Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биологический анализ ДНК, выходящей из лимфоцитов крови человека и клеток постоянной линии HL 60 в среду культивирования

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологический анализ ДНК, выходящей из лимфоцитов крови человека и клеток постоянной линии HL 60 в среду культивирования"

институт цитологии академии наук ссср

На правах рукописи удк 577.113

ВАСЮХИН Валерий Иванович

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ДНК, ВЫХОДЯЩЕЙ ИЗ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И КЛЕТОК ПОСТОЯННОЙ ЛИНИИ НЬ60 В СРЕДУ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.25-клеточная биология

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ленинград 1991

Работа выполнена в Лаборатории биохимической цитологии и цитохимии Института цитологии АН СССР и Лаборатории онкогематологии Университета (г. Женева).

Научные руководители: доктор биологических наук К. А. САМОЙЛОВА кандидат биологических наук О. И. ПОДГОРНАЯ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. А. КОРДЮМ доктор биологических наук С. Н. БОРХСЕНИУС

Ведущее учреждение — Институт молекулярной биологии АН СССР.

у

Защита состоится 1991 г. в « » часов

на заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан «

г,

г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л. Н. ПИСАРЕВА

© — Институт цитологии АН СССР

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Одним из важнейших вопросов, сформулированных класссической генетикой и решаемых молекулярной биологией, является пластичность генома, его изменчивость, отличающаяся по темпам и механизмам от обычного мутационного процесса /Хесин, 1985/. Частью проблемы "непостоянства генома" являются его перестройки, ведущие к образованию экстрахромосомных молекул ДНК (эДНК), обнаруживаемых в клетках эукариотических организмов различного уровня организации /см. Rush, Misra, 1985 /• Как правило, эДНК представлены кольцевыми, гетерогенными по размеру молекулами /3ertelsen et. al., 1982 /. Некоторые из них образуются путем эксциэии фрагментов ДНК из хромосом; другие - представляют собой амплифицированные молекулы ДНК, формирующиеся при рекомбинации участков хромосом, реплици-рованных более I раза за клеточный цикл /schimke et al., 1986 /. Показано, что эДНК может содержать гены, детерминирующие фенотип клеток /Von Hoff et al.* 1988, Ruiz et al., 1989 /, но в целом ее функциональное значение остается не установленным. В отсутствие селективного давления клетки быстро утрачивают эДНК /pauletti et al., 1990 /. Имеются данные свидетельствующие о том, что она способна выходить из ядра в цитоплазму /Kiyama et al., 1989 /, ее дальнейшая судьба остается не выясненной.

Практически независимо от изучения эДНК с середины 70-х годов разрабатывается вопрос о внеклеточной ДНК (енДНК), выходящей из клеток во внеклеточную среду и обнаруживаемой в ряде биологических жидкостей, в частности -в плазме крови. Хотя выход ДНК описан для самых разных клеток, подавляющее большинство работ выполнено на лимфоцитах (Лфц) крови человека /см. Федоров, Янева, 1982/. Получены убедительные доказательства того, что появление внДНК является активным процессом и не связано с гибелью клеток /см. Adams, 1985 /. Ее количество значительно воз-

растает при активации клеток митогенами, лазерным излучением, мембранотропными агентами (трипсин, проназа, плаз-мин). При стимуляции фитогемагглютинином (ФГА) 70-90% Лфц включает ^Н-тимидин, но в митоз вступает менее 40%, 35-90% синтезированной ДНК экскретируется в среду /Hogers et al., 1972 /. По данным кинетики реассоциации, она отличается от тотальной ДНК клеток и составляет около 10% генома Лфц / Kogers, 1976 /. Механизм образования внДНК и ее функции остаются неясными. Некоторые исследователи считают, что внДНК является следствием шеддинга ДНК с плазматической мембраны и что именно на поверхности клеток она выполняет свою основную функцию, являясь составной частью сложных рецепторных образований /Heid et al., 1979 /. Имеется ряд данных, свидетельствующих о том, что внДНК способна регулировать пролиферативную активность других клеток /Гамалея и др., 1983, Sryfter, Ktorowicz, 1984 /. Не исключено, что внДНК учавствует в процессе обмена генетической информацией между различными субпопуляциями Лфц в процессе им-муного ответа /Anker et al., 1984/.

Пониманию функционального значения внДНК может способствовать идентификация ее клеточных предшественников и анализ присутствующих в ней нуклеотидных последовательностей. В некоторых работах, выполненных с помощью импульсного мечения ДНК ^Н-тимидином, предшественник внДНК был обнаружен среди эДНК клеток /Rogers, 1976 /, однако, исследований взаимосвязи эДНК и внДНК с использованием современных методов не проводилось.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы -изучение нуклеотидных последовательностей и структуры внДНК с позиции тех механизмов, которые вовлечены в процессы образования эДНК. Представлялось целесообразным выполнить такое исследование в основном на Лфц крови человека в норме и в условиях, стимулирующих выход из них ДНК, и лишь в некоторых экспериментах использовали другие клет-

ки. Задачи работы состояли в следующем.

, I. Электрофоретический анализ внДНК.

2. Идентификация в препаратах внДНК кольцевых молекул.

3. Гибридизационный анализ внДНК Лфц и ДНК плазмы крови человека.

4. Гибридизационный анализ внДНК различных субпопуляций Лфц.

5. Выявление в препаратах внДНК амплифицированных молекул.

Научная новизна работы. Впервые показано, что ДНК, освобождающаяся в культуральную среду из Лфц, содержит кольцевые молекулы, среди которых обнаружены дискретные по размеру фрагменты, гомологичные делегирующемуся в процессе дифференцировки иммуноглобулиновому (1б-) гену . Их источником являются В-Лфц. Впервые получены доказательства того, что внДНК Лфц и клеток промиелоцитической лейкемии человека НЬ 60 содержит амплифицированные молекулы. Выявленные свойства внДНК дают основание считать, что ее предшественником является эДНК клеток.

Впервые установлено, что УФ облучение СУФО) крови в терапевтических дозах (применяемых при аутотрансфузиях УФ облученной крови - АУФОК) способствует повышению содержания ДНК в плазме и ее выходу из Лфц.

Практическая ценность работы. Полученные результаты существенно дополняют сведения о свойствах и происхождении ДНК, освобождающейся из эукариотических клеток. Они способствуют углублению имеющихся представлений о механизмах поддержания стабильности генома. Стимуляция выхода ДНК в плазму крови после ее УФО в терапевтических дозах, может составить один из механизмов иммунокорегирующего действия метода АУФОК. По-видимому, особый интерес полученные данные представляют для практической онкологии. Известно, что в возникновении и прогрессии опухолей важную роль играет процесс амплификации онкогенов. Дополнительные копии онкогенов присутствуют в ряде малигнизиро-

ванных клеток в виде эДНК. Обнаруженный 'в настоящей работе выход из трансформированных клеток ДНК, обладающей свойствами эДНК, может составлять один из механизмов образования метастазов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Молодежной конференции Института цитологии АН СССР /Ленинград, 1987/, на I Всесоюзной конференции "Биохимия-медицине" /Ленинград, 1988/, на П школе-конференции молодых ученых /Трускавец, 1988/, на II Международном совещании по клеточному ядру /Суздаль, 1989/, на семинарах факультета математических и биологических наук Ньюйоркского государственного университета /Буффало, США, 1990/, факультета биологии университета Лаваля /Квебек, Канада, 1990/, лаборатории онкогематологии университета /Женева, Швейцария, 1990/ и на совместном семинаре лабораторий биохимической цитологии и цитохимии, стабильности хромосом и клеточной инженерии и генетических механизмов дифферен-цирозки и малигниэации клеток Института цитологии АН СССР /Ленинград, 1990/.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы "Материал и методы исследования", результатов исследования, обсуждения и выводов. Иллюстрированный материал содержит 20 рисунков. Список литературы включает 156 работ, из них 19 на русском языке.

МАТЕРИМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования - Лфц и образцы плазмы донорской крови, а также клетки постоянной линии промиелоцитической лейкемии человека НЬ 60 . В ряде экспериментов использовали мышиные фибробласты постоянной линии Ь 929 . Лфц выделяли по стандартной методике с помощью центрифугирования крови в градиенте плотности фиколл-иэопака. Т-Лфц очищали с использованием колонок с- нейлоновой ватой, 3-клетки -

методом роэеткообразования с эритроцитами барана. В зависимости от задачи эксперимента работали с Лфц непосредственно после их ввделения и инкубирования в растворе Хенкса в течение 30 мин при 37°С или после их культивирования в течение I-б сут в пластиковых пробирках в среде 199, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Исследовали как не стимулированные Лфц, так и стимулированные митогенами (ФГА, митоген лаконоса -pwu ) или УФ облучением. УФО крови проводили в аппарате "Изольда", применяемом с лечебной целью при проведении АУФОК (254 нм). Использовали стандартную терапевтическую дозу и дозу в 5 раз ее превышающую (810 и 4000 Дж/м^). При УФО суспензии выделенных Лфц дозу снижали в 20 раз (36 Дж/м^), при этом они облучаются примерно в той же дозе, как и при УФО цельной крови в аппарате "Изольда".. Клетки постоянных линий HL 60 и L 929 культивировали соответственно в средах hfmi I6AO и 199, содержащих 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота.

Выделение ДНК. Клетки осаждали центрифугированием при 400 g, 10 мин. Осадок использовали для выделения тотальной клеточной ДНК, а из супернатанта, после двух последовательных центрифугирований (1500 g, 10 мин и 12 000 g, 20 мин), выделяли внДНК. Тотальную ДНК очищали по стандартной методике с использованием обработки протеиназой К в присутствии додецилсульфата натрия, фенольной экстракции, переосаждения этанолом и центрифугирования в градиенте плотности раствора CsgSO^ /jachertz et al., 1979 /• внДНК очищали с помощью двух экстракций фенолом, хроматографии на колонке гидроксиаппатита и последующего центрифугирования в градиенте CSgSO^ ./Anker et ai., 1984/. При очистке ДЧК плазмы крови, перед центрифугированием в градиенте Cs2S0^ » препараты подвергали хроматографии на колонке конканавалин А - сефарозы /stroun et al., 198?/. Малые по размерам ДНК клеток выделяли по методу Хирта / Hirt, 1967 /. В качестве одного из контролей использова-

ли препарат тотальной клеточной ДНК, частично гидролизо-ванной клеточными эндонуклеазами. Для его получения Лфц разрушали в гомогенизаторе Даунса и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Из полученного лизата выделяли ДНК по описанной выше методике.

Электрофоретический анализ ДНК. Очищенные препараты ДНК разделяли в гелях 0,3 и 0,8$ агарозы по стандартной методике /Маниатис и др., 1984/. Для изучения стабильности внДНК, среда, кондиционированная в течение 24 ч клетками HL 60 , была разделена на аликвоты, которые инкубировали О, 12, 24, 36, 48, 60 ч при 37°С. Для выяснения влияния подобных манипуляций на очищенные препараты ДНК, в каждую алкйвоту предварительно было внесено по 3 нг рестрициро-ванной Xbai тотальной клеточной ДНК, меченной по концам ^Р. По окончании инкубаций присутствующая во внеклеточной среде ДНК фма выделена и проанализирована с помощью электрофореза. ДНК, вышедшая из клеток, выявлялась с помощью окрашивания геля в растворе бромистого этидия. Препараты очищенной ДНК, внесенной в образцы перед началом инкубации, выявлялись при экспозиции геля с рентгеновской пленкой. После этого сравнивали электрофоретические картины препаратов ДНК до и после инкубации среды при 37°С. ~

Выявление кольцевых молекул в препаратах ДНК. Препараты ДНК анализировали методом электронной микроскопии по Дэвису с соавт. / Davis et al., I97l/- Другим простым и надежным методом, позволяющим обнаружить кольцевые ДНК, является задержка их миграции в электрическом поле путем полимеризации ДНК в геле легкоплавкой агарозы / Schindler et al., 1982 /. С этой целью пробу, содержащую ДНК, смешивали при 65°С с предварительно расплавленным раствором 1,5% легкоплавкой агарозы и полученную смесь вносили в "карман" блока для агарозного электрофореза. Через несколько минут в "кармане" образовывался гель агарозы. На соседнюю дорожку наносили пробу ДНК без легкоплавкой агарозы и проводили обычное электрофоретическое разделение.

После этого сравнивали картины разделения препаратов. Присутствующая в анализируемом препарате кольцевая ДНК остается на старте при полимеризации в геле агарозы и свободно мигрирует на паралельной дорожке геля.

Дот-блот гибридизация и блоттинг по Саузерну. При анализе ДНК гибридизацией с повторяющимися последовательностями использовали метод дот-блот гибридизации, а при гибридизации ДНК с уникальными последовательностями - метод блоттинга по Саузерну. Фильтры гибридизовали с пробами ДНК, меченными ^Р методом случайного праймера до удельной активности 3x10^ имп/мин/мкг. Гибридизацию проводили в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем мембраны (в 50% формамиде при 43°С для уникальных генов и при 52°С для повторов). После окончания гибридизации фильтры отмывали от метки с конечно^ инкубацией в растворе ОДхввс, 0,1% БВВ при 65°С.

Плазмиды. В работе использована плазмида рС 2 / Hieteг et а1., 1980 /, содержащая константный (С) участок ]^-гена э? человека, которая была любезно предоставлена В.А.Поспеловым /Ин-т цитологии АН СССР/. Рестриктная карта гена и пробы , использованные в гибридизациях, представлены на рис Л.

\-е51ММ8 -

I Т.п.н. I --

Рис Л. Рестриктная карта С участка ig-гена 'J? человека.

Прямоугольником обозначен С регион гена; вертикальными линиями - 5 Joining-последовательностей; в, Bg, Н, S - участки узнавания для рестриктаз BanHI, Bglll, Scofil, Sstl, соответственно; отрезки внизу - пробы, использованные а гибридизациях.

Плазмида pHEL-83H, содержащая полный ген актина миокарда человека / Gunning et al., 1984/, передана нам Л.Ке-дес Ai.Kedes, Stanford University, USA /. Плазмида pAC 12 получена нами путем субклонирования фрагмента экзона гена актина миокарда из плазмиды pHEL-83E в вектор рис 19. В результате был субклонирован фрагмент экзона гена актина миокарда, не содержащий повторяющихся последовательностей, который использовался в качестве геноспецифической пробы.

Плазмида рМТ 8, содержащая Hindlll фрагмент митохондри-альной ДНК мыши размером 1,8 т.п.н., любезно предоставлена К.А.Сальниковым /Ин-т цитологии АН СССР/.

В качестве специфической пробы "(-сателлита хромосомы № II человека использовали коммерческий препарат фирмы Onkor .

Во всех случаях пробы оделяли от векторной ДНК с помощью электрофореза. ДНК из геля получали методом легкоплавкой агарозы /Маниатис и др., 1984/.

Выявление в препаратах ДНК амплифицированных молекул проводили после культивирования клеток в среде, содержащей 3 мкм 5-броадезоксиуридина (БДУ). Включающийся во вновь синтезируемую ДНК ЕДУ увеличивает ее плавучую плотность в градиенте CsCl и тем самым позволяет разделить не реплицировавшуюся ДНК от ДНК, реплицировавшейся за время мечения^ I или 2 раза. ДНК выделяли по описанным выше методикам. Очищенные препараты центрифугировали в градиенте CsCl в вертикальном роторе Beckiaan VTi50.2 в течение 16 ч. Образовавшийся градиет фракционировали. Концентрацию ДНК в каждой фракции определяли с помощью спектрофотометра, а плотность раствора - с помощью рефрактометра. Затем расчитывали процентное содержание в анализируемом образце ДНК, реплицировавшейся за время мечения 2 раза ( две тяжелые цепи ДНК, heavy-heavy , НН-ДНК), ДНК, реплицировавшейся I раз (одна тяжелая цепь, другая - легкая, heavy-light , HL-ДНК) и ДНК, не реплицировавшейся вообще (две легкие цепи, lightlight ЪЬ-ДНК)/ Von Hoff et al.,I988/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ

Электрофоретический анализ внДНК. При электрофорезе в геле агарозы ДНК плазмы крови и ДНК, выходящая из Лфц человека, клеток нь 60 и клеток ь 929. регистрируется в виде гетерогенного набора фрагментов с размерами от 0,4 до 20 Т.п.н. Для того, чтобы выяснить, не является ли выявляемый набор фрагментов внДНК промежуточным этапом ее деградаций во внеклеточной среде, мы сопоставили электрофореграымы препаратов внДНК клеток щ, 60 после различных сроков инкубации полученных от этих клеток кондиционированных сред. Оказалось, что ДНК, вышедшая из клеток во внеклеточную среду, практически не деградирует при ее инкубации при 37°С в течение 2,5 сут. Поскольку очищенные препараты ДНК в тех же условиях деградировали весьма эффективно, можно заключить, что стабильность внДНК определяется не отсутствием во внеклеточной среде ДНК-азной активности, а с тем, что внДНК защищена от действия нуклеаз.

Количество ДНК, выходящей из Лфц различных доноров значительно варьирует: в этой серии экспериментов у четырех доноров ее количество во внеклеточной среде достигало 50 - 100 нг на 2хЮ®кл, а у двух других внДНК вообще не регистрировалась. Принимая во внимание то обстоятельство, что УФО в малых дозах является для клеток поверхностно активным агентом индуцирующим шедцинг надмембранных компонентов и активацию лимфоцитов /Самойлова, 1979/, мы исследовали влияние этого фактора на освобождение внДНК. Выяснилось, что УФО суспензии Лфц приводит к увеличению количества внДНК только у тех доноров, у которых в норме внДНК не выявляется. В то же время после УФО б образцов крови в стандартной терапевтической дозе увеличение количества ДНК в плазме наблюдалось во всех случаях. Поскольку УФО в дозах, которые мы применяли, не приводит к повреждению Лфц /Оболенская и др., 1986/, можно предположить, что увеличение количества внДНК не связано с гибелью клеток. Обсуждая

значение феномена увеличения количества ДНК в плазме УФ облученной крови, следует принять во внимание, что молекулы ДНК являются полианионами и, возможно, подобно ряду других полиэлектролитов /Петров, Хаитов, 1978/, оказывают стимулирующее влияние на иммунув систему организма. В этом случае он может оказаться одним из факторов определяющих лечебный эффект от применения метода АУФОК в медицинской практике.

Идентификация в препаратах внДНК кольцевых молекул. ДНК, вышедшая из Лфц, инкубированных в растворе Хенкса в течение 30 мин при 37°С, была проанализирована методом электронной микроскопии. Выяснилось, что она содержит кольцевые молекулы, контурная длина которых варьирует от 0,1 до 2,8 мкм. Чаще всего встречаются молекулы размерами около 0,6 мкм. При анализе того же препарата ДНК методом задержки кольцевых молекул при полимеризации в геле легкоплавкой агарозы, оказалось, что она полностью задерживается и не выходит из геля в электрическом поле /рис.2/.

Таким образом, два независимых метода показали, что внДНК содержит кольцевые молекулы. Подобное свойство является характерной чертой эДНК клеток. Основным компонентом препарата кольцевых эДНК является ДНК митохондрий. Для того, чтобы выяснить, присутствует ли митохондриальная ДНК в препаратах внДНК были проведены эксперименты с блот гибридизацией внДНК мышиных фибробластов постоянной линии

Рис.2. Электрофорез препаратов внДНК Лфц крови человека до (I) и после (2) полимеризации в геле легкоплавкой агарозы.

Цифры слева - размеры маркерных фрагментов ДНК, т.п.н.

I 2

23 -

9.4 -

6.5 -

4,3 ~

2,3 _ 2,0 ~

L 929 с клонированным фрагментом митохондриальной ДНК мыши. Хорошо выявляемая в тотальной клеточной ДЙК, мито-хондриальная ДНК практически не обнаруживается в препарате внДНК. Это позволило сделать вывод о том, что внДНК имеет ядерное происхождение.

Гибридизационный анализ внДНК Лфц и ДНК плазмы крови. В процессе дифференцировки у части В-Лфц происходит деле-ция из хромосомы ig-гена 3? /Klobeck, Zaohau, 1986 /. Эксцизия происходит строго по определенным регионам хромосомы и приводит к образованию дискретных по размерам молекул эДНК,»содержащих ig-ген э?. В настоящей работе была сделана попытка выявления подобных молекул в препара^р'х внДНК 'Лфц методом блот гибридизации. При анализе не обработанных рестриктазами препаратов, было установлено, что ДНК плазмы крови и ДНК, вышедшая из Лфц при их инкубации в растворе Хенкса в течение 30 мин при 37°С, содержит дискретные по размеру фрагменты, гомологичные ig-гену J? /рис.3, I зг/. Это кольцевые ДНК и поэтому положение после электрофореза не отражает их настоящих размеров. Такие молекулы не идентифицируются в препаратах тотальной ДНК Лфц и продуктов ее частичного гидролиза /рис.3, I ад/. По-видимому, они имеют большие размеры и поэтому не выделяются из препарата тотальной клеточной ДНК по методу Хирта /рис.3, б/.

Для решения вопроса о том, находится ли ig-ген 3? в данном препарате ДНК в исходном или перестроенном состоянии, обычно проводят гидролиз ДНК рестриктазой Bglll и 5лот гибридизацию с пробой С фрагмента этого гена /Schei-bani et al.,I987 /. Появление после гибридизации зон, от-зутствующих в гаметной ДНК, свидетельствует о том, что ig--ен а? находится в перестроенном состоянии. Используя данный прием,мы показали, что в препарате внДНК Лфц гомологичные С участку ig-гена фрагменты отличаются по размерам >т выявляемых в тотальной клеточной ДНК, где идентифицируется не перестроенный ген /рис.3, П ав/. Это свидетель-iTByeT о том, что внДНК Лфц содержит молекулы с

а б в г д

9,4 -6,5-| 4,3 -

1

П

а б в г д

23

9.4

6.5 4,3

2,3 2,0

Ш

а б в г д

23 -

9.4 -

6.5 ~ 4*3 -

2,3 2,0 =

2,3 -

2,0

Рис.3. Блот гибридизация не рестрицированных (I) и гидро-лизованных рестриктазами Ве111 Ш) и ЕсоВ1 (Ш) препаратов ДНК с меченным ^Р фрагментом ( ЕсоВ1-ЕсоЫ, 2,5 т.п.н.), содержащим С регион Ig-гена

а - тотальная ДНК Лфц (5 мкг). б - фракция Хирта тотальной ДНК Лфц (5 мкг). в - внДНК Лфц (0,3 мкг). г - ДНК плазмы крови (5 мкг). д - тотальная ДНК.Лфц, частично гидролизованная

клеточными эндонуклеазами (5 мкг). Цифры слева - размеры маркерных фрагментов ДНК, т.п.н.

перестроенным -геном дв . То же самое обнаружено и при анализе ДНК плазмы крови /рис.3, П г/.

После обработки тотальной ДНК Лфц и препаратов внДНК рестриктазой бсой1 и гибридизации с пробой 1е~гена (есоЩ-гЕсоЕГ » 2,5 т.п.н.) выявляются молекулы размером 2,5 т.п.н., что соответствует рестриктной карте, представленной на рис.1. При аналогичной обработке препаратов ДНК плазмы крови наряду с такими же молекулами, обнаруживаются

Рис.4. Блот гибридизация гидролизованного 8вЪ1 препарата ДНК плазмы крови с меченным ^Р фрагментом (8в-М-БеМ » 0,5 т.п.н.), содержащим С регион 1в-ге-на а? /а/ и с фрагментом (БвИ-ЕсоЩ: , 1,8 т.п.н.) расположенным с 3' конца от экзона С /б/. Цифры слева - размеры маркерных фрагментов ДНК, т.п.н.

и фрагменты величиной 4,6 и 6,5 т.п.н. Это дало основание предположить, что некоторые находящиеся в плазме крови молекулы ДНК, гомологичные з^-гену а?, претерпели рекомбинацию, точка которой расположена внутри участка гена, использовавшегося в качестве зонда. Для более точной кар-тировки района рекомбинации в следующем эксперименте в качестве проб использовали отдельные фрагменты зонда (Еоой1-ВсоН1 ). При этом ДНК плазмы крови гидролизовали рестриктазой Бв-н и анализировали методом блот гибридизации с пробой БвИ-ЗвИ , 0,5 т.п.н., содержащей С регион з^-гена гр/рис.4, а/. После гибридизации, в соответствии с рестриктной картой гена /рис.1/, выявлялись фрагменты ДНК величиной 0,5 т.п.н. Таким образом, ВвИ-Вв-Ы-регион, включающий экзон, не содержит сайта рекомбинации. При гибридизации того же препарата ДНК с пробой Зв-Ы-ЕсоЫ: , 1,8 т.п.н., содержащей последовательность расположенную с 3' конца от С участка гена, выявляются две зоны , свидетельствующие о том, чтс часть гомологичных -гену Я?.молекул в препарате ДНК плазмы крови претерпело рекомбинацию, сайт которой расположен с 3' конца от последнего экзона гена /рис.4, б/. Нуклеотидная последовательность данного региона неизвестна. Возможно, он содержит участки, по которым происходит сайт-специфическая рекомбинация,

а б

5 -

4.3 -

3.5 -

2,0 -

1.6 -

1.4 -

0,8 ~ 0,5 ~

приводящая к двлеции 16-гена а? . Ответить на этот вопрос можно только после секвенирования данного участка.

Выявленные в настоящей работе дискретные по размерам фрагменты ДНК, гомологичные 1в-гену дв, сходны с образующимися в процессе дифференцировки В-Лфц продуктами деле-ции этого гена. Молекулы такого рода обнаружены в Лфц после сложной процедуры выделения, клонирования и анализа клонотеки et а1., 1990 /. Они не выявляются при

анализе тотальной ДНК клеток методом блот гибридизации. Мы также не обнаружили этих молекул при анализе тотальной ДНК Лфц. Их выявление в препаратах внДНК, по-видимому, свидетельствует о том, что они значительно обога^рны такими молекулами по сравнению с тотальной ДНК клеток.

Гибридизационный анализ внДНК различных субпопуляций Лфц. Чтобы определить, какой именно тип клеток является источником обнаруженных во внДНК Лфц дискретных по размерам молекул, гомологичных 1ц-гену д?, в следующей серии

I П

абвгде абвгде

22 - ~ »

Рис.5. Блот гибридизация препаратов ДНК В-Лфц, стимулиро-ванныхрш , с пробой ( ЕсоШ:-ЕсоЕ1 , 2,5 т.п.н.), содержащей С регион 1в -гена 3?/I/ и с пробой гена актина миокарда человека /П/..

а - внДНК В-Лфц (10 мкг); б,в - то же, после гидролиза рестриктаэами ЕсоВ1и Ве1И , соответственно; г -тотальная ДНК В-Лфц (10 мкг); д,е - то же, после гидролиза рестриктаэами всоЕ1 иBgl.Il , соответственно. Цифры слева - размеры маркерных фрагментов ДНК, т.п.н

экспериментов были выделены и отдельно проанализированы субпопуляции культивируемых Т- и В-Лфц. Были исследованы: несгимулированные Т-Лфц; Т-Лфц, стимулированные ФГА; Т-Лфц, стимулированные PWM; нестимулированные В-Лфц; В-Лфц, стимулированные FVM . Препараты тотальной клеточной ДНК и ДНК, вышедшей из клеток в среду культивирования, были проанализированы с помощью блот гибридизации с пробой С региона ig-гена % и пробой актина миокарда человека. Отсутствие загрязнения исследуемых препаратов плазмидными ДНК контролировали с помощью гибридизации с плазмидой pBR 322. Препараты внДНК культивируемых Лфц не содержат нуклеотид-ных последовательностей, гомологичных гену актина миокарда /рис.5, Ц/. Дискретные по размерам фрагменты ДНК, гомологичные Ig -гену выявляются только во внеклеточной среде В-Лфц, стимулированных к дифференцировке обработкой FVM /рис.5, I а/. Именно в дифференцирующихся В-Лфц наблюдаются перестройки ig-генов, которые сопровождаются появлением эДНК / Toda et al., 1989/. Таким образом, полученный результат находится в соответствии с предположением о том, что источником обнаруженных во внДНК дискретных по размерам молекул, гомологичных lg-гену ¿f7, являются эДНК, представляющие собой делетируемые продукты перестроек Ig-генов.

Идентификация амплифицированных молекул в препаратах внДНК. Для выявления амплифицированных молекул клетки культивировали в присутствие БДУ в течение одного клеточного цикла /клетки нЪ 60/ или в течение времени, не превышаю-цего его минимальную продолжительность /Лфц человека/., В этих условиях только амплифицированная ДНК успевает сделать два раунда репликации и может быть обнаружена в виде ffl-ДНК.

Лфц крови человека в течение 16 ч культивировали в при-;утствии БДУ, и затем в течение 5 ч в среде без предшественника /рис.6/. НН-ДНК не выявлялась при исследовании тотальной клеточной ДНК. Это находится в соответствии с имеющимися представлениями о том, что Лфц периферической крови-

100

П Рис,6. Содержание НН-, НЬ-1 иьь -молекул в препаратах тотальной (О), экстраэфо-мосомной (0) и внеклеточ-

I

50

нн нь ьь нн нь ьь

и мШ Иг

Уж ной (■) ДНК Лфц сразу

после мечения (I) и через Як 5 ч после его окончания ■Ш СП), % от суммарного коли-■гт чества ДНК в образце.

это в подавляющем большинстве покоящиеся, не делящиеся клетки. В то же время сразу после мечения НН-ДНК была обнаружена в препарате малых эДНК Лфц (фракция Хирта). Пик НН-ДНК полностью исчезал при культивировании этих клеток в течение 5 ч в среде без предшественника. В это время НН-ДНК появляется в среде культивирования и составляет около 14% всей внДНК.

В случае клеток нь 60, культивировавшихся в присутствии ЕДУ в течение 48 ч, процентное содержание ДНК, реплицировавшейся за время мечения 2 раза (НН-ДНК), было выше во внДНК, чем в препарате тотальной ДНК клеток /рис.7/. В паралельной серии экспериментов пролиферацию клеток останавливали после первого клеточного цикла добавлением в среду колхицина. В этом случае НН-ДНК не выявлялась в препарате тотальной клеточной ДНК, но составляла 4% препарата внДНК. Таким образом, обнаруженная в тотальной ДНК клеток, культивируемых без колхицина, НН-ДНК, по-видимому, представляет собой ДНК той небольшой части клеток, которые за время мечения успели сделать два цикла. НН-ДНК во внеклеточной среде, вероятно, представляет собой амплифициро-ванную ДНК, поскольку она выявляется и в том случае, когда клетки культивировали в присутствии колхицина.

Исследования частоты амплификации различных участков генома позволили сделать вывод о том, что чем раньше в 8-фазе реплицируется данный регион хромосомы, тем больше

Рис.7. Содержание НН-, нь-и ы, -молекул в препаратах тотальной (□) и внеклеточной (■) ДНК клеток при их культивировании без колхицина (I) и с колхицином (П), % от суммарного количества ДНК в образце.

зероятность его повторной репликации. Таким образом, ампли-¡зицированная ДНК должна отличаться от тотальной ДНК клеток рем, что она вообще не содержит или содержит очень мало ^клеотидных последовательностей, реплицирующихся в поздней 3-фазе. Одной из последовательностей такого типа является цэицентромерный о(-сателлит человека. В связи с этим при ],от-блот гибридизации препаратов НН-, НЬ-иЬЬ-ДНК была юпользована проба некриптического, прицентромерного о(-са-геллита хромосомы № II человека. Было установлено, что НН-Щ, вышедшая из Лфц во внеклеточную среду, практически ie содержит последовательностей гомологичных зонду. НН-ДНК з среде культивирования клеток HL 60, по данным денситомет-зии, содержит в 8 раз меньше последовательностей с<-сателли^ га. чем тотальная ДНК клеток. Эти данные свидетельствуют о ?ом, что НН-ДНК во внеклеточной среде действительно пред-:тавлена амплифицированными последовательностями.

Таким образом, в настоящей работе удалось показать, ito препараты ДНК, выделенные из среды культивирования Лфц срови человека и клеток постоянной линии EL 60 , обладают зядом свойств характерных для эДНК клеток. В частности, >ни содержат кольцевые, гетерогенные по размеру молекулы. 1 них обнаружены молекулы ДНК, которые образуются в клетках 1утем делеции фрагментов хромосом. Они содержат амплифици-юваннке молекулы. 'Все это позволило нам сделать заключение ) том, Лфц донорской крови и клетки промиелоцитической лей-

кемии человека нь 60 освобождают во внеклеточную среду молекулы ДНК, появление которых в клетках связано с образованием эДНК.

ВЫВОДЫ

1. Внеклеточные ДНК лимфоцитов крови человека, клеток постоянных линий нь 60 и ъ 929 , а также ДНК плазмы крови доноров.представляют собой гетерогенный набор фрагментов

с размерами от 0,4 до 20 т.п.н. Они защищены от разрушенад внеклеточными эндонуклеазами и не деградируют в среде культивирования клеток в течение 2,5 сут при 37°С.

2. Количество ДНК, освобождающейся из лимфоцитов крови различных доноров, значительно варьирует; оно возрастает при УФ облучении лимфоцитов или цельной крови в не повреждающих клетки дозах, применяемых с лечебной целью при аутотрансфузиях УФ облученной крови.

3. Внеклеточная ДНК лимфоцитов представлена кольцевыми, гетерогенными по размеру молекулами, однако, митохон-дриальная ДНК в препаратах ДНК, выходящей из клеток, не обнаруживается.

4. ДНК плазмы донорской крови и внеклеточная ДНК лимфоцитов содержат дискретные по размерам молекулы, гомологичные делетируемому с участием процессов эксцизионной рекомбинации 1£-гену 3?. Их источником являются стимулированные к дифференцировке обработкой митогеном лаконоса В-лимфоциты.

5. В препаратах внеклеточных ДНК лимфоцитов и клеток промиелоцитической лейкемии человека нь 60 присутствуют амплифицированные молекулы, которые не выявляются при анализе тотальной клеточной ДНК и обнаруживаются во фракции малых экстрахромосомных ДНК (фракция Хирта).

6. Совокупность полученных данных свидетельствует о сходстве между^ внеклеточными и экстрахромосомными ДНК клеток и позволяет заключить, что лимфоциты крови человека и

клетки постоянной линии HL 60 освобождают экстразфомосом-ные молекулы ДНК во внеклеточную среду.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васюхин В.И. Экскреция ДНК лимфоцитами человека // Материалы научн. конф. молодых ученых Ин-та цитологии АН СССР, Ленинград, 31 марта - 2 апреля, 1987.- Деп. в ВИНИТИ 05.05.88.- С.9.

2. Самойлова К.А., Оболенская К.Д., Фрейдлин И.С., Га-мова И.М., Волгарева Е.В., Нисман Б.Х., Руновская И.В., Мухурадзе Н.А., Васюхин В.И. Изменение поверхности и активация циркулирующих лейкоцитов при аутотрансфузиях УФ-об-лученной крови // Вестник хирургии.- 1990.- Т.144.- №6.-С.99-105.

3. Васюхин В.И., Липская Л.А., Цветков А.Г., Подгорная О.И. ДНК, выходящая из лимфоцитов человека, содержит последовательности гомологичные иммуноглобулиновому гену зе // Молекулярная биология.- 1991.- Т.25.- №2.- С.405-412. '

4. Podgornaya O.I., Lipskaya L.A., Vasyukhin V.I. Hybridization analysis of DNA released by human lymphocytes // In. Ilth Nuclear workshop.- Suzdal.- 1939.- P.146.

5. Vasyukhin V.I., Lipskaya L.A., Tsvetkov A.G., Pod-gornaya O.I. The extracellular lymphocyte and blood plasma DNAs contain the discrete size molecules homologous to the C^ fragment of the Ig gene // In. Nuclear Structure and Function.- Ed. J.E.Harris and I.B.Zbarsky.- Plenum Press.- New York.- 1990.- P.57-40.

6. Vasyukhin V I., Lipskaia L.A., Anker P., Maurice P.A., Lyautey J., Lederrey C., & Stroun Ы. DNA amplification ав the origin of released DNA by cells // I5th International congress of biochemistry.- Israel.- 1991.- P.136.

S