Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Двухквантовые взаимодействия лазерного излучения видимого диапазона с биологическими молекулами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Двухквантовые взаимодействия лазерного излучения видимого диапазона с биологическими молекулами"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 535.37+577.336

РГ6 од

МЕШАЛКИН Юрий Петрович

ДВУХКВАНТОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ВИДИМОГО ДИАПАЗОНА С БИОЛОГИЧЕСКИМИ МОЛЕКУЛАМИ

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Красноярск - 1998

Работа выполнена в лаборатории лазерной спектроскопии кафедры "Электронные приборы" Новосибирского государственного технического университета

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор физико-математических наук ПЯБелобров доктор физико-математических наук В.А.Гайслер профессор, доктор физико-математических наук А.П. Демченко

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Красноярский государственный университет

Защита состоится "14" 1998 г. в "№" часов

на заседании Специализированного совета по защите докторских диссертаций Д 003.45.01 при Институте биофизики Сибирского отделения Академии наук России по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН г.Красноярск

Автореферат разослан "-? 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

канд.физ.-мат. наук

Косолапова Л.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возможность двухфотонного поглощения была теоретически предсказана еще в 30-е годы Марией Геп-перт-Майер. Ей было показано, что существует отличная от нуля вероятность одновременного поглощения двух квантов, пропорциональ-ная прогаведеиию интенсивностей двух световых потоков, если поглощаются два кванта с разными энергиями (цветной эксперимент), или квадрату интенсивности, если приложена всего одна мода (одноцветный эксперимент) [Л1]. Поэтому при одинаковых мощностях поглощаемого излучения переход молекул в возбужденное состояние в результате однофотонного поглощения происходит в среднем через каждые 10"7 - 10"8 с, а в результате двухфотонного поглощения - не чаще чем в 10"3 с [Л2].

Первые эксперименты по регистрации двухфотонного поглощения в молекулярных системах были выполнены Кайзером и Гарретом уже в 1961 году, сразу же после создаиия лазеров. В их одноцветных экспериментах излучением рубинового лазера (/.=694,3 нм) возбуждалась голубая люминесценция (^.=425 нм) кристалла фтористого кальция с примесью ионов европия (Сар2:Еи 2+) [ЛЗ]. Кванта красного света недостаточно для возбуждения голубой люминесценции и только при одновремешюм поглощении двух квантов требуемая энергия может быть получена:

Ш+Ш = Ег-Ее

где Ег - энергия верхнего возбужденного уровня, Ег - энергия основного уровня.

В последующих работах двухфотонное поглощение наблюдалось в некоторых органических кристаллах: пирене, антрацене, 3,4-бен-зпирене [Л4], бетойной и ацетилсалициловой кислотах [Л5], нафталине [Л6]; в органических жидкостях: бензоле [Л7] и антрацене [Л8].

В настоящей работе показано, что двухфотонное поглощение лазерного излучением видимого диапазона характерно для многих биологических молекул - белков, нуклеиновых кислот и некоторых физиологически активных веществ. При этом специфика объектов ис-следоващш потребовала создания оригинальной конструкции лазерного двухфотонного спектрометра и методики измерения сечений двухфотонного поглощения биомолекул.

Двухфотонные эффекты начинают проявляться уже при плотностях мощности порядка 105 Вт/см2. Такие плотности достижимы в некоторых методах лазерной медшщны, однако при этом двухфотонные эффекты не рассматриваются в качестве побочных результатов взаимодействия излучения с веществом. Учитывая тенденцию к росту мощности используемых в медицине источников лазерного излучения, изучение двухфотонного поглощения лазерного излучения биоорганическими молекулами актуально для составления общей картины биофизических процессов, определяющих специфику воздействия лазерного излучения на организм и объясняющих биологические эффекты и, вероятно, более отдаленные последствия.

С середины 90-х годов сфокусированное лазерное излучение эффективно используется в медицинской практике для двухфотонного возбуждения фармацевтических препаратов, вводимых в опухолевые ткани (фотодинамическая терапия) и селективного поражения бактерий Salmonella (ORNL's Biological and Environmental Research Program, USA).

Флуоресцентные метки с двухфотонным возбуждением могут составить основу сверхчувствительных аналитических методов. Нижний предел детектирования флуоресцентных меток при линейном возбуждении составляет 10 5 - 10 6 молекул в пробе, а при двухфотонном возбуждении - около 1000 молекул в пробе. При этом нижний предел понижается с ростом эффективности двухфотонно-возбуждаемой люминесценции метки.

Актуально развитие методов двухквантовой спектроскопии в направлении получения дополнительной информации о молекулярной структуре и процессах внутри- и межмолекулярного переноса энергии возбуждения. Определенные перспективы могут быть связаны с предложенными в данной работе методами оценки эффективных размеров л-электронных облаков молекул и параметров нелинейности сложных органических и биологических молекул.

И наконец, поиск веществ с большими сечениями двухфотонного поглощения и эффективной двухфотонно-возбуждаемой люминесценцией (квадрофоры), в том числе, и среди биоорганических молекул, актуально для развития некоторых прикладных направлений нелинейной оптики: 1) разработки методов фотодинамической терапии раковых заболеваний с двухфотонным возбуждением фотосенсибилизаторов; 2) флуоресцентной конфокальной микроскопии с двухфотонным

возбуждением; 3) построения объемных изображений с помощью двухфотонно-возбуждаемой люминесценции; 4) создания объемных оптических носителей информации на фотохромных материалах с двухфотошюй записью и считыванием.

Цель н задачи исследования. Целью работы явилось изучение двухбайтовых эффектов взаимодействия лазерного излучения с биологическими и органическими молекулами.

В связи с этим поставлены следующие задачи:

1. Разработать автоматизированный лазерный спектрометр для исследовашы спектров возбуждения и спектров двухфотонно-возбуждаемой люминесценции биоорганических молекул.

2. Показать возможность существования двухфотонного поглощения лазерного излучения видимого диапазона различными типами биологических молекул и молекул биологически активных веществ.

3: Разработать метод измерения сечетшй дпухфотошюго поглощения биомолекул не зависящий от пространственных и временных характеристик лазерного излучения (метод двухквантового эталона).

4. Показать связь сечений двухфотошюго поглощения с молекулярной структурой (модель п- электронного облака).

5. Теоретически и экспериментально исследовать двухступенчатые процессы взаимодействия лазерного излучения с красителями и разработать метод исследования переноса энергии возбуждения с высоких возбужденных синглетных состояний (метод характеристических зависимостей).

Научная новизна. В результате проведенных исследований разработаны новые экспериментальные методы и подходы формирующие новое направление - двухфотопная лазерная спектроскопия биологических молекул. Полученные экспериментальные результаты, установленные закономерности и их интерпретация определяют основные защищаемые положения.

На защиту выносятся:

1. Автоматизированный лазерный спектрометр для исследования спектров двухфотонно-возбуждаемой люминесценции и люминесценции из высоких возбужденных состояний биоорганических молекул и органических красителей и спектры двухфотощго-возбуждаемой люминесценции органических и биологических молекул, измеренные впервые.

2. Метод двухквантового эталона для измерения сечений двух-фотонного поглощения органических и биологических молекул не зависящий от пространственных и временных флуктуаций лазерного излучения, концентрационные зависимости сечений и значения сечений двухфотонного поглощения ряда органических молекул, биологических молекул и молекул биологически активных веществ, измеренные впервые.

3. Модель л-электронного облака, позволяющая на основе измерений сечений двухфотонного поглощения оценить эффективные размеры эффективных я-электронных облаков и значения эффективных радиусов электронных облаков органических и биологических молекул.

4. Метод характеристических зависимостей, основанный на измерениях с помощью управляемого аттенюатора возбуждающего излучения зависимости интенсивности коротковолновой люминесценции из высоких возбужденных состояний от интенсивности возбуждения и определение параметров нелинейности - показателя участия данного высшего синглетного состояния в процессах переноса энергии возбуждения.

5. Представление о биологической ткани как нелинейной оптической среде приводящей к появлению в ней гармоник основного излучения в процессе распространения излучения видимого диапазона.

Практическая ценность. Метод двухквантового эталона позволяет измерять сечения двухфотонного поглощения до 10~54 см4с/фот мол, что по чувствительности на два порядка выше ранее существующих методов измерений сечений. Метод может быть легко реализован при измерениях на других длинах волн и с другими источниками лазерной накачки и найти широкое применение для поиска эффективных материалов для практических приложений (фотохром-ных материалов, красителей для двухфотонной фотодинамической терапии, сред для объемных транспарантов). Измеренные сечения двухфотонного поглощения являются фундаментальными константами и могут составить основу таблиц нелинейных оптических характеристик органических и биологических молекул. Вводимая классификация - сильных и слабых квадрофоров позволяет проводить отбор и сравнение молекул - перспективных кандидатов для прикладных применений, использующих двухфотонно-возбуждаемую люминесценцию.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на 1 Всесоюзном биофизическом съезде (Моск-ва,1982), V Всесоюзном симпозиуме по химии и физике белков и пептидов (Баку, 1980), VI Симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), ХП1 Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Минск, 1988), XV Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Санкт-Петербург,1995), XI Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике (Москва, 1998), Международной кон-ферешщи "Лазер-91" (Сан-Диего,США,1991), на Международном совещании "Биолюминесценция в экологии и образовании" (Красноярск, 1994), на Международных научно-технических конференциях "Актуальные проблемы электронного приборостроения" (Новосибирск, 1992,1994,1996, 1998), на X и XI Международной Вавиловской конференции Новосибирск, 1990,1997), на 2 Европейском биофизическом конгрессе (Орлеан, Франция, 1997), на 1 Корейско-Российском симпозиуме "КОРУС-97" (Ульсан, Южная Корея,1997,) на научных семинарах в институтах СО РАН: биоорганической химии, автоматики и электрометрии, лазерной физики (Новосибирск), биофизики (Красноярск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 36 работ. Материалы диссертациошюй работы отражены в шести научно-исследовательских отчетах по программам Университеты России "Физика лазеров и лазерные системы" - МЛЦ МГУ (1993,1994,1996) и "ФИЗМАТ" (1993,1994,1995).

Личный вклад автора состоял в проведении всех экспериментальных и теоретических работ по теме диссертации. Автору принадлежит идея измерения сечений ДФП с калибровкой каналов спектрометра по эталону (метод эталона), экспериментально реализованная совместно с сотрудниками лаборатории лазерной спектроскопии; модель л- электронного облака и все расчеты размеров электронных облаков органических и биологических молекул и все биофизические интерпретации двухфотонных взаимодействий лазерного излучения с биологическими молекулами.

Список используемых сокращений. БАВ - биологически активные вещества, ВВСС - высшие возбужденные синглетные состояния, ДФВЛ - двухфотонно-возбуэвдаемая люминесценция, ДФП - двухфо-тоннос поглощение, МСБ - р-бис-О-метилстерилбензол, 5'<1АМР - 5'-

дезоксирибо-аденин монофосфат, 5'dCMP - 5'-дезоксирибо-цитозш1 монофосфат, 5'dAGP - 5'-дезокснрибо-гуашш монофосфат, 5'dATP -5'дезоксирибо-тимин монофосфат, DODCI- 3,3-диэтилоксадикарбо-цианиниодид, РОРОР - 1,4-ди-(5-фенилоксазолил-2) бензол.

Структура работы. Диссертационная работа изложена на 320 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, четырех глав с изложением результатов работы, заключения, выводов и списка литературы (188 источников, в т.ч. 115 - зарубежных). Диссертация иллюстрирована 96 рисунками и 13 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Двухквантовые эффекты взаимодействия лазерного излучения с молекулами основаны на представлениях нелинейной оптики и молекулярной спектроскопии. В первой главе "Двухквантовые процессы в молекулярных системах" даны основные определения двухфотонных и двухступенчатых процессов поглощения и определено сечение двухфотонного поглощения (ДФГ1) - основного параметра, характеризующего эффективность двухфотонного взаимодействия излучения с молекулами и зависящий от природы вещества.

Квантовомеханическое описание вероятности двухфотошюго перехода (W) и сечения ДФП (5 gf ) в системе двух реальных уровней g и f и виртуального промежуточного уровня к, получено в тензорной форме (цветной эксперимент) [Л9]:

W = 8gflil2» kQiQ2g(Pi +Q2)ISgf|2 где g(Q!+Q2) - форма линии поглощения (в первом приближении гауссова кривая); Ii и I2 - интенсивности лазерного излучения с частотами Qi иП2:

(e,<g I г | k>)(<f I г | k>e2) (е 2<к | г ! g>)(<f ] г | Ье,)

|Sgrl=Z - + -

- Q 1 - к 1 о Ц^-^-кгО

где г -радиус-вектор электрона.

Для сложных ^голекул выполнить строгий расчет полных матричных элементов дипольных моментов сделать невозможно, что существенно ограничивает возможность использования двухфотонной спектроскопии для изучения органических и биологических молекул в

А

конденсированной фазе. Необходимы новые подходы к интерпретации спектров двухфотонного поглощения и сечений ДФП.

Прямая регистрация двухфотонного поглощения органическими и биологическими молекулами является сложной экспериментальной задачей. 1-Молярный раствор вещества с сечением ДФП К)"50 см 4 с/фот мол (1ГМ - гепперт-майер) в кювете с оптическим путем 1 см ослабляет световой поток с плотностью фотонов 1025 фот/см2 с на

(сШЯО = -8 п о 1: с1х ~ I Ю-50 6 1023 10251 100% « 6% Вещества в реальных концентрациях 103 - 10'5 М ослабляют лазерное излучение на величину сравнимую с пространственными и временными флуктуациями лазерного пучка.

Для люминесцирующих молекул более перспективны методы регистрации двухфотонного поглощения, основанные на измерении двухфотонно-возбуждаемой люминесценции (ДФВЛ). На основе решения динамических уравнений для населенности уровней получены выражения связывающие интенсивность ДФВЛ с сечением ДФП с учетом различных релаксационных процессов: внутренней конверсии, синглет-триплетные конверсии, светового тушения и синглет-синглетной аннигиляции. Интенсивность ДФВЛ при возбуждении лазерными импульсами с длительностью больше времени жизни первого возбужденного синглетного состояния равна:

I люм = "Л б п012 „0,6 (одноцветный эксперимент) Зависимость ^ Ьпом будем называть характеристической зависимостью. Тангенс угла наклона (порядок нелинейности) такой зависимости равен 2 для двухфотонных процессов.

Во второй части первой главы дан обзор двухквантовых взаимодействий в биологии. Несмотря на ограниченный экспериментальный материал, тем не менее, можно выделить три группы двухквантовых взаимодействий в зависимости от энергии квантов:

1) высокие энергии квантов (УФ-кванты). Суммарная энергия двух квантов достигает 9-10 эВ, что превышает пороги фотоиоиизации и фотодиссоциации молекул. Результатом такого взаимодействия является радиолиз молекул воды и появление продуктов фотораспада молекул. Такие двухфотонные процессы наиболее хорошо изучены [Л10], в том числе и методом ЭПР [Л11].

2) кванты излучения видимого диапазона. Суммарной энергии достаточно для возбуждения молекул, поглощающих в УФ области (белки, нуклеотиды, БАВ). Результатом нелинейного поглощения яв-

ляется межмолекулярный перенос значительной энергии с реальным биологическим эффектом.

3) кванты ПК-излучения. Суммарной энергии достаточно для возбуждения молекул, поглощающих в видимой области спектра (красители, пигменты, железосодержащие белки, фотохромы) без заметного биологического эффекта, но с большими прикладными возможностями в плане визуализации излучения и построения объемных изображений.

Вторая глава диссертации «Экспериментальные методы двух-фотонной лазерной спектроскопии» посвящена описанию методов исследования спектров двухфотошюго возбуждения (ДФВ), спектров ДФВЛ и методам измерения сечений ДФП. Анализ всех существующих методов регистрации спектров и измерения сечений ДФП показывает их непригодность для исследования биологических молекул. Сформулированы требования к спектрометру для исследования двухбайтовых процессов в биологических системах:

1) регистрировать спектры ДФВ с использованием перестраиваемого лазера на красителях в диапазоне длин волн 550-590 нм;

2) регистрировать спектры ДФВЛ с возбуждением второй гармоникой Ыс1:УАО лазером в диапазоне длин волн 280-420 нм;

3) регистрировать спектры люминесценции из высоких возбужденных синглетных состояний (ВВСС) в диапазоне длин волн 280-420 нм;

4) измерять зависимости интенсивности люминесценции от интенсивности возбуждения;

5) измерять сечения ДФП до значений 10"55 см4 с/фот мол;

6) регистрацию спектров и зависимостей проводить в автоматизированном режиме с накоплением статистики до 10000 измерений на каждой длине волны, с вычитанием шумов, учетом спектральных характеристик ФЭУ и фильтров, с использованием сплайн-интерполяций при построении спектров.

Оптическая схема разработанного спектрометра приведена на рис. 1. Импульсы с фотодиода и ФЭУ с длительностью около 200 не, соответствующие одному лазерному импульсу, запоминались пиковыми детекторами, оцифровывались многоканальным АЦП в стандарте КАМАК и поступали в управляющую ЭВМ, где производились накопление и обработка информации, построение спектров и расчет сечений ДФП.

В последующей модернизации экспериментальной установки разработана плата расширения для управлошя спектрометром и обработки результатов измерений на ЮМ РС [15].

Рис. 1. Оптическая схема двухфотонного лазерного спектрометра

Для измерения сечений ДФП предложен метод двухбайтового эталона [10]. Суть метода заключается в одновременном измерении интенсивности ДФВЛ в исследуемом образце (1Х) и в эталоне (10) - веществе с известным сечением ДФП на данной длине волны (5о). В этом случае сечение ДФП образца (5*) может быть измерено как: Ix сх цх

8Х = у - 80,

1о Со "По

где у - аппаратный коэффициент, зависящий от геометрии установки, эффективности сбора и преобразования сигналов ДФВЛ образца и эталона, определяемый экспериментально; г|х , г|0 - квантовые выходы люминесценции образца и эталона, соответственно, Сх , С0 - молярные концентрации образца и эталона. В качестве эталона используется

и

сцинциллятор р-бис о-метилстерилбензол МСБ фирмы «Eastman Kodak» с сечением 3,3 10"49 см4с/фот мол на данной длине волны [Л 12].

В третьей главе диссертации приведены спектры ДФВЛ, характеристические зависимости и результаты измерений сечений ДФП органических молекул, являющихся предшественниками биологических молекул и молекул биологически активных веществ - бензола, нафталина, антрацена, фенола, гидрохинона, резорцина, пирокатехина, а- и Р- нафтолов и ванилина (таблица 1). Для всех этих молекул двухфо-тонная природа люминесценции подтверждается квадратичными зависимостями интенсивности ДФВЛ от интенсивности возбуждающего излучения, полученные с помощью управляемого аттеныоатора (Рис.2).

Для отбора органических молекул для прикладных задач, основанных на использовании ДФВЛ вводится определение квадрофоров - веществ, люминесцирующих в результате двухфотонного поглощ-

Рис.2. Характеристическая зависимость ДФВЛ фенола

Для количественного описания квадрофоров вводится параметр эффективности ДФВЛ - ц, численно равный:

ц = (г1 5) Ю50

Вещества с [I <1 предлагается называть слабыми квадрофорами, с 1 < ц < 100 - квадрофорами, а с д > 100 - сильными квадрофорами. Простые органические молекулы являются, как правило, слабыми квадрофорами (Таблица 1).

Анализ сечений ДФП органических молекул показывает их зависимость от структуры молекул, наличия боковых заместителей и анне-лирования бензольных колец.

Предложена модель тс-электронного облака [11] согласно которой дпухфотонное поглощение происходит лишь тогда, когда в пределах делокализованного электронного облака л-элекгронов одновременно находятся два фотона (Рис.3).

Рис.3, тс-электронное облако молекулы бензола.

В приближении сферического облака его радиус Я связан с сечением двухфотонного поглощения (5):

3 I 3 5с

и. = V-

2 п <зи2

где с - скорость света в вакууме, <зул - сечение однофотонного поглощения на половинной длине волны. Вычисленные таким образом радиусы эффективных л-электрошшх облаков органических молекул (Таблица 1) соизмеримы с геометрическими размерами С-С связей (1,39 А в молекуле бензола).

Наибольший радиус делокализованного 7с-электронного облака имеет молекула бензола, обладающая сферической симметрией (11=2,55 А). Введение боковых заместителей в молекулу бензола приводит к появлению дипольного момента, а также к искажению п-электронного облака.

В предлагаемой модели искажение электронного облака при введении боковых заместителей или ашгелировании бензольных колец отбывается параметром - р, вычисляемым как отношение радиуса эффективного тс-электронного облака молекулы к радиусу эффективного л-электронного облака молекулы бензола (Таблица 1). Уменыпе-

ние параметра р отмечается при Р-замещении (нафтол) и в случаях, когда бензольные кольца или боковые группы не лежат в одной плоскости (бифенил).

Таблица 1.

Сечения ДФП на длине волны 532 нм (8), эффективность ДФВЛ (ц), радиус эффективного 7с-электронного облака (И), параметр искажения сферической симметрии тс-электронного облака (р) слабых органических квадрофоров

Вещество Раствори тель 8 см4 с/фот мол И Я А Р

Бензол 1,0 10"51 7,0 Ю'4 2,55 1

Фенол - 2,6 КГ51 0,026 1,97 0,77

Хлорбензол вода 7,0 10"53 1,0 Ю-4 0,69 0,27

Гидрохинон вода 6,0 10"52 1,49

этанол 9,1 10'52 9,0 10"3 1,79 0,70

Резорцин этанол 2,0 10"51 0,060 1,75 0,69

Пирокатехин этанол 5,2 10 "51 0,052 2,37 0,93

Вг-гидрохинон этанол 4,5 10 '52 1,32 0,52

Ванилин этанол 1,1 10 51 0,011 1,44 0,56

Бифенил этанол 3,5 10'52 6,0 10"3 0,49 0,19

Нафталин этанол 1,6 10 "51 0,048 0,95 0,37

а-Нафтол этанол 1,7 10 '51 0,034 1,56 0,61

(З-Нафтол этанол 2,4 10 -51 0,048 0,91 0,36

Антрацен 1,7 10 "50 0,058 0,75 0,29

В четвертой главе приведены экспериментальные результаты изучения двухфотонного взаимодействия лазерного излучения видимого диапазона с биологическими молекулами.

Ароматические аминокислоты - триптофан, тирозин и феьшлаланин, имеющие спектры поглощения в УФ области спектра (250-300 нм), могут поглощать излучение II гармоники Ыс1:УАО лазера с длиной волны 532 нм по двухфотонному механизму [ 6, 9,13,14].

Двухфотонная природа люминесценции ароматических аминокислот подтверждается квадратичной характеристической зависи-

те

мостыо. Положения максимумов люминесценции, полуширина лшпш и характерные зависимости от рН среды показывают, что как и при однофотонном поглощении люминесцирующим является первое возбужденное синглстное состояние Бь

Б0 + 2 ПО -> Б 1* -> Б о + ПО п

Сечения двухфотонного поглощения ароматических амшюкислот по порядку величин существешю не отличаются от сечений ДФП слабых органических квадрофоров (Таблица 2).

На основе модели «л-электронного облака» определены геометрические размеры эффективных гс-электронных облаков ароматических аминокислот и вычислены их параметры искажения сферической симметрии (Таблица 2).

Таблица 2

Сечения ДФП (5) на длине волны 532 им, эффективность ДФВЛ (ц), радиус эффективного я-электронного облака (I*) и параметр искажения сферической симметрии и-электронного облака (р) молекул ароматических амнпокнелот

Аминокислота 5 см 4 с/фот мол Я О л Р

Триптофан (1,55+0,02) 10"51 0,07 1,10 0,43

Тирозин (2,33±0,08) 10"52 5,5 10"3 0,96 0,38

Фенилаланин (6,14+0,45) 10"53 3,1 10"4 1,66 0,65

Белки - лизоцим, бычий сывороточный альбумин (БСА), трипсин, химотрипсиноген А, пепсин и фибриноген поглощают по двухфо-тонному механизму излучение второй гармоники Нс13*:УАО лазера [5, 12-¡4, 28, 32]. Двухфотонное поглощение обусловлено наличием в их структуре остатков триптофана. Так как размеры белковых макромолекул и количество остатков триптофана в их первичной структуре различны, сечения ДФП измерены и рассчитаны с учетом относительного содержшшя остатков триптофана на 1 ООО аминокислот (Таблица

Таблица 3.

Сечения ДФП (8), размеры эффективных ^-электронных облаков (Я) и параметр искажения электронного облака остатков триптофана в белковых макромолекулах

Белок 5 Л с Р Локальное

см4 с/фот мол А окружение

Лизоцим 3,36 Ю"51 1,41 1,28 Внутри молекулы в жестком окружении нескольких подвижных

9,00 10"52 полярных групп

Химотрипсино- 0,92 0,84 Внутри молекулы в

ген А 7,49 10"н жестком окружении

Трипсин 0,86 0,78 Внутри молекулы в жестком окружении нескольких подвижных

7,98 10"54 полярных групп

Альбумин 0,19 0,17 На поверхности молекулы в контакте с молекулами связанной

1,39 10'54 воды

Пепсин 0,11 0,10 На поверхности молекулы в контакте с молекулами связанной воды

Размеры эффективных л-электронных облаков триптофана и искажение их сферической симметрии в зависимости от локального окружения хромофора в белковой макромолекуле. По мере выхода остатков триптофана на поверхность белковой макромолекулы и уменьшения жесткости окружения размеры эффективных л-электронных облаков уменьшаются (Таблица 3).

При денатурации белков у которых остатки триптофана находятся в жестком окружении внутри белковой макромолекулы наблюдается уменьшение размеров эффективных гс-электронных облаков и параметра искажения сферической симметрии - р, что свидетельствует о

разрыве контактов остатков триптофана с боковыми группами соседних аминокислот и их выходу в водное окружешге (лизоцим).

При денатурации белков с остатками триптофана находящимися на поверхности белковой глобулы в контакте с молекулами воды изменение размеров эффективных я-электрошшх облаков достоверно не обнаружено (альбумин) (Таблица 4).

Таблица 4

Геометрические размеры тг-электронных облаков триптофана в na niBiu.iv и денатурированных белках

Белок Состояние Квантовый 8 Я

выход см4 с/фот мол А

Лизоцим нативный 0,07 3,36 ю -м 1,41

тепловая 2,87 10 "51

денатурация 0,082 1,34

Альбумин нативный 0,32 7,98 10 -54 0,191

тепловая 7,60 10 -54

денатурация 0,35 0,186

Сыворотка крови - поглощает излучение второй гармоники К(13+:УЛ(т лазера [23]. Сравнение спектров ДФВЛ сыворотки и спектров ДФВЛ альбумтша показывает, что двухфотонное поглощение сыворотки обусловлено белковой фракцией.

Для моделирования патологии использовалась контрольная сыворотка «НшпаИо1 Р».

В патологической сыворотке отмечается рост интенсивности ДФВЛ в красной области спектра (Рис.4), связанный, предположительно, с повышенной концентрацией триглицеридов в контрольном материале. Концентрация глюкозы, холестерина и мочевины не влияет на форму спектра ДФВЛ сыворотки крови.

Двухфотонная спектроскопия сыворотки крови представляет интерес для объяснения механизмов терапевтического воздействия лазерного излучения на кровь, а также в перспективе может использоваться в качестве нового инструмеотального аналитического метода.

длина волны (нм)

Рис. 4. Спектр ДФВЛ нормальной (а) и патологической (б) контрольных сывороток крови

Нуклеиновые кислоты, имеющие спектры поглощения в ближней УФ области способны поглощать излучение второй гармоники Кс13':УАС лазера (532 нм) по двухфотонному механизму [15].

Пример спектров ДФВЛ некоторых дезоксирибонуклеотидов приведен на рисунке 5.

Рис. 5. Спектры ДФВЛ 5'<1АСР (а) и 5'сЮМР (б)

Результаты измерений сечений ДФП дезоксирибонуклеотидов и параметров их я-электронных облаков приведены в Таблице 5.

Наибольшее сечение ДФП имеет 5'-дезоксирибо-тимин монофосфат. Это не противоречит общим положениям, что тимин играет основную роль в фотохимических реакциях в нуклеиновых кислотах. Пуриновые основания гуанин и аденин, по видимому, имеют несколь-

ко меньшее сечение, но в пределах того же порядка величины. Достаточно высокие сечеиия ДФП нуклеотидов обусловлены наличием де-локалгоованных систем л-электронов в их структурах (например, в молекуле аденина 12 делокализоваиных я-электронов). Радиусы дело-кализовашшх я-электрошшх облаков, рассчитшшые через сечения ДФП приведены в таблице 5.

Таблица 5

Длина волны ДФВЛ {X), сечения ДФП (8), эффективность ДФВЛ (}1) и радиус эффективного я-электронпого облака (И) молекул дсзокснрибонуклеотидов.

Нуклеотид А 8 И И.

нм см4 с/фот мол А

5'с1АМР 363 1,61 Ю"50 4,2 10'4 1,67

5'сЮМР 343 2,01 Ю~50 6,0 10"4 1,94

5'ёТМР 340 2,20 Ю"50 2,2 Ю"4 2,00

5'(1СМР 324 2,10 Ю-50 1,7 10"4 1,98

ДПК - поглощает излучение второй гармоники Ш34: УАС лазера по двухфотонному механизму.

Сечение ДФП ДНК с молекулярной массой 106 дальтон составило 1,25 10"54 см 4с/фот мол [15].

Известны и другие оценки сечения ДФП нуклеотидов в ДНК на основании измерения концентрации продуктов фотораспада (цикло-бутилпиримидинов), выполненные Хилекампом с сотр. [Л 12]. Полученное усредненное значение сечения ДФП среднестатистического нуклеотида - 5 10 "53 см 4с/фот мол необходимо как минимум увеличить в два раза, т.к. в образовании циклобутшширнмидшгоп не участвуют гуанин и аденин. Кроме того, небольшое сечение, в сравнении с сечением ДФП триптофана и белков, противоречит тому, что при лазерном микрооблучении клеток наиболее уязвимы не белковые структуры, а хромосомы [Л 13].

Биологически активные вещества - адреналин, новокаин, кордиамин, кофеин, аминазин, аспирин, гепарин и аскорбиновая кислота, с полосами поглощения в УФ области спектра, поглощают излучение

второй гармоники Ш3+:УЛО лазера с длиной волны 532 1ш по двух-фотошюму механизму. На рисунке 6 представлен спектр ДФВЛ новокаина - одного из наиболее сильных биологических квадрофоров.

280 320 360 400

длина волны, нм

Рис.6. Спектр ДФВЛ новокаина.

Рис. 7. Характеристическая зависимость ДФВЛ новокаина.

Для некоторых БАВ измерены сечения ДФП и вычислены геометрические размеры эффективных и-электронных облаков (Таблица 6).

Обращает на себя внимание аномально высокое сечение ДФП новокаина [20]. Новокаин единственный среди биологических молекул квадрофор с ц > 1.

Таблица 6

Длина волны максимума ДВФЛ (Я,2г), сечение ДФП (5), эффективность ДФВЛ (ц) и параметры эффективных тс-элсктронных облаков молекул биологически активных веществ

Вещество 8 § Р

нм см 4 с/фот мол А

Адреналин 314 3,22 10"" 3,2 10"3 0,48 0,19

Новокаин 356 3,07 10'49 3,1 5,28 2,07

Кордиамин 390 1,00 10"53 1,0 Ю"4 0,28 0,11

Кофеин 380 5,36 10"53 5,4 10"4 0,28 0,11

Гепарин 296 не измерено

Аспирин 336 не измерено

Аминазин >420 не измерено

Аскорбат 386 не измерено

Лидокаин нет -

Хиноин нет -

Папаверин нет -

В заключительной части четвертой главы обсуждаются полученные результаты. Отмечается, что двухфотонное поглощение лазерного излучения видимого диапазона характерно для большого числа биологических молекул, имеющих в структуре систему сопряженных двойных связей (как правило, бензольное кольцо). Несмотря на то, что в большинстве случаев сечения ДФП биомолекул имеют значения шоке 10"51 см4 с/ фот мол, у отдельных биомолекул сечения ДФП могут принимать значения порядка 10"49 - Ю"50 см4 с/фот мол , и в сочетании с высоким квантовым выходом люминесценции среди них можно найти достаточно эффективные квадрофоры.

При наличии в структуре биологических тканей, органов и клеток гютетщальных мишеней двухфототюго взаимодействия необходимо рассматривать двухфотонное поглощение как побочный эффект любого лазерного воздействия на биологические системы как в лазерной хирургии, так и в терапии.

Благодаря большей глубины проникновения излучения видимого диапазона в биологическую ткань нелинейные эффекты могут стать

причиной ряда патологий, в том числе, причиной активации онкогенов в ДНК и селективной фотоактивации БАВ. Расчет, выполнешшй на основе гиперболического закона Ламберта-Бугера-Бера, показывает, что для активации мишени с сечением 10"52 см4 с/фот мол по двухфо-тонпому механизму нужна интенсивность видомого излучения в 2,7 раза меньшей интенсивности Уф излучения, необходимой для активации этой мишени по линейному механизму.

Двухфотонная спектроскопия как метод исследования биоорганических молекул развивает представления о делокализации я-электро-1юв и переносе электрона в пределах делокализовашгого я-элект-рошюго облака как в пределах молекулы, так и между молекулами..

Полученные численные значения размеров эффективных я-элсктропных облаков позволяет сделать два вывода:

1. В белковых макромолекулах нет условий для перекрывания электронных облаков отдельных ароматических аминокислот с образованием достаточно протяженных делокализованных я-электронных облаков. Однако в области активных центров с учетом я-электронов пептидных групп такая делокализация вполне возможна

Избирательное воздействие отдельных БАВ на белковые макромолекулы может происходить по типу создания межмолекулярных делокализованных я-элсктронных облаков. Именно делокализация я-электронов позволяет осуществлять перенос энергии в пространственно разделенных молекулярных системах. В качестве примера обсуждаются, полученные ранее автором методом ЯМР, результаты изучения взаимодействия адреналина с коллагеном [ 1, 26,27].

Предполагается, что ряд местных анестетиков (и прежде всего новокаин) блокируют нервную проводимость создавая делокализо-ванное я-элскгронное облако с мембранными белками, нарушая ионную проводимость мембран.

2. В полинуклеотидных структурах и ДНК делокализованные л-электронные облака могут быть образованы не только комплементарными основаниями соседних спиралей, но и соседними основаниями одной спирали. Плоскости оснований, расположенных одно над другим, взаимно параллельны и расстояние между ними - 3,4 А, тогда как радиусы эффективных я-электронных облаков дезокси-рибонуклеотидов лежат в пределах 1,67 - 2,00 А. Следовательно, возможен перенос я-элсктрона на значительные расстояния вдоль макро-

молекулы ДНК, что и объясняет ее полупроводниковые свойства [ЛИ].

В пятой главе «Двухступенчатое возбуждение высших синглет-ных состояний молекул красителей» теоретически и экспериментально изучены двухфотониые процессы поглощения с участием реальных промежуточных уровней и релаксацией энергии возбуждения в виде коротковолновой люминесценции из высоких возбужденных синглет-ных состояний (ВВСС).

ВВСС заселяются в результате ступенчатого поглощения:

Бо +ЬП -> Б/ + ЛО 8„ Численными методами решены кинетические уравнения для насе-ленностей трех-и четырех синглетных уровней [ 8] (Рис.8):

п з = 512 п о + стп I п 1 - Г32 п з - Р п з - I п з П2= Г32 И з - Г21П2 - Рп2 - стт1п2 П1= ао1по - о п I п 1 + Г 21 п 1 - XV 1 п (- Г)0 п 1 п7 — XV 1 п ] -ктпт N = по + П| + п2 + пз + пх

где стт - сечение тушения, И - константа скорости переноса энер-гии возбуждения, \У( - константа скорости интеркомбинационной конвер-С1ш; кт - константа скорости распада триплетного состояшм Т|, определяемая конверсией на Я о и фосфоресценцией. В качестве фиксированных величин выбраны: Г32 = 10й с"1; Г21 = Ю10 с"1; Сто ~ ст п = 10* 16 см2; = 10» с1.

Варьируемыми параметрами являлись: 5: 10~48 -10"41 см4 с/фот мол стт: Ю-16-1013 см2 Р: 10й -Ю14^1 кт: 106 - 10" с'1

В численных расчетах интенсивность возбуждающего излучения варьировалась в пределах 1023 - 1028 фот/см2 с.

Численные решения выполнены методом Гаусса и получены в виде зависимостей ^ п; от ^ I, где п, - населешгости соответствующих люминесцирующих уровней, I - интенсивность возбуждения. Введен параметр п - порядок нелинейности, определяемый как тангенс угла наклона графической зависимости ^ ц = {(^ I).

эт

сжетогое

Рис.8. Многоуровневая система с двухквантовым возбуждением и возможными каналами релаксации энергии возбуждения.

Показано, что для двухквантовых процессов порядок нелинейности сохраняется равным двум для высших возбужденных синглетных состояний во всем интервале интенсивностей возбуждения, если вклад светового тушения или механизмов переноса энергии возбуждения с высших синглетных состояний незначителен.

При «включении» механизмов тушения (Рис.9) или переноса порядок нелинейности становится меньшим двух при интенсивностях возбуждения больших 5 1025 фот /см2 с.

Люминесценцию из высоких возбужденных синглетных состояний при двухступенчатом возбуждении красителей можно экспериментально обнаружить в виде коротковолновых полос относительно основной полосы линейной люминесценции.

Рис.9. Влияние светового тушения от = 10"14 см2, Р = 0.

На рис. 10 приведен спектр коротковолновой люминесценции красителя О-160, для которого характерна зависимость интенсивностей максимумов от концентрации. Линейная люминесценция красителя О-160 с максимумом 600 нм по интенсивности на пять порядков выше.

260 300 340 380 длина волны (нм)

Рис.10. Коротковолновая люминесценции из высших возбужде1шых синглетных состояний красителя 0-160.

Коротковолновая люминесценция из ВВСС при двухступенчатом возбуждении излучением второй гармоники №13+:УА() лазера наблюдалась в ряде красителей (Таблица 7).

Таблица 7.

Максимумы основной (А,) и коротковолновой (А,кл) люминесценции некоторых красителей

Краситель Растворитель X ^•кр

нм нм

Малахитовый зеленый вода 850 368, 384 (плечо)

Метиленовый голубой вода 700 • 366

Бриллиантовый зеленый этанол 780 294(0,1); 340(1,0)

Флуоресцеин натрия вода 525 278(0,1 );312(0,2);368( 1,0)

Фуксин кислый вода 308 (0,5); 390 (1,0)

Конго красный вода 624 390

Акридиновый красный вода 356

Фталоцианин этанол 314 (0,7); 326 (0,5)

680 386(1,0)

Краситель О-160 этанол 600 298 (1,0); 392 (0,7)

Сафранин вода 585 316(1,0);362(0,4);384(0,7)

Феназин этанол 467 316,-420

Родамин 6в 60% этанол 569 308 (0,4); 386 (1,0)

Родамин незамещенный 60% этанол 535 278 (0,2); 310 (1,0)

Родамин В вода 599 294(0,3);322(0,4)384 (1,0)

Родамин С вода 578 302 (0,6); 396 (1,0)

Высокие возбуждешше синглетные состояния красителей имеют времена жизни порядка 10 "и - 10 ",5 с, что затрудняет их исследования. Вместе с тем, ВВСС активны в фотохимических процессах и через них может происходить перенос энергии возбуждения при интер-каляции красителя в клетку (фотодинамическая терапия) или в ДНК (метод афшшой фотомодификации [Л15]).

Предложен метод зондирования ВВСС на предмет их участия в фотохимических процессах. Метод основан на измерениях характеристических зависимостей коротковолновой люминесценции из ВВСС от интенсивности возбуждающего излучения и определния порядка нелинейности. При участии данного возбужденного синглетного состояния в фотохимических процессах порядок нелинейности для коротковолновой люминесценции с этого уровня становится меньше 2. На примере красителя сафранина показано, что фотоионизация красителя происходит при поглощении кванта возбуждающего излучения молекулой красителя, находящейся в состоянии Бг [7,30].

Коротковолновая люминесценция из ВВСС была зарегистрирована в фотохромных материалах в записанной форме. В сочетании с линейными спектрами поглощения и люминесценции нелинейная флуоресцентная спектроскопия позволяет значительно расширить представления о системе электронных уровней и путях релаксации энергии возбуждения.

В шестой главе «Новые прикладные направления двухфотошюй спектроскопии» показаны перспективы использования двухфотонных взаимодействий лазерного излучения с биологическими и органическими молекулами.

Фотодинамическая терапия с двухфотонным возбуждением.

Основной проблемой в фотодинамической терапии является доставка лазерного излучения к фотодинамическому красителю избирательно накапливаемому в опухоли. При использование гематопорфи-рина и его прошводных излучение аргонового лазера проникает на глубину, ограниченную поверхностным слоем кожи. Двухфотонное возбуждение красителей в позволяет перейти к более длинноволновому излучению, что приводит не только к увеличению глубины проникновения до 1 см, но и к значительному снижению нагрузки на здоровые ткани, а также к уменьшению фоточувствителыюсть кожи в процессе выполнения терапии.

Для реализации такой технологии необходимы фотодинамические красители с высокими сечениями ДФП. Одним из таких красителей может стать фталоцианин, нелинейные оптические свойства которого продемонстрированы в настоящей работе.

Флуоресцентная конфокальная микроскопия с двухфотонным возбуждением.

Двухфотонное возбуждение является наиболее удобным способом реализации точечного освещения внутри объема [Л16]. Два когерентных луча проникают в объем без поглощения до точки их пересечения. При сложении энергии в точке пересечения лучей возникает люминес-ЦС1ЩИЯ, регистрируемая точечным детектором .

В настоящее время методы конфокальной лазерной флуоресцентной спектроскопии развиваются в направлешш совершенствования техники получения изображения [Л17-18]. Вместе с тем, измерение сечений биологических молекул, а также неповреждакяцих клетку маркеров - двухфотонных зондов- квадрофоров, позволит подобрать оптимальные условия построения изображения с максимально вы-

соким разрешением и идентифицировать биологические структуры в сложных объектах.

Построение объемных изображений скрещенными лазерными лучами.

В последнее время интенсивно развиваются методы пространственной визуализации, основанные на лазерных технологиях. Преимуществом таких технологий является построение не проективных, а трехмерных изображений, сформированных в физическом объеме све-торассеивающей или светоизлучающей среды лазерным лучом . Примером такой технологии является метод построения трехмерного изображения в объеме легированного флуоресцентного стекла при двухступенчатом возбуждении [Л19]. Диаграмма энергетических уровней и принципы получения изображений приведены на рисунке 11.

При использовании легированных молекулярных кристаллов с большим набором люминесцентных уровней и системы полупроводниковых лазеров (по три с каждой стороны) можно получить три длины волны люминесценции в точке фокусировки. Такая технология может быть положена в основу нового типа цветного экрана.

Ег

Рис. 11. Построение 3 Э изображения в объеме кристалла.

Двухфотонная рсалография на фотохромах.

Устройства оптической памяти могут создаваться на основе фо-тохромных материалов, под действием света переходящих из основного состояния (форма А) в «записанное» (форма В). Предлагается ис-

7Я

пользовать двухфотоннос взаимодействие лазерного излучения с фотохромом для записи и чтения информации в таких устройствах [Л20].

Схума уровней и переходов в таких устройствах приведена на рисунке 12.

Очевидно, что практическая реализация данного метода существенным образом зависит от подбора фотохромного материала с высокой эффективностью ДФВЛ.

Во всем мире идет поиск и синтез оптимальных для устройств оптической памяти фотохромных материалов. Одним из первых материалов па котором был реализован принцип молекулярной оптической памяти был бактериородопсин [Л21]. Вероятно, что в фотосинте-зирующих системах можно найти и другие перспективные материалы. В связи с этим исследования нелинейных оптических свойств биологических молекул представляется весьма перспективным направлением молекулярной биофизики.

Предложенный нами метод измерения сечений ДФП может стать основой для отбора перспективных фотохромных материалов [22].

--- 8о

Рис.12. Двухфотонная реалография на фотохромах

Органические и биорганичсские квадрофоры.

В большинстве прикладных применении двухфотонных взаимодействий лазерного излучения с веществом необходима высокая эффективность ДФВЛ, т.е. используемые вещества должны быть хорошими квадрофорами. В таблице 8 приведены сводные результаты измерений сечений ДФП и эффективности ДФВЛ органических и биологических молекул.

Вводимое нами определение квадрофоров [35] позволяет хорошо дифференцировать вещества по эффективности ДФВЛ. Как следует из таблицы 8 сильных квадрофоров очень мало и их поиск и синтез активно ведется. Такие вещества могут быть найдены и среди биологических молекул.

Недавно появилось сообщение о синтезе вещества AF 50 с эффективностью в несколько тысяч единиц по нашему критерию [Л22] и это вещество сразу же стало коммерческой тайной.

Двухфотонпыс зонды.

Метилстерилбензол имеет характерный спектр ДФВЛ и высокую эффективность ДФВЛ, что позволяет использовать его в качестве метки в аналитических применениях. Порог обнаружения МСБ по спектру ДФВЛ составил 1,2"'°моль [Л23]. Нам удалось регистрировать МСБ в концентрации 5 10'9моль. Ограничения в применении МСБ в качестве зонда в биологических системах связаны с его растворимостью только в органических растворителях.

Двухфотонной меткой могут стать и БАВ с высокой эффективностью ДФВЛ, например, новокаин.

Большие перспективы могут быть связаны с квадрофорной меткой ковалентно связанной с биологическими молекулами и введенной в структуру клетки. Для реализации этого направления также необходим поиск сильных органических квадрофоров.

ЯП

Таблица 8

Органические и биологические квадрофоры

Вещество Растворитель Длина волны, нм Сечение ДФП см4 с/фот мол Эффективность ДФВЛ

1 МСБ циклогексан 568 6,9 10'** 646,6

2 Родамин 6 G этанол 694,3 1,8 10"48 169,2

3 Родамин 6 G этанол 1064 1,2 Ю-49 11,3

4 DODCI метанол 1064 2,2 Ю49 11,0

5 Родамин В этанол 1064 1,3 10" 9,1

6 РОРОР циклогексан 694,3 8,0 Ю"50 7,4

7 Кумарин этанол 694,3 1,0 1049 4,5

8 Новокаин вода 532 3,1 lo"19 3,1

9 Акридиновый

красный этанол 1064 2,8 10"50 1,3

10 Нафталин монокристалл 532 2,5 Ю'50 0,93

11 Антрацен этанол 532 1,7 Ю'50 0,51

12 Флуоресцеин этанол 1064 1,8 10'51 0,17

13 Триптофан вода 532 3,1 10'51 0,07

14 Резорцин этанол 532 2,0 10'51 0,06

15. Антрацен циклогексан 694,3 1,6 10"51 0,06

16 Нафталин монокристалл 694,3 1,3 10'51 0,05

17 Пирокатехин этанол 532 5,2 10'51 0,05

18 Р-Нафтол этанол 532 2,4 10"51 0,05

19 Нафталин этанол 532 1,6 10'51 0,04

20 а-Нафтол этанол 532 1,7 10"51 0,04

21 Фенол этанол 532 2,6 10"51 0,03

22 Ванилин этанол 532 1,1 10"51 0,011

23 Гидрохинон этанол 532 9,1 10" 9,0 10J

24 Бифенил этанол 532 3,5 10"52 6,0 10 "3

25 Тирозин вода 532 2,6 10" 5,5 10'3

26 Адреналин гидрохлорид 532 3,2 10 й 3,2 103

27 Стильбен метанол 532 8,0 Ю"50 1,7 10"3

28 Бензол - 532 1,0 10'51 7,0 104

29 Фенилалашш вода 532 8,2 1053 3,1 10"4

Г>1

Выводы

1. Двухфотошюе взаимодействие интенсивного лазерного излучения с биологическими и органическими молекулами является безпоро-говым фундаментальным физическим явлением.

2. Процессы двухфотонного поглощения могут быть положены в основу спектральных методов получения информации о геометрических размерах я-электрошшх облаков органических и биологических молекул.

3. Для количественного учета эффективности двухфотонного взаимодействия лазерного излучения с молекулами можно использовать сечение двухфотонного поглощения на данной длине волны. Сечения ДФП являются фундаментальными константами и измерены различными методами для ряда органических молекул.

4. Предложен метод двухквантового эталона, позволяющий измерять сечения ДФП люминесцирующих органических и биологических молекул. Метод позволяет измерять сечения до 10"55 см4с/фот мол и не зависит от пространственных и фремешшх флуктуаций лазерного излучения.

5. Впервые измерены сечения ДФП биологических молекул: ароматических аминокислот; белков: лизоцима, альбумина, трипсина, пепсина, химотрипскногена; сыворотки крови, дезоксирибонуклеоти-дов и ДНК, а также молекул биологически активных веществ: адреналина, новокаина, кофеина и кордиамина. Сечения ДФП биологических молекул сравнимы по величине с сечениями ДФП органических молекул.

6. В силу существования двухфотонного поглощения лазерного излучения биологическими молекулами, биологическую ткань необходимо рассматривать как нелинейно-оптическую среду, в процессе распространения в которой падающей волны видимого диапазона, возможно появление гармоник основного излучения.

7. Учет двухфотошшх процессов взаимодействия излучения с веществом необходим для составления общей картины физических процессов, определяющих специфику воздействия лазерного излучения на организм.

8. В системах сложных электронных уровней органических молекул возможны двухступенчатые процессы заселения короткоживу-щих высших возбужденных синглетных состояний. Предлагается использовать кванты видимого излучения для зондирования УФ уровней

я?

путем измерения характеристических зависимостей коротковолновой люминесценции из ВВСС от интенсивности возбуждения и определе-■ ния параметра нелинейности. По отклонению параметра нелинейности от двух можно судить о существовании дополнительного фотохимического канала релаксации энергии возбуждения.

9. Двухквантовые взаимодействия лазерного излучения с биологическими и органическими молекулами, как и молекулярными кристаллами, могут стать основой новых прикладных методов: двухфо-тонпой фотодинамической терапии, конфокальной флуоресцентной микроскопии с двухфотонным возбуждением, двухфотонной реало-графии на фотохромных материалах и построения объемных изображений.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Мешалкин Ю.П., Габуда С.П., Щербаков В.Н., Айзман Р.И. Взаимодействие коллагена с ионами натрия // Биофизика - 1982. -Т.27, №4. - С.590-594.

2. Мешалкин Ю.П., Толочко Б.П., Кулипанов Г.Н., Габуда С.П. Использование синхротрошюго излучения для изучения динамики структурных изменешш коллагена при дегидратации // Биофизика -1984. -Т.29, №2. -С.316-319.

3. Мешалгаш Ю.П., Резвухин А.И., Коробкова E.H. Спектры 13С ЯМР высокого разрешения пептидов коллагена // Биофизика - 1986. -Т.31, №3,- С.422-425.

4. Мешалкин Ю.П. Об изомерии иминокислот в пептидах коллагена // Биофизика - 1988. - Т.ЗЗ, №2. - С.358-360.

5. Мешалкин Ю.П., Грошев Д.Е., Макуха В.К., Гуськов Л.Н., Лисицын В.Н. Двухфотонное возбуждение альбумина // Биофизика -1990.-Т. 35, №5.-С.739-741.

6. Грошев Д.Е., Лисицын В.Н., Макуха В.К., Мешалкин Ю.П., Ру-денко П.А. Двухфотонное возбуждение люминесценции ароматических аминокислот // Журнал прикладной спектроскопии - 1990. - Т.53, №1. - С.149-151.

7. Грошев Д.Е., Лисицын В.Н., Мешалкин Ю.П. Коротковолновая люминесценция сафранина //Журнал прикладной спектроскопии -1992. Т.57, №1-2. - С.112-115.

8. Мешшпсин Ю.П. Четырехуровневая система с двухквантовым возбуждением: зависимость люминесценции от возбуждения // Журнал прикладной спектроскопии - 1994. - Т.61, №5-6 (11-12). - С.424-428.

9. Мешалкин Ю.П., Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К. Измерите сечений двухфотонного поглощения ароматических аминокислот //Журнал прикладной спектроскопии - 1996. - Т.63, №3. -С.432-435.

10. Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К., Мешалкин Ю.П. Метод двухквантового эталона для измерения сечения двухфотонного поглощения сложных органических молекул // Оптика и спектроскопия - 1995. - Т.78, №3. - С.400-402.

11. Мешалкин Ю.П. Сечения двухфотонного поглощения и геометрические размеры электронных облаков молекул оксибензолов // Оптика и спектроскопия - 1998. - Т.84, №2. - С.217-221.

12. Мешалкин Ю.П., Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К. Двухфотошюе поглощение видимого света белками // Доклады РАН -1995,- Т.340, №6. - С.825-826.

13. Мешалкин Ю.П. Сечение двухфотонного поглощения ароматических аминокислот и белков // Квантовая электроника - 1996. -Т.23, №6. С.551-552.

14. Meshalkin Yr.P. Two-photon absorption cross-section of aromatic ammo-acids and proteins //Quantum Electronics - 1996. V.26, N 6. -P.536-537.

15. Мешалкин Ю.П., Алфимов E.E., Макуха В.К. Сечения двухфотонного поглощения дезоксирибонуклеотидов и ДНК //Квантовая электроника - 1998. - Т.25. №8. - С.714-716.

16. Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К., Мешалкин Ю.П. Плата расширения для автоматизированного двухфотонного лазерного спектрометра на базе компьютера ЮМ PC// Приборы и техника эксперимента - 1998, №2. - С.164-165.

17. Лисицын В.Н., Мешалкин Ю.П. Двухфотонные процессы взаимодействия лазерного излучения с живой тканью // Приборы и системы управления - 1993, №5. - С.11-12.

18. Лисицын В.Н., Мешалкин Ю.П. Нелинейные эффекты взаимодействия лазерного излучения с живой тканью: роль и возможное биологическое значение // Электронная техника - 1993. Сер.7, №2(177)-3(178). - С.52-54.

Я4

19. Meshalkin Yr.P., Alfimov E.E., Groshev D.E., Makukha V.K. The two-photon fluorescence excitation spectroscopy ob biological molecules // Pros.SPIE. - 1996. - V.2802. - P. 191-199.

20. Meshalkin Yr.P. Two-photon absorption of laser radiation biological activity molccules //European Biophys.Journal - 1997. V.26, N1. -P. 118.

21. Лисицын B.H., Мешалкин Ю.П. Физические основы применения лазеров в биолопш и медицине И Учебн.пособие. Новосибирск. НГТУ. - 1993.-41 С.

22. Angelutc А.А., Chikishev A.Yu., Koroteev N.I., Magnitskii S.A., Meshalkin Yu.P., Ozheredov I.A., Orhancev S.Yu., Shubin V.V., Sok-olyuk N.T. Photochemical and spectroscopic properties of naphtacenequi-nones. Candidates for 3D optical memory devices //OTuB - 1996. - P. 178-180.

23. Kudryasheva N.S., Meshalkin Y.P., Shigorin D.N. Upper electron-excited states in bacterial bioluminescence //Bioluminescence and Chemiluminescence, Ed.J.W. Hastings, L.J.Kricka, P.E.Stanley. John Wiley and Sons. NY. - 1996. - P. 178-180.

24. Alfimov E.E., Groshev D.E., Makukha V.K., Meshalkin Yr.P. Two-photon absorption of laser radiation in visible range in blood's serum // Proc. First Korea-Russia Int.Symposium on Science and Technology -KORUS' 97, Ulsan, Republic of Korea. - 1997. -P.318-321.

25. Мешалкин Ю.П., Евдокимов А.А. Модель Шефера-Шмидта в структурных задачах нелинейной спектроскопии органических молекул // Сборник научных трудов НГТУ. Новосибирск. - 1995. - Т.1, -С.109-112.

26. Щербаков В.Н., Габуда С.П., Мешалкин Ю.П. Молекулярные эффекты взаимодействия коллагена с адреналином //Тез.Докл.Всес. Симп. «Магшггный резонанс в биологии и медицине». Черноголовка. - 1981.-С.112.

27. Мешалкин Ю.П., Габуда С.П. Действие адреналина на ионо-депонирующую функцию соединительной ткани // Тез. Докл. Всес. Конф. «Физиология экстремальных состояний и индивидуальная защита человека». Москва. - 1982. - С.531-532.

28. Габуда С.П., Мешалкин Ю.П., Ржавин А.Ф. Физика взаимодействия биополимеров с водой в свете спектроскопии ЯМР низкого разрешения // Тез. Докл.1 Всес. Биофизического съезда. Москва. -1982. С.93.

29. Макуха В.К., Грошев Д.Е., Мешалкин Ю.П. Двухфото1шая лазерная спектроскопия белков // Тез.Всес.научн.сессии, посвящ. Дню Радио. Москва. - 1989. - С. 50.

30. Грошев Д.Е., Лисицын В.Н., Мешалкин Ю.П. Нелинейная каскадная люминесценция сафранина при лазерном возбуждении // Мат. Межд.Конф. «Актуальные проблемы электронного приборостроения» АПЭП-92. Новосибирск. - 1992. - Т.З. - С. 17-20.

31. Лисицын В.Н., Мешалкин Ю.П. Роль и значение двухкванто-вых процессов в лазерной медицине // Мат.Межд.Конф. «Актуальные проблемы электронного приборостроения» АПЭП-92. Новосибирск. -1992. - Т.З. -С.3-7.

32. Мешалкин Ю.П., Грошев Д.Е., Макуха В.К. Относительный метод измерения сечения двухфотонного поглощения органических и биологических молекул // Тез. Докл. Российской научн.-техн. Конф. «Информатика и проблемы телекоммуникаций». Новосибирск. - 1994. - С.113-114.

33. Мешалкин Ю.П., Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К. Сечение двухфотонного поглощения белков с различным количеством ароматических аминокислот в первичной структуре // Мат. 2 Межд. Конф. «Актуальные проблемы электронного приборостроения» АПЭП-94. - Т.6. - С.3-7.

34. Алфимов Е.Е., Грошев Д.Е., Макуха В.К., Мешалкин Ю.П. Измерение сечения двухфотонного поглощения в растворах биоорга-иических молекул с учетом ширины линии люминесценции // Мат. 3 Межд.Конф. «Актуальные проблемы электронного приборостроения» АПЭП-96. - 1996. - Т.З. - С.51-53.

35. Alfimov Е.Е., Makukha V.K., Meshalkiu Yr.P. Tverdokhleb P.E., Trubitskoj A.B. New criterion for organic molecules selection in information-optical two-photon technologies //Abs.XVI International Conference on Coherent and Nonlinear Optics ICONO'98. Moscow 29 June-3 July 1998. - 1998. -P.238.

36. Meshalkin Yu.P., Alfimov E.E., Makukha V.K. Two-photon absorption cross sections of deoxyribonucleotides and DNA // Quantum Electronics - 1998. - V.28, N8. - P.872-874.

ЛИТЕРАТУРА

[Л1] Goeppert-Mayer М/ Uber Elementarakte mit Zwei Quanten-sprimgen//Ann. DerPhys. -1931. - V.9. - P.273-278.

[Л2] Саржсвский A.M. Оптика: В 2 т. - Минск: Изд-во Университетское, 1986. Т.2. -319 с.

[ЛЗ] Kaiser W., Garret C.G.B. Two-photon excitation in Ca F2:Eu2+ Whys. Rev. Letters. -1961. - V.7. -P.229-231.

[Л4] Peticolas W.L., Goldbough J.P., Reickhoff K.E. Double photon excitation in organic crystals //Phys.Rev.Letters. - 1963. - V. 10. - P.43-48.

[Л5] Горелик B.C., Козулин Е.А. Двухфотошю-воздуждаемая люминесценция в органических кристаллах // Краткие сообщения по физике, - 1992. - В. 7-8. - С.66-70.

[Л6] Bergman A., Jortner J. Two-photon absorption spectra of crystalline naphtalene and of the naphtalene molecule in solution //Chem.Phys.Lett. -1974. - V.26, N3. - 323-326.

[Л7] Tam A.C., Patel C.K.N, Two-photon absorption spectra and crossection measurements in liquids //Nature. - 1979. - V.280. - P.304-306.

[Л8] Peticolas W.L., Norris R., RieckoffK.E. Polarization effects in the two-photon excitation of antracene fluorescence //J.Chem.Phys. - 1965. -V.42, N12. - P.4164-4169.

[J19] Бердж P. Спектроскопия одно- и двухфотонного возбуждения// Сверхчувствительная лазерная спектроскопия / Под ред. Д.Клайджера. -М.: Мир, 1986. - С.138-213.

[Л 10] Никогосян Д.Н. Физические принципы нелинейной лазерной фотобиологии // Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения /Под ред. А.Б.Рубина. М.: Наука, 1988. -С.70-78.

[Л11] Каюгнин Л.П., Грибова З.П., Азизова О.А. Электронный парамагнитный резонанс фотопроцессов биологических соединений. М.: Наука, 1973. -304 с.

[Л 12] Kennedy S.M., Lytle F.E. p-bis (O-Methylstyril) benzene as a power-sguarcd senser for two-photon absorption measurements between 537 and 694 nm //Anal.Chem. - 1986. -V.58, N13. - P.2643-2647.

[Л13] Kochevar I.E., Iiefetz Y., Dunn D.A., Deutsch T.F., Bucley L., Hillinkamp P. DNA photo products formed using high intensity 532-nm laser radiation //Proc. Laser Applications in Life Sciences. Part II. SPIE -1990. -V. 1403. - P.756-763.

[JIM] Berns M.W., Olson R.S., Rounds D.E. In vitro production of chromosomal lesions with an argon laser microbeam // Nature -1969. -V.221. - P. 74-75.

[JI15] Ладик Я. Квантовая биохимия для химиков и биологов. -М.:Мир, 1975 -256 с.

[Л16] Бенимецкая Л.З., Козионов А.Л., Муратов Л.С., Новожилов С.Ю., Штокман М.И. Нелинейная лазерная фотомодификация нуклеиновых кислот, индуцированная интеркалированными красителями // Биофизика - 1987. - Т.32, в.4. - С.716-731.

[Л 17] Denk W., Strickler J.H., Webb W.W. Two-photon fluorescence scanning microscopy //Science - 1990. - V.248. - P.73-75.

[Л18] Hanninen P.E., Hell S.W., Salo J., Cremer C., Soini E. Two-photon excitation 4Pi-confocal microscopy: a new fool for biological research //Appl. Phys. Lett. - 1995. - V.66. - P. 1698.

[Л19] Downing E., Hesselink L., Ralston J., Macfarlane R. A three-color, solid-state, three-dimensional display //Science - 1996. - V.273. P. 1185-1189.

[Л20] Hunter S., Kiamilev F., Esener S., Parthenopoulos D.A., Rentzepis P.M. Potentials of two-photon based 3-D optical memories for high performance computing //Applied Optics - 1990. - V.29, N 14. -P.2058-2066.

[Л21] Birge R.R., Lawrence A.F. Optical random access memory based on bacteriorhodopsin //Symp.Mol.Electron Biosensors and Biocom-put: 19 th Annu. Meet. Fine Part; Soc.Div.Biotechnol, Health and Environ. Santa Clare, Calif, July 19-22, 1988. S.I., sa- P.40.

[Л22] Prasad P.N. - личное сообщение.

[Л23] Wirth M.J., Fatunmbi H.O. Very high detectability in two-photon spectroscopy // Anal.Chem. - 1990. - V.62, N 9. - P.973-976.

Подписано в печать 12.08.98 г. Формат 84x60x1/16 Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Печ.л. 2,5. Заказ № Ч 5

Отпечатано в типографии Новосибирского государственного технического университета 630092, г. Новосибирск, пр.К.Маркса,20

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Мешалкин, Юрий Петрович, Новосибирск

) I

чУ

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

| президиум ВАК России :

(решение от »19 № г., № '

приедал ученую степень ДСВД^. рукописи

ь^чальнжк^праздениж ВАКРос

1/ЧАн

m:\n-:

'С.Т X £

о 5"

МЕШАЛКИН ЮРИЙ ПЕТРОВИЧ

ДВУХБАЙТОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ВИДИМОГО ДИАПАЗОНА С БИОЛОГИЧЕСКИМИ МОЛЕКУЛАМИ

03.00.02 - биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Новосибирск 1998

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ АО - акусто-оптический АОЗ - акусто-оптический затвор АЦП - аналого-цифровой преобразователь ВВСС - высокие возбужденные синглетные состояния ГМ - гепперт-майер

ДАМ - двухквантовая афинная модификация

ДФВЛ - двухфотонно-возбуждаемая люминесценция

ДФВ - двухфотонное возбуждение

ДФП - двухфотонное поглощение

ИВК - измерительно-вычислительный комплекс

КЛ - коротковолновая люминесценция

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид

ОАЭ - оптико-акустические эффекты

ОФП - однофотонное поглощение

РНК - рибонуклеиновая кислота

СВХ - схема выборки и предварительного хранения

ТРП - триптофан

ТИР - тирозин

УФИ. - устройство формирования импульсов

ФЕН - фенилаланин

ФЭУ - фотоэлектронный умножитель

ШД - шаговый двигатель

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

D0DCI - 3, 3-диэтилоксадикарбоцианиниодид

MSB - п-бис-О-метилстерилбензол

NAQH - никотинадениндинуклеотид

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ... 9

ГЛАВА 1. ДВУХБАЙТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ СИСТЕМАХ ... 17

1.1. Двухфотонные процессы

1.1.1. Двухфотонное поглощение в молекулярных системах ... 21

1.1.2. Сечение двухфотонного поглощения ... 25

1.1.3. Двухфотонно-возбуждаемая люминесценция ... 28

1.2. Двухступенчатые процессы

1.2.1. Двухступенчатое поглощение в системе

синглетных уровней ... 35

1.2.2. Двухступенчатое поглощение в системе

триплетных уровней ... 38

1.3. Двухквантовые процессы в фотобиологии

1.3.1. Многофотонные взаимодействия лазерного излучения с клетками и клеточными структурами при микрооблучении ... 41

1.3.2. Двухквантовые фотоповреждения ДНК ... 44

1.3.3. Двухквантовая фотоионизация белковых молекул ... 53

1.3.4. Двухфотонное поглощение высокоинтенсивного УФ излучения ... 58

1.3.5. Двухфотонное поглощение лазерного излучения

видимого диапазона биологическими молекулами ... 60

1.3.6. Двухфотонное поглощение ИК излучения ... 63

1.4. Выводы главы ... 64

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ДВУХФОТОННОЙ ЛАЗЕРНОЙ

СПЕКТРОСКОПИИ

2.1. Методы двухфотонной спектроскопии молекул

2.1.1. Метод двух источников ... 66

2.1.2. Спектроскопия двухфотонно-возбуждаемой люминесценции ... 68

2.1.3. Спектроскопия двухфотонного возбуждения ... 73

2.2. Автоматизированный лазерный двухфотонный спектрометр

для исследования биологических молекул

2.2.1. Требования к спектрометру: измеряемые параметры ... 77

2.2.2. Автоматизированный спектрометр двухфотонного возбуждения: оптическая схема ... 78

2.2.3. Автоматизированный спектрометр двухфотонно-возбуждаемой люминесценции: оптическая схема ... 81

2.2.4. Измерительно-вычислительный комплекс ... 83

2.2.5. Программное обеспечение измерений ... 87

2.3. Метод двухквантового эталона для измерения сечений

двухфотонного поглощения

2.3.1. Прямые методы измерения сечений ДФП органических молекул ... 91

2.3.2. Косвенные методы измерения сечений ДФП

органических молекул и твердых тел ... 95

2. 3. 3. Сечения ДФП молекулярных кристаллов и

органических молекул ... 102

2. 3. 4. Метод двухквантового эталона ... 106

2.4. Интерпретация результатов измерений сечений ДФП

2. 4.1. Квантовомеханический подход ... 112

2. 4. 2. Геометрическая модель Шефера-Шмидта ... 118

2.5. Выводы главы ... 121

ГЛАВА 3. ОРГАНИЧЕСКИЕ КВАДРОФОРЫ ... 122

3.1. Измерение сечений двухфотонного поглощения органических квадрофоров

3.1.1. Эффекты самоассоциации и сольватации в двухфотонной спектроскопии квадрофоров ... 124

3.1.2. Сечения двухфотонного поглощения органических

молекул ... 127

3.1.3. Факторы, влияющие на точность измерений сечений двухфотонного поглощения ... 130

3.2. Эффективность двухфотонно-возбуждаемой люминесценции и структура слабых органических квадрофоров

3.2.1. Полиядерные ароматические углеводороды ...134

3.2.2. Ароматические углеводороды и их производные ...140

3.3. Геометрические размеры эффективных л-электронных облаков некоторых органических молекул по данным спектроскопии ДФП ... 154

3.4. Выводы главы ...163

ГЛАВА 4. ЛАЗЕРНАЯ ДВУХФ0Т0ННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ

КВАДРОФОРОВ

4.1. Ароматические аминокислоты

4.1.1. Триптофан

4.1.2. Тирозин

164 169

4.1.3. Фенилаланин ... 170

4.2. Белковые макромолекулы

4.2.1. Двухфотонная спектроскопия триптофансодержащих

белков ... 174

4.2.2. Двухфотонная спектроскопия денатурированных

белков ... 182

4.2.3. Двухфотонная спектроскопия сыворотки крови ... 187

4.3. Нуклеиновые кислоты

4.3.1. Мононуклеотиды ... 191

4.3.2. Дезоксирибонуклеиновая кислота ... 197

4.4. Некоторые биологически активные вещества - квадрофоры... 202

4.5. Роль и биологическое значение двухфотонного поглощения излучения видимого диапазона

4.5.1. Двухфотонное взаимодействие излучения с биологическими тканями .. . 209

4.5.2. Электронная структура и биологическая активность молекул ... 215

4.6. Выводы главы ... 218

ГЛАВА 5. ДВУХСТУПЕНЧАТОЕ ВОЗБУЖДЕНИЕ ВЫСШИХ СИНГЛЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ МОЛЕКУЛ КРАСИТЕЛЕЙ

5.1. Трехуровневая система с двухквантовым возбуждением ... 220

5.1.1. Трехуровневая система: основные динамические уравнения ... 221

5.1.2. Трехуровневая система без светового тушения и резонансного переноса энергии возбуждения ... 224

5.1.3. Трехуровневая система с учетом светового тушения ... 228

5.1.4. Трехуровневая система с резонансным переносом

энергии возбуждения . .. 232

5.1.5. Некоторые итоги анализа трехуровневой системы ... 236

5.2. Четырехуровневая система с двухквантовым возбуждением... 238

5.2.1. Четырехуровневая система без учета светового тушения и резонансного переноса энергии возбуждения

5.2.2. Четырехуровневая система с учетом светового тушения

5.2.3. Четырехуровневая система с учетом резонансного переноса энергии возбуждения и светового тушения

5.2.4. Некоторые итоги анализа четырехуровневой системы

5.3. Экспериментальные исследования высоких возбужденных синглетных состояний красителей при двухквантовом возбуждении

5.3.1. Коротковолновая люминесценция красителей при интенсивном лазерном возбуждении

5.3.2. Каскадная люминесценция сафранина 5. 3. 3. Двухступенчатое возбуждение феназина 5.3. 4. Двухквантовые процессы в фотохромах

5.4. Выводы главы

ГЛАВА 6. НОВЫЕ ПРИКЛАДНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ ДВУХФОТОННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ

6.1. Двухквантовая фотодинамическая терапия ... 271

6.1.1. Физические основы фотодинамической терапии ... 274

6.1.2. Двухфотонное возбуждение гематопорфирина ... 276

239

240

242 244

246 254 260 263

6.1.3. Фотодинамические процессы с участием высших

возбужденных синглетных состояний красителей ... 277

6.2. Двухфотонная реалография на фотохромных материалах ... 280

6.3. Построение объемного изображения скрещенными лазерными лучами . .. 283

6.4. Флуоресцентная микроскопия с двухфотонным

возбуждением ... 285

6.5. Выводы главы ... 288

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ... 289

ВЫВОДЫ ... 294

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ ... 296

ПРИЛОЖЕНИЕ

319

"Белое сделать Ньютон из многих цветов умудрился, Так умудрил он людей, верят ему уж сто лет."

Гёте. 1790. Венеция.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Спектроскопические методы всегда играли заметную роль в биофизике. Значительные успехи в развитии представлений о структуре и конформации биологических молекул, их взаимодействиях и преобразованиях связаны с методами ядерного магнитного резонанса и оптической спектроскопии. Однако в последнее время эти, некогда ведущие экспериментальные методы биофизики, уже не дают принципиально новой информации и стали весьма рутинными. Биофизика, как и другие фундаментальные науки испытывает потребность в новых методических подходах. Такие подходы могут быть созданы на экспериментальной базе и теоретических представлениях интенсивно развивающейся, в последнее время, нелинейной оптики конденсированных сред. Один из таких подходов - спектроскопия комбинационного рассеяния успешно развивается в направлении изучения биологических молекул и их взаимодействий.

В настоящей работе развивается другое перспективное для биофизики направление нелинейной оптики - двухквантовая лазерная спектроскопия биологических молекул - т.е. спектроскопия электронных переходов, обусловленных одновременным поглощением двух квантов лазерного излучения.

Возможность двухквантового поглощения была теоретически предсказана еще в 30-е годы, в период зарождения квантовой меха-

ники, Марией Гепперт-Майер, впоследствии автором оболочечной модели ядра - лауреатом нобелевской премии. К тому времени П.Дирак уже рассчитал вероятность двухфотонного рэлеевского и рамановс-кого рассеяния света. Однако Гепперт-Майер впервые указала на вытекающую из теории дисперсии Дирака возможность таких процессов как двухфотонное поглощение и эмиссия. В общем случае, вероятность двухфотонного поглощения пропорциональна произведению интенсивностей двух световых потоков, если поглощаются два кванта с разными энергиями (цветной эксперимент), или квадрату интенсивности, если приложена всего одна мода (одноцветный эксперимент) [1]. Поэтому при одинаковых мощностях поглощаемого излучения переход молекул в возбужденное состояние в результате од-нофотонного поглощения происходит в среднем через каждые 10"7 -

о

10" с, а в результате двухфотонного поглощения - не чаще чем в 10"3 с 121.

Первые эксперименты по регистрации двухфотонного поглощения в молекулярных системах были выполнены Кайзером и Гарретом уже в 1961 году, сразу же после создания лазеров. В их одноцветных экспериментах красным светом рубинового лазера (Х=694, 3 нм) возбуждалась голубая люминесценция (Хр=425 нм) кристалла фтористого кальция с примесью ионов европия (СаР2:Еи2+) [3]. Кванта красного света недостаточно для возбуждения голубой люминесценции и только при одновременном поглощении двух квантов требуемая энергия может быть получена:

ЬЯ + М2 = Ег - Её где - энергия верхнего возбужденного уровня, Её - энергия основного уровня.

В последующих работах двухфотонное поглощение наблюдалось в

некоторых органических кристаллах: пирене, антрацене, 3,4-бенз-пирене [4], бензойной и ацетилсалициловой кислотах, и нафталине [5]; в органических жидкостях: бензоле [6] и антрацене [7].

Причем, поскольку в органических молекулах в конденсированной фазе за счет сложной колебательной и вращательной структуры электронные уровни уширены до 103 см"1, то для получения двухфо-тонного поглощения не требуется наличие точного резонанса: М2 + М2 > Ег - Её Пик интереса исследователей к двухфотонной спектроскопии пришелся на середину 70-х годов, когда объектами исследования стали молекулярные кристаллы, полупроводники и некоторые органические соединения - производные бензола при низкой температуре. В этом случае двухфотонная спектроскопия, основывающаяся на других правилах отбора, чем линейная спектроскопия, открывала перспективы получения дополнительной спектральной информации о запрещенных переходах.

Биологические молекулы лишь эпизодически становились объектами двухфотонной спектроскопии. При этом чаще всего изучались процессы двухфотонного или двухквантового поглощения УФ квантов, приводящие к фотоионизации молекул. Двухфотонные взаимодействия биологических молекул с квантами видимого излучения, в силу меньшей выраженности эффекта, оказались вне рассмотрения.

Однако, по нашему мнению, такие взаимодействия наиболее интересны для молекулярной биофизики. С одной стороны, регистрация спектров двухфотонного поглощения и спектров двухфотонно-возбуж-даемой люминесценции позволяет получать новую спектральную информацию. В частности такой информацией является оценка размеров делокализованного эффективного л:-электронного облака молекулы -

т. е. эффективного расстояния на котором перекрывание электронных облаков соседних молекул приводит к переносу электрона от одной молекулы к другой.

С другой стороны, измерение сечений двухфотонного поглощения биомолекул, впервые выполненное в настоящей работе, позволяет рассматривать биологическую ткань как нелинейную оптическую среду с преобразованием излучения в гармоники высшего порядка. Это положение требует учета биологической роли нелинейных эффектов при рассмотрении взаимодействия интенсивного лазерного излучения с биомолекулами.

В конденсированных средах двухфотонные эффекты начинают проявляться уже при плотностях мощности порядка 105 Вт/см2. Такие плотности достижимы в некоторых методах лазерной медицины, однако при этом двухфотонные эффекты не рассматриваются в качестве побочных результатов взаимодействия излучения с веществом. Учитывая тенденцию к росту мощности используемых в медицине источников лазерного излучения, изучение двухфотонного поглощения лазерного излучения биоорганическими молекулами актуально для составления общей картины физических процессов, определяющих специфику воздействия лазерного излучения на организм и объясняющих биологические эффекты и, вероятно, более отдаленные последствия.

В последнее время наблюдается рост интереса к исследованиям двухфотонного взаимодействия лазерного излучения с конденсированными средами, обусловленный появлением новых прикладных применений: селективного двухфотонного возбуждения фотодинамических красителей; конфокальной флуоресцентной микроскопии с двухфотон-ным возбуждением; построения объемных изображений и создания трехмерной памяти с двухфотонным доступом. Для поиска наиболее

•aítwftPWTWnWkJY РГ\0 П П"4^ |-ГК\Т JT ^ TTTJLTIJ Q TT-"i Т Т ГГП ПГШИП nn/-\ ПТЛЛОЛ Т TOI* jfTJf

uyyvfv i i i wi xx/ix> ítfi uj^iuw xw-^x iЛ ww«¿£4w< л i xwv icona DDUjljx'iГЛС1Л, flCUV'ii'i

ÎMC3 f^nT^QWMLTOf^LfM V nOl/"1./ " = г^п-л лp^ Dг\ ПСЗОТ1 Г*\Т_

1 VV W I V Л1 I Г Itfl UU XXX 1WWX Vf lit IVXWV 1WL V^r V i ГМЗСВД jJUywjyrUD X iUut/Utf Xtf 1 W X V y

ШПГТП ОиикТЬЛ П^ПД^ПУ ^ТТТГЧПГ^ФМФК ПТ'^ПУ4. пгмттп/мпп o mr>y

u^v^w i u^i xi luiivi uu^uuuui ji tij^wu i ti i и w i vw^ uupyiivtviiiui xDiA ПС/ЦОО i Dj D i Wl/l

иыгпо м ñмпnnruuDri^nrn nnnurvníifnouua пna пршоиыа ■йтыу "зяпди

11 iv/j fx w г xwv tux п ivwi vwx w njjwiiw (tw^iv^vi iiivi ,L|v xtf x ^ ^/m^i xx xtf x и x , -* л (

flnoi тмгЬмьгд fiun ппрыирп/иу nFi'uow'pnn tho/WOT пдчшлтма wrnnnw-

WX X WX-JI ХЧ]^! XI VW« WIIWVIWX XX lUWlVlin WVUV1V1WU i и 1 |jCaOwX X X X Xtfl UUiwi iCprí

урита пкипй пя^кт up пиирйипй гпри'тппги'ппмм м гп^ пяныа nujmvrtuvnn—

1VIWl 1 X WV Ш1 1 W J 1 WUlUm 1 1 Wtf 1XXX (Ulli 1 Wl 1 Wi X Ъ 1 ^/WUl VW1 1X1X1 XI WUU^Ud X X Xtf X U1/1WU1VW Du

tdutdпкцпгп пя^рпниги пп^улпфпнипрп гпр1гтппмрфпй rnnrnfiwnrn пй-

x U(i X wv X1_>1 I Wi. w V iw^wwpi x wx w w ^ ii WW X wx IX iwx w wi 1U1V X j-/wiviw X VI xw vwwîxwx W pu.

пптятк Г* ЬЛД ПкТШЛ LfOUT1РНТПЯ1 тмамм пмгшппрьлггг Г* НГЛЧ^МУ ЬГПЯиФППКТНЛ ПкТ—

\_/ Ч_/ A W< X 1-1 W IVXWitf 11S1IVXI X ■■».«. ^ ■ ■ ■ у, ,. t | » j f » д-1 ^ Г I If Р 1 " HIT Р UUUmUlí lUlV^tfl V 1 XXXWlVIllVl IvDCin X WWlSXlVl wDl

упппу лтшлиогт tout tmm Tältmo ^дпдии иоппъыпжип ПРШЙФк FjOQ дптпия-

Л W^Win V iiViflf XX J W WX_| JX_| I J / X . X Ufl VXIV^ J X X i X tb/L/UUiriWlftVi iU vmuti X и W^w UU X и/ши>

THQñl TMM ^ГПРПММРиФЯ МГГТП Пк^ППЙШЛа MPTnnnR ия^ПППРШЛа П/РЦД nnn

i IlUUil^IlIl UlVWUU^Itm^ll IlWlIWl/lUUULfUillIiilfl XVXW X W^WW HUltiUllVlWlilliri Ulli llUVlUi_/

m m у пйпяFintltm

XI С 1 W X 1 VI X ■

i ïoп^ч m чяпяим игг прпппянма îloпкш пя^птм апмппгк ы^ииоиыо

Ц^У tu II I-¿и«,Ци« XXX IlWWlV^UUUillIllH. 1U1V UiVW X Ш tf X W X Xtf IW VU I 1 W^T luí 1МЧ/

nmjYLfn^uTnnkïY ^rMSoiTTnn сзяымппригтпыа ПЯ'ЗРГЩПГП мчтшршла птппптл

Jr ítl VUUU 1 1 WUVlít V X WW х_/ uur XtVXW^ WX XW X WX Xtf 1 tf XW«W WfJX IWX W HUVij IWllIXtfl w í ujyuíí

гяпупнм^м M ri • VáfZ пачрпя (Л г Дмпппгмиргшлуы м ппг^иыиог-

X W«f-f 1V1W1 IX 11 VI 1 1ЧЧЛ. A MU VlUU^jJU V UUtV lllVl/ W VIIWV 1W1 XI XX Wf-SX Uli III xww

If МММ МП nOLfV ПЙМЫ M PHQ ПЯНМР UÍ* ЪФПТ/Г nrunnp изппдп пойма ппи YífinTnU —

1 VI ixrxx 1 XVI Wtf XWX V^T tf 1LA1V1I X XX VUUfÙIUil X I 1 V X lUi и X WI1 W Wl X W W W X 1M1 1|JUiUV XWX X I Xtf X ^fU jf X WX X

unü пйчрпипй рпрыфппрт-гппым лтммиогт iMnvmmMV fiwn ппгмирпля мп now п

X X WI X tf ILAU W JWi XWJTX WX 1W1V X J.T W WX VWX 11 11 X tf XI4SIV1I XX IWWl_^IIf_fjr 14SXU|I Ui W I XWV XWX XX XWWlVIXXk XVIWV ivnj tf 1.

R rnaQW г* ^тиу ппгфйп поим rnpnvmfwp пяим-

W W Wtf 1 W X 1 W WXX XIYX X X W W X XWX Х1УХ WV IV^ y ХЧ/ХХ^С 1 W UU^Ui XXX.

1 Рачпяпптать ичирпмтопьыш ьгпилп поит ппчпп nainuiMÚ исгпоттп-

X ■ 1 LAU J>-/ V-^'W W X X (J IXWXVIW^II X Wtf IUI 1Ш1 X 1 VW1VU ItflWIVWj X XW Uü Wtf Itf ХХЧ/ХЦ1 III IXWWtf 1 W|¿^ w

п^Фк гпоьгфпкт nn^fivwnpuua м гпр^тпм nnuvfanTnuun—nin—

WW/ X W WXXWXVX Jjyi !_/ W W W y Hilf I IX WXX Wl V 1 I^Ul W ^r vj^W X WX XX XW W W W wjf UlVj^ W1V1WI X tf XIV/

УЫЦРП TOUT TMM пипппгяимиргч/му илп пои\т п

XVXI XX 1 W Wl—^ Wl XI X WIXWW^X Uli XXI XWWlVIlf* XVXWtf IWXVjf tf X.

о Пп^я^^ФК пп^упчгипгфк нгптргтпппяииа ttrvYrfinrrnuunrin ппгппттто—

№. 1 iwi VW« WW« X W ииишиош X W W X LJ W y lî^W W X W W WW«X llltfl fL^Wjr i\V^W XWX11XWX W X XWX V ÎWXX^W

има пй^рпипгп MQ m/upuua пмпммпгп пийпячпца пач лмииктмм птлп ппги-

1 IX XV 1 tf 1UVU W J-pf X XWX W X XWV x^r XWllXitfi WXXgb^X X1VXWX W ,Ц1 1W«X XW«W WX XW« ^ WiWV 111 11 ШШН 1 WX XWV 1WX X 1

UOPLfMMM ИЛП noi/u ПЯКЛМ M 1^ЛП TlOlSW naïufM ñun ППГМиРГУЫ flVTUnWWV nOTTTOP'TR

X W Wl VI 11V1I I IVlWtf 1 Wl V jp V 1W«1VXI X IX XVXWV X WX V j V XW«XV1I 1 W X 1 1WX XI 1WWXVI1 W«X V X I X WX IX/XIb W W 1XJ|W W X w ■

Я Рачпяпптать мотпп ичмопонма гоионый ппууЛптпннлпп ппгпп-

. L UUI^fUiUW X и» X и ши X I 1иши 1J1V1 ич^ 1ЧУ111111 jl tiyu 1 II 1W1 и t IUI V 1W

шаыма Fiuni/inrtOLTWп но чапигашнй пт пппг"гпаыгтроыыму ы ппо^лоыыыу

li^UI HIV 1 Ч/IIWItlWV lUlli^ ir I 1 lu UUfbri 1 Wtf 1|Ц| 1 IL WX 1 ipuu 1 ^ Ud XW X U^l 11 ll^ll^ ZI U^Uiri^l 11 ШШ

yanai/TOnurTuii пачошогп нчт/ирииа

liiu^livillll UlUUU^HÜl W I1UII 1U11IU1.

А Ппечать гпачь гоириий ппиуЛптпнилрп ппгплтонма г 1лп notr^r—

X I X 1 WL VW« WW« XW WWtflWU WW XW11X1XX W jf í 1 V^W XWX XX XWX W X XWX V xwxi^wx XX Xtf X W IV1WW X WX V J

папнпы пттп/типпн Гмппопк if- ^ nPLfTnnHHnrTi пппяи-я^

VltfX^XXWXl WX^f^lVXjf pwil V XV1W|L^ WV XW /V UV1U1V1 j^Ulll XWX