Метаболические процессы в нефотосинтезирующих клетках, индуцированные лазерным излучением в УФ, видимой и ближней ИК областях спектра

Кару, Тийна Йоханнесовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Метаболические процессы в нефотосинтезирующих клетках, индуцированные лазерным излучением в УФ, видимой и ближней ИК областях спектра
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Метаболические процессы в нефотосинтезирующих клетках, индуцированные лазерным излучением в УФ, видимой и ближней ИК областях спектра"

АКАДЕМИЯ НАУК ССОР НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОНЭДШЕНИЕ.

На правах рукописи

КАРУ Тийна Йоханнеоовна

УДК 621.373,826:577

ИЕТАБОЖЧЕСКШЗ ШЦШСЫ В НЕФОТОСШПЕЭГРУЩО. КЛЕТКАХ, 1ВДУВДР0ВА1ШЕ ШВЕЯМ ИЗЛУЧЕНИЕМ В УЗ, ИЩКЮИ И БЛИШЕЙ ИК ОБЛАСТЯХ СПЕКТРА

03.00.02 - биофезшса

'АВТОРЕФЕРАТ

диоовггггтда на Оояскшше ученой степени доктора физшсо-иагематичвских наук

Ленинград ~ 1989

Шли пешлат&ш^ 3&290У-

Работа выполнена в Научно-исследовательском центре по технологическим лазерам АН СССР

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Б.С.Непорент .

доктор физико-математических наук, профессор, член-корр. АН БССР А.Н.Рубинов

доктор физико-математических наук П. Г. Плешаков

Ведущая организация: • '

Физический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова

Защита диссертации срстоится "_"_19 года

в _ час на заседании Специализированного совета

Д 003.53.01 при Научно-техническом объодинвЕГПи

АН СССР (I98I03, Ленинград, пр. Огородникова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НТО All СССР.

Автореферат разослан "_"_____ 1903 г.

Учений секретарь Специализированного совета,

кандидат химических наук

В.А.Шкуров

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность исследовшгий

Вслед за созданием первых лазеров ^олее чем 25 лет тому назад почти сразу появился интероо к взаимодействию когерентного монохроматического излучения с биологическими системами. К настоящему времени можно говорить о двух основных направле-шшх в лазерной биомедицине. Это, во-першх, макродеструкция целостности тканей и клеток, являющаяся основой лазерной хирургии, и,во-вторых, молекулярная фотомодицина, основшшая на фотофизических процессах и последующих фотохимических и фотобиологических реакциях в биомолекулах и клетках. Процессы взаимодействия лазерного излучения с биологическими материалами, являющиеся основой лазерной хирургии (коагуляция, сильный нагрев и испарение, абляция, оптический пробой и гидравлический удар), ранео не наблюдались под действием обычного свота из-за его низкой интенсивности. Поэтому в первое десятилетие в лазерной биология и медищше больше вшшания было уделено изучению механизмов взаимодействия мощного лазерного луча с биологическими системами.

Параллельно лазерпно источники начали использовать в традиционных направлениях как фотофизики и фотобиологии (изу-ченио процессов фотосинтеза, зрения), так и фотомедицшш (терапия псориазов, $оторадиациош1ая терапия). В фотомедицшш и фотобиологии сейчас ужо можно говорить о развитии целой области лазерной медико-биологической науки, включающей разнообразные направления, где лазеры применяются как уникальны о инструменты изучения биологических объектов (различные спектральные методы исследования, лазерная микроскопия, голография и т.д.) или как средство воздействия в терапевтической практике. Основой этих методов являются механизмы взаимодействия излучения, лазерного 1Ш1 нелазерного, с биомолекулаш и iut2TKai.ni, которые в принципе могут быть фотоэпергетичоокими (юле, например, фотосинтез), гдо происходит непосредственное эш1:1с;ишо энергии света, или фотоповревдающими (па молекулярном* уровне), фоторогуляторшшп ИЛИ фотоинформациошшш, 1'ДО не происходит запасания анергии. Рассматриваемые и диссертации процессы щмш.чдюзкат ко второй грутшо процессов, т.е. нпфото-

энергетическим. Взаимодействие лазерного излучения с биомо-лекуламп и клетками, которое лежит в основэ нефотоэнергетичэо-ких процессов, охватывает широкий диапазон кнтенсивностей излучения и длительностей времен воздействия, но тем на менее находится исключительно в пределах неразрушащего действия.

С точки зрения клеточной биологии, конечный фотобиологический эффект воздействия излучения определяется главным образом теш клеточзшш структурами (ядро, мембраны, митохондрии) , где протекают начальные стадии (фотофизические и фотохимические) данного фотопроцесса. Хотя некоторые пз нефото-энергетических процессов явились предметом исследований классической фотофизики и фотобиохимии (например, воздействие низкоинтенсивного УФ непрерывного излучения на ДНК), в данной диссертации исследуются процессы, не являющиеся традиционными, во-первых, в смысле источников излучения (импульсные УФ лазерные источники в широком диапазоне интенсивностей и длительностей импульсов, ранее не использованные в УФ фотобиологии клетки), и,во-вторых, в смысле диапазона излучений (видимое и ближнее Ж излучение не было областью исследований нефото-энергетических процессов в нефотосинтезщ)ущпх клетках).

Необходимость проведения систематических исследований по воздействию излучения водимой и ближней ИК областей на клетку появилась в связи о развитием низкоинтенсивной лазерной терапии,осуществляемой в основном при помощи Не-Л/е лазера, которую вполне успешно используют, например, для лечения долго незаживающих ран и трофических язв различной этиологии, где традиционные медикаментозные методы часто являются неэффективными. До сих пор систематические исследования этих явлений и их интерпретация на клеточном уровне отсутствуют.

Большинство авторов, проводя эксперименты по воздействию различных агентов, в том числе УФ и ^-излучения, на культуру клеток, использует в качестве модели культуру в экспоненциальной фазе роста, а данные о воздействии на клетки в стационарной фазе роста даже непрерывного низкоинтонсгазного УФ излучения очень малочисленны.Но именно эта модель, культура клеток в стационарной фазе роста, заслугсиваот большого вшг-маняя с точки зрения онкологии. Общепринятой является сейчас точка зрения, что покоящиеся опухолевые клетки (а они являются одной из основных субпопулжогй в культур* глоток гтацло-

парной фаза роста) являются более резистентными к повреждающим воздействиям, с чем связывают определенные трудности как лучевой, так и химиотерапии опухолей. По данным литературы, культура опухолевых клеток в стационарной фазе роста является удовлетворительной моделью (в смысле составляющих эту культуру субпопуляций) для солидных опухолей. Во всех разделах диссертации проведено сравнительное исследование реакций на облучение культуры клеток HeLa (карцинома человека) в стационарной и экспоненциальной стадиях роста, а в шестой главе исследуется возможное радиомодифицирущее действие лазерного света на клетки в стационарной фазе роста.

1.2. Цель работы

В диссертации проведено систематическое изучение воздействия непрерывного и импульсного (в разных режимах) УФ, видимого и блюшего ИК излучения как на метаболизм клетсси в целом, так и на отдельные структуры клетки. Выполношше исследования преследовали три основные цоли: I) разработка фотофизических и фотобиологических методов воздействия видимого света на нефотоспнтозируюдие клетки и научное обоснование низкоинтенсивной лазерной терапии; 2) расширение возможностей УФ фотофизики и фотобиологии клетки о помощью новых дая этой области науки импульсных лазерных источников; 3) поиски возможностей селективного повреждения лазерным излучением нопролиферирую-щих опухолевых клеток по сравнению с активно пролифорирующимц с целыо повышения эффективности противоопухолевой лучевой терапии.

В результате выполненных.исследований разработано новое направленно в области фотсбпофпзшси и фотобиологии - рэгуля-. торное воздействие ближнего УФ, видимого и ближнего ШС излучения на метаболизм 'юфотосилтезирутеци клоток (прокариоти-ческло и эукарнотическис микроорганизмы, клетки млекопитагацюс),

1.3. Основные защгацаомые положении!:

I. Существование эффекта регуляции метаболизма при воздействии па 1слбтки разной степени организащш монохроматическим излучоштон в ближней УФ, видимой и блшашй 1IK областях.

2. Требования на основные параметры лазерного излучения для проявления регулятор1Шх эффектов в клетке.

3. Существование ранних (в перше минуты и часы после воздействия) и отдаленных (десяти! часов после воздействия) изменений в клеточном метаболизме после облучения.

4. Принцип регуляторного воздействия видалого, ближнего УФ и ближнего ИК излучения на метки. Схемы передачи и усиления регулятор1шх сигналов в эукариотической и прокарио-тяческой клетках.

5. Селективное воздействие импульсного лазерного излучения на покоящиеся клетки по сравнению о активно пролиферирую-

ЩИМЙ.

6. Радиомодафицирующее действие лазерного излучения в УФ и видимом диапазонах на покоящиеся клетки.

1.4. Научная новизна работы

1. Исследовано воздействие низкоинтенсивного излучения в широком диапазоне длин волн, доз и интенсивностей на про-кариотические, примитивные и сложные зукариотические клетки. Установлены условия, при которых свет оказывает стимулирующее воздействие на клеточный метаболизм, и условия, при которых наблюдаются ингибирующее воздействие

или летальность.

2. Определена роль монохроматичности и когерентности в эффективности воздействия видимым, ближним ИК п блшшлм. УФ излучением на клеточный метаболизм.

3. Выяснен физиологический статус клетки, необходимый для проявления регуляторных эффектов излучения.

4. Установлен принцип регуляторного воздействия низкоинтенсивного монохроматического излучения в ближней УФ, видимой и ближней ИК областях спектра. Выявлены молекулярные основы регуляторного воздействия.

5. Исследованы возможности селективного воздействия импульсным лазерным излучением в широком диапазоне дайн волн

и режимов облучения на покоящиеся клетки по сравнению

с активно пролиферирущими. Разработаны два метода селективного повреждения покоящихся опухолевых клеток. 6. Последовало радиомодифицирущее дейотвие лазерного излучения на клеточном уровне различных длин волн и типов излучения. Определены типы излучения, которые могут оказывать либо радиозащитное?либо радиосенсиби-лизируюцее действие. 1

1.5. Научная и практическая ценность

Основным практическим применением монохроматического низкоинтенсивного видимого свота в медицине являетоя лазерная терапия (в основном Ые-А/в лазер, в последние года также Не-Со! лазер и полупроводниковые 6-з.Аъ лазеры). Пред-ставлешше в диссертации результаты по комплексному исследованию воздействия ближнего УФ, видимого и ближнего ИК излучения на клетку создают биологическую основу существующим эмпирическим и несистематическим данным в этой области медицины. Б низкоинтонсивной лазерной терапии получешше дашше позволяют оптимизировать параметры излучения (доппш волны, доза, интенсивность ).

Цикл исследований по мутагенному и летальному действию излучений ХеС|- и Л/&11; лазеров позволяет оценить побочные эффекты использования этих лазеров в практической медицине ( ХеСI лазер считается перспективным для лазерной ангиопластики, а ШЪ,:Шлазер - для лазерной офтальмологии), Дашше о летальном и мутагешюм действии излучения ХеС | лазера ( X =308 нм) гакжо представляют практическую важность в овязи о уменьшенном озонового слоя стратосферы для прогноза воздействия ожидаемого одвига границы попадающего на землю ближнего УО и'лучения.

Получешше в диссортации результаты по селективному воздействию на покоящиеся опухолевые клетки 2-й гармоники Си лазера и излучения А/сР^АСг лазера (основная частота, 2-я и 4-я гармо-

шп'л) могут бить использованы для разработки ношх методов шш модификации существующих методов противоопухолевой терапии.

Полученные в диссертации данные о радиомодифиодрутацем действии излучения Но—Л/в лазера могут быть использованы для разработки или оптимизации методов радиозащиты,

1.6. Апробация работы

Материалы диссертация докладывались на 14 .Всесоюзных и 16 Международных конференциях, симпозиумах, совещаниях и школах: XI, XII, XIII Всесоюзных конференциях по когерентной и нелинейной оптике (Ереван - 1982, Москва - 1985, Минск -1988); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва - 1982); III, 1У Всесоюзных школах по применению лазеров в биологии (Красноввдово - 1983, Кишинев - 1986); Всесоюзной конференции по применению лазеров в народном хозяйстве (Звенигород

- 1985); Всесоюзном симпозиум© "Использование лазерного излучения в сочетании с другими физико-химическими факторами в медицине" (Сухуми - 1983), Всесоюзной конференции по применению лазеров в медицине (Красноярск - 1983); Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы биологического действия оптического излучения " (Ялта - 1984); Всесоюзном совещании по применению лазеров в биологии и медицине (Цущино - 1982); Всесоюзном совещании "Лазеры в народном хозяйстве "(Москва -1988); Менсреспубликанской школе-семинаре по применению лазеров в биологии и медицине (Тарту - 1988, 1989); X и XII Международных школах по квантовой электронике (Эриче, Италия -

1983, 1987); I и II Европейских конгрессах по фотобиологии (Гренобле, Франция - 1986, Падуя, Италия - 1987); Международном симпозиуме по метаболизму цианобактерий (Киос, Греция

- 1985); Меадународном конгрессе "Лазеры в медицине и хирургии" (Болонья, Италия - 1985); X Международном фотобиологическом конгрессе (Иерусалим, Израиль - 1988); ХУ и ХУ1 конгрессах Американского фотобиологического общества (Балтимор, GUIA. - 1987, Харбор, США - 1988); Гордоновсглх конференциях по применению лазеров в биологии и медицине (Мериден, CL1A -

1984, 1988); Международном симпозиуме по биологическому действию неионизирущего издучети КИРО-87 (Стокгольм, Сешсл

- 1987); X. Международном конгрессе но прикладной биомедицине (Нью Орлеане, США - 1988); II Международном симпозиуме по низкоинтенсивной лазерной терапии (Лондон - 1988); Международной конференции по фотодинамшее и применению'лазеров в медицине (Лондон - 1988); Ежегодном конгрессе Американского общества лазерной хирургии и медицины (Арлингтон - 1989).

Материалы диссертации также докладывались на научных семинарах в различных институтах СССР (Институт спектроскопии АН СССР, Институт молекулярной биологии АН СССР, Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР, Всесоюзный кардиологический научный центр АМН СССР) и за рубежом (Институт квантовой оптики, Гархинг, ФРГ - 1981, 1984; Технический университет, Мюнхен, ФРГ - 1981, 1984; Институт биофизической химии, Геттинген, ФРГ - 1981, 1984; Онкологический центр, Гойдель-берг, ФРГ - 1984; Королевский институт, Стокгольм , Швеция -1987; Университет йена, ГДР - 1983; Центр квантовой электроники, Милан, Италия - 1982, 1985; Медицинская школа Неаполитанского университета - 1985, 1987; Институт квантовой оптики, Флоренция, Италия - 1982, 1985; Массачусетский технологический институт, Кембридж, США - 1988; Калифорнийский университет в Беркли, США - 1988; Медицинская школа Гарвардского университета, США - 1988; Онкологический центр им. М.Д.Авдерсона университета Тохас, Хюстон, США - 1988; Университет Техас в Остине, США - 1988; Медицинская школа университета Пенсильвания, США - 1988; Оптический центр университета Аризоны, Тушон, США - 1988; Гай Хоогштал, Лондон - 1988; Бекмановский лазерный институт, Ирвайн;США - 1989; Лазерный институт Медицинской школы университета Юга, Солт Лейк Сити, США -1989; Университет Нью Йорка , США - 1989).

1.7. Публикации

По материалам диссертации опубликовано 57 печатных работ, в том числе одна монография и 5 обзоров, список которых приводится в конце автореферата, а также три препринта. Получены два авторских свидетельства.

1.8. Личный вклад соискателя '

Автор осуществлял выбор направлении исследовашоТ, постановку задач, участвовал в проведении и обсуэденип экспериментов, шторпротировал и обобщал результаты.

1.9. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы. Объем диссертации составляет 249 страниц основного текста. Кроме того, она содержит 112 рисунков, 32 таблицы, список литературы, включающий 484 наименования.

II. СОДЕРЖАНИИ ДИССЕРТАЦИИ

Во введешш сформулироваш задачи и цель исследований, рассмотрона степень новизны и значимость результатов, а также описаны содержание и структура диссертации.

Глава I является вводной. В § I рассмотрены первичные фотофизические и фотохимические процессы в биомолекулах -компонентах клетки. Приведены схемы фотов°збуждения и обсуждены условия одноквангового и многоквантового фотовозбувдения. Отмечено, что взаимодействие лазерного излучения с биомолекулами, лекащее в основе всех методов по применению лазеров в биологии и медицине, охватывает исключительно широкий диапазон интенсивностей излучения и длительностей воздействия.

Показано, что в области длительности импульсов 'Сс ю-13 о, когда ^¿-^ Т2 и интенсивности менее Ю*5 Вт/м2, взаимодействие лазерного излучения с биомолекулами в конденсированной среде при физиологических температурах имеет некогерентный характер. Именно в этой области находится подавляющее большинство приведенных в диссертации экспериментов.

При малых интенсивностях излучения, во-первых, отсутствует заметный нагрев вещества и,во-вторых, не проявляются нелинейные явления. В этой области (3 =10^ - 10 Вт/м^, точная граница зависит от коэффициента ослабления излучения в веществе) возможны только линейны о фотохимэтеоше процессы, эффективность которых возрастает ло мере перехода от видимого в УФ область. Эта область интенсивностей является областью класагчоской фотобиохимин и фотобиолопш. Линейные фотофнзи-ческие и фотобкологическке эффекты обсуг^ги-хгся з главах

2-4 диссертации.

По мере увеличения интенсивности импульсов более существенным отановитоя нелинейное взаимодействие лазерного света о клеткой. Так, при воздействии непрерывного излучения видимого диапазона о интенсивностью более 10®- 10® Вт/м2 начинают проявляться эффекты нагрева и термического разрушения. Эти эффекты лежат в основе лазерной хирургии. При сокращении длительности лазерного импульса до значений, меньших времени диффузии тепла из облучаемой области, взаимодействие носит импульсный характер;

При потоке энергии (1-5)'10® Дг/м2 лазерного импульса оильно поглощающий биоматериал подвергается импульсному тепловому испарению, а также фотохимическому разложению (для импульоов в дальней УФ области), т.е. лазерной абляции. Это явление лежит в основе разрабатываемых новых методов лазерной хирургии. При сравнимом потоке энергии импульсы наносекун-дной длительности имеют большую мощность и могут вызывать фотохимическое воздействие, фотобиологичеоким следствием которого является, например, мутагенность и даже летальность. Для оценок побочных явлений лазерной абляционной хирургии представляет интерес изучение воздействия на клетку таких потоков энергии. Этим вопросам посвящен § 6 пятой главы.

При переходе к субнаносекундным импульсам о интенсивностью Ю13- 10"^ Вт/иг становится существенным оптический пробой конденсированной слабопоглощаюцей.среды и соотвествунцее разрушение клеток. Это явление лежит в основе лазерной микрохирургии клеток. В этой облаоти пнтенсивностей и длительностей импульса могут проявляться двухступенчатые процессы возбуждения биомолекул, особенно если дайна волны излучения совпадает о длиной волны полосы поглощения молекулы. Для пикосекундных и оубпикосекуцдных длительностей импульса, когда интенсивность может достигать 10 Вт/м2, процессы многофотонного возбуждения превалируют, даже если порог разрушения не достигнут из-за малого потока энергии лазерного импульса. Воздействие ультракоротких импульсов высокой мощности, не разрушающее метки, также предотавляет большой интерес, так как позволяет инициировать многофотошше биохимические реакции, которые не могли быть рассмотрены в классической фотобиохимии низких интейоив-ностоД. Эти эксперименты описываются в главе 5.

ш/*2

РисЛ. Диаграмма типов взаимодействия лазерного излучения о клетками в координатах: пиковая ннтенсш-ность - длительность лазерного импульса. Используемые в ваших опытах лазерные источники обозначены следующим образом: I - от3+ гХАв лазер; 2 -ХеС1 лазер; 3 - Си лазер; 4 - ааА1Ав лазер; 6 - непрерывщй УФ а видешй свет.

В первой главе отмечено, что характер воздействия лазерного света на клетку зависит от клеточной структуры и от молекулы, в которой происходят вышеуказанные первичные фотофизические и фотохимические превращения'. В УФ области основной критической мишенью является ДНК, а в видимой и ближней ИК области - флавопротеины и порфирины.

В § 2 обсуждаются вторичные (фотобиологические) процессы в клетке, которые о точки зрения клеточной биологии можно разделить на функционально-физиологические и деструктивно-модифицирующие. В-случае деструктивно-модифицируюпщх процессов (например., мутагенез, летальность ) происходит повреждение жизненно важных структур клетки. Как правило, такие процессы ограничены .антиусилительными механизмами в клетке, призванными противодействовать повреждающему действию света и вызывать быстрое затухание биологических следствий электронного возбуждения молекул-фотоакцепторов. Типичным примером этого класса явлений является воздействие на клетку УФ излучения, которое более подробно рассматривается в разделе 2.1. В этом случае в качестве антиусшштельного механизма работают ферменты репарации. Конечный биологический эффект этого типа реакции может быть связан как с повреждением молекул-фотоакцепторов (например, ДНК), так и со свойствами фотохимических продуктов первичных реакций. Последние могут быть либо токсичными для клетки, либо стимулирующими или модифицирующими её метаболизм. Поэтому рядом о повревдающим воздействием УФ излучения иногда наблюдаются и эффекты противоположные с точки зрения клеточной биологии - стимулирующие рост и развитие клетки. Некоторые примеры этих эффектов,

—.....- - —~ ~ „ ------- о т

дсии&и и ¿КЛО.Ц&и.и . X .

В противоположность деструктивно-модифицирующим реакциям в фушщионально-физиологических реакциях свет может быть участником нормальных метаболических процессов, как это хорошо установлено, например, при различных информационных (фототаксис, фотокинесис, фотопериодизм) процессах. Свет запуока-от специализированные усилительные механизмы, в результате чого клетка (шшршлор, микроорганизм) получает необходимую информацию о ситуации в окружающей среде. Фотореакции этого класса,как правило,имеют сложную конструкцию усилительного аппарата фотосигнала, соединяющую поглощение фотона молеку-

лой первичного фотоакцептора и появление конечного фотобиологического макроэффекта. Общим для функционально-физиологических реакций является отсутствие повреждений жизненно важных структур клетки в диапазоне доз и интенсивностей, вызывающих данную функционально-физиологическую реакцию. Это не исключает повреждающего воздействия света этой же длины волны, например, при существенном увеличении дозы или интенсивности. Как пример функционально-физиологических реакций в разделе 2.2. рассматривается регуляция роста и размножения клеток и высказывается предположение, что световой сигнал может служить регулирующим фактором клеточного цикла.

В § 3 описываются материалы ц методы, выбранные для выполнения поставленных задач.

Глава 2. Воздействие низкоинтенсивного видимого

и ближнего ИК излучения на непродуктивные свойства прокариотических и эукариоти-ческих клеток

В § I исследуются количественные закономерности (зависимости от длины волны, дозы, интенсивности света) стимуляции роста микроорганизмов. Эксперименты проводили с бактериями Escherichia coli wp 2 (пример прокариотической клетки) и шестью штаммами дрожжей (эукариотические микроорганизмы).

' В разделе I.I. приведены имеющиеся малочисленные литературные данные о воздействии видимого света на рост и развитие микроорганизмов. Доступная нагл литература не содержала данных о том, что рост изучаемых нами штаммов может стимулироваться под действием монохроматического видимого овета с низкой интенсивностью.

В разделе 1.2. представлены количественные данные о стимуляции роста культуры е.coli wp г . Показано, что эффект облучения заключается преимущественно в сокращении латентного периода роста после начала инкубации клеток в питательной среде (облучение проводится в буфере, где размножение остановлено). В дальнейшем под термином "стимуляция роста культуры" мы подразумеваем отношение числа яизнеопособных клеток в облученной культуре к числу клеток в необлученной культуре через 60 мин. после перенесения клеток из буфера в питательную среду.

При фиксированном времени инкубации после "облучения (60 мин.) уровень стимуляций роста культуры зависит от дозы, интенсивности и длины волны излучения.

Зависимость доза-эффект имеет во всех случаях колоколооб-разную Форму о фазой подъема, максимумом и фазой затухания. (Ложно сделать вывод о существовании двух груш активных спектральных областей. Первая группа - излучение о длиной волны 365, 404 и 434 нм ускоряет рост культуры при более низких дозах,около 10-100 Дж/м2. Во вторую группу входит свет о дли- ; нами волн 454, 560,"620 и 750 нм. Для достижения максимального эффекта требуются существенно большие дозы света этих спектральных областей, составляющих I03 - 10^ Дж/м2. Что касаетря 1 зависимости от интенсивности, то,например,при непрерывном излучении о Л =454 пм(аргоновый лазер) при дозе 3 х 103Дж/м2 стимуляция роста культуры наблюдается при интенсивности 100-200 Вт/м2. Уменьшение или увеличение интенсивности приводит к исчезновению эффекта. Спектр действия низкоинтенсивного, видимого света на рост культуры Б. сои построен для двух доз - 14 Дж/м2 и 4*10^ Дж/м2. Этот спектр имеет несколько максимумов: около 404, 454, 560, 620 и 730 нм.

Также было изучено действие на рост е.coli WP2. непрерывного света в ближней ИК области ( g&aias лазер, Л =890 нм, частота повторения 666 Гц ели 3480 Гц). Лазерное излучение способно ускорять рост культуры при облучении дозами 0,1 - 1,5 Дж/м2,' притом кривые, отражающие дозовую зависимость, напоминают по форме полученные ранее для непрерывного видимого света колоколообразше дозовые кривые. Отличив в действии импульсного излучения заключается в возможности угнетать рост бактерий при использовании доз больше 2 Дж/м2, что не наблюдалось нами при исследованиях воздействия непрерывного монохроматического видимого света.

В разделе 1.3. показано, что рост эукариотических микроорганизмов (дрожжевые культуры Saocharomycodea ludwigii, Saooha-romyces cereviaiae 14, Candida maltoaa, Candida guillermondli, Torulopsie ephaerica, Candida boidinii, Endomycea magnuaii) может быть ускорен с помощью облучения монохроматическим видимым светом. В отличие от культуры е.ooü, сокращение латентного периода роста культуры после облучения не намечается. Ооношоо ол'игтае в кривых роста облученной и необлученноЙ

ДОЗД. Дж/ 2

Рис.2. Зависимость действия излучения полупроводникового лазера ( А = 890 нм) на рост культуры Escherichia coli WP2 от дозы при частоте повторения импульсов 3480 (I) и 666 Гц (2) и времени инкубации после облучения G0 мин. (пунктир - контрольный уровень).

культуры заключается в скорости роста в экспоненциальной фазе роста. Клетки облученной культуры достигают стационарной фазы роста раньше, чем необлученныё, Приведены данные о сокращении времени генерации культуры т.арЬаег!са.

Даже если реакция различных дрожжевых организмов на облучение качественно одинакова, она может иметь существенные количественные различия. Во-первых, для кавдой культуры дрожжей существует область доз, при которых происходит активация синтеза белка. Во-вторых, количество синтезированного белка при облучении в дозе, вызывающей максимальную стимуляцию (]1ШК0>, также различно. В разделе 1.4. приведены поиски причин различной фоточувствительности дрожжевых культур. Полученные данные не позволили выявить корреляцию между общим количеством флавинов или рибофлавина в клетке и их чувствительностью к действию излучения Не- не лазера. В то же время полученные данные свидетельствуют о корреляции между интенсивностью дыхания интактной культуры и возможной активацией накопления биомассы. При выращивании дрожжей с. ЬохсИпИ на метаноле в качестве источника углерода шесто глюкозы (в этих условиях выращивания клетка переходит на глиоксилатный цикл дыхания) увели-чивaeтgя оптимальная доза облучения (от З'Ю^ Дя/м2 до 1,5'10 Дх/м2) и возрастает накопление биомассы (от 122 £ 7 до 155 - 5 %). Показано, что большее количество каталазы в клетках соответствовало большему количеству синтезированного белка после облучения Не- Не лазером в дозе 1,5*10 Дж/м2.

Спектр действия низкоинтенсивного видимого света для стимуляции роста дрожжей злиаМеИснят при дозах 10 и 40 Дж/м2, В условиях нашего эксперимента максимальное ускорение синтеза бежа происходит при облучении синим (около 404 нм ), зеленым (около 560 ¿ид), красны« (около 020 им), далиигл г.расипм п ближним ИК (около 700.и 760 нм) излучением.

§ 2 посвящен исследованию воздействия ближнего УФ, видимого и ближнего ИК излучения на пролиферацию культур клеток млекопитающих. В разделе 2.1. приведены тлеющиеся литературные данные по этому вопросу, Сделан вывод, что излучение одного и того же лазера в одних культурах стимулирует, а в других - ингибирует пролиферацию. В .части работ эффект не бил обнаружен вообще. Отмечоно отсутствие в литературе спектров дуйстыи, зависимости от дозы и интенсивности. Полностью в литературе отсутствуют данные о воздействии света на

е-

г о

Т ■ ...... t ..... - 4 1 I' •••

Saccharomycodes -

tudwiQri

А' w i '

____ ..i i " y i г : i

490 500 (00 700 100

S НИ

Рис.3, Спектры действия непрерывного видимого, ближнего УФ и ближнего ИК излучения на рост культуры Eecheriohia ooli WP2 0 Saccharomycodea ludwigii. Дозы для Е.coli 13 Дж/м2 (I) или <1*103 Дж/м2 (2), для S.ludwigii 10 Дж/м2 (!) или 40 Дя/м2 (2).

клетки в стационарной фазе роста. В разделе 2.2. приведены количественные данные об изменениях в скорости синтеза ДНК и РНК после облучения. Приведены дозовые зависимости при облучении непрерывным светом, а также спектры действия света на скорость синтеза ДНК и РНК в клетках Не ь а в экспоненциальной и стационарной фазах роста. Оказалось, что для обеих фаз клеток Не ь а оптимальная доза в красной, дальней красной и ближней Ж областях спектра равнялась 100 Дж/м2, а в синей и ближ ней УФ области опа была ниже примерно на порядок величины.

Спектры действия света на скорость синтеза ДНК и РНК,измеренные через 1,5 часа или 4 часа после облучения клеток в экспоненциальной и стационарной фазах роста, весьма структурированы и 'ллеют максимумы практически во всех областях спектра. Стимуляцию можно наблюдать в следующих диапазонах длин волн: 320 - 450 600 - 650 нм,.660 - 720 им, 720 - 830 им с максимумами около 400, 630, 680 и 760 нм.

Результаты измерений влияния интенсивности света на скорость

синтеза ДНК показывают, что эффект очень чувствителен ко времени облучения (или интенсивности света при заданной дозе). В эксперименте с непрерывным светом с Л =633 нм отчетливо наблюдается порог интенсивности, выше которого появляется эффект стимуляции синтеза ДНК. Этим порогом в условиях нашего эксперимента является 7 Вт/м2 при заданной дозе 100 Дж/м2, а максимумом 8-10 Вт/м2. В то же время при импуль-сно-периодическом облучении ( Л =633 нм, частота повторения импульсов 10 кГц, =Ю-8 с ) эффект не наблюдается при интенсивностях( менее 7 Вт/:,!2 и ппковых интенсивностях Ю3 - Ю5 Вт/м2 (при сопоставимых с экспериментом с непрерыв-ним светом дозах облучения). Поскольку при таких пиковых интенсивностях реализуются высокие скорости возбуждения (до Х0Ч с""*), можно сделать вывод, что эффект стимуляции синтеза ДНК чувствителен не к пиковой мощности наносекундного излучения, а к средней интенсивности в течение 10-100 с, т.е. является интегральным эффекюм за указанное время облучения.

Исследована зависимость эффекта стимуляции синтеза ДНК от расширения спектра облучения. Найдено, что вызванный облучением светом с X =633 нм эффект стимуляции синтеза ДНК при одновременном облучении узкополосным или широкополосным светом из желто-синей области исчезает.

/, Вг/ем*

_I_i_I_

100 10 1

Рио. 4 . Зависимость включения ^-тимпдина в ДНК клеток HeLa в экспоненциальной фазе роста через 2,5 часа после облучения культура Но-Ño лазером и лазером на краситоле ( Л =633 нм) от времени облучения (при интенсивности света) в условиях постоянной дози Д=Ю2 &Vm2.

— Г!---------------

¡¡опрзриеного 5!*!™м0г0; бттжлйго

ИК п блстюго УФ излучения на синтез ДНК и РНК в клетках Не1а в экспоненциальной фазе роста через 1,5 «аса после облучения в дозах 10 ДжДг (I) или 100 ЛдЛл2 (2).

Пунктиром обозначено включение ЧИгшидина в ядра иэоблучеиных клеток.

В разделе 2.3. привэдэнн дшшнэ о. шлтаеглоотп п елоно-генности клеток НеЬа в стационарной фазе роста поело облучения Не- N6 лазером. Показано, что' сблучснда увояпчЕваэт процент клоногенных клеток. Э$фокт заваоет от дока облучения п врвдшц между облучением ыоноолоя п перэоехш клотое в овзаую питательную среду. Также изменяется поело облучайся раопрздаленпэ клонов по размерам. В атом го раздело приводятся анализ крпшг роста облученных популяций. Бога щшя еззду сблучешеа н пересевом было большэ 30 шнут, ваблвдалаоь стимуляция роста культуры в экспонешщальной стадш роста. Ешгснгяооь, что процент недоразвитых 1уюнов практически по кепшюя поело облучения по сравнении о необлучетюй культурой. Процент иаках клонов уменьшался, а число орэдщк и крупен: клопов увзхзш-валось в зависимости от дош обдучашш. Т&кш образов, сгсду-лирущее действие обдучопш Еэ- по дазоршл больно еосго ска- • зывалось на активности щшс£зрацагхэдазшо раотугщх субпопуляций (медленно дажщзося едока: долг кашю к ерздгшэ клоны).

Радаоавтографячзшшй спалпз по::азал, прг сблучслпг: клеток НеЬа в вкопопапцпапыгой фаго роста в езрглз 3-4 чаза число ДНК-ошгаезируЕЩп: глоте;.: <пдрка 8 фази) ухлЕсчпгз— лось, а к сроку 6 часов падало до контрольного урог^л. Пра облучении кдояок ЕЬЬа в стецпжаряой фаза роста. укуотошо доли ДНК ош:Еозару5ЕЦ£2 клзток пачпоаяооь чороз 3-4 чаоа После облучаада. Еа ооноеэ разультатоо о пзу^ьск^л п пзпрз-рывным цэчшгсеа одолел ш>д, что угшглшко ч^зла ккзгов з фазы связало с о1—* з перезвдоа чаоте кдотоп.

Анализ дпягапг о разцрэдояепал гранул соребра над цэчешэ ядрами в контрольная п обдугопнлг щетках показал, что интенсивность еллшзшш в едра кгото:; з фаза угая:- . чивалась водэдотвпа облучкиш. Въелся ксаотапа шшапэшя чпз-ла клеток о В фазо'п пгрепои^жадя спнтога ДШС в хамтгсг, уже находящихся в а фазэ , вовкшют лрздаолагагв, что о перше часа поело облучон-я прасалирует процесс ускорэшюго а1—» 8 перехода, в поояэдующпэ часа (павр^ор, чэрэз 6 часов после облучения) - вдташя^зкздэт синтеза ДНХ.в плетках, находвБШхея о 8 фаза.

§ 3 посвящен выводам данной главы. Полученные экспериментальные данные указывают на то, что в определешшх условиях, в зависимости от дозы, интенсивности и длины волны, облучение монохроматическим излучением бливней УФ, видалой и ближней ИК области позволяет прокариотическлм клеткам е. со и начинать делиться практически без латентного периода, и ускоряет размножение эукариотических микроорганизмов в экспоненциальной фазе роста культуры без сокращения латентного периода. Можно также активировать пролиферацию культуры клеток Пеьа.

Глава 3. Ранние и отдаленные изменения в клеточном метаболизме после облучения монохроматическим видимым светом

§ I. Введение. В предыдущей главе было показано, что облучение вызывает изменения в скорости пролиферации, а также в скорости синтеза нуклеиновых кислот, не способных поглощать свет видимой и ближней ИК областей. Это значит, что событиям, описанным в предыдущей главе, должен предшествовать ряд других реакций в меточном метаболизме как в перше минуты и часы, так и в более поздние сроки после облучения.

§ 2 посвящен экспериментальному исследованию структуры и активности хроматина покоящихся клеток, лимфоцитов из периферической крови человека, после облучения этих клеток Не-н е лазером. В разделе 2.1. дается описание изменений в структуре и активности хроматина покоящихся ( оо ) клеток после воздействия известных- митогенов, таких, как,например, фитогемагглу-тшшн (ФГА). В разделе 2.2. описывается методика измерения количества доступных для транскрипции мест в хроматине по интенсивности связывшпш гатакомолекулярного лиганда акридинового оранжевого (АО).

Обнаружено (раздел 2.3.), что, как после обработки клеток ФГА, так и после облучения Не-Не лазером, в первые шесть часов в структуре хроматина происходили сходные изменения -увеличение связывания АО с ДНК в первые 45-90 мин., затем снижение доступности ДНК к красителю, которое достигает контрольного уровня через 3-4 часа после воздействия. Затем наблюдалось повторное увеличение связывания красителя о ДНК. Из-ш'янс, '11ч> такой трохпталшВ характер изменений структуры

покоящихся клеток, активированных к пролиферации различными по природе стимулами, является универсальным. Дозовый интервал, облучение в котором вызывает эти изменения в структуре хроматина, является узким, от 28 до 116 Дд/м2 с максимумом 56 Дж/м2. Добавление сразу после облучения или обработки клеток о ФГА восстанавливающего агента цистеина в концентрации от 0,5 до 5,0 мМ препятствовало стимуляции связывания с АО хроматином.

Установлено, что увеличение добтупных для транскрипции мест в хроматине, которое было показано при помощи связывания АО в предыдущих опытах, сопровождается увеличением синтеза РНК. Как ФГА, так и облучение He-Ne лазером вызывают принципиально сходные изменения в синтезе РНК, однако максимальные величины для клеток» обработанных ФГА, являются более значительными (152 % и 190 %)•> чем для облученных клеток (123 и 150 %). Но начиная со срока 7 часов после воздействия происходит принципиальное расхождение в кривых. -Если в обработанных с ФГА лимфоцитах наблюдается новое, третье увеличение включения С^-уридина, то в облученных Не- N е лазером клетках происходит уменьшение включения до контрольного уровня.

Таким образом, показано; что кратковременное облучение Не-Не лазером в определенном, очень узком дозовом интервале," может в ядре покоящихся клеток в течение первых 6 часов вызывать изменения, сходные о изменениями, вызванными митогеном ФГА. После этого срока активированные светом клетки возвращаются в состояние % , о чем свидетельствует отоутотвие бласттран-сформации (раздел 2.4.).

В § 3 приведены данные об изменениях в активности ферментов окислительного и фосфорного обмена в ранние и отдаленные сроки после облучения. В разделе 3.1. показано, что оразу после облучения дрожжей lerulopsia ephaerica He-N е лазером происходит активация НАДН-дегидрогеназы, осуществляющей передачу электронов в первом комплексе дыхательной цепи. Активация ' ШДН-дегидрогеназы начинается о дозы I•102Дк/м2 и достигает максимума (152 - 9 %) при 4,6'Ю2 Дж/м2. При дальнейшем увеличении дозы активность НАДН-дегидрогеназы уменьшается. Напомним, что по аналогичной дозовой кривой с максимумом около 4,6'Ю2 Дж/м2 происходит также стимуляция синтеза бежа в клетках T.sphaerica (§ j второй главы). В разделе 3.1. 24

приведены данные об изменениях активности каталазы в клетках т. sphaerica сразу пооле облучения культуры Не- Не лазером, а также сравнительные дашше о стимуляции синтеза белка в нормальных условиях и в условиях,когда каталаза ингибирована 1,2,4-триазолом. Показано, что в необлучешшх клетках подавление активности каталазы 1,2,4-триазолом не влияет на скорость синтеза белка, в то время как в облученных клетках предварительное ингабирование каталазы предотвращает проявление эффекта стимуляции синтеза белка. Сопоставление результатов этих двух серий опытов показывает, что,с одной стороны, стимуляция спн-теза белка, вызванная облучением Не- Не лазера, связана с активностью каталазы в облучаемых клетках, а с другой стороны, 1 динамика изменения активности каталазы сразу после облучения указывает на то, что участие каталазы является опосредованным.

В разделе 3.2. описаны отдаленные изменения в активности ферментов окислительного и фосфорного обмена после облучения Не- н е лазером. Отдаленные фотобиологические изменения, как правило, связаны с синтезом белка da novo. Измерение проводили в дрожжевой культуре Т.sphaerica через 18 часов после облучения. Установлено, что при увеличении дозы облучения от З'Ю2 до 4,6*I02 Дж/м2 активность НАЩ-дегидрогенази возрастала с 160 % до 241 %, если активность этого фермента в нэ-облученных дрожжах принимать за 100 %. При увеличении дозы от 4,6'Ю2 до 1,9*10 Дж/м* активность ПАДД-дегидрогеназы уменьшалась до 120 %. Наибольший эффект (241 %) наблюдался при дозе облучения 4,6'Ю2 Дж/м2, совпадшащвй с дозой для максимальной стимуляции синтеза белка (раздел Х.З. второй главы). Найдена корреляция мезду активацией синтеза белка, после облучения He- Nе лазером и активностью НАИН-дещдроге-назы, что указывает на участие этого фермента в процессе стимуляции синтеза белка.

Облучение вызывает также увеличение активности терминальной оксидазн дыхательной цепи - цктохромоксвдазы, но это усиление не так существенно, как активация НАДН-депщрогеназн (128,5 % по сравпенни с контрольными образца!,®). Установлено уменьшение активности (75 % от контроля) кислой фосфотазы (48 % от контроля). Активность цнтозольной суиероксцдцис/лу-тазы в облученных клетках оставалась на контрольном уровне.

По^чгцпле дашшо с клетками T.ophaerica подтверздапись в

опытах С культурами Saccharomycodes ludwigii и Candida boidinii. Экспериментальные данше .этого раздела показывают, что кратковременное облучение (несколько десятков секунд) влечет за собой долгосохраняющиеся изменения в меточном метаболизме.

В § 4 рассматривают индукцию облучением Не- Ne лазером хемплшшесценцпи фагоцитирующих клеток, которая связана с активацией находящегося в клеточной мембране фермента НАДН^-оксидазы. Показано, что облучение Не- Ne лазером в дозах от 100 до 300 Дж/м:(с максимумом около 200 Дк/м2) вызывает немитохондриалышй респираторный взрыв (который измеряют путем регистращш хемижминесценции) клеток селезенки мыши и усиливает интенсивность стимулированной объектом фагоцитоза (Candida albicans ) хемилшинесценции. Эти результаты указывают на то, что облучением целых клеток можно активировать фермент, имеющий соответствующую полосу в спектре поглощения.

В § 5 приведены данные об изменениях в первые часы после облучения во внутриклеточной концентрации универсального переносчика информации в клетке, циклического аденозин-з', б'-монофос-фата (цШ). Обнаружено,- что фиолетовый (404 нм) и красный свет (632,8 нм) вызывают уменьшение уровня цАМ5 уже через 30 ' мин. после облучения. Облучение светом о длиной волны 546 и 700 нм практически не влияет на уровень цАМ5 в клетке, а облучение светом с Л=760 нм вызывает увеличение его содержания на 75 %. В полученных результатах можно видеть корреляцию с результатом стимуляции включения %-ттвщина в ДНК (глава 2), где облучение светом с Л=404 нм, 632,8 нм и 760 нм вызвало стимуляцию, а облучение светом с Л=546 и 700 нм практически не вызвало изменений. С другой стороны, наблюдается разница в кинетике изменения уровня ц/№ после облучения клеток светом с длинами волн 632,8 нм и 760 нм, хотя облучение обеими длинами волн вызвало стимуляцию синтеза ДНК (глава 2). Разница в кинетике изменения уровня цЛШ после облучешш клеток светом о длинами волн 632,8 нм и 760 им,возможно, может послужить объяс-нешпо исчезновения эффекта стимуляции синтеза нуклеиновых кислот при одновременном дихромном действии этих длин волн (слава 4).

Таким образом, полученные в третьей главе экспериментальные дашше свидетельствуют, во-первых, о том, что облучение монохроматическим видимым светом вызывает в глоточном метабо-

лизме рад ранних и отдаленных изменений, и, во-вторых, позволяют предположить, что в клетке существует связь мзнду изменениями, наблюдаемыми в разных структурах клерки. Об этом свидетельствуют, например, изменения в структуре хроматина после облуче1шя Но- п е лазером, хотя в хроматине отсутствуют хромофоры для поглощения излучения Не- II о лазера. Эти вопросы обсуждаются в выводах данной глаш (§6).

Глава 4. Певвстше йотоакпептота. ответственные

за взаимодействии япзкоинтенсквного видимого и ближнего ИК рзлучения о клеткой

§ I посвящен постановка задач исследований, описанных в этой главе. Также приведены результаты эксперимента, показывающего, что наличие первичных фотоакцепторов в клетке необходимо для достижения ускорения размножения. При исследованиях воздействия облучения Не*- н е лазера на систему бактериофаг Т4-бакте-рия е.coli показано, что в исследуемом диапазоне доз (Ю3 -б'ХО4 Дж/м^) облучение бактериофага, не содержащего хромофоров для света с X =632,8 im, не влияет на его литпческие свойотва. Облучение•бактерий в тех же дозах увеличивает в 1,25 - 1,35 раза их способность поддерживать жизнедеятельность необлучэнного бактериофага.Т4.

В § 2 сравнивают полученные ранее спектры действия различных конечных фотобиологпческях эффектов (глава 2) и спектры поглощения компонентов дыхательных цепей е. coli и митохондрий эука-рнотическгос клеток. Приводятся собственные экспериментальные данные о дифференциальном спектре поглощения суспензии е.coli, имеющий характерный дои шгтохрома d максимум около 630 нм,-

§ 3 посвящен описанию экспериментов о клетками He La и 2.0011 до дюсромногду облучению. ПроБодшш либо одновременное дихромное облучение о X =632,8 нм в излучением других длин волн в диапазоне 400-800 год , либо последовательное облучение двумя длинами волн (404, 632,8 км и 760 нм) о вариацией времени между облучениями.

При одновременном дихромном облучении с Л =632,8 нм и монохроматическим излучением от 400 до 800 нм полученные спектры действия существенно отличались от спектров действия одинарного облучения. Во-первых, исчез !лакснмум на длине

волны 760 юл, во-вторых, максимум при 404 нм переместился на 450 нм, а при увеличении дозы исчез, в - третьих, появилась полоса ингибирования в области 550-570 нм. .

При последовательном дихромном облучении клеток Неха светом 633 и 760 нм (время мезду облучениями от I с до 240 с), эффекты зависели от последовательности длин волн. При облучении вначале светом с Л =760 нм, а потом светом с Л =633 нм наблюдалась стимуляция синтеза нуклеиновых кислот, а при обратном порядке (633 нм + 760 нм) - ингибирование. При облучении E.ooli по той же схеме выяснилось, что при облучении в последовательности 633 + 760 шл конечный результат был -равным влиянию облучения одним красным светом в соответствующей дозе. При изменении порядка облучешш картина существенно менялась. Еоли культура, облученная светом 760 нм, облучалась затем светом 635 шл, эффекты света этих двух спектральных областей складывались. При обсуздении полученных результатов делается вывод о функционировании фотоакцепторов красного и дальнего красного света в качестве компонентов цепи последовательных реакций.

При последовательном облучении клеток Не L а синим и красным светом обнаружено, что облучение в последовательности 633 шл + 404 шл практически не оказывало воздействие, а в последовательности 404 нм + 633 нм наблюдалась стимуляция синтеза нуклеинових кислот независимо от времени интервала между актами облучешш. При облучешш е.coli обнаружено, что свет этих длин волн в порядке 404 шл + 633 нм действует аддитивно. При обсуждении результатов дихромного облучения светом с )i =404 шл и 633 шл делаетоя вывод, что фотоакцепторы этих двух длин волн связаны друг с другом слабее,чем фотоакцепторы света-633 и 760 шл , но являются компонентами одной и той же системы, о чем свидетельствуют данные одновременного дихромного облучения,

В § 4 приведены данные о модификации фотобиологических эффектов химическими реагентами (в основном окислителями и восстановителями). Результаты этих экспериментов дают основание высказать предположение, что при использованных нами дозах и интенсивностях света фотобиологический эффект связан с изменением редоке-потенциала клетки на начальных этапах ' восприятия и передачи фотосигнала.

2В

Рис.6. Изменение скорости синтеза ДНК и РНК через 1,5 .ч-после последовательного дихромного облучения клеток HeLa в экспоненциальной фаза роста красным ( Л =632,8 нм) и ближним ИК ( Л =760 нм) излучением в зависимости от времени между облучениями.

Универсальный характер фоточувствительнооти к низкоинтенсивному монохроматическому видимому свету различных клеток - прокариот, примитивных и сложных эукариот , о одной стороны, и сложные спектры действия (глава 2) совместно о результатами о модификации фотобиологических эффектов при помощи дихромного облучения и химических реагентов - о другой стороны, дают возможность высказать предположение, что первичные фотоакцепторы являются компонентами окислительно-восстановительных цепей. Анализ полос в спектрах действия различных фотобиологических эффектов (глава 2) и полос поглощения компонентов митохондриалышх и бактериальных дыхательных цепей, а также данных о ранних изменениях в клеточном метаболизме после облуче5шя (глава 3) дает возможность сделать предположение, что этой окислительно-восстановительной цепью является дыхательная цепь. Исходя из предположения, что фотоакцепторами низкоинтенсивного водимого света в клетке являются компоненты дыхательной цепи, оценивали значения для скорости возбуждения в двух монохроматических полосах с длинами Волн 632,8 и 454 нм, в которых поглощают цитохром d и флавопротеиды. Используя данные для клеток E.coll > выяснилось, что Wggg=0,434 и V4g4=0,83 с"1. Эти результаты хорошо согласуются с параметрами периодичности энергетических процессов в клетке, о одной стороны, и реально требующимися временами для получения оптимального эффекта в наших условиях эксперимента (10-100 с), о другой (§5).

В § 6 приведены данные о том, что при увеличении дозы и интенсивности света можно достичь'ингибирования метаболизма клетки или даже летальности. Фотоакцепторами для отрицательных эффектов также являются компоненты дыхательной цепи. Высказано предположение о существовании по меньшей мере двух процессов, связанных с дыхательной цепью, соотношение которых определяет конечный фотобиологический эффект. Одшяд из этих процессов является ускоренно переноса электронов в окислительно-восстановительных парах в некоторых секциях дыхательной цепи. Для достижения стилулирунцего действия света требуется функционирующая система переноса электронов. В случае ингнг бирующего метаболизма или летального эффекта перенос электронов замедляется ели даже прерывается. Колоколообразная форма дозовых зависимостей также говорит о возможной кошсурешдаи

медду нвоколькЕля процессом:!. СтЕмущрущее действие оказывают дозы в очень узком и определенном интервале, в принципе только на восходащей часта дозсшх крзгнх,. а отрицательные эффекта достпгазтся легко в продоа интервале доз.

В § 7 продсгадяеки окот, связавшею кзяду собой столь далокие стСзпзя, itait поглозсяпэ свата пэлсзул&'эг йотоакцепто-ров п увашпзнпэ гстотятесзсЯ пктшзюста. Основой предполага-cimx схем является овжгюсаяга esesothux d бгологш клетки рзакцдй, рогудтруе^аг прохоздегпз г/птотпггсо^ого цикла, с еоз-дейстезш овота ira ста рзйэтпз. Sopos» csseorso, что кнстру-ггонткл, о псглсгтга которая плоткп спрэдолтат ЕослэдоЕатель-

ЕОСТЬ пютвнгл гспоз з рзгтлируп? nporcr^crrro готического

цшсла, явяяятся Еггэясгшя ргзетшх сарпггатпоз платочного гсизссгаза, орздз noropas ящзстз? 2 грра - сзоЗяодашо з грздзсязгг одцз- « дзтггг^слтЕс: сопов.'рН) и рохудязгориэ (шщразр, пс-лгтюгсгэ акщептрэдзЗ цшашчоскпх ЩГКООТЦКОЗ) » Ltl зссткгкз пзрсд ссЗэЗ содаяу шйякяь, что посдз^откгэ crssa гкз рзгулг.торпзго сзяетгкге в оебэ

сбутаз дгя кгсгл пг^злотет п дспс.'зппздт) го асззгэши, готова есазсзз со спзийакоЗ сгзгогото гоадаСотогя, s.o. фото&кетзсгйз s фотожсггасжэ рсзсаш п кагзаукос пехотных Сэтсг^сптспоп, Пргдггззшз ета пржгпо-следоггзнЕнх спкэзЗ для пп.тзцсггпл паргдзтроэ :г;зго~:с:го гс-ксетдса оукарио-cn^ocncil к.*:зг:-п. Ео-пзр-пк, ото с^троггзгглггз кгщу сгтзщ?0Егш2г.а сгзусз с^а^-элгно-асокшоЕЗгаапазг реаг.-цгггл d депетольпоЗ цзяп, дспзлггргздгзй пдгто^яоЗ ¿тсгбраш и пзкзившш тщтрязязытхсо рй. йнагорх, ото азгяядэ облучен:m га ¡эдтрггсязточтЗ угзсзяь

кся пздсдгл спзтсм дигатолмгзя цзта ггрсбрстазз споообггость ' создаггяъ иообходкдШ для дзленет ногнЭ грздгест рЯ йястрзэ, позмдгя теп ссгдд! вгаткэ качпать бнстрзз додзгьея. Прзддо-согзапз о тем, тге о<$луч5пгз соад237 езебзвдг::^ рЯ градкент ка плоточяоЗ кг&Зрздо, подггзрздаозел senro диааая & тем, тто сблучзяпз Нз-По лаззрегд усаптсясаго способпооть подаер-шхгагь развзтпэ бакторио|ага (§ I гяаги 4). .Известно,, что соадвдоо pli градпзнта является такта кзобэздагаЗ прзддосалкой для шфовщп взруса В 2ЛЭТКУ«

В § 8 обсуждены пределы величины эффектов фотостимуляции метаболизма. Приведены данные о сезонной периодичности ускорения размножения микроорганизмов,и на основе обсуждения собственных и литературных данных делается вывод, что регуляция метаболизма микроорганизмов вследствие кратковременного лазерного облучения и его естественная природная периодичность являются связанными явлениями.

Глава 5.ровпешштаеэ воздействие импульсного УФ и винимого лазерного излучения на клетки НеЬа в экспоненциальной и стационарной воота

§ I посвящен введению н постановке задача. В § 2 приведены экспериментальные данные о воздействии импульсного УФ лазерного излучения на интенсивность вхлаченпя Зц-тшщина в ДНК и уридина в ГОК клеток Нэ I- а в экспоненциальной в в стационарной фазе роста. В качества источников импульсного- надучения использовали вторую гармошку лазера на парах иеди (импульсно-пернодаческое излучение с высокой пшсоеой и низкой средней интенсивностью, Л =271,2 ни), Ш1*: ЬА& лазор (одиночные высокой интенсивности Еьшульоа о пшсосскундаоа длительиоояьи, Л =266 нм), а в качестве непрерцвного излучения попользовали УФ лампу о ионохрохз&торсм, X =270 ка. При облучении клеток в экспоненциальной фазе роста в диапазоне доз от 0,02 до 20 Дгк/м2 как тшульсно-периодичеокш излучением ^ =271,2 ни, так и непрерывным излучением с Л =270 шл, включение ®Н-тюли-дина и 14С-урндша уыеньыалось с увеличением дозы. Совершенно другая ситуация набладалась при облучении глоток в.стационарной фазе рсота. В зтси случае, при облучении клеток пмпульсно-перкодическшл излучением с ^ =272,2 им , была обнаруаена зависимая от дозы стимуляция включения ^Н-ткмядина в ДНК. В клетках Не иа стимуляция пачпналаоь при дозах около 0,1 Дж/и2 и достигала иакскиуда при облучении в дозе около 0,5 Дк/м2. При дальнейшем увеличении дозы включение %-тюллджт падало до контрольного уровня. В тех ио условиях опыта включение 5

^-уридина в РНК оставалось на контрольном уровне во воем изучавши диапазоне доз облучения. При облучонии клеток в отмдеонариой фазе роста непрерывным У'Р излучением с Х.-.:ЭТ0 нм 32

в дозовом интервале от 0,1 до 4 Дк/м (т.е. в том дозовом интервале, где в случае шдпульсно-пориодаческого излучения наблвдали стимуляцию включения %-тиглидина) включение 3И-тишдина оставалось на контрольном уровне, а при дозах выше 4 Дж/м2 угнеталось зависимым от дозы образом. Таким образом, динамика включения %-тшпшша в ДНК клеток Но!, а в стационарной фазо роста после облучения импульсно-периодическим и непрерывным излучением различна.

Поскольку было на!!двно, что клетки Не1. а в стационарной фазе роста реагируют на импульсно-периоднческое и непрерывное излучение по-разному, в дальнейшем изучали влияние пмпульсно-периодического излучения на включе5шэ %-тимидяна в ДПК в разные сроки (8, Ю, II и 13 сутки) после посева, т.е. в начало, середине и в коночной части фазы стационарного роста. Показано, что при облучении клетск на &-о сутки синтез ДНК утне-тался при увеличении дозы облучения, что напоминает соответствующую до зовую кривую для клеток в экспоненциальной фазе роста. На 10, II и 13 оутзш после посева наблвдалаоь стимуляция включения %-тимиД1ша в дозовом интервале от 0,05 до 5 Дж/м2 с максимумом около 0,5 Дж/м2. Эта серия опытов показывает, что наблвдаемый эффект стимуляции является,действительно, свойственным только клеткам в стационарной фазе роста.

Изучали зависимость эффокта стимуляции синтеза ДНК в клетках, находящихся в стационарной фазе роста, от частоты повторения импульсов. В изучаемом диапазоне частот от 3 до 30 кГц скорость синтеза ДНК увеличивалась в двух областях частот: 8-12 кГц и 19 - 25 кГц (доза была во всех олучаях 0,5 Дк/м2), что указывает на то, что наблюдаемый эффект стимуляции связан со оцицц^пчеок^ил воздействием ¡^лпульсиогс излучения»

При облучении клеток Не1а в экспоненциальной и стационарной фазах роста мощными ультракороткими импульсами (УКИ) с Л =266 шл ( интенсивность от 3-Ю8 ВтД^до 1012 Вт/м2, тшсло импульсов от I до 100, доза от 10~2 до Ю3 Дя:/м2) обнаружено, что облучение моток в экспоненциальной фазе роста может вызывать как усиление, так и угнетение включения Н~тга.шдлиа в /¿К, в то вромн как включение Н-тгелпдина в клетки стационарной фазы роста остается на контрольном уровне во всем изучанном диапазоне гнтенстшостой и доз. Отсутствие каких-либо эффектов при облучения УКЛ с X =1064 шл указывает на то, что яЭДг-кты,

наблвдаеше под воздействием УКИ с Л =266 нм, связаны с повреждением ДНК. Изменения во включении ^С-уридииа в И ПС клеток обеих фаз являются незначительными. При изучении угнетения синтеза ДНК в клетках в экспоненциальной фазе роста обнаружена зависимость от интенсивности импульсов.

При сравнении полученных данных с данными о воздействии непрорывного излучения с А =270 ил можно делать следующие выводы. Клетки líela в экспоненциальной фазе роста реагируют одинаково на низкоинтенсивное импульсно-периодическое и непрерывное облучение - о увеличв1шем дозы происходит ингибирование синтеза ДНК. При облучении УКИ наблюдается стимуляция включения 3Н-тпш1дппа в дозах от 10~~ до 10 Дж/м2 и ингибирование - в дозах выше 10 Дж/м2. Таким образом, реакция пролиферирующих клеток на высог.оинтенсивное излучение отличается от таковой в случае низкоинтенсивного облучения.

При облучешш клеток в стационарной фазе роста УЖ не оказывают воздействия, а низкоинтенсивное излучение воздействует. Низкоинтенсивное импульсно-периодическое и непрерывное излучение оказывает противоположное воздействие в одинаковых дозах (первый из них стимулирует, а второй - ингибирует включение "%-тимццина в ДНК). В конце § 2 оценена вероятность двухквантового возбужден молекул в клетках в экспоненциальной фазе роста с УКИ Л =266 юл Получешше данные указывают на возможность повреждения ДНК по двухбайтовому механизму.

§ 3 посвящен более подробному изучению механизма действия ишульсно-пориодического излучения с -X =271,2 нм на клетки HeLa в стационарной фазе роста. РаДиоавтографическил методом (импульсная метка) показано, что через 2,5 часа после облучешш число ДНК синтезирующих клеток больше по сравнению с необлученнш контролем при дозах облучения 0,16 и 1,6 Да/м2, а при увеличошш дозы облучения их число падает до контрольного уровня. Анализ распределения ядер по числам гршгул серебра показывает, что при облучении в дозах 0,16 и 1,6 Дк/м2 происходит сдвиг кумулятивных кривых направо от контроля, т.е. увеличение числа клеток с большим числом гранул, что можно рассматривать как стимуляцию сиптеза ДНК. При облучешш в дозах 5,6 и 16 Дж/м2 происходит сдвиг кумулятивных кривых налево, что указывает на уменьшение числа клеток о большим колнчес-

г зо

з 20

0 1 2 э. Л 5

ВРЯЯ ПОСЛЕ ОЫУЧЕКИЧ, ч

Ряо.7. Динамика изменения включения %-тимидина в ДНК клеток HeLa в стационарной фазе роота после облучения импульсно-периодичеокнм излучением с Л =271,2 нм (I) или непрерывным излучением с -270 нм (Я) в до a о П.5 Пя/м2. Шнкттюм обозначен контрольный уровень.

твои гранул, т.е. происходит подавление рзшшкатишого пинте за После облучения.

Радиоавтографическим методом в уоловшх постоянного контакта клеток о %-тЕмидином после облучения культуры в стационарной фазе роста в дозе 4 Дж/м2 показано, что в первые часы после облучения происходит резкое увеличение числа слабомеченых клеток, что указывает на осуществление репаративного оинтеза. Также обнаружено некоторое увеличение, по сравнению с контролем, числа сшЕыгамеченых клеток, что указывает на возможность ускоренного перехода клеток пролиферативного пула.

Таким образом, радиоавтографические данные свидетельствуют о том, что стимуляция включения 3Н-тимидина, обнаруженная ранее (§ 2) как следствие специфического воздействия на клетки в стационарной фазе роста импульсно-периодического излучения в определенном дозовом интервале и определенной частотой повторения импульсов, происходит, в основном, за счет репаративного синтеза ДИК и в меньшей мере - за счет увеличения решшкативного синтеза в части субпопуляций культуры.

Эти данные дают основание предполагать, что импульсно-пери-одическое УФ излучение вызывает специфические повреж-

дения ДНК клеток в стационарной фазе роста по сравнению о УФ непрерывным излучением. В связи с этим представлял интерес исследовать, каким образом эти повреждения влияют на репродуктивные способности клеток. Анализ числа образовавшихся колоний от облученных клеток и их распределения по размерам показывает, что облучение в тех дозах (от 0,1 до 3 Дж/иг), что ранее вызывали стимуляцию включения "%-тшцДина, вызывает увеличение числа образовавшихся колоний, т.е. увеличивается клоногенность клеток, которые находились в стационарной фазе роста во время^ облучения. При облучении большими дозами (10, 30 и 100 Дис/м2) клоногенность уменьшается по сравнению с необлучешшм контролем. Изучение распределения колоний по размерам показывает, что в облучешшх в стимулирущих дозах культурах уменьшается доля абортивных и мелких колоний, а доля средних и крупных колоний увеличивается. Этот факт свидетельствует о том , что облучение в дозах I и 3 Дк/м2 стимулирует репродуктивные свойства глоток в стационарной фазе роста. При увеличении дозы доля крупных и средних колоний

уменьшается, б то время как воздействие излучения на долю абортивных и мелких колоний несущественно,

Таким образом, результаты исследования, приведенные в § 2 и в § е9,дают основание предположить, что облучение клеток НеЬа в стационарной фазе роста кмпульсно-периодическтл излучением с -X =271,2 юл в дозовом интервале от 0,1 до 10 Дж/м2 (частота повторения импульсов 10 кГц) вызывает в ДНК повреждения, которые улучшают клоногешше свойства части популяции.

В § 4 проведены исследования ■ воздействия УКИ с Л=266, 532 и 1064 нм на проницаемость клеточной мембраны клеток НеЬа в стационарной фазе роста. Облучение проводили двумя импульсами (параметры облучения были одинаковыми), варьируя время между ними.

Обнаружено, что один импульс не вызывает никаких изменений по сравнению с контролем во включении %-тшцдша в клетку, а подача второго импульса, в зависимости от проходящего времени, может увеличивать прснзкновенсе %-тивддина в клетку. Максимальный эффект обнаружен, когда время между двумя импульсами' было 4-5 с. Поскольку эффект не зависит от длины волны, а зависит от интенсивности излучения, делается вывод, что эффект связан с кратковременным локалышм напевом. Предполагается, что первый импульс вызывает какие-то раакцпи "в компонентах транспортной система тнмцдина (тшлцдпн транспортируется через мембрану по пассивному опосредованно;.^ механизму), регуляция которых требует нескольких секунд, но которые сами по себе не приводят к изменениям в проницаемости мембран. Если второй импульс поступает в определенный момент, ноеым воздействием достигаются такие изменения в системе транспорта, которые приводят уже к ускорению прохождения нуклеоздда через мембрану.

Проведенные рценкп изменения температуры показывают, что тотальный однородный нагрев в надих условгях невозможен (температура поднимается на 10"^ - 10~2 градусов), но может происходить локальный импульсный нагрев ( до =36°С) какого-то определенного участка мембран, что достаточна для конфор-шционных изменений молекул.

§ 5 посвящен исследованию специфики летального и мутагенного действия УКИ с длиной волны 532 юл в клетках Е.ооН ирг или Не I- а в экспоненциальной я стационарной фазах роста.

Рио.8. Изменение радиоактивности целых клеток через 2,5 ч. после облучения двумя пикосекундными импульсами в зависимость от интервала между ниш I - Л =266 им, 3 =2'1010 Вт/м2; 2 -■N=266 нм, 3" 20'1010 Вт/м2; 3- Л =532 нм, 3= 2'1010 Вт/м2. Радиоактивность ДНК <4) в этих же уоловиях не изменяется (обозначение точек то же, что и выше, величина ошибки измерения менее размера точек). Пунктиром обозначен контрольдаЯ уровень для радиоактивности целых клеток и ДНК.

Интенсивность света была 2'1013, 7,5'Ю*3 или 1,3'Ю14 Вт/ы2, число импульсов от I до 500, в результате чего доза изменялась в пределах от Ю4 до I06 Дд/"2.

Обпаружено, что метки Не La в обеих фазах роста являются весьма резистентными к этому типу облучения, выжившая фракция ни при каких условиях не была меньше 0,75. Отсутствует зависимость летального эффекта от интенсивности, что говорит о незначительном вкладе двухквантовых повреждений. Различий в реакциях пролпферирушцих и покоящихся iustok не обнаружено. Сравнение этих данных с данными, полученными при облучении клеток Не La в экспоненциальной н стационарной фазах роота б УЖ А =266 гол, показывает, что летальное действие в случае УФ облучения существенно более шракено,. имеется разница в летальности клеток в экспоненциальной и стационарной фазах роста (пролпферирующае клетки являются более чувствительными).

Летальное действие УКИ с 532 км на бактерии E.ooli проявляется также очень олабо. Облучение максимальной дозой, использованной в наших опытах - 2'Ю6 Дж/м2 ( J =4*10 Вт/м2), приводит к снижению выживаемости до 0,63. Отметим, что при облучении этого штамма УКИ с Л =266 нм для снинения выживаемости до 0,6 достаточно дозы 20 Дп/м2, что ца.5 порядков нияе соответствующей доза зеленого лазерного импульсного излучения.

Пикосекундаые лазерные тшульсы с данной волны 532 нм не. вызывают увеличения количества реверсий к триптофанне зависимости, т.е. не обладают мутагенным действием в условиях нашего опыта.

Полученные данные свидетельствуй? о том, что импульсное лазерное излучение о Л =532 на но оказывает в условиях нашего опыта спецвфнчоского летального а кутагенного воздейств-вия по сравненил. с непрерывным зелешнл светом.

В § 6 приведены дагашэ об исследованиях летального и мутагенного действия излучения ХеС| лазера на бактерии E.coli .Показано, что доза ДЛ37 составляет I04 Дд/м2, а при облучении бактерий, в дозе 10 Дд/м2 Еызпваеиость сншгается до I %. Число ревертантов к триптофаннезависимости составляет около 100 на I06 выживших клеток цра дозе Ю5 Да/м2 и 25

Рис.9 . Зависимость летальногб (I) и мутагенного (2)

действия излучения XeCi лазера ( X = 308 им) ■ на бактерии Escherichia coll WP2 от дозы.

на Ю6 - при дозо ЛД37. Отмечено, что ДД37 для излучения О

Л =308 1С,! превышает ЛД37 дая низкопнтенсивного непрерывного овэта о А =309 - 10 нм более чем в 5 раз, а чиоло мутантов при облучении в"дозе 4'103 Дж/м2 выше в случае •X =309 - 10 нм по сравнению с таковым при Л =309 нм более чем па порядок (300/Ю6 и Ю/Ю6, соответственно). При облучении в дозах ЛДду число мутантов отличается незначительно, что говорит о том, что в обоих случаях одинаковое чполо мутаций приходится на одно летальное событие. Из анализа собственных я литературных данных делается вывод, что обнаруженная разница в числе мутантов при облучении светом 309 4 10 ил и 308 нм вызвана присутствием в оветэ 309 нм коротковолновых примесей, которые покатает спектр дейотвия, т.е. определяется дайной волны используемого излучения, а не импульсным характером источника света при А =308 нм.

Глава 6. О ранксготдттФштттггугтрч действии УФ л видимого лаз оттого излучения

§ I является вводным. Задачей накзх экспериментов было проведете исследования комбинированного воздействия у-радиации и лазерного излучения на опухолевые клетки НеЬа в стационарной фазе роста. Отточено, что соответствую- . цие данные на клеточном уровне кра5лэ малочисленны и касаются исключительно воздействия Не-N о лазера на клетки в экспоненциальной фазе роста.

На основе данных, полученных рапса (глава 2-5), в качестве еоточкекоз света ин выбрали По-Г/о лазер . 2-ую гармонику Си лазера я 4-ую гармонику А^ 4Т УА$- лазера, в качестве ионизирующей радиации использовали ¥ -излучение, воздействие которого на глотки Не1 а в стационарной фазе роста хорошо изучено (Календо, 1982). Методическим вопросам проведения экспериментов посЕящен § 2.

В начале § 3 приведены данные о кривих роста облученных в стационарной фазе роота клеток после пересева. Изучена диншлпеа кривых после лазерного облучения шш у-облучения, а такяе в зависимости от промежутка времени мезду лазерным и У-облучением при комбинированном воздействии. Показано, что облучение клеток мощны:.® УКИ лазера не вызывает

никаких изменений по сравнению с контролем. При облучении

ишульсно-периодическим излучением Сч лазера наблкщаетоя стимуляция роста клеток, которая заключается в достижении более высоких плотностей культуры в отацаонарной фазе, а облучение Не-Ме лазером вызывает активную пролиферацию клеток в экспоненциальной фазе роста, которая не прекращается до 9-ых суток (в контроле на 6-7-е сутки). После этого начинается массовое открепление клеток и устанавливается стационарное ооотояние на уровне, близком к контролю.

Установлено, что предварительное облучение Не-А/в лазером до У -облучения вызывает стимуляцию роста культуры в экспоненциальной фазе роста по сравнению только о У-облученными клетками. Эффект зависит от промежутка времени между двумя облучениями. Если этот промежуток короткий (от 5 мин до 20 мин), то стимуляции не наблюдали. Стимуляция в экспоненциальной фазе роста и появление репопулящш на 13-е сутки максимальны, когда промежуток между лазерным и у-облучением составляет 180 мин. Предварительное облучения Си, лазером (А =271,2 нм) вызывает подавление роста культуры во всех фазах роота.

При исследовании моногенности клеток после комбинированного лазерного и у -облучения обнаружено, что предварительное облучение УФ нмпульоно-периодическим излучением уменьшает число клопогонных клеток по сравнению о только у-облученными клетками, а облучение Не-Л/е лазером увеличивает моногенность клеток . Последний эффект завысит как от промежутка времени между лазерным и у-облучениями, так и от дозы лазерного света. Приведены данные о вариабельности размеров клонов как после лазерного, так и после комбинированйого лазерного и у-облучения.

Таким образом, в определенных уоловиях (параметры излучения, время ыезду облучениями) лазерное излучение может оказывать радаомодифицирующее действие. Пиззсоинтенсивное УФ импульсно-периодачеоков излучение несколько уошшваэт, а непрерывное низкоиитеиоивное излучение Не-N о лазера ослабляет эффективность у-облучения в дозе 5 Гр. Различное действие этих лазерных источников связывают о разными мишенями воздействия ' (в случае УФ излучения - основной критической мишенью является да, а для видалого света - митохондрии, см. главы 2-5). Дашше о дыхательной цепи как о первичном фотоакцопторе для ¿единого лазерного света в клетке и предположение о связанной с дыхательной цепью родокс- ригу-

ллцШ'1 клеточного метаболизма (глава 4) позволяют высказать гипотезу о тон, что радиозощитноо воздействие излучения Но-N о лазера монет бить объяснено в рамках известной "тиоль-ной концепции" радиочувствительности.

швода

1. Установлены количественные закономерности рогуляторного воздействия видимого, ближнего УФ и ближнего ИК излучения па метаболизм прокариотических, примитивных и сложных эукариотичоских ¡теток, которые заложили основы нового научного направлешш в фотобиофизика н фотобиологии сложных биологических систем.

2. Установлено, что эффективность регуляторного воздействия определяется монохроматичностью излучения в пределах ширины полос спектра поглощения биомолекул. Когерентность лазерного излучения для этого процесоа не существенна.

3. Показано, что регуляторше эффекты имеют пороговую зависимость по интенсивности и дозе лазерного излучения, требуемые величины которых определяются видом и типом клеток.

4. Сформулирован принцип регуляторного воздействия видимого, ближнего УФ и ближнего ИК излучений на клетку. Предложены • схемы передачи п усиления регуляторного сигнала в эука-риотической и прокариотической метко.

5. Предложены и исследованы два метода селективного воздействия импульсным лазерным излучением в УФ, видалой и ближней ИК областях на покоящиеся клетки по сравнению о активно пролиферирующими клетками.

6. Обнаружено существенное влияние предварительного воздействия на клетку лазерным излучением на ее стойкость к последующему у-облучению. Показано,■что облучение импульсно-периодическим УФ излучением усиливает эффективность влияния последующего у-облучения, а облучение непрерывным видимым излучением ослабляет его воздействие.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Действие ультракоротких импульсов УФ лазерного излучения на опухолевые клетки HeLa / Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C., Матвеец Ю.А., Семчишэн В.А., Серебряков Н.Г., // Квантовая электроника - 1981. - Т.8, №12. - С.2540-2545.

2. Karu T.I., Kalendo G.3., Letokhov V.S. Control of RNA eyn-theaia rate in tumour calls HeLa by eotion of low intensity visible light of copper laser // Lett. II lluovo Cimento-1981. - V.32, 11°2. - P.55-59.

3. Реакция пролиферирующих и покоящихся опухолевых клеток на импульсно-периодцческое лазерное УФ излучение низкой интенсивности / Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C., Либко В.В. // Докл. АН СССР. - 1982. - Т.262, Д6. -C.I498-I50I.

4. Действие низкоинтенсивного видимого излучения медиого лазера на культуру клеток HeLa / Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C., Лобко В.В. // Квантовая электроника - 1982. -Т. 9, М. - С. 141—144.

5. Зависимость биологического действия низкоинтенсивного видимого света на клетки HeLa от параметров излучения -когерентности, дозы, длины волны и режима облучения / Кару Т.Н., Календо Г.С., Летохов B.C., Лобко В.В. // Квантовая электроника - 1902. - Т.9, №9. -.0.1761-176?;

6. Зависимость биологического действия низкоинтеноивного видимого света на клетки lleLa о^ когерентности, дозы, длины волны и режима облучения.II / Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C., Лобко В.В. // Квантовая электроника - 1983. -Т. 10, J69. - C.I771 -1776.

7. Bloatimulation of HeLa cells Ъу low intensity visible light / Karu Т.1., Kalendo O.S., Letokhov V.3., Lobko V.V. // II Huovo Cimento D - 19B2. - V.I, П°6. - P.B28-B40.

8. Кару Т.Н., Календо Г.С., Лобко В.В. Зависимость биологического действия низкоинтеноивного видимого света на клетки от параметров иэлучошш - когерентности, дозы и длины полны // Изв. All СССР, серия физическая - 1983. - Т.47, НО. - С, 2017-2022.

9. Different responses of proliferating and resting tumour oells to pulsed high repetition rats low-intensity laser light at 271 nm / Karu T.I., Kalendo G.S., Letokhov V.S., Lobko V.V.//Laser Chemistry -1983. - V.1, №3.- P.153-161.

10. Воздействие низкоинтенсивного импульсно-периодического лазерного УФ-излучения на скорость синтеза нуклеиновых кислот в пролнферирующих и покоящихся клетках / Кару Т.Й., Федосеева Г.Е., Юдахина Е.В., Календо Г.С., Лобко В.В. // Цитология - 1983. - Т.25, JSI0, - C.I207-I2I2.

11. Stimulation of E.coli growth by laeer and inoooherent red light / Karu T.I., Tiphlova O.A., Letokhov V.3., Lobko V.V. // II Huovo Cimento D. - 1983. - V.2, №4. - P.1138-1144.

12. Кару Т.Н. Воздействие ннзкоинтенсивного монохроматического света в видимой области на жизнедеятельность ¡слетки - Применение лазеров в биологии / Ред. Л.В.Губни. Изд. ¡ЛГУ,

1983. - С.15-19.

13. Кару Т.Й., Календо Г.С,, Летохов B.C. Сравнение действия ультракоротких УФ мощных импульсов на репликативную и транскрипционную функцию ДНК в пролифериругощих и покоящихся клетках Не|_а // Радиобиология - 1984. - Т.24, Щ. - C.I7-20.

14. Действие импульсного лазерного УФ излучения на пролифери-рующие и покоящиеся опухолевые клетки HeLa / Кару Т.Й., Календо Г.С., Летохов B.C., Лобко В.В. // Радиобиология -

1984. - Т.24, №2. - С.273-276.

15. Светолечение больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кашки на основе стимуляции клеток низкоинтенсивным красным светом / Кару Т.Й., Летохов B.C., Лобко В.В., Новиков В.Ф., Парамонов Л.В. // Вопросы курортологии, фи-зиотор. и лечебн. йизкульт. - 1984. - ftl. - С.36-39.

16. Bioatimulation of HeLa cells by low-intensity visible light. II. Stimulation of DHA and RNA synthesis in a wid& range / Karu T.I., Kalendo G.S., Letokhov V.S., Lobko V.V. // II Nuovo Cimento D - 1984. - V.3 D, №2. - P.309-318.

17. Biostimulation of HoLa cells by low-intensity visible light. III. Stimulation of nucleic acid synthesis in plateau phaRe cells // Karu T.I., Kalendo G.3., Letokhov V.S., Lobko V.V. // II Nuovo Cimento D, - 1984. - V.3,

ri'J2. - F.319-3?5.

18. д:!:;етяка- роста онухол-звых клеток HeLa при еубкультлвирэ-

вании после облучения низкоинтенсивным красным светом в стационарной фазе роста / Кару Т.Н., Календо Г.С., Доб-ко В.В., Пятибрат JI.B. // Экспериментальная онкология -

1984. - Т. 6, - JM. - C.GO-62.

19. Biostimulating action of low-intensity monochromatic visible light-ia it possible? / Karu T.I., Tiphlova O.A.-, Fedoseyeva G.E., Kalendo G.S., Letokhov V.8., Lobko V.V., Lyapunova T.3., Pomoehnikova N.A., Ueissel M.N. // Laser Chemistry - 1984. - V.5, №1. - P. 19-25.

20. Effect of the He-He laser radiation on the reproduction rate and protein sythesis of the yeasts / Pedoeeyeva G.E., Karu T.I., Letokhov V.S., Lobko V.V., Pomoehnikova N.A., Lyapunova T.3., Mela eel M.l). // Laser Chemistry - 1984. -V.5, Hf1. - P.27-33.

21. Karu T.I., Letokhov V.S, Biological action of low-intensity monochromatic light in the visible range - Laser Photo-biology and Photomedicine / Eds. S. Martelucct, A.N.Chester - New York: Plenum Press, 1985. - P.57-66.

22. Лобко B.B., Кару Т.й., Летохов B.C. Существенна., ли когерентность низкоинтенсивного лазерного света при его воздействии на биологические объекты? // Биофизика - 1985. -Т.30, &г. - С.366-371.

23. Влияние облучения монохроматическим видимым светом на содержание цАМФ в клетках млекопитающих / Кару Т.Й., Лукпапова И.М., Чирков Ю.Ю. // Докл. АН СССР -

1985. - Т. 281, Ш, - С Л242-1244.

24. Karu T.I., Letokhov V.3., Lobko V.V. Bloatimulation of HeLt cells by low-intensity visible light. IV. Dichromatic irradiation // II Nuovo Cimento D. - 1985. - V.5, ' №6. - P.403-*,36.

' 25. Низкоинтенсивиый некогерентный красный свет в комплексном лечении язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки / Сазонов A.M., Романов Г.А., Портной Л.Ы., Одинокова В.А., Кару Т.Й., Лобко В.В., Летохов B.C. // Советская медицина - I9Q5. - Й12. - С.42—15.

2G. Календо Г. С., Кару Т.Й. Реакция опухолевых клеток Не La, пролцферирующих и находящихся в стационарном периоде роста, на слабна физачесшю воздействия //Актуальные нробле-

ми онкологии и медицинской радиологии - Шнек, 1985. -вып.13 - C.I60-I63.

27. Karu T.I. Biological action of low-intensity visible monochromatic light and soma of ite medioal applications -Laser / Ed. G.Galletti - Bolognas Monduzzi Editora, 1985.-P.25-29«

28. Кару T.Ü. 0 молекулярном механизме терапевтического действия низкоинтенсивного лазерного света // Докл. АН CCCF-1986. - Т.291, №5. - C.I245-I249.

29. Кару Т.К. Воздействие импульсного лазерного УФ излучения на проницаемооть мембраны покоящихся опухолевых клеток // Радиобиология - 1986. - Т. 26, JS6. - С. 793-797.

30. Тифлова O.A., Кару Т.Й. Действие излучения аргонового лазера и некогерентного синего света на бактерии Escherichia coli // Радиобиология - 1986. - Т.26, №6. -0.829-832.

31. Изменение активности дрожжевых ферментов после облучения низкоинтенсивным лазерным светом / Федосеева Г.Е., Кару Т.Й., Ляпунова Т.С., Мейоель М.Н., Помощникова H.A., Пес-кин A.C. //Микробиология - 1986. - Т.55, №. - С.944-948.

32. Летальное и мутагенное действие излучения XeCí лазера на бактерии Escherichia ooli / Тифлова O.A., Кару Т.й., Фур-зиков Н.П., Карбышев»Е. А. // Радиобиология - 1987. -

Т. 27, JS5. - С.706-708.

33. Изменение структуры хроматина лимфоцитов после облучения He-Ate лазером / Федосеева Г.Е., Смольянинова Н.К., Кару Т.Й., Зеленин A.B.// Радиобиология - 1987. - Т.27, JS5. -С.605-609.

34. Кзру Т.Й. Воздействие нэ эндогэнннв с°нсибялпяптош в клетке как возможный механизм фототерапии нпзкоинтенсивным светом - Применение лазеров в биологии / Ред. Л.Б.Рубин -Кишинев, - 1986. - С.92-96.

35. Тифлова O.A., Кару Т.й. Действие низкопнтеноивного света красной и дальней красной областей спектра на бактерии Escherichia ooli// Микробиология - 1987. - Т.56, №3. -

С.393-395.

36. Кару Т.Н., Тифлова O.A. Воздействие монохроматического низкоинтенсивного видимого света на роот Escherichia ooli // Микробиология - 1987. - Т.56, JH. - С.626-630.

37. Чувствительность различных дрожжевых культур к действию низкоинтенсивного сьота / Федосеева Г.Е., Кару Т.й., Ляпунова Т.О., Помощникова H.A., Мейсель М.Н. // Микробиология - 1987. - Т.56, Й5. - С.792-796.

38. Кару Т.Н., Пятибрат Л.В., Календо Г.С. Радиомодифици-рующее действие УФ и видимого лазерного света // Радиобиология - 1987. - Т.27, №. - С.804-809.

39. Effect of ii-radiation with monochromatic visible light on cAMP content in Chinese hamster fibroblasts / Karu T.I., LukpEnova G.G., Parkhomenko I.M., Tiphlova O.A. // II Huovo Cimento D - 1967. - V.9, M°10. - P.1245-1252.

40. Фотобиологический эффект излучения полупроводникового лазе] в ближней ИК области / Жаров В.П., Кару Т.Й., Литвинов

■ Ю.О., Тифлова O.A. // Квантовая электроника - 1987. -T.I4, Ш. - C.2I35-2I36.

41. Karu T.I. Photobiological fundamentals of low-power laser therapy // IEEE J. of Quantum Eleotronica - 19B7.-V.QE-23, H°10. - P.1703-1717.

42. Тифлова O.A., Кару Т.Н. Влияние низкоинтенсивного видимого света на нестационарние метаболические процессы в клетках бактерий Escherichia coli // Докл. Ail СССР -1987. - Т.295, М. - C.I002-I005.

43. Karu 'ГЛ., Pyatibrat L.V., Kalendo G.S. Biostimulation of H"La "ells by low-intensity viBible light. V. Stimulation of cell pr oliferation in vitro by Ile-Ne laser radiation. // II. Huovo Cimento V - 1987. - V.9, H°12. -

p. 1485-1494.

44. Karu T.I, Molecular mechanism of the therepeutical effect of low-in tensity laser radiation // Lasers in the Lite Sciences - 19B8. - V.2, № 1. - P.53-74.

45. The activation of yeast metabolißm with He-He laser radiation. I. Protein synthesis in various cultures / Fe-doöeyeva O.E., Karu T.I., Lyepunova T.S., Pomoahnikova H.A., MulsBöl M.N. // Lasers in the Lil'e Scienceo -199Ö. - V.2, Uu?. - I1. 137-146.

46» The activation of yaat metabolism v»ith He-Ne Laser radiation. II. Activity of ensymes of oxidative and phosphorous metabolism / Fedoseyeva G.E., Karu T.I., Lyapu-nova T.S., Pomoehnikova И.А., Moleael M.N. // Lasers in the Life Scienaes - 1999. - V.2, H°2 . - P.147-154.

47. Tiphlova O.A., Karu T.I., Furzikov H.P. Lethal and muta-genio action of XeCl laser radiation on Escherichia coil // Lasers in the Life Sciences - 1988. - V.2, H°2. -P.155-159.

4B. Исследование специфики летального и мутагенного действия ипкосекундных лазерных импульсов о длиной волны 532 гол/ Кару Т.Й., Лятибрат Л.В., Тифлова О.А., Нпкогосян Д.Н.// Радиобиология - 1988. - Т.28, М. - С.499-502.

49. Tiphlova О.А., Karu T.I. Escherichia ooli growth stimulation by low-intensity monochromatic» visible light // Photochem. Fhotobiol. - 1988. - V.48, H°4. - P.467-47I.

50. Human lymphocyte chromatin changes following irradiation with a Ие-Na laser / Fodoseyeva O.E., Smolyaninova H.K., Karu T.I,, Zelenin A.V. // Lasers in the Lifo Soienoea -

1988, - V.2, №3. - P.197-205.

51. Тифлова О.А., Кару Т.Н. Влияние излучения Ho-//e лазера на систему бактериофаг Т4 - E.coli WP2 // Радиобиология-

1989. - Т. 29, !Ъ2. - С. 278-280.

52. Karu T.I. Photobiology of low-power laser effeota // Health Fhyaics - 1989. - V.56, Н°5» - P.691-704.

53. Karu T.I. Fundamentals of low-power laser photomodioine-Laeer Science and Technology / Eds. A.H.Chester, V.S.Le-tokhov, S.Martelluoci - Hew York « Plenum Ргевв, 1989

P.217-232.

54. Влияние излучения lle-tíe лазера на хемилшинесценцши íwwío;-' селезенки мыши / Кару Т.Л., Рябых Т.П., Федосеева Г.Е., Пучкова Н.И. // Радиобиология - 1989. - Т.2. - С. 230234.

55. Tiphlova О.А., Каш T.I. Role of primary photoacceptúre in low-power laser effects : action of He-He laser radiation on the bacteriophage T4-Bscheriohla noli interaction // Lasers Surg. Kod. - 19Я9. - V.9, №1. - Р.67-6Э.

56. Karu T.I. Photobiology of Low-Power Laser Therapy. Chur, London, Paris, New Yorki Harwood Academio Publ., 1989.

57. Кару Т.И. Фотобиология низкоинтенсивной терапии // Итоги науки и техники. Сер. физические основы лазерной

V и пучковой технологии, Т.4 - M.s ВИШИ - 1989. - С.53 -ИЗ.

ffcpc^^y

Информация о работе

Кару, Тийна Йоханнесовна
доктора физико-математических наук
Ленинград, 1989
ВАК 03.00.02

Автореферат

Метаболические процессы в нефотосинтезирующих клетках, индуцированные лазерным излучением в УФ, видимой и ближней ИК областях спектра - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы