Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность фотопродуктов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность фотопродуктов"

На правах рукописи

Козырь Людмила Анатольевна

Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность

фотопродуктов

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, Кягова A.A.

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Иванов И.И. Доктор биологических наук, доцент Грызунов Ю.А.

Ведущее учреждение: ГУ НИИ ФХМ Росздрава

На заседании диссертационного Совета К 208.072.05 В Российском государственном медицинском университете, по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук, доцент И.В.Буромский.

Защита состоится «

Jodf~4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор (ФС), применяемый в фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty TJ. (2002), Hopper С. (2000)]. После введения ФС на ткани пациента, содержащие ФС, воздействуют светом, инициирующим фотобиологические процессы, которые приводят к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson ВС. (2002)].

Предполагается, что фотодеградация опухолевых тканей при ФДТ может происходить по двум механизмам [Dougherty TJ. (2002), Wilson ВС. (2002)]: 1) прямое повреждение опухолевых клеток, приводящее к индукции апоптоза или некроза; 2) непрямое повреждение опухолевых клеток в результате либо разрушения сосудов опухоли (что приводит к ее некрозу), либо активации иммунных механизмов. Известны два механизма фотодинамических реакций ФС в ФДТ. Тип I - перенос электрона между электронно-возбужденным красителем и биосубстратом. Тип II - перенос энергии с электронно-возбужденного красителя на молекулярный кислород с генерацией синглетного кислорода, который окисляет биомолекулы. В последние годы обсуждается еще один фотохимический механизм, заключающийся в автофотоокислении молекул ФС. Образующиеся при этом относительно стабильные фотопродукты ФС взаимодействуют с биомолекулами, инициируя их повреждение. Биологическая активность фотопродуктов ФС в литературе малоизученна и нуждается в дополнительных исследованиях.

В литературе предполагается, что противоопухолевая активность ФДТ с использованием МЦ540 может быть следствием действия его фотопродуктов. Обнаружено, что продукты фотоокисления МЦ540 способны ингибировать пролиферацию, вызывать апоптоз и некроз различных типов опухолевых клеток в культурах in vitro. Показано также, что введение фотопродуктов МЦ540 мышам с привитыми опухолями, приводит к замедлению роста и деградации опухолей [Gulliya K.S., et. all 1990, Pervaiz S„ 2001, Pervaiz S., et. all 1998]. Есть данные о способности фотопродуктов инактивировать in vitro различные типы

I ни.

вирусов [Tran C.C.,et. all 1992]. До сих пор остается неясным, могут ли перечисленные биологические эффекты фотопродуктов МЦ540 быть следствием повреждения мембран клеток. В этой связи изучение мембранотоксических свойств фотопродуктов МЦ540 является актуальным. С другой стороны известно, что одним из механизмов противоопухолевой активности ФДТ, может являться действие ФДТ на иммунную систему [Dougherty TJ. (2002), Wilson ВС. (2002)]. В литературе отсутствуют данные о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов на иммунную систему также является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучить фотофизические и фотохимические свойства МЦ540 и оценить биологическую активность его фотопродуктов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить методами спектрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540.

2. Исследовать мембранотоксические свойства фотопродуктов МЦ540 (пМЦ540) на модели гемолиза.

3. Изучить действие пМЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакций гиперчувствительности замедленного типа и контактной чувствительности у мышей и сравнить с эффектами фотоокисленного псоралена.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе проведено исследование фотолиза МЦ540 в растворителях с различным содержанием этанола и солей. Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. В водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих отрицательно заряженную группу SO3" и таким образом способствующих агрегации. Эти данные указывают на ведущую роль в автофотоокислении МЦ540 реакций типа I. Установлено, что МЦ540 обладает гемолитическим эффектом. Выявлено, что

МЦ540 в темноте вызывал превращение метгемоглобина (MetHb) в другие формы.

Впервые обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Впервые показано, что супрессия КЧ, вызванная пМЦ540, адоп-тивно переносится другим животным. В основе иммунного механизма супрес-сорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ. Обнаружено, что фотоокисленный псорален (ФОП) при его пероральном введении мышам вызывает зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к ДНФБ. В отличие от пМЦ540 в основе иммунного механизма супрессорного действия ФОП на КЧ лежит активация клеток, специфически угнетающих КЧ.

Практическая значимость. Работа является фундаментальным исследованием, направленным на усовершенствование ФДТ. Отдельные ее положения имеют прямое практическое приложение. Исследования спектральных свойств МЦ540 и закономерностей его фотолиза позволяют предложить оптимальные условия для получения продуктов фотоокисления МЦ540, обладающих иммуносупрессорными свойствами.

Внедрение в практику. Данные, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики РГМУ, а также кафедры фармакологии РГМУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Скорость фотолиза МЦ540 увеличивается в растворителях, способствующих агрегации данного красителя.

2. Продукты фотолиза МЦ540 способны модулировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo.

3. Супрессорное действие фотопродуктов МЦ540 и псоралена является системным и обусловлено активацией клеток с супрессорным потенциалом.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на International conference on clinical chemiluminescence, Berlin (April 25-28, 1994), на 6th Congress of the European Society for Photobiology, Cambridge (3-8 September 1995), на 10th Congress of the European Society for Photobiology, Austria (September 6-11, 2003), на III съезде биофизиков России, Воронеж (24-29 июня 2004 г), на III съезде иммунологов России, Екатеринбург (24-29 июня 2004 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 страницах, содержит 31 рисунок, 10 схем, 2 таблицы. Состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", выводы. Список литературы включает 148 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовались коммерческие препараты мероциа-нина-540 («Sigma», США), псорален (Институт химии растительных веществ, Узбекистан), гемоглобин («Sigma», США), 2,4 - динитрофторбензол (ДНФБ) («Sigma», США), оксазолон («Sigma», США).

Методы исследования. Спектрофотометрия, спектрофлуориметрия, фотохимические методы, постановка реакций ГЗТ и КЧ, метод адоптивного переноса.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Зависимость скорости фотолиза МЦ540 от его агрегационного состояния в различных растворителях.

В настоящем разделе изучались спектральные и фотохимические свойства МЦ540, а именно, способность его к агрегации в различных растворителях, и влияние агрегации МЦ540 и растворителей на скорость фотолиза МЦ540. На рис. 1 представлены спектры поглощения МЦ540, растворенного в 96% этаноле (кривая 1), воде, содержащей 50% этанола (кривая 2) и 0,5% этанола (кривая 3). В литературе длинноволновый максимум в спектре поглощения красителя при-

писывают мономерам, а коротковолновый агрегатам [Mateasik А., а1., 2002; 81кигоуа Ь., й а1., 1997; 81кигоуа Ь., е! а1., 1995, 8)'кигоуа Ь., й а!., 1988]. Видно (кривая 1), что с увеличением концентрации этанола происходит мономериза-ция красителя, сопровождающаяся уменьшением коротковолновой и увеличением длинноволновой полосы поглощения.

350 400 450 500 550 600 650 700 длина волны (нм)

Рис. 1. Спектры поглощения МЦ540 (10'5 М) в смесях вода-этанол.

1 - раствор МЦ540 в 96% этаноле;

2 - раствор МЦ540 в воде с 50% этанола;

3 - раствор МЦ540 в воде с 1% этанола.

По нашим, а также литературным данным [Garcia D.A. and Perillo М.А., 2004], за флуоресценцию МЦ540 отвечает, в основном, его мономерная форма.

При облучении МЦ540 в воде происходит равномерное падение оптической плотности в области 400-580 без заметных изменений формы спектра, свидетельствующее об одинаковом уменьшении содержания мономерных и агрегированных форм МЦ540.

Скорость фотолиза (рис. 2) была тем выше, чем ниже была концентрация этанола, т.е. чем выше удельное содержание агрегатов в растворе. Это указывает на важную роль агрегированных форм МЦ540 при осуществлении фотохимических реакций при его автофотоокислении. По-видимому, главный вклад в эти реакции вносят реакции типа I, протеканию которых благоприятствует агрегация красителя. При добавлении солей к водным растворам происхо-

дит экранировка отрицательного заряда на БОз" группе молекул МЦ540 и это способствует усилению его агрегации [ВПв^ Р., й а1., 1999; 81кигоуа Ь., й а1., 1997]. Скорость фотолиза МЦ540 в солевых растворах значительно возрастает, что еще раз подтверждает нашу гипотезу о доминирующей роли фотореакций типа I в автофотоокислении МЦ540.

Рис. 2. Влияние этанола на фотолиз МЦ540.

Раствор МЦ540 (1,76-1 (Г5 М) облучали (546 нм, 23.6 Вт/м2) в течение разного времени. Цифры у кривых указывают процентное содержание этанола в растворах МЦ540. Оптическая плотность необлу-ченного раствора (D0) в максимумах поглощения составляла 0,25; 0,11 и 0,10 для содержания этанола 96%; 20% и 0,5%, соответственно. D - абсолютные значения оптической плотности фотолизированных проб в максимуме поглощения.

В дальнейшем при изучении биологического действия фотопродуктов МЦ540 облучение с целью ускорения фотолиза мы проводили в растворах с малым содержанием этанола и в присутствии фосфатно-солевого буфера.

2.Действие MII540 м его фотопродуктов на эритроциты и метгемог-

лобин.

Нами установлено, что МЦ540 обладает гемолитическим эффектом. Так скорость темнового гемолиза в присутствии 10 мкг/мл МЦ540 возрастала примерно в три раза по сравнению со спонтанным. Выявлено, что МЦ540 в темноте вызывал превращение метгемоглобина (MetHb) в другие формы (рис. 3). Фотопродукты МЦ540 обладали меньшей гемолитической активностью и способностью модифицировать меттемоглобин, чем необлученный МЦ540.

время облучения (мин)

Это отличает фотопродукты МЦ540 от фотопродуктов других фотосенсибилизаторов. В этой связи, в следующих разделах настоящей работы мы попытались выяснить эффективность продуктов фотолиза МЦ540 на других биологических системах, а именно на моделях Т-клеточного иммунного ответа ш vivo.

20

"Í 0

,300 1180

0 15 30 45 60 75 90 время инкубации (мин)

Рис. 3. Кинетика превращений метгемоглобина, индуцированных необлученным и предоблученным МЦ540.

2,5 мл раствора МЦ540 в концентрации 8,77 10 5 М (ФБР, 10% этанола) смешивали с 0,5 мл раствора МеШЬ (6 мг/мл). Цифрами у кривых указано время облучения МЦ540 в минутах (546 нм, 23,6 Вт/м2).

3. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ у мышей.

Известно, что продукты фотодеградации МЦ540 способны in vivo замедлять рост привитых опухолей у мышей [Gulliya K.S., et al., 1990] и ингиби-ровать пролиферацию опухолевых клеток в культурах [Gulliya K.S., et al., 1990, Pervais S. 2001]. Однако не изучено, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему.

Мы оценили способность продуктов фотоокисления мероцианина 540 влиять на Т-клеточный иммунитет. На моделях реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) [Lagrange Р.Н. et al., 1974; Black С. А., 1999] и реакции контактной чувствительности (КЧ) к 2,4- динит-

рофторбензолу (ДНФБ) или оксазолону у мышей [Grabbe S. and Schwarz Т., 1998; Gorbachev A.V., and Fairchild R.L.,2001 (a, b)].

3.1. Модуляция фотопродуктами МЦ540 реакции ГЗТ к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей.

На первом этапе настоящей работы было изучено действие продуктов фотолиза МЦ540 на ГЗТ к ЭБ (схема 1). Мышей (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель) линии СВА сенсибилизировали путем внутривенной инъекции 0,2 мл суспензии ЭБ (5x105 кл/мл) в фосфатном буферном солевом растворе (ФБР).

Схема 1. Влияние предоблученного мероциапина 540

(пМЦ540) на реакцию гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана (ЭБ) у мышей. (Схема эксперимента).

10 5 ЭБ внутривенно

0,5 мл пМЦ540 внутривенно

72 ч

24 ч

^ регистрация отека лапки

Сенсибилизация

4x10 'ЭБ подкожно Тест-инъекцияя

Через 96 ч после сенсибилизации мышам подкожно в подушечку задней лапки вводили 40 мкл суспензии ЭБ в концентрации 108 кл/мл (тест-инъекция). В другую заднюю лапку в качестве контроля вводили 40 мкл ФБР. Через 24 ч после тест-инъекции у мышей при помощи специального микрометра оценивали величину отека опытной и контрольной лапок. Разность в отеке опытной и контрольной лапок служила мерой реакции ГЗТ. В опытных группах мышам через 72 часа после сенсибилизации (ЭБ) вводили внутривенно по 0,5 мл раствора МЦ540 (17 мкМ в ФБР, содержащем 10% этанола), облученного различными

дозами видимого света зеленого диапазона (X = 546 нм, I = 23,6 Вт/м2). В качестве отрицательного контроля служила группа интактных (несенсибилизиро-ванных ЭБ) мышей, которым ввели внутривенно по 0,5 мл ФБР с 10% этанола и затем животным сделали тест-инъекцию ЭБ.

Интенсивность реакции ГЗТ в процентах рассчитывали по формуле: ГЗТ(%) = [(£- К~) /(К+ - К~ )]х 100%, где Е, К+ и К" отек лапки у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно. На рисунке 4 представлена зависимость изменения интенсивности реакции ГЗТ от дозы предоблучения раствора МЦ540.

Рис. 4. Модуляция реакции ГЗТ к ЭБ под действием предоблу-ченного МЦ540.

Раствор МЦ540 (17 мкМ в ФБР, содержащем 10% этанола) облучали видимым светом (I = 23,6 Вт/м2, X = 546 нм). Мышам вводили внутривенно 0,5 мл предоблучен-ного разными дозами раствора МЦ540 за 24 часа до повторного нанесения ДНФБ на ухо. К1 (положительный контроль) и К" (отрицательный контроль) - сенсибилизированные ДНФБ и интактные мыши, получившие по 0,5 мл ФБР с 10% этанола, соответственно. Каждая точка на кривой - среднее для 8 мышей ± SEM р<0,001 по отношению к К4.

Видно, что введение мышам необлученного раствора МЦ540 не приводило к изменению уровня реакции ГЗТ по сравнению с положительным контролем (К+). Предоблучение в течение 1 часа раствора МЦ540 приводило к увеличению интенсивности реакции на 49% а дальнейшее предоблучение МЦ540 приводило к монотонному снижению интенсивности реакции (супрессии) ГЗТ. Фотолизированный в течение 9 часов МЦ540 ингибировал ГЗТ на 65% (р<0,001 по отношению к К+).

Таким образом, на модели реакции ГЗТ было показано, что облучение раствора МЦ540 приводит к образованию фотопродуктов, способных влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. При этом при малых дозах облучения МЦ540 реакция ГЗТ активировалась. Напротив, при больших дозах предоблу-чения - реакция ГЗТ супрессировалась. Обнаруженный в данной работе эффект модуляции реакции ГЗТ продуктами фотодеградации мероцианина-540 качественно совпал с таковым, описанным в литературе для фотопродуктов псоралена [Potapenko A.Ya., et al., 1994, Kyagova A.A., et al., 1996].

В этой связи можно предположить, что, несмотря на значительные различия в химической структуре МЦ540 и псоралена, во-первых, фотопродукты данных красителей могут иметь сходные химические группы, ответственные за иммуномодуляцию. Во-вторых, сходство эффектов пМЦ540 и облученного псоралена на ГЗТ может быть обусловлено близкими иммунными механизмами их модулирующего действия.

3.2. Супрессорное действие продуктов фотодеградации МЦ540 на реакцию КЧ к ДНФБ и оксазолону у мышей.

Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили как в работах [Kim Т.Y. et al., 1990; Yee G,K. et al., 1990], с незначительными модификациями (схема 2). Мышей линии СВА (самцы весом 18-20 г., возраст 8-10 недель) сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Через 144 часа после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2% раствора в ацетоне). На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя в качестве контроля. Через последующие 24 часа оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека опытного (аппликация ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей.Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле: % супрессии = [1 - (Е - К")/(К+- К")]100%, где Е, К+ и К' - отек уха у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно. Раствор МЦ540 в ФБР (1,7610'5М, с

0,5% этанола) облучали разными дозами видимого света зеленого диапазона (X = 546 нм, I = 23,6 Вт/м2).

Схема 2. Влияние предоблученного МЦ540 на реакцию контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ. I Схема эксперимента).

сенсибилизация 50 мкл 03% ДНФБ накожно

+ в/в 0,5 мл

120 ч

- ФБР (положительный контроль)

- МЦ540 без облучения

- или облученный МЦ540

^ регистрация отека уха

5 мкл 0,2% ДНФБ накожно

На рис. 5 видно, что МЦ540 без облучения не влияет на КЧ. Напротив, предоблученный МЦ540 обладает зависимым от дозы супрессорным действием на КЧ.

_ Рис. 5. Влияние предоблученного

МЦ540 на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей

МЦ540 (1,76-10"5 М в ФБР содержащем 0,5% этанола)

Íl-+ облучали видимым светом (X = 546 К нм, I = 23,6 Вт/м2) при 7°С в течение разного времени. Мышам вводили внутривенно по 0,5 мл облученного разными дозами раствора МЦ540 через 120 ч после сенсибилизации ДНФБ. К+ - поло-| К* жительный контроль, К" - отрицательный контроль, сенсибилизированные и интактные мыши, полу чившие в/в 0,5 мл ФБР с 0,5% эта-время облучения (час) нола, соответственно. Каждая точка

_ среднее для 5 мышей ± SEM.

*р<0,001 по сравнению с К1.

время облучения (час)

Следовательно облучение МЦ540 приводило к накоплению фотопродуктов МЦ540, обладающих супрессорным действием на КЧ.

На следующем этапе мы оценили действие фотопродуктов МЦ540 на КЧ к оксазолону. Мышей сенсибилизировали путем аппликации на брюшко 50 мкл 2% раствора оксазолона в ацетоне. Через 6 суток (144 часа) после сенсибилизации, на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили 5 мкл 0,4% раствора оксазолона в ацетоне. Необлученный МЦ540 не влиял на реакцию КЧ к оксазолону. Напротив, облученный в течение 2 часов МЦ540, полностью, до уровня отрицательного контроля ингибировал КЧ к оксазолону (р< 0,01 по сравнению с К+).

Таким образом, обнаружено, что фотопродукты МЦ540 обладают супрессорным действием на реакцию КЧ независимо от вида гаптена (ДНФБ или оксазолона), использованного для инициации данной реакции и фотопродукты МЦ540 способны влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей.

3.3. Выяснение иммунных механизмов супрессии реакции КЧ, обусловленной продуктами фотодеградации МЦ540.

Ослабление функций эффекторов КЧ, вызванное фотопродуктами MII540.

Реакция КЧ, в отличие от других видов гиперчувствительности, может быть перенесена от сенсибилизированного животного несенсибилизированно-му не сывороткой, а антиген-специфическими Т-клетками [Black С.А., 1999; Grabbe S. and Schwarz Т., 1998]. Поэтому, общепринятым подходом для выявления действия различных агентов, включая фотосенсибилизаторы, на АГ-специфические эффекторные Т-лимфоциты являются опыты по адоптивному переносу эффекторов КЧ [Perez M.I. et al.,1992 (a,b); Simkin G.O., et al., 1997, Musser D.A., and Oseroff A.R. 2001]. Мы изучили влияние in vivo фотопродуктов МЦ540 на сохранение способности клеток-эффекторов адоптивно переносить реакцию КЧ (схема 3). Для этого 0,5 мл предоблученного раствора МЦ540 (1,7610*5 М в ФБР, с 0,5% этанола) вводили внутривенно мышам-донорам через 120 часов после сенсибилизации животных ДНФБ. Через 24 часа после инъ-

екции пМЦ540 у мышей-доноров выделяли клетки селезенки, отмывали, после чего вводили 108 этих клеток внутривенно сингенным интактным мышам-реципиентам. Через 1 час вслед за этим мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 5 мкл 0,2% ДНФБ. В группах сравнения мышам-донорам вводили внутривенно либо 0,5 мл раствора необлученного МЦ540, либо 0,5 мл растворителя (ФБР с 0,5% этанола; группа положительного контроля К+).

Схема 3. Влияние предоблученного МЦ540 на перенос

эффекторами реакции КЧ. (Схема эксперимента).

На рисунке 6 видно, что перенос спленоцитов от сенсибилизированных ДНФБ доноров интактным мышам-реципиентам приводит к иммунизации последних, что проявляется в развитии у мышей-реципиентов реакции КЧ при повторной аппликации на ухо ДНФБ (группа К+). Этот факт свидетельствует об успешном переносе интактным мышам-реципиентам пула специфически сенсибилизированных антигеном (в нашем случае - ДНФБ) эффекторных Т-лимфоцитов КЧ. Видно также, что перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540 достоверно не влиял на КЧ мышей-реципиентов. Напротив, перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию предоблученного МЦ540, приводил к полной супрессии реакции КЧ (*р<0,01 по сравнению с К+).

Рис. 6. Ослабление способности эффекторов к переносу реакции КЧ in vivo под действием пМЦ540.

МЦ540 (1,76-10'5 М в ФБР, с 0,5% этанола) облучали (546 нм, 23,6 Вт/м2) в течение 2 часов, при 7°С. Мышам-донорам вводили внутривенно по 0,5 мл либо раствора пМЦ540, либо раствора необлучен-ного МЦ540, либо ФБР с 0,5% этанола (положительный контроль К4) через 120 часов после сенсибилизации животных ДНФБ. Остальные условия проведения эксперимента отражены на схеме 3. К" - отрицательный контроль. Каждая группа состояла из 5 пар сингенных мышей-доноров и мышей-реципиентов. Представлено среднее ± SEM. *р<0,01 по сравнению с К1.

Полученные результаты указывают, что воздействие пМЦ540 in vivo угнетало способность клеток-эффекторов КЧ переносить данную реакцию другим животным. Это утверждение могло быть следствием двух процессов: прямого воздействия пМЦ540 на эффекторные Т-лимфоциты или тем, что пМЦ540 индуцировал образование Т-клеток с супрессорным потенциалом.

Вызванная пМЦ540 активация клеток с супрессорным потенциалом.

Известно, что ФДТ с использованием таких классов фотосенсибилизаторов, как порфирины и псоралены может ограничивать развитие КЧ путем активации клеток с супрессорным потенциалом. Для фотопродуктов МЦ540 таких исследований не проводилось. Поэтому нами были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ (схема 4 А).

0.20

0.15

И 0.10

0.05

0.00

МЦ540

К" К+ 0 2

время облучения МЦ540 (ч)

Схема 4. Выявление возможности яаоптивиого переноса супрессии КЧ, индуцированной пМС540 in vivo. Роль клеток с супрессорным потенциалом и их специфическое действие.

сенсибилизация

50 мкл 0,3% ДНФБ + в/в 0,5 мл

или:

120 ч

-ФБР

- МЦ540 без облучения

- облученный МЦ540

донор

сенсибилизация 50 мкл 0,3% ДНФБ иакожно

реципиент А

Б 10* кл в/в

144 ч

144 ч

сенсибилизация 50 мкл 2% оксазолон накожно

реципиент Б

регистрация отека уха

5 мкл 0,2% ДНФБ накожно

1 ч

24ч

регистрация отека уха

5 мкл 0,4% оксазолон накожно

На рисунке 7 А видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540, незначительно подавлял (супрессия 30% ± 18%) реакцию КЧ мышей-реципиентов. При этом введение мышам-реципиентам клеток мышей-доноров, получивших инъекцию пМЦ540, приводило к значительной супрессии реакции КЧ (69% ± 4%).

Таким образом, после введения пМЦ540 сенсибилизированным мышам-донорам в популяции спленоцитов появлялись клетки, угнетающие развитие КЧ при их адоптивном переносе сенсибилизированным мышам-реципиентам.

Т.е. предоблученный МЦ540 in vivo вызывал появление клеток, обладающих супрессорной активностью.

0.45 Б

0.40 0.35 1 А I 1

X 0J0 » 0.25 0.20 V 1 гЬ ■ 1

0.10 0.05 Г*1 L L

К", К*, К-J к К*э

■ МЦ540 без облучения ■ облученный 2ч МЦ540

Рис. 7. Предоблученный МЦ540 вызывает адоптивно-переносимую супрессию реакции КЧ. Эта супрессия является неспецифической.

МЦ540 вводили внутривенно сенсибилизированным ДНФБ донорам через 120 часов после сенсибилизации.

А - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным ДНФБ.

Б - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном.

K"¡ и K+i - отрицательный и положительный контроли на ДНФБ в переносе

К"2 - отрицательный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров на интактных реципиентов с последующим разрешением реакции КЧ оксазолоном)

К"3 - отрицательный контроль на оксазолон без переноса клеток

К*2 - положительный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров к сенсибилизированным оксазолоном реципиентам).

*р<0,01 по сравнению с Ki+; **р<0,01 по сравнению с К2+.

Полученные результаты позволяют сделать следующие заключения: 1) супрессия реакции КЧ, вызванная действием пМЦ540, может быть адоптивно перенесена другим животным; 2) предоблученный МЦ540 способен in vivo активировать клетки с супрессорным потенциалом.

В следующей серии экспериментов мы оценили специфичность супрессорного действия пМЦ540 на КЧ. Для этого были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ с использованием двух разных гаптенов: ДНФБ и оксазолона (схема 4 Б). На рис. 7 Б видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, сенсибилизированных ДНФБ, к интактным мышам-реципиентам, с последующей аппликацией реципиентам оксазолона, не приводил к развитию реакции КЧ (К~2). Видно также, что уровень отрицательного контроля в переносе (К2") не отличается от уровня отрицательного контроля на оксазолон без переноса. При этом видно, что если мыши-реципиенты были сенсибилизированы оксазолоном, то повторная аппликация оксазолона данным мышам приводила к развитию реакции КЧ (Кг ). Эти данные свидетельствуют, что гаптены ДНФБ и оксазолон не являются перекрестными, т.е. эффекторы КЧ, сформировавшиеся после сенсибилизации ДНФБ, не отвечали на аппликацию оксазолона.

На рис. 7 Б видно также, что перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540, не повлиял на уровень реакции КЧ у сенсибилизированных оксазолоном мышей-реципиентов. Напротив, перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию облученного МЦ540, привел к угнетению на 75% ± 7% реакции КЧ у мышей-реципиентов на оксазолон (р<0,01 по сравнению с К+2).

Таким образом, предоблученный МЦ540 инициировал в селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров появление клеток, которые подавляли КЧ на чужеродный гаптен - оксазолон. Эти данные позволяют заключить, что супрессорное действие фотопродуктов МЦ540 основано на активации клеток с неспецифическим супрессорным потенциалом.

4. Супрессорное действие Фотоокисленного псоралена (ФОП) на реакцию контактной чувствительности (КЧ1 у мышей.

4.1. Зависимость эффектов ФОП на реакцию КЧ от дозы облучения псоралена.

Ранее было обнаружено, что ФОП способен ингибировать реакцию КЧ при его внутривенном введении [Andina E.S., et al.,1998, Козлов И.Г., и соавт. 2001, Larina N., et al., 2001]. Осталось неясным, могут ли продукты фотоокисления псоралена влиять на реакцию КЧ, если их вводить перорально? Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно схеме, использованной при изучении эффектов фотопродуктов МЦ540 с некоторыми модификациями. Раствор псоралена (0,8 мМ в ФБР с 1% этанола) облучали разными дозами УФА-света (365 нм, 21 Вт/м2 при 4°С). Полученные таким образом растворы ФОП вводили мышам перорально по 0,5 мл через 120 часов после сенсибилизации, т.е. за 24 часа до повторного нанесения ДНФБ. На рисунке 8 представлена зависимость изменения реакции КЧ от дозы предоблучения раствора псоралена. Видно, что пероральное введение мышам необлученного раствора псоралена (0 кДж/м2) не приводило к изменению уровня реакции КЧ по сравнению с положительным контролем (К+). Напротив, раствор предоблученного псоралена вызывал зависевшею от дозы супрессию реакции КЧ у мышей. Так псорален, облученный в диапазоне доз от 6 кДж/м2 до 19 кДж/м2 вызывал полную супрессию КЧ (р<0,001 по сравнению с К+) до уровня отрицательного контроля К" (рис. 8). Полученные данные указывают, что не только внутривенное, но и пероральное введение ФОП приводило супрессии реакции КЧ.

Таким образом, нами обнаружено сходство между способностью фотоокисленного псоралена и облученного МЦ540 вызывать супрессию КЧ. При этом возникает вопрос, а являются ли сходными иммунные механизмы супрес-сорного действия фотопродуктов этих двух фотосенсибилизаторов. В этой связи в следующем разделе для сравнения иммунных механизмов действия ФОП и пМЦ540 мы изучили специфичность супрессорного действия ФОП.

18

Рис. 8. Супрессия реакции контактной чувствительности (КЧ) к ДНФБ у мышей, индуцированная фотоокисленным псораленом (ФОП).

{г

Мышам вводили перорально по 0,5 мл раствора ФОП или необ-лученного псоралена через 120 часов после сенсибилизации животных ДНФБ. В группах положительного (К1) и отрицательно-

Í К" го (К") контролен мышам вводи-

3

О 5 10 15 20

Доза облучения (кДж/м2)

ли перорально по 0,5 мл ФБР, содержащего 1% этанола. Каждая точка на кривой представляет собой среднее значение, полученное на группе из 5 животных ± SEM. *р<0,001 по сравнению с

Г.

4.2. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП на КЧ.

Далее нами была исследована, во-первых, возможность адоптивного переноса супрессии реакции КЧ, индуцированной ФОП in vivo. Во-вторых, изучалась специфичность адоптивно-переносимой супрессии при действии ФОП. Эксперименты по влиянию ФОП на адоптивный перенос супрессии КЧ были проведены согласно схеме 4 с незначительными модификациями (ФОП вводили мышам перорально через 24 часа и 120 часов после сенсибилизации доноров). На рис. 9 видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших перорально ФОП, мышам-реципиентам, сенсибилизированным ДНФБ, угнетал реакцию КЧ мышей-реципиентов по сравнению с контролем (К+|) (панель А: ДНФБ). При этом интенсивность супрессии КЧ составляла 58,3% ± 14,9% и 75% ± 8% при введении ФОП через 24 часа или 120 часов после сенсибилизации доноров ДНФБ, соответственно. Таким образом, ФОП инициировал в селезенках мышей-доноров клетки с супрессорным потенциалом независимо от времени его введения мышам-донорам (24 или 120 часов после сенсибилизации). На рис. 9 (панель Б: оксазолон) также видно, что если спленоциты мышей-доноров, получивших перорально ФОП, переносили оксазолон- сенсиби-

лизированным мышам-реципиентам, то ФОП не вызывал супрессию реакции КЧ.

А: ДНФБ

с 0.3

5 0.1

ФОП 24 ч ФОП 120 ч

Б: оксазолон

i

rh

nh

К-1 К+1

К-2 К+2

Рис. 9. Влияние ФОП на адоптивный перенос супрессии реакции КЧ у мышей.

Мышам-донорам вводили перорально ФОП (12,6 кДж/м2) через 24 часа (опыт 1) или 120 часов (опыт 2) после сенсибилизации ДНФБ. ФОП получали путем пре-доблучения (365 нм, 21 Вт/м2 при комнатной температуре) раствора псоралена (0,8 мМ в фосфатном буферном растворе, содержащем 1% этанола). Через 120 часов (опыт 1) или 24 часа (опыт 2) выделяли спленоциты и переносили мышам-реципиентам.

Серия А (ДНФБ): - мыши-реципиенты были сенсибилизированы ДНФБ. K+i (положительный контроль на ДНФБ) - перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших вместо ФОП 0,5 мл ФБР с 1 % этанола к мышам-реципиентам которые были предварительно, за 144 часа, сенсибилизированы 0,3% ДНФБ. Через 1 час после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 0,2% ДНФБ. K"i (отрицательный контроль на ДНФБ) - интактные мыши, получившие только тест-аппликацию ДНФБ.

Серия Б (оксазолон): - мыши-реципиенты были сенсибилизированы оксазолоном. 1^2 (положительный контроль на оксазолон) - перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, получивших вместо ФОП ФБР в том же объеме, мышам-реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном. К"2 (отрицательный контроль на оксазолон) перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных мышей-доноров, интактным мышам-реципиентам с последующим их тестированием оксазолоном.

Каждая из групп состояла из 5 пар сингенных мышей-доноров и мышей-реципиентов. Представлено среднее ± SEM. *р< 0,001 по сравнению с К **р <0,05 по сравнению с К^.

Более того, ФОП вызывал даже активацию КЧ мышей-реципиентов. Реакция КЧ составляла 142,9% ± 20,6% и 147,6% ± 9,5% при введении ФОП через 24 и 120 часов после сенсибилизации доноров ДНФБ, соответственно (рис. 9, Б). Таким образом, ФОП in vivo индуцировал клетки, которые не только не супрес-сировали, но даже активировали реакцию КЧ в переносе у мышей-реципиентов, сенсибилизированных другим, отличным от ДНФБ гаптеном, а именно оксазо-лоном. Результаты, представленные на рис. 9 позволяют заключить, что: 1) введение ФОП животным приводило к активации клеток с супрессорным потенциалом, которые обладали антиген-специфическим супрессорным действием на КЧ; 2) ФОП активировал клетки, которые обладали активаторным действием на чужеродный гаптен.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. Так в водно-этанольных смесях скорость фотолиза возрастала с уменьшением содержания этанола. А в водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих отрицательно заряженную группу S03' и таким образом способствующих агрегации. Эти данные указывают на ведущую роль в автофотоокислении МЦ540 реакций типа I.

2. Установлено, что МЦ540 обладает гемолитическим эффектом. Так скорость темнового гемолиза в присутствии 10 мкг/мл МЦ540 возрастала примерно в три раза по сравнению со спонтанным. Выявлено, что МЦ540 в темноте вызывал превращение метгемоглобина (MetHb) в другие формы. Фотопродукты МЦ540 обладали меньшей гемолитической активностью и способностью модифицировать метгемоглобин, чем необлученный МЦ540.

3. Обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. При этом пМЦ540 вызывал:

а) модуляцию ГЗТ к эритроцитам барана (ЭБ), а именно, при малых дозах облучения вызывалась активация ГЗТ, а при больших дозах - ее супрессия;

б) зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к различным гаптенам [2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону].

4. Показано, что супрессия КЧ, вызванная фотоокисленным МЦ540, адоптивно переносится другим животным. В основе иммунного механизма су-прессорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим супрессорным действием на КЧ.

5. Обнаружено, что фотоокисленный псорален (ФОП) при его перо-ральном введении мышам вызывает зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к ДНФБ. В отличие от пМЦ540 в основе иммунного механизма супрессорного действия ФОП на КЧ лежит активация клеток, специфически угнетающих КЧ.

Практические рекомендации.

Обнаруженные иммуносупрессирующие эффекты пМЦ540 могут служить основой для разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. A.Ya. Potapenko, Е.Р. Lysenko, L.N.Bezdetnaya, А.А. Kyagova, T.S. Mamedov, M.V. Malakhov, N.N. Zhuravel, T.V. Belichenko, L.A. Kozyr Chemiluminescent Investigations of photodynamic reactions of psoralens in PUVA-therapy. International conference on clinical chemiluminescence, Berlin, April 25-28, 1994. Book of abstracts, Section: CL methods in studies of drugs and noxious substances, D-2.

2. A. Ya. Potapenko, A. A. Kyagova, E. P. Lysenko, I. V. Belichenko, L. A. Kozyr, L. N. Bezdetnaya. Type TTT mechanism of photodynamic reactions. 6'h Congress of the European Society for Photobiology 3-8 September 1995, Churchill College, University of Cambridge, UK. Book of Abstracts. P. 96.

3. M. V. Malakhov, E. P. Lysenko, E. S. Andina, L. A. Kozyr, A. Ya. Potapenko. Modification of methemoglobin by previously photooxidizcd psoralen and other dyes. 6th Congress of the European Society for Photobiology. 3-8 September 1995, Churchill College, University of Cambridge, UK. Book of Abstracts. P. 96.

4. Kyagova A.A., Kozir L.A., Mansurova G.V., Zorin V.P. and A.Ya. Potapenko. Modulation of delayed type hypersensitivity in mice treated with photoproducts of various photosensitizers used in photodynamic therapy. Russ. J. Immunol., 2002. Vol. 7, No. 4, pp. 328-334.

5. A.Y. Potapenko, A.A. Kyagova, G.V. Mansurova, L.A. Kozir, V.Y. Pavlov, 1.0. Konstantinov, G.V. Ponomarev. Suppression of contact hypersensitivity in mice by products of protoporphyrin IX photooxidation. 10fh Congress of the European Society for Photobiology. September 6-11, 2003. General Hospital Vienna, Austria. Programme and book of abstracts. P. 50.

6. E.A. Кожинова, JI.A. Козырь, JI.H. Бездетная, Ф. Гимя. Супрессорное действие фотопродуктов мероцианина540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей. Вестник РГМУ2004, V.34, №3 специальный выпуск, стр. 165-166.

7. Козырь JI.A., Кягова А.А., Кожинова Е.А., Бездетная Л.Н., Гимя Ф., Потапенко А.Я. Супрессия Т-клеточного иммунного ответа in vivo под действием продуктов фотолиза мроцианина-540. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Том 2, стр. 533.

8. Мансурова Г.В., Козырь Л.А., Потапенко А .Я., Пономарев Г.В., Павлов В.Ю., Константинов И.О., Кягова А.А. Супрессорное действие продуктов фотоокисления протопорфирина IX на реакцию контактной чувствительности у мышей. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Том 2, стр. 544-545.

9. Кягова А.А., Козырь Л.А., Ларина Н.А., Нагурская Е.В., Потапенко А.Я. Супрессорное действие фотопродуктов фурокумаринов на реакцию контактной чувствительности у мышей. Russ. J. Immunol. 2004, V. 9, Supp. 1, p. 252.

Б Русский фонд

2007-4 5751

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Козырь, Людмила Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Обзор литературы

1.1. Спектральные свойства мероцианина

1.1.1. Влияние полярности растворителя

1.1.2. Влияние рН растворителя

1.1.3. Влияние катионов

1.1.4. Влияние микроокружения 13 12. Типы фотохимических реакций фотосенсибилизаторов

1.3. Фотохимические реакции мероцианина

1.3.1 .Биологическая активность фотопродуктов мероцианина'

1.4. Современные представления о механизмах развития реакций 31 замедленного типа (ГЗТ и КЧ)

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Спектральные и фотохимические свойства МЦ

3.1.1. Зависимость спектров поглощения и возбуждения 50 флуоресценции МЦ540 от растворителя

3.1.2. Фотолиз МЦ540 в водных и этанольных растворах

3.2. Действие МЦ540 и его фотопродуктов на эритроциты и 66 метгемоглобин

3.2.1. Гемолиз, индуцированный необлученным и фотоокисленным 66 МЦ

3.2.2. Превращения метгемоглобина, индуцированные 71 предоблученным МЦ

3.3. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на реакции 74 гиперчувствительности замедленного типа у мышей

• 3.3.1 Модуляция фотопродуктами МЦ540 реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана

3.3.2. Супрессорное действие продуктов фотодеградации МЦ540 на 78 реакцию контактной чувствительности (КЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону у мышей

3.3.3. Выяснение иммунных механизмов супрессии реакции КЧ, обусловленной продуктами фотодеградации МЦ

Ослабление функций эффекторов КЧ

Активация клеток с супрессорным потенциалом

3.4. Супрессорное действие фотоокисленного псоралена (ФОП) на рёакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей

3.4.1. Изучение дозовых зависимостей ФОП на реакцию КЧ

3.4.2. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП на

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотолиз мероцианина-540: биологическая активность фотопродуктов"

Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор - соединение, повышающее чувствительность биообъектов к свету. Это соединение успешно применяется в фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty T.J., 2002; Mopper С., 2000].

ФДТ - один из современных методов лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанный на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС) [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002; Collaud S., 2004; Beischer A.D. et al. 2002; Kirdaite G. et al., 2002; Ibbotson S.H. 2002]. Метод заключается в следующем: при однократном введении в организм человека ФС, его молекулы избирательно накапливаются в высокопролиферирующих тканях (например, опухолях) и повышают чувствительность этих тканей к световому излучению определенной длины полны (в области поглощения ФС). После введения ФС на ткани пациента, содержащие ФС, воздействуют светом, инициирующим фотобиологические процессы, которые приводят к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson B.C., 2002].

Предполагается, что фотодеградация опухолевых тканей при ФДТ может происходить по двум механизмам [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]:

- прямое повреждение опухолевых клеток, приводящее к индукции апоптоза или некроза;

- непрямое повреждение опухолевых клеток в результате разрушения сосудов опухоли (что приводит к ее некрозу), или активации иммунных механизмов.

Данные механизмы противоопухолевого действия ФДТ могут инициироваться в результате протекания фотохимических реакций ФС двух типов (тип I и II). В реакциях типа I происходит перенос электрона (или Н) между молекулами ФС в триплетном возбужденном состоянии и биосубстратом, в результате образуются радикалы ФС и/или субстрата. Свободные радикалы затем взаимодействуют с молекулярным кислородом, что приводит к необратимым повреждениям биосубстрата [Ochsner М., 1997; Foote C.S., 1991]. В реакциях типа

И происходит перенос энергии с триплетного ФС на молекулярный кислород с образованием электронно-возбужденного синглетного кислорода ('СЬ), который повреждает биологический субстрат [Ochsner М. 1997; Moan J. and Berg К., 1991].

В последние годы обсуждается другой, отличный от типов I и 11, фотохимический механизм, существенный для ФДТ. Этот механизм заключается в том, что повреждение (модификацию) биосубстрата вызывают относительно стабильные фотопродукты ФС, а не '02 или свободные радикалы. Фотопродукты ФС образуются в результате автофотоокисления самих молекул ФС по следующей схеме:

ФС—+ 02->фопюпродуктыФС , где ФС и 3ФС* - молекулы фотосенсибилизатора в основном и возбужденном триплетном состояниях, соответственно.

Данные литературы о механизме реакций автофотоокисления МЦ540 в растворах противоречивы и требуют дополнительных исследований.

В литературе предполагается, что противоопухолевая активность ФДТ с использованием МЦ540 может быть следствием действия его фотопродуктов. Так, например, обнаружено, что продукты фотоокисления МЦ540, полученные путем облучения данного ФС, способны ингибировать пролиферацию, вызывать апоптоз и некроз различных типов опухолевых клеток в культурах in vitro. Показано также, что введение фотопродуктов МЦ540 мышам с привитыми опухолями, приводит к замедлению роста и деградации опухолей [Gulliya K.S. et al., 1990; Pervaiz S. et al., 1998; Pervaiz S., 2001]. Присутствуют данные о способности фотопродуктов инактивировать in vitro различные типы вирусов [Tran С.С. et al., 1992]. До сих пор остается неясным, могут ли перечисленные биологические эффекты фотопродуктов МЦ540 быть следствием повреждения мембран клеток. В этой связи изучение мембранотоксических свойств фотопродуктов МЦ540 является актуальным.

С другой стороны известно, что одним из механизмов противоопухолевой активности ФДТ, например с такими красителями, как порфирины и хлорины, может быть влияние ФДТ на иммунную систему [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]. Известно так же, что проведение ФДТ с упомянутыми красителями часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Simkin G.O. et al.

1997; Simkin G.O. et al., 2000, Musser D.A. and Oseroff A.R., 2001 J. В литературе отсутствуют данные о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов на иммунную систему также является актуальным.

Цель настоящей работы:

Изучить фотофизические и фотохимические свойства МЦ540 и оценить биологическую активность его фотопродуктов.

Задачи исследования:

1. Изучить методами спекгрофотомерии и спектрофлуориметрии влияние растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540.

2. Исследовать мембранотоксические свойства фотопродуктов МЦ540 (пМЦ540) на модели гемолиза.

3. Изучить действие пМЦ540 на Т-клегочный иммунный ответ in vivo в моделях реакций гиперчувствительности замедленного типа и контактной чувствительности у мышей и сравнить с эффектами фотоокисленного псоралена.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Козырь, Людмила Анатольевна

выводы

1. Обнаружено, что скорость фотолиза МЦ540 в растворах увеличивалась в условиях, благоприятствующих агрегации этого красителя. Так в водпо-этанольных смесях скорость фотолиза возрастала с уменьшением содержания этанола. А в водных растворах она увеличивалась в присутствии солей, экранирующих отрицательно заряженную группу SO3" и таким образом способствующих агрегации. Эти данные указывают па ведущую роль в автофотоокислении МЦ540 реакций типа I.

2. Установлено, что МЦ540 обладает гемолитическим эффектом. Так скорость темнового гемолиза в присутствии 10 мкг/мл МЦ540 возрастала примерно в три раза по сравнению со спонтанным. Выявлено, что МЦ540 в темноте вызывал превращение меггемоглобина (Metí Ib) в другие формы. Фотопродукты МЦ540 обладали меньшей гемолитической активностью и способностью модифицирован, метгемоглобин, чем необлученный МЦ540.

3. Обнаружено, что предоблученный МЦ540 (пМЦ540) способен влиять па Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. При этом пМЦ540 вызывал: а) модуляцию ГЗТ к эритроцитам барана (ЭБ), а именно, при малых дозах облучения вызывалась активация ГЗТ, а при больших дозах - ее супрессия; б) зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к различным гаптенам [2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону].

4. Показано, что супрессия КЧ, вызванная фотоокисленным МЦ540, адоптивно переносится другим животным. В основе иммунного механизма супрессорного действия пМЦ540 лежит угнетение функций клеток-эффекторов и активация клеток с неспецифическим суирессориым действием на КЧ.

5. Обнаружено, что фотоокисленный псорален (ФОП) при его пероральном введении мышам вызывает зависимую от дозы предоблучения супрессию реакции КЧ к ДНФБ. В отличие от пМЦ540 в основе иммунного механизма супрессорного действия ФОП на КЧ лежит активация клеток, специфически угнетающих КЧ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Козырь, Людмила Анатольевна, Москва

1. Красновский А.А., мл. (2001) Синглетный кислород и механизм фотодинамического действия порфиринов в кн. Успехи химии порфиринов. Т. 3, гл. 11, с. 191-216, СПб.

2. Alcindor Т., Gorgun G., Miller K.B., Roberts T.F., Sprague K., Schenkein D.P., F.M. Foss (2001). Immunomodulatory effects of extracorporeal photochemotherapy in patients with extensive chronic graft-versus-host disease. Blood. 98, No.5, p. 1622-1625.

3. Banchereau J., Briere F., Caux C. Davoust J., Lebecque S., Liu Y.J. Pulendran В., Palucka K. (2000) Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. V. 18, p. 767-811.

4. Beischer A.D., Bhathal P., de Steiger R., Penn D., Stylli S. (2002) Synovial ablation in a rabbit rheumatoid arthritis model using photodynamic therapy.

5. A NZ J Surg. V. 72, No. 7, p. 517-22.

6. Bernik D. Tymczyszyn E. DaraioM.E. Negri R.M. (1999) Fluorescent dimmers of merocyanine-540 (MC540) in the gel phase of phosphatidylcholine liposomes. J Photochem Pholobiol V.70, No. 1, p.40-48.

7. Bilski P., McDevitt T., Chignell C.F. (1999). Mcrocyanine 540 solubilized as an ion pair with cationic surfactant in nonpolar solvents: spectral and photochemical properties. J Photochem Photobiol. V.69, No6, p.671-676.

8. Black C.A. (1999) Delayed type hypersensitivity: current theories with an historic perspective. Dermatol. Online J. 5, No.l, p. 7.

9. Bonnett R., McGarvey D.J., Harriman A., Land E.J., Truscott TG, Winfield U.J. (1988). Photophysical properties of meso-tetraphenylporphyrin and some meso-tetra(hydroxyphenyl)porphyrins. J. Photochem Photobiol. V.48, No3, p.271-276.

10. Bouloc A., Cavani A., Katz S.I. (1998) Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. J. Invest. Dermato I. V.III. No.l, p. 44-49.

11. Byeon S.W., Pelley R.P., Ullrich S.E., Waller T.A., Bucana C.D., Strickland F.M. (1998) Aloe barbadensis extracts reduce the production of interleukin-10 after exposure to ultraviolet radiation. J. Invest. Dermatol. V.l 10, No.5, p. 811-817.

12. Cella M., Sallusto 1\, Lanzavecchia A. (1997) Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr. Opin. Immunol. V.9, No.l, p. 1016.

13. Chanh T., Allan J., Pervaiz S., Matthews J., Gulliya K. (1992). Preacktivated MC540 inactivates H1V-1 and SIV-1: potential therapeutic and blood banking applications. J. of A.l.D.S. No.5 p. 188-195.

14. Clarke R.J., Schrimpf P., Schoneich M. (1992), Spectroscopic investigations of the potential-sensitive membrane probe RH421. Biochim Biophys Acta. V.l 112, No.l, p.142-52.

15. Collaud S., Juzeniene A., Moan J. Lange N. (2004). On the selectivity of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX formation.Curr Med Chem Anti-Canc Agents. V. 4, No. 3, p. 301-16. Review.

16. Dall'Acqua F., Vadaldi D. and S. Caffieri (1996) Principles of psoralen photocensitization. In: The Fundamental Bases of Phototherapy (Edited by H. Honigsmann, G. Jori and A.R. Young), OEMF spa, Milano, p. 1-16.

17. Dall'Acqua F., Martelli P. (1991) Photosensitizing action of furocoumarins on membrane components and consequent intracellular events. J.

18. Photochem. Photobiol. B. V.8, No.3, p. 235-254.

19. Davila J., Guliya K., Harriman A. (1989) Inactivation of tumors and viruses via efficient photoisomerisation. J. Chem.Soc Chem Commun. No. 17, p. 1215-6.

20. Davila J., Harriman A., Gulliya K.S. (1991). Photochemistry of merocyanine 540: the mechanism of chemotherapeutic activity with cyanine dyes. J. Photochem Photobiol V.53,Nol,p.l-ll.

21. Dearman R.J., Kimber I. (2000). Role of CD4(+) T helper 2-type cells in cutaneous inflammatory responses induced by lluorescein isothiocyanate. Immunology V. 101, No. 4, p. 442-45 1.

22. Demidova T.N., Hamblin M.R. (2004). Macrophage-targeted photodynamic therapy. IntJ. Immunopathol Pharmacol. V. 17, No. 2, p. 117-26. Review.

23. Dougherty T.J. (2002). An update on photodynamic therapy applications. J. Clin Laser Med Surg. V. 20, No. 1, p. 3-7.

24. Edelson R.L. (1991). Photopheresis: present and future aspects. J. Photochem. Photobiol. B.V. 10, No. 1-2, p. 165-174.