Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и механизмы их иммуносупрессорного действия

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена и механизмы их иммуносупрессорного действия"

На правах рукописи

ПЯТНИЦКИЙ ИЛЬЯ АЛЕКСЕЕВИЧ

ФОТОИНДУЦИРОВАННАЯ АГРЕГАЦИЯ ПРОДУКТОВ ФОТООКИСЛЕНИЯ ПСОРАЛЕНА И МЕХАНИЗМЫ ИХ ИММУНОСУПРЕССОРНОГО ДЕЙСТВИЯ

03.01.02-Биофизика 14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005557528

Москва-2014

005557528

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Кягова Алла Анатольевна Официальные оппоненты:

Тутельян Алексей Викторович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора Мареев Глеб Олегович — доктор медицинских наук, доцент кафедры оториноларингологии ГБОУ ВПО «Саратовский Государственный Медицинский Университет им. В.И. Разумовского»

Ведущая организация Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

диссертационного совета Д212.243.05 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке СГУ имени В.А. Артисевич и на сайте ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского», www.sgu.ru

Защита состоится

года в

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физико-математических наук Дербов Владимир Леонардович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Псоралены - вещества растительного или синтетического происхождения, которые используют для фотохимиотерапии дерматозов. Существует два метода терапии с использованием псораленов и УФ-А (320-400 нм) облучения светом: ПУВА-терапия (псорален+УФА) и фотоферез [Voss С., 2010]. При ПУВА-терапии УФА-светом облучают кожу пациента, предварительно получившего препарат псораленов. При фотоферезе облучению в присутствии псораленов подвергается лейкоцитарная фракция крови пациентов. Наряду с терапевтическим действием, ПУВА-терапия вызывает побочные токсические эффекты, такие как, например, гиперпигментация и эритема [Voss С., 2010]. Несмотря на побочные эффекты, оба вида терапии давно успешно используются в клинической практике для лечения патологий, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета, например, витилиго, псориаза, аллергического контактного дерматита и др. [Bulat V., 2011].

При УФА-облучении тканей пациентов в присутствии псораленов (ПУВА-воздействие) происходит фотолиз фотосенсибилизатора с образованием продуктов его фотоокисления (ФОП) [Caffieri S., 2002]. В нашей лаборатории ранее было выявлено, что существуют стабильные продукты ФОП, которые, при введении их в биологические объекты, инициируют фотобиологические эффекты сходные с таковыми при ПУВА-воздействии. А именно, ФОП-продукты обладали как мембранотоксическим (индуцировали гемолиз эритроцитов), так и иммуномодулирующим действием [Potapenko А., 1994]. Эти данные указывали на то, что продукты ФОП могут вносить вклад как в терапевтические, так и в побочные токсические эффекты ПУВА-терапии и фотофереза.

Известно, что облучение эритроцитов в присутствии псоралена приводит к индукции гемолиза (ПУФА-гемолизу), механизм которого зависит от интенсивности УФА-излучения [Потапенко А., 2004]. При низкой интенсивности ПУФА-гемолиз схож с коллоидно-осмотическим гемолизом, тогда как при высокой интенсивности механизм становится иным. Предполагается, что основной вклад в развитие высокоинтенсивного ПУФА-гемолиза могут вносить продукты ФОП [Kyagova А., 1997]. Присутствуют косвенные данные, что повреждение мембран эритроцитов происходит при действии агрегатов ФОП [Belichenko V., 1995]. Однако, зарегистрировать такие агрегаты ФОП авторам не

удалось. На сегодня одним из методов, позволяющих с высокой чувствительностью выявлять агрегаты красителей, является метод резонансного светорассеяния (PCP) [Pasternak R., 1995]. В этой связи, изучение фотоиндуцированной агрегации продуктов фотоокисления псоралена методом PCP является актуальным.

Предполагается, что терапевтическое действие ПУВА-терапии или фотофереза основано на индукции специфической иммуносупрессии. Эти данные были получены преимущественно в моделях Т-клеточного иммунного ответа in vivo (реакции гиперчувствительности замедленного типа - ГЗТ, и контактной гиперчувствительности - КЧ) [Saint-Mezard Р., 2004]. В нашей лаборатории впервые было продемонстрировано, что продукты ФОП способны модулировать (активировать/супрессировать) Т-клеточный иммунный ответ in vivo [Kyagova А., 2002]. Это указывало на то, что ФОП-продукты могут вносить вклад в терапевтическое действие псораленовой фотохимиотерапии. Более того, предварительные данные показывают, что ФОП-продукты могут быть эффективны при лечении атопической экземы и псориаза [Потапенко А., 2011].

На сегодня, иммунотропные механизмы супрессорного, и, как следствие, терапевтического действия ФОП-продуктов остаются не ясными. В этой связи изучение действия ФОП-продуктов на различные этапы развития Т-клеточного иммунного ответа in vivo и in vitro является актуальным. Полученные результаты могут, во-первых, позволить приблизиться к пониманию иммуносупрессорного действия ФОП. Во-вторых, дать предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии - ФОП-терапии на основе продуктов фотоокисления псораленов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучить агрегацию продуктов фотоокисления псоралена и иммунологические механизмы их супрессорного действия.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать возможность обнаружения агрегации фотопродуктов псоралена методом резонансного светорассеяния, исследовать ее кинетику при разных концентрациях и интенсивностях облучения.

2. Оценить образование фотоиндуцированных агрегатов в растворах псоралена, облученных в присутствии или в отсутствие кислорода, с параллельным тестированием их гемолитической активности.

3. Исследовать динамику накопления в лимфоузлах животных ДНФБ-специфических лимфоцитов, их цитокиновый профиль и пролиферативную активность при действии ФОП in vivo.

4. Оценить проапоптотическую активность ФОП in vivo и in vitro, сопоставить дозовые зависимости для ФОП-индуцированного апоптоза in vitro и ФОП-агрегации.

5. В опытах по адоптивному переносу выявить клеточные популяции, ответственные за иммуносупрессорное действие ФОП в реакции КЧ.

Научная новизна работы

В данной работе впервые показано, что облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления. Кроме того, продемонстрировано, что величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена. Впервые установлены схожие закономерности между степенью агрегации ФОП и его гемолитической активностью. Указанные данные позволили предположить, что мембранотоксические эффекты ФОП могут быть следствием действия его агрегатов. Впервые установлено, что иммуносупрессорное действие ФОП является следствием угнетения пролиферативной активности лимфоцитов in vivo и in vitro, которое реализуется путем модуляции цитокинового профиля последних. Методом проточной цитофлуориметрии исследована проапоптотическая активность ФОП-продуктов in vivo и in vitro. Впервые показано, что индуцируемый ФОП-продуктами апоптоз лимфоцитов не может играть ведущую роль в иммуносупрессорных эффектах ФОП.

Практическая значимость

Совокупность полученных результатов работы показывают, что продукты ФОП обладают иммунорегуляторными свойствами, и механизмы их иммуносупрессорного действия в некоторых чертах сходны с таковыми для традиционной псораленовой фотохимиотерапии (ПУВА-терапии и фотофереза). Выявленные механизмы иммуносупрессорного действия продуктов ФОП дают предпосылки для разработки нового способа псораленовой фотохимиотерапии (ФОП-терапии) для лечения заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунной системы. Преимущество ФОП-терапии перед ПУВА-терапией/фотоферезом заключается в отсутствии необходимости УФА-

воздействия на ткани пациента, что позволит исключить развитие различных побочных эффектов, например, эритемы или преждевременного старения кожи.

Положения, выносимые на защиту

1. Облучение раствора псоралена приводит к агрегации продуктов его фотоокисления; величина агрегации пропорциональна концентрации и интенсивности действующего света при облучении раствора псоралена.

2. Исследования агрегации продуктов фотоокисления псоралена методом PCP позволяют установить схожие закономерности между степенью агрегации ФОП-продуктов и их гемолитической активностью.

3. Иммуносупрессорное действие продуктов ФОП на реакцию КЧ обусловлено модуляцией цитокинового профиля АГ-специфических Т-лимфоцитов и угнетением их пролиферативной активности.

4. Проапоптотическая активность ФОП-продуктов, по-видимому, не играет ведущей роли в проявлении иммуносупрессорных свойств последних.

Внедрения результатов исследования. Результаты диссертации внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии, а также в работу отдела медицинской и химической токсикологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Разработанные в диссертации модели и методы внедрены в научно-исследовательскую деятельность Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на конгрессе Европейского общества дерматологических исследований в Будапеште, Венгрия (2009 г.) и Барселоне, Испания (2011 г.), Европейских фотобиологических конгрессах во Вроцлаве, Польша (2009 г.), Женеве, Швейцария (2011 г.), и Льеже, Бельгия (2013 г.), Съезде Российского фотобиологического общества в Шепси, РФ (2011 г.), 4-м Съезде биофизиков России в Нижнем Новгороде (2012 г.). Работа апробирована на совместном заседании кафедры физики и математики, кафедры фармакологии и кафедры иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 23 сентября 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы в журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки; 11 тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций.

Личное участие автора в получении научных результатов Пятницкий И.А. проделал значительный экспериментальный и аналитический объем работы. Диссертантом были освоены методы измерения резонансного рассеяния света, цитофлуорометрического анализа, иммуномагнитной сепарации, а также флуоресцентные и спектрофотометрические методы. Автором также проведен статистический анализ результатов.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 138 страницах, содержит 58 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, насчитывающего 92 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные

В экспериментах были использованы мыши линий СВА (самцы весом 18-20 г, возраст 8-10 недель), содержащиеся на стандартном пищевом рационе вивария при свободном доступе к воде и пище. Забор селезенок и лимфатических узлов (ЛУ) у подопытных животных проводили под глубоким эфирным наркозом. Протокол исследования на животных был одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова.

Приготовление ФОП

Фотоокисленный псорален (ФОП) получали путем облучения растворов псоралена (Институт химии растительных веществ, Узбекистан, Ташкент) в фосфатно-буферном растворе УФА-светом (365 нм). Источником УФА-света в опытах по изучению фотоиндуцированной агрегации фотопродуктов псоралена служил УФ-испускающий светодиод ОТЬН-0480-4У (ДХ=14,5 нм, США), а в опытах на животных - УФ-лампа «В1аски§Ы» (Оэгат, Германия).

Изучение агрегатного состояния и фотолиза псоралена оптическими методами

Спектры поглощения растворов регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV-1601» (Япония). Регистрацию спектров флуоресценции, возбуждения флуоресценции и резонансного светорассеяния осуществляли на спектрофлуориметре «Shimadzu RF-1501». Регистрацию спектров PCP осуществляли под углом 90° с использованием синхронного режима сканирования настроенных на одну и ту же длину волны монохроматоров спектрофлуориметра.

Постановка ФОП-гемолиза

Растворы ФОП смешивали с суспензией эритроцитов (107 кл/мл) в объемном соотношении 1:1 при непрерывном перемешивании. После инкубации (37°С) растворов, гемолиз эритроцитов регистрировали на спектрофотометре «Shimadzu UV-1601 PC» (Япония) по изменению оптической плотности суспензии эритроцитов при X = 670 нм.

Реакция контактной чувствительности у мышей

Постановку реакции КЧ проводили согласно работе [Maeda A. et al., 2008] с незначительными модификациями. Мышей сенсибилизировали путем аппликации на выбритую за сутки до опыта кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Через 6 суток после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили 5 мкл 0,2% раствора ДНФБ в ацетоне (разрешение реакции). На внутреннюю поверхность другого уха в качестве контроля наносили 5 мкл ацетона. Через 24 часа после аппликации гаптена у мышей оценивали интенсивность реакции КЧ (отек уха) по разности толщины опытного и контрольного ушей. В опытных группах мышам на разные сроки после сенсибилизации ДНФБ вводили (per os или в/в) по 0,5 мл ФОП или необлученного раствора псоралена. В группе положительного контроля (К+) сенсибилизированным ДНФБ мышам вместо облученного псоралена вводили в/в или per os по 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. В качестве отрицательного контроля (К") служила группа интактных (несенсибилизированных ДНФБ) мышей, получивших аппликацию разрешающей дозы ДНФБ. Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле: % супрессии = (1 - (Е - К )/(К* - КГ))хЮ0%,

где Е, К+, К' - средние значения отека joca у мышей в опытной группе, группе положительного и отрицательного контроля соответственно. В экспериментах по адоптивному переносу наряду с ДНФБ использовали другой гаптен - оксазолон. Для сенсибилизации животных на кожу брюшка наносили 50 мкл 2% раствора оксазолона в ацетоне, для тест-аппликации на ухо мышам наносили 5 мкл 0,4% раствора оксазолона в ацетоне. Остальные условия проведения реакции КЧ были аналогичны КЧ к ДНФБ.

Приготовление суспензий клеток лимфоузлов и селезенок

Паховые ЛУ или селезенки мышей гомогенизировали в стеклянных гомогенизаторах, стромальные элементы органов фильтровали капроновым фильтром. После двойного центрифугирования удаляли надосадок, полученный осадок ресуспендировали в неполной среде. После лизирования эритроцитов 3% уксусной кислотой подсчет клеток проводили в камере Горяева.

Оценка пролиферативной активности лимфоцитов

Исследование пролиферации клеток ЛУ, полученных от ДНФБ-сенсибилизированных мышей, проводили радиоизотопным методом, оценивая включение 3Н-тимидина в ДНК делящихся клеток. Результаты выражали в количестве импульсов в минуту.

Оценка уровня секреторных цитокинов

Клетки ЛУ выделяли на четвертый день после двукратной (с интервалом 24 ч) сенсибилизации мышей ДНФБ. Выделенные лимфоциты культивировали 24 и 48 ч в полной среде RPMI-1640 при 37°С и 5% С02 в присутствии 15 мкг/мл КонА. Концентрации цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИФН-у, ГМ-КСФ, ФНО-а) определяли цитофлуориметрическим методом, используя набор реактивов Mouse Thl/Th2 FlowCytomix Multiplex и программное обеспечение FlowCytomix Pro (Bender MedSystems, Австрия).

Оценка апоптоза при действии ФОП in vivo и in vitro

Исследование апоптоза клеток ЛУ мышей при действии ФОП in vivo проводили методом цитофлуориметрического определения количества ДНК с использованием йодистого пропидия. Исследование апоптоза клеток ЛУ мышей при действии ФОП in vitro проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя Annexin V-FITC/PI-PE Apoptosis Detection Kit (Beckman Coulter, США).

Иммуномагнитная сепарация

Для получения отдельных популяций спленоцитов использовали методы негативной и позитивной клеточной селекции. Для сепарации CD3+ клеток использовали реактив Dynabeads Mouse pan Т (Thyl.2), сепарации В-клеток -Dynabeads Mouse pan В , а для сепарации CD3+, CD4+ и CD8+ - Dynal Mouse Negative Isolation Kit (Invitrogen Dynal AS, Норвегия). Контроль чистоты популяции осуществляли методом проточной цитометрии с использованием флюорохром-меченых моноклональных антител (aHra-CD3+, -CD4+, -CD8+ и анти-45R) к поверхностным маркерам лимфоцитов мышей (Invitrogen, США).

Статистический анализ

Рассчитывали средние значения определяемых величин и стандартную ошибку SEM= s/r

среднего: / V«, где s - выборочное среднее квадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

АГРЕГАЦИЯ ПРОДУКТОВ ФОТООКИСЛЕНИЯ ПСОРАЛЕНА

Фотоиндуцированная агрегация псоралена, спектры PCP

Ранее, при исследовании гемолиза эритроцитов под действием фотоокисленного псоралена, была высказана гипотеза, что повреждение мембран происходит при участии агрегатов его фотопродуктов [Belichenko V., 1995]. Однако регистрация таких агрегатов не была методически возможна. В настоящее время существует физический метод, позволяющий с высокой чувствительностью обнаруживать агрегаты красителей - метод PCP. Исходя из этого, в данной работе были впервые проведены измерения спектров PCP необлученных и УФА-облученных растворов псоралена, что позволило впервые обнаружить явление агрегации продуктов ФОП (рис.1). На рисунке 1 видно, что после облучения псоралена появляется широкая и очень интенсивная полоса сигнала PCP продуктов его фотоокисления. Также видно, что сам по себе необлученный псорален тоже способен к незначительной агрегации, что доказывает наличие небольшого экстремума в спектре PCP псоралена около 300 нм.

250 300 350 400 450 500

длины волн, нм

Рисунок 1. Спектры поглощения (немаркированные кривые) и PCP (маркированные кривые) необлученного псоралена (пунктирные кривые) и ФОП (сплошные кривые). Доза облучения 35 кДж/м2, интенсивность 270 Вт/м2, концентрация псоралена0,1 мМ.

Стабильность фотоиндуцированных агрегатов псоралена во времени

В настоящей работе обнаружено, что агрегаты ФОП нестабильны во времени. Данный факт отображен на рисунке 2А сплошной кривой. Пунктирной кривой обозначен сигнал PCP раствора фотоокисленного псоралена, разведенного в два раза фосфатным буфером. Обе кривые нормированы к начальному сигналу неразведенного ФОП.

Время хранения, минуты Время хранения, минуты

Рисунок 2. А) Зависимость сигналов PCP ФОП (10"4 М, 270 Вт/м2, 67,5 кДж/м2) при 290 нм от времени хранения. Верхняя кривая - неразведенный образец, нижняя - разведенный в два раза фосфатно-буферным раствором (ФБР). Обе кривые нормированы к начальной интенсивности сигнала PCP. Б) Зависимость гемолитического эффекта ФОП от времени его хранения (согласно данным Potapenko et. al, 1991).

Видно, что скорость распада агрегатов с разведением увеличивается по сравнению с неразведенным раствором ФОП (рис. 2А). Необходимо отметить, что при проведении ФОП-гемолиза суспензии эритроцитов также разбавляли вдвое раствором ФОП. Сравнивая пунктирную кривую на рисунке 2А и кривую на рисунке 2Б, видно, что как эффективность гемолиза, так и сигнал PCP, т.е. количество и объем агрегатов, уменьшаются с течением времени приблизительно по одному закону.

Исследование спектров PCP ФОП при облучении псоралена в бескислородной среде и в присутствии кислорода

Известно, что образование продуктов ФОП, а значит и ФОП-гемолиз, может иметь место только при облучении псоралена в присутствии кислорода [Potapenko А., 1991]. В этой связи было изучено влияние кислорода при облучении раствора псоралена на сигнал PCP. Для этого раствор псоралена облучали как на воздухе, так и пропуская через него инертный газ аргон, который вытеснял кислород во время облучения.

Рисунок 3. Зависимость сигнала PCP от времени облучения в кислород-содержащей (02) и бескислородной среде (-02); представлена кинетика сигнала PCP в зависимости от времени облучения для длин волн 300, 350 и 450 нм. Раствор псоралена (0,1 мМ в ФБР) облучали УФА-излучеиием (365 нм, интенсивность - 840 Вт/м2). Результаты трех независимых экспериментов.

На рисунке 3 представлены зависимости интенсивности сигнала PCP от времени облучения псоралена в присутствии и отсутствии кислорода. Видно, что сигнал PCP в отсутствии кислорода при облучении (-02) превышает таковой в его присутствии (02). Это может говорить о том, что в отсутствии кислорода образуются другие, возможно, большие по размеру и количеству агрегаты

продуктов фотоокисления псоралена, однако они не являются ФОП-гемолизинами.

ИЗУЧЕНИЕ ИММУННЫХ МЕХАНИЗМОВ ОГРАНИЧЕНИЯ РЕАКЦИИ КЧ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФОП

Супрессорное действие ФОП на разные фазы развития реакции КЧ

Известно, что продукты ФОП обладают двумя типами эффектов -иммуносупрессивными и мембранотоксическими [Potapenko А, 1994], механизмы которых не ясны. В этой связи в настоящем разделе были изучены механизмы иммуносупрессорного действия ФОП-продуктов на реакцию КЧ у мышей -модели аллергического контактного дерматита. Реакция КЧ развивается в две фазы - сенсибилизации (афферентная) и разрешения (эффекторная) [Honda Т., 2013].

Ранее в нашей лаборатории было показано, что ФОП способен угнетать эффекторную фазу развития реакции КЧ, однако его действие на афферентную фазу изучено не было. В этой связи, было изучено действие ФОП на афферентную стадию реакции КЧ. На рисунке 6А видно, что ФОП вызывает супрессию КЧ при его введении мышам через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ. Однако, введение ФОП за 24 часа до аппликации гаптена (рис. 6Б) не приводило к супрессии КЧ. Таким образом было показано, что, как эффекторная (120 ч), так и афферентная (24 ч) фазы реакции КЧ чувствительны к супрессорному действию ФОП. Согласно данным литературы [Schmitt S., 2009], можно предположить, что супрессия КЧ при введении ФОП через 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ могла быть следствием влияния данного агента на способность АГ-презентирующих клеток (АПК) представлять антиген наивным Т-лимфоцитам в регионарных ЛУ, а также на пролиферацию и созревание специфических Т-лимфоцитов. Отсутствие действия ФОП на реакцию КЧ при введении его за 24 ч до сенсибилизации (рис. 6Б, -24 ч) могло быть следствием нескольких причин. Известно, что при приеме пациентом препаратов псораленов в ходе проведения ПУВА-терапии они выводятся из организма пациента в течение суток [Worel N., 2012]. В этой связи можно предположить, что ФОП мог бьгть выведен из организма к моменту аппликации ДНФБ. Во-вторых, отсутствие действия ФОП при введении его мышам за 24 ч до сенсибилизации, могло свидетельствовать о том, что интактные иммунные клетки не были чувствительны к действию ФОП,

или данный агент не влиял на процессы захвата антигена АПК кожи и последующую их миграцию в регионарные ЛУ.

0,25

0,20

1 0.15 <в

| 0,10 о

0,05 0,00

Jh

Г~1 Псорален Ш ФОП

к- к+

Рисунок 6. А) ФОП вызывает супрессию реакции КЧ как на афферентной, так и на эффекторной стадиях ее развития. Необлученный псорален или ФОП вводили по 0,5 мл перорально через 24 или 120 часов после сенсибилизации мышей ДНФБ. К+ (положительный контроль КЧ): сенсибилизированные ДНФБ мыши, получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. К" (отрицательный контроль КЧ): интактные мыши, получившие аппликацию ДНФБ на ухо. Данные 5 независимых экспериментов ± SEM. *р<0,02 по сравнению с К+; #р<0,05 по сравнению с К+. Б) Введение ФОП за 24 часа до инициации реакции КЧ не вызывает ее супрессию. *р<0,03 по сравнению с К+.

Влияние ФОП на динамику накопления и пролиферацию клеток лимфоузлов ДНФБ-сенсибилизированных мышей

Известно, что на афферентной фазе реакции КЧ происходит пролиферация, созревание и накопление пула АГ-специфических Т-лимфоцитов в ответ на накожную аппликацию гаптена [Honda Т., 2013]. Так как ФОП супрессировал реакцию КЧ на её афферентной стадии (рис. 6А и 6Б), это указывало на возможность угнетения пролиферации АГ-специфических лимфоцитов под действием ФОП. В этой связи было изучено влияние ФОП на динамику накопления клеток в регионарных ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. На рисунке 7 А видно, что введение ФОП мышам приводит к уменьшению количества клеток ЛУ (пунктирная кривая) по сравнению с контролем (сплошная кривая). Это указывает на то, что ФОП in vivo мог приводить к угнетению пролиферации АГ-специфических Т-лимфоцитов [Honda Т., 2013]. На рисунке 7Б, видно, что введение ФОП ДНФБ-сенсибилизированным мышам приводит к снижению пролиферативной активности клеток ЛУ.

Время после ееисибкпизац«*. ч

Рисунок 7. А) Влияние ФОП на динамику изменения in vivo абсолютного числа клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. В течение 7 дней после сенсибилизации мышей ДНФБ выделяли паховые ЛУ животных и подсчитывали абсолютное количество клеток на лимфоузел. Мышам вводили перорально по 0,5 мл ФОП (0,1 мМ, 25 Вт/м ; 22,5 кДж/м ) через 24 после сенсибилизации. Сплошная кривая: сенсибилизированные ДНФБ мыши (К+). Пунктирная кривая: мыши, получившие ФОП. К" (отрицательный контроль): интактные мыши. Данные 3-х независимых экспериментов + SEM. Б) Пролиферативная активность клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей при введении им ФОП или необлученного псоралена внутривенно (заштрихованные столбцы) или перорально (сплошные столбцы). Псорален - мыши, получившие внутривенно или перорально необлученный псорален. ФОП или псорален вводили на 2-е и 3-е сутки после двукратной сенсибилизации (1-е и 2-е сутки) мышей ДНФБ. *р < 0,03 и #р < 0,05 по сравнению с К+.

Таким образом, снижение количества клеток в ЛУ при действии ФОП in vivo могло быть следствием угнетения пролиферации АГ-специфических Т-лимфоцитов, как это описано для ПУВА-воздействия [Maeda А., 2008].

Изменение цитокинового профиля клеток лимфоузлов КЧ под действием ФОП in vivo

Известно, что супрессорное действие многих агентов на реакцию КЧ, включая ПУВА-воздействие, может быть следствием регуляции цитокинового профиля иммунокомпетентных клеток, принимающих участие в развитии КЧ [Bladon J., 2006]. Поэтому было изучено влияние ФОП in vivo на продукцию секреторных цитокинов клетками ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. На рисунке 8 видно, что введение ФОП мышам приводит к снижению продукции провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ2, ИЛ-4 и ИФН-у. Согласно данным литературы [Christensen А., 2012] ИЛ-2 ответственен за стимуляцию пролиферации иммунокомпетентных Т-клеток в реакции КЧ. По-видимому,

антипролиферативная активность ФОГТ на афферентной фазе КЧ обусловлена угнетением продукции ИЛ-2 Т-лимфоцитами.

i 25 ¡ 20 N

® 1S «

s

I 10

I S

z

О

" о

• и 11-2 rh * rto Hh

1 # нн

1 1

1 1

rfi

гЬ

10

- 6 i

г 4

-Ь 1 (+1

1

1 1

I 1

^100 I 80

вГ

х

I «I

| | Псорален

5 20

S О ж

О

| | «ЮЛ

1

rh

с 500 2

g 400

N о

".300

с

£

§100

ИФН-т

1 * 1+1

1 É # rí]

I

I |к+

Рисунок 8. Уровень секреторных цитокинов клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Мыши были дважды сенсибилизированы ДНФБ на первые и вторые сутки. ФОГТ или необлученный псорален вводили мышам в/в (заштрихованные столбцы) или перорально (сплошные столбцы) на вторые (48 ч) и третьи (72 ч) сутки с момента первичной сенсибилизации. *р < 0,05 и ftp < 0,03 по сравнению с К+.

На рисунке 8 также видно, что введение ФОП мышам приводит к парадоксальному росту провоспалительного цитокина ИЛ-17. Данный факт можно объяснить [Gaffen S., 2011] возможным переключением типа иммунного ответа с Thl на Thl7 под действием ФОП.

Индукция апоптоза клеток ЛУ продуктами фотоокисления псоралена in vitro

Выявленное в настоящей работе снижение количества клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей под действием ФОП (рис. 7А) могло быть следствием индукции апоптоза лимфоцитов, принимающих участие в развитии реакции КЧ.

При выполнении настоящей работы зарегистрировать индукцию апоптоза клеток ЛУ мышей под действием ФОП in vivo не удалось. Однако на рисунке 9А и 9Б видно, что ФОП in vitro в концентрациях 10"5М и 5х10"5М через 18 ч культивации вызывал увеличение процента апоптотических клеток ЛУ, выделенных как у

интактных животных (на 14% и 31% соответственно, по сравнению с К-), так и полученных спустя 24 ч после сенсибилизации мышей ДНФБ (на 2,5% и 15% соответственно, по сравнению с К+). Кроме того, обнаружено, что добавление ФОП in vitro в тех же концентрациях (10'5 М и 5х10"5 М) к суспензии клеток ЛУ, полученных спустя 72 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ, достоверно увеличивало процент апоптотических клеток на 8% и 15% соответственно, после 18 часов культивации по сравнению с положительным контролем.

70

60

8 50 о

с 40 о

¡5 30 ^ 20 10 0

□ PI+

i ОАП+Р1+ : ¡ CJAn+

40 35 S30 2 25

с 20 га

^ 15

О4

10 5 0

OPi*

OAn+P¡+

QAn+

К-

Пс

106

10*

5* 10 5

к+

ПС

ФОП

10* 10й 5x104, ФОП

Рисунок 9. Влияние ФОП in vitro на процент апоптотических клеток ЛУ интактных (А) и ДНФБ сенсибилизированных мышей (Б). Клетки ЛУ интактных мышей (А) или клетки, выделенные спустя 24 часа после сенсибилизации мышей ДНФБ (Б), инкубировали в присутствии ФОП или необлученного псоралена (Пс) в течение 18 часов. Затем

?егистрировали апоптоз. Конечные концентрации по псоралену в пробах составляли 10 , 10' или 5х10"5 М. К-: клетки ЛУ интактных мышей. К+: клетки ЛУ ДНФБ сенсибилизированных мышей. Ап+ - ранний апоптоз, Ап+РГ - поздний апоптоз, РГ - некроз. *р<0,05 и #р < 0,03 по сравнению с К-.

Согласно данным литературы [Honda Т., 2013], во время пролиферации клеток, принимающих участие в реакции КЧ, происходит увеличение синтеза ИЛ-2, который обладает антиапоптогенными свойствами. Данный факт, может служить объяснением тому, что интактные клетки были более чувствительны к апоптогенному действию ФОП (рисунок 9А), нежели пролиферирующие клетки, полученные от сенсибилизированных животных. Кроме того, известно, что спустя 24 часа после сенсибилизации в ЛУ происходит представление АГ АПК наивным Т-лимфоцитам, и начало пролиферации Т-клеток [Honda Т., 2013]. Время в 72 часа после нанесения гаптена на кожу животного, соответствует пику пролиферации и накопления Т-клеток в ЛУ. Таким образом, очевидно, что в регионарных ЛУ сенсибилизированных животных через 24 и 72 часа находились разные

субпопуляции клеток, принимающих участие в развитии КЧ. При этом, процент апоптозирующих клеток ЛУ сенсибилизированных мышей под действием ФОП достоверно не отличался между собой в зависимости от времени выделения клеток (спустя 24 или 72 часа). С учетом изложенного, можно заключить, что выявленное в настоящей работе снижение количества клеток ЛУ ДНФБ-сенсибилизированных мышей под действием ФОП (рисунок 7А) не могло быть следствием индукции апоптоза АГ-специфических лимфоцитов, принимающих участие в развитии реакции КЧ.

Образование агрегатов продуктов ФОП при дозах, вызывающих апоптоз клеток ЛУ мышей

При облучении раствора псоралена образуется множество продуктов его фотоокисления [СаШеп 8, 2002]. Окончательно не ясно, какие из них обладают апоптотическими свойствами. В настоящей работе было показано, что продукты ФОП способны к агрегации (рис. 1). В этой связи была изучена взаимосвязь между агрегацией продуктов ФОП и их способностью индуцировать апоптоз, т.е. влияние агрегации продуктов ФОП на проявление их апоптотических свойств.

А

1,2

S 0.9

а." о а.

0,6

..............................'•»■■■■■ ' 10 г . I ,,,<,,. I .,.!,. .

О 2 4 6 8 10 12 14 и о 2 4 6 8 10 12 14 18

Доза облучения, кДж/м2 Доза облучения, кДж/м2

Рисунок 10 А) Зависимости величин сигнала PCP раствора ФОП измеренного при 290 нм от доз облучения при двух интенсивностях - 40 и 190 Вт/м2. Б) Влияние интенсивности действующего УФА-света на образование проапоптогенных продуктов

ФОП. Раствор псоралена (0,1 мМ, 1% этанола) облучали при одинаковых дозах, но разных интенсивностях (40 Вт/м2 и 190 Вт/м2). Дозы облучения составляли: 0 кДж/м2 (необлученный псорален), 5,8 кДж/м2, 8,8 кДж/м2, 11,7 кДж/м2 и 14,7 кДж/м2. Регистрировали сигнал PCP этих растворов при 290 нм (А). Далее 1 мл раствора ФОП добавляли in vitro к 1 мл клеточной суспензии, содержащей ЗхЮ6 клеток. Спустя 18 часов культивации оценивали апоптоз цитофлюориметрическим методом используя An/Pi-окрашивание (Б). Каждая точка на кривых представляет собой среднее значение ± SEM, полученное на группе из 3-х животных.

40 Вт/м2 190 Вт/м2

Л

ж

Б /и

60

50

я

о

о 40

»

30

20

18 ч культивации

Растворы псоралена облучали при одинаковых дозах и двух интенсивностях -низкой (40 Вт/кг) и высокой (190 Вт/м2). Полученные растворы были использованы для индукции апоптоза клеток ЛУ интактных животных. Параллельно, проводили регистрацию агрегации таких растворов путем измерения их спектров PCP.

На рисунке 10А представлены дозовые зависимости величины сигнала PCP растворов ФОП при двух интенсивностях - 40 и 190 Вт/м2. На рисунке 10Б -дозовые кривые зависимости величины апоптотического эффекта растворов ФОП при тех же интенсивностях. Сравнивая рисунки 10А и 10Б видно, что дозовые кривые для агрегации и апоптоза имеют сходный характер, при этом как образование ФОП-агрегатов, так и продуктов ФОП, индуцирующих апоптоз, возрастает с увеличением интенсивности действующего света.

Известно, что продукты ФОП, обладающие иммуносупрессорным действием, в том числе и на реакцию КЧ, в основном образуются при малых интенсивностях действующего света (например, при 40 Вт/м2), тогда как ФОП-гемолизины - при высоких (более 150 Вт/м2) [Kyagova А., 1997]. На рисунке 10Б видно, что увеличение интенсивности света приводит к увеличению проапоптогенного эффекта ФОП. Анализируя результаты, приведенные на рисунках 10А и 10Б, и сопоставляя их с данными литературы можно предположить, что, по-видимому: 1) проапоптотическая активность продуктов ФОП определяется интенсивностью действующего света при их получении; 2) проапоптогенное действие ФОП вряд ли может считаться главным механизмом иммуносупрессорного действия данного агента, особенно в условиях высокоинтенсивного облучения.

Выявление популяции клеток, ответственных за супрессорное действие ФОП

Известно, что введение ФОП сенсибилизированным мышам приводит к появлению в организме животных клеток, обладающих специфическими супрессорными свойствами на реакцию КЧ [Kyagova А., 1997]. Тип таких клеток на сегодня неизвестен. Для выявления популяции клеток с супрессорными свойствами на реакцию КЧ были изучены эффекты ФОП в модели адоптивного переноса супрессии указанной реакции. Для этого сенсибилизированным мышам-реципиентам переносили различные популяции иммунокомпетентных клеток, полученных методами позитивной или негативной иммуномагнитной сепарации (схема экспериментов представлена на рис. 11).

После сенсибилизации ДНФБ мышам-донорам per os или в/в вводили ФОП и через 120 часов выделяли спленоциты. Методом иммуномагнитной сепарации выделяли различные популяции лимфоцитов, а именно: CD3+ лимфоциты, В клетки или клетки, не содержащие на себе В-клеточных маркеров. Полученные популяции клеток в/в вводили сенсибилизированным мышам-реципиентам и через сутки проводили регистрацию интенсивности реакции КЧ.

Сенсибилизация ДНФБ

облученный лсорален (ФОП, 12 кДж/м2) 0.5 мл peros или внутривенно

ДОНОР

спленоциты

негативная или позитивная иммуномагнитная сепарация

(Dynai KSouse Negative isolation Kit; Dynabeads Mouse Pan T (Thy 1.2) и Pan В Kits): CD3+, 8-клетки, не Б-кпетки

Сенсибилизация ДНФБ

в/в 7х106 клеток

Разрешение ДНФБ

1ч 24 ч

РЕЦИПИЕНТ

Рисунок 11. Схема адоптивного переноса.

отек уха

На рисунке 12А видно, что перенос CD3+ субпопуляции мышам-реципиентам от мышей-доноров, получивших ФОП, приводил к супрессии реакции КЧ. Однако, супрессия реакции КЧ была неполной. На рисунке 12Б видно, что перенос мышам-реципиентам В-лимфоцитов от мышей-доноров, получивших ФОП, не приводил к угнетению реакции КЧ.Суммируя полученные данные можно заключить, что клетки с супрессорными свойствами на реакцию КЧ, генерируемые под действием ФОП in vivo, относятся к популяции Т-клеток. Согласно данным литературы [Honda Т., 2013) известно, что клетками-эффекторами реакции КЧ к ДНФБ выступают CD8+ лимфоциты. Исходя из этого, можно предположить, что к клеткам, обладающими супрессорными свойствами на реакцию КЧ к ДНФБ, генерируемые под действием ФОП, относятся CD4+ Т-лимфоциты.

Переносимые клетки

Переносимые клетки

Рисунок 12. Выявление фенотипа клеток, ответственных за супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена: А) роль CD3+ лимфоцитов; Б) роль CD45R/B220+ субпопуляции («Не В-клетки»). К- (отрицательный контроль): интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо; K+i (положительный контроль без переноса спленоцитов); К+2 положительный контроль на ДНФБ в переносе. ФОП (темные столбцы) адоптивный перенос КЧ: введение ФОП per os или в/в (сплошные и заштрихованные столбцы соответственно). А) *р<0,05 по сравнению К+З;#р<0,03 по сравнению с К+2; Б) #р< 0,03 по сравнению К+3; *р<0,05 по сравнению К+2.

ВЫВОДЫ

1. Обнаруженная методом резонансного светорассеяния (PCP) фотоиндуцированная агрегация продуктов фотоокисления псоралена (ФОП) усиливается при увеличении концентрации псоралена, а также при увеличении интенсивности действующего света.

2. Обнаружено, что фотоиндуцированная агрегация ФОП происходит как в присутствии кислорода, так и в атмосфере аргона. Причем при равных дозах облучения сигнал PCP в бескислородных условиях превышает таковой при облучении на воздухе примерно в два раза. В отличие от этого фотопродукты, вызывающие гемолиз, образуются только на воздухе, т.е. способностью вызывать гемолиз обладают только продукты фотоокисления псоралена (ФОП-гемолизины).

3. Выявлено, что введение ФОП приводит к уменьшению накопления ДНФБ-специфических клеток как в лимфоузлах, так и в селезенках мышей, а также приводит к снижению пролиферации клеток ЛУ и модуляции цитокинового профиля лимфоцитов, принимающих участие в развитии КЧ, а именно: уменьшению продукции ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у и увеличению синтеза ИЛ-17.

4. Показано, что ФОП in vitro индуцирует апоптоз клеток ЛУ, полученных как от интактных, так и от ДНФБ-сенсибилизированных мышей. Образование ФОП-

продуктов с проапототическими свойствами зависит от интенсивности действующего света. При этом дозовые зависимости для ФОП-индуцированного апоптоза и ФОП-агрегации имеют схожий характер.

5. Выявлено, что клетки с супрессорным действием на реакцию КЧ, индуцированные под действием ФОП in vivo, относятся преимущественно к субпопуляции CD3+ Т-лимфоцитов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Kyagova, A. Immunospecific suppression of contact hypersensitivity by psoralen photolysis products / A. Kyagova, L. Kozir, I. Pyatnitskii, N. Gorshkova, S. Pavlova, I. Kozlov, M. Malakhov, A. Potapenko. // Programme and Book of Abstracts, 13th Congress of European Society for Photobiology and the 2nd Conference of the European Platform for Photodynamic Medicine, Wroclaw, Poland. 5-10 September 2009, - p. 108.

2. Kyagova, A. Immunosuppression induced by psoralen photoproducts can be realized through generation of adhesive cells with specific suppressive functions and apoptotic cells / A. Kyagova, L. Kozir, N. Gorshkova, I. Pyatnitskii, S. Pavlova, I. Kozlov, M. Malakhov, A. Potapenko. // J. Invest. Dermatol., Sup., 2009, - №129, - p.34.

3. Malakhov, M. Photoinduced aggregation in psoralen aqueous solutions and its role hemolytic effects of photooxidized psoralen / M. Malakhov, I. Pyatnitskiy, E. Nevezhin, A. Ryabov, A. Potapenko. // Programme book of Abstracts, 14й1 Congress of the European Society for Photobiology, Geneva, Switzerland. 1-6 September 2011, - p 136.

4. Kyagova, A. Suppression of contact hypersensitivity to 2,4-dinitrofluorbenzene in mice caused by psoralen photooxidation products / A. Kyagova, S. Pavlova, D. Albegova, I. Pyatnitskiy, I. Kozlov, L. Kozir, A. Potapenko. // Programme book of Abstracts, 14th Congress of the European Society for Photobiology, Geneva, Switzerland. 1-6 September 2011, - p 133.

5. Kyagova, A. Modulation of the contact hypersensitivity in mice by psoralen photooxidation products: alteration in the cytokine balance and generation of cells with specific suppressive functions / A. Kyagova, S. Pavlova, D. Albegova, I. Pyatnitskiy, I. Kozlov, L. Kozir, A. Potapenko. // Journal Inv Dermatol, Sup, Program book, 41st Annual ESDR meeting, Barcelona, Spain. 7-10 September 2011,-№131, - p. S100.

6. Кягова, А. Механизмы иммуносупрессорного действия продуктов фотоокисления псораленов на реакцию контактной чувствительности у мышей / А. Кягова, Д. Албегова, С. Павлова, И. Пятницкий, И. Козлов, Л. Козырь, Н. Власова, А. Потапенко. // Сборник тезисов 6-ого съезда Российского фотобиологического общества, пос. Шепси, РФ. 15-22 сентября 2011 года, - с. 117.

7. Пятницкий, И.. Исследование агрегации продуктов фотоокисления псоралена методом резонансного светорассеяния / И. Пятницкий, Н. Власова // Вестник РГМУ. - 20 И. - № 1. -С. 69-73.

8. Пятницкий, И. Супрессия афферентной стадии реакции контактной чувствительности у мышей под действием фотоокисленного псоралена in vivo / И. Пятницкий, С. Павлова, Д. Албегова, А. Потапенко, А. Кягова // Вестник РГМУ, материалы VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции молодых ученых 2012 года, №1, - с. 293-294.

9. Пятницкий, И. Механизмы супрессорного действия фотоокисленного псоралена на афферентной фазе реакции контактной чувствительности у мышей / И. Пятницкий, С. Павлова, Д. Албегова, Л. Козырь, И. Козлов, А. Потапенко, А. Кягова // Российский иммунологический журнал. - 2012. - Т.6(15). - № 2. - С. 139-146.

10. Потапенко, А. Гемолиз эритроцитов под действием фотоиндуцированных агрегатов псоралена / А. Потапенко, И. ПятпицкиП, Е. Невежин, М. Малахов. // Материалы докладов IV съезда биофизиков России, Нижний Новгород, РФ. 20-26 августа 2012 года, - с. 191.

11. Потапенко, А. Приглашенная лекция «Фотобиология и фотомедицина» / А. Потапенко, М. Малахов, А. Кягова, Л. Козырь, Е. Лысенко, Т. Шмиголь, Н. Власова, Е. Невежин, И. Пятницкий // Материалы докладов Международной научно-методической конференции «Современные проблемы биофизики сложных систем. Информационно-образовательные процессы», г. Воронеж, РФ. 24-27 июня 2013 г, - с. 9-12.

12. Kyagova, A. The Bunsen-Roscoe reciprocity law is not fulfilled in apoptosis of lymphocytes induced by psoralen photooxidation products / A. Kyagova, I. Pyatnitskiy, M. Malakhov, A. Potapenko // Programme book of Abstracts, 15th Congress of Ihe European Society for Photobiology, Liege, Belgium. 2-6 September, 2013, -p. 131.

13. Potapenko, A. Aggregation of psoralen photolysis products monitored by the resonance light scattering: hypothesis of mechanochemical mechanism of hemolysis / A. Potapenko, E. Nevezhin, N. Vlasova, I. Pyatnitskiy, A. Kyagova, M. Malakhov // 15111 Congress of the European Society for Photobiology. Programme book of Abstracts. Liege, Belgium, September 2-6, 2013. p. 131-132, P069.

14. Пятницкий, И. Супрессорное действие продуктов фотоокисления псоралена на реакцию контактной чувствительности у мышей: ингибирование пролиферации и индукция апоптоза лимфоцитов / И. Пятницкий, С. Павлова, Д. Албегова, И. Козлов, А Потапенко, А. Кягова. // Российский журнал кожных и венерических болезней. - 2013. — № 6. - С. 59-63.

Подписано в печать:

05.12.2014

Заказ № 10409 Тираж - 50 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 vvww.autoreferat.ru