Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Скрининг гемолитической и иммуносупрессорной активности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Скрининг гемолитической и иммуносупрессорной активности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда"

На правах рукописи

Мансурова Галина Валерьевна 0030542"7 1

Скрининг гемолитической и иммуносупрессорной активности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2007

003054271

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, доцент Кягова А.А.

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Официальные опщщенты:

Доктор биологических наук, профессор Осипов А.Н. Доктор биологических наук, в.н.с. Мурина М.А.

Ведущее учреждШйе: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится*« -«2007 г. в час.

На заседании диссертационного Совета К 208.072.05 в Российском государственном медицинском университете, по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук, доцент

И.В.Буромский.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Фотодинамическая терапия (ФДТ) является бурно развивающимся методом лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанным на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС). Один из главных путей совершенствования ФДТ - создание новых более эффективных ФС, как правило, путем модификации порфи-ринов - ФС, применяемых в ФДТ [Dougherty, 2002; Hopper, 2000]. Т.к. таких ФС создается очень много, то н еобходим скрининг их биологической эффективности. Одна из самых простых и хорошо изученных моделей для скрининга - фотогемолиз эритроцитов человека. Поэтому, определение гемолитической эффективности и выявление связи "структура ФС-биологическая активность" новых ФС для ФДТ является актуальной задачей.

Известно, что ФДТ с такими ФС, как порфирины, часто сопровождается угнетением Т-клеточного звена иммунитета [Simkin et al., 2000, Musser and Oseroff, 2001; Nowis et al., 2005]. ФДТ-индуцированная иммуносупрессия может быть основным механизмом терапевтических эффектов при неонкологических, например, кожных и аутоиммунных заболеваниях [Kurwa and Barlow, 1999]. Фотохимический механизм иммуносупрессии при ФДТ не известен. Одним из ФС, используемых в ФДТ, является протопорфирин IX (111 ИХ) [Sternberget al., 1998]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ПГПХ с образованием его стабильных фотопродуктов [Сох and Written, 1982; Wessels et al., 1993], которые можно обнаружить как в растворах, так и в клетках [Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. В литературе нет данных о том, могут ли стабильные фотопродукты 111 ИХ вносить вклад в супрессорное действие ФДТ. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов ПГОХ на Т-клеточный иммунный ответ in vivo также является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнить гемолитическую и иммуносупрессорную активность производных дейтеро-порфирина IX (ДП), протопорфирина IX (ПГПХ) и его фотопродуктов и порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить темновые и фотогемолитические эффекты производных ДП и определить прочность связывания данных соединений с мембраной эритроцита.

2. Оценить темновые и фотогемолитические эффекты ПГПХ и его фотопродуктов, а также порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

3. Изучить влияние фотопродуктов ПГПХ на Т-клеточный иммунный ответ ш vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе проведено исследование темновой и фотогемолитической эффективности 2- или 4-монозамещенных и 2,4-дизамещенных производных ДП. Показано, что все исследованные производные ДП обладают темновым гемолитическим действием. Фотогемолитическая активность зависит от структуры производных. Разработана методика оценки прочности связывания ФС с мембранами эритроцитов, основанная на сравнении скоростей фотосенсибилизированного гемолиза в отмытых и не отмытых от ФС суспензиях эритроцитов.

Показано, что фотопродукты ПГПХ обладают фотогемолитическим действием. Фотогемолитические эффективности фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПП2) превышают фотогемолитическую эффективность ПГПХ. Удаление из молекулы ФПП1 ОН-группы приводит к снижению темновой и увеличению фотогемолитической эффективности. Определены фотогемолитические эффективности диметилового эфира 0,0-диэтил-(Ы-третбутил)-фосфонометил фотопротопорфирина IX (АФ1) и диметилового эфира 3-[0,0-диэтил-(Ы-третбутил)-фосфонометил]-8-винилдейтеропорфирина IX (АФ2). АФ1, содержащий ОН-группу в первом положении, в отличие от АФ2, обладает выраженным детергентоподобным темновым гемолитическим действием.

Впервые показано, что предоблученный ПП1Х способен супрессировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Глубина супрессии определялась дозой облучения ПП1Х .Впервые обнаружено, что супрессорный эффект предоблученного ПГПХ обусловлен действием его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 в количестве 2,5 нг/кг веса животных. В основе супрессорного действия фотопродуктов ПШХ на КЧ лежит угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным потенциалом.

Практическая значимость. Работа является фундаментальным исследованием, направленным на усовершенствование ФДТ. Отдельные ее положе-

ния имеют прямое практическое приложение. Обнаруженная в работе иммуно-супрессорная активность фотопродуктов 111 ИХ создает предпосылки для поиска новых лекарственных форм для терапии неонкологических заболеваниях, для которых характерна гиперреактивность иммунной системы.

Внедрение в практику. Данные, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики РГМУ, а также кафедры фармакологии РГМУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Фотогемолитическая активность производных ДП и ПП1Х зависит от структуры, числа и положения боковых заместителей.

2. Регистрация скорости фотосенсибилизированного гемолиза позволяет оценить прочность связывания ФС с мембраной эритроцита.

3. Фотопродукты ПШХ обладают неспецифическим супрессорным действием на Т-клеточный иммунный ответ in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 12th International Congress on Photobiology, Austria (September 1-6, 1996), на Deutsche Gesellschaft für Biophysik. Jahrestagung, Leipzig (18-21 September 1996), на 9fh Congress of the European Society for Photobiology, Norway (3-8 September 2001), на III Съезде фотобиологов России, Воронеж (28 июня-4 июля 2001), на 10th Congress of the European Society for Photobiology, Austria (September 6-11, 2003), на III съезде биофизиков России, Воронеж (24-29 июня 2004 г), на III съезде иммунологов России, Екатеринбург (24-29 июня 2004 г). lst Inter-natiional Conference Skin & Environment. Moscow-St. Petersburg, Russia. (1-6 June 2005), объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры медицинской и биологической физики педиатрического факультета, кафедры биофизики факультета МБФ и ПНШ1 Биофизика РГМУ (24 октября 2006г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных

работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 24 рисунка, 5 схем, 4 таблицы. Состоит из разделов "Введение", "Обзор литературы", " Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", выводы. Список литературы включает 164 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовались коммерческие препараты димети-ловый эфир ПППХ («Sigma», США), полиэтилен гликоль (ПЭГ)-400 («Sigma», США), динитрохлорметан («Sigma», США), гаптены 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ) и оксазолон («Sigma», США). Производные ДП: 2,4-тетраоксо-ДП (ДП1), 2,4-дигидрокси-ДП (ДП2); 4-диоксо-ДП (ДПЗ), 4-оксо-ДП (ДП4), 4-гидрокси-ДП (ДП5), 2-диоксо-ДП (ДП6), ФПП1 и ФПП2 синтезированы в лаборатории проф. Пономарева Г.В. (ИБМХ РАМН). АФ1 и АФ2 синтезированы Зобниной Е.В. в лаборатории проф. И.П. Белецкой (МГУ им. Ломоносова, Москва).

Методы исследования. Спектрофотометрия, турбидиметрическая регистрация гемолиза, фотохимические методы, тонкослойная хроматография, реакция КЧ к гаптенам у мышей, методы адоптивного переноса реакции КЧ и ее супрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов производных ДП

Фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов является удобной и хорошо изученной моделью для изучения фотоповреждения биологических мембран. В настоящем разделе сопоставлена темновая и фотогемолитическая активность производных ДП, считающихся перспективными для применения в ФДТ опухолей [Иванов и др., 1998]. Эксперимент проводили по схеме: суспензию эритроцитов с производным ДП инкубировали в темноте в течение 30 минут, после чего облучали УФ-А светом. Далее пробы инкубировали в темноте и регистрировали гемолиз.

Чаще всего, гемолиз, вызываемый ФС, развивается по коллоидно-осмотическому механизму и зависимость скорости гемолиза V от дозы облучения D может быть описана уравнением вида: V=Vg+aDb, где Уд - скорость тем-нового гемолиза, D - доза облучения, а - коэффициент, характеризующий фотогемолитическую эффективность красителя, Ь - показатель степени при дозе облучения. Величина а зависит от концентрации ФС, его поглощения при данной длине волны, квантового выхода фотохимической реакции и связывания с мембраной эритроцита вблизи критической мишени. Показатель степени при

дозе облучения дает информацию о числе квантов света, необходимых для одного акта повреждения мембраны. Считают, что если b равен 2, то катионный канал образуется вследствие независимого повреждения двух субъединиц белка полосы 3 [Pooler, 1985; Grossweiner, 1999].

На рис. 1 приведены кривая гемолиза (А) и дозовая зависимость скорости гемолиза (Б), сенсибилизированного производным ДП5. Видно, что лизису подвергались все клетки суспензии, т.е. гемолиз был завершенным. Из кривых гемолиза рассчитывалась скорость гемолиза V=l/ tsg, где fjp - время, за которое лизируют 50% клеток в суспензии. Аналогичные по форме кривые и дозовые зависимости скорости фотогемолиза получены с другими ДП.

А Б

Рис. 1. Типичная кривая фотогемолиза при дозе облучения 6,24 кДж/м2 (А) и дозовая зависимости скорости фотогемолиза (Б), сенсибилизированного ДП5.

Интенсивность УФА-излучения 26 Вт/м2, длина волны 365 нм. Концентрация фотосенсибилизатора в суспензии эритроцитов 10"5 М. Концентрация эритроцитов в суспензии 107кл/мл. Температура инкубации 37 °С.

Все исследованные производные ДП характеризовались практически одинаковыми значениями Ь~2, но величины У0 и а у них были различны (табл. 1). Величины а и Ь рассчитывались методом наименьших квадратов из спрямленных в двойных логарифмических координатах дозовых зависимостей. Концентрация производных ДП была одинаковой (10"5 М), но значения (1-Т) при 365 нм отличались. Поэтому мы ввели нормированный к поглощению коэффициент ат=а/(1-Т)365 (табл. 1). Он зависел только от физико-химических свойств ФС и его способности связываться с мембраной.

Все использованные производные ДП увеличивали скорость темнового гемолиза. Из таблицы 1 видно, что для разных производных ДП величина У0

была в 1,6 - 7,3 раза выше скорости спонтанного гемолиза эритроцитов (контроль без ФС).

Таблица 1. Сравнительные характеристики производных ДП. _

Производное ДП* Показатель степени при дозе облучения, Ь Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-Г)зб5 ат,10"3, м4/(кДж2ч) Скорость темнового гемолиза, ^ЮЛч1

ОуСН3 О^'-уСН, гн^Нз ДП1 \ 1 / Л»о св3 2,1±0,10 0,0049±0,00092 0,95±0,11

ону-СН3 Ч^СНз СН, ДП2 СН3 ОН 1,85±0,03 0,63±0,042 1,26±0,30

сн3 он 2,1±0,12 36,7±3,25 3,44±0,93

ДПЗ сн СН3 о 1,8±0,05 42,7±4,24 2,18±1,53

сн3 ° 1,9±0,05 140,2±8,66 2,77±0,69

ДПб СН3 Л^О 1,8±0,09 206,2±10,19 4,29±0,84

Контроль без ФС 0,59±0,03

*Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

Фотогемолитические эффекты ФС различаются гораздо сильнее, чем темновые. Более эффективными оказались 2- и 4-монозамещенные производные: ДП6, ДП4, ДПЗ и ДП5, причем предпочтительнее наличие заместителя во втором положении тетрапирольного кольца. Видно, что структура боковых заместителей влияет на фотогемолитическую активность. Производное ДП4 с ок-согруппой в боковом заместителе имеет большую фотогемолитическую эффек-

тивность по сравнению с производным ДП5, имеющим ОН-группу в том же положении и производным ДПЗ с двумя оксогруппами.

Показатель степени при дозе облучения у всех соединений равен 2 (табл.1), что указывает на то, что мишень для данных ФС была одна и та же. Ею может быть двухсубъединичная молекула белка полосы 3 в мембране эритроцита [Grossweiner, 1999; Pooler, 1985]. Поэтому различия гемолитических эф-фективностей ФС можно объяснить различиями в их структурах (табл.1), обеспечивающими способность связываться с мембраной как можно ближе к белку полосы 3.

Считается, что в повреждающем действии большинства порфирино-вых ФС преобладают реакции, в которых с биосубстратом взаимодействует синглетный кислород ('Ог). В работе [Ivanov et al., 2004] было показано, что диффузия кислорода в липидной фазе мембран затруднена. По нашим расчетам, учитывая данные этой работы, длина пробега 'Ог в мембране за 50 не [Красновский, 2001] составляет 0,4 нм, что на порядок меньше толщины мембраны и даже меньше размеров молекулы порфирина. Поэтому близость расположения ФС к критической мишени чрезвычайно важна для повреждения мембраны. Можно предположить, что различия в структуре исследуемых производных ДП приводят к тому, что они оказываются локализованными на разных расстояниях от критической мишени.

2. Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека

Одним из факторов, влияющих на гемолитическую эффективность ФС, может быть прочность связывания ФС с мембраной эритроцита. Поэтому мы оценили прочность связывания с эритроцитами вблизи критической для гемолиза мишени производных ДП2 и ДП5, отличающиеся количеством боковых заместителей с ОН-группой и величинами я г (табл. 1).

Для этого суспензию эритроцитов с добавленным ФС инкубировали в темноте, затем разделяли на равные объемы и центрифугировали. После этого один образец ресуспензировали в той же надосадочной жидкости, а в другом заменяли супернатант на фосфатный буферный раствор (ФБР). Затем образцы облучали при одинаковых условиях, инкубировали в темноте и регистрировали гемолиз.

На рис. 2, А представлены скорости фотогемолиза, сенсибилизированного ДП5, в отмытом (столбец 2) и не отмытом (заштрихованный столбец 1) образцах. Видно, что отмывание эритроцитов от красителя приводит к возрастанию скорости фотогемолиза, что указывает на сильный экранирующий эффект свободного ФС. Если уменьшить толщину облучаемого образца {рис. 2, В) и тем самым - экранирующий эффект, то после отмывания эритроцитов происходит уменьшение скорости фотогемолиза, что свидетельствует о том, что часть ФС удаляется из мембраны.

Если экранирующий эффект учесть расчетным путем (не заштрихованные столбцы I, рис. 2), то разность в скоростях гемолиза в не отмытом и отмытом образцах становиться еще больше.

Рис. 2, Влияние отмывания эритроцитов от ДП5 на скорость фотогемолшл.

1 - центрифугирование, ресуспензирование, облучение (заштрихованный столбец);

2 - центрифугирование, замена сунернатанта на ФБР, облучение;

3 - центрифугирование, рссусп газирование;

4 - центрифугирование. замена супернагганта на ФКР,

i I I - скорость гемолиза, исправленная с учетом эффекта экранировки. Доза облучения при 365 нм 6,24 кДж/м2. Концентрация фотосенсибилизатора в суспензии эритроцитов 10"5 М Концентрация эритроцитов в суспензии 107кл/мл. Температура суспензии клеток при инкубации 37 °С. а - толщина слоя I см; б - толщина слоя 0,1 см.

При расчете доли ФС, прочно связанного с мембраной эритроцита, были использованы выражение для интенсивности света, поглощенного связанным красителем в присутствии экранирующей примеси [Владимиров, Потапенко, 2006],квадратичные зависимости скорости гемолиза от дозы облучения и концентрации ФС [Pooler, 1985; Gross we iner, 1999]. Коэффициент прочности связывания /?(т.е. доля ФС, прочно связанного с мембраной) рассчитывался по

c2_ l(l-T0J

формуле:

С, ]2 МбЛК

, где С; - количество ФС, первоначаль-

но связавшегося с мембраной; С? - количество ФС, оставшегося после отмывания; Т0бщиА0бщ - пропускание и оптическая плотность ФС до отмывки; VomM и Уэкр - скорости гемолиза в отмытом и не отмытом образцах, соответственно.

Коэффициент ß для ДП5 равен 0,86, для ДП2 - 0,61. Коэффициенты распределения красителей ДП5 и ДП2, измеренные в системе октанол/вода, составили соответственно 20,7 и 17,0 (определены Решетниковым A.B., ИБМХ РАМН). Значения коэффициента прочности связывания коррелируют со значениями коэффициента распределения октанол/буфер, но не позволяют объяснить различия фотогемолитических эффективностей.

3. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов ПП1Х и его фотопродуктов на эритроциты

Одним из ФС, используемых в ФДТ является ГППХ [Sternberg et al., 1998]. При воздействии света на ПГПХ происходит фотолиз с образованием фотопродуктов, в основном изомеров ФПП1 и ФПП2 [Сох and Written, 1982; Wessels et al., 1993]. Эти продукты фотолиза образуются и в тканях при проведении ФДТ [Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. Известно, что ПП1Х обладает гемолитическим эффектом, как в темноте, так и при фотодинамическом воздействии [Lagerberg et al., 1996]. Однако гемолитическое действие фотопродуктов ПГПХ не изучено. В этой связи нами были исследованы темновые и фототоксические эффекты ФПП1 и ФПП2 на мембраны эритроцитов, которые мы сравнили с таковыми ПП1Х.

Общие закономерности фотогемолиза, сенсибилизированного ПП1Х и его производными оказались такими же, как для исследованных производных ДП. Кривые фотогемолиза имели сигмоидную форму, а дозовые зависимости скорости фотогемолиза были квадратичными. Значительно различались только величины нормированной к поглощению при 365 нм фотогемолитической эффективности ат (см. табл. 2).

В таблице 2 можно увидеть, что скорость темнового гемолиза в присутствии iiiliX и ФПП2 увеличивается по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов (контроль без ФС) лишь на 25 %. Темновой эффект

ФПП1 оказался значительнее: увеличение скорости У0 по сравнению с контролем составляет 200 %. Однако, наибольшим фотогемолитическим эффектом обладает не ФПП1, а ФПП2: его гемолитическая эффективность ат в 9 и 1,8 раз больше, чем ат для ПШХ и ФПП1, соответственно.

Для оценки влияния ОН-группы был поставлен гемолиз в присутствии альдегида. Этот ФС не имеет гидроксильной группы, а имеет только один заместитель - альдегидную группу во втором положении, как и ФПП1.

Таблица 2. Сравнительные характеристики производных ПШХ, его фотопродуктов и альдегида. ___

ФС* Показатель степени при дозе облучения, Ь Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-Г)зб5 От,Ю"3, м4/кДж2ч Скорость темнового гемолиза, ^ÍOV

■Чч I л

1,90 ±0,027 11,9± 1,58 0,26±0,009

ПП1Х

"V" J 1,77 ±0,015 70,5 ± 9,74 0,63±0,048

ФПП1

-он 1.91 ±0,020 129,7 ±26,67 0,26±0,011

ФПП2

ЧуН

J 1,75 ±0,021 217,0± 31,9 0,23±0,010

Альдегид

Контроль без ФС 0,21±0,008

*Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

При сравнении темновых и фотогемолитических эффектов ФПП1 и альдегида, видно, что присутствие ОН-группы рядом с альдегидной (ФПП1) приводит к увеличению скорости темнового гемолиза на 200 %, а наличие только альдегидной группы увеличивает скорость темнового гемолиза лишь на 10 %. В

то же время на фотогемолитическую эффективность ОН-группа влияет противоположным образом: «г альдегида в 3 раза больше, чем агФПП1.

Для определения влияния заместителя во втором положении тетрапи-рольного кольца на темновой и фотогемолитический эффекты были исследованы порфирины, содержащие а-аминофосфонатную группу во втором положении - АФ1 и АФ2 (см. табл. 3). а-Аминофосфонаты были включены в тетра-пиррольное кольцо, т.к. это могло усилить фототоксические свойства порфири-нов. Однако биологическая активность этих соединений до настоящего времени не была исследована.

При выбранной концентрации (2 мкМ) кривые как темнового, так и фо-тосенсибилизированного АФ1 гемолиза, оказались отличными от таковых для всех остальных сенсибилизаторов. Эти кривые приведены на рис. 3. Их сложная форма указывает на осуществление нескольких процессов, приводящих к гемолизу. Мы можем выделить две компоненты: "быстрый" гемолиз (ранний компонент) и "медленный" гемолиз (поздний компонент), как показано на рисунке 3 для кривой 1.

Рис. 3. Кривые гемолиза, сенсибилизированного АФ1.

Дозы облучения, кДж/м2: 1-0; 2-26,1; 3-34,8; 4-52,2.

Концентрация суспензии эритроцитов 1,7 107 кл/мл. Конечная концентрация АФ1 2 мкМ. Температура суспензии клеток 22 °С.

Аналогичной двухкомпонентной формы получаются кривые гемолиза при добавлении к суспензии эритроцитов детергента Na-додецилсульфата (Na-ДЦС) [Chernitskii et. al., 1996; Rideal, Taylor, 1958]. Можно предположить, что АФ1 обладает детергентоподобным гемолитическим действием, характеризующимся наличием "быстрой" и "медленной" компонент.

Амплитуда "быстрого" гемолиза не зависела от дозы облучения: в этом процессе при любой дозе облучения участвовало около четверти всех эритро-

цитов суспензии (рис. 3, кривые 2-4). Облучение приводило к увеличению скорости обеих компонент. Фотогемолитические характеристики АФ1 мы определили для "быстрого" и "медленного" гемолиза отдельно (рис. 3).

Таблица 3. Сравнительные характеристики АФ1 и АФ2.

ФС* Показатель степени при дозе облучения, Ь Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-7)зб5 аъ Ю 3> м4/кДж2ч Скорость темнового гемолиза, У„1(Г2,ч1

Р(О)(ОЕ02 АФ1 "быстрый" гемолиз 2 ? | 497 | 49,3±2,73

2 ? "медленный" гемолиз 45,9 6,03±0,133

Р(0)(ОЕ.)1 АФ2 1,92±0,012 97,4±7,34 0,66±0,011

Контроль без ФС (с растворителем) 0,21±0,008

^Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

Большим темновым эффектом обладает АФ1: скорость "медленной" компоненты темнового гемолиза по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов возрастает на 2800 %, а "быстрой" компоненты - еще больше. АФ2 увеличивает скорость темнового гемолиза на 210 %. По-видимому, такое различие в темновых эффектах связано с наличием ОН-группы в первом положении тетрапиррольного кольца рядом с аминофосфо-натной группой у АФ1 (см. табл. 3). Фотогемолитические эффекты этих соединений по нашим оценкам (если принять величины Ь равными 2) различаются гораздо меньше. Более того, величина ат АФ1 ("медленная" компонента) в 2,2 раза меньше, чем таковая у АФ2.

Аналогичное влияние гидроксильной группы в первом положении тетрапиррольного кольца на темновое или фотогемолитическое действие ФС прослеживается при сравнении ФПП1 и альдегида. Видно (табл. 2), что усиление темнового эффекта наблюдается у ФПП1, содержащего гидроксильную группу, но при этом уменьшается его фотогемолитическое действие.

Сравнение АФ1 и ФПП1, а также АФ2 и альдегида, позволяет предположить, что наличие аминофосфонатной группы во втором положении тетра-пиррольного кольца приводит к значительному увеличению темнового действия ФС. Тогда как замена аминофосфонатной группы на альдегидную группу приводит к увеличению фотогемолитической эффективности производных ПП1Х.

4. Влияние фотопродуктов ПП1Х на реакцию контактной чувствительности (КЧР у мышей

Известно, что ФДТ часто сопровождается индукцией системной супрессии Т-клеточного звена иммунитета [Dougherty, 2002; Simkin et al., 1997]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ФС с образованием его стабильных фотопродуктов. Известно, что стабильные фотопродукты псоралена и мероциа-нина 540 могут окислять биологические мишени в ходе последующих темно-вых реакций [Potapenko, 1997; Потапенко и др., 2004], приводя к иммуносу-прессии. Могут ли фотопродукты 111 ИХ вносить вклад в супрессорное действие ФДТ остается не ясным. В этой связи была изучена способность продуктов фотолиза ПШХ влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo, оцениваемый по реакции КЧ у мышей.

4.1. Супрессорное действие предоблученного ПШХ и его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 на реакцию КЧ к ДНФБ

Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили как в работах [Kim T.Y. et al., 1990; Yee G,K. et al., 1990], с незначительными модификациями (схема 1). Мышей линии СВА (самцы весом 18-20 г, возраст 8-10 недель) сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3 % раствора ДНФБ в ацетоне. Через 144 часа после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2 % раствора в ацетоне). На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя (ацетона) в качестве контроля. Положительным контролем (К+) служили мыши, сенсибилизированные ДНФБ и получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. Отрицательным контролем (К") служили интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо. Через 24 часа оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека опытного (аппликация ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей.

Схема 1. Влияние предоблученного ПП1Х и его фотопродуктов

на реакцию КЧ к ДНФБ

+ в/в 0,5 мл сенсибилизация 5 мкл 0,2% ДНФБ

р-ра ПП1Х 50 мкл 0,3% ДНФБ накожно

V) накожно /

\( ГГ«^ 24 ч 144 ч f ' /о 24 ч ^ регистрация

h * ) отека уха

В экспериментальных группах (Е) мышам за 24 ч до сенсибилизации ДНФБ вводили в/в по 0,5 мл предоблученного раствора 1Ш1Х. В группах К+ и К" вместо растворов ПШХ мышам вводили 0,5 мл ФБР, содержащего 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле: % супрессии = [1 - (Е - К")/(К+- К")]-100%.

0.08

0.06

0.04

0.02

700

длина волны, нм

Рис. 4. Влияние предоблученного ПП1Х на КЧ к ДНФБ у мышей (А). Спектры поглощения ПП1Х в ходе его облучения (Б).

Раствор ПП1Х (10 мкМ в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола, облучали УФА-светом (28 Вт/м2,365 нм) при 22 °С в течении разного времени. А. Мышам вводили внутривенно по 0,5 мл облученного разными дозами раствора ПП1Х за 24 ч до сенсибилизации ДНФБ.

К+ (положительный контроль) и К" (отрицательный контроль) - сенсибилизированные и интакгные мыши, соответственно, получившие в/в 0,5 мл ФБР с 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Каждая точка на кривой - среднее для 10 мышей ± SEM. *р < 0,001 по сравнению с К+.

Б. Фотолиз ПП1Х оценивали путем регистрации спектров поглощения облученных растворов (цифры у кривых - доза облучения раствора, кДж/м2). Толщина кюветы при регистрации спектров поглощения 1 см.

На рис. 4 видно, что введение животным необлученного 111 ИХ не влияет на реакцию КЧ. Предоблученный же ГППХ вызывает зависимую от дозы облучения супрессию реакции КЧ. При дозе облучения 200 кДж/м2 супрессия составляет 61±13 %.

В ходе приготовления проб предоблученного ПГПХ для введения животным контролировали спектрофотометрически фотолиз раствора 111 ИХ (рис. 4, Б). На этом рисунке видно, что фотолиз раствора ПП1Х приводил к появлению длинноволнового максимума (680 нм) в спектре поглощения, что указывает на образование преимущественно двух видов фотопродуктов - ФПП1 и ФПП2 [Wessels et al., 1993; Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodos-siou and MacRobert, 2002].

Предоблученный раствор ПГПХ (200 кДж/м2, 10 мкМ) был проанализирован методом тонкослойной хромотографии (ТСХ) с использованием в качестве свидетелей аналитически чистых образцов ПГПХ, ФПП1 и ФПП2 (выполнено совместно с сотрудниками ИБМХ РАМН проф. Г.В. Пономаревым и к.х.н. В.И. Павловым). По данным ТСХ-анализа в образце предоблученного ПГПХ присутствовало три основных соединения (пятна на ТСХ-пластинке) - ПП1Х, ФПП1 и ФПП2 (данные не приводятся).

Анализ спектров поглощения предоблученного раствора ПП1Х (200 кДж/м2) показал, что суммарная концентрация ФПП1 и ФПП2 в этом образце составляет 0,51 мкМ.

На следующем этапе было изучено действие химически чистых фотопродуктов ППГХ - ФПП1 и ФПП2, полученных методом химического синтеза, как описано в работе [Pavlov et al., 2003]. Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно схеме 1. Мышам вводили в/в по 0,5 мл эквимоляр-ной смеси ФПП1 и ФПП2 (в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола) в различных концентрациях за 20 часов до сенсибилизации животных ДНФБ.

На рис. 5, А видно, что смесь ФПП1 и ФПП2 обладает супрессорным действием на КЧ. Величина супрессии определяется концентрацией фотопродуктов, и при концентрации 0,1 мкМ она составляла 65±13 %. Если сравнить данные рис. 4, А и 5, А, то видно, что степень супрессии КЧ, индуцированной при действии растворов предоблученного ПГПХ или смеси фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 была практически одинаковой, если данные растворы содержа-

ли близкую концентрацию смеси ФПП1 и ФПП2 (0,1 мкМ). Отсюда можно заключить, что супрессорный эффект предоблученного ПГПХ на КЧ обусловлен действием только фотопродуктов ФПП1 и ФПП2. Осталось не ясным, какой из данных фотопродуктов более эффективен как супрессорный агент. Для ответа на этот вопрос сравнили влияние каждого из индивидуальных растворов ФПП1, ФПП2 и эквимолярной смеси этих фотопродуктов, приготовленных в одинаковых концентрациях на реакцию КЧ.

0.20

0.15

£ 0.10 и

н

О 0.05

0.00

К" К+ ФПП1 ФПП1 ФПП2

+

ФПЮ

А Б

Рис. 5. Супрессорное действие на КЧ к ДНФБ ФПШ и ФПП2.

Мышам за 20 ч до сенсибилизации ДНФБ в/в вводили по 0,5 мл: А. эквимолярной смеси ФПП1 и ФПП2(1:1) в разных концентрациях; Б. смеси ФПШ и ФПП2 (1:1), ФПШ или ФПП2 в концентрации 0,1 мкМ (в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола).

К+ (положительный контроль) и К" (отрицательный контроль) - сенсибилизированные и интактные мыши, соответственно, получившие в/в 0,5 мл ФБР с 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Каждая точка - среднее в группе из 5-10 животных + SEM. *р<0,001 по сравнению с К1.

Видно (рис. 5, Б), что введение животным либо смеси ФПШ и ФПШ, либо каждого из данных фотопродуктов в эквимолярных концентрациях су-прессирует КЧ на 55-65 %. Таким образом эффективности супрессорного действия ФПШ и ФПШ были сравнимы. По-видимому это является следствием наличия одинаковых боковых заместителей в химической структуре данных соединений и, при этом локализация боковых групп в тетрапиррольном кольце не играет роли для проявления супрессорных свойств ФПШ и ФПШ.

4.2. Иммунные механизмы супрессорного действия ФПП1 на КЧ

Действие ФПП1 на разные фазы развития КЧ

Известно, что развитие КЧ протекает в две стадии: афферентная (сенсибилизации) и эффекторная (разрешения) [Watanabe et al., 2002; Saint-Mezard et al., 2004]. Фазы сенсибилизации и разрешения наступают при первичном и повторном контакте кожи с гаптеном. Во всех экспериментах, приведенных в разделе 4.1. растворы фотопродуктов ПГПХ вводили мышам на фазе инициации КЧ, т.е. до сенсибилизации ДНФБ. Не ясно, обладают ли ФПП1 и ФПП2 су-прессорной активностью на других фазах КЧ?

Для ответа на этот вопрос раствор ФПП1 вводили мышам в разное время относительно сенсибилизации ДНФБ. Было выявлено, что ФИШ супрессирует КЧ на разных этапах (за 20 ч до или через 27, 80 или 122 ч после сенсибилизации) ее развития. Однако, полная супрессия КЧ (87 ± 15 %) наблюдалась, если ФПП1 вводили за 20 ч до сенсибилизации животных ДНФБ.

Эти данные не позволяют сделать вывод о механизме ограничения развития КЧ при действии ФИШ. Тем не менее, с учетом представленной в литературе информации о патофизиологических и иммунологических механизмах, обеспечивающих протекание реакции КЧ [Gorbachev and Fairchild, 2001а; Grabbe and Schwarz, 1998], можно предположить, что действие ФПП1 могло быть направлено на модуляцию (угнетение или активацию) функций иммуно-компетентных клеток, опосредующих или регулирующих развитие реакции КЧ.

Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с супрессор-ньш потенциалом

Известно, что развитие КЧ на ДНФБ опосредуют эффекторные АГ-специфические CD8+Т-лимфоциты [Grabbe and Schwarz, 1998; Kobayashi et al., 2001; Li et al.,1994]. В этой связи нами была изучена возможность реализации супрессорного действия ФПП1 через угнетение функций АГ-специфических эффекторов КЧ. Реакция КЧ может быть перенесена от сенсибилизированного животного интактному (несенсибилизированному) АГ-специфическими Т-клетками, а не сывороткой [Black, 1999; Grabbe and Schwarz, 1998]. Поэтому, общепринятым подходом для выявления действия различных агентов, включая ФДТ, являются опыты по адоптивному переносу эффекторов КЧ [Simkin et al.,

1997; Musser and Oseroff, 2001]. Данный подход был использован нами для выявления действия ФПП1 на эффекторные Т-лимфоциты КЧ (схема 2, А).

Для этого 0,5 мл раствора ФПП1 (0,1 мкМ в ФБР, содержащем 0,4 % этанола и 0,6 % ПЭГ) вводили внутривенно мышам-донорам за 21 час до сенсибилизации ДНФБ. Мышей-доноров сенсибилизировали путем накожной аппликации 0,3 % раствора ДНФБ в ацетоне. Через 142 часа после сенсибилизации ДНФБ выделяли спленоциты мышей-доноров, отмывали, после чего вводили 108 этих клеток внутривенно сингенным интактным мышам-реципиентам. Через 2 часа вслед за этим мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 5 мкл 0,2% ДНФБ. Через последующие 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов А. В группах сравнения мышам-донорам вводили внутривенно 0,5 мл растворителя (ФБР, содержащий 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола).

На рисунке 6, А видно, что перенос слленоцитов сенсибилизированных доноров интактным мышам-реципиентам приводил к иммунизации последних, что проявлялось в развитии у мышей-реципиентов реакции КЧ при тест-аппликации ДНФБ (А, группа К+*(1)). Перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию ФНП1, интактным мышам-реципиентам подавлял практически полностью реакцию КЧ у последних (рис. 6, А). Следовательно, ФПШ in vivo ослаб мл функции эффекторов КЧ у мышей доноров, не оставалось неясным, может ли ФПШ активировать клетки с супрессорным потенциалом.

В то же время известно, что ФДТ может ограничивать развитие КЧ путем активации таких иммунокомлетентных клеток [Gollnick et al., 2001; Musser an ti Oseroff, 2001]. Нами была изучена возможность активации клеток с супрес-сорнъши свойствами на КЧ под действием ФПШ на модели адоптивного переноса супрессии КЧ (схсма 2,Б). Реципиентами в этих экспериментах были ДНФВ-сенсибилизированные мыши.

Рис. 6. ФПШ угнетает способность клеток-эффекторов переносить реакцию КЧ (А) и активирует клетки с супрессорным потенциалом (Б).

Эксперимент проводили по схеме 3. К+ и К' - положительный и отрицательный контроли без адоптивного переноса клеток, соответственно. К++(1) и К"(2) - положительные контроли, в которых егтсиоцити сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров были перенесены интактным или Д Н Ф Б-се не иби л изи ро ва н н ы м мы-

шам-реципиентам, соответственно. Каждая опытная и контрольная группа без переноса состояла из 5 животных. Каждая опытная и контрольная группа с адоптивным переносом состояла из 6 пар си н генных мышей-доноров и мышей-реципиентов. Представлено среднее± SEM,

*р<0,00) по сравнению с соответствующим положительным контролем.

На рис. 6, Б видно, что перенос эффекторов КЧ мышей-доноров сенсибилизированным мышам-реципиентам увеличил интенсивность КЧ реципиентов (отек уха в группе К+*(2) больше, чем в }). Перенос же спленоцитов мы шей-доноров, получивших инъекцию ФПШ, подавлял интенсивность КЧ сенсибилизированных мышей-реципиентов. Таким образом, после введения

£ ЗЁ

0.20

0.15

о> h

0.05

0.00

без переноса

I--~1

К+

Г*1

х-

¿J

i

перенос клеток

КГ(2)

тг

К"(1)

ril

ФПШ

ФГШ1

ФПШ

ФПП1 сенсибилизированным мышам-донорам в популяции спленоцитов появлялись клетки, угнетающие развитие КЧ при их адоптивном переносе сенсибилизированным реципиентам. Т.е. ФПП1 in vivo вызывал появление иммуноком-петентных клеток, обладающих супрессорной активностью.

В следующей серии экспериментов мы оценили специфичность супрес-сорного действия ФПП1 на КЧ. Для этого были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ с использованием двух разных гаптенов: ДНФБ и оксазолона (схема 3). Донорами, которым вводили ФПП1, в этих экспериментах служили ДНФБ-сенсибилизированные мыши. Тогда как реципиентами, которым переносили спленоциты от доноров были либо ДНФБ-сенсибилизированные (А), либо оксазолон-сенсибилизированные (Б) животные.

На рис. 7 видно, что введение мышам-реципиентам спленоцитов от доноров, получивших инъекцию ФПП1, приводило к супрессии реакции КЧ у реципиентов, сенсибилизированных как ДНФБ (А), так и оксазолоном (Б).

Рис. 7. ФПШ вызывает адоптивно-переносимую супрессию реакции КЧ. Эта супрессия является неспеЦйфтач-ной.

Л - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным ДНФБ, Б - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном. K"¡ и К+] -отрицательный и положительный кон-зроли на ДНФБ в перелосе. К"г - отрицательный контроль ira оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров к интакт-

ным реципиентам с последующим разрешением реакции КЧ оксазолоном), КЛ - положительный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизировапных доноров к реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном). *р<0,002 йй сравнению с K+v:*+P<0,03 по сравнению О

Таким образом, ФПШ in vivo инициировал в селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров появление клеток, которые подавляли КЧ на чужеродный гаптен — оксазолон. Можно предположить, что клетками-супрессорами КЧ являются макрофаги, как описано в литературе для супрессии КЧ при ФДТ с гематопорфирином [Lynch et al., 1989].

Можно заключить, что супрессорпое действие фотопродуктов ПГПХ является неспецифическим. ФПП1 in vivo активируют клетки с неспецифическим супрессорным потенциалом.

ВЫВОДЫ

1. Исследование фотогемолитической эффективности производных дейте-ропорфирииа IX (ДП) показало, что она возрастает в ряду: 2,4-тетраоксо-ДП (ДШ) < 2,4-дигэдрокси-ДП (ДГО) < 4-гидрокси-ДП (ДП5)<

4-диоксо-ДП (ДПЗ) < 4-оксо-ДП (ДП4) < 2-диоксо-ДП (ДП6). Все исследованные производньзе ДП увеличивают скорость темнового гемолиза не более чем в 7,3 раза, по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов. 2- или 4-монозамещенные производные ДП являются более мем-б ран оф ототок с и ч н ы м я по сравнению с 2,4-дизамещенными производными. Важную роль играет структура самих заместителей', производное ДШ с оксо-группой в боковом заместителе имеет большую фотогемолитическую эффек-

0.25 -,

1 В: оксазолон

0.20 А: ДИФЬ т

s 2 я * а Ci 0.1 S 0.10 Т| 1

а 0.05 * Т 1

0.00 Г*1 i ñ 1

к- К4 ,ФШ]] щ к+ 2ФПП1

тивность по сравнению с производным ДП5, имеющим ОН-группу в том же положении и производным ДПЗ с двумя оксогруппами.

2. Разработана методика оценки прочности связывания ФС с мембранами эритроцитов, основанная на сравнении скоростей фотосенсибилизированного гемолиза в отмытой и не отмытой от ФС суспензиях эритроцитов. Значения коэффициента прочности связывания с мембраной ф), определенные для ДП5 и ДП2 составили 0,86 и 0,61, соответственно, что коррелирует со значениями их коэффициентов распределения в системе октанол/буфер. Однако, различия в фотогемолитических эффективностях этих производных ДП существенно больше, чем различия в величинах р. Это указывает на то, что прочность связывания ФС с мембранами не играет решающей роли в их фотогемолитическом действии.

3. Показано, что фотопродукты протопорфирина IX (ПШХ) обладают мем-бранотоксическими свойствами. Фотогемолитические эффективности фотопро-топорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПГ12) превышают фотогемолитическую эффективность ПШХ в 5 и 9 раз, соответственно. Удаление из молекулы ФПП1 ОН-группы приводит к снижению темновой эффективности и увеличению фотогемолитической эффективности.

4. Исследованы мембранотоксические эффекты порфиринов с аминофос-фонатной групой во 2 положении тетрапирольного кольца: диметиловый эфир 0,0-диэтил-(К-третбутил)-фосфонометил фотопротопорфирина IX (АФ1) и диметиловый эфир 3 - [0,0-диэтил-(Н -третбутил)-фосфонометил] -8-винил-дейтеропорфирина IX (АФ2). АФ1, содержащий ОН-группу в первом положении, в отличие от АФ2, обладает выраженным детергентоподобным темновым гемолитическим действием. Фотогсмолитическая эффективность АФ2 в 2 раза больше, чем у АФ1.

5. Обнаружено, что предоблученный ПШХ способен супрессировать Т-клегочный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Глубина супрессии определялась дозой облучения ПШХ.

6. Выявлено, что супрессорный эффект предоблученного ПШХ обусловлен действием его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2. ФПП1 и ФПП2 приводят к 60 % супрессии КЧ при введении данных соединений животным в количестве 2,5 нг/кг веса. В основе супрессорного действия фотопродуктов ПШХ на КЧ лежит

угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим су-прессорным потенциалом.

Практические рекомендации.

Обнаруженные иммуносупрессорные эффекты ФПП1 и ФПП2 указывают на возможность разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1.1. V. Belichenko, A. A. Kyagova, N. N. Zhuravel, G. V. Mansurova, L. N. Bezdet-naya, F. Guillemin, S. Wunderlich, F. Pliquett, E. P. Lysenko, A. Ya. Potapenko. Photodynamic haemolysis sensitized by psoralen: effects of butilated hydroxy-toluene. Phys. Chem. Biol. & Med., 2, № 3, 151-157,1995.

2. I. Belichenko, S. Kirsten, G. Mansurova, L. Bezdetnaya, V. Melnikova, E. Lysenko, A. Potapenko, F. Guillemin. Biological testing of photobleaching of hematoporphyrin derivative (HpD) in solutions: hemolysis as a test system. 12 th International Congress on Photobiology. September 1-6, 1996. Vienna, Austria. Abstracts. P. 312.

3. S. Kirsten, 1. V. Belichenko, L. N. Bezdetnaya, G. V. Mansurova, A. Ya. Potap-

enko, F. Guillemin. Formation of biologically active porphyrin photoproducts as a result of hematoporphyrin derivative photobleaching in solution. Deutsche Gesellschaft fur Biophysik. Jahrestagung 1996. vom 18.-21. September 1996 an der Universität Leipzig. P135.

4. G. V. Mansurova, O. G. Pogrebnaya, G. V. Ponomarev, A. V. Reshetnickov, A. Ya.

Potapenko, L. N. Bezdetnaya, F. Guillemin. Comparison of photoheolytic efficiencies of deuteroporphyrin-IX derivatives, http://www.photobiology.com/photo-biology2000/mansurova/index.htm

5. Г.В. Мансурова, О.Г. Погребная, Г.В. Пономарев, A.B. Решетников, А. Я. По-

тапенко, Л.Н. Бездетная, Ф. Гимя. Скрининг фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии по их фотогемолитической эффективности. Ill Съезд фотобиологов России. 28 июня-4 июля 2001 г. Воронеж. 2001. Материалы съезда. С. 133-134.

6. G. V. Mansurova, О. G. Pogrebnaya, G. V. Ponomarev, А. V. Reshetnickov, L. N.

Bezdetnaya, F. Guillemin, A. Ya. Potapenko. A method of selection of sensitizers for photodynamic therapy by their photohemolytic efficiencies, у Congress of the European Society for Photobiology. Lillehammer, Norway. 3-8 September 2001. Programme and Book of Abstracts. P. 204.

7. Kyagova A.A., Kozir L.A., Mansurova G.V., Zorin V.P. and A.Ya. Potaperiko. Modulation of delayed type hypersensitivity in mice treated with photoproducts of various photosensitizers used in photodynamic therapy, fiuss. J. Immunol., 2002. Vol. 7, No. 4, pp. 328-334.

8. Г.В. Мансурова, О.Г. Погребная, Г.В. Пономарев, А.В. Решетников, А.Я. По-

тапенко, Л.Н. Бездетная, Ф. Гимя. Фотогемолиз, сенсибилизированный производными дейтеропорфирина IX: определение прочности связывания красителей с эритроцитами. Биофизика, 2003, 48, № 2, 251-255.

9. A.Y. Potapenko, А.А. Kyagova, G.V. Mansurova, L.A. Kozir, V.Y. Pavlov, I.O. Konstantinov, G.V. Ponomarev. Suppression of contact hypersensitivity in mice by products of protoporphyrin IX photooxidation. l(fh Congress of the European Society for Photobiology. September 6-11, 2003. General Hospital Vienna, Austria. Programme and book of abstracts. P. 50.

10. Мансурова Г.В., Козырь Л.А., Потапенко А .Я., Пономарев Г.В., Павлов В.Ю., Константинов И.О., Кягова А.А. Супрессорное действие продуктов фотоокисления протопорфирина IX на реакцию контактной чувствительности у мышей. Ill съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г Воронеж. Тезисы докладов Том 2, стр. 544-545.

11. Potapenko A. Ya., Kozir L. A., Mansurova G. V., Kozhinova E. A., Ponomarev G.V., Kyagova A. A. Photooxidation products of photosensitizers are responsible for systemic immunomodulation. 1International Conference Skin & Environment. Moscow-St. Petersburg, Russia. 1-6 June, 2005. Program and book of Abstracts. P. 38.

12. Kyagova A.A., Mansurova G.V., Kozir L.A., Ponomarev G.V., Pavlov V.Y., Konstantinov I.O., Potapenko A.Y. Systemic Suppression of Contact Hypersensitivity b у P roducts of P rotoporphyrin IX P hotooxidation. P hotochem Photobiol. 2005, 81; 1380-1385.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мансурова, Галина Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Фотодинамическая терапия (ФДТ)

1.1.1. История фотодинамической терапии

1.1.2. Типы фотодинамических реакций

1.1.3. Фотодинамическая терапия

1.1.4. Механизмы повреждения опухолевой ткани при проведении ФДТ

1.2. Фотосенсибилизаторы (ФС)

1.3. Структура и фотофизические свойства порфиринов

1.4. Внутриклеточная локализация ФС

1.5. Клеточные эффекты при фотодинамическом воздействии

1.6. Фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов человека

1.7. Иммунно-регуляторные эффекты ФДТ

1.8. Современные представления о механизмах развития реакции контактной чувствительности (КЧ)

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов производных 48 дейтеропорфирина1Х (ДП)

3.2. Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека

3.3. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов протопорфирина1Х (ПП1Х) и его фотопродуктов

Определение и сравнение темновых и фотогемолитических эффектов

АФ1 и АФ

Влияние боковых заместителей на темновые и фотогемолитические эффекты производных ПП1Х

3.4. Влияние фотопродуктов ПП1Х на реакцию КЧ у мышей 81 3.4.1. Супрессорное действие предоблученного ПП1Х и его фотопродуктов - фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина

ФПП2) на реакцию КЧ к ДНФБ

3.4.2. Иммунные механизмы супрессорного действия ФПП1 на КЧ

Действие ФПП1 на разные фазы развития КЧ

Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с 91 супрессорным потенциалом

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Скрининг гемолитической и иммуносупрессорной активности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда"

Фотодинамическая терапия (ФДТ) - современный метод лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанный на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС) [Dougherty, 2002; Wilson, 2002; Collaud et al., 2004]. Метод заключается в следующем: пациенту однократно вводят ФС, молекулы которого избирательно накапливаются в опухолевых тканях, повышая их чувствительность к свету. Спустя некоторое время ткани, содержащие ФС, облучают светом, что инициирует фотобиологические процессы, приводящие к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson, 2002].

Повреждение опухолевой ткани при проведении ФДТ происходит по нескольким направлениям: 1) эффекты, приводящие к непосредственной гибели клеток через некроз или апоптоз; 2) изменения в кровоснабжении опухолевой ткани, приводящие к ее ишемии; 3) иммунный ответ организма вследствие разрушения опухоли [Korbelik, 1996; Oleinik, Evans, 1998; Henderson, Dougherty, 1992; Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002].

Предполагают, что терапевтический эффект ФДТ является следствием протекания фотодинамических (ФД) (кислород-зависимых) реакций ФС и главным повреждающим агентом является синглетный килород ('02) [Henderson, Dougherty, 1992]. В живых клетках диффузионная длина пробега 'С>2 мала и сопоставима с толщиной мембраны, и он преимущественно дезактивируется в непосредственной близости от места его генерации [Kanofsky, 1991; Moan, Berg, 1991; Krasnovsky, 1998]. '02 повреждает биоструктуры в непосредственной близости от молекул ФС. Поэтому, повреждающее действие ФДТ во многом определяется локализацией ФС в клетке.

Известно, что способность ФС проникать в клетку и его внутриклеточная локализация ФС зависят от размеров молекулы ФС, полярности, способности к агрегации, распределения заряженных групп в молекуле и др. [Соболев и др., 2004; Berg et al., 1994; Boyle, Dolphin, 1996; Ruck, Diddens, 1996].

Селективность внутриклеточного распределения ФС не абсолютна, что предполагает существование множества внутриклеточных мишеней для ФД воздействия: мембраны клеток (плазматические, митохондриальные, ядерные и т.д.), митохондрии, лизосомы и эндосомы, эндоплазматический ретикулум и комплекс Гольджи, ядро. При этом трудно выделить какую-либо одну критическую мишень, модификация которой ведет к гибели клетки. Считают, что терапевтический эффект ФДТ является следствием фотосенсибилизированного повреждения различных клеточных мишеней [Jori, 1996; Morgan, Oseroff, 2001].

Наиболее широко в ФДТ используются соединения порфиринового ряда - различные порфирины, хлорины, фталоцианины и т.д. [Kessel, 1997; Dougherty et al., 1998; Hasan et al., 2000; Zane, 2001; Moan, Peng, 2003]. Однако, идет поиск новых наиболее эффективных ФС для ФДТ. Требованиями к новым ФС являются: селективное и быстрое накопление опухолями; отсутствие темновой токсичности; высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода; высокий квантовый выход триплетных состояний; наличие максимума поглощения в длинноволновой области видимого излучения и т.д. [Moan, 1990; Penning, Dubbelman, 1994; Jori, 1996; Joham, 1998].

Одной из клеточных мишеней при ФД воздействии является плазматическая мембрана клетки [Dougherty et al., 1998]. В этой связи, скрининг биологической активности новых ФС для ФДТ может быть проведен по их мембранотоксическим свойствам. Поэтому выявление связи структура ФС-мембранотоксичность является актуальной задачей.

Удобной и широко используемой моделью оценки мембранотоксических свойств ФС, применяемых в ФДТ является фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов человека [Kaestner et al., 2004].

Известно, что ФДТ с такими красителями, как порфирины и хлорины, часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Simkin G.O. et al. 1997; Simkin G.O et al., 2000, Musser D A. and Oseroff A.R., 2001; Nowis et al., 2005]. ФДТ-индуцированная иммуносупрессия может быть основным механизмом терапевтических эффектов при неонкологических заболеваниях. Например, обнаружено, что ФДТ может успешно использоваться для лечения ряда кожных и аутоиммунных заболеваний [Kurwa and Barlow, 1999]. Фотохимический механизм супрессии при ФДТ не известен. Одним из ФС, используемых в ФДТ является протопорфирин IX (ПП1Х) [Sternberg et al., 1998]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ПШХ с образованием его стабильных фотопродуктов [Сох and Written, 1982; Wessels et al., 1993], которые можно обнаружить как в растворах, так и в клетках [Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. В литературе нет данных о том, могут ли стабильные фоюпродукты ПП1Х вносить вклад в супрессорное действие ФДТ. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов Г1П1Х на Т-клеточный иммунныи ответ in vivo также является актуальным.

Цель настоящей работы: сравнить гемолитическую и иммуносупрессорную активность производных дейтеропорфирина IX (ДП), протопорфирина IX (ПП1Х) и его фотопродуктов и порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

Задачи исследования:

1. Сравнить темновые и фоюгемолитические эффекты производных ДП и определить прочность связывания данных соединений с мембраной эритроцита.

2. Оценить темновые и фотогемолитические эффекты ПП1Х и его фотопродуктов, а также порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

3. Изучить влияние фотопродуктов ПП1Х на Г-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Мансурова, Галина Валерьевна

Выводы

1. Исследование фотогемолитической эффективности производных дейтеропорфирина IX (ДП) показало, что она возрастает в ряду.

2,4-тетраоксо-ДП (ДП1) < 2,4-дигидрокси-ДП (ДП2) < 4-гидрокси-ДП (ДП5) < 4-диоксо-ДП (ДПЗ) < 4-оксо-ДП (ДП4) < 2-диоксо-ДП (ДП6). Все исследованные производные ДП увеличивают скорость темнового гемолиза не более чем в 7,3 раза, по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов. 2- или 4-монозамещенные производные ДП являются более мембранофототоксичными по сравнению с 2,4-дизамещенными производными. Важную роль играет структура самих заместителей: производное ДП4 с оксогруппой в боковом заместителе имеет большую фотогемолитическую эффективность по сравнению с производным ДП5, имеющим ОН-группу в том же положении и производным ДПЗ с двумя оксогруппами.

2. Разработана методика оценки прочности связывания ФС с мембранами эритроцитов, основанная на сравнении скоростей фотосенсибилизированного гемолиза в отмытой и не отмытой от ФС суспензиях эритроцитов. Значения коэффициента прочности связывания с мембраной (Р), определенные для ДП5 и ДП2 составили 0,86 и 0,61, соответственно, что коррелирует со значениями их коэффициентов распределения в системе октанол/буфер. Однако, различия в фотогемолитических эффективностях этих производных ДП существенно больше, чем различия в величинах р. Это указывает на то, что прочность связывания ФС с мембранами не играет решающей роли в их фотогемолитическом действии.

3. Показано, что фотопродукты протопорфирина IX (ПШХ) обладают мембранотоксическими свойствами. Фотогемолитические эффективности фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПП2) превышают фотогемолитическую эффективность ПП1Х в 5 и 9 раз, соответственно.

Удаление из молекулы ФПП1 ОН-группы приводит к снижению темновой эффективности и увеличению фотогемолитической эффективности

4. Исследованы мембранотоксические эффекты порфиринов с аминофосфонатной групой во 2 положении тетрапирольного кольца: диметиловый эфир 0,0-диэтил-(Н-третбутил)-фосфонометил фотопротопорфирина IX (АФ1) и диметиловый эфир 3-[0,0-диэтил-(Ы-третбутил)-фосфонометил]-8-винилдейтеропорфирина IX (АФ2). АФ1, содержащий ОН-группу в первом положении, в отличие от АФ2, обладает выраженным детергентоподобным темновым гемолитическим действием. Фотогемолитическая эффективность АФ2 в 2 раза больше, чем у АФ1.

5. Обнаружено, что предоблученный ПП1Х способен супрессировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Глубина супрессии определялась дозой облучения ПШХ.

6. Выявлено, что супрессорный эффект предоблученного ПП1Х обусловлен действием его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2. ФПП1 и ФПП2 приводят к 60 % супрессии КЧ при введении данных соединений животным в количестве 2,5 нг/кг веса. В основе супрессорного действия фотопродуктов ПП1Х на КЧ лежит угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным потенциалом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мансурова, Галина Валерьевна, Москва

1. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я (2006) Физико-химические основы фотобиоло1 ических процессов. Mr. Дрофа.

2. Геннис Р. (1997) Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.\ Мир, 624 с.

3. Иванов А.В., Решетников А.В., Дмитриев А.А., Градюшко А.Т., Швец В.И., Пономарев Г.В. (1998) Структурно-фукциональные зависимости для некоторых порфиринов сенсибилизаторов. II Всероссийский съезд фотобиологов, Пущино. с. 362-364.

4. Красновский А.А., мл. (2001) Синглетный кислород и механизм фотодинамического действия порфиринов в кн. Успехи химии порфиринов. Т. 3, гл. 11, с.191-216, СПб.

5. Потапенко А .Я., Малахов М.В. и Кягова А.А. (2004) Фотофизика фурокумаринов. Биофизика 1. 49, с. 307-324.

6. Решетников А. В., Швец В. И., Пономарев Г. В. (1999) Водорастворимые тетрапирольные фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака Успехи химии порфиринов. С.Пб: НИИ Химии СПбГУ. Т. 2, с. 70-114.

7. Соболев А.С., Розенкранц А.А., Гилязова Д.Г. (2004) Подходы к направленной внутриклеточной доставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и придания клеточной специфичности. Биофизика. Т. 49. с. 351-379.

8. Ando, Т., Т. Yoshikawa, Т. Tanigawa, M. Kohno, N. Yoshida and M. Kondo (1997) Quantification of singlet oxygen from hematoporphyrin derivative by electron spin resonance. Life Sci. V. 61, p. 1953-1959.

9. Auler H., Banzer G. (1942) Untersuchungen uber die rolle der porphyrine bei geschwulstkranken Menschen undtieren. Z. Krebsforsch. V.53, P. 6568. (цит. no: Szimiez et al., 2001).

10. Bagdonas S., L.W. Ma, V. Iani, R. Rotomskis, P. Juzenas and J. Moan (2000) Phototransformations of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in vitro: a spectroscopic study. Photochem. Photobiol. V. 72, p. 186-192.

11. Banchereau J., Briere F., Caux C., Davoust J., Lebecque S., Liu Y.J., Pulendran В , Palucka K. (2000) Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev. Immunol V.18, p. 767-811.

12. Berg K. (1996) Mechanism of cell damage in photodynamic therapy. In: H. Honigsmann, G. Jori, A.R. Young. The Fundamental Base of phototherapy. OEMF spa, Milan, p. 181-207.

13. Berg K., Moan J. (1994) Lisosomes as photochemical targets Int. J. Cancer V. 59, p. 814-822.

14. Berg K., Moan J. (1997) Lisosomes and microtubules as targets for photochemotherapy of cancer. Photochem. Photobiol. V. 65, p. 403-409.

15. Berg K., Peng Q., Nesland J.M., Moan J. (1994) Cellular responses to photodynamic therapy. Proc Spie. V. 2078, P. 278-285.

16. Berg K., Western A., Bommer J.C., Moan J. (1990) Intracellular localization of sulfonated meso-tetraphenylporphines in a human carcinoma cell line. Photochem. Photobiol. V. 52, p. 481-487.

17. Bielecki K., A. Dziamska and J. Sarapuk (2001), Physiological activity of some aminophosphonates. Z. Naturforsch. C., 56c, 995-998.

18. Bissonnette R., Tremblay J.F.,Juzenas P., Boushira M., Lui H. (2002) Systemic photodynamic therapy with aminolevulinic acid induces apoptosis in lesional T lymphocytes of psoriatic plaques. J. Invest.

19. Dermatol V. 119, p. 77-83.

20. Black C.A. (1999) Delayed type hypersensitivity: current theories with an historic perspective. Dermatol Online J. 5, No.l, p 7.

21. Bonnet R. and Berenbaum M. (1989) Porphyrins as photosensitizers. In Photosensitizing Compounds: their Chemistry? Biology and Clinical Use. Wiley, Chichester (Ciba Foundation Symposium 146). p. 40-59.

22. Bouloc A., Cavani A., Katz S.I. (1998) Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. J. Invest Dermato 1. V.l 11, No.l, p. 44-49.

23. Boyle R.W., Dolphin D. (1996) Structure and biodistribution relationships of photodynamic sensitizers. Photochem. Photobiol. V. 64. N. 3. p. 469485.

24. Cecic I., Korbelik M. (2002) Mediators of peripheral blood neutrophilia induced by photodynamic therapy of solid tumors. Cancer Lett. V. 183, p. 43-51.

25. Chernitskii E. A., Sen'covich O. A., Kozlova N M. (1996) Heterogeneity of pores formed in erythrocyte membrane by lipophilic hemolysins Biofizika, 41 (6), 1270 1274.

26. Cox G.S. and Written D.G. (1982) Mechanisms for the photooxidation of protoporphyrin IX in solution. J. Am. Chem. Soc V. 104, p. 516-521.

27. Dall'Acqua F., Martelli P. (1991) Photosensitizing action of furocoumarins on membrane components and consequent intracellular events. J Photochem Photobiol. B. V.8, No.3, p. 235-254.

28. Dearman R.J., Kimber I. (2000). Role of CD4(+) T helper 2-type cells in cutaneous inflammatory responses induced by fluorescein isothiocyanate. Immunology V. 101, p. 442-451.

29. Dellinger M. (1997) Apoptosis or necrosis following Photofrin photosensitization: influence of the incubation protocol. Photochem Photobiol. V. 66, p. 479-483.

30. Deron, A. Dziamska, I. Pawlaczyk, K. Bielecki, H. Kleszczynska, R. Gancarz and J. Sarapuk (2001) The membrane-disrupting activity of alpha-aminoalkanephosphonic acids and their derivatives. Cell Biol Mol Lett., 6, 291-297.

31. Dougherty T.J. (2002). An update on photodynamic therapy applications. J Clin Laser Med Surg. V. 20, No. 1, p. 3-7.

32. Dougherty Т., Grindey G.B., Fiel R, Weishaupt K.R., Boyle D.G. (1975) Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. J. Natl. Cancer Inst. V. 55, p. 115-121.

33. Dougherty T.J., Gomer C.J., Weishaupt K.R. (1976) Energetics and efficiency of photoinactivation of murine tumor cells containing hematoporphyrin. Cancer Res. V. 36, P. 2330-2333.

34. Dougherty Т., Kaufman J.E., Goldfarb A., Weishaupt K.R., Boyle D., Mittleman A. (1978) Photoradiation therapy for treatment of malignant tumors. Cancer Res. V. 38, P. 2628-2635.

35. Dougherty Т., Gomer C.J., Henderson B.W., Jori G., Kessel D., Korbelik M., Moan J., Peng Q. (1998) Photodynamic therapy. J. Natl. Cancer Inst. V. 90, p. 889-903.

36. Dougherty T.J. (2002). An update on photodynamic therapy applications J Clin Laser Med Surg. V. 20, No. 1, p. 3-7.

37. Dubois В., Chapat L., Goubier A., Papiernik M., Nicolas JF., Kaiserlian D. (2003). Innate CD4+CD25+ regulatory T cells are required for oral tolerance and inhibition of CD8+ T cells mediating skin inflammation. Blood. V. 102, p. 3295-3301.

38. Evensen J.F. and Moan J. (1982) Photodynamic action and chromosomal damage: a comparison of haematoporphyrin derivative (HpD) and light with X-irradiation. Br. J. Cancer. V.45, p. 456-465.

39. Figge F.H.J., Weiland G.S., Manganiello L.J. (1948) Cancer detection and therapy, affinity of neoplastic, embryonic and traumatized tissues for porphyrins and metalloporphyrins. Soc. Exp. Biol. Med. V. 68, P. 640-641

40. Foote C.S. (1991) Definition of type I and type II photosensitized oxidation. Photochem. Photobiol. V. 54, No. 5, p. 659.

41. Girolomoni G., Sebastiani S., Albanesi C., Cavani A. (2001) T-cell subpopulations in the development of atopic and contact allergy. Curr. Opin Immunol V. 13, No.6, p. 733-737.

42. Girotti A. (1990) Photodynamic lipid peroxidation in biological system. Photochem. Photobiol. V. 51 p. 497-509.

43. Girotti A. (2001) Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathway, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms. J. Photochem. Photobiol. B. Biol. V. 63, p. 103-113.

44. Golab J., Nowis D., Skrzycki M. (2003) Antitumor effects of photodynamic therapy are potentiated by 2-methoxyestradioI. A superoxide dismutase inhibitor. J. Biol. Chem. V. 278, p. 407-414.

45. Gollnick S.O., Liu X., Owczarczak В., Musser D.A., Henderson B.W. (1997) Altered expression of interleukin 6 and interleukin 10 as a result of photodynamic therapy in vivo. Cancer Res., V. 57, p. 3904-3909.

46. Gomer C. J., Ferrario A., Murphee A. L. (1987) The effect of localized photodynamic therapy on the induction of tumor metastasis. Br. J. Cancer V. 56, P. 32-37.

47. Gorbachev A.V., Fairchild R.L. (2001a) Induction and regulation of T-cell priming for contact hypersensitivity. Crit. Rev. Immunol. V.21, No.5, p. 451-472.

48. Gorbachev A.V., Fairchild R.L. (2001b) Regulatory role of CD4+ T cells during the development of contact hypersensitivity responses. Immunol Res V.24, No.l, p.69-77.

49. Grabbe S., Schwarz T. (1998) Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity. Immunol. Today V. 19, No.l; p. 37-44.

50. Grossweiner L.I. (1999) Photosensitization of blood cell hemolysis: a brief review. Статья в Интернете http //www photobiology com/reviews/5/ index, htm

51. Guan H., Zu G., Slater M., Elmets C., Xu H. (2002) gammadeltaT Cells Regulate the Development of Hapten-Specific CD8+ Effector T Cells in Contact Hypersensitivity Responses. J Invest Dermatol V.119, No.l, p. 137-142.

52. Hasan Т., Moor A., Ortell B. (2000) Photodynamic therapy of cancer. Cancer Medicine/Eds. Holland J.F. New York: B.C. Decker, Inc. p. 489502.

53. Henderson B.W., Dougherty T. (1992a) Photodynamic therapy: basis principle and clinical application. New York: M. Dekker.

54. Henderson B.W, Dougherty T.J. (19926) How does photodynamic therapy work? Photochem. Photobiol. V. 55, p. 145-157.

55. Hrygorenko E.A, Oseroff A.R, Morgan J, Rittenhouse-Diakun K. (1998) Antigen specific and nonspecific modulation of the immune response by aminolevulinic acid based photodynamic therapy. Immunopharmacology. V. 40, p. 231-240.

56. Hunt D.W, Jiang H, Granville D J, Chan A.H, Leong S, Levy J.G. (1999) Consequences of the photodynamic treatment of resting and activated peripheral T lymphocytes. Immunopharmacology. V. 41, p. 3144.

57. Ilya I. Ivanov, German E. Fedorov, Renatta A. Gus'kova, Konstantin I. Ivanov, Andrew B. Rubin (2004) Permeability of lipid membranes to dioxygen. Biochem Biophys Res Commun. 322. P. 746-750.

58. Juzenas P, V. Iani, S. Bagdonas, R. Rotomskis and J. Moan (2001) Fluorescence spectroscopy of normal mouse skin exposed to 5-aminolaevulinic acid and red light. J Photochem. Photobiol. В. V. 61, p. 78-86.

59. Joham D. (1998) Clinical experiences and expectations. Photodynamic tumor therapy. 2nd and 3rd generation photosensitizers. Ed. Moser J.G. -Australia: Harwood Acad. Publ., p. 213-225.

60. Jori G. (1996) Tumour photosensitizers: approaches to enhance the selectivity and efficience of photodynamic therapy. J Photochem. Photobiol. B. Biology, V. 36, p. 87-93.

61. Joshi P.C, Pathak M.A. (1984) The role of active oxygen (!02 and 0(2)) induced by crude coal tar and its ingredients used in photochemotherapy of skin diseases. J Invest Dermatol Jan; V.82, N.l, p. 67-73.

62. Kaestner L, Juzeniene A. and J. Moan (2004) Erythrocytes the "house elves" of photodynamic therapy. Photochem. Photobiol. Sci., V. 3, p. 981989.

63. Kanofsky J.R. (1991) Quenching of singlet oxygen by human red cell ghosts. Photochem. Photobiol, V. 53, p. 93-99.

64. Kessel D. (1997) Photodynamic therapy of neoplastic diseases. Laser Oral Maxillofascial Surg. V. 9, p. 73-84.

65. Kessel D., Yu Luo (1999) Photodynamic therapy: mitochondrial inducer of apoptosis. Cell Death Differ. V. 6, p. 28-35.

66. Kessel D., Luo Y., Deng Y., Chang C.K. (1997) The role of subcellular localization in initiation of apoptosis by photodynamic therapy. Photochem. Photobiol., V. 65, p. 422-426.

67. Kessel D., Poretz R.D. (2000) Sites of photodamage induced by photodynamic therapy with a chlorin e6 triacetoxymethyl ester (CAME) Photochem. Photobiol. V. 71, p. 94-96.

68. King D.E., Jiang H., Simkin G.O., Obochi M.O., Levy J.G., Hunt D.W. (1999) Photodynamic alteration of the surface receptor expression pattern of murine.splenic dendritic cells. Scand. J. Immunol,V. 49, p. 184-192.

69. Kleszczynska H., Bonarska D., Bielecki K., Sarapuk J. (2003) The hemolytic and physiological activities of mixtures of some phenoxy and organophosphorous herbicides. Cell Mol Biol Lett. V. 8, p. 55-61.

70. Konan, Y. N., R. Gurny and E Allemann (2002) State of the art in the delivery of photosensitizers for photodynamic therapy. J Photochem Photobiol В V.66,p. 89-106.

71. Korbelik M. (1996) Induction of tumor immunity by photodynamic therapy. J. Laser Med. Surg. V. 14, p. 329-334.

72. Krasnovsky A.A. (1998) Singlet molecular oxygen in photochemical systems: IR phosphorescence studies. Membr. Cell Biol V. 12. P. 665690.

73. Krasnovsky A.A. Jr., Foote Ch.S. (1993) Time-resolved measurements of singlet oxygen dimol-sensitized luminescence. J Am Chem Soc V.115, p. 6013-6016.

74. Kurwa H.A., Barlow R.J. (1999) The role of photodynamic therapy in dermatology. Clin. Exp. Dermatol. V. 24, p. 143-148.

75. Kvam E., Stokk Т., Moan J., Steen H.B. (1992) Plateau distributions of DNA fragment lengths produced by extended light exposure of extranuclear photosensitizers in human cells. Nucleic Acid Res. V. 20, p. 6687-6693.

76. Linsel G., I. Dahse and E. Muller (1988) Physiol Plan, 73, 77-84.

77. Lipson R. L., Blades E.J. (1960) The photodynamic properties of a particular hematoporphyrin derivative. Arch. Dermatol. V. 82, p. 508-516.

78. Lynch D.H., Haddad S., King V.J., Ott M.J., Straight R.C. and C.J. Jolles. (1989) Systemic immunosuppression induced by photodynamic therapy (PDT) is adoptively transferred by macrophages. Photochem. Photobiol.,1. V. 49, p. 453-458.

79. Moan J. (1986) Porphyrin photosensitization and phototherapy. Photochem Photobiol. V. 43, p. 681-690.

80. Moan J. (1990) On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues. J Photochem Photobiol., В. V. 6, p. 343-347.

81. Moan J. and Berg K. (1991) The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochem. Photobiol. V. 53, p. 549-553.

82. Moan J., Berg K. (1992) Photochemotherapy of cancer: experimental research. Photochem. Photobiol. V. 55, p. 931-948.

83. Moan J., Peng Q., Sorensen R., Iani V., Nesland J.M. (1998) The biophysical foundations of photodynamic therapy. Endoscopy, V. 30, p. 387-391.

84. Moan J, Peng Q. (2003) An outline of the hudred-yaer history of PDT. Anticancer Res. V 23, p. 3591-3600.

85. Moan J., L. W. Ma, A. Juzeniene, V. Iani, P. Juzenas, F. Apricena and Q. Peng (2003) Pharmacology of protoporphyrin IX in nude mice after application of ALA and ALA esters. Int. J. Cancer., V. 103, p. 132-135.

86. Moreno G. (1986) Photosensitization of mammalian cells by psoralens and porphyrins. Biochimie. Jun V. 68, p. 869-73.

87. Morgan J., Oseroff A.R. (2001) Mitochondria-based photodynamic anticancer therapy. Adv. Drug Deliv. Rev V. 49, p. 71-86.

88. Muller K.M., Rocken M., Carlberg C., Hauser C. (1995) The induction and functions of murine T-helper cell subsets. J Invest Dermatol. V. 105, No. 1 Suppl, 8S-13S.

89. Musser D.A., Oseroff A.R. (2001) Characteristics of the immunosuppression induced by cutaneous photodynamic therapy:persistence, antigen specificity and cell type involved. J Photochem Photobiol. V. 73, p. 518-524.

90. Nowis D., T. Stoktosa, M Legat, T. Issat, M. Jakobisiak, J. Gotab (2005) The influence of photodynamic therapy on immune response. Photodiag. andPhotodyn. Ther. V. 2, p. 283-298.

91. Obochi M.O., Ratkay L.G., Levy J.G. (1997) Prolonged skin allograft survival after photodynamic therapy associated with modification of donor skin antigenicity. Transplantation. V. 63, p. 810-817.

92. Ochsner M. (1997) Photophysical and photobiological processes in the photodynamic therapy of tumours. J. Photochem. Photobiol. В. V. 39, p. 1-18.

93. Oleinik N.L., Evans H.H. (1998) The photobiology photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms. Radiat. Res. V. 150S, p. 146-156.

94. Oleinik N.L., Morris R.L., Belichenko 1. (2002) The role of apoptosis in response to photodynamic therapy, what, where, why and how. Photochem. Photobiol. V. 1, p. 1-21.

95. Oseroff A.R., Ohuoha D., Ara G., MaAuliffe D., Foley J., Cincotta L. (1986) Intramitochondrial dyes allow selective in vitro photolysis of carcinoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. V. 83, p. 9729-9733.

96. Park B.K., Pirmohamed M., Kittenngham N.R. (1998) Role of drug disposition in drug hypersensitivity: a chemical, molecular, and clinical perspective. Chem Res Toxicol. V. 11, p. 969-988.

97. Pathak M.A., West J.D. (1982) Porphyrias: office procedures and laboratory tests for diagnosis of porphyrin abnormalities Acta Derm Venereol Suppl (Stockh). N. 100, p. 91-105. Review.

98. Peng Q., Ma L.W., Berg K., Moan J. (1994) Effect of sulfonation on the photosensitiziting efficiency of aluminum phthalocyanine and meso-tetraphenylporphine in photodynamic therapy of cancer. Proc. SPIE. V. 2078, p. 258-267.

99. Peng Q., Nesland J.M., Madslien K., Danielsen H.E., Moan J. (1996) Subcellular photodynamic action sites of sulfonated aluminum phthalocyanines in a human melanoma cell line. Proc. SPIE. V. 2628, p. 102-113.

100. Peng Q., Moan J., Kongshaug M. Comparing in vitro and in vivo phototoxicities/ Photodynamic tumor therapy. 2nd and 3rd generation photosensitizers./ Ed. Moser J.G. Australia: Harwood Acad. Pubi, p. 195209.

101. Penning L.C., Dubbelman T.M.A.R. (1994) Fundamental of photodynamic therapy: cellular and biochemical therapy. J. Photochem. Photobiol. V. 5, p. 139-146.

102. Pervaiz S. (2001). Reactive oxygen-dependent production of novel photochemotherapeutic agents. FASEB J. V.15, p. 612-617.

103. Roberts W.G., Berns M.W. (1989) In vitro photosensitization. I. Cellular uptake and subcellular localization of mono-L-aspartyl cholrin e6, chloroaluminum sulfonated phthalocyanine, and Photofrin II. Lasers Surg. Med.V. 9, p. 90-101.

104. Polikard A. (1924) Etude sur les aspects offers par des tumeurs experimentales examinees a la lumiere de wood. C.R. Soc. Biol. V.91, P. 1423-1424. (цит. no: Szimiez et al., 2001)

105. Pooler J.P. (1985) The kinetics of colloid osmotic hemolysis. Photohemolysis. Biochem. Biophys. Acta. V.2, P. 193-198.

106. Potapenko A.Ya. (1991) Mechanisms of photodynamic effect of furocoumarins. J Photochem Photobiol. B. Biol., V.9, p.1-33.

107. Reddan J.C., Anderson C.Y., Xu H., Hrabovsky S., Freye K., Fairchild R, Tubesing K.A., Elmets C.A. (1999). Immunosuppressive effects of silicon phthalocyanine photodynamic therapy. J Photochem Photobiol V. 70, p. 72-77.

108. Rideal E. K., Taylor F. H. (1958). On hemolysis and hemolytic acceleration. Proc. Roayl Sos. Ser. В, V. 148, p. 450 464.

109. Ricchelli F. (1995) Photophysical properties of porphyrins in biological membranes. J Photochem Photobiol. B: Biol. V. 29, p. 109-118.

110. Ricchelli F., Salet C., Moreno G. (1997) Distribution properties of photosensirizers in biological membranes. Trends in Photochem.

111. Photobiol. V. 4, p. 285-289.

112. Ricchelli F. (1995) Photophysical properties of porphyrins in biological membranes. J. Photochem Photobiol. B: Biol. V. 29, p. 109-118.

113. Rosental I. (1991) Phtalocyanines as photodynamic sensirizers Photochem Photobiol. V. 53, p. 859-870.

114. Ruck A, Diddens M. (1996) Uptake and sebcellular distribution of photosensitizing drugs in malignant cells. The fundamental bases of phototherapy,/ Eds. Honigsmann H, Jori G, Young A.R. Milano OEMF.

115. Saint-Me/ard P, Berard F, Kaiserlian D, Kaiserlian D, Nicolas J.-F. (2004) The role of CD4+ and CD8+ 1 cells in contact hypersensitivity and allergic contact dermatitis Eur. J. Dermatol., V. 14, p. 131-138.

116. Schmidt W, Butler W.L. (1976) Flavin-mediated photoreactions in artificial systems: a possible model for the blue-light photoreceptor pigment in the living systems. Photochem. Photobiol. V. 24, p. 71-75.

117. Schwartz S, Absolon K., Vermund H. (1955) Some relationships of porphyrin, X-rays and tumors. Med. Bull. V. 27, P. 7-13.

118. Shornick L P, Bisarya A.K., Chaplin D.D. (2001) IL-lbeta is essential for langerhans cell activation and antigen delivery to the lymph nodes during contact sensitization: evidence for a dermal source of IL-lbeta. Cell Immunol V. 211, p. 105-112.

119. Sienkiewicz A, Graczyk A. (1991) Photodynamic therapy -photochemical and photobiological principles. Biocybern. Biomed.1. Eng. V. 11, p. 23-36.

120. Simkin G.O., King D.E, Levy J.G., Chan A.H., Hunt D.W. (1997). Inhibition of contact hypersensitivity with different analogs of benzoporphyrin derivative. Immunopharmacology V. 37, p.221-230.

121. Simkin G.O., Tao J.S., J.G. Levy and D.W. Hunt. (2000) IL-10 contributes to the inhibition of contact hypersensitivity in mice treated with photodynamic therapy. J. Immunol. V. 164, p. 2457-2462.

122. Singh G., Jeeves W.P., Wilson B.C., Jang D. (1987) Mitochondrial photosensitization by Photofrin II. Photochem. Photobiol. V. 46, p. 645649.

123. Specht K.G. and Rogers M.A. (1991) Plasma membrane depolarization and calcium influx during cell injury by photodynamic action. Biochem. Biophys. Acta. V. 1070, p. 60-68.

124. Sterling Т. M. (1994) Mechanisms of herbicide absorption across plant membranes and accumulation in plant cells. WeedSci, 42, 263-276.

125. Sternberg E. D., D. Dolphin and C. Bruckner (1998) Porphyrin-based Photosensitizers for Use in Photodynamic Therapy. Tetrahedron, V. 54, p. 4151-4202.

126. Stranadko E.F., Scobelkin O.K., Litvin G.D., Astrakhankina G.A. (1996) Photodynamic therapy of human malignant tumours: a comparative study between Photohem and tetrasulfonated aluminum phthalocyanine. Proc. SPIE. V. 2625, p. 440-448.

127. Susmita S., Tania В., Dibyendu R. and A.S. Chakraborti (2004) Protoporphyrin IX-induced structural and functional chages in human red blood cells, haemoglobin and myoglobin. J. Biosci. V. 29, p. 281-291.

128. Svennilson J. (2005) Novel approaches in GVHD therapy. Bone Marrow Transplant. V. 35 (Suppl. 1) p. 65-67.

129. Theodossiou T. and A.J. MacRobert (2002) Comparison of the photodynamic effect of exogenous photoprotoporphyrin and protoporphyrin IX on РАМ 212 murine keratinocytes. Photochem. Photobiol. V. 76, p. 530-537.

130. Tomaso J. M. di and J. M. Di Tomaso (1994). Evidence against a direct membrane effect in the mechanism of action of graminicides. Weed Science. V. 42, p. 302-309.

131. Trela Z., H. Kleszczynska and J. Sarapuk (2001) Physiological and hemolytic toxicity of some aminophosphonates. Z. Naturforsch CJ, V. 56, p.838-842.

132. Tsai M., Grimbaldeston MA., Yu M., Tam SY., Galli SJ. (2005) Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. V. 87, p. 179-197.

133. Valenzeno D.P., Tarr M. (1991) Membrane photomodification and its use to study reactive oxygen effects. Photochemistry and Photophysics! Ed. Rabek J.F.-Boca Raton: CRC Press. V. VIII, p. 137-191.

134. Van Gell I.P.J., Oppelaar H., Oussoren Y., Schuitmaker J.J., Stewart F.A. (1995) Mechanism for optimising photodynamic therapy: second generation photosensitizers in combination with mitomycin C. Br. J. Cancer. V. 72, p. 344-350.

135. Vicari A.P., Trinchieri G. (2004) Interleukin-10 in viral diseases and cancer : exiting the labyrinth? Immonol Rev. V. 202, p. 223-236.

136. Wang В., Feliciani C., Freed I„ Cai Q., Sauder D.N. (2001) Insights into molecular mechanisms of contact hypersensitivity gained from gene knockout studies. J Leukoc. Biol V. 70, p. 185-191.

137. Watanabe H., M. Unger, В. Tuvel, В. Wang and D. N. Sauder (2002) Contact hypersensitivity: the mechanism of immune responses and T-cell balance. J. Interferon Cutokine Res. V. 22, p. 407 412.

138. Weigmann В., Schwing J., Huber H., Ross R., Mossmann H., Knop J., Reske-Kunz AB. (1997). Diminished contact hypersensitivity response in IL-4 deficient mice at a late phase of the ehcitation reaction. Scand J Immunol V. 45, p. 308-314.

139. Wessels J.M., Sroka R., Heil P. and Seidlitz H.K. (1993) Photodegradation of protoporhyrin-dimethyiester in solution and in organized environments. Int. J. Radiat. Biol. V. 64, p. 475-484.

140. Woodburn K.W., Vardaxis N.J., Hill J.S., Kaye A.H., Phillips D.R. (1992) Subcellular localization of porphyrins using confocal laser scanning microscopy. Photochem. Photobiol. V. 54, p. 725-732.

141. Zane C., de Panfilis G., Calzavara-Pinton P. (2001) Photosensitizers -systemic sensitization. Photodynamic therapy and fluorescence diagnosis in dermatology/ Eds. Calzavara-Pinton P., Szeimies P.M., Ortel B. Amsterdam: Elsevier, p. 103-114.