Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитотоксические и иммуномодулирующие эффекты продуктов фотолиза псоралена и порфиринов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Цитотоксические и иммуномодулирующие эффекты продуктов фотолиза псоралена и порфиринов"

РГБ Ой

1 з '

На правах рукописи

БЕЛИЧЕНКО Ирина Викторовна

ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОДУКТОВ ФОТОЛИЗА ПСОРАЛЕНА И ПОРФИРИНОВ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена на кафедре медицинской и биологической физики Российски Государственного Медицинского Университета (Москва).

Научный руководитель: кандидат биологических наук БЕЗДЕТНАЯ Л.Н.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор ПОТАПЕНКО А.Я.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор ИВАНОВ И.И. доктор биологических наук, профессор КЛЕБАНОВ Г.И.

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Минздравмедпрс РФ.

Защита состоится " ьСсРиУ_1995 г

в (О часов на заседании Специализированного Совета К 0.84.14.04 в Российа Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869 Москва, Островитянова 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке РГМУ по адресу: 117869 Мое? ул. Островитянова, д. 1.

Автореферат разослан "«¿»С " 1995 г

Ученый секретарь Совета, доцент

БУРОМСКИЙ И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для лечения кожных и онкологических заболеваний применяются методы фотохемотерапии, заключающиеся в облучении светом либо кожи, либо опухолей в присутствии соединений, повышающих чувствительность биообъектов к свету (фотосенсибилизаторов). В процессе облучения сенсибилизаторы подвергаются фотодеструкции (Henderson B.W., 1992, Konig К., 1990), часть образующихся при этом фотопродуктов может обладать биологической активностью. Так, показано, что продукты фотолиза псоралена, использующегося в фотохемотерапии кожных заболеваний, вызывают лизис эритроцитов, влияют на активность макрофагов, индуцируют супрессию реакции гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана у мышей (Potapenko A.Ya. et al., 1991, !994).

Для изучения биологически активных фотопродуктов псораленов удобным объектом исследования являются эритроциты. Ранее было показано, что гемолиз можно вызвать как облучением эритроцитов УФА-светом (320-400 нм) в присутствии псоралена (ПУФА-гемолиз), так и добавлением к ним предварительно облученного в растворе псоралена (ФОП-гемолиз) (Potapenko A.Ya., 1991). Причем гемолитической активностью обладают продукты фотолиза, полученные при облучении псоралена и в водном, и в этанольном растворах. Ранее было показано, что гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно облученным в этанольном растворе, ингибируется антиоксидантом ионолом, что указывает на вовлечение свободных радикалов в индукцию гемолиза (Potapenko A.Ya. et а!., 1988). Влияние ангиоксидантов на ПУФА-гемолиз и гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно облученным в водном растворе, не изучалось.

Остаются необъясненными парадоксальные зависимости скорости гемолиза, вызванного ФОП и ПУФА-воздействием. В этих случаях при повышении концентрации гемолитика скорость гемолиза не возрастает, а снижается.

В фотохемотерапии опухолей используются порфирины. Методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии были обнаружены продукты фотолиза порфиринов (Ahram М. et al., 1994, Dietel W. et al., 1990). Однако, в отличие от псоралена, биологическая активность фотопродуктов порфиринов не обнаружена и их роль в индукции терапевтического, иммуносупрессирующего и побочных (например, эритемного) эффектов при проведении фотохемотерапии не определена.

Поскольку биологическая активность фотопродуктов порфиринов в опытах с опухолевыми клетками не была обнаружена и, подвергаясь фотодеструкции, порфирины теряют фотосенсибилизирующие свойства, то для клинической дозиметрии очень важно оценить степень фотовыцветания препарата при облучении. Считается, что главная роль в фотовыцветании порфиринов принадлежит синглетному кислороду, фотогенерированному самими порфиринами (Krieg М. et al., 1984). Недавно для оценки фотовыцветания порфиринов было предложено использовать биологическое тестирование. Этот метод основан на уменьшении способности предоблученных растворов порфиринов фотосенсибилизировать гибель опухолевых клеток (Bezdetnaya L. et al., 1994). Квантовые выходы фотолиза порфиринов, определенные методом биотестирования оказались значительно выше таковых, измеренных флуоресцентным методом. Однако, осталось невыясненным можно ли для био-тестирования фотовыцветания использовать другие биологические эффекты, например, гемолиз эритроцитов, а также не была выяснена роль синглетного кислорода в реакциях фотолиза порфиринов, приводящих к потере их фотосенсибилизируюшей активности.

Целью настоящей работы явилось исследование механизмов фотолиза и проявления биологической активности фотопродуктов псораленов и порфиринов -сенсибилизаторов, используемых в фотохемотерапии кожных и онкологических заболеваний. При этом были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить влияние антиоксиданта ионола на ПУФА-гемолиз и гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно облученным в водном растворе.

2. Исследовать влияние предоблученных протопорфирина IX и производного гематопорфирина in vivo на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей и in vitro на антиген-презентирующие клетки - макрофаги.

3. Разработать биологическую тест-систему для оценки степени фотовыцветания протопорфирина IX и производного гематопорфирина в растворе, основанную на определении способности предоблученных растворов фотосенсибилизировать лизис эритроцитов, а также определить роль синглетного кислорода в процессе фотовыцветания.

Научная новизна работы. Показано, что при облучении псоралена в водном и этанольном растворах образуются фотопродукты, имеющие разную природу. Опыты с использованием антиоксиданта ионола выявили, что гемолиз, индуцированный при совместном облучением эритроцитов с псораленом либо при добавлении к эритроцитам псоралена, предоблученного в этанольном растворе, осуществляется с участием свободных радикалов и ингибируется ионолом. Однако, если предоблучение псоралена проводить в водном растворе, то образуются фотопродукты-гемолитики, разрушающие мембраны без участия свободных радикалов.

Предложена гипотеза, объясняющая падение скорости гемолиза, сенсибилизированного псораленом, при увеличении концентрации гемолитика. Гипотеза основана на экспериментах по исследованию концентрационной зависимости гемолитических эффектов ионола. Эта зависимость так же парадоксальна, как и дозовые зависимости скорости ПУФА- или ФОП-гемолиза. Показано, что падение скорости гемолиза, индуцированного ионолом, при увеличении его концентрации коррелирует с агрегацией ионола в водных растворах. Предполагается механическое повреждение мембран эритроцитов агрегатами ионола, причем мелкие агрегаты вызывают более быстрый лизис эритроцитов, чем более крупные. Сходный механизм гемолиза предполагается для ФОП: при облучении псоралена образуются продукты его фотолиза,

которые в водных растворах способны агрегировать и механически повреждать мембран) эритроцитов.

Впервые обнаружена биологическая активность продуктов фотолизг протопорфирина IX (ПП IX) и производного гематопорфирина (ПГП). Предоблученньк растворы обоих порфиринов вызывали гибель клеток перитонеального экссудата in vitro кроме того in vivo они влияли на уровень реакции гиперчувствительности замедленной: типа к эритроцитам барана у мышей (ГЗТ): ПГП снижало уровень реакции ГЗТ, ПП 1> увеличивал уровень реакции ГЗТ.

Изучена роль фотоокислительных реакций производного гематопорфирина i индукции им фотогемолиза. Показано, что при низких концентрациях ПГП (0.16 мкг/мл наблюдается выраженный кислородный эффект, указывающий на то, что фотогемоли: индуцируется по механизму Типа II (с участием синглетного кислорода). Однако npt высоких концентрациях ПГП (1,5 мкг/мл) происходит изменение механизмг фотогемолиза, проявляющееся в полном исчезновении зависимости фотогемолиза от присутствия кислорода. Таким образом, можно сделать вывод, что MexaHH3N мембранотоксических эффектов ПГП сильно зависит от концентрации сенсибилизатора.

Предложен способ оценки фотовыцветания порфиринов при их облучении i растворе по уменьшению способности предоблученных растворо! фотосенсибилизировать гемолиз эритроцитов. Показано, что фотовыцветанш протопорфирина IX в растворе зависит от присутствия кислорода при облучении J осуществляется, по-видимому, с участием синглетного кислорода. Фотовыцветанш производного гематопорфирина не зависит от присутствия кислорода при облучении, не значительно снижается, если при облучении присутствует антиоксидант ионол Предполагается, что фотовыцветание производного гематопорфирина осуществляется < участием свободных радикалов.

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований позволяю" приблизиться к пониманию механизма мембранотоксического действия продукте!

фотолиза псоралена. До сих пор фотолиз порфиринов считался неблагоприятным фактором, снижающим эффективность фотохемотерапии. В данной работе впервые показано, что продукты фотолиза порфиринов обладают токсическим действием на мембраны клеток и влияют на развитие иммунного ответа in vivo. Эти факты прямо указывают на то, что в процессе фотохемотерапии могут быть вовлечены не только активные формы кислорода, фотогенерированные порфиринами, но и продукты фотолиза порфиринов. Способность ПП IX активировать иммунный ответ организма может давать вклад в индукцию терапевтического эффекта.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на заседании кафедры медицинской и биологической физики Российского Государственного Медицинского Университета (1996), а также на 11м Международном Конгрессе по Фотобиологии (1992, Киото, Япония), 5м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1993, Марбург, Германия), Совещании Французского Общества Фотобиологов "Новые горизонты в Фотобиологии" (1994, Париж, Франция), 22м Ежегодном Совещании Американского Общества Фотобиологов (1994, Скоггсдейл, США), Международной Конференции по клинической Хемилюминесценции (1994, Берлин, Германия), 4м Международном Симпозиуме по ЭПР, Дозиметрии и Применению (1995, Мюнхен, Германия), 1м Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (1995, Пущино, Россия), 6м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1995, Кембридж, Англия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 133 источника. Работа состоит из трех глав и изложена на 106 страницах, включая 28 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали псорален (Институт химии растительных веществ АН Узбекистана, Ташкент), протопорфирин IX и ионол производства SIGMA (США), NaCl, ЫаНгР04, Na2HP04, KCl, CaCh, этанол, D-глюкоза и ЭДТА отечественного производства ХЧ или ЧДА, производное гематопорфирина предоставлено Queen Elizabeth Hospital (Вудвилль, Австралия).

Оценка гемолитических эффектов псоралена и порфиринов проводилась на эритроцитах человека методом турбидиметрии (Potapenko A.Ya., 1991).

Жизнеспособность перитонеальных макрофагов оценивали методом их окраски 0,1% раствором трипанового синего (Phillips Н,, 1973).

Облучение псоралена осуществляли сфокусированным светом ртутно-кварцевой лампы сверхвысокого давления ДРШ-250-3. УФА-область выделяли с помощью светофильтра "Hg-MON 365" (К. Цейсс, Германия). Облучение порфиринов проводили лампой накаливания мощностью 150 Вт на расстоянии 10 см.

Изменение агрегатного состояния ионола оценивали спектроскопически на спектрофотометре СФ-46 (Россия).

Влияние предоблученных порфиринов на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей оценивали по разнице отека между опытной и контрольной контрлатеральными лапками (Lagrange Р. et а)., 1974).

Статистическая обработка результатов: результаты обрабатывали методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического и стандартного отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ионола на фотогемолиз, индуцированный псораленом.

Гемолиз, индуцированный облучением эритроцитов в присутствии псоралена (ПУФА-гемолиз), ингибировался антиоксидантом ионолом (рис. I). В случае незавершенного гемолиза происходил сдвиг кривой амплитуд гемолиза в область больших доз, т.е. в присутствии ионола тот же эффект достигался облучением суспензии эритроцитов в большей дозе (кривая 1), чем без ионола (кривая 2). Скорость завершенного гемолиза при добавлении ионола уменьшалась приблизительно в 2 раза при всех использованных дозах облучения (рис. 1, кривые 3 и 4).

Исследована также концентрационная зависимость влияния ионола на ПУФА-гемолиз. Максимальное (двукратное) ингибирование гемолиза оказывал ионол в концентрации 10'5 М. Ингибирующий эффект исчезал при концентрации ионола 3x10-7 М. Возможно, ионол присутствующий во время облучения клеток с псораленом, перехватывает свободные радикалы, образующиеся в процессе распада нестабильных в воде продуктов фотоокисления псоралена.

Ионол не влиял на гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно фотоокисленным в водном растворе (ФОП-гемолиз). Из этих опытов можно сделать вывод, что при облучении псоралена в воде образуются устойчивые в воде гемолитики,, повреждающие мембраны эритроцитов без участия свободных радикалов.

Гемолиз, индуцированный ионолом. При высоких концентрациях ионол вызывал лизис эритроцитов (рис.2). В узком диапазоне концентраций ионола (от 16 мкМ до 24 мкМ) индуцировался незавершенный гемолиз, который оценивали по амплитуде гемолиза (% лизировавших клеток в суспензии). При концентрациях 24 мкМ и выше ионол вызывал завершенный гемолиз (лизировали все клетки суспензии), который оценивали по скорости гемолиза. При этом с ростом концентрации ионола скорость гемолиза падала.

•Доза облучения, кДхдм

Рис. 1. Зависимость амплитуды и скорости ПУФА-гемолиза от дозы УФА-облучения

в присутствии (1,3) и в отсутствие (2,4) ионола.

Интенсивность УФА-света - 180 Вт/м2. Концентрации: псоралена - 10 4 М, ионола -10"5 М.

Этот факт интересен тем, что для ПУФА- и ФОП-гемолиза наблюдаются аналогичные закономерности (см. рис. 1): в узком диапазоне доз облучения наблюдается незавершенный гемолиз, а скорость завершенного гемолиза с ростом дозы облучения (т.е. с ростом концентрации гемолитика) падает.

концентрация ионола, мкМ

Рис. 2. Зависимость амплитуды и скорости гемолиза, индуцированного ионолом, от его концентрации. Содержание этанола в пробах - 1%.

Методом абсорбционной спектроскопии нами было показано, что при концентрациях ионола выше 24 мкМ в водных растворах ионола появляется светорассеяние, связанное, по-видимому, с агрегацией. Чем выше была концентрация ионола, тем меньше было светопропускание растворов ионола при 320 нм (при этой длине волны оптическая плотность поглощения ионола равна нулю). Мы предположили, что при добавлении ионола к суспензии эритроцитов происходит механическое повреждение мембран клеток агрегатами ионола, приводящее к гемолизу. Причем мелкие агрегаты повреждают мембраны легче, чем крупные, что приводит к падению скорости гемолиза, при увеличении концентрации и, соответственно, размеров агрегатов ионола. Аналогичный процесс предполагается и для ПУФА- и ФОП-гемолиза: при облучении псоралена образуются фотопродукты, агрегирующие в водных растворах. Чем выше доза облучения псоралена, тем выше концентрация фотопродукта-гемолитика и степень его агрегированности.

Изучение фотовыиветания производного гематопорфирнна ГПГТР н протопорф!фина IX (НИ IX).

В отличие от псоралена предоблученные растворы ПГП и ПП IX, добавленные к суспензии эритроцитов, не вызывали ускорения гемолиза по сравнению с контролем без предоблучения растворов ПГП и ПП IX. С другой стороны, известно, что при совместном облучении ПГП и ПП IX с эритроцитами индуцируется гемолиз (Chignell С. et al., 1995). Причиной гемолиза считается перекисное окисление липидов (Beaton S. et al., 1995). Нами была изучена роль фотоокислительных реакций (ПГП) в индукции им фотогемолиза. Показано, что при низких концентрациях ПГП (0.16 мкг/мл) наблюдается выраженный кислородный эффект. При облучении эритроцитов в присутствии ПГП в атмосфере аргона наблюдается почти двукратное снижение скорости гемолиза по сравнению с облучением на воздухе, что указывает на то, что фотогемолиз индуцируется по механизму Типа II (с участием синглетного кислорода). Однако при высоких концентрациях ПГП (1,5 мкг/мл) происходит изменение механизма фотогемолиза, проявляющееся в полном исчезновении зависимости фотогемолиза от присутствия кислорода. Таким образом, можно сделать вывод, что механизм мембранотоксических эффектов ПГП сильно зависит от концентрации сенсибилизатора.

Из литературы известно, что порфирины при облучении подвергаются фотовыцветанию, сопровождающемуся снижением оптической плотности поглощения и интенсивности флуоресценции (Henderson B.W., 1992). Недавно была предложена новая модель оценки фотовыцветания порфиринов в растворе, в которой о фотовыцветании судили по утрате способности предоблученного красителя фотосенсибилизировать повреждение опухолевых клеток в культуре ткани (Bezdetnaya L. et al., 1994). Мы попытались развить эту модель, используя в качестве тест-системы не культуру ткани, а значительно более простой объект - эритроциты. Суть этой модели заключается в следующем. ПГП и ПП IX предоблучали разными дозами света в растворе, смешивали с суспензией эритроцитов и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем эту смесь

эблучали фиксированной дозой света и регистрировали гемолиз. На рис. 3 и 4 (кривая 1) представлены дозовые зависимости относительной скорости гемолиза (Уо1Н), щдуцированного ПГП и ПП IX, от времени их предоблучения в растворе. Чем выше эыла доза предоблучения порфиринов в растворе, тем ниже становилась относительная жорость гемолиза, что говорит о фотовыцветании растворов порфиринов при предоблучении и потере ими фотосенсибилизирующих свойств.

Рис. 3. Зависимость относительной скорости гемолиза, индуцированного ПП IX, от времени предоблучения раствора ПП IX. 1 - растворПП IX предоблучали на воздухе, 2 - раствор ПП IX предоблучали в атмосфере аргона. Концентрация ПП IX при облучении 8,7х10 6 М. Время облучения раствора ПП IX в присутствии клеток - 20 мин. Конечная концентрация клеток после смешивания с раствором ПП IX -107 кл/мл. Считается, что фотовыцветание порфиринов в растворе - кислородзависимый процесс, протекающий с участием синглетного кислорода М. е1 а1., 1984). Поэтому на

следующем этапе работы растворы ПГП и ПП IX предоблучали в атмосфере аргона.

Фотовыцветание ПП IX зависело от присутствия кислорода при облучения относительная скорость гемолиза значительно повышалась, если предоблучение ПП I проводили в атмосфере аргона (рис. 3). Эти результаты согласуются с данны\ литературы. В отличие от ПП IX фотовыцветание ПГП (3 мкг/мл) в растворе не зависе; от присутствия кислорода (рис. 4, кривая 2). Фотовыцветание более разбавленно! раствора ПГП (0,33 мкг/мл) также не зависело от присутствия кислорода.

Таким образом, фотовыцветание ПГП в растворе является кислород-независимы процессом. По-видимому, эта реакция осуществляется по механизму Типа I, т.е. б участия синглетного кислорода. На рис. 5 представлены результаты исследован» влияния антиоксиданта ионола на фотовыцветание ПГП.

Время предоблучения ПГП, мин

Рис. 4. Зависимость относительной скорости гемолиза, индуцированного ПГП, от времени предоблучения раствора ПГП. 1,2- раствор ПГП предоблучали на воздухе или в атмосфере аргона, соответственно. Концентрация ПГП при предоблучении 3 мкг/мл. Время облучения раствора ПГП в присутствии клеток - 4 мин. Конечная концентрация клеток после смешивания с раствором ПГП -107 кл/мл.

Видно, что Уогн гемолиза, индуцированного ПГП, значительно выше, когда ионол присутствовал при предоблучении ПГП в растворе (кривая 1) по сравнению с контролем без добавления ионола (кривая 2). Если ионол был добавлен после предоблучения ПГП перед смешиванием с клетками, то ингибирующий эффект отсутствовал. Следовательно ионол влиял на фотохимическую стадию реакции и не влиял на взаимодействие ПГП с клетками. Можно предположить, что фотовыцветание ПГП в растворе происходит по механизму Типа I, т.е. с участием свободных радикалов.

Время предоблучения ПГП, мин

Рис. 5. Ингибирование фотовыцветания раствора ПГП ионолом. 1 - раствор ПГП предоблучали в присутствии 5 мкМ ионола, 2 - раствор ПГП предоблучали в отсутствие ионола. Конечная концентрация клеток после смешивания с раствором ПГП - 107кл/мл.

Влияние предоблученнмх ПП IX и ПГП на выживаемость клеток перитонеального

гиперчувствнтельности барана у мышей.

Как было сказано выше, в литературе нет сведений о том, что продукты фотолиз порфиринов обладают собственной биологической активностью.

Нами было обнаружено, что предоблученные растворы ПГП и ПП IX обладаю мембранотоксическим действием на макрофаги. Мембранотоксическим эффекто: обладали и необлученные ПГП и ПП IX, но значительно меньшим (выживаемость клето около 92%), чем предоблученные растворы (выживаемость клеток около 60% Полученные результаты нельзя объяснить влиянием на макрофаги активных фор: кислорода, образующихся при облучении растворов порфиринов, т.к. времена их жизн достаточно малы (Foot С., 1990), чтобы присутствовать в растворе предоблученны растворов ПГП и ПП IX в момент их смешивания с суспензией макрофагов.

0 15 30 45

Время облучения, мин

Рис. 6. Влияние предоблученного ПГП на на реакцию ГЗТ. ПГП (3 мкг/мл) в фосфатном буферном растворе облучали светом лампы накаливания (150 Вт) на растоянии 10 см. Мышам внутривенно вводили по 0,5 мл предоблученного ПГП через 66 часов после сенсибилизации антигеном, мышам в группах К+ (положительный контроль) и К-(отрицательный контроль) вместо ПГП вводили 0,5 мл физраствора.

Единственным объяснением гибели макрофагов может быть мембранотоксичсско действие относительно стабильных фотопродуктов, образовавшихся при предоблученш растворов ПГП и ПП IX.

Известно, что при проведении ФДТ индуцируется супрессия Т-клеточного шмунного ответа (Musser D. et al., 1991). Однако вклад продуктов фотолиза порфиринов ) индукцию иммунологических эффектов ранее не изучался. Поэтому в настоящей работе «следовали влияние предварительно облученных в растворе ПГП и ПП IX на реакцию •иперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ). Лредоблученный в течение 45 мин ПГП при внутривенном его введении вызывал тримерно двукратное снижение уровня реакции ГЗТ (рис. 6) по сравнению с юложительным контролем (К+) и необлученным ПГП. Таким образом, было показано, )то снижение уровня иммунного ответа можно индуцировать не только при облучении 1ГП in vivo (т.е. при проведении фотохемотерапии), но и при введении в организм 1редварителыю облученного раствора ПГП.

В отличие от ПГП предварительно облученный протопорфирин IX вызывал 1ктизацию реакции ГЗТ (рис.7) по сравнению с положительным контролем и «облученным ПП IX в интервале времен облучения от 30 мин до 3 часов.

Полученные результаты прямо указывают на то, что в процессе фотохемотерапии .югут быть вовлечены не только активные формы кислорода, фотогенерированные торфиринами, но и продукты фотолиза порфиринов. Способность ПП IX активировать [ммунный ответ организма может давать вклад в индукцию терапевтического эффекта.

Время предоблучения ПП IX, ч

Рис. 7. Увеличение уровня реакции ГЗТ под действием предоблучешюго в растворе ПП IX.

ПП IX (0,01 мг/мл) в фосфатном буферном растворе, содержащем 0,5% D-глюкозы, предоблучали светом лампы накаливания (150 Вт) на расстоянии 10 см. Мышам внутривенно вводили по 0,5 мл предоблученного ПП IX через 66 часов после сенсибилизации антигеном, мышам в группах К+ (положительный контроль) и К- (отрицательный контроль) вместо ПП IX вводили 0,5 мл 0,5% раствора D-глюкозы.

ВЫВОДЫ

1. Изучено влияние антиоксиданта ионола на гемолиз, индуцированный УФА облучением (366 им, 180 Вт/м2) эритроцитов человека в присутствии псоралена (ПУФА гемолиз). Показано, что добавление ионола к эритроцитам до облучения приводило : ингибированию гемолиза: это проявлялось в снижении скорости гемолиза и сдвиг дозовой кривой амплитуд гемолиза в область больших доз облучения. Защитный эффек

донола, возможно, объясняется тем, что он перехватывает лабильные фотопродукты тсоралена, имеющие радикальную природу.

2. При облучении псоралена в водном и этанольном растворах образуются }>отопродукты-гемолитики, имеющие разную природу. Ионол ингибирует гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно облученным в этанольном растворе и не злияет на гемолиз, индуцированный псораленом, предварительно фотоокисленным в воде. По-видимому, при облучении псоралена в воде образуются фотопродукты, способные лизировать эритроциты без участия свободных радикалов.

3. Найдена модель, имитирующая гемолитические эффекты псоралена как при ПУФА-воздействии на эритроциты, так и при добавлении к клеткам предварительно фотоокисленного псоралена (ФОП-гемолиз). Концентрационная зависимость гемолитических эффектов ионола парадоксальна и качественно совпадает с дозовычи зависимостями как ПУФА-, так и ФОП-гемолиза. Концентрации ионола ниже 20 мкМ являются подпороговыми и гемолиз не вызывают. В интервале концентраций ионола 2024 мкМ индуцируется незавершенный гемолиз, амплитуда гемолиза растет с увеличением концентрации ионола. При концентрациях 24 мкМ и выше ионол индуцирует завершенный гемолиз. При этом скорость гемолиза снижается с увеличением концентрации гемолитика. Предложена механо-химическая модель гемолитических эффектов ионола. Предполагается, что данная модель справедлива и для гемолиза, вызванного фотопродуктами псоралена.

4. Изучена роль фотоокислительных реакций производного гематопорфирина (ПГП) в индукции им фотогемолиза. Показано, что при низких концентрациях ПГП (0.16 мкг/мл) наблюдается выраженный кислородный эффект, указывающий на то, что фотогемолиз индуцируется по механизму Типа II (с участием синглетного кислорода). Однако при высоких концентрациях ПГП (1,5 мкг/мл) происходит изменение механизма фотогемолиза, проявляющееся в полном исчезновении зависимости фотогемолиза от

присутствия кислорода. Таким образом, можно сделать вывод, что механ! мембранотоксических эффектов ПГП сильно зависит от концентрации сенсибилизатор

5. Исследованы мембранотоксические свойства продуктов фотолиза протопорфирина и производного гематопорфирина. Гемолитический эффект фотопродуктов не обнару» Однако в тесте с трипановым синим выявлено, что предварительно облученньи растворе протопорфирин IX и производное гематопорфирина вызывают гибель кле перитонеального экссудата мышей.

6. Показано, что предварительно облученные в растворе протопорфирин IX производное гематопорфирина влияют на развитие реакции гиперчувствительно замедленного типа к эритроцитам барана у мышей (ГЗТ). Предоблученный раст! производного гематопорфирина вызывал снижение уровня реакции ГЗТ, в то время ] протопорфирин IX вызывал увеличение уровня реакции ГЗТ. Предполагав образование иммунологически активных фотопродуктов при облучи протопорфирина IX и производного гематопорфирина в растворе.

7. Предложен способ оценки фотовыцветания порфиринов при их облучении в раств< по уменьшению способности предоблученных растворов фотосенсибилизировать гемо. эритроцитов. Показано, что фотовыцветание протопорфирина IX в растворе зависит присутствия кислорода при облучении и осуществляется, по-видимому, с участг синглетного кислорода, Фотовыцветание производного гематопорфирина не зависит присутствия кислорода при облучении, но значительно снижается, если при облучен присутствует антиоксидант ионол. Предполагается, что фотовыцветание производне гематопорфирина осуществляется с участием свободных радикалов. Практические рекомендации.

1. Результаты работы могут быть использованы в курсе лекций по теме: "Биофизичео основы фотомедицины" для студентов б-го курса на медико-биологическом факульт« РГМУ.

Результаты работы могут быть ."спользованы в лекциях на "Высших международных -шверситетских курсах по фундаментальным аспектам лазерной медицины и иомедицинской оптики" при МГУ им. М.В. Ломоносова.

Полученные данные могут быть использованы для совершенствования существующих разработке новых методов фотохемотерапии кожных и онкологических заболеваний.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. I.V. Belichenko, A.A. Kyagova, N.N. Zhuravel, G.V. Mansurova, L.N. Bezdetnaya, . Guillemin, S. Wunderlich, F. Pliquett, E.P. Lysenko and A.Ya. Potapenko. Photodynamic aemolysis sensitized by psoralen: effects of butylated hydroxytoluene.// Phys Chem Biol & led, 2:151-157,1995.

2. I.V. Belichenko, E.P. Lysenko, N.N. Zhuravel, A.A. Kyagova, M.V. Malakhov, L.N. ■ezdetnaya, F. Guillemin and A.Ya. Potapenko. Comparison of haemolytic effects of butylated ydroxytoluene and previously photooxidized psoralen.// Phys Chem Biol & Med, 2:159-164, 995.

3. "Membratoxic photodynamic effects of psoralen" Potapenko A., Bezdetnaya L., .ysenko E., Saparov S., Kyagova A., Mamedov I., Mollaev R., Belichenko I. and Zhuravel N. 1th International Congress on Photobiology (September 7-12, 1992, Kyoto, Japan).

4. "Psoralen sensitized photohaemolysis is a helpful model for elucidation of the lechanisms of photodynamic effects of psoralens in PUVA therapy" Potapenko A., Saparov S., lollaev R., Mamedov I., Kyagova A., Zhuravel N., Malakhov M., Belichenko I., Lysenko E. nd Bezdetnaya L. 5th Congress of the European Society for Photobiology (September 19-26, 993, Marburg, Germany).

5. "Investigation of immunological effects of products of psoralen photooxidation" Lyagova A., Chernyakhovskaya I., Bekhalo V., Nagurskaya E., Belichenko I., Zhuravel N., ;mailova M., Rodenko I. and Potapenko A. 5th Congress of the European Society for hotobiology (September 19-26,1993, Marburg, Germany).

6. "Type III photodynamic effects of psoralens and porphyrins" A. Potapenko, Belichenko, L. Bezdetnaya, A. Kyagova, J.-L. Merlin, F. Guillemin. "Nouveaux horizons photobiologie" (5-7 Decembre, 1994, Paris, France).

7. "Suppression of delayed type hypersensitivity (DTH) reaction by prelimin; photooxidized psoralen (POP): effect of wavelength of UV". M.V. Malakhov, A.A. Kyago N.N. Zhuravel, I.V. Belichenko, E.P. Lysenko, A.Ya. Potapenko. Photochem.Photobiol., special issue, 33S-34S, 1994. 22th Annual Meeting of the American Society for Photobiolc (June 25-29, 1994, Scottsdale, Arisona).

8. "Chemiluminescent investigations of photodynamic reactions of psoralens in PUV therapy". A.Ya. Potapenko, E.P. Lysenko, L.N. Bezdetnaya, A.A. Kyagova, I.S. Mamed' M.V. Malakhov, N.N. Zhuravel, I.V. Belichenko, L.A. Kozir. International Conference Clinical Chemiluminescence (April 25-28, 1994, Berlin), Book of Abstracts, D-2.

9. "Investigation of properties of photooxidized psoralens by ESR-method with spin ti c-phenil -n-tert-butyl-nitronc (PBN)". E. Lysenko, I. Rodenko, A. Osipov, S. Saparov, Moilaev, M. Malakhov, N. Zhuravel, I. Belichcnko, A. Kyagova, A. Potapenko. < International Simposium on ESR Dosimetry and Applications (May 15-19, 1995, Munch Germany).

10. "Влияние продуктов фотоокисления псоралена на Т-клеточный иммунн; ответ у мышей in vivo". A.A. Кягова, H.H. Журавель, M.B. Малахов, И.В. Беличеш А.Я. Потапенко. 1й Международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения перспективы их практического использования" (Тезисы докладов. 1-5 августа 19! Пущино, Россия).

11. "Type III mechanism of photodynamic reactions". A.Ya. Potapenko, A.A. Kyago' E.P. Lysenko, I.V. Belichenko, L.A. Kozir, L.N. Bezdetnaya. 6th Congress of the Europe Society for Photobiology (September 3-8, 1995, Cambridge, UK).

12. "Spectroscopic and biological testing of photobleaching of porphyrins in solution Lina N. Bezdetnaya, Irina V. Belichenko, Jean-Louis Merlin, Alexander Ya. Potapenko a

François Guillemin. 6th Congress of the European Society for Photobiology (September 3-8, 1995, Cambridge, UK).