямых методов структурного анализа - рентгеновская электронная дифракция, эллшсометрия и сканирующая туннельш шкроскопия. Использование ПК-спектроскопии также более-эффектщ» при исследовании пленок, чем растворов.

Целью работы являлось формирование и исследование структур мультислойных пленок комплексов нуклеиновых кислот с катионнш. амфифильными молекулами и поликатионами. В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:

1. Разработать методы формирования мультислойных плене комплексов нуклеиновых кислот с катионннми амфифильнкмл молекула?, (алифатическими аминами и их и-алкилзамещенными) и поликагиснал (полиалиламин, полиэтияенимин,-поли-1-лизин и поли-1-аргинш).

2. Исследовать структуру мультислойных ленгмюровских плене комплексов нуклеиновых кислот с катионннми' амфифильнш* молекулами. Идентифицировать группы и типы взаимодействиГ ответственные за образование комплексов нуклеиновых кислот катионных амфифильных молекул. Выяснить конформацианное состоят ДНК в этих пленках.

3. Исследовать мультислойные пленки комплексов ДНК поликатионами. Определить конформаиионное состояние нуклешовс компоненты в этих пленках.

Для решения этих задач используются следующие метод формирования мультислойных пленок: ленгмюровская технология метод поочередной адсорбции разноименно заряженнъ полиэлектролитов. Структурные исследования проводятся метода?, малоуглового рентгеновского рассеяния, электронографии элипсометрии, сканирующей тунельной микроскопии, УФ- к ИИ спектроскопии.

Научная новизна работы. Получен и исследован новый клас молекулярных систем, представляющий собой мультислойные плен* комплексов нуклеиновых кислот с катионннми амфифильнш,1 молекулами, сформированные методом Ленгмюра-Блоджетт мультислойных пленок комплексов ДНК и поликатионоъ сформировметодом поочередной адсорбции разноименно - заряженнъ полиэлектролитов.

Установлены структуры мультислойных ленгмюровских плене

змплексов ДНК и полиуридиловой кислоты с алифатическими аминами, ззличащихся длиной углеводородной цепи, и с диоктадецилмметил-дмонием. Определено расположение углеводородных цепей в этих тенках. Идентифицированы группы. атомов и типы взаимодействий 1ределяющих комплексообразсваание нуклеиновых кислот и катионных «фифилышх молекул. Исследована гидратация этих пленок и выявлены штры связывания молекул вода. Обнаружено, что в этих пленках ДНК аходится в расплетенном состоянии в случае комплекса с тифатическими аминами и остается в двухспиральном, когда она змплексуэтся с его М-алкилзамещеннюл. Идентифицировано зпформационое состояние ДНК в мультислойных пленках ее комплексов поликатионами. Выявлена неизвестная ранее способность Ш3+-групп знкурентно связываться водородными связями с азотистыми шованиями,- нарушая тем самым комплементарное связывание и шводя молекулу ДНК к расплетанию.

Практическое значение работы. Полученные мультислойные пленки, держащие нуклеиновые кислоты, могут быть использованы в юсенсорных устройствах на определенные нуклеотидные

юлэдовательности, а такие на белки, специфически ¡имодействущио с нуклеиновыми кислотами, и низкомолекулярныэ здества - интеркаляторы. Эти пленки и предложенные в работа ¡тоды иммобилизации нуклеиновых кислот могут найти применение при ¡здании новых ионообменников с управляемой селективностью. )зультаты данной работы представляются важными при выяснении «анизма биологического действия алифатических аминов и их -алкилпроизводннх, широко используемых в различных областях ¡дицины. Обнаруженный в работе факт .существования ДНК в (сплетенном состоянии в комплексе с алифатическим амином и в виде юйной спирали в комплексе с его и-алкиллроизводным, необходимо гитывать при развитии« различных подходов генной терапии, в ютности, усиления трансмембранного переноса ДНК при >мплексообразсваш1я ДНК с катиснннми амфифильными молекулами, ¡нарушенная способность аминогруппы кошурировать за водородные ¡язи с комплементарными азотистыми основаниями может быть одним : важных принципов, определяющих структуру и функции комплексов К с гистонами, протамшами и др. основными белками.

Апробация работы. По теме диссертационной работы опубликова! 9 печатных работ. Основные результаты диссертации докладывались : 6 европейской конференции по исследованию поверхностей ' раздела коллоидов (Грац, Австрия, 1992г.), на школе "Физика нуклеинов! кислот" (Харьков, Украина, 1993г.), на 3 международной конференщ по рентгеновскому и нейтронному исследованию поверхности (Дубнг Россия, 1993г.), на 6 международной конференции по организовать молекулярным пленкам (Труа-Ривьер, Канада, 1993г.), на ' ] мекдународном биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993г.; на семинарах "Ленгмюровские пленки и ансамбли амфифильных молек^ (Институт Кристаллографии РАН, 1Э92-1ЭЭ4гг.) и на семинаре кафедры биофизики физического факультета МГУ (1933-1994гг.)

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, глав, выводов и списка цитированной литературы. Диссертащ: изложена на ¡5"й страницах, содержит 42 рисунков и 2. таблицы. Списс литературы включает ¿53 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Во введении обоснована актуальность теш диссертации определены цель и задачи исследования, его научная новизна црактическая значимость.

В первой главе дан обзор литературы, в котором описаны метод Ленгмюра-Блоджетт и чередующейся адсорбции макромолекул дл получения мультислойных пленок органических и биоорганически молекул, включая белки и их комплексы. Приведены основны результаты структурного анализа таких пленок. Представлен результаты ряда работ по взаимодействию ДНК с липидами, катионным амфифильными молекулами и поликатионами пептидной природы. Сдела анализ работ по применению нуклеиновых кислот в биосенсорны устройствах.

Во второй главе описаны материалы и метода. В работ использовали ДНК из молок осетровых рыб с молекулярной массой 10 в натквной и денатурированном теплом состояниях, полиуридилову;

кислоту, алифатические амины с длиной углеводородной цепи от 16 до 24 углеродных атомов, Я-алкилзамещенный алифатический амин (диоктадецилдиметиламмоний бромид) и поликатионы (поли-1-лизин, ггсли-1-аргинин, полиаллиламин и полиэтиленимин). Приведена схема легмюровской ванны для формирования на поверхности водной субфазы и нанесения на твердую подложку монослоев катионных амфифильных молекул и их комплексов с нуклеиновыми кислотами. Описаны применяемые в работе приборы и метода структурных исследований мультислойных пленок: инфракрасный спектрометр, аппаратура и схема малоугловых рентгеновских измерений, электроногрзф, эллипсометр и сканирующий туннельный микроскоп.

3 третьей главе описано формирование монослоев комплексов нуклеиновых кислот и катионных амфифильных молекул на поверхности водной субфазы и перенос их на твердую подложку с образоваанием мультислойной структуры. Различие тс-А изотерм монослоя октадециламина в отсутствии и при наличии растворенных в субфазе нуклеииновых кислот указывает на комплексообразование нуклеиновых кислот с монослоем октадециламина на поверхности субфазы. Факт ксмплексообразования также подверждается данными по изменению межфазного потенциала при формировании монослоя октадециламина на поверхности чистой субфазы и субфазы, содержащей растворенную нуклеиновую кислоту. Аналогичным образом было показано формирование монослоя комплекса ДНК с диметилдиоктадециламмонием.

воздух

--Дшши/.

вода ^

монослои

алифатического воздух амина -

V

лилЦ-

вода

нуклеиновая кислота

Рис. 1. Формирование мультислойных ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот с катионными амфифильными молекулами. Стрелками показано направление движения подложки сквозь монослой комплекса.

Сформированные монослои наносили на твердую подложку методе Ленгмюра-Блоджетт. Предполагаемая схема формирования мультислойны пленок комплексов нуклеиновых кислот и катионных амфифилъны молекул представлена на рис.1. Нуклеиновые кислоты, связанные монослоем на поверхности водной субфазы, переносятся на подложу захватываясь между полярными грушами двух монослоев катиошш амфифильных молекул.

Для сравнительного анализа наряду с мультислойным ленгмюровскими плешами комплексов катионных амфифильных молекул нуклеиновыми кислотами, были приготовлены мультислойны ленгмюровские пленки катионных амфифильных молекул без нуклеиновы кислот.Ь этом случае в субфазу для нейтрализации положительн заряженных групп монослоя вводили соль Иа^о^. Кены прочн

связывают полярные группы двух слоев катионных амфифильных молеку при образовании мультислойной пленки.

Четвертая глава посвящена структурным исследования ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот и катионны амфифильных молекул методами малоуглового рентгеновског рассеяния, электронографии, эллипсометрии, сканирующей тушельно микроскопии и инфракрасной спектроскопии.

На рис.2а приведены кривые малоуглового рентгеновско рассеяния от ленгмюровских пленок октадециламина и его комплекса ДНК. Эти кривые являются типичными для всех исследованных нам мультислойных ленгмюровских пленок алифатических аминов и и. комплексов с нуклеиновыми кислотами. Наличие трех брегговски. максимумов на кривых рассеяния указывает на слоеву: упорядоченность пленок. Вычисленные из формулы Брегга: 21>з1п0=п; (где Б - межслоевое расстояние, в - угловое положение максимума Л.=1.54Й - длина волны рентгеновского излучения) кежслоевы' расстояния составляют 50.5§ для плеши октадециламина и 57.5^ дл. пленки его комплекса с ДНК. Величина 50.5Й находится в хороше! соответствие с суммой длин двух молекул октадециламина (24+24)2 ; 2.5$, размера противоиона БО^2-. Данные о межслоевых расстояния: для ленгмюровских пленок гомологов алифатических аминов и к: комплексов с ДНК сведены в таблицу. Видно, что увеличение длин: углеводородной цепи на 2 с^-труппы увеличивает межелоевс* расстояние на 5?, что соответствует удвоенной длине двух сегменто:

Рис.2. Кривые малоуглового рентгеновского рассеяния от ультислойних ленгмюровских пленок: а - октадециламина (I) и его эмплекса с ДНК (2), б - диоктадецилдаметиламмония (I) и его

омплекса с ДНК (2).

глеводородной цешь Это свидетельствует о бислойной структуре ленок, в которых углеводородные цепи алифатических аминов анимзмт строго вертикальное положение. Таким образом, молекулы НК занимают Э-12 (разница+2.58, см. таблицу) между полярными

Таблица. Мекслоевые расстояние мультислойных ленгмюровских ленок алифатических арлшов и их комплексов с ДНК, определенные зтодом малоуглового рентгеновского рассзякия.

Алифатический амин Межслоевое расстояние, '2 (-1&) ■

без ДНК ДНК включена 1 Разница

сн3-(-сн2-)15-ш2 45.5 53.0 7.5

СН3-(-СН2-)17-Ш2 50.5 5Т.5 Т.О

СН3-(-СНя-)1Р-КН2 55.5 •62.5 Т.О

СН3-(-СН?-)?3-Ш.-. 65.5 '73.5 8.0

группами алифатических аминов, что существенно меньше диаметр! нативной молекулы ДНК, составляющего 208.

Для выяснения вторичной структуры молекулы ДНК в этих пленка: были исследованы пленки комплексов октадециламина с одноцепочечно] полиуридиловой кислотой (полиУ)и с денатурированной ДНК. Положени: брегговских максимумов.на кривых рассеяния от этих пленок тако( как и на рис. 2а. Совпадение межслоевкх расстояний мультислойны: пленок комплексов с октадециламиком как" с нативной, так и < денатурированной ДНК, а также с одноцепочечной полиуридилово! кислотой свидетельствует о расплетенном состоянии двойной спирал] ДНК в ленгмюровской пленке ее комплекса с алифатическим амином Следует отметить также, что величина 9Й, которую занимаю' нуклеиновые кислоты между полярными группами алифатических аминов находится в хорошем соответствие поперечному размер: полинуклеотидной цепи.

Метод электронографии подвердил вертикальное расположена углеводородных цепей в пленках на основе полученного и: электронограмм периода в распределении электронной плотности вдол: нормали к поверхности пленки равного 2.58, что соотвествуе1 "зигзагу" углеводородной цепи. Кроме того, из положения рефлексо: на электронограммах было найдено, что углеводородные цепи плоскости слоя образуют моноклинную решетку с параметрами а=4.2§ Ь=4.4§ и 7=111°. Включение молекулы ДНК в пленки не изменяв расположение молекул октадециламина в плоскости сдоя.

На полученных нами методом сканирующей туннельной микроскопи (СТМ) изображениях бислоя октадециламйна также видна моноклинна. решетка с приведенными выше параметрами, полученными методо] электронографии. При включении между полярными группами бисло, октадециламина молекул ДНК наряду с изображением моноклинно: решетки появляются хорошо заметные на больших площади: сканирования протяженные впадины и возвышености. Глубина впади 7-88. Их можно трактовать как локальное отсутствие молекул ДИ мевду полярными группами октадециламина. Несомненно, чт интерпретация СТМ-изображэний не может быть однозначной. Вместе тем достоверность полученных наш данных подвергается данным других однозначно интерпретируемых методов структурного анализа

о

0,5

0,3 0,2 0,1

0,60 0,50

0,14 0,10 0,06 0,02

3600 2800 2000 1800 1400 1000 ОТ1

Рио.З.-ИК-сяектры: октадециламина в КБг (кривая I), пленки дативной ДНК при 0 и 93% о.в. (кривые 2 и 3 соответственно), лультислойной ленгмюровской- пленки комплекса октадециламина с ДНК три О и 9-3% (кривые 4 и 5 соответственно).

зентгеновской и электронной дифракции.

Детальный анализ структуры молекулы ДНК и идентификация групп, обеспечивающих коплексообразование в этих пленках, был проведен методом инфракрасной спектроскопии. На рис. 3 представлены Ж-спектры октадециламина в квг, плешах нативной ДКК и ¿ультислойной ленгмюровской пленки комплекса октадециламина и ДНК три 0 и 93% относительнольной влажности (о.в.). На спектре ¿ультислойной ленгмюровской пленки виден триплет узких и интенсивных полос: 2956, 2920 и 2852см-1, относящийся к валентным ЗН-колебаниям октадециламина и полоса 1468см-1, относящаяся- к деформационным сн-колебаниям. Значения частот и форма этих полос в шектре октадециламина в квг и в планке идентичны. Это указывает м то, что углеводородные цепи октадециламина не взаимодействуют с ■1уклеиновой компонентой в мультислойной лэнгмюрсвской пленке.

В противоположность углеводородным цепям, аминогруппы жтадециламина взаимодействуют с нуклеиновой кислотой. Кроме того,

Ш2-группа октадециламина переходит в заряженную ш3+-форму, что характеризуется следухздими спектральными изменениями. Полосы 3336 и 3150см--1", относящиеся соответственно к антисимметричным и симметричным валентным колебаниям м^-группы октадециламина и полоса 1488см"1, относящаяся к деформационным колебаниям этой группы изчезают в спектре мультислойной ленгмюровской пленки комплекса. Вместо них появляется широкая полоса в области 3500-2000см~* и полоса 1534см-1 (0% о.в.)Эти полосы относятся соответственно к валентным и деформационным колебаниям Ш3+-группы. Полоса 1534см-1 при увеличении влажности смещается в область высоких частот,достигая при 40% о.в. предельного значения 1560 см"-1, что связано с образованием водородных связей 1Ш3+-группы октадециламина с молекулами воды.

Частоты антисимметричных колебаний фосфатных групп

нуклеиновых кислот в ленгмюровских пленках их комплексов с октадециламином ниже, чем в пленке нативной ДНК при тех же аначениях о.в. Это указывает на связывание фосфатных групп нуклеиновой кислоты с аминогруппами октадециламина. Взаимодействие мавду фосфатными и аминогруппами сильнее,.чем обычная водородная связь. На это указнвет то, что при высоких значениях о.в. частота антисимметричных колебаний фосфатных групп (1216рм-1) в мультислойной пленке комплекса ниже, чем в пленке нативной ДНК (1224см-1), где фосфатные группы принимают участие в водородном связывании с молекулами воды. При высушивании ДНК частота антисимметричного колебания РО^- группы смещается от 1224 до 1246 см-1. В случае же мультислойной пленки ее комплекса частота этого колебания практически не зависит от о.в., что указывает на блокирование гидратации фосфатных груш ДНК в комплексе.

Взаимодействие между нуклеиновой кислотой и октадециламином обеспечивается не только 'сильными ш3+--,ро2- связями, но и с=0""Щ3+ водородными связями. На это указывают следующие данные: при 0% относительной влажности частоты с=0 валентных колебаний в пленках полиУ (1694см-1) или в пленке ДНК (1663см-1) выше, чем в мультйслойных ленгмюровских пленках их комплексов с октадециламином (1688 и 1648см"*-1 соответственно). Эти частотные сдвиги показывают, что с=о группы нуклеиновых кислот участвуют в

юдородном связыванию! с аминогруппами октадециламина..

Стехиометрия комплексов полиУ-октадециламин и ДНК-жтадециламин в пленках была оценена исходя из коэффициентов жстинкции полос октадециламина (2852 и 2920см"1) и коэффициента >кстшщии полос фосфатных групп ДНК и полиУ (1224см-1) - Было ¡айдено, что в мультислойных ленгмюровских пленках комплексов ДНК : сктадециламияом на один нуклеотид приходится 7 молекул жтадециламина, а в мультислойных пленках комплексов полиУ-жтадециламин на одну фосфатную группу приходится 3.5 молекул жтадециламина.

Наиболее интересующий нас вопрос связан с конформацией галекулы ДНК в мультислойной пленке ее комплекса с ктадециламином. Приведенный на рис. 3 спектр мультислойной енгмюровской пленки кошлекса ДНК с октадециламином полностью овпал со спектром мультислойной ленгмюровской пленки комплекса .енатурированной ДНК с октадециламином. Кроме того, спектр ДНК в омплексе сильно отличается от спектра нативной ДНК в области от лощения фосфатных груш (1250-1000см"~1) и азотистых оснований 1720-1550см-1). Очень слабые изменения в спектре комплекса при С 33% о.в. указывают на отсутствие конформационных изменений уклеиновой компоненты в комплексе с октадециламином при сорбции ода. Нативная ДНК, наоборот испытывает конформационные изменения, ерэходя из неупорядоченного состояния при 0% о.в. в В-фюрму войной спирали при 93% о.в., что характеризуется специфическими зменениями в ИК-спектре (рис.3,врезка). Это ' доказывает, что олекулы ДНК в мультислойных ленгмюровских пленках комплексов с ктадециламином находятся в расплетенном состоянии.

Как видно из рис. 3 широкая полоса 3400см"1, относящаяся к ОН злзнтным колебаниям молекул воды, достаточно интенсивна. Этот акт означает значительную гидратацию мультислойных ленгмюровских яенок комплексов нуклеиновых кислот с алифатическим амином, доставление изменений спектральных параметров полос поглощения С=0-групп и других груш нуклеиновых кислот в звисимости от о.в. показывает, что основными центрами гидратации мультислойных ленгмюровских пленках являются свободные от знтакта с полинуклеотидшми цепями Ш?>+-грушш алифатического

шшшш

О .1

iL N (1 / X » Ж

Рис.4. (I) - Общая схема мультислойных ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот с алифатическими аминами (а -алифатический биолой, б - гидрофильный канал, Б - межслоевое расстояние, определяемое ' из кривых малоуглового рентгеновского рассеяния). (2) - Конкретизированная схема гидрофильного канала в мультислойной ленгмюровской пленки комплекса полиУ с алифатическим

амина. Это находится в соответствии с приведенными выше данными о стехиометрии комплексов.

Основываясь на представленных выше данных, полученных несколькими методами структурного анализа, мы предложили общую схему мультислойной ленгмюровской пленки комплексов нуклеиновых кислот с алифатическими аминами, (рио.4.1). Характерными ее особенностями являются бислои алифатичес coro амина и расположенные мевду ними полинуклеотидкые цепи. Для мультислойной пленки комплекса полиУ с алифатическим амином эта схема конкретизирована на рис. 4.2. Ш3+-грушш алифатического амина связываются как сильными водородными и электростатическими связя*-®! с фосфатными группами полщуклеотидной цепи, так и с карбонильными группами азотистых оснований. Укладка полинуклеотида между бислоями алифатического амина формирует гидрофильный канал мультислойной ленгмюровской пленкой комплекса. Наиболее сильно гидратирующий центр канала - ш3+-группа алифатического амина, свободная от контакта с пслиУ.

На рис. 26 приведены кривые малоуглового рентгеновского рассеяния мультислойной пленки комплекса джжтадоцилдиметил-

® . > ®

аммония (ЛОДА) с ДНК, а также мультислойной пленки ДОДА с противоионами ЭО^2-. В отличии от пленок алифатических аминов и их комплексов с нуклеиновыми кислотами в случае ДОДА присутствие нуклеиной кислоты не изменяет положения Орегговских максимумов. Вычисленное из формулы Брегга межслойное расстояние в данном случае равно 40.52. Если исходить из вероятной Оислойной структуры, то углеводородные цепи должны быть наклоненны относительно плоскости пленки на угол 60°.

Исследование мультислойных пленок комплексов ДНК с ДОДЛ методом электронографии показало наличие периода 2.2§ в распределению? электронной плотности вдоль нормали к плоскости пленки. Это значение соответствует проекции на нормаль "зигзага" углеводородной цепи 2-.5Й при угле наклона в 60°, подверждая тем самым данные малоугловога рентгеновского рассеяния. Было установлено также, что углеводородные цепи ДОДА образуют в плоскости слоя ромбическую решетку с параметрами а=7.в8, ь=5.бЯ, 7=90°.

Остается невыясненным расположение молекул ДНК в этих пленках. Видимо, структура комплексной ЛБ-пленки определяется упаковкой молекул ДОДА,"а полимерные молекулы ДНК, нейтрализуя положительный заряд аммониевой группы, дают возможность молекулам ДОДА сблизиться и образовать более плотную кристаллическую структуру, чем в отсутствие нуклеиновой компоненты. В пользу этого свидетельствует увеличение числа от одного до двух и уменьшение полуширины брегговских максимумов, характеризующих слоевую упорядоченность пленки (рис.26).

Анализ конформационного состояния ДНК в мультислойной пленке ее комплекса с ДОДА был выполнен методом ИК-спектроскопии. На рис.5 приведены спектры диоктадецилдиметиламмония бромида в КВг и мультислойной пленки комплекса ДНК и ДОДА при О и 93" о.б. Анализ этих спектров, аналогичный приведенному выше для комплекса ДНК с октадециламином, приводит нас к выводу, что ДНК в мультислойной пленке комплекса с ДОДА контактирует только с его полярной частью.

Наиболее интересно поглощение ДНК в области азотистых оснований (1750-1550СМ-1) и фосфатных групп (1250-950см'1). ДОДА в этой области частот поглощения не обнаруживает, позволяя относить

Рис.5. ИК-епектры: диоктадецилдиметиламмония бромида в КВг (кривая I), пленки нативной ДНК при 0 и 93% о.в. (кривые 2 и 3 соответственно), мультислойной ленгмюровской пленки' комплекса диоктадецилдиметиламмония с ДНК при 0 и 93% (кривые- 4 и 5 соответственно).

поглощение мультислойной пленкой комплекса к нуклеиновой компоненте. Появление при 93% о.в. полосы 1715см-1, идентифицирующей образование стэкинг-взаимодействий между соседствующими азотистыми основаниями, свидетельствует, что молекулы ДНК переходят в форму двойной спирали. Об этом также свидетельствует характерное для перехода в двухспиральное состояние появление при высоких значениях о.в. интенсивных и узких полос 1083 и ЮоЗсм-1, относящихся соответственно к 'Симметричному колебанию Р02~ группы и с5-о4 связи сахаро-фэсфатной цепи. В целом, изменяя в спектре при увеличении влажности от 0 до 93% о.в. для ДНК в мультислойной пленке комплекса с ДОДА полностью

совпадают с аналогичными изменениями для пленки чистой ДНК (рис.5,врезка). Все это указывает на то', что ДНК в комплексе с ДОДА является нативной, испытывает те же конформационные переходы с изменеием влажности из неупорядоченного состояния в В-форму двойной спирали, как и нативная ДНК.

Приведенное выше доказательство нативного состояния молекулы ДНК в мультислойной ленгмюровской пленке комплекса с ДОДА со всей наглядностью показывает, что причиной расплетания молекулы ДНК в ленгмюровской пленке ее комплекса с октадециламином является конкурентное с комплементарными азотистыми основаниями водородное связывание аминогруппами алифатического амина с С=0-группами оснований ДНК. и-алкилзамещение алифатических аминов не дает возможности образования водородных связей, сохраняя тем самым, структуру двойной спирали ДНК.

Пятая глава посвящена мультислойным пленкам, полученным методом чередующейся адсорбции ДНК и поликатионов (поли-1-лизин, поли-1-аргишш, голиалиламин и полиэтиленимин). Единственным структурным параметром, получаемым из кривых малоуглового рассеяния от таких пленок является толщина пленки, определяемая из углового положения минимумов Киссига. В работе определяли изменения толщины пленки после адсорбции пары слоев ДНК и поликатиона. Эти данные приведет на рис.6, из которого видно, что для всех пар ДНК-поликатион имеет место линейный рост толщины пленки в зависимости от числа слоев. Наклон этих линий характеризует среднюю толщину, приходящуюся на пару слоев ДНК-поликатион. Полученные значения равны:

- для пары слоев ДНК - поли-1-лизин - 25±5$

- для пары слоев ДНК - полиаллиламин - 28±8§

- для пары слоев ДНК - полиэтиленимин - 44-12Й

- для пары слоев ДНК - поли-1-аргинин - 17-21.

Пунктирной .линией на рис.в показано гипотетическое изменение толщины, соответствующее 20$ т.е. поперечному размеру двухспиральной молекулы ДНК. Для трех типов комплексов линии проходят выше, однако в случае поочередной адсорбции ДНК и поли-1-аргинина толшина адсорбированной пары слоев меньше

2

1

¿1

3

01 2345678 9 10

пцр слоав

Рис.6. Изменения толщин мультислойных пленок комплексов ДНК с поли-1-аргинином (I), с поли-1-лизином (2), с полиаллиламином (3) и с голиетилекимином (4) от числа пар адсорбированных слоев ДНК-поликатион.

поперечного размера двухспиралыюй молекулы ДНК. Это может объясняться нарушением структуры двойной спирали ДНК в комплексе с поли-1-аргинином. Для комплексов ДНК с другими поликатионами средние толщины пары адсорбированных слоев заметно превышает размер ДНК. Вероятно, молекула ДНК сохраняет в мультислойных пленках комплексов с полиаллиламином, полиэшленимином и поли-1-лизином нативную форму.

Подробный анализ конформационного состояния нуклеиновой компоненты в мультислойных пленках комплексов ДНК и поликатионов был проведен на основе ИК-спектров этих пленок. В ИК-спектрах пленок всех четырех типов чистых поликатионов (полиаллиламйна, полииэтиленимина, поли-1-лизинаа и шли-1-аргинина) в области поглощения фосфатных групп ДНК 1250-900см-1 и в области выше ГУООсм"1 полос поглощения не обнаруживается. Из этого следует, что описяшше выше критерии нахождения ДНК в форме двойной спирали могут бить эффективно использованы для анализа конформационного состояния нуклеиновой компоненты комплекса.

Полосе симметричного колебания фосфатной группы в сухой. (0%

э.в.) пленке ДНК и сухих мультислойных пленках ее комплексов с юликатионами имеет одну и ту же частоту. При увлажнении, также сак и в случае плешей ДНК, для мультислойных пленок ее комплексов 5 полиаллиламином, голиэткленимином и полй-1-лизином наблюдается зозрастание интенсивности полосы симметричного колебания Р02" и ^большое ~10см-^" смещение в длиноволновую область. При еысоких шаченях о.в. (75% и выше) в спектрах пленок этих комплексов :аблюдаются два интенсивных узких пика с частотами 1085 и ;053см-1, характерных для двойной спирали ДНК, В спектре пленки ссмплекса ДНК с поли-1-аргинином таких изменений не наблюдается, ¡то свидетельствует о расплетенном состоянии ДНК в этом комплексе. С такому же выводу можно прийти и из анализа изменений спектральных параметров ИК-полос в области колебаний азотистых зенований. Высокочастотная полоса 1715см-1 появляется при высоких злажностях в спектре пленок комплексов ДНК с полиаллиламином, голиэтиленимшом, поли-1-лизином и отсутствует в спектре комплекса ЩК с поли-1-аргинином.

Причина расплетания ДНК при комплексообразовании с юли-1-аргинином, по-видимому, та же что и при ее взаимодействии с юнослоем алифатического амина и заключается в конкурентном связывании аминогруппы с азотистыми осхюваниями комплементарной тары ДНК. В гуанидиновой группе аргининового остатка две миногруппы также как и в случае твердого монослоя алифатического мина расположены друг относительно друга на расстоянии ван-дер-заальсового радиуса, что резко повышает их способность связываться ю только электростатическими и водородными связями с фосфатными группами, но и конкурировать за водородные связи с кэмплементаршми азотистыми основаниями, наруиая тем самым двойную яптраль ДНК. Эта способность, для остальных исследованных нами юликатионов существенно ослаблена, посколько их аминогруппы достаточно удалены друг от друга.

Основные выводы.

1. Разработана методика формирования мультислойных ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот (голиуридиловая кислота, нативная и денатурированная ДНИ) с катионными амфифильнши молекулами (алифатическими аминами с длиной углеводородной цепи от

до С24 и диоктадецилдимэтиламмонием).

2. Методами малоуглового рентгеновского рассеяния, электронографии и сканирующей туннельной микроскопии показано, что углеводородные цепи алифатических аминов в ленгмюровских пленках их комплексов с нуклеиновыми кислотами образуют в плоскости слоя моноклинную решетку с параметрами а=4.2?, Ь=4.4Й; 7=1II0 и расположены нормально плоскости подложки. Углеводородные цепи диоктадецилдиметиламмония в ленгмюровких пленках его комплекса с ДНК расположены под углом 60° к плоскости слоя и образуют ромбическую решетку с параметрами а=7.8Й, Ъ=5.6Й; 7=90°.

3. На основании ИК-спектров и данных малоуглового рентгеновского рассеяния показано, что молекулы ДНК в мультислойной ленгмюровской пленке комплекса с эмфатическим амином находятся в расплетенном состоянии, а в ленгмюровской пленке комплекса с даоктадецилдиметшшммонием двойная спираль ДНК сохраняется. Установлены структуры мультислойных пленок комплексов нуклеиновых кислот с алифатическими аминами, характерной особенностью которых является наличие алифатических бислоев и расположенных между ними полинуклеотидных цепей. ИН3+-группы алифатических аминов связываются прочными водородными и электростатическими связями с фосфатными группами полинуклеотида, а также водородными связями с С-С грушами нуклеиновых оснований. Показано, что в мультислойных пленках комплекса ДНК или полиуридиловой кислоты с октадециламином фосфатные группы практически не гидратируются, а наиболее сильно гидратируются КНд+-группы алифатических аминов, свободная от контакта с полинуклеотидными цепями.

4. Разработана методика получения мультислойных пленок комплексов ДНК с пожкатионами, основанная на поочередной адсорбции на твердую подложку разноименно заряженных полиэлектролитов. Методом малоуглового рентгеноского рассеяния определены толщины пар адсорбированных слоев ДНК с полиэтленимином, полиаллиламинсм,

поли—l-лизшюм и поли-1-аргикином, которые составляют соответственно 44, 28, 25'и 17Й. Из данных УФ- и ИК-спектроскопин следует, что в мультислойной пленке комплекса с полиаргинином ДНК находится в расплетенном состоянии, а в пленках комплексов с остальными- поликатионами - в виде двойной спирали.

5. Установлено, что причина расплетания ДНК в мультислойных пленках комплексов с алифатическими аминами и с полиаргинином обусловлена способносью аминогрупп связывться не только с фосфатными группами ДНК, но и конкурировать за водородные связи с комплементарными азотистыми основаниями.

6. Найдены условия получения устойчивых монослоев бактериородопслна на поверхности водной субфазы и переноса их на твердую подложку. Период мультислойной ленгмюровской пленки бактериоропскна составляет 47$, что соответствует размеру молекулы бактериородопсина в пурпурной мембране.

По теме диссертации опубликованы работы:

1. Suthorukov G.B., Erokhin V.V. Abstracts of 6th European Colloid 5c Interface Society Conference, September 1992, Graz, Austria. PI-43. "¡iuoleio acids in Langmuir-Blodgett films".

2. G.B.Sukhorukov, Y.I.Lotyshev, V.V.Erokhin, Molecular materials, 1S92, Vol.1, pp.91-95. "Preparation and X-ray study of bacteriorhodopsin Langmuir films"

3. Сухсруков Г.Б.. Ерохин В.В., Тронин А.Ю. Биофизика, 1993,Том 38(2) стр.257-262. "Получение и исследование ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот и октадециламина"

4. G.B.SukJiorukov. Abstracts of 3th international conference on surface X-ray and neutron scattering, June 1993, Dubna, Russia, r>.93. "X-гзу study of langrauir films of aliphatic amines - nucleic icids complexes".

}. V. X.Lobyshev, G.B.Sukhoruitov. Abstracts of 6th International Conference on organized molecular films, July 1993, Trois-Rivieres, Canada, P-14o.14. "X-ray and 3TM study of bacteriorhodopsin "arigmuir film".

6. G.В.Sukhorukov, . V.V.Erokhin, L.A.Feigin, M.M.Montrel, B.I.Sukhorukev. Abstracts of 6th International Conference on organized molecular films, July 1993, Trois-Rivieres, Canada, P-14o.27. "X-ray and infrared study-of Xangniuir films of complexes between aliphatic amines and nucleic acids"

7. G.В.Sukhorukov, M.M.Montrel, V.V.Erokhin. Abstracts of 11th International Biophysics Congress, July 1993, Budapest, Hungary. D1-33- "X-ray and infrared study of interaction of nucleic acids with aliphatic amines"

8. Yu.Lvov, G.Deoher, G.Sukhorukov. Uacromolecules, 1993, vol.26, PP,5396-5399. "Assembly of thin films by means of successive deposition of alternate layers of DNA and polyallylamine".

9. Сухоруков Б.И., Монтрель М.М;, Сухорукое Г.Б., Шабарчина Л.И., Биофизика, 1994, Том 39(2), стр 302-311 "Оптические свойства и структура ленгмюровских пленок комплексов нуклеиновых кислот с липидами и синтогичесними амфифильными молекулами. I.ICC-спектры, структура и гидратация мультислойной ленгмюровской пленки комплекса полиуридиловой кислоты с октадециламином".