Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы модулирования реакций гиперчувствительности замедленного типа и повреждения эритроцитов под действием фотоокисленных фурокумаринов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы модулирования реакций гиперчувствительности замедленного типа и повреждения эритроцитов под действием фотоокисленных фурокумаринов"



иС-Л •

На правах рукописи УДК 612 014 4:514 14

АНДИНА В пена Семеновна

МЕХАНИЗМЫ МОДУЛИРОВАНИЯ РЕАКЦИЙ I ИПЕРЧУВ( ТВИТЕЛ1.НО< ТИ Ч А М ЕДЛ Е11 НО ГО ТИПА II ПОВРЕЖДЕНИЯ Н'ИТРОЦИТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ФОТООКИСЛЕНШ1ЫХ ФУ РО КУМАРИ НОВ

03.00.02 - биофишка АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соисканиеученой степени кандидат* биологически! наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре медицинской и биологической физики Российского Государственного Медицинскою Университета

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор А.Я.Потапенко Научный консультант:

Кандидат биологических наук Е В. Нагурская

Официальные оппоненты: д.б.н., проф. Иванов И И

д.б.н., проф. Завильгельский Г.Б.

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ Российской Федерации

Защита диссертации состоится » 1998г. в /Г час. на

заседании диссертационного Совета К.084.14.04 по присуждению учёной степени кандидата наук по специальности "биофизика" при Российском Государственном Медицинском Университете по адресу: 117869, Москва, уд Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Российского Государственного Медицинского Университета

Автореферат разослан «___»_1998г.

Ученый секретарь Диссертационно г о совета К.084.14.04 .

кандидат медицински* наук,

доцент И.В.Буромский'

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Для лечения многих кожных заболеваний, таких как псориаз, витилиго, поема, кожная Т-клеточиая лимфома, успешно применяется комбинированное воздействие псораленов (фурокумарннои) п ближнего УФА излучения (320-400нм) - ПУФА-терапия (Pathak and Fitzpatrick 1991 J. Однако, наряду с терапевтическим действием ПУФА-терапия приводит к побочным токсическим эффектам (эритеме, эдеме, гиперпигментации н старению кожи). Ранее большое внимание уделялось реакциям фотоприсоединення фурокумаринов к нн1)имидиновым основаниям нуклеиновых кислот, протекающим без участия кислорода [lnnocenti et al. 1986]. ('читалось, что с этими реакциями связаны терапевтические эффекты ПУФА-терапии. Позже, благодаря использованию антиоксидантов в ПУФА-терапии, выявили важную роль фотоокислительных реакций псораленов в индукции эритемы [Потапенко и др. 1984; Pathak et al. 1984]. Эти реакции являются кислород-зависимыми и мишенью для них являются преимущественно мембраны клеток [Potapenko et al. 1990]. Поэтому исследование механизма мембранотоксических эффектов фурокумаринов является актуальной задачей. Длительное время протекание кислород-зависимых реакций связывали только с индукцией токсических эффектов данного вида фотохимиотерапии. Однако недавно появились данные о том, что фотоокислительные реакции могут быть ответственными за терапевтические эффекты фурокумаринов

13 последние годы появляется все больше информации о том, что в основе ПУФА-герапии лежат иммуномодулирующие фотобиологические эффекты фурокумаринов. Так, было показано, что ПУФА-воздействие способно ингибировать реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) н контактной гиперчувствителыюсти (КЧ) [Aubin et al. 1991]. Это явление связывают либо с прямым повреждением антшен-презентирующих клеток в коже [Morison et al. 1981], либо с индукцией клона супрессорных Т-клеток [Perez et al. 1989], либо с увеличением секреции цитокинов иммунокомпетентными клетками, обладающих иммуносупрессирующим действием [Tokura et al 1991]. Недавно возникло предположение, что некоторые токсические, а также основные терапевтические эффекты ПУФА-воздействия могут реализоваться через стадию образования продуктов фотоокнсления псораленов. Это предположение основывается на тех фактах, что продукты фотоокисления псоралена (ФОП) модулируют реакцию ГЗТ и влияют на активность антиген-презентнрующих клеток in vitro [Potapenko 1994]. Иммунологические механизмы модуляции Т-клеточного ответа у животных под действием ФОП до конца не ясны. Неизвестно также, какова природа продуктов окисления фурокумаринов, обладающих иммуносупрессирующим действием. Псораленовая фотохимиотерапия, по-видимому, является иммунотерапией. Это делает изучение иммуномодулирующих эффектов псораленов чрезвычайно актуальной задачей.

Цели н плачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение иммуномодулирующих и токсических свойств продуктов фотоокислення фурокумарннов in vivo и in vilru.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить действие продуктов окислеиия псоралена и императорина на [емсодержащие белки - метгемоглобнн и оксигемоглобин.

2. Исследовать мембранотоксическое действие продуктов окисления императорина и их вклад в фотогемолиз, сенсибилизированный импсраторином.

3. Выяснить механизмы иммуномодулируюшего действия ФОН н исследовать действие продуктов окисления императорина и аллоимператорина на реакцию ГЗТ к ЭБ у мышей.

Научная новизна работы

Показано, что фотоокисленный псорален и продукт фотоокисления императорина - гидропероксид императорииа - вызывают частично обратимые взаимные превращения форм гемоглобина: меггемоглобина в гемихром, оксигемоглобина в метгемоглобнн. Продукты окисления псоралена, вызывающие подобные изменения гемсодержащих белков, образуются только в присутствии кислорода, стабильны при хранении, разрушаются ионами двухвалентного железа и ферментами катапазой и глутатион-пероксидазой. Предполагается, что основным фотопродуктом, опосредующим токсическое действие ФОП в отношении гемсодержащих белков, является гидропероксид водорода.

Обнаружено, что императорин обладает фотогемолитическим действием, гемолиз носит завершенный характер. Установлено, что дозовая зависимость скорости данного фотогемолиза имеет сложный характер и лучше всего описывается уравнением вида: V - +al>2 + bl> 'J где V и V0 - скорости светового и темпового гемолиза, соответственно, а и b - постоянные. При малых дозах облучения основной вклад в фотогемолиз вносит компонента Ы)'\ Было предположено, что появление этой компоненты связано с появлением в ходе облучения гидропероксида императорина и его гемолитическим действием. Свободнорадикальные продукты (ОН*) и (RO*), образующиеся при распаде гидропероксида императорина, по-видимому, запускают процесс перекисного окисления липидов в мембранах эритроцитов, что приводит к образованию каналов проницаемости. Об этом свидетельствуют результаты опытов с антиоксидантами, в которых показано, что императориновый фотогемолиз ингибируется ионолом и трет-бутанолом на 50%, Значение показателя степени при дозе облучения (1/2) указывает на то, что для образования двух каналов проницаемости в мембране клетки необходимо поглощение одного кванта света молекулой сенсибилизатора и образование одной молекулы его гидропероксида. Предполагается, что вторая компонента (aD2), вносящая основной вклад в фотогемолиз при больших дозах облучения, связана с фотосенсибнлизированным повреждением белковых компонент мембраны и образованием в результате этого катионных каналов проницаемости в мембране

клетки. 'Значение показателя степени при лозе облучения сенсибилизатора (2) укатывает на то, что для обраювания одною канала проницаемости в мембране клегкн необходимо поглощение двух квантов спета.

На модели реакции гиперчувствительностн замедленного типа к эритроцитам барана у мышей покатано, ню продукты окисления псоралеиа обладают иммуномодулируюшим действием при виеденнн их в организм животного на любых сроках развития иммунологической реакции (на афферентной и эфферентной фазах реакции) В экспериментах по адоптивному переносу реакции ГЗТ было установлено, что иммуносуирессия, вызванная ФОН, обусловлена изменением активности клеток не Т-клеточной природы 1 (редположено, что аитиген-презентирукнцие клетки опосредуют иммуносупрессирующее действие ФОП за счет активации их супрессорного потенциала. Обнаружено, что иммуносупрессирующим действием также обладают продукты фогоокисления других фурокумаринов - имиераторина и аллоимлераторина - их гидропероксиды.

Практическая значимость

Результаты проведенных исследовании in vivo и in vitro расширяют наши представления об особенностях токсическою и нммуномодулирующето действии продуктов окисления псоралеиов и мотут быть использованы для совершенствовании фотохимиотерапии.

Основываясь на полученных результатах можно предложить продукты фоюокисления фурокумаринов н качестве терапевтических агентов при лечении некоторых кожных заболеваний (ФОП-терапия). ФОП-терапия позволит избежать ряд пежелателытых побочных аффектов, наблюдающихся при проведении обычной ПУФА-терапни.

Апробации работы

Основные положения диссертации обсуждались на 1 Всероссийской конференции фотобиологов (Пущино 1996), на международном симпозиуме, посвященному памяти А. А. Красповского "Problems and Trends of Pholobiochemistry" (Москва 1997), па международной научно-практической конференции "Биологически активные вещества и новые продукты в косметике" (Москва 1996), на VI и VII конгрессах Европейского Фотобиологического общества (Кембридж 1995, Отреза 1997), на 12 международном конгрессе по Фошбиологии (Вена 1996), на заседаниях кафедры медицинской и биологической физики Российского Государственного Медицинского Университета.

Публикации

1 lo теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 149 страницах машинописи и состоит из введения (3 стр.), обзора литературы (33 стр.), описания материалов и методов исследования (10 стр.), изложения полученных результатов и их обсуждения (68 стр.), заключения (7 стр.) и библиографического указателя (19 стр.). Работа содержит 42 рисунка, 2 таблицы, список цитированной литературы (224 источника).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы исследования.

В работе использовались фурокумарины: псорален (Институт химии растительных веществ АН Узбекистана, г.Ташкент), императорин, аллоимператорин, гидропероксиды императорина I, II и аллоимператорина, алкоголи императорина и аллоимператорина (лаборатория профессора В. Адама, Институт органической химии, г. Вюрцбург, Германия).

Аскорбат - "Реахим", Россия; гидропероксид водорода (Н2О2), - "Fluka", Германия; трет-бутанол - "Merk-Schuchardt", Германия; гемоглобин (меттемоглобнн 91 %), глутатион (GSH), окисленный глутатион (GS-SG), каталаза, глутатион-пероксидаза, ионол (2,6-ди-и/кт»-бутил-п-крезол), тритон Х-100, Тролокс С - фирма "Sigma", США. NaCl, КН2РО* КС1, Na:HP04, FeS04x 7HjO, уксусная кислота, этанол, среда 199 на растворе Хенкса - отечественного производства (ХЧ или ЧДА).

Источником УФ-А-излучения служили ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления ДРШ-250-3 (УФ-А область выделялась с помощью светофильтра "Hg-Mon 365" (Карл Цейсс, Германия)) и кварцевая лампа "Q-139, Medicor" (Венгрия). Интенсивность света измеряли с помощью калиброванного фотоэлемента "Waldman" (Германия).

Кинетику превращений гемоглобина в смеси рассчитывали по изменению оптической плотности при 4-х длинах волн (560, 577, 630 и 700 нм). Измерения проводились на спектрофотометре UV-I60A "Shimadzu" (Япония). Процентное содержание основных форм гемоглобина рассчитывали по методу [Андреюк 1988] или по методу [Winterboum 1990].

Гемолиз регистрировали по изменению мутности в суспензии эритроцитов в 1 мм повете при 677 нм на фотоэлектроколориметре КФК-2МП.

Реакцию ГЗТ к эритроцитам барана изучали на мышах гибридах (СВА х C57BU) по методу [Liew 1977]. Раствор продуктов фотоокисления фурокумаринов вводили мышам внутривенно. Интенсивность реакции ГЗТ оценивали по разнице отека между опытной и контрольными лапками.

Результаты обрабатывали методами вариационной статистики с соответствующими рассчетами среднего арифметического и стандартной ошибки среднего. Дозовые кривые императоринового фотогемолиза обрабатывались по методу наименьших квадратов.

И-ЛУЛЫ АТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОГ.СУЖДКНИЕ.

Превращении гемоглобина, индуцированные ФОН

1'анее било показано [Оапарон 19921, что после ПУФА-воздействия на эритроциты концентрация оксигемотлобнна (oxyllb)-в гемолнзате падала, а метгемоглобина (melHb) - увеличивалась. Кроме гаю, в лаборатории А.Я. Потапенко было обнаружено, что предварительно <|ютоокисленный чтанольный раствор 8-мегоксмнсоралеиа вызывал почти полностью обратимое превращение ме I гемоглобина в гемнхром (her) |Ионина 1994] В настоящей работе исследовалось действие продуктов фотоокисления псоралена на гемоглобин (9091% метгемоглобина) и свойства mix фотопродуктов.

Фогоокисленный псорален вызывал превращение одних форм гемоглобина в другие (рис.1).

X

ю

о

г-, (О 2 и

время инкубации, мин

Рис. 1. Кинетика изменения процентного содержания основных форм гемоглобина: метгемоглобина, оксигемоглобина и гемихрома под действием ФОН.

2,5 мл раствора псоралена (Ю-4 М, 1 % этанола) облучали УФ-Л светом (доза - 828 кДж/м , интенсивность - 230 Вт/ы2), затем добавляли 0,5 мл раствора гемоглобина (14 мкМ). КП1йнь, Кихуць, КЬи - контрольные кривые - гемоглобин инкубировался с необлученным псораленом.

Добавление ФОН приводит к быстрому (за 4-6 мин) уменьшению доли melllb. 'ho уменьшение частично обратимо, так как за 40 минут инкубации процентное содержание metí Ib восст анавливается до 70 % о г исходного уровня. В то же время, концентрация гемихрома (her) увеличивается и достигает максимума на 1-6 минуте инкубации, а затем наблюдается медленное обращение процесса. Конце« фация океш емотлобнна необратимо уменьшается. В

контрольных пробах (с необлученным псораленом) существенных изменений в конценфации основных форм гемоглобина не наблюдалось (рис.1, кривые

Kmeillb КотуНь,

Таким образом, metHb частично обратимо переходит в гемихром под действием ФОГ1. ОхуНЬ, по-видимому, превращается в metHb, обеспечивая возвращение процентного содержания metHb почти к исходному уровню.

Доля меттемоглобнна, превращенного в гемихром к 5-6 мшгуте инкубации, монотонно увеличивалась с увеличением дозы облучения пеоралена (рис.2) Доля превращенного metHb, определяется количеством продуктов фотоокисления пеоралена. Экспоненциальный характер лозовой кривой указывает на выцветание пеоралена в ходе облучения

92

90

о4 88

$' 86

ю

0

S 84

0

1 82

2 80

78

76

О 400 800 1200 1600 доза облучения, кДж/м 2

Рис.2. Зависимость превращения меттемоглобнна (проценты) на шестой минуте его инкубации с ФОН от дозы облучения раствора пеоралена.

К 2,5 мл раствора пеоралена (10"4 М, 1 % этанола), облученного разними дозами УФ-А света (1=230 Вт/м2), добавляли 0,5 мл раствора гемоглобина (14 мкМ, 90,5% метгемоглобина).

Исследована природа фотоггродуктов пеоралена, вызывающих превращения гемоглобина. ФОП-продукты не теряли своей способности реагировать с гемсодержащими белками ни при нагревании их до 100°С, ни при длительном предварительном хранении (2 часа), ни при инкубации с восстановленным глутатионом. Однако, продукты окисления пеоралена не оказывали практически никакого действия на гемоглобин после 15-ти минутной инкубации с Ре2', с каталазой и глутатион-пероксидазой. Для образования ФОГТ-продуктов, активных в отношении гемсодержащнх белков, необходимо присутствие кислорода. Так, при облучении пеоралена в бескислородных .условиях (в

атмосфере аргона) образовавшиеся продукты фотолиза псоралена не оказывали существенного влияния на гемоглобин. Результаты этих экспериментов, а также данные литературы | \1arley 1995] поволили предположить в качестве основного продукта окисления псоралена, действующею на гемеодержащне белки, -гидропероксид водорода. Действительно, IЬСЬ, реагируя с гемоглобином, вызывал аналогичные превращения гемсодержащих белков н растворе, что и ФОН. Причём, даже после предварительной часовой инкубации Нг02 при 100°С активность этого соединения в отношении гемоглобинов "е изменялись.

Действие гидропероксида императорииа ни окснгемоглобин

Ранее было показано [Лысенко и др: "1996] необратимое действие ФОН на окснгемоглобин, полученный из лизироваииых эритроцитов человека. ФОН вызывал превращение оксигемоглобина в меттемоглобин и гемнхром, причем с ростом дозы облучения псоралена доля превращенного в другие формы оксигемоглобина возрастала. Мы сравнили действие гидропероксидз императорииа (1тООН) и ФОН на окснгемоглобин. Оказалось, что кинетические кривые превращения 'оксмгемог'лобина под действием продуктов окисления этих двух фурохумаринов сходные.

100

0 80

; во

1 40

с j

с

' 20 О

60 SO 40 30 20 10 О

7.

О

а х х Ж

О 25 50 75 100 125 150 время инкубации, мин

Рис.3. Кинетика изменения концентрации основных форм гемоглобина под действием гидропероксида императорииа.

Окснгемоглобин (в конечной концентрации 10 мкМ) смешивали с гндропероксидом императорииа (в конечной концентрация 0,2 мМ) я рассчитывали процентное содержание основных форм гемоглобина по данным спектрофотометрнн.

К„«,кь, Kmciii!„ К|кг - контрольные кр/шы: (pscrrxp охсшеког.здбши содержал 2 % этанола).

Пч рнс.З видно, 'ио концентрация окснгемоглобин:) под действием HMiicparopiiiioBOi о шдропероксида необратимо падает и через 2 часа после

- Я -

начала инкубации составляет лишь 22 % от начального количества (рис.3, сплошная линия). При этом большая часть оксигемоглобина переходит в метгемоглобин (55%), а меньшая часть окисляется далее до гемихрома (23%) (рис.3, пунктирные кривые metHb и her). В контрольных пробах концентрации основных форм гемоглобина практически не менялись.

Тахим образом, продукты окисления фурокумаринов пероксидной природы вызывают значительные изменения состояния гемсодержащих белков.

Фотогемолиз, сенсибилизированный императорином

Фотопродукты псоралена очень нестабильны, и выделить их достаточно сложно. Однако для некоторых других фурокумаринов - императорина и аллонмператорина - стабильные фотопродукты (гидропероксиды, алкоголи) были получены и выделены в лаборатории В. Адама (Германия) и любезно предоставлены в наше распоряжение. В настоящей работе было исследовано фотогемолитическое действие императорина и мембранотокснческое действие его фотопродуктов.

Нами был изучен темповой гемолиз, вызванный продуктом окисления императорина - его гндропероксидом (рис.4).

К01щентрация 1шООН I, мкМ

Рис.4. Зависимость скорости темнового гемолиза от концентрации императоринового гидропероксида 1.

5 мл суспензии эритроцитов (106 кл/мл) инкубировались при 37°С и при 4°С в присутствии различных концентраций 1шООН I. Концентрация этанола во всех пробах -2%.

Оказалось, что концентрационная зависимость скорости гемолиза, индуцированного ЬпООН при 4°С хорошо описывается уравнением вида: Г-Го + сКУ, где Уд - скорость гемолиза в отсутствие агента, с! - коэффициент пропорциональности, С - концентрация 1тООН, у - показатель степени при концентрации. Показатель степени при концентрации оказался равным 0,47. Это говорит о том, чго одна молекула гидропероксида вызывает образование двух

каналов проницаемости в мембране эритроцита, каждый из которых даёт вклад в лизис клетки. Мы предположили, что образование каналов проницаемости может быть связано с образованием гидроксильных (ОН*) и алкоксильных (RO*) радикалов при термолизе гидропероксида.

Для кривой при 37°С иайти V представляло определенную сложность, т.к. при концентрации ImOOH выше 10 мкМ наблюдался незавершенный гемолиз. Наши данные указывают на то, wo незавершенный гемолиз обусловлен реакциями ImOOH с оксигемоглобкном (см. рис.3). Известно, что некоторые гидропсроксиды вызывают образование внутри- и межмолекулярных сшивок молекул гемоглобина [Giulivi et al 1994, Rice et al 1983]. Незавершённый лизис эритроцитов в нашем случае можно объяснить образованием большого количества ковалентных связей между молекулами гемоглобина, что ведёт к образованию плотных, повторяющих форму эритроцита, но меньших по размеру (по сравнению с интактными эритроцитами) агрегатов гемоглобина. По-видимому, эти агрегаты обладают примерно такими же светорассеивакгарши свойствами, как и эритроциты. Их образование проявляете* в форме кривых незавершенного гемолиза.

Нашими опытами показано, что императорин является эффективным сенсибилизатором фотогемолиза. Гемолиз всегда имел завершенный характер. На рис.5 представлена дозовая зависимость скорости императоринового фотогемолиза.

доза облучения, кДж/м2

Рис.5. Фотогемолиз, сенсибилнзировашшй нмлераторином.

5 мл суспензии эритроцитов (10 кл/мл) облучали при 22"С разными дозами УФ-А (1=500 Вт/м , 365 нм) в присутствии 20 мкМ нмператорина и 2 % этанола (кривая 1) или только 2% этанола (кривая 2). Гемолиз регистрировали при 37°С. Кривая 1 аппроксимировалась согласно уравнению (2). Более подробно участок дозовой зависимости в области до 250 кДж/м2 представлен на вставке.

Обычно дозовая зависимость скорости гемолиза описывается следующим уравнением:

V = Vo + aD" ()),

где D - доза облучения; V и V0 - скорость фотосенсибилизированного и темпового гемолиза, соответственно; а- коэффициент пропорциональности, х-показатель степени при дозе [Dubbelnwi et al. 1980, Cook et al. 1956]. С помощью метода наименьших квадратов мы вычислили показатель степени при дозе: х -1,53. При построении графика с использованием уравнения (I) выяснилось, что начальный участок дозовой зависимости плохо им аппроксимируется (а, = 0,0064) (нижняя кривая на вставке, рис.5), экспериментальные точки лежат достоверно выше кривой, построенной с использованием уравнения (I).

Известно, что скорость гемолиза, фотосенсибилизированного псораленом, производными гематопорфирина, а также ультрафиолетового гемолиза пропорциональна квадрату дозы, т. е., х = 2 в уравнении (!) [Potapenko et al. 1993, Dubbeltnan et al. 1980]. Гемолиз - процесс вероятностный, поэтому делается предположение, что для образования одного канала проницаемости в каждом эритроците, приводящего к лизису, необходимы два независимых фотохимических события [Pooler et al. 1986]. Наиболее вероятной мишенью фотогемолиза считается белок полосы 3 анионного канала эритроцита, состоящий из двух су&ьединиц. Предполагается, что анионный канал после фотохимической модификации каждой из двух субъединиц под действием двух квантов света превращается в канал, проницаемый для катионов, что и приводит к разрушению клетки [Pooler et al. 1986]. В случае императоринового фотогемолиза показатель степени при дозе значительно занижен (до 1,53), что могло быть связано либо с выцветанием сенсибилизатора в процессе облучения, либо с занижением его в результате наложения второго процесса, имеющего показатель степени при дозе облучения существенно меньше 2.

Мы предположили, что занижение показателя степени при дозе для императоринового фотогемолиза связано с участием императоринового гидропероксида. Известно, что этот фотопродукт образуется в ходе облучения императорша, а его концентрация прямо пропорционально зависит от дозы облучения сенсибилизатора [Adam et al. 1993, 1996]. Мы проверили эту гипотезу, аппроксимировав экспериментальные точки уравнением вида:

V = V„+aDl(2), Кривая 1 и верхняя кривая на вставке (рис.5) проведены согласно уравнению (2). Видно, что формула (2) описывает процесс значительно лучше, чем формула (!), так ст2 = 0,0029 (<т2 почти в 2 раза меньше 0|).

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что фотогемолнз, сенсибилизированный императорином, включает в себя два механизма. Первый связан с образованием гидропероксида императорина и его гемолитическим действием, а второй - с фотоповреждением белковых компонент мембраны эритроцита и образованием катонных каналоо проницаемости.

Исследование шшяния ФОП па рашчпие фазы иммунного ответа у мышей.

Известно, что продукты фотоокисления псоралена способны модулировать реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей -активировать при малых дозах облучения псоралена и супрессировать при больших дозах облучения псоралена [Кягова 1992, Ро1арепко е( а). 1994]. В настоящей работе исследовалось влияние ФОП на разные фазы Т-клеточного

доза облученн» псоралена, кДж/м 2

Рис.6. Влияние ФОП на различные фазы реакции ГЗТ к эритроцитам

барана у мышей.

К' - общий положительный контроль - 0,5 мл фосфатного буфера (1 % этанола) вводили мышам внутривенно за 24 часа или через 72 часа после первичной сенсибилизации;

1С - отрицательный контроль - '10* эритроцитов барана вводили мышам подкожно без первичной сенсибилизации;

кривая 1 - 0,5 мл ФОП (1=20,8 Вт/м2) вводили внутривенно мышам за 24 часа до первичной иммунизации;

кривая 2 - 0,5 мл ФОП вводили внутривенно мышам через 72 часа после первичной иммунизации.

ФОП увеличивал уровень реакции ГЗТ при дозе облучения псоралена 2,9 кДж/м2 (рис.6). Увеличение реакции ГЗТ не зависело от фазы иммунного ответа, на которой вводили ФОП. Различия между кривыми 1 и 2 при дозе облучения 2,9 кДж/м2 не достоверны (р>0.05). При введении псоралена, облученного в дозах 8,64 и 25,92 кДж/м2, наблюдалась супрессия реакции ГЗТ на обеих фазах иммунного ответа.

Таким образом, обнаружено, что продукты фотоокисления псоралена способны модулировать реакцию ГЗТ к ЭБ у мышей (усиливать и супрессировать) не зависимо от фазы иммунного ответа, на которой вводили

фотоокисленный сенсибилизатор. Увеличение реакции I3T в ответ на введение продуктов фотоокисления псоралена в низкой концентрации (нсорален облучали малыми дозами) может быть связано с активацией антигенпрезентирующих клеток (АПК) in vivo. Это утверждение основывается на факте активации макрофагов in vitro под действием псоралена, облученного малыми дозами УФА света [Kyagova et al. 1991]. При введении ФОП до сенсибилизации животного (за 24 часа) может происходить стойкое изменение функциональной активности АПК, которое влияет на процесс презентации антигена на стадии сенсибилизации. В случае, когда ФОП вводили на эффекторной стадии реакции ГЗТ (через 72 часа после первичной сенсибилизации), возможно, менялась активность АПК, участвующих в презентации АГ при вторичной сенсибилизации животного.

В дальнейших экспериментах была прояснена природа иммуносупрессии реакции ГЗТ, вызванной ФОП. На основании опытов по адоптивному переносу реакции ГЗТ был сделан вывод о клеточной природе супрессии данной реакции. В специальном опыте с использованием сыворотки с моноклональными антителами антнТ-клеточной направленности было показано, что супрессия реакции ГЗТ, индуцированная ФОП, имеет не Т-клеточную природу. Мы предположили, что данная иммуносупрессия может быть связана с активацией супрессорного потенциала антигенпрезентирующих клеток.

Модуляция реакции ГЗТ фотоокисленным яллоимператорнном и продуктами окисления аллоимператорина и императорина.

В литературе нет данных о действии аллоимператорина, фотопродуктов аллоимператорина и императорина на иммунную систему. В настоящей работе представлены результаты исследования нммуномодулирующих свойств облученного УФД-светом аллоимператорина и выделенных фотопродуктов аллоимператорина и императорина на модели ГЗТ к ЭБ у мышей. Показано, что внутривенная инъекция облученного разными дозами УФ-А-света аллоимператорина вызывала значительную супрессию реакции ГЗТ. Известно, что основным продуктом окисления аллоимператорина является гидропероксид [Abou-Elzahab et al. 1991, Adam et al. 1993]. Мы предположили, что он может образоваться в ходе УФА-облучения фурокумарина и вызвать супрессию реакции ГЗТ. Для проверки этого предположения животным вводили раствор химически синтезированного и выделенного гидропероксида аллоимператорина (рис.7). Оказалось, что гидропероксид аллоимператорина полностью супрессировал (почти до уровня отрицательного контроля) иммунологический ответ на второе введение АГ во всем использованном нами интервале концентраций гидропероксида (КГ'-Ю12 М). Аналогичные результаты были получены для императоринового гидропероксида. Супрессия реакции ГЗТ наблюдалась при любом способе введения фотопродуктов (внутривенном или оральном (per os)). Эги результаты указывают на системный характер иммуносупрессии, индуцнровашюй гидропероксидами фурокумаринов.

Рис.7. Влияние гидропероксида аллоимператорина на реакцию ГЗТ к ЭБ у мышеи.

В опытных группах 0,5 мл водного раствора гидропероксида аллоимператорина (1 % этанола) в указанных концентрациях вводили внутривенно мышам через 72 часа после первичной иммунизации.

Продукт дальнейшего фотолиза гидропероксида фурокумарина - алкоголь аллоимператорина, также как и гидропероксид водорода существенного влияния на реакцию ГЗТ не оказывали.

Таким образом, был сделан вывод о необходимости наличия гидропероксидной группы у императорина и аллоиператорина для индукции супрессии реакции ГЗТ.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что фотоокисленый псоралея и гидропероксид императорина индуцируют частично обратимые превращения метгемоглобина в гемихром и необратимое уменьшение концентрации окспгемоглобипа. Показано, что продукты фотолиза псоралена, вызывающие превращения гемоглобина,, кб Образуются в бескислородных условиях, стабильны при хранении и -нагревании, незначительно разрушаются восстановленным глутатионоМ, Почти .полиостью - каталазой (на 80%) и полностью разрушаются ионами двухвалентного железа и глутатион-пероксидазой. Кинетические кривые превращения метгемоглобина, индуцированиго ФОП, гидропероксидом императорина и гидропероксидом водорода сходны. Получетпле данные указывают на то, что главным ■ фотопродуктом псоралена, ответственным за превращения метгемоглобина, является гидропероксид водорода..

2. Гидропероксид императорина вызывает необратимое превращение оксигемоглобина в метгемоглобин и гемихром. Характерные изменения в спектре поглощения оксигемоглобнна в ходе инкубации его с гидропероксидом императорина позволили сделать предположение о том, что происходи! высвобождение железа из гемопротеина.

3. Изучено действие каталазы и глутатион пероксидазы на ФОП-гемолиз. Показано, что предварительная совместная инкубация фотоокисленного псоралена с этими ферментами не ингибировала ФОП-гемолиз. Видимо, гидропероксид водорода и продукты окисления псоралена пероксидной природы не принимают участия в индукции ФОП-гемолиза.

4. Установлено, что гидропероксид императорина способен вызывать гемолиз. Зависимость скорости гемолиза (V) от концентрации гемолизина ((.') имела вид: V' У о + dC/2, где V0 - скорость спонтанного гемолиза, d постоянная.

5. Обнаружено, что императорин обладает фотогемолитическим действием, гемолиз носит завершенный характер. Показано, что дозовая зависимость (/)) скорости (К) данного фотогемолиза имеет сложный характер и лучше всего

г

описывается уравнением вида: У = t u/> i hi) 1, где V0 - скорость темновою гемолиза, а н b - постоянные. При малых дозах облучения основной вклад п фотогемолиз вносит компонента ЫУ2, обусловленная, по-видимому, образованием тдропероксида императорина, тогда как при больших дозах облучения (более 200 кДж/м2) - компонента alf. Императориновый фотогеиолиз ингибируется почти на 50% антиоксидантами ионолом и трет-бутанолом.

6. Было исследовано влияния ФОП на разные фазы иммунного ответа у мышей. ФОП вводили животным внутривенно либо за 24 часа, либо через 72 часа после первичной сенсибилизации. Показано, что продукты фотоокисления псоралена модулировали (в зависимости от дозы облучения - активировали или супрессировали) реакцию гиперчу ветви гельности замедленного типа к эритроцитам барана у мышей независимо от фазы иммунного ответа, на которой вводили ФОП-продукты.

7. Установлено, что иммуносупрессирующнми свойствами обладают, помимо ФОП, фотоокисленный аллоимператорин, а также гидропероксиды императорина и аллоимператорина. В то время, как алкоголь аллоимператорина, гидропероксид водорода или фоголнзированный гидропероксид аллоимператорина не влияли на уровень реакции ГЗТ к эритроцитам барана у iJuuieft. Иммуносупрессия, индуцированная гидроперокендами фурокумаринов, наблюдалась при любом способе введения агентов: оральном {per ш) или внутривенном.

8. В опытах с адоптивным переносом реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа и обработкой спленоцитов донора моноклональными антителами Т-клеточной направленности показано, что супрессия иммунологического ответа обусловлена вызванным ФОП изменением активности клеток не Т-клеточной природы Предположена активация супрессорных механизмов у ашнгенпрезешнруюшич клеток селезенки мышей-;;оноров под действием ФОП и гндропероксида аллоимператорина.

СПИСОК РА Г, ОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лысенко Е.П., Андина ЕС., Мельникова В.О., Беличенко И.В., Потапенко А.Я. Возможный механизм модификаций оксигемоглобкна и метгемоглобина в присутствии фотоокисленных псораленов и производного гематопорфприна. I Всероссийская Конференция Фотобиологов. Тезисы докладов, с.82. (28-30 мая 1996, Пущяно, Россия). .

2. Потапенко А.Я., Кягова A.A., бездетная Л.Н., Андина Е.С., Лысенко Е.П. Фотоокнслительные реакции красителей в медицине и косметологии. Международная научно-практическая конференция "Биологически активные вещества и новые продукты в косметике". Тезисы докладов, с.56. (26-28 ноября 1996, Москва, Россия).

3. Yurikova N.A., Andina E.S., Neklyukova М.В., Kyagova A.A., and A.Ya. Potapenko. Inhibition of contact hypersensitivity reaction in mice induced by previously photooxidized psoralen. Первая международная интернетовская конференция по фотохимии и фотобиологии: http://www.netsci-iournal.com/97v3/yurikova/index.htm.

4. Melnikova V.O., Malakhov M.V., Andina E.S., Lysenko E.P., Belichenko I.V., Bezdetnaya L.N., Guillemin F. and Potapenko A. Ya.Temperature dependence of hemolysin production during psoralen photooxidation. Первая международная интернетовская конференция по фотохимии и фотобиологии: http://www.netsci-journal.com/97v3/melnikova/index.htm.

5. Potapenko A.Ya., Kyagova A.A., Andina E.S., Zhuravel N.N., Lysenko E.P., Möller M.M., Stopper W., Adam W., C.R. Saha-Möller. Membranotoxic effects photosensitized by psoralens.Abstracts of international symposium "Problems and Trends of Photobiochemistry" p.59. (2-29 May 1997, Moscow)

6. Lysenko E.P., Wunderlich S., Pliquett F., Andina E., Melnikova V., Belichenko* I., Potapenko A. Possible mechanism of hemoglobin conversion induced by photooxidized psoralen and hematoporphyrin derivatives. Deutsche Gesellschaft für Biophysik, p.135. (18-21 September 1996, Leipzig, Germany).

7. Andina E.S., Melnikova V.O., Belichenko I.V., Lysenko E.P., Wunderlich S., Pliquett F., Potapenko A. Ya. Methemoglobin conversion induced by previously photooxidized psoralens and hematoporphyrin derivative. 12л Internation Congress on Photobiology. Final Program Abstracts, P157, p.284. (1-6 September 1996, Viena, Austria).

8. A.Kyagova, E.S.Andina, N.Zhuravel, A.Ya.Potapenko, Möller M.M., Stopper W., Adam W., C.R. Saha-Möller. Effect of furocumarin hydroperoxides on erythrocyte memranes and delayed type hypersensitivity reaction. 12th Intematicm Congress on Photobiology. Final Program Abstracts, 034, p.205. (1-6 September 1996, Viena, Austria).

9. A.Kyagova, E.V.Nagurskaya, E.S.Andina, A.Ya.Potapenko. The alteration of effectors and induction of suppressors of delayed type hypersensitivity reaction under the treatment by preliminary photooxidized psoralen. 12ft Internation Congress on Photobiology. Final Program Abstracts, P60, p.259. (1-6 September 1996, Viena, Austria).

10. M.V.Malakhov, E.P.Lysenko, E.S.Andina, L.A.Kozyr and A.Ya.Potapenko. Modification of methemoglobin by previously photoxidized psoralen and other dyes. 6th Congress of the European Society for Photobiology, Book of Abstracts Vlll-Ip/06, p.96. (3-8 September 1995, Cambridge, UK).

11. A.Kyagova, E.S.Andina, A.Ya.Potapenko, Môller M.M., Stopper VV., Adam W., C.R. Salia-Môller. Suppression of delayed type hypersensilyvity reaction by psoralen hydroperoxides in mice. 7A Congress of the European Society for Photobiology, Abstracts, P86, p. 116 (8-13 September 1997, Stresa, Italy).

12. A.Ya.Potapenko, A.Kyagova, E.S.Andina, N.Zhuravel, E.P.Lysenko, Mciller M.M., Stopper W., Adam W., C.R. Saha-MOller. Dark and photohemolysis induced by imperatorin and it's oxyfunctionalyzed products. 7th Congress of the European Society for Photobiology, Abstracts, 0113, p.83 (8-13 September 1997, Stresa, Italy).