Лазерная фотоионизация ДНК

Гурзадян, Гагик Григорьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лазерная фотоионизация ДНК
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Лазерная фотоионизация ДНК"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Р Г 0 ОД пРавах рук0™™

- 3 ОПТ 1998

ГУРЗАДЯН ГАГИК ГРИГОРЬЕВИЧ ЛАЗЕРНАЯ ФОТОИОНИЗАЦИЯ ДНК

.оо. о г,

4.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук в виде научного доклада

ЕРЕВАН 1996

Работа выполнена в НПО Лазерная Техника при Ереванском государственном университете и в Институте Макса Планка радиационной химии, Германия (Max-Planck-Institut für Strahlenchemie, Mülheim an der Ruhr)

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Бабаян Ю.С.

доктор физико-математических наук, профессор Меликян А .О.

доктор химических наук, профессор Чибисов А.К.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии HAH

Республики Армения

Защита состоится " $0 " С?М 1996 г. в " ¡У " часов на

заседании Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университете (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна 1, Ереванский госуниверситет, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Диссертация разослана " ^ " ^^-¿/¿^ 1996 г.

Ученый секретарь Специализированного

Совета, кандидат биологических наук Гонян С.А

DNA is the beginning and the end.

M. Simic

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Воздействие УФ излучения на одну из самых важных биомолекуд дезоксирибснгуклеиновую кислоту (ДНК), привлекает внимание исследователей несколько десятилетий (Wang S.-Y., 1976). Подавляющее большинство работ посвящено исследование фотохимии и фотобиологии нуклеиновых кислот при облучении ртутной лампой низкого давления. Длина волны УФ излучения при этом (254 нм) попадает на первую электронную полосу поглощения, что приводит к возбуждению первого электронного синглетного уровня S\ (Fisher GJ. and Johns H.E., 1976, Patrick M.H. and Rahn R.O., 1976, Patrick M.J., 1976, Jagger J., 1976, Harm W„ 1980, Mitchell D.L. and Nairn R.S., 1989, Helene С., 1987, Sage E., 1993). Появление мощных нано- и пикосекундных лазеров генерирующих в УФ диапазоне позволило значительно расширить спектр исследуемых эффектов (Nikogosyan D.N., 1990, Cadet J. еа, 1987, Schulte-Frohlinde D. ea, 1990, Angelov D.A. ea, 1991). В частности, при высоких интенсивностях лазерного УФ излучения {длина волны 248-266 нм) происходит двухступенчатое поглощение излучения с возбуждением высоколежащих электронных уровней S]\j молекул оснований нуклеиновых кислот и последующей ионизацией (Angelov D.A. ea, 1980, Gurzadyan G.G. ea, 1981, 1982, Zavilgelsky G.B. ea, 1984, Nikogosyan D.N., 1982, 1990). Использование эксимерного ArF лазера (длина волны 193 нм) позволяет однокванггово ионизовать ДНК и ее компоненты (Candeias L.P. еа, 1992, Gömer еа, 1992, Gurzadyan G.G. and Görner H., 1992). Таким образом, с помощью лазерного излучения появляется возможность реализовывать химические и биологические процессы, свойственные ионизирующей радиации. Следует заметить, что в случае -/-облучения падающая энергия поглощается как биомолекулами, так и водой; более того, эффект косвенного действия (за счет ионизации и диссоциации воды и участия образующихся реахционноспособных радикалов в химических превращениях) в случае нуклеиновых кислот является главным. При лазерном же облучении происходит избирательное возбуждение хромофоров нуклеиновых кислот -азотистых оснований, с последующей ионизацией. Принципиальным отличием лазерного возбуждения (одноквантового с 193 нм и двухквантового с 248-270 нм) является возможность направленного воздействия в клетке на

нуклеиновые кислоты, не затрагивая при этом других компонент (белки, липиды).

Как известно, у-радиолиз ДНК приводит к образованию целого ряда повреждений вторичной структуры ДНК: одно- и двунитевых разрывов, разрывов N-гликозидной связи, межшггевых сшивок (von Sonntag С., 1987). Гидратированный электроп и катион радикал основания, возникающие при лазерном возбуждении ДНК, могут привести к аналогичным эффектам. В то же время, дезактивация высоколежащих электронных . уровней после возбуждения с ВУФ (в случае 193 им: S2) приведет к заселению первого возбужденного S] уровня с последующим образованием "классических" фотопродуктов, специфичных для возбуждения с 254 им: пиримидиновых димеров циклобутанового типа (5,6-дипиримидинов), фото гидратов и пиримидин(6-4)пиримидон аддуктов ((6-4)фотопродуктов). Таким образом, при возбуждении с миной волны 193 им будут образовываться два класса фотопродуктов: специфичных для у-радиолиза и классического УФ облучения. Широкое применение ArF лазеров в медицине и хирургии актуализировало изучение механизмов воздействия лазерного излучения с длиной волны 193 нм (6.4 эВ) на ДНК, плазмиды, бактерии (Johnson-Tompson М. еа, 1984, Wrackler К. еа, 1988, Rasmussen R.E. еа, 1989, Kochevar еа, 1989, 1990, 1991).

Эта проблема находится на стыке квантовой электроники, лазерной спектроскопии, молекулярной биофизики, фотохимии и фотобиологии. Выяснение молекулярных механизмов воздействия ионизирующего лазерного излучения на ДНК открывает новое направление в лазерной биомедицине связанное с использованием "неклассических" источников ионизирующего излучения - УФ и ВУФ лазеров.

Следует также отметить, что длина волны 193 нм попадает на край поглощения как воды (все эффекты исследуются в нейтральном водном растворе), так и используемых оптических элементов (линзы, призмы, кристаллы). В то же время, под действием мощного лазерного излучения пикосекундной длительности с длиной волны 210-270 нм в прозрачных средах могут иметь место различные нелинейные эффекты (например, двухфотонное поглощение). Изучение указанных эффектов представляется чрезвычайно актуальным для корректной интерпретации полученных результатов с биомолекулами, в частности, с нуклеиновыми кислотами.

Цель исследований: всесторонне исследовать фотофизику й фотохимию нуклеиновых кислот и их составляющих в условиях ионизации под действием

лазерного "УФ излучения с длинами волн в диапазоне 193-270 нм и провести

сравнительный анализ полученных результатов с таковыми классического низкоинтенсивного УФ облучения (254 нм). Для этой цели:

- создать^ источник лазерного излучения пикосекундной длительности в ультрафиолетовом диапазоне спектра с контролируемыми параметрами генерируемого излучения;

- исследовать нелинейные эффекты в воде под действием мощного пикосекундного лазерного излучения; ,

- исследовать фотофизику воздействия лазерного излучения на нуклеиновые кислоты, измерить квантовые выходы ионизации ори одно- и двухквантовом возбуждении;

- выявить и исследовать фотопродукты и фотоповреждения, образующиеся при ионизации ДНК; измерить квантовые выходы их формирования;

- методом фотолиза определить эффективность безызлучательной внутренней конверсии со второго на первый возбужденный синглетиый уровень нуклеиновых кислот;

- определить промежуточные звенья в цепи образования летальных повреждений в плазмидах;

- выявить механизм инактивации плазмид и бактерий при возбуждении с длиной волны 193 нм, определить биологическую роль разрывов цепей ДНК; выявить различие протекания репарационных процессов в плазмидах и бактериях;

Научная новизна.

.- выведены новые приближенные формулы дчя расчета углов синхронизма в нелинейных кристаллах; их точность превышает точность других имеющихся в литературе аналогичных формул;

- обнаружен новый эффект нелинейной дефокусировки лазерного излучения в нелинейно поглощающих средах;

- выявлен одноквантовый механизм ионизации молекул нуклеиновых кислот при лазерном возбуждении с 193 нм;

- систематически исследована фотохимия и фотобиология нуклеиновых кислот при облучении с 193 нм; выявлено образование целого класса фотопродуктов/ фотоповреждений (разрывы цепей ДНК, межнитевые сшивки, разрывы Ы-гликозидной связи, локальные денатурированные участки) с высоким квантовым выходом; выявлен ионизационный механизм формирования этих фотопродуктов;

впервые исследована инактивация четырех штаммов бактерий Е. coli с различными дефектами в репарационной системе при лазерном облучении с длиной волны 193 и 216 нм, выяснен механизм их инактивации; выявлено, что

основной мишенью является ДНК; основными легальными фотопродуктами в случае облучения Е, coli К12 АВ2480 (uvrA гесА), дефектной относительно эксцизисяшой и постреплнкативной репарации, являются пиримидиковые димеры; в случае же облучения AB 1157 (дикий тип) основными летальными фотопродуктами являются продукты ионизации: однонитевые разрывы цепей ДНК, разрывы N-гликозидной связи, разрушение нуклеотидов; - впервые измерена эффективность S2 —> S] перехода для ряда модельных компонентов нуклеиновых кислот: ТрТ, UpU, СрС, CpU, dCpT;

Практическая ценность работы:

1. Новый метод измерения чириа пикосекундного излучения.

2. Новые формулы для расчета углов синхронизма в нелинейных кристаллах.

3. Новый метод определения коэффициента двухфотонного поглощения с помощью эффекта нелинейной дефокусировки лазерного излучения.

4. Ионизация молекул нуклеиновых кислот с помощью мощных УФ лазеров.

5. Лазерно-индуцированное эффективное образование одно- и двунитевых разрывов цепей ДНК, ковалснтных межнитевых сшивок, свободных оснований, локальных денатурированных участков.

6. Механизм инактивации плазмид и бактерий Е. coli при лазерном облучении с длиной волны 193 нм.

7. Выявление роли разрывов цепей ДНК как основного звена в цепи образования летальных повреждений при облучении с 254 и 193 нм.

8. Методика определения эффективности внутренней конверсии со второго на первый возбужденный синглетный электронный уровень с помощью лазерного фотолиза.

Практическая ценность работы также обуславливается широким использованием ArF эксимерных лазеров в медицине (в частности в глазной хирургии) и необходимостью учитывания имеющих место при этом нежелательных эффектов (ионизационные повреждения: разрывы ценой ДНК, сшивки и т.д.). Результаты полученные в приведенной работе нашли широкое применение в различных научных лабораториях мира (Wellman Laboratories of Photomedicine, Massachusetts General Hospital, USA; Max-Born Institute for Nonlinear Optics and Short Puke Spectroscopy, Berlin; Humboldt University of Berlin, Germany; CEA-Saclay, Gif-sur-Yvette, France; Trinity College,

Dublin, Ireland; Science Applications International Corporation, Ohio, USA; и др.), что также подтверждается наличием множества цитирований на публикации автора (около 100 за период 1990-95).

Апробация работы. Основные положения и результаты были доложены на IV Internet. Symp. "Ultrafast Phenomena in Spectroscopy" (GDR, 1985); Респ. конференции молодых ученых и спец., Тбилиси, 1986; 4 координ. семинара "Динамика и активность биол.макромолекул: лазерный и. компьютерный эксперимент", Ереван, 1988; 5th symposium on optical spectroscopy, SOS, Eisenach, GDR, 1988; 3rd Congress of the European Society for photobiology, Budapest, 1989; 4th National Conference "Laser and their applications", Plovdiv, Bulgaria, 1990; Internat. Conference on Laser in the Life Sciences, Guangzhou, China, 1990; 4th Congress of the European Society for photobiology, 1-6.9.91, Amsterdam, 1991; 5th Congress of the European Society for photobiology, 19-26. 9. 1993, Marburg; Radiation chemistry annual meeting, Munchen, 1993; 13.Vortragstagung der GDCh, Berlin, 1993; XV IUPAC Symposium on Photochemistry, July 17-22, 1994, Prague; 6th Congress of the European Society for Photobiology, 3-8. 9. 1995, Cambridge, 1995; International Conference of Radiation Chemistry, Sept. 1995, Wur/burg; на семинарах в Max-Planck Institute fur Strahlenchemie, Mulheim an der Ruhr, Germany; CEA Saclay, France; Humboldt University of Berlin, Germany; Max-Bom Institute of Nonlinear Optics and Short Pulse Spectroscopy, Berlin; Institute of Radiation Biology, DLR, Cologne, Germany; в НПО Лазерная техника, Ереван; на кафедре молекулярной физики ЕГУ, Ереван; в Институте экспериментальной биологии АН Армении, Ереван; и др.

Публикации. Результаты и положения диссертации опубликованы в 44 работах, включающих 2 монографии и 26 статей в журналах (15 в международных).

Структура диссертации. Диссертация изложена в виде научного доклада.

2. Экспериментальные методы и материалы

2.1 Пикосекуилный Nd:YAiO-} лазер с преобразованием излучения в 4 и 5

гармонику

Экспериментально исследовалась генерация гармоник излучения пикосекундного Nd:YA103 лазера тремя различными способами в кристаллах

КДР и пентабората калия (КВ5). Лазер состоял из генератора с пассивной синхронизацией мод на красителе 3274у, системы выделения одиночного импульса I! двухкаскадного усилителя на кристаллах Ис1:УА10з . На рис. 1 приведены схемы установок д\я генерации пятой гармоники.

а, ы, ы, ы, ш,

' вч^в-

1 ' { 1 ; s

-&LJ-S

Ц n 1 UJf

1 (tlt 1 1 bit ь s

Рисунок 1.

В первом случае энергия излучения пятой гармоники 216 нм составляла 40 мкДж. Энергия измерялась калиброванным пироприемником. Во второй схеме энергии четвертой и пятой гармоник составляли, соответственно, !,6 мДж и 50 мкДж при суммарном коэффициенте преобразования в пятую гармонику 0,08%. Третья схема, наиболее оптимальная, где вместо кристалла КВ5 использовался КДР, позволяет генерировать излучение с 216 нм до 0,45 мДж при коэффициенте преобразования 0,75%. Эффективность достигается как большими нелинейностями КДР и угловой ширины синхронизма для генерации пятой гармоники, так и меньшим поглощением КДР на 216 нм по сравнению с КВ5: 0,07 и 0,12 см'' соответственно.

2.2 Генерация второй гармоники в кристалле ВВО

Кристаллы p-бората бария f5-BaB2C>4 (ВВО] облают многими замечательными свойствами, позволяющими эффективно их использовать для преобразовании частоты в нелинейных устройствах (Chen С. са, 1981). Эффективный коэффициент генерации второй гармоники ВВО в 5-6 раз выше, чем у монокристаллов КДР (Cheng L.K. еа, 1988). Кристаллы имеют широкую область прозрачности 190-3500 нм, высокий порог разрушения. С использованием элемента из монокристалла ВВО толщиной 1.6 мм исследовалась генерация второй гармоники шзхосекундного лазера на Nd:YA103 с пассивной синхронизацией мод: длина волны 1.08 мкм, длительность импульса 15 пс, энергия одиночного импульса 1 мДж. Ддя

в >

сравнения эффективности преобразования также исследовалась генерация второй гармоники в кристаллах ШО3 (Ь = 6.4 мм) и КДР (Ь = ■ 14.6 мм). Используя приближение заданного поля при небольших преобразованиях и литературные значения нелинейных коэффициентов получены соотношения между коэффициентами преобразования в исследуемых кристаллах:

(и I о3)/^ (вво) - г 1 1( \а>?щ (вво) = аз

что достаточно хорошо согласовывалось с экспериментальными результатами.

Коэффициент преобразования в ВВО при шгтеисивиостях излучения 2 ГВт/см2 составлял 6.1% (с учетом френелевских потерь и поглощения в кристалле 9%). Экспериментально измеренная угловая ширина синхронизма в ВВО (1.6 мм) равнялась 2й0 — (3.07 + 0.15) мрад. Порог поверхностных повреждений при воздействии одиночных лазерных импульсов при 1.08 мкм составлял 250-350 ГВт/см2, а при 0.54 мкм - 120-150 ГВт/см2.

2.3 Новые формулы для расчета углов синхронизма

В случае скалярных взаимодействий типа еое, оее и еео нахождение углов синхронизма сводится к решению уравнения четвертой степени относительно , поэтому обычно расчет углов синхронизма производится

методом последовательных приближений на ЭВМ. Для углов синхронизма 0С и. |9С в литературе имеются приближенные формулы, но они очети. громоздки и не дают необходимой точности (Дмитриев В.Г. и Тарасов Л.В. 1982). Нами получены приближенные формулы для , < 11

точные аналитические выражения для , , . В таблицах 2

и 3 приведены соответствующие формулы для одноосных и двухосных кристаллов.

Таблица 1. Формулы для расчета углов синхронизма в одноосных кристаллах.

.Отрицательны«- одно. кристаллы Положительные* одноосные кристаллы

1 — 11 — и 1 'К "с ~ и —Э

1 — 1Г-- V Й 1 —V *„2 ___- 'К °С - V — У

1 — г— и <1 1 — Т 0

Обозначения: У - (Л f В)г1С11? (А -)- В)г/Г»; Я -= (А • /?)'/(О + В)"-; С> = (А -Ь + В)Ч{А + £)*; 5---- М~Я)»/(0 -}-£)»: V = ВгЦС — Л)г. У — (В/Е)г; Т = Аг/(С — В)1;

Следует отметить, что ошибка составляет 0.1-0.2°, что намного превышает обычную ошибку вырезания кристалла по направлению синхронизма. Это обуславливает практическую ценность полученных выражений.

Таблица 2. Формулы для расчета углов синхронизма в двухосных кристаллах.

Формулы для расчета углов синхронизма е двухосных кристаллах при распространении излучения в глазных плоскостях

= с" о ¿

о • = Л К ь 2 * 1 » в и с « Формулы Обозна

и 5* н

оос 1 —у А = "м V Лг С --■= "из V пхз

XV Си? ! — и 'б1 Ф «« ц?^ А- '■1' ••2 С - "т Аз ' «я V "*3 Аз

оее 1 — и ^ 9 вг^ пп V лг с = Аз ' £ — V F = а,

5 с э . С а гс с - л п о 2 в * 4>0|<м}лы . Обозначении

<зсн и с Н ^

его „ 1 - у л = "01 Р,^ С "И Аз АГ Я = "и А,"

У2 оео „ 1 ->"' А = В = А* С - Аз "г!

€00 „ I - т А ^ «я я, £=. "И Яа с = ».» А» «г! А,

к оое , 1 - и = и/— 1 А = "я Аз В = пк Аг с ~ Аэ Аз

л кг 0 < еое , 1-и А = В ^ пЯ1 А," с - "я А3 £> = А) ^ Г "«» Аз

А с оее л '-и А ^ Аз В = Лг С "ч Аз £ А,"' ? = "хг А,!

еео „ ' — у А =-- А, в - "хг А2 с = А3 "и АГ £ = 5а А,

хг оео А = А> П*2 А* с = "И Аз Е — Лгз Аг

еоо 1 —г «е'в-тсгг А = с« "уз Аз 0.- "и А,

ХУ его оео еоо 1 — и 1— V 1-7 . "я Л==1Г в в в Лу л, «гг Лг, Аз ~ "гз ^ л» Лз л, Л, 4 = А; н

уг о ое еое оее о 1 1 -и ' А, ' в -= В- я = "тг Лг пУг А,* _ "1/3 с - Л, - "В5 с - А, г пиз С- X,- пгз '•г /»2 "гз Пгз ~ А,

его а ,, п>п '•I ч.а А,

хг б < VI оео 1— V 'б-'О- 1/_К л1 ^хг л2 ' Лз 1 - X,

£00 I —г я = X»' А3 -- А,.

X = £

а • ^ =

« ► 1 мулы Обозначении

о - п о

о еН и 5 н <

Х2 0> V.

е ^

1 — иг- и 1 А = "я >ч В = "д/г А» С-. £ А,

1 — У Л Л = ь» А. л = яя А, е.- Аз О --= Р Г, Аз

1 — и ч /1 -= Пщ Аг ' ПД2 А,' С = >•3 ' ^ = "гз Аз

Обща) об о з и а ч с н и «: и = 1 Л)'/С». V - (А +- В) ЧГ'. К «•- 1Л +111 -ЛО + В)'. (?я.М4

еое

2.4 Новый метод измерения чирпа излучения пикосекундного лазера

С помощью нелинейного динамического спектрографа с временным разрешением 0.1 пс и спектральным 0.02 нм измерен чирп пикосекундних импульсов лазера на фосфатном стекле с неодимом ла длине волны 1.054 мкм. Схема экспериментальной установки приведена на рис. 2а.

¡1

Рисунок 2а.

Лазер 1 на фосфатном стекле с пассивной синхронизацией мод генерировал цуг импульсов, один из которых выделялся с помощью ячейки Поккельса 2 и усиливался в усилител^ 3. Телескопом 4 пучок расширялся до 15 мм в диаметре и направлялся на автокорреляционный измеритель длительности ультракоротких импульсов 5 совмещенный со спектрографом 7. Принцип действия нелинейного динамического спектрографа иллюстрирует рис. 26.

Рисунок 26. Взаимодействие пучков в нелинейном кристалле.

На рис. 3 и 4 приведены расчетные и экспериментально полученные динамические спектрограммы в случае спектрально-ограниченных импульсов (а) и импульсов с чирпом за счет фазовой модуляции (б, в, г). Измеренные значения чирпа ультракоротких импульсов вблизи центральной части лазерной частоты для приведенных динамических спектрограмм составляют соответственно, 1,21, 0.37 и 0.15 нм/пс (рис. 4 6, виг).

2.5 Измерение чирна пикосекундного континуума

Нелинейно-динамический спектрограф, описанный в предыдущем параграфе, использовался также д\я исследования спектрально-временных характеристик пикосекундного континуума. Рисунок 5 иллюстрирует экспериментально полученную линешгую зависимость частоты излучения пикосекундного континуума вблизи частоты накачки от временной задержки. Отметим, тго в диапазоне 1.01 - 1.17 мкм в зависимости от параметров импульса накачки чирп изменяется от 250 см"'/пс до 800 cm~*/iic. Результаты указывают на то, что основным механизмом генерации спектральных компонент пикосекундного континуума вблизи частоты накачки в нашем случае является фазовая самомодуляция.

Рисунок 5.

2.6 Авухфотонное поглощение УФ излучения в кристаллах

Основным механизмом нелинейных потерь в оптических элементах (линзах, призмах, кристаллах) является двухфотояное поглощение. Нами измерены коэффициенты двухфотонного поглохцения кристаллов' дигидрофосфата калия (КДР), пентабората калия (КВ5О8 • 4Н2О), кристаллического и плавленного кварца на длинах волн 270 и 216 нм. Нелинейное поглощение определялось по зависимости обратного пропускания образцов от интенсивности падающего излучения. В качестве источника лазерного УФ излучения использовался лазер на YA103:Nd3 + (1.08 мкм) с пассивной синхронизацией мод и с преобразованием частоты в четвертую (270 нм) и пятую гармонику (216 нм). Процесс двухфотонного поглощения описывается следующим уравнением:

¿1/Лъ = ylz

где d и J3 соответственно, коэффициенты линейного и двухфотонного поглощения, I интенсивность падающего излучения. В таблице 3 приведены результаты экспериментов для 270 и 216 нм в предположении Гауссовской формы импульса; для сравнения приведены также литературные значения коэффициентов ДП на других длинах волн (Liu Р. еа, 1978, 1979, Ross I.N. еа, 1989).

Таблица 3 Коэффициенты двухфотонного поглохцения ß, 10"10 см/Вт

КДР КВ5 плавленный кварц кристалличес кий кварц

355 нм 0.059 - 0.0125 -

270 нм 2.8 3.5 <0.2 <0.15

266 нм 2.7 - 0.17-0.45 0.45

216 нм 6 6.5 5 4

На рис. 6 приведен соответствующий график для КДР. Как видно, кривая двухкомпонентна: имеется начальный крутой подъем с переходом на пологий наклон. Это явление объясняется следующим образом: двухкваотовое поглощение кристалла следует рассматривать как комбинацию двухфотонного поглощения кристаллической решетки и двухквантового поглощения примесей, имеющихся в кристаллах. Двухквантовое поглощение в этом общем случае описывается следующим уравнением: n 2

d I /J г - (егдт) )/(i+ folr) ) ~fl

где N0 и Ыл населенности начального и промежуточного уровней

1А

!, ГВт/см2

Рисунок 6.

примесей, Cfj и <о"г -сечения первого и второго .-электронных переходов, соответственно, % ~ время жизни промежуточного уровня. Решая уравнение численным методом согласие с экспериментом полутом при ß> — (3.4 + 0.4) J 0-Ю см/Вт и ff¡T — (6,5 + 3) 10"26 см2 с Следует отметить, что первый член в уравнении ответственен за начальную кривизну кривой, а второй -за общий наклон. Этот факт указывает на то, что для корректного определения коэффициента двухфотонного поглощения необходимы достаточно большие интенсивности излучения: > 0,5 ГВт/смЯ

2.7 Другие источники УФ излучения: Nd:YAG лазер, эксимерный ArF лазер, ртутная лампа

В экспериментах в основном использовался коммерческий эксимерный ArF лазер (Lambda Physik, EMG 200), генерирующий на длине волны 193 им импульсы длительностью 10 не. Энергия одиночного импульса составляла 0.01-10 мДж, что соответствовало интенсивности излучения 10^ - 10^ Вт/см'^. Энергия одиночных импульсов измерялась с помощью откалиброванного детектора (Laser Instr., 14 NO).

В экспериментах но двухквантовому возбуждению ДНК использовался пикосекундный Nd.YAG лазер с преобразованием излучения в четвертую гармонику: 266 нм, 30 пс, 10 мДж (Крюков П.Г. и др, 1978). В исследованиях

инактивации бактерий использовалась также пятая гармоника наносекундного Nd:YAP лазера (216 нм, энергия 0.01-1 мДж, интенсивность 0.005-0.5 МВт/см2).

В качестве источника низкоинтенсивного УФ излучения использовалась ртутная лампа низкого давления с фильтром, отсекающим длины волн меньше 200 нм, длина волны излучения 254 нм, интенсивность 0.1 - 1 мВт/см2.

Облучение препаратов ДНК и водных растворов компонентов нуклеиновых кислот проводилось в кварцевых кюветах с оптической толщиной 1 см. Оптическая плотность растворов составляла 0.2-0.8; исключение составляет случай определения лазерно-индуцированных свободных оснований при облучении полинуклеотидов: в этом случае оптическая плотность на длине волны облучения составляла А = 4 - 8 в 1 см. Для абсорбционных и флуоресцентных измерений использовались, соответственно, спектрофотометр Perkin-Elmer 554, СФ-46 (ЛОМО) и спектрофлуориметр Perkin Elmer, LS5. Все исследования проводились в нейтральном водном растворе при рН 6.6-7.2 при 23 + 2°С.

2.8 Методы определения фотоповреждений ДНК

Детектирование неповрежденных оснований проводилось путем измерения поглощения на 260 нм после разделения свободных оснований от остального материала с молекулярным весом более 3000 Д центрифугированием (Beckman J2-21) в центриконе 3 (Amicon, Danvers, MA) и далее жидкостной хроматографией (ЖХВД). Для ЖХВД использовалась колонка Nucleosil 5-С18 с 5 мМ КН2РО4 мобильной фазой + 1% метанол и Shimadzu SPD-6AV детей-op. Квантовый выход разрыва N-гликозидной связи вычислялся из отношения количества детектированных свободных свободных оснований и количества поглощенных квантов.

Разрушение нуклеотидов исследовалось путем проведения ЖХВД УФ облученных препаратов ДНК (А = 1 на 260 нм) после гидролиза с нуклеазой Р1 при 37° С в течение 2 часов. Образующиеся 5-монофосфаты детектировались на длине волны 260 нм, квантовые выходы вычислялись с учетом поглощения всего ДНК. Потеря хромофора регистрировалась по уменьшению поглощения на максимуме первой электронной полосы (250-270 нм). Соответствующий квантовый выход рассчитывался в предположении отсутствия поглощения образующихся фотопродуктов на длине волны регистрации.

Для определения одно- и двунитевых разрывов ДНК плазмиды использовался гель электрофорез фирмы Pharmacia (GNA-100); гель

окрашивался бромидом этидия (0.5 мкг/мл), негативы поляроида сканировались на денситометре Sigma, FTR-20, далее количества трех форм плазмиды измерялись с использованием компьютерной программы (Aboul-Enein A. and Schulte-Frohlinde D., 1988).

Выживаемость плазмиды определялась по трансформации бактериальных штаммов Е, coli К12 AB 1157 (дикий тип по репарации), AB 1886 (uvrA"), АВ2463 (гесА") и АВ2480 (uvrA" гесА") СаОД методом с небольшой модификацией (Cohen S.N. еа, 1972, Gurzadyan G.G. еа, 1993). г

Количество межнитевых сшивок и локальных денатурированных участков определялось с использованием флуоресцентного метода с красителем акридин оранжевый (Завильгельский Г.В. и др., 1964). Детектирование (6-4)фотопродуктов проводилось методом флуоресцентной спектросхопии. Оптически толстые растворы УФ облученной ДНК тимуса теленка (А = 6 в 1 см) возбуждались на длине волны 330 нм и флуоресценция детектировалась в районе 420 нм.

В исследованиях возникновения разрывов цецей ДНК в протеиновом экстракте из Е. coli Kl 2 AB 1157 использовался метод выделения экстракта согласно Lu A.L. еа, 1983 с некоторой модификацией (Ventur Y. 1992). Подробно условия проведения эксперимента описаны в Gurzadyan and Schulte-Frohlinde, 1994. Инактивация бактерий Е. coli К12 исследовалась методом микроколоний, фотореактивация проводилась с использованием излучения с 366 нм (флуоресцентная лампа Osram L с фильтрами).

2.9 Используемые материалы

Использовалась плазмида pBR322 (4360 пар оснований) и pTZ18R (2871 пар

оснований) от Boehringer (Mannheim) и Pharmacia (Freiburg), соответственно. ДНК тимуса теленка была от Serva (Heidelberg) (в экспериментах по высвобождению оснований) и Merck (Darmstadt) (во всех остальных случаях). Использовались также poly С, poly A, poly U из Boehringer, poly G, poly dU из Pharmacia, мономеры нуклеиновых кислот (основания, иуклеозиды, иуклеотиды) из фирм Merck, Reidel-de Haen, Sigma или Aldrich/EGA. Все использованные дияухлеотид-фосфаты (UpU, ТрТ, СрС, CpU, dCpT) были из фирмы Sigma. Бактериальные штаммы E.coli К12 ABl 157 были от E.A.Adelberg (через B.Bachmann, Genetic Stock Center, Yale University); AB1886 от Devoret (через W.Wackernagel, University of Oldenburg); AB2463 от W.Wackemagel, AB2480 от B.D.Michael (Gray Laboratory). Вода была от системы Millipore (Milli Q).

3. Нелинейные эффекты в воле 3.1 Двухфотонное поглощение

При высохоинтенсшшом пикосекунднои облучении с 266 - 316 нм вода поглощая два УФ кванта приобретает энергию 7.9-9.3 зВ, что достаточно ддя ее ионизации и диссоциации (Ангелов Д.А. и др, 1981, Nikogosyan D.N. and Angelov D.A., 1981, Никогосян Д.Н., 1987):

H20*.....> Н20 + + е- ,

н2о-.....> НЧ ОН".

За время 3*10~13 с электрон гидратируется (Wiesenfeld J.M. and îppen E.P. 1980): '

e*-----> eaq' .

Далее за время порядка 10*13 с катион радикал воды реагирует с молекулой воды (Swallow A.J., 1973):

н2о+ + н2о .....> н3о+ + ОН*.

Экспериментально определялась зависимость квантового выхода двухфотошюй ионизации воды (образования гидратированного электрона) от длины волны лазерного УФ излучения (Gurzadyan G.G. еа, 1982): на длине волны 266 нм он равен <J>j 0.15 + 0.02 и уменьшается в 10 раз при переходе к длине волны 316 нм. Порог ионизации жидкой воды равен 6.5 £ 0.5 эВ (Nikogosyan D.N. еа, 1983), что больше энергии кванта излучения с 193 нм (6.4 эВ). Квантовый выход диссоциации воды на длине волны 266 нм равен 0.13 ± 0.07 (Nikogosyan D.N. еа, 1983). Отметим, что максимальный квантовый выход ионизации и диссоциации в случае двухфотонного поглощения, может равняться 0.5.

Таким образом, за время лазерного пикосекундного импульса образуются eaq" , H3O+, Н*и ОН. Возникает "косвенный" канал фотолиза нуклеиновых кислот, который необходимо учитывать в экспериментах по фотохимии с использованием пикосекундного УФ излучения.

3.2 Нелинейная дефокусировка лазерного УФ излучения

Поглощение лазерного излучения (линейное или нелинейное) в отсутствие процессов переизлучения (флуоресценция, фосфоресценция) приводит в конечном счете к нагреванию среды. Показатель преломления среды в этом случае можно представить в виде

л(Т)= л0+ (Эи/ЗТ)лТ

где По показатель преломления невозмущенной среды, дТ возмущение температуры в поле волны. В случае Эи/ЭТ>0 имеет место самофокусировка, при Эп/ЭТ<0 расфокусировка (или дефокусировка) (СЫао И. еа, 1964). Нами обнаружен и исследован эффект нелинейной дефокусировки пикосекундного лазерного УФ излучения с длиной волны 216 нм в воде вследствие нелинейного (двухфотонного) поглощения. Нами предлагается новый метод измерения коэффициента двухфотонного поглощения на основе эффекта нелинейной дефокусировки излучения. Возбуждение осуществлялось с помощью пятой гармоники излучения пикосекундного лазера на алюминате иттрия 216 нм, 15 пс; визуализация эффекта достигалась с помощью пучка Не-Ые лазера типа ЛГ-72 с длиной волны 633 нм и Р= 1 мВт (рис. 7а).

Рисунок 7а.

Для оценки угла расфокусировки в геометрическом приближении получена следующая формула:

д—1 X т Ь _ __ Т

ът су ' -Ч1 +

где А к ^ коэффициенты линейного и двухфотонного поглощения, X-интенсивность пучка, £ -длина взаимодействия. В отсутствие двухфотонного поглощения зависимость Д 0 от интенсивности линейная, а наличие приводит к нелинейной зависимости, причем при 6$-<(- £ О эта зависимость квадратичная, что хорошо согласуется с полученными

эксперимента,льными кривыми для этанола и воды. Из уравнения

рефракции с учетом температурной зависимости показателя преломления получена формула для изменения интенсивности зондирующего пучка:

Н0= [ 4 Вп X Г 1 / а Л Л]

т еХР\щагдТср1Р+а110\Ш+«1Ыыр{а[)-р} )

где М/М нормированная интенсивность дефокусировавшего излучения в осевой части. В случае расфокусировки в воде (рис. 76) наилучшее согласие с

Рисунок 76.

3.3 Тепловые эффекты при мощном лазерном облучении ДНК

Одним из важных аспектов лазерной фотохимии и фотобиологии является выявление роли тепловых эффектов. Эффект нелинейной дефокусировки лазерного излучения позволяет определить вариации показателя преломления ДП. и локальное изменение температуры лТ в облучаемом участке водной среды. При 1 = 5 ГВт/см2, для дП. получена величина 10"^ и для дТ = 0.12°С. Эти результаты достигнуты в чистой воде при двухфотонном поглощении излучения (50% поглощенной энергии). Следует отметить, что 8 случае облучения ДНК в водном растворе с А=0.4 приведенные оценки для температурных вариаций будут такие же, как для случая—воды. Таким образом, при высокоинтенсивном пикосекундном лазерном облучении бяомолекул в воде температурными эффектами можно пренебречь вплоть до интенсивностей в несколько ГВт/с.мЯ

4. Лазерная фотофизика ДНК 4.1 Одно- и двухступенчатое возбуждение

При высошггенсивпом пикосекундном лазерном облученин ( J = 1-10 ГВт/см^) с длиной волны 216-270 нм происходит двухступенчатое возбуждение высоколежащих синглетных электронных уровнен Sjsj молекул оснований нуклеиновых кислот через промежуточный уровень Sj (Nikogosyan D.N. and Letokhov V.S., 1983, Zavilgelsky G.B. ea, 1984) (рис. 8a). При яаносекундном облучении с 1= 0.1-1 МВт/см^ происходит двухступенчатое возбуждение высоколежащих триплетных уровней Tnj через "промежуточный уровень Т). При этом энергия двух квантов (8-10 эВ) выше порога ионизации оснований нуклеиновых кислот в водной среде, 5.5-6.8 эВ (Rubin LB. ea, 1981), что приводит к его ионизации и реализации химических реакций с высоким квантовым выходом.

Под квантовьда выходом фотореакции (как одноквантовой, так и двухквантовой) подразумевается отношение числа прореагировавших молекул к числу поглощенных квантов излучения. При таком определении становится возможным сравнивать между собой квантовые эффективности одноквантовой и двухквантовой фотореакций, а также выявлять rot относительный вклад по их зависимости от интенсивности облучения.

Хорошо известно, что в классическом случае низкоинтенснвпого УФ-облучения квантовый выход фотореакции является величиной постоянной, не зависящей от интенсивности облучения (закон Бунзена-Роско, см. Смит К., Хэнеуолт, 1972). В то же время квантовый выход двухквантовой фотореакции возрастает пропорционально росту интенсивности вплоть до насыщения одной из ступеней двухступенчатого процесса возбуждения (Nikogosyan D.N. ea, 1982).

Линейная зависимость квантового выхода разложения оснований нуклеиновых кислот от интенсивности 216 нм пикосекундного лазерного излучения с последующим насыщением (пример для аденина показан на рис. 86) указывает на двухступенчатое возбуждение через промежуточный уровень S2- Как было уже указано выше, энергия одного кванта лазерного излучения с длиной волны 193 нм (6.4 эВ) достаточна д\я ионизации ДНК и компонентов (но недостаточна для ионизации воды, см. раздел 3.1) . Таким образом, облучение с 193 нм приводит к одноквантовой ионизации ДНК (подробнее в разделе 4.2).

Рисунок 8а.

-10 9 8

6 5 4

2 А О

Интенсивность, ГВт/см?

Рисунок 86.

При двухступенчатом возбуждении ДНК с длиной волны 266 им наблюдается также следующее явление: интенсивности насыщения двухквантовых эффектов (например, образования однонитевых разрывов) в биополимерах ДНК значительно меньше таковых в случае отдельных компонент ДНК: оснований, нуклеозидов, нуклеотидов (Гурзадян Г.Г. и

4. Лазерная фотофизика ДНК

4.1 Одно- и двухступенчатое возбуждение

При высоинтенсивном пикосекундном лазерном облучении ( J = 1-10 ГВт/см2) с длиной волны 216-270 нм происходит двухступенчатое возбуждение высоколежащкх синглетных электронных уровней Sfj молекул оснований нуклеиновых кислот через промежуточный уровень Sj (Nikogosyan D.N. and Letokhov V.S., 1983, Zavilgelsky G.B. ea, 1984) (рис. 8a). При наносекундиом облучении с I~ 0.1-1 МВт/см^ происходит двухступенчатое возбуждение высоколежащкх триплетных уровней Tjsj через" промежуточный уровень Tj. При этом энергия двух квантов (8-10 эВ) выше порога ионизации оснований нуклеиновых кислот в водной среде, 5.5-6.8 эВ (Rubin L.B. ea, 1981), что приводит к его ионизации и реализации химических реакций с высоким квантовым выходом.

Под квантовым выходом фотореакции (как одноквантовой, так и двухквантовой) подразумевается отношение числа прореагировавших молекул к числу поглощенных квантов излучения. При таком определении становится возможным сравнивать между собой квантовые эффективности одноквантовой и двухквантовой фотореакций, а также выявлять rot относительный вклад по их зависимости от интенсивности облучения.

Хорошо известно, что в классическом случае низкоинтенсивного УФ-облучения квантовый выход фотореакции является величиной постоянной, не зависящей от интенсивности облучения (закон Бунзена-Роско, см. Смит К., Хэнеуолт, 1972). В то же время квантовый выход двухквантовой фотореакции возрастает пропорционально росту интенсивности вплоть до насыщения одной из ступеней двухступенчатого процесса возбуждения (Nikogosyan D.N. ea, 1982).

Линейная зависимость квантового выхода разложения оснований нуклеиновых кислот от интенсивности 216 нм пикосекундного лазерного излучения с последующим насыщением (пример для аденина показан на рис. 86) указывает на двухступенчатое возбуждение через промежуточный уровень S2- Как было уже указано выше, энергия одного кванта лазерного излучения с длиной волны 193 нм (6.4 эВ) достаточна для ионизации ДНК и компонентов (но недостаточна для ионизации воды, см. раздел 3.1) . Таким образом, облучение с 193 нм приводит к одноквантовой ионизации ДНК (подробнее в разделе 4.2).

мв

Интенсивность, ГВт/см2

Рисунок 66.

При двухступенчатом возбуждении ДНК с длиной волны 266 нм наблюдается также следующее явление: интенсивности насыщения двухквантовых эффектов (например, образования однонитевых разрывов) в биополимерах ДНК значительно меньше таковых в случае отдельных компонент ДНК: оснований, нуклеозидов, нухлеотидов (Гурзадян Г.Г. и

В свою очередь гидратированный электрон может реагировать с основаниями (К = (0.9-1.5)-М"'с"1) с образованием анион радикалов (Schulte-Frohlinde D. and Bothe Е., 1991, Steenken S. ea, 1992):

eäq + цепь ДНК-основание-----> цепь ДНК-основание" ".

В присутствии кислорода электрон трансформируется в менее реакционноспособный C>2~(von Sonntag С., 1987):

e"aq+ 02.....> 02".

Радикалы результирующие от радикал катиона пиримидиновых оснований реагируют с кислородом с образованием перохсил радикалов (von Sonntag С., 1987):

ДНК-сахар(-Н)-----> ДНК-сахар(-Н)-02----->-----> однонитевые разрывы.

В присутствии N2O электрон эффективно трансформируется в реакционно способный ОН радикал (топ Sonntag С., 1987, Steenken S., 1989):

eaq+ n2° + н2°-----> ОНЧ ОН" + N2.

В дальнейшем ОН'радикалы участвуют в образовании разрывов цепей ДНК и разрывов N-гликозидной связи.

При возбуждении с длиной волны 193 им гидратированный электрон может появиться, в принципе, и от возбужденного сахаро-фосфатного остатка (Gut I.G. and Kochevar I., 1992, Kochevar I. and Buckley L.A., 1990). Более tora, квантовый выход ионизации (вылета электрона) очень высокий: для рибозо-5-фосфата Фе = 0.24-0.47 и фосфата Фе = 0.33-0.52 (Candeias L.P. and Steenken S., 1992). Однако, из-за очень маленькой экстинкции g < 150 М''см~', суммарный выход электрона оценивается в меньше, чем 4«10_3 (Gómer Н. еа, 1992).

4.3 Депопуляция высоковозбужденных синглетных уровнен Исследовалось образование фотодимеров урацила и оротической. кислоты, фотогидратов 5-UMP, фотодимеров и (6-4)фотопродуктов ТрТ, фотогидратов и (6-4)фотопродуктов dCpT, фотогндратов UpU, СрС и CpU в водном растворе

при комнатной температуре при возбуждении с длиной волны 254 или 193 нм (рис. 11).

Рисунок 11.

Проведена идентификация фотопродуктов и выявлен вклад ионизации при 193 нм. Разделение фотопродуктов с помощью хроматографии и их спектры поглощения после разделения на примере ТрТ и ири приведены на рис. 12 и 13.

Рисунок 12 Рисунок 13

В таблицах 5а, б, в приведены квантовые выходы разрушения динуклеотидов образования гидратов (ф^ ), фотодимеров () и (6-4)фотопродуктов (ф^) при облучении с 254 и 193 нм. Таблица 5а. Квантовые выходы образования фотопродуктов при облучении с 254 нм.

Соединение Фйес V Ф Шга Ф 6-4

ТрТ 0.023 (0.023) - 0.017 0.0059

ири 0.032 (0.025) 0.016 0.015 0.0004

СрС 0.0045 (0.003) 0.0038 § 0.0006

сРи 0.010 0.0093

dCpT 0.010 0.0053 § 0.0014

Таблица 56. Квантовые выходы образования фотопродуктов при облучении с 193 нм. Соединение Ф^ Ф^ Фйт Ф^

ТрТ 0.043 (0.043)+ - 0.012

ири 0.069 0.0088

СрС 0.014 0.0023 5.

Сри 0.037 0.0054- §

бСрТ 0.031 0.0057 §

0.0032

0.0011

Таблица 5в. Квантовые выходы образования четырех типов' гидратов в динуклеотидах при облучении с 254 и 193 нм.

Соединение X. (пш)

Н,

Н.,

н.

ири 254 0.0044 0.0044 0.0043 0.0032 0.016

СрС 0.0010 0.0012 0.0010 0.0006 0.0038

Сри 0.0047 0.0014 0.0006 0.0026 0.0093

dCpT 0.0035 0.0018 0.0053

ири 193 0.0041 0.0025 0.0013 0.0009 0.0088

СрС 0.0008 0.0007 0.0004 0.0004 0.0023

Сри 0.0017 0.0019 0.0011 0.0007 0.0054

асрт 0.0022 0.0035 0.0057

Отношение квантовых выходов соответствующих фотопродуктов (таблица 5 г) во всех исследованных случаях < 1, что позволяет сделать вывод о том, что указанные фотопродукты образуются с уровня Sj , но не с уровня S2. Другим выводом является возможное существование двух путей дезактивации высоковозбужденных электронных уровней: S2 -—> Sj и S2 -* ---> S0.

Согласно правилу Каша (Kasha M., еа, 1950) молекулы люминесцируют с низшего возбужденного уровня, т.е. дезактивация высоровозбуждешшх состояний протекает через S( или Tj. Однако, в нескольких соединениях была зарегистрирована люминесценция с S2 в Sg (McGimpsey W.G., 1989, Kobayashi H. and Kaizu Y., 1986). Ввиду предельно маленького выхода флуоресценции нуклеиновых кислот (<10~5, Wang Y.S., 1976, Daniels M., 1976) и субпнхосекувдных времен жизни S2 уровня (время жизни Sj уровня, например, порядка 1 пс; Nikogosyan D.N. and Letokhov V.S., 1983), измерение

эффективности S2 .....> So перехода методами сверхбыстрой лазерной

спектроскопии (как абсорбционной, так и флуоресцентной) представляется чрезвычайно затруднительным.

Таблица 5 г. Отношение квантовых выходов продуктов при облучении с 193 и 254 нм.

Соединение Я ГИДР 1 Дим 1 6-4

урацил 0.94

оротическая кислота 0.55

уридин 0.67

5-UMP 1.0

ТрТ 0.71 0.54

UpU 0.55

СрС 0.61

CpU 0.58

dCpT 1.08 0.79

5. Лазерная фотохимия ДНК

5.1 ПиримиАиновые димеры

Основные фотопродукты низкоинтенсивного УФ облучения нуклеиновых кислот с 254 нм, пиримидиновые димеры, образуются с квантовым выходом 2.6'10'3 .(Rahn R.O and Patrick М.Н., 1976, Cadet J. and

Vigny P., 1990, Garces F. and Davila C.A., 1982). Литературные данные д\я диапазона длин волн 190-290 нм позволяют сделать вывод, что квантовый выход их образования практически не зависит от длины волны возбуждения (Kochevar I. and Buckley L.A., 1990, Rahn R.O and Patrick M.H., 1976). Результаты инактивации бактерий, полученные нами для длин волн 193, 216 и 254 нм (см, ниже) также указывают на эффективное образование этих фотопродуктов даже при возбуждении в ВУФ диапазоне. Приведенные выше результаты (раздел 4.3) позволяют утверждать, что высоколежащие электронные уровни не дают вклада в образование димеров.' Более того, при интенсивностях пикосекундного лазерного излучения 1 - 10 ГВт/см2 уровень

Si эфективно опустошается за счет переходов Sj .....> Sjsj. и, как следствие,

выход димеров резко падает. Это было продемонстрировано на poly(dT), dTpdT и плазмидной ДНК (Никогосян Д.Н. и др, 1983, Есеналиев P.O. и др, 1987).

5.2 Гилраты

Фотогидраты цитозина образуются в ДНК и ее компонентах с высоким квантовым выходом, однако ввиду их неустойчивости и быстрой дегидратации обратно в цитозин, биологическая роль этих продуктов незначительна (Grossman L, and Rodgers Е., 1968, Vanderhoek J.Y. and Cerutti P.A., 1973). Учитывая, что потеря хромофора включает в себя все фотопродукты с небольшим поглощением на 260 нм, а разрушение иуклеотидов (измеренная после гидролиза ДНК и последующего анализа с помощью хроматографии) включает в себя все продукты кроме гидратов (гидраты СМР быстро переходят обратно в СМР), таким образом разность соответствует квантовому выходу образования гидратов.

5.3 (6-4)d30T0np0AYKTH

Образование (6-4 ¡фотопродуктов регистрируется с помощью флуоресценции в диапазоне 400-420 нм при возбуждении с 320-360 нм (Hauswirth W. and Wang S.Y., 1973, Wang S.Y., 1976). Зависимость интенсивности флуоресценции на 420 нм от дозы облучения с длинами волн 254 и 193 нм приведена наа рис. 14а. При облучении с 193 нм нами обнаружена зависимость квантового выхода их образования от газовой среды и увеличивается в порядке Фб-4(02) < Фб-4(Лт) < Фб-4(^20) (Таблица 6). Вообще говоря, увеличение при N2O указывает на дополнительный канал образования повреждений (помимо Sj уровня) - через ионизацию; в пользу

этого говорит также факт возрастания выхода (6-4) фотопродуктов при переходе от 254 к 193 нм облучению.

Доза, к Дж/м2

Рисунок 14а.

Таблица 6. Квантовые выходы (Ю-4) образования (6-4)фотоцродуктов

Газ 193 нм 254 нм

Однонитевая ДНК гч2о 20-30

о2 22

воздух 2.9

Двунитевая ДНК Аг 7.7

N20 12

о2 4.8

воздух 1.4

Тимин Аг 1.4

ы2о 2.1

о2 0.7

воздух 0.08

5.4 Разрушение субстрата

Квантовый выход разрушения субстрата (нуклеотидов) в однонитевой ДНК определялся по количеству 5-монофосфатов с помощью жидкостной хроматографии (после гидролиза нуклеазой Р1 и инкубацией при 37° С). Аналогичный эффект - потеря хромофора - определялась по убыли поглощения на 250-270 нм в предположении, что образующиеся фотопродукты не поглощают на длине волны регистрации (таблица 7).

Таблица 7. Квантовые выходы высвобождения неповрежденных оснований Фво, разрушения нуклеотидов в ДНК ФрН и потери хромофора Фпх при облучении с 193 и 254 нм, а также значения величин в для разрушения оснований при воздействии ионизирующим излучением (значения С из СегиШ, 1976).

193 им (10-4) 254 нм (10-4)

Основание Фво Фрн Фцх Фво Фон Фпх С

тимин 3.4 140 - 0.02 9.6 - 0.64

цитознн 7.7 110 - 0.15 5.3 - 0.38

аденин 6.3 80 - 0.03 4.4 - 0.39

гуанин 0.2 150 - 0.03 2.1 - 0.26

Т+Ц+А+Г 17.6 480 - 0.23 21.4 - 1.67

ДНК - - 530 - - 31

Отметим, что при 254 нм облучении фоторазложение пиримидинов более чем в 10 раз выше, чем д\я пуринов. В случае же 193 нм, разница в значениях Фр,{ значительно меньше (менее чем в 2 раза),- с максимальным значением для гуанина. Повторим, что разность Фпх - ФрН соответствует выходу гидратов (см. раздел 5.2).

5.5 Одно- и двунитевые разрывы депей ДНК

При облучении плазмид рВИ.322 и рТ218!1 с 193 нм количество суперскручегаюй формы уменьшалось с дозой, одновременно количество кольцевой открытой и линейных форм увеличивалось (рис. 146), что указывало на образование одно- и двунитевых разрывов (ОР и ДР) цепей ДНК.

Образование разрывов исследовалось в присутствии воздуха при различных интенснвностях излучения и различных концентрациях ТЕ буфера (Трис-ЕДТА в молярной пропорции 10:1, рН7.5). В отсутствие буфера квантовый выход образования однонитевых разрывов составлял 1,5 • 10"3, двунитевых разрывов - 6 »10-5. Зависимость количества ДНК без разрывов от дозы во всех случаях являлась моноэкспоненциальной, что свидетельствовало об одноударном механизме возникновения ОР. В отличие от ОР, ДР являются следствием накопления достаточного количества ОР. С увеличением концентрации ТЕ буфера в диапазоне 0.1 - 10 мМ доза необходимая для

® -

........4—-1—/А

150 300

100

Доза, Дж/м2

Рисунок 146.

образования определенного количества ОР и ДР резко увеличивалась, что свидетельствовало о защитном эффекте буфера: за счет поглощения излучения, ионной силы, и возможно, захвата радикалов, возникающих из катион радикала ДНК.

Механизм образования разрывов ДНК включает ионизацию основания с образованием катион радикала: ДНК-основание —-> ДНК-основание+ + е^

Следующим звеном в цепи образования разрывов следует рассматривать отделение Н-атома от С-4 позиции сахара нейтральным радикалом основания с последующим разрывом сахаро-фосфатной цепи (5сЬиКе-РгоЫтс1е еа, 1989, 1990, 1991):

ДНК-основание+ -----> ДНК-основание —> —>сахар-радикал —>—> ОР

Роль гидратированного электрона е^ в образование разрывов незначительна, поскольку квантовый выход ОР одинаков в присутствии аргона и кислорода -в кислороде електрон превращается в менее реакционноспоособыый_02":

еад + 02 --> 02" . Биологическая роль разрывов ДНК обсуждается в следующих разделах.

посвященных инактивации плазмид и бактерий.

5.6 Высвобождение оснований

При 193 нм лазерном возбуждении двухнитевой ДНК при помощи хроматографии после разделения фракций с маленьким молекулярным весом от остального, регистрировалось образование всех четырех оснований и ничего иного поглощающего на длине волны регистрации 260 нм, например монокухлеозидов и моноиуклеотидоа. Пример хроматографиицоказан на рис. 15 (вставка).

Рисунок 15. Концентрация высвобожденного от ДНК тимина в зависимости от'дозы облучения с 193 нм.

Укажем, что необлученные образцы двунитевой ДНК, в отличие от Ьднонптевой ДНК, не содержали свободных оснований. Оптическая плотность во всех случаях была постоянной и равнялась А = 3.0 в ■ 1 см. Концентрация свободного тимина в растворе при облучении с прокачкой кислородом увеличивается линейно с дозой (до 4 Дж/см2) при 193 нм лазерном облучении (рис. 15). Не наблюдалось зависимости квантового выхода образования свободного тимина Фво от интенсивности лазерного излучения при изменении последнего в диапазоне 0.02 - 0.8 МВт/см^ . Это указывает на то, что Фво не зависит ни от дозы и ни от интенсивности излучения. В растворах с прокачкой аргоном были получены практически такие же квантовые зыходы образования свободного тимина. В растворах насыщенных N20 концентрация тимина в зависимости от дозы имеет несколько иное поведение

происходит насыщение при дозах 1 Дж/см? (что соответствует 1 % преобразованию) и остается неизменной вплоть до 4 Дж/см^. Полученный

с линейного участка зависимости Фв0 в N20 существенно больше, чем

таковой в О2 или Аг (таблица 4).

Лазерно-индуцированный вылет цитозина с двунитевой ДНК показан на рис. ¡6. Зависимости в Аг, О2 и N20 насыщегашх растворах описанные выше практически те же. что для тимнна, т.е. линейные зависимости в Аг и С>2, и насыщение в N20. Однако, величины ФБО для цитозина^ примерно в два раза больше, чем соответствующие значения для тимина (таблица 4). Аналогичные эффекты наблюдались и для высвобождения аденина, с той лишь разницей, что линейные участки кривых доходили до больших доз. Наименьший выход при фиксированной дозе наблюдался для гуанина (рис.17).

Рисунок 16 Рисунок 17

Фво для гуанина в 10-50 меньше, чем соответствующие Фв0 для остальных трех оснований. С другой стороны, при переходе от О2 к N20, увеличение значительно больше. Следует отметить, что эффективность разрыва !М-гликозидной связи при двухквантовом возбуждении с 266 нм и последующей обработкой щелочью, - в обратном порядке, т.е. наибольшая для гуанина и наименьшая для цитозина (Вис1омгеку ЕЛ. еа, 1986).

5.7 Межнитевые ковалентпые сшивки

Образование межнитевых сшивок и локальных денатурированных участков в ДНК при облучении с 193 нм определялось с использованием красителя акридина оранжевого как флуоресцентного индикатора (Завильгельский Г.Б. и др., 1964). Известно, что акридин оранжевый прикрепляется к двунитевой ДНК в виде мономеров и к однонитевой ДНК в виде димеров. Мономеры и димеры характеризуются флуоресценцией с максимумом, соответственно, на 530 и 640 нм. После УФ облучения часть препаратов ДНК денатурировалась при 95 С и затем быстро охлаждалась во льду. ДНК с одним и более межяитевыми сшивками после этой процедуры денатурации-охлаждения полностью ренатурирова\а. Затем эти препараты ДНК вместе с теми не прошедшими такой процедуры окрашивались акридином оранжевым и регистрировались спектры флуоресценции. Образование межнитевых сшивок и локальных денатурированных участков регистрировалось, соответственно, по увеличению и уменьшению отношения интенсивности флуоресценции на 640 и 530 нм от дозы УФ облучения (рис. 18). Верхняя кривая относится к межнитевым сшивкам, нижняя - к локальными денатурированным участкам.

0.6 -г--г-Л-

0.5 1.0 1.5

Доза, КДж/м2

Рисунок 18.

Результаты измерений (таблица 8) показывают, что в случае использования конкретного газа оба эффекта, образование межнитевых сшивок и локальных денатурированных участков, коррел1груют. Отсутствие зависимости от интенсивности излучения указывает на одноквантовый механизм образования указанных фотоповреждений. В то же время, наблюдается четкий эффект от

используемою газа (увеличение квантового выхода в N20), что указывает на то, что эти эффекты инициируются фотоионизацией, т.е. они могут быть следствием образования свободных радикалов. В присутствии О2, как известно, гидратированный электрон трансформируется в О2-. Таблица 8

Интенсивность МВт/см^ Газ о Фсшивки (Ю-4) Флок.ден.учДЮ"4)

3.0 аргон 0.12 0.14

0.15 аргон 0.45 0.26

N20 1.6 2.3

воздух 0.9 0.8

Образование межнитевых ковалентных сшивок также исследовалось при мощном пикосекундном облучении с длинами волн 216 и 270 нм. Четкая зависимость квантового выхода образования сшивок от интенсивности облучения свидетельствует о двухквантовом механизме их образования (рис. 19).

Рисунок 19.

5.9 Квантовые выходы образования Фотопродуктов

В таблице 9 приведены квантовые выходы (Ю-4) образования различных фотопродуктов/фотоповреждений в двунитевой ДНК в

вклада поскольку квантовый выход разрыва N-гликозидной связи не меняется при увеличении концентрации poly С в 3 раза.

При облучении poly С с 193 нм концентрация свободного цитозина увеличивается с дозой, достигает максимума и при дозах больше 1.8 Дж/см2 уменьшается (рисунок 20). Этот эффект объясняется одновременным участием двух процессов: фоторазложением свободного цитозина и цитозина в составе poly С. Экспериментальные результаты для случая 02 сравнивались с расчетной кривой, полученной из уравнений: 2

Рисунок 20.

«ЦсуЦ/сЮ = ^Фр^ус...^ бро1уС 1ро1уС] - Фй(суг) Есу^суШ <1[ро1уС)/ао = -м(Фр01уС...>су1 + Фа(р°1уС))Ер01ус [ро1уС]

где Б - доза облучения (в квантах на квадратный сантиметр), £ро1уС и еСу^ молярные коэффициенты экстинкции ро1уС и су!, соответственно, на длине волны облучения 193 нм, N — 10^ lnlO/Nд (Ыд -число Авогадро). Первый член в первом из уравнений описывает образование свободного цитозина за счет разрыва Ы-гликозидной связи, и второй член - фоторазложение цитозина. Второе уравнение описывает разложение ро1уС за счет как вылета основания, так и потери хромофора. Сплошная кривая на рис. 20 получена подстановкой в уравнения значений квантовых выходов из таблицы 10. Как видно, согласие с экспериментом достаточно хорошее, что указывает на правильность выбранной модели.

6.2 Урадил и его производную

При облучении пиримидинов (в частности урадила и его производных) с 254 нм основными фотопродуктами являются гидраты и димеры (рис. 11) (Swenson P.A. and Setlow R.B., 1963, Pearson M. ea, 1966, Brown I.H. and Johns H.E., 1968, Fisher GJ. and Johns H.E., 1976). Их квантовые выходы находятся в диапазоне 0.006-0.05. Для уридина и 5-UMP основным фотопродуктом является гидрат. Маленький вклад димеров подтверждается незначительным кислородным эффектом на реакцию потерю хромофора.

К',К":Н,СН,

Рисунок 21а иллюстрирует образование димеров при облучении с и

реверсия с •

1.0

0.9>

0.8

0.7

Аад

0.6

0.5

0 10 20 0 0.1 0.2 0.3

Доза, Дж/см2

Рисунок 216. Первоначальное уменьшение и последующее увеличение поглощения на 260 нм при облучении водного раствора урацила в присутствии аргона, соответственно, с 254 и 193 нм.

hVi

При облучении poly С с 193 нм концентрация свободного цитозина увеличивается с дозой, достигает максимума и при дозах больше 1.8 Дж/см^ уменьшается (рнсунок 20). Этот эффект объясняется одновременным участием двух процессов: фоторазложением свободного цитозина и цитозина в составе poly С. Экспериментальные результаты для случая О2 сравнивались с расчетной кривой, полученной из уравнений:

io 2 12

1 .0 • 1 1 ......-4

в я я о о и8 ст 'А ■ x. лч

« к а & * 0 \ д . _ „

о я" x о x о / ! 1

0 2 4 6 8

Доза, Дж/см2

ч.

Рисунок 20.

<1[су1]ЛШ = Н(Фро1уС.„>су1 еро1ус [ро1уС] - Ф^суЧ есу1[су1|) (1[ро1уС]/сЮ = -Н(Фр01уС—>суг + Ф(1(Р01уС))г.рО]уС [ро1уС]

где О - доза облучения (в квантах на квадратный сантиметр), £ро1уС и есу1 молярные коэффициенты экстюгкции ро1уС и су1, соответственно, на длине волны облучения 193 нм, N = 10^ 1пШ/1ч'д (Ыд -число Авогадро). Первый член в первом из уравнений описывает образование свободного цитозина за счет разрыва N-глнкозидной связи, и второй член - фоторазложение цитозина. Второе уравнение описывает разложение ро1уС за счет как вылета основания, так и потери хромофора. Сплошная кривая на рис. 20 получена подстановкой в уравнения значений квантовых выходов из таблицы 10. Как видно, согласие с экспериментом достаточно хорошее, что указывает на правильность выбранной модели.

6.2 Урадил и его производные

При облучении пиримидинов (в частности урацила и его производных) с 254 нм основными фотопродуктами являются гидраты и димеры (рис. 11) (Swenson P.A. and Setlow R.B., 1963, Pearson M. ea, 1966, Brovm I.H. and Johns H.E., 1968, Fisher GJ. and Johns H.E., 1976). Их квантовые выходы находятся в диапазоне 0.006-0.05. Для уридина и 5-UMP основным фотопродуктом является гидрат. Маленький вклад димеров подтверждается незначительным кислородным эффектом на реакцию потерю хромофора.

я, я": н.сн, Хг<\(

Рисунок 21а иллюстрирует образование димеров при облучении с ^ и реверсия с .

1.0 0.9 0.8

0.7 ■А-240 0.6

0.5

0 10 20 0 0.1 0.2 0.3

Доза, Дж/см2

В отсутствие кислорода основными фотопродуктами урацила являются димеры; их относительный вклад может быть оценен путем облучения с 193 им, что приводит к разрыву димеров и образованию мономеров (реакция фотореверсии с квантовым выходом 1) (рис. 21а, б).

Нами обнаружено образование свободных оснований за счет разрыва N-гликоэидной связи при облучении с 254 нм. Квантовые выходы этого процесса (10"5) в присутствии различных газов приведены в таблице 11. Таблица 11

Соединение О?. Аг N?0

уридин 6 2-4 6

5-UMP 3 2-3 4-5

poly U 3.5 1.5

poly dU 2.1 2.4

аденозин 3-5 3-8 1

5-AMP 1 it 1.3 2

poly А 2.5 1.6 2-3

poly dA 3.5 0 2.0 3.5

Квантовые выходы очень малы (меньше 10"'), и чувствительны к присутствию кислорода, в частности для уридина.

При облучении с 193 нм вышеуказанные фотопродукты также образуются, однако, не обязательно с той же эффективностью, В добавок, образуются фотопродукты результирующие от однофотонной ионизации

К-основанне —> К-оснопание + -+ е^ .

Здесь И относится к сахаро-фосфатному остатку. В нейтральных водных растворах катион радикалы быстро взаимодейтсвуют с водой или депротонируются:

Я-основание + 4- Н2О —> Н-основание-ОН + Н + Н-основание +■ —> Я-основание(-Н) + Н+ .

Гидратированный электрон может также взаимодействовать с основанием с образованием анион радикала

eaq+R-основание —>■ R-основание" R-ocHOBaiffle* + H2O —-> R-основание-(H) + ОН'

Два процесса результирующие от катион радикала, вылет оснований и разрывы цепей ДНК, включают в себя радикалы сахара, согласно:

Rl-основание-ОН + R2-ocHoaaíme—>Rj-ocH0Bajffle/H2O + Я2-(Н)-осноиание R}-основание(-Н) 4- R2-ocfiOBaiiHe —> Rj-основание + R2-(Hj-ocüOBaHHe R2-(H)-0CH0BaHHe —> —> вылет оснований и разрыв цепей

В присутствии N2O оба этих процесса значительно более эффективны за счет реакции трансформации гидратированного электрона в ОН радикал (см. раздел 6.1). Из радиационной химии (von Sonntag С., 1986) ОН радикалы известны как эффективно взаимодействующие с основаниями нуклеиновых кислот. Таким образом может быть объяснено двухкратное увеличение эффективности разрывов цепей (см ниже) и N-гликозидной связи в присутствии N2O (см. таблицу 4).

6.3 Аденин и его производные

При облучении аденина и его производных с 254 нм образуются несколько фотопродуктов (например, в случае аденозина 11, Arce R. еа, 1993), Два основных димерных фотопродукта обнаружены и идентифицированы (Porschke D., 1973, Kumar S. еа, 1991). Измеренный нами суммарный квантовый выход фоторазложения аденина и производных (потеря хромофора и разрушение нуклеотидов, см. раздел Экспериментальные методы), так же как и разрывов N-гликозидной связи очень мал и составляет порядка (3-15) 10"5. Эффективность указанных реакций не зависит от присутствия или отсутствия N2O, что указывает на отсутствие ионизации при 254 нм. В тоже время, при 193 нм облучении в присутствии N2O наблюдается двухкратное увеличение квантового выхода разрушения нуклеотидов, что является следствием ионизации и участия реакционно-способного ОН радивала в фоторазложение (см. реакции в разделе 6.2). Квантовые выходы разрушения нуклеотидов (и потери хромофора) более чем в 10 раз выше при 193 нм облучении в сравнении с 254 нм. Таким образом, в случае аденин содержащих соединений основными фотопродуктами при 193 нм облучениии являются таковые результирующие от ионизации.

6.4 Гуанин и его производные

В сравнении с у-радиолизом, информация о фотохимии гуанина и его производных с 254 нм и, тем более с 193 нм, очень скудная (Steenken S., 1992, Vieira A.J.S.C. еа, 1993). Это, в частности, является следствием его высокой фотохимической устойчивости. Фотоионизация наблюдалась с использованием мощного лазерного излучения с 266 нм (в условиях двухступенчатого возбуждения) и 193 нм (одноквантовое возбуждение) с квантовым выходом 0.034-0.05?(193 нм, Candeias L.P. еа, 1992, Gurzadyan and Görner, 1992). Нами также исследовалось образование свободйых оснований в poly G за счет разрывов N-гликозидкой связи: = 4.5; 7.3 и 12» 10*4 в присутствия аргона, кислорода и N2O, соответственно.

7. Лазерная фотобиология АНК 7.1 Инактивапия плазмид

Моноэкспоненциальная зависимость выживаемости плазмидной ДНК от дозы облучения с 193 нм при трансформации бактерий E.coli К12 АВ1886 и

Рисунок 22. а°за-

Разница в наклонах этих двух кривых соответствует вкладу димеров и (6-4)фотонродуктов в летальный фотопродукт. Для АВ2480 известно, что каждый димер является летальным (Howard-Flanders P. and Воусе R.P., 1966). Обнаружено, что димеры при 193 нм, так же как и при 254 нм облучении, являются основными летальными фотопродуктами; квантовые выходы остальных фотоповреждений значительно меньше квантового выхода инактивации. В случае E.coli К12 АВ1157, эффективно репарирующим димеры

и (6-4)фотопродукты, основными летальными повреждениями являются однонитейые разрывы цепей ДНК и освобожденные основания. Вклад двунитевых разрывов в инактивацию АВ1157 меньше 15%. В случае АВ1886 30-40% летальных повреждений являются димеры и (6-4)фотопродукты, остальное - однонитевые разрывы и разрывы N-гликозидной связи.

7.2 Роль разрывов цепей АНК в инактивации плазмнл

Процессы, протекающие в клетках моделировались с использованием протеинового экстракта из бактериальных штаммов E.coli АВ1157 (дикий тип по репарации) и АВ2480 uvr- гес Плазмидная ДНК pBR322 после облучения с 254 нм инкубировалась в протеиновом экстракте при 37 С и затем с помощью гель-электрофореза исследовалась на образование одно- и двунитевых разрывов. Наблюдалось ферментативная трансформация 254-нм-индуцированных фотопродуктов (пиримидиновых димеров й (6-4)фотопродуктов) в однонитевые разрывы (рис. 23).

ОР/молекула 2.0

1.5

1.0

0.5

Рисунок 23.

Отметим, что в условиях эксперимента не наблюдалось образование двунитевых разрывов. Без инкубации в экстракте (непосредственно после УФ облучения) практически не образуется разрывов. При инкубации же при временах меньше 3 мин количество ОР увеличивается и затем переходит на насыщение. Зависимость ОР от дозы УФ облучения указывает на ферментативное трансформирование УФ повреждений.

Моноэкспоненциальная зависимость количества с разрывов от дозы (рис. 24) свидетельствует о том, что один фотопродукт трансформируется в один

Время инкубации, мин

разрыв. Из рис. 24 видно, что квантовые выходы биологической инактивации при трансформации бактерий E.coli AB tl 57 и энзиматическя-индуцированных разрывов одинаковы (оба кривых параллельны). Отметим, что... квантовый выход пиримидиновых димеров примерно в 20 раз меньше квантового выхода инактивации в E.coli ABl 157. Таким образом, более 90% димеров репарируются в бактериях с помощью uvr системы. Оставшаяся часть (10%) не репарируется uvr системой и остается как нерепарируемые ОР. Природа этих перепарируемых ОР следующая: в процессе энзиматической репарации, как промежуточное звено, образуется ОР на месте димера. Очевидно, такой

1.0<

0.9

N/N0 0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

01 1-1-1-1-1-

о 10 20 30 40 50

Доза, мДж/см2

Рисунок 24.

ОР репарируется энзиматической системой репарации. Один тип повреждения трудно репарировать, это-двунитевые повреждения. Возможное объяснение в нашем случае может состоять в следующем: однонитевой разрыв или пробел в дочерней нити напротив фотодимера. Очевидно, такой тип однонитевого рызрыва не может быть репарирован и\г системой репарации.

При облучении плазмиды с длиной волны 193 нм, как было показано выше, эффективно образуются однонитевые разрывы. Инкубация 193 нм-

pBR322 254 am

О выживаемость в ABl 157 д ОР без экстракта

□ ОР с экстрактом (без репарации) О ОР с экстрактом (с репарацией)

облученной плазмиды в протеиновом экстракте из E.coli ABl 157 приводит к появлению двунитевых разрывов. Сравнение инактивации плазмиды с кривой соответствующей двунитевым разрывам позволяет выявить биологическую роль энзиматически образуемых ДР: их вклад составляет 20-30%, основной же вклад в инактивацию плазмид имеют непосредственно (лазерно) индуцируемые однонитевые разрывы.

7.3 Инактивация бактерий E.coli

В этой части приводятся результаты полученные при непосредственном облучении бактерий E.coli К12 длинами волн 193 и 216 нм. Исследовались УФ инактивация и фотореактивация четырех штаммов с различными репарационными мутациями, результаты сравнивались с таковыми при облучении с 254 нм. Одним из основных результатов является то, что бактерии E.coli при облучении с 193 нм инахтивируются за счет повреждения ДНК, но не белков мембран, как имеет место в случае клеток млекопитающих (Cadet J. еа, 1992). Белки только лишь защищают ДНК от вакуумного УФ поглощая часть излучения. Другой основной результат: штамм E.coli ABl 157 репарирует фотоповреждения хромосомной ДНК значительно эффективнее при облучении с 254 нм, чем при 193 нм.

Кривые выживаемости для четырех штаммов бактерий E.coli К12 ABl 157 (D ), AB 1886 ( О ), AB2463 ( Л) и АВ2480 (V) после облучения с 193 нм приведены на рис. 25 (для случая AB 1157 доза должна умножаться на 10). Зависимости N/Ы0 от падающей дозы линейны для AB 1886, АВ2463 и АВ2480 указывая на одноударный механизм, и незначительно выгнуты для дикого штамма ABl 157. Фотореактивация, как известно является высокоселективным процессом для обнаружения дилеров (Heelis P.F еа„ 1993, Sanear A. and Tang M.S., 1993). Сектор фотореактивации для трех длин волн и четырех штаммов бактерий приведен в таблице 12.

Таблица. 12._

длина волны, нм ABl 157 AB 1886 АВ2463 АВ2480

254 <3 85 + 3 81 ± 3 88 ¿ 3

216 <3 63 + 8 68 + 8 80 + 3

193 <3 67 ± 3 70 ± 3 70 ± 3

Доза, Дж/м2

Рисунок 25,

Как видно, исключая дикий штамм ABU57 (который эффективно репарирует димеры темновой системой репарации клеток), в трех остальных штаммах сектор фотореактивации больше 60%. Это указывает на образование димеров в хромосомной ДНК даже при 193 нм. Квантовый выход инактивации хромосомной ДНК рассчитывался по следующей формуле

Ф;па = (330 х Na)/[D37 х T(Airr) х £{Xirr) x М\У(ДНК) x InlO]

где Na число Авогадро, T(Àjrr)-оптическая прозрачность клеток на данной длине волны, s(Â.jrr) - мо.\ярный коэффициент поглощения ДНК и MW = 2-10>' г/моль, молекулярный вес бактериальной ДНК; 330 - средний молекулярный вес 1гуклеотидов (таблица 13).

Таблица 13._Фта ^_

длина волны, нм Т АВ1157 АВ1886 АВ2463 АВ2480

254 0.80 0.032 0.90 1.9 29

216 0.48 0.027 0.34 0.91 15

193 0.30 0.077 0.59 0.99 12

Сравнение квантовых выходов инактивации для АВ1157 показывает основной вклад ионизационных повреждений при 193 нм (одно- и двунитевые разрывы, разрушение нуклеотидов и освобожденные основания). В случае АВ2480 при всех трех длинах волн димеры являются основным летальным фотопродуктом.

7.4 Разрушение белков

Известно, что основной мишенью при инактивации бактерий E.coli К12 при облучении с 254 нм является ДНК (Howard-Flanders P. and Theriot L„ 1966). При переходе с 254 к 193 нм значительно увеличивается поглощение белков содержащих ароматичесхие аминокислоты, так для ароматических аминокислот молярный коэффициент поглощения становится в 100 раз больше, и в 2-3 раза больше чем таковой для нуклеотидов (Repeyev Yu.A. еа, 1992). Учитывая высокий квантовый выход разрушения аминокислот при 193 нм (0.1-0.24) произведение ■ & (эффективность инактивации белков) становится на 193 нм в 1000 раз больше, чем на 254 нм (Nikogosyan D.N. and Gorner H., 1992). Сравнение средних летальных доз для трех длин волн облучения в случае АВ2480, однако же, указывает на пренебрежительно малую роль вклада разрушения белков в инактивацию бактерий: на дшне волны 193 нм доза в 8 раз больше, чем на 254 нм. Основная функция белков И других клеточных компонентов, таким образом, является лишь защита внутриклеточной ДНК от облучения с 193 и 216 нм, но не инактивация. Дополнительными аргументами в пользу этого вывода являются:

а) наличие эффективной фотореактивации на длинах волн 216 и 193 нм;

б) существенная разница в квантовых выходах инактивации для uvrA+ и uvrA- систем, указывающая на более чем 90% вклад повреждений ДНК (димеров и (6-4) фотолродуктов) в инактивацию бактерий.

7.5 Сравнение инактивации плазмил и бактерий

На длине волны 254 им квантовый выход инактивации E.coli К12 АВ2480 для плазмидной, и хромосомной ДНК одинаков в пределах фактора 2 (таблица 14). Это указывает на то, что во всех этих случаях ДНК инактивируется за счет единичного фотодимера на геном. Все остальные фотопродукты имеют меньшие квантовые ш-гходы (сравни данные табл. 9 и 14). Бактериальный штамм АВ2480 не может репарировать фотодимеры uvrABC системой репарации, а также двунитевые разрывы, возникающие как промежуточное звено при неудачной попытке репликации ДНК содержащей димер.

Выживаемость плазмидной к хромосомной ДНК в E.coli К12 АВ2463 одинакова; квантовые выходы инактивации изменяются в пределах 1,8-10-4 -2.7*10-4 для E.coli и от 1.2'10-4 до 4.0-10-4 для различных фагов и плазмид. Так как репарация двунитевых разрывов в указанном штамме (гее-) отсутствует, можно заключить, что эпзиматическая репарация uvrABC системой в обеих типах ДНК практически одинакова. Указанное заключение относится к пиримидиновым димерам.

Таблица 14. Кваэтовые выходы (10~4) инактивации для разных биообъектов на длине волны облучения 254 им (вычислены с использованием значений средних доз инактивации дом^у из Gurzadyan еа, 1993, Radman еа, 1970, Ogawa еа, 1968, Tyrrell, 1979, Nikogosyan еа, 1986, Howard-Flanders еа, 1966, Hodges еа, 1980, Webb and Brownn, 1976, Strike and Lodwick, 1987).

Биообъект Мол.вес (Ю6) АВ2480 AB 1886 АВ2463 ABl 157

pTZ18R 1.89 31 4.3 4.0 1.6

pBR322 2.88 27 - - 1.8

Фаг X 33 4.9 2.3 1.3 0.4

- 6.3 - 1.3

- 5.9 - 0.85

18 - - -

6.8 5.2 1.8 1.1

ФагТ! 31 - 8.2 2.6 2.1

Е. coli 2000 28 0.7 1.9 0.012

14 0.37 - -

28 - 1.2 -

- - 2.8 0.023

27 - - -

1.7 2.8 0.045

В штамме АВ1886, неспособной репарировать димеры и (б-4)фотопродукты, инактивация хромосомной ДНК в 10 раз меньше, чем плазмидной. Обнаружена также существенная разница в квантовых выходах инактивации на всех трех длинах волн 193, 216 и 254 нм для E.coti К12 АВ1886 и особеннго АВ1157 для плазмидной % хромосомной ДНК; так для 193 нм ф;па в 35 и 180 раз, соответственно выше для плазмидной ДНК. Этот факт объясняется

недостаточной эффективностью тесА системы репарации для плазмид следствие единичного акта инфицирования клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные выводы,

1. Предложены новые приближенные формулы для расчета углов синхронизма в одноосных и двухосных нелинейных кристаллах.

2. Теоретически и экспериментально исследовано двухквантовое поглощение в кристаллах при наличии двухфотонного поглощения кристаллической решетки и двухступенчатого поглощения молекул примесей. Указано, что ддя корректного определения коэффициента двухфотонного поглощения необходимо использование интенсивностей лазерного излучения > 0.5 ГВт/см2.

3. Обнаружен и теоретически и экспериментально исследован эффект расфокусировки лазерного УФ излучения в нелинейно поглощающих средах (двухфотонное поглощение в воде). Предложен новый метод измерения коэффициента двухфотонного поглощения и локального изменения температуры в облучаемом участке среды. Показано, что тепловыми эффектами при пикосекундном лазерном облучении биомолекул в воде можно пренебречь.

4. Предложен новый метод измерения чирпа ультракороткого импульса с помощью нелинейного динамического спектрографа с временным 0.1 пс и спектральным разрешением 0.02 нм. Измерен чирп одиночного пикосекундного импульса лазера на фосфатном стекле и излучения пикосекундного континуума.

5. Систематически исследована фотохимия и фотобиология нуклеиновых кислот и их компонентов при лазерном облучении с длиной волны 193 нм. Показано, что лазерное излучение с 193 нм ионизует молекулы нуклеиновых кислот по одно квантовому механизму. Измерен квантовый выход ионизации для ряда модельных молекул нуклеиновых кислот.

6. Предложен метод определения эффективности перехода с высоковозбужденного на первый возбужденный электронный уровень молекул с помощью фотолиза. Показано, что в молекулах нуклеиновых кислот димеры, гидраты, (6-4)фотопродукты образуются только с низколежащего уровня Б} (или Т1), но не с 52- Измерена эффективность безызлучательного

.....>S] перехода для ряда компонентов нуклеиновых кислот: ТрТ, UpU,

СрС, CpU, dCpT, урацил, уридин, оротическая кислота, 5-UMP. Она находится в диапазоне 0.5 - 1.

7. Всесторонне исследована фотохимия цнтозин, урацил и аденин содержащих нуклеиновых компонент, измерены квантовые выходы потери хромофора, разрушения 1гуклетоидов, образования гидратов и димеров (для пирнмидинов) в различных условиях эксперимента (газ, длина волны, интенсивность излучения). .

8. Выявлено эффективное образование одно и двунитевых разрывов цепей ДНК, разрывов N-гликозидной связи, межшггевых сшивок, локальных денатурированных участков, разрушения субстрата (¡гуклеотидов) при облучении ДНК с 193 нм.

9. Выявлен механизм инактивации плазмид и бактерий E.coli Kl2 при облучении с 193 нм. Основной мишенью, аналогично с 254 нм, в бактериях E.coli К12 является ДНК. Двойной мутшгг АВ2480 (uvr гес') ишктшшруется в основном за счет пиримидиновых димеров (как плазмидная, так и хромосомная ДНК). Для дикого штамма E.coli К12 АВ1157 основными летальными повреждениями являются шшзационные фотопродукты, однонитевые разрывы, разрывы N'-гликозидной связи и поврежденные нуклеотиды.

10. Выявлена роль однонитевых разрывов цепей ДНК как промежуточного звена в цепи образования летальных поврежден™ в плазмиде при облучении с длиной волны 254 нм и, соответственно, двунитевых разрывов в случае 193 нм.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. D.N.Nikogosyan, G.G.Gurzadyan. Two-quantum photoprocesses in DNA and RNA biopolimers under powerful picosecond laser UV irradiation. Laser Chemistry, v.4, p.297-303, 1984.

2. Г.Г.Гурзадян, Д.Н.Никогосян. Двухступенчатое возбуждение, оснований в составе биополимеров ДНК и РНК. Доклады АН СССР, том 276, с. 628-631, 1984.

3. G.B.Zavilgelsky, G.G.Gurzadyan, D.N.Nikogosyan. Pyriniidine dimers, single-strand breaks and crosslinks induced in DNA by powerful laser UV radiation. Photobiochem. Photobiophys., v.8, p.175-187, 1984.

4. R.E.Avalyan, G.G.Gurzadyan, R.N.Gyuzalian. Investigation of the temporal distribution of picosecond continuum by the "sum-frequency beam" technique, in Abstracts of IV lntemat. Symp. "Ultrafast Phenomena in Spectroscopy" (GDR, 1985), p.PW33, 1985.

5. Г.Б.Завильгельский, Г.Г.Гурзадян, Д.Н.Никогосян. Индуцируемые лазером межнитевые сшивки в ДНК. Биофизика, том 30, с.568-570, 1985.

6. Г.Г.Гурзадян. Двухквантовая лазерная фотохимия ДНК. Тезисы докладов респ. конференции молодых ученых и спец., Тбилиси, с. 38-40, 1986.

7. Д.Н.Никогосян, Г.Г.Гурзадян. Новые формулы для расчета углов синхронизма. Квантовая электроника, том 13, с.2519-2520, 1986.

8. R.E.Avalyan, G.G.Gurzadyan, R.N.Gyuzalian. Investigation of the temporal distribution of picosecond continuum by the "sum-frequency beam" technique. Proceed. IV lntemat. Symp. "Ultrafast Phenomena in Spectroscopy" (GDR, 1985), Moscow, p.127-130, 1987.

9. ДН.Никогосян, Г.Г.Гурзадян. Кристаллы для нелинейной оптики. Квантовая электроника, том 14, с.1529-1541, 1987.

10. Г.Г.Гурзадян, Р.Н.Гюзалян, И.С.Захаркин. Измерение чирпа пикосекундных импульсов лазера на фосфатном стекле с неодимом методом динамической спектроскопии. Квантовая электроника, том 14, с.1660-1663, 1987.

11. «kupquirijuiti: 1_щцЬрЪЬр}1 Щ^шшГши hhimlilj[iuplibpQ 1(Ышшрш1ш1р|шЬ

lib?: 1)нпшр_|ш1) U mb}ufc{lliM,' N 4, 13-19, 1S88.

12. <t. Чпфсцшциаи, Ч. fluljuulijuili: LuiqUpmjfilj pdjljnipjuih

tjuiljuili шигцЫрлЪЬре: 4Jiuinipjnilj U Ulbjulijiliw, N ll. t.g 48-51. 1S88.

13. Г.Г.Гурзадян, К.Ш.Восканян, Р.К.Испирян, С.Г.Арутюнян. Фотомодификации вторичной структуры ДНК при мощном лазерном УФ облучении. Тезисы докладов 4 координ. семинара "Динамика и активность биол.макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент", Ереван, с. 7071, 1988.

14. G.G.Gurzadyan, K.Sh.Voskanyan, S.G.Harutunyan. Investigation of DNA two-quantum photoproducts induced by intense 216 and 270 niji laser irradiation. Abstracts of filth symposium on optical spectroscopy. SOS, p. 97, Eisenach, GDR, 1988.

15. А.Г.Арутюнян, Г.Г.Гурзадян, Р.К.Испирян. Генерация пятой гармоники пикосекуидного лазера на алюминате иттрия. Квантовая электроника, том 16, с.2493-2495, 1989.

16. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan, K.Sh.Voskanyan. Two-quantum photoprocesses in DNA and water at picosecond laser LTV' 216 and 270 nm irradiation. Abstracts of 3rd Congress of the European Society for photobiology, Budapest, p. 231, 1989.

17. Г.Г.Гурзадян, Р.К.Испирян. Нелинейная дефокусировка лазерного пучка вследствие нелинейного поглощения излучения. Оптика и спектроскопия, том

- 68, с. 1348-1351, 1990.

18. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan. Efficiency of laser photolysis of nucleic acids at 216 nm. Abstracts of Internat. Conference on Laser in the Life Sciences, Guangzhou, China, p. 15, 1990.

19. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan. Two-photon absorption peculiarities of KDP, KB5 and quartz crystals at 216 nm. Abstracts of 4 national conference Laser and their applications, Plovdiv, Bulgaria, p. 146-147, 1990.

20. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan. Nonlinear defocusing of laser radiation in nonlinear absorbing medium. J. Modern Optics, v. 38, p.1265-1269, 1991.

21. Г.Г.Гурзадян, В.Г.Дмитриев, ДН.Никогосян. Нелинейно-оптические кристаллы. Свойства и применения в квантовой электронике. Справочник. Радио и связь, Москва, 160 стр, 1991.

22. V.G.Dmitriev, G.G.Gurzadyan, D.N.Nikogosyan. Handbook of Nonlinear Optical Crystals (Springer Series in Optical Sciences, vol.64), Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New-York, 222 p., 1991, ISBN 3-540-53547-0

23. G.G.Gurzadyan, . R.K.Ispiryan. Two-photon absorption peculiarities in potassium dihydrogen phosphate crystal at 216 nm. Appl. Phys. Lett., v.59, p.630-631, 1991.

24 Г.Г.Гурзадян, А.С.Оганесян, А.В.Петросян, Р.О.Шархатунян. Выращивание и исследование нелинейных свойств монокристаллов б-бората бария. Журн. Техн.Физ. том 61, с.152-154, 1991.

25. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan, K.Sh.Voskanyan. Two-quantum photoprocesses in DNA at picosecond laser UV 216 and 270 nm irradiation. J. Photochem. Photobiol. B: Biology, v. 11, p.269-275, 1991.

26. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan. Efficiency of laser photolysis of nucleic acids at 216 nm. Proceed, of Intemat. Conference on Laser in the Life Sciences, Guangzhou, China, p. 27-40, 1991.

27. G.G.Gurzadyan. Photochemistry of DNA and its components at laser 216 nm irradiation. Abstracts of 4th Congress of the European Society for photobiology, 16.9.91, Amsterdam, p. 88, 1991.

28. G.G.Gurzadyan, R.K.Ispiryan. Two-photon absorption in KDP, KB5 and quartz crystals at 270 and 216 nm. Int. J. Nonlinear Optical Physics, v.l, p. 533540, 1992.

29. G.G.Gurzadyan and H.Gorner. Base release from DNA and polynucleotides upon 193 nm laser excitation. Photochem. Photobiol., v.56, p.371-378, 1992.

30. H. Gorner and G.G.Gurzadyan. Photolysis of polycytidylic acid on 193 nm laser excitation. J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, v. 71, p. 155-160, 1993.

31. G.G.Gurzadyan and H.Gôrner. Photolesions in DNA upon 193 nm excitation. Photochem. Photobiol. v. 58, p. 71 - 80, 1993.

32. G.G.Gurzadyan, H.Gôrner and D.Schulte-Frohlinde. Photolesions and biological inactivation of plasmid DNA on 254 nm irradiation and comparison with 193 nm laser irradiation. Photochem. Photobiol. v.58, p. 311-319, 1993.

33. G.G. Gurzadyan and D.Schulte-Frohlinde. Biological inactivation of plasmid DNA on 254 and 193 nm Irradiation, Abstracts oi the Vth Congress of the European Society for Photobioîogy, 19-26. 9. 1993, Marburg.

34. G.G. Gurzadyan and D. Schulte-Frohlinde. Are enzymaticaly produced single-strand breaks involved in UV-induced inactivation of plasmid DNA? J. Photochem. Photobiol. B: Biology, 1993, v.22, p.131-138, 1994.

35. G.G.Gurzadyan, H.Gôrner. Damage to uracil- and adenine-containing bases, nucleosides, nucleotides and polynucleotides: quantum yields on irradiation at 193 and 254 nm. Photochem. Photobiol. v.60, p.323-332, 1994.

36. H. Gorner and G.G.Gurzadyan. Photochemie der DNA: Produktverteilung und Ouantenausbeuten. J.lnform. Record. Mater, v.21, p.439-440, 1994.

37. G.G.Gurzadyan, H.Gôrner and D.Schulte-Frohlinde. Ultraviolet (193, 216 and 254 nm) photoinactivation of E.coli strains with different repair deficiencies. Radiat. Research, v. 141, p.244-251,1995.

38. H.Gorner and G.G. Gurzadyan. Product Quantum Yields of Uracil- and Adenine-Containing Bases, Nucleosides, Nucleotides and Polynucleotides. Abstracts of the XVth IUPAC Symposium on Photochemistry. July 17-22, 1994, Prague.

39. H.Gorner, G.G.Gurzadyan. Photolesions in DNA produced by irradiation at 193 and 254 nm. Abstracts of th Vlth Congress of the European Society for Photobioîogy, 3-8. 9. 1995, Cambridge, p. 26, 1995.

40. G.G. Gurzadyan, H.Gorner and D. Schulte-Frohlinde. Influence of Different Repair Deficiencies on the Photoinactivation (193, 216 and 254 nm) of E. coli Strains. Abstracts of the International Conference of Radiation Chemistry, Sept. 1995, Wurzburg.

41. G.G.Gurzadyan, H.GBrner. Depopulation of highly excited singlet states of DNA model compounds: quantum yields of 193 and 254 nm photoproducts of pyrimidine monomers and dinucieoside monophosphates. Photochem. Photobiol. v. 63, p. 143-153, 1996.

42. G.G.Gurzadyari, H.Gorner. Laser photoionization of DNA and its constituents. Abstracts of the second symposium "Multiphoton photochemistry in biological systems". Bad Honnef, Germany, 1996.

43. T.Gustavsson, L.Cassara, G.Gurzadyan, S.Pommeret, J.-C.Mialocq. Femtosecond spectroscopic study of the non-radiative relaxation processes in 7-aminocoumarins. In: Ultrafast Phenomena X, 1996

44. Г.Г.Гурзадян, ДШульте-Фролинде. Биологическая важность разрывов цепей ДНК при облучении с длиной волны 193 нм. Биофизика, т. 41, N3, 1996.

Выражаю благодарность всем моим коллегам и друзьям, с кем довелось работать и находить дружескую поддержку в Институте спектроскопии АН СССР (Троицк), Молекулярной биологии АН СССР (Москва), Институте физических исследований АН Армении (Аштарак), НПО Лазерная техника (Ереван), Max-Planck-Institut fur Strahlenchemie (Germany), AG Photobiophysics, Humboldt University of Berlin (Germany), Service de chimie moleculaire, CEA Saclay (France).

Gagik G. Gurzadyan LASER PHOTOIONIZATION OF DNA

Summary

New formulas for calculation of phase-matching angles in uni and biaxial crystals are presented. Two-photon absorption peculiarities of KDP crystal at 216 nm are studied. A new method of nonlinear dynamic spectroscopy for measerements of the picosecond pulse chirp is offered. Nonlinear thermal defocusing of laser radiation in water due to two-photon absorption is detected.

Action of laser radiation of nanosecond and picosecond duration with wavelengths of 193, 216, 248, 266 and 270 nm, as well as of low-power UV light from conventional Hg-Iamp on DNA nucleic acids constituents, plasmids and bacteria E.coli with different repair defficiencies was studied, .Formation of single-and double-strand breaks, covalent interstrand crosslinks, localy denatured sites, base release, destruction of nucleotides with high quantum yield was observed. It was shown that above mentioned photoproducts/photolesions are the consequence of ionization.

Biological inactivation of plasmid (transformation of E.coli bacteria strains AB1157 wild type, AB1886 uvrA AB2463 recA, AB2480 uvrA recA) was studied upon irradiation at 193 and 254 nm; the monoexponential survival curves in all cases show that a single damage site leads to inactivation (one single hit). The biological consequences of different photoproducts are outlined. Inactivation of E.coli upon irradiation at 193 and 216 nm was demonstrated to be due to damage of intracellular DNA rather than to membrane or protein damage.

Depopulation of highly excited electronic states of DNA model compounds was studied. Quantum yields of photodimers, (6-4)photoproducts and photohydrates in pyrimidine monomers and dinucleoside monophospates after excitation of the first and second excited states (254 and 193 nm, respectively) were measured. The efficiency of the internal conversion S2 —> Sj was found to be in the range of 0.5 - 1 for UpU, CpC, CpU and dCpT.

ийфпфтй

UfiumbilunnfiljnpbG hbuiujqnuiiltuâ t GnitiibGujjtiG ppniGbp[i фпшп^ЬчЬ^чЛ Ii Ínumpfii5}iujü lujqbpiujhü GuiGniJUJjpLjjuiCiujj|iG 193 G¿ lULhpnií (SimuiqujjptlujQ luqrçbgntpjuiû шшЦ: Liuqbpuujhû 193 Oi5 6imujqujjpQ hnütiqiugüniú t GniljLbGujjhG ppmübpp úfi$nwnG i5bfuwíj[iqi3m{ tmiugujgGbimj hfiqpujinujjJiû tthljinpnG nt hfidßfi IjiuinfrnG niurtftljuJi:

Snijg t щрфШ, np uinwsuiüniú Ьй Gnp mjiuiti 3>nirmGjnt.pbp. ft t5bl¡ U bpl)pb^mj[iü бЬгщЬр, úfippbiiujfiG 1|шрфод5рйЬр, [пЦш[ г^ЬйшштршдЦшд uibqujúujubp, ujqujin hfiúpbp: Ujrj t^ЬЦшОЬрд finGfiqtughuij{i hbuiUujGßG Ьй: ЬщЬршфй nLimpaiúiuíjnL2uilíUiqnijt] 216 йй hqnp ¿ujfliuqiujpp фЫдоМпрЬй LuniugujgimLd t i}|i5pbLiuj[iü ^шрфидрйЬр ILO |t dn|bljni[ttLÚ; émjg t трфхй, np [UjqbpuijfiG 193 üú 6amiuquijpQ tußiupiugünid t 254 Gú pGnpn¿ înmnGjnipbn. ümljibnqfiriübph. ni únilubnmfiqübph 1фр{и5[1#йшфй гфйЬрйЬр, (6-4)$nuinöjnipbp, h|iqpunnGbp:

ïnmnpfiùfiujijiuQ àbni| umiugfiü UJÜqmú ¿шфф-uó t bptjpnprç u|iGq|btn ЦЫ^трпйшфй úuiliujpaujlffig imuigfiG ¿¡ш^ииргци^ n¿ 6iunujqujjpujjfiG шйдйшй t3>bljinh4ntpjniGD. ûmljibùiujtiG pptuûbpfi uiuippbp IjnúmnGbGinübpfi ИилЗшр uijû фпфп[г1фш5 10.5 ru 1 -fi ú[i?h:

'ЛшрцшршО^шд t miuiqútNlGbpfi ni ptuljtfibpfiujûbpti ¡^ûшl^шt^llШ9^ШJf1 úbfuiuüfiqÚQ luiqbpujjfiü 193 Gi5 ätuntuquijRfi uiqqbgnipjiuúp: "ЧЬИ h úbt)pb[iuj|iO ÓbqpbpQ hiuüqtiuujüniú Ьй miujqú|iriübpti qijuwilnp |Ьтш[. tlüiuu4uJ0ßGbpG: 254 Dú 6tur¡iuqiujpútuú rnulj fiüiuljtnhUuighLUJh ¿lipuiülfjuuL фпцй t ^ЬЙ h |5Ы^Ь|.шфй ÖbqßbpQ, npnüp luniuguiGniú Ьй ¿Gq|iikuui|i^npbG uif)pfiúfirihüujj¡iü qfiúbpGbphg, ¡uit< 193 Gil ámnujquijpúuiü шшЦ {ШиЛцгффид^шф lifiguiólijuit фпцй t Ьр1)рЬ[шфй tíbqgbpo, npnGß ujnujgiuüniú bG tGqfiúwtntiljnpbü i5bl|pbiiuj|iii бЬщЬрЬд:

E.coli ро11)1пЬ|фшйЬр|1 cufuimlnp р|прш[ио 493 M 6ujnuK»iujpùiuù шшЦ ЧЫЗф (5nibL¡mtü t: AB2480 úniimuüui piufyuibp|iuiGbp|i huiúiup q||uua}np |t»uiiu[ ЦйшиЦийрйЬрй Ьй nfidbpübpQ, hui) фЧРЬ 2^lüi1i5 AB 1157 fi huiúiup' fin&jiqujgtiuijli 5>пшп4Ьши4ш0£ЬЬро, hiuinl|uiu|bu óbLfpt¡^uuj|iü tíbrifibpQ

Snijg t inp4iuó, np çbpùujjtiG Ц>ЫцлйЬро ljbGuuiiJn|bljni|_Gbp|i 1фЦпф^рЦ|шйшфй luiqbpujjfiû бшпшдшдейшй (huduiüujli uiüü2tuG bG. бшпшдиурйшй doiuruó gbpúuiumfiguiGfi фофп^игодгиБо 1 uiumfiöuiühg фпрр t:

Ьршцпрдфид t ифЦп^ицр^шйшфй [luqbpiujfiü äuißtuqiujpütuG ni щ|14пфи}р1{)шйшфй ЦпйифОптиЗ^ íhpufh ¿шфйшй ünp úbpnq: Uimugijitió Ьй pjmphiiübpfi üb? !J)ujqujjhG ufiGfupnGJiqiio hw2i{b|.nL Gnp pwGuiàLbp: ^шцлйшрЬр^шб L hbuiLuqnmi|uj<) t n¿ qàmjfiG Lj.LUiönq útiowitmjpbpniú [Luqbpmjfiü п^шршйшОтгш^шчпцй nj qôuijjiG gpniúQ:

Информация о работе

Гурзадян, Гагик Григорьевич
доктора физико-математических наук
Ереван, 1996
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Лазерная фотоионизация ДНК ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Лазерная фотоионизация ДНК"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Лазерная фотоионизация ДНК
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика