Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование мембранотоксических и иммуномодулирующих свойств фотоокисленного псоралена

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование мембранотоксических и иммуномодулирующих свойств фотоокисленного псоралена"

I т

рга од

2 7 ПОП ^

На правах рукописи

ЖУРАВЕЛЬ Наталья Николаевна

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАНОТОКСИЧЕСКИХ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ФОТООКИСЛЕННОГО ПСОРАЛЕНА

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в Российском Государственном Медицинском Университете (Москва) и Научно-Исследовательском Институте Физико-Химической Медицины МЗ МП РФ (Москва).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор ПОТАПЕНКО А. Я.; доктор медицинских наук, профессор ХАЛИЛОВ Э. М.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор СОРОКОВОЙ В. И. кандидат биологических наук, ст. преп. каф. биофизики МБФ РГМУ

АНОСОВ А. К.

Ведущее учереждение: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится "_"_ 1995 г.

в_часов на заседании Специализированного Совета Д. 084. 66. 01. в

Научно-Исследовательском Институте Физико-Химической Медицины по адресу: 119828 Москва, ул. Малая Пироговская 1а.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИФХМ по адресу: 119828 Москва, ул. Малая Пироговская 1а.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь Совета

МУРИНА М. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для лечения дерматозов (псориаз, витилиго, кожная Т-клеточная лимфома и др.) успешно применяется ПУФА-терапия комбинированное воздействие псораленов и ближнего УФА-излучения (320-400 нм).

Считается, что за терапевтический эффект ПУФА-воздействия отвечает кислороднезависимое фотоприсоединение псораленов к ДНК (Мизаз'о 1_. Л а!., 1965). Кислород-зависимым реакциям псораленов всегда отводилась минорная роль в терапии, так как считалось, что они приводят только к побочным, токсическим эффектам (Мопвоп ЧУХ. е{ а1., 1977). Однако, в последнее время возникло предположение, что, как токсические, так и терапевтические ПУФА-эффекты могут реализоваться через стадию образования фотоокисленного псоралена (ФОП) (Рогарепко А. Уа, 1991).

Предполагают , что в основе механизма ПУФА-терапии может лежать иммуномодулирующее действие фурокумаринов в комбинации с УФА-излучением на организм. В недавних экспериментах было показано, что ФОП, так же, как и ПУФА-воздействие, модулирует реакцию ГЗТ (Ро1арепко А. Уа. й а!., 1994). Механизм образования ФОП-иммуносупрессоров не изучался. Поэтому изучение механизмов модификации мембран в присутствии ФОП и иммуномодулиру ющего действия ФОП является актуальной задачей, т.к. полученная информация может служить основой совершенствования ПУФА-терапии.

Фотоокислительные реакции ФК с биомолекулами протекают в растворах с невысокими квантовыми выходами, но в коже роль этих реакций велика, т. к. ФК повышают эритемную чувствительность к УФ-излучению на несколько порядков. Это указывает на то, что должны существовать механизмы химической активации фотоокислительных реакций. Одним из регуляторов внутриклеточных и

внутритканевых процессов может быть Fe(II), так как известно, что ионы железа присутствуют в интактной ткани. Показано (W. Adam et а!., 1991), что при УФА-облучении растворов ФК образуются гидроперекиси и диоксетаны, которые, как известно, могут эффективно разрушаться ионами Fe2+. Влияние ионов Fe2+ на ФОП-гемолитики и ФОП-иммуносупрессоры не изучалось.

Целью настоящей работы явилось изучение физических и химических факторов, влияющих на биологические эффекты ФОП:

- изучение влияния ионов Fe2+ на мембранотоксические эффекты ФОП-продуктов на эритроциты и перитонеальные макрофаги мышей.

- исследование влияния ионов Fc2* на продукты ФОП, отвечающие за иммуносупрессию реакции ГЗТ у мышей.

- исследование влияния температуры, интенсивности света и концентрации псоралена при облучении на выход иммунологически активных ФОП-продуктов в водном растворе.

Научная новизна работы. Показано, что двухвалентное железо активирует гемолиз, вызванный продуктами фотоокисления в воде псоралена. Активация связана с тем , что, во-первых, железо(П) вызывает стойкие повреждения в эритроцитах, которые проявляются под действием ФОП; во-вторых, ионы Fe2+ индуцируют образование активных ФОП-гемолизинов, которые нестабильны как сами по себе, так и разрушаются под действием железа(И). Установлено, что ФОП-супрессоры, так же, как и ФОП-гемолизины, разрушаются Fe2+ с образованием лабильных, однако, не менее биологически эффективных продуктов. Выявлено, что зависимость выхода ФОП-гемолизинов в водном растворе от концентрации псоралена при его предоблучении носит экстремальный характер. При низких концентрациях (менее 0,3 мМ) выход гемолизина увеличивался с ростом концентрации псоралена. Однако, при дальнейшем увеличении концентрации выход гемолизина снижался. Предполагается, что снижение выхода обусловлено

явлением тушения триплетных состояний псоралена невозбужденными молекулами псоралена. Это указывает на то, что в образовании гемолизина участвуют триплеты псоралена.

Обнаружена невыполнимость закона Бунзена-Роско при образовании ФОП-супрессоров реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Показано, что ФОП-супрессоры образуются более аффективно в разбавленых растворах псоралена и под действием света низкой интенсивности. Предлагается кинетическая схема образования ФОП-супрессоров и ФОП-гемолизинов с учетом экспериментально полученных данных.

Установлено, что гибель макрофагов при совместном воздействии ФОП и железа (II) связана с количеством железоразрушаемого продукта в растворе ФОП. Образование этого продукта зависело от дозы УФА-света и носило экстремальный характер. Токсическое действие на мембраны макрофагов продуктов реакции ФОП с Ре(П) снижалось в присутствии аптиоксиданта ионола, что указывает на участие в этом процессе свободных радикалов.

Показано, что зависимость интенсивности железоиндуцированной хемилюминесценции в водном растворе ФОП от дозы облучения УФА-света носит экстремальный характер. Увеличение интенсивности связывается с накоплением железоразрушаемого продукта во время облучения, снижение - с распадом лабильных продуктов фотоокисления псоралена.

Выявлено, что ФОП-супрессоры при комнатной температуре сохраняют активность в водном растворе в течение как минимум трех суток и быстро распадаются при 58°С, что свидетельствует о термолабильности этих фотопродуктов.

Практическая ценность. Результаты проведенных исследований с использованием химических (Ре2+) и физических (интенсивность УФ-излучения, температура) факторов расширяют наши представления об особенностях

фотоокислительного механизма повреждения мембран в результате воздействия фотоокисленным псораленом, а также представления об условиях образования продуктов ФОГТ, отвечающих за системные иммунологические эффекты, что важно при разработке новых подходов для совершенствования ПУФА-терапии. . Так как показано, что продукция ФОП-иммуносупресеоров была более эффективной при низкой интенсивности света и низкой концентрации псоралена во время облучения, т.е. при условиях близких к условиям ПУФА-терапии, поэтому предполагается, что при терапевтическом действии, как и в процессе иммуносупрессии, могут быть вовлечены продукты ФОП.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на заседании кафедры медицинской и биологической физики Российского Государственного Медицинского Университета (1995) и заседании отдела биохимии Научно, Исследовательского Института Физико-Химической Медицины (1995), а также на Им Международном Конгрессе по Фотобиологии (1992, Киото, Япония), 5м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1993, Марбург, Германия), Юм Ежегодном Совещании Общества Фармакологии Кожи (1993, Гонконг), 22м Ежегодном Совещании Американского Общества Фотобиологов (1994, Скоттсдейл, США), Международной Конференции по Клинической Хемилюминесценции (1994, Берлин), 4м Международном Симпозиуме по ЭПР, Дозиметрии и Применению (1995, Мюнхен/Нюрнберг, Германия), 1м Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их , практического использования" (1995, Пущино, Россия), 6м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1995, Кембридж, Англия).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа

состоит из трех глав и изложена на 112 страницах, включая 22 рисунка. Список литературы содержит 193 ссылки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали псорален (Институт химии растительных веществ АН Узбекистана, Ташкент); FeSO* х 7НгО, пептон производства "Sigma", США; десферал "Ciba-Geigy", Switzerland; NaCl, Na^PO-t, NaiHPOi, этанол, ионол, среда Хенкса - отечественного производства ХЧ или ЧДА.

Оценка гемолитических эффектов псоралена проводилась на эритроцитах человека методом турбидиметрии (Potapenko, 1991).

Жизнеспособность перитонеальных макрофагов оценивали методом окраски 0.1% раствором триланового синего (Phillips НJ., 1973).

Облучение осуществляли сфокусированным светом ртутно-кварцевой лампы сверхвысокого давления. УФА-область выделяли с помощью светофильтра "Hg-MON 365" (К. Цейсс, ГДР).

Интенсивность света измеряли при помощи метода ферриоксалатной актинометрии (Паркер, 1972) или калиброванным фотодиодом.

Интенсивность действующего света варьировали при помощи металлической сетки, помещаемой между лампой и образцом.

Влияние ФОП на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей оценивали по разнице отека между опытной и контрольной лапками (Lagrange Р.Н. et al., 1974).

Регистрацию хемилюминесценции проводили на установке, включающей фотоприемник ФЭУ-39-А, высоковольтный блок питания ВСВ-2, усилитель постоянного тока (рН-метр OP-208/I, Венгрия).

В работе использован кинетический метод анализа.

Статистическая обработка результатов: результаты обрабатывали методами вариационной статистики с соответствующими расчетами среднего арифметического и стандартного отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ионов Ре2* на гемолиз, индуцированный фотоокисленным псораленом

(ФОП)-

Гемолиз, индуцированный ФОП, значительно активировался при добавлении экзогенного Ре2+ (рис.1, кривая 1) по сравнению с контролем без добавления Ре2+ (кривая 2). Во всех экспериментах конечные концентрации были следующие: эритроциты -10 млн.кл/мл, Ре(П) - 0,1 мМ, псорален - 0,1 мМ.

Доза облучения, кДж/м Однако, ФОП полностью утрачивал свою гемолитическую активность при его предынкубации с Ре(Н) в течение 1 часа до добавления к эритроцитам (рис.1., кривая 3). Исследование динамики распада продуктов реакции ФОП с ионами Рег+ показало, что образующиеся гемолитики нестабильны как сами по себе (рис.2, кривая 1), так и разрушаются ионами Рв(11) (кривая 2). При этом было выяснено, что Ре3+ в концентрации 10"4 М не влияет на ФОП-гемолиз.

Рис 1. Влияние ионов Ре на скорость ФОП-гемолиза.

ФОП смешивали с суспензией эритроцитов, затем добавляли Fe(II) (кривая 1) или воду (кривая 2), кривая 3 - ФОП предынкубировали с Fe(II) в течение 1 часа до смешивания с суспензией эритроцитов.

2+

О 20 40 60 80 100 1^0

Рис.2 Распад гемолизинов, образовавшихся из ФОП под действием Ре(П).

1 - к ФОП последовательно добавляли Ре(Н и десферал, хранили эту смесь различное вр( затем добавляли к эритроцитам;

2 - ФОП смешивали с Ре(Н), хранили, затем последовательно вводили десферал и эритрс

О 5 10 15 20 Время хранения, мин

Согласно данным литературы, при облучении псоралена в растворе образуется

смесь фотопродуктов, часть из которых является пероксидами (W. Adam et а!.,

1991). Продукты разрушения пероксидов в составе ФОП ионами FeJ+ активируют

гемолиз. Другая причина активации ФОП-гемолиза состояла в повреждении

ионами Fe (II) самих эритроцитов (рис.3., кривая 1). Оказалось, что Fe(II)

вызывает латентные повреждения эритроцитов, которые не влияют на спонтанный

темновой лизис эритроцитов, однако оказываются существенными при проведении

ФОП-гемолиза.

г 0.03

■ь-i-

§0.02 s

OJ

gO.Ol-

о §■

*0.00J

Рис.3 Влияние предынкубации эритроцитов с Fe(II) перед смешиванием с ФОП на скорость гемолиза. Перед смешиванием с ФОП к смеси эритроцитов и Fe(II) добавлялся хелатор железа десферал. 1 - эритроциты смешивали с Fe(II), хранили в течение времени, указанного на оси абсцисс, затем добавляли ФОП; 2 - к эритроцитам добавляли ФОП, но не добавляли Fe(II). Конечные концентрации Fe(II) - 0,1 мМ;

О „ 20 40 60 десферала - 0,2 мМ; эритроцитов - 10 млн/мл. Время хранения t, мин

Влияние ионов Ре24 на супрессию фотоокисленным псораленом реакции гиперчувствительности замедленного типа.

В составе ФОП кроме продуктов, вызывающих токсическое действие на клетки, содержатся продукты, обладающие иммуномодулирующим действием. Так, продукты ФОП способны ингибировать реакцию гиперчувствительности

замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей, подобно ингибированию реакции ГЗТ при ПУФА-воздействии (Рогарепко е1 а1., 1994). Природа этих продуктов неизвестна и для того, чтобы охарактеризовать их был поставлен эксперимент, подобный описанному выше опыту на эритроцитах. К ФОП добавляли Ре2* (Ю-4 М), эту пробу хранили в течении двух час<?в, затем вводили мышам. В контрольной группе к ФОП добавляли воду, не содержащую Ре(П) и так же хранили два часа перед введением мышам. Другими контролями служили необлученный Пс (КИМ), необлученный водный раствор Пс (104 М) в смеси с Ре2+(10'4 М), хранившиеся 2 часа в фосфатном буфере. Оказалось, предынкубация ФОП с Ре2+ в течении двух часов приводит к отмене супрессии реакции ГЗТ, т.е. иммунологически активные ФОП-продукты разрушаются железом (II), тогда как в отсутствие Ре(И) ФОП вызывает супрессию реакции ГЗТ почти до уровня отрицательного контроля; необлученный Пс, ионы Ре2+ в фосфатном буфере не оказывают влияния на супрессию реакции ГЗТ. Если же Ре2+ инкубировалось с ФОП и другими пробами не дольше 1 минуты до введения мышам внутривенно, то ФОП сохранял свою активность.

Т.е., если ввести Ре2+ к ФОП, то немедленно образующиеся продукты эффективны и как гемолитики, и как супрессоры реакции ГЗТ. При длительном совместном хранении ФОП и Ре2+ теряется биологическая активность ФОП.

Исследование влияния концентрации псоралена при облучении и интенсивности света на образование биологически активных ФОП-продуктов.

Известно, что выход гемолитически активных ФОП-продуктов в этаноле зависел от концентрации раствора псоралена во время облучения (Нагиев, 1991). В настоящей работе регистрировали зависимость гемолитической эффективности ФОП как функции концентрации псоралена в водных растворах при его предоблучении.

Гемолитическую эффективность ФОП определяли как величину, обратную времени облучения псоралена, при котором лизировали 50% клеток суспензии в процессе незавершенного гемолиза. Параметр "гемолитическая эффективность" прямо пропорционален квантовому выходу образования фотопродуктов-гемолизинов в растворе псоралена (Рйарепко, 1991).

I

0 п «■ - Рис.4 Зависимость гемолитической эффективности

к „ 0.012л

й л

а н о.ою

0 о

¡¡> о Q.008-

f я 0.006

1 S 0 004

О о

S -9-

0.002-

ц "Э" 0.000-Д|,|,,.................................. постоянной

ФОП от концентрации псоралена в водном растворе при облучении.

Различные концентрации (с) Пс облучали УФА-светом (I = 180 Вт/м 2), варьируя при этом толщину кювет (1) таким образом, чтобы произведение с х 1 было постоянным, при этом поглощенная доза также оставалась

0.0 0.3 0.5 0.8 1.0 Конечные концентрации: клетки - 10 млн. кл/мл, [Пс] при облучении, мМ Пс - 20 мкМ.

Показано, что при предоблучении водных растворов псоралена гемолитическая эффективность росла в интервале концентраций от Ю-4 М до 2Ч0-4 М (рис.4), что

согласуется с ранее выявленной зависимостью при предоблучении этанольных растворов псоралена (Нагиев, 1991). Однако, при дальнейшем увеличении концентрации водного раствора псоралена наблюдалось падение гемолитической эффективности (рис.4) Уменьшение выхода ФОП-гемолитиков при облучении высоких концентраций псоралена в водном растворе (от 2-10-4 М до 10"3 М) можно

объяснить существованием лабильного промежуточного продукта А, который при облучении псоралена в высоких концентрациях тушится невозбужденными молекулами псоралена.

hv Пс Пс-►А

гемолизин

тушение

В наших расчетах (с использованием координат Штерна-Фольмера) время жизни промежуточного продукта А для нисходящей части кривой на рис.4 составило 0.8 мкс, что близко соответствует времени жизни триплетного электронно-возбужденного состояния псораленов (Sloper et al., 1979), поэтому можно предположить, что при облучении высоких концентраций псоралена в растворе происходит тушение 3Пс молекулами Пс, что приводит к снижению выхода гемолитика и, следовательно, падению гемолитической эффективности ФОП.

Влияние интенсивности света и концентрации псоралена при облучении на образование иммунологически активных ФОП-продуктов.

Ранее было показано (Potapenko et al., 1994), что продукты ФОП способны вызывать ингибирование реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ), аналогично ингибированию реакции ГЗТ при ПУФА-воздействии. Нами было изучено влияние интенсивности света и концентрации псоралена при облучении на образование иммунологически активных ФОП-продуктов.

Обнаружено, что образование фотопродуктов Пс, вызывающих in vivo супрессию реакции ГЗТ, зависит от интенсивности действующего УФ-излучения и от концентрации псоралена во время облучения. Выход иммунологически активных продуктов ФОП значительно увеличивался с уменьшением интенсивности действующего света (рис.5).

Рис.5 Влияние интенсивности действующего УФ-излучения на образование ФОП-продуктов, вызывающих супрессию реакции ГЗТ.

Мышам линии (СВА х C57BL6) Fl вводили внутривенно ФОП через 72 часа после сенсибилизации антигеном. Интенсивность реакции ГЗТ в (%) рассчитывали по формуле: ГЗТ, % = (Е - "К-") / ("К+" - "К-") х 100 %, где Е, К+ и К-отек лапки у мышей в опытной группе, положительном и отрицательном контролях, соответственно. Доза'облГчения, кДж/Л ЦиФры У КРИВЫХ * интенсивность света.(Вт/м2)

При интенсивности 20,8 Вт/м2 наблюдалась практически полная супрессия реакции ГЗТ при дозе облучения 10 кДж/м2, тогда как при интенсивности света 150 Вт/мг практически полная супрессия была только при дозе 45 кДж/м2.

Изучение влияния концентрации Пс во время облучения на образование ФОП-продуктов, вызывающих супрессию ГЗТ, показало, что выход этих продуктов значительно увеличивается с разбавлением раствора Пс (рис.6). Кривая дозовой зависимости реакции ГЗТ сдвигается к области более низких доз облучения с уменьшением концентрации Пс.

0 1 2 3 4 5 Доза облучения, кДж/м2

Как показали наши специальные опыты, ФОП-иммуносупрессоры сохраняют

свою активность в течение как минимум 3-х суток при комнатной температуре, по

полностью распадаются при 60°С, что указывает на их термолабильность.

Известно, что при ПУФА-терапии индуцируется супрессия реакции ГЗТ. Во время

проведения ПУФА-терапии применяются низкие интенсивности света и

концентрация псоралена в организме также очень низка. В наших экспериментах

по фотоокислению псоралена в растворах продукция ФОП-иммуносупрессоров

была более эффективной при низкой интенсивности света и низкой концентрации

псоралена во время облучения, т.е. при условиях близких к условиям ПУФА-

терапии. Таким образом, можно предположить, что при терапевтическом

действии, как и в процессе иммуносупрессии, могут быть вовлечены продукты

фотоокисления псоралена.

■К-

Рис.6 Влияние концентрации псоралена ■К+ при облучении на образование иммунологически активных продуктов ФОП.

Интенсивность света I = 20.8 Вт/мг К+, К- положительный и отрицательный контроли. Цифры у кривых - концентрация Пс при облучении. Остальные условия, как на рис.5.

0.0

Данные кинетических исследований образования ФОП-гемолизинов и ФОП-иммуносупрессоров могут быть резюмированы следующей сеткой реакций:

0) Пс + —► 'Пс —► зПс

1) 3Пс + Пс к' > тушение

2) зПс-к?-„ А

02

КЗ

3) А * ФОП1 (иммуносупрессор)

к4

4) А + А -► ФОПг (гемолизин)

где А - лабильный промежуточный продукт, Пс, 'Пс, 3Пс - псорален в основном состоянии, а также в синглетном и триплетном возбужденных состояниях, соответственно.

Решение дифференциальных уравнений для относительных скоростей образования ФОП: (01 отн) и ФОП2 (1)2отн) в приближении стационарных состояний

Боденштейна-Семенова без учета реакции 1) дает уравнения для относительных выходов образования ФОП-гемолизинов и ФОП-супрессоров, которые описываются следующими графическими зависимостями:

X, отн. ед. концентрация псоралена или интенсивность света

Т. о. процессы образования ФОП-гемолизинов и ФОП-иммуносупрессоров являются конкурирующими, и при низких интенсивностях или концентрациях образуются преимущественно иммуносупрессоры, тогда как при высоких интенсивностях или концентрациях преимущественно образуются гемолизины.

Влняние предварительно фотоокисленного в воде псоралена (ФОТТ) на выживаемость перитонеальных макрофагов мышей.

Известно, что макрофаги и нейтрофилы в коже, лимфатических узлах и крови являются первичной мишенью при проведении ПУФА-терапии или фотофереза (№согга 1 й а!., 1985), кроме того макрофаг является первой клеткой, которая реагирует на антиген при запуске реакции ГЗТ.

Мы показали, что выживаемость макрофагов снижается при их обработке смесью ФОП и Ре2+ , тогда как добавление к клеткам водного раствора ФОП без Ре(И) не приводило к нарушению клеточной проницаемости. Гибель макрофагов при совместном воздействии ФОП и железа (II) связана с количеством железоразрушаемош ггродукта в растворе ФОП. Образование этого продукта зависит от дозы УФА-света и носит экстремальный характер (рис. 7). 3.5]

Рис.7 Дозовая зависимость образования железоразрушаемого ФОП-продукта, токсичного для клеток перитонеального экссудата мышей.

С50- концентрация клеток, при которой наблюдалась 50% выживаемость после воздействия Ие (II) и ФОП, облученного различными дозами УФ-света.

0 30 60 90 120 150 180 Доза, кДж/м2

Параметр С50 пропорционален концентрации цитотоксических продуктов.

Известно, что раствор фотоокисленного псоралена представляет собой смесь фотопродуктов, в составе которой есть пероксиды, взаимодействующие с ионами Fe2+ с образованием свободных радикалов (Potapenko et al., 1993) Наши данные

указывают на то, что in vivo может происходить взаимодействие ФОП с эндогенным клеточным железом, приводящее к токсическим эффектам. Токсическое действие на мембраны макрофагов продуктов реакции ФОП с Fe(II) снижается в присутствии антиоксиданта ионола, что указывает на участие в этом процессе свободных радикалов. ХЛРе, отн.ед.

Рис.8 Зависимость интенсивности хемилюминесценции (ХЛ Fe), индуцированной Fe (II) в растворе ФОП, от дозы облучения псоралена.

ФОП смешивали с Ре(И), при этом регистрировалась вспышка хемилюминесценции. Конечная концентрация Ре(Н) - 40 мкМ. Интенсивностью УФА-света 1=! 50 Вт/м2.

111 г 1111111111111111111111111111

0 50 100 150 200 250 300 1

Доза, кДж/м

Свободнорадикальная природа продуктов реакции ФОП с Ре(И) подтверждается данными по железоиндуцированной хемилюминесценции (ХЛре) в растворе ФОП (рис.8). Увеличение интенсивности при малых дозах связывается с накоплением железоразрушаемого продукта во время облучения, снижение хемилюминесценции при больших дозах облучения - с фотолизом и/или спонтанным распадом лабильных продуктов фотоокисления псоралена.

Близкое совпадение формы дозовых зависимостей ХЛре (рис.8) и цитотоксических эффектов смеси ФОП и Ре(Н) (рис.7) указывает на то, что концентрация цитотоксических фотопродуктов псоралена может определяться методом регистрации хемилюминесценции растворов ФОП, индуцированной ионами Ре2+.

выводы

1. Двухвалентное железо активирует гемолиз, вызванный продуктами фотоокисления в воде псоралена. Активация связана с тем , что, во-первых, железо(Н) вызывает стойкие повреждения в эритроцитах, которые проявляются под действием ФОП; во-вторых, ионы Бе24 индуцируют образование активных ФОП-гемолизинов, которые нестабильны как сами по себе, так и разрушаются под действием железа(Н).

2. ФОП-иммуносупрессоры, так же, как и ФОП-гемолизины разрушаются Ре,+ с образованием лабильных, однако, не менее биологически эффективных продуктов.

3. Зависимость выхода ФОП-гемолизинов в водном растворе от концентрации псоралепа при его предоблучении носила экстремальный характер. При низких концентрациях (менее 0,3 мМ) выход гемолизина увеличивался с ростом концентрации псоралена. Однако, при дальнейшем увеличении концентрации выход гемолизина снижался. Предполагается, что снижение выхода обусловлено явлением тушения триплетных состояний псоралена невозбужденными молекулами псоралена. Это указывает на то, что в образовании гемолизина участвуют триплеты псоралена.

4. Обнаружена невыполнимость закона Бунзена-Роско при образовании ФОП-иммуносупрессоров реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Показано, что ФОП-иммуносупрессоры образуются более эффективно в разбавленых растворах псоралена и под действием света низкой интенсивности. Предлагается кинетическая схема образования ФОП-иммуносупрессоров и ФОП-гемолизинов с учетом экспериментально полученных данных.

5. Гибель макрофагов при совместном воздействии ФОП и железа (II) связана с количеством железоразрушаемого продукта в растворе ФОП. Образование этого продукта зависит от дозы УФА-света и носит экстремальный характер.

Токсическое действие на мембраны макрофагов продуктов реакции ФОП с Fe(II) снижается в присутствии антиоксиданта ионола, что указывает на участие в этом процессе свободных радикалов.

6. Зависимость интенсивности железоиндуцированной хемилюминесценции в водном растворе ФОП от дозы облучения УФА-света носит экстремальный характер. Увеличение интенсивности связывается с накоплением железоразрушаемого продукта во время облучения, снижение - с распадом лабильных продуктов фотоокисления псоралена.

7. ФОП-иммуносупрессоры при комнатной температуре сохраняют ' активность в водном растворе в течение как минимум трех суток и быстро распадаются при 58°С, что свидетельствует о термолабильности этих фотопродуктов.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Saparov S.M., Zhuravel N.N., Mollaev R.E., Sukhorukov V.L., Potapenko A. Ya. Effect of calcium ions on psoralen-sensitized photohaemolysis.// J.Photochem.Photobioi. B:Bioi.,10.-(1991).-!59-164.

2. Rustam M.Mollaev, Sapar M.Saparov, Nataly N. Zhuravel, Eugeniy P.Lysenko, Lii N.Bezdetnaya, Alia A.Kyagova, B.R.Rakhmetov and Alexander Ya. Potapenko. Effect of EDTA on Psoralen-Sensitized Photohaemolysis.// Phys Chem Biol & Med, 2:21-25,1995.

3. "Membranotoxic photodynamic effects of psoralen" Potapenko A., Bezdetnaya L., Lysenko E., Saparov S, Kyagova A., Mamedov I., Mollaev R., Belichenko I. and Zhuravel N 11th International Congress on Photobiology ( September 7-12,1992, Kyoto, Japan).

4. "Psoralen sensitized photohaemolysis is a helpful model for elucidation of the mechanisms of photodynamic effects of psoralens in PYVA therapy" A. Potapenko, S.Saparo R. Mollaev, I. Mamedov, A. Kyagova, N.Zhuravel, M. Malakhov, I. Belichenko, E. Lysenko and L. Bezdetnaya. 5th Congress of the European Society for Photobiology (September 19-26, 1993, Marburg, Germany)

5. "Investigation of immunological effects of products of psoralen photooxidation" A Kyagova, I. Chernyakhovskaya, V. Bekhalo, E. Nagurskaya, I. Belichenko, N. Zhuravel, M.

Ismailova, I. Rodenko and A. Potapenko. 5th Congress of the European Society for Photobiology ( September 19-26, 1993, Marburg, Germany)

6. "Effects of photooxidized psoralens on delayed type hypersensitivity in mice" N.Zhuravel, A. Kyagova, I. Rodenko, A. Potapenko. 10th Annual Meeting of the Skin Pharmacology Society ( October 25-27, 1993, Hong-Kong).

7. "Suppression of delayed type hypersensitivity (DTH) reaction by preliminary photooxidized psoralen (POP): effect of wavelength of UV". M.V.Malakhov, A. A.Kyagova, N.N. Zhuravel, I.V. Belichenko, E.P.Lysenko, A.Ya.Potapenko Photochem.Photobiol., 59, special issue, 33S-34S, 1994. 22nd Annual Meeting of the American Society for Photobiology ( June 25-29,1994, Scottsdale, Arisona)

8. "Chemiluminescent investigations of photodynamic reactions of psoralens in PUVA-therapy" A.Ya.Potapenko, E.P.Lysenko, L. N. Bezdetnaya, A.A.Kyagova, I.S. Mamedov, M.V.Malakhov, N.N. Zhuravel, I.V. Belichenko, L.A. Kozyr. International Conference on Clinical Chemiluminescence (April, 25-28, 1994, Berlin), Book of Abstracts, D-2.

9. "Investigation of properties of photooxidized psoralens by ESR-method with spin trap c-phenil-n-tert-butyl-nitrone (PBN)" E. Lysenko, I. Rodenko, A. Osipov, S. Saparov, R. Mollaev, M. Malakhov, N.Zhuravel, I. Belichenko, A. Kyagova, A. Potapenko. 4th International Simposium on ESR Dosimetry and Applications ( May 15-19, 1995, Munchen/Neuherberg, Germany)

10. "Влияние продуктов фотоокисления псоралена на Т-клеточный иммунный ответ у мышей in vivo" А.А.Кягова, Н.Н. Журавель, М.В. Малахов, И.В. Беличенко, А.Я. Потапенко. 1й Международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Тезисы докладов. 1-5 августа 1995, Пущино, Россия).

11. "Фотоокислительные реакции псораленов типа III" А.Я. Потапенко, Е.П. Лысенко, JI.H. Бездетная, А.А.Кягова, Н.Н. Журавель. 1й Международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Тезисы докладов. 1-5 августа 1995, Пущино, Россия).

12. "Effect of concentration and fluence rate during psoralen UVA-preirradiation on the yield of immunologically active photoproducts" Natalia N. Zhuravel, Alia A.Kyagova, Alexander Ya. Potapenko. 6th Congress of the European Society for Photobiology (September 3-8, 1995, University of Cambridge, UK)