Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка научно-методических основ и биотестсистем для скрининга иммуносупрессоров

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салова, Татьяна Викторовна, Москва

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

САЛОВА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

РАЗРАБОТКА НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИХ ОСНОВ И БИОТЕСТСИСТЕМ ДЛЯ СКРИНИНГА ИММУНОСУПРЕССОРОВ. /03,00.23 - биотехнология/.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители академик РАМН профессор В.А. БЫКОВ профессор Ю.О. САЗЫКИН

Москва-1999г.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Сто.

X

I. ВВЕДЕНИЕ................................................................5

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................10

Глава 1. Вторичные метаболиты микроорганизмов. Новые аспекты их использования и проблемы скрининга... 10

1.1. К истории открытия циклоспорина А..............15

1.2. Продуценты циклоспоринов............................16

1.3. Химия циклоспорина А..................................17

1.4. Биосинтез циклоспорина А. Циклоспорин син-тетаза.........................................................18

1.5. Направленный биосинтез циклоспорина А........20

1.6. Эффекты циклоспорина А на уровне клеток и межклеточных взаимодействий........................21

1.7. Новые иммуносупрессоры природного проис-

хождения...................................................23

1.8. Внутриклеточные мишени циклоспорина A, FK506

и рапамицина.............................................27

1.9 Некоторые проблемы моделирования при поиске

природных иммуносупрессоров.......................39

1.10 Биологическая активность циклоспориновых структур, не связанная с иммуносупрессорным

эффектом...................................................48

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.................................53

Глава 1. Материалы и методы.......................................53

1.1 Антибиотики и реагенты..............................53

1.2 Тест-объекты (виды и штаммы грибов)...........53

1.3 Питательные среды.....................................54

1.4 Определение антифунгальной активности циклоспорина А одного и в комбинации с другими биологически активными веществами............................................................55

1.5 Изучение морфологических особенностей мицелия в присутствии циклоспорина А........................56

1.6 Ультраструктурный анализ действия циклоспорина А на клетки грибов...............................56

1.7. Получение липосомальных препаратов антибиотиков.........................................................57

1.8 Получение протопластов из клеток Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum.............................58

1.9 Определение нарушения проницаемости цито-плазматической мембраны...............................59

1.10 Определение белка и нуклеиновых кислот в клетках грибов........................................................61

1.11 Определение активности протеолитических ферментов........................................................61

1.12 Математическая обработка результатов.............62

Глава 2. Особенности действия циклоспорина А на грибы......63

2.1. Антифунгальная активность циклоспорина А и его влияние на морфологические свойства

при росте Aspergillus niger J 37 а в различных условиях культивировании................................63

2.2. Морфологические особенности культуры Aspergillus niger 137 а при росте на агаризованных средах содержащих циклоспорин А.........................66

2.3. Морфология клеток Aspergillus niger 137а, растущих в присутствии циклоспорина А

в условиях глубинного культивирования...........76

2.4. Влияние циклоспорина А на морфологические свойства Pénicillium lucidum штамм 41 В........84

2.5. Морфологические аномалии Aspergillus niger и Tolypocladium inflatum, вызываемые новыми природными иммуносупрессорами...................87

Глава 3. Влияние некоторых биологически активных соединений на антифунгальную активность циклоспорина А...................................................91

3.1 Влияние макролидных структур на антифунгальный

эффект циклоспорина А.................................92

3.2. Влияние некоторых новых иммуносупрессоров на

антифунгальный эффект циклоспорина А.........96

3.3 Влияние на активность циклоспорина А фузидина и

аминогликозидных антибиотиков.....................97

3.4. Влияние на активность циклоспорина А соедине ний, включенных в биоэнергетический метаболизм...........................................................99

Глава 4. Изучение действия циклоспорина А на клетки

Aspergillus niger методом электронной микроскопии...........................................................104

Глава 5. Действие циклоспорина А на барьерные функции цитоплазматической мембраны Aspergillus

niger 137 а..................................................113

5.1. Действие циклоспорина на синтез бежа и

нуклеиновых кислот.....................................118

5.2. Действие липосомального препарата циклоспорина А на барьерные функции цитоплазма-тической мембраны Aspergillus niger 137а......121

5.3. Совместное действие циклоспорина А и амфоте рицина В в свободной и липосомальной форме на проницаемость цитоплазматической мембраны Aspergillus niger 137а...........................124

5.4. Действие циклоспорина А и амфотерицина В на проницаемость мембраны протопластов Tolypocla-dium inflatum............................................127

Глава 6. Влияние циклоспорина А на протеолитическую активность Aspergillus niger 137a (in vitro и in vivo).......................................................135

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................142

V. ВЫВОДЫ...............................................................149

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................152

I. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Вторичные метаболиты почвенных микроорганизмов исключительно разнообразны по структуре и биологической активности. Длительное время, интерес к ним определялся наличием у многих из них антибиотических свойств и той ведущей ролью, которую заняли антибиотики как лекарственные препараты. Исследования двух последних десятилетий показали, что вторичные вещества микробного происхождения далеко не исчерпываются теми, что обладают резко выраженными антимикробными свойствами. Среди метаболитов почвенных микроорганизмов обнаружены структуры, обладающие слабым антимикробным действием, но избирательно подавляющие отдельные биохимические реакции в тканях макроорганизма.

Среди вторичных микробных метаболитов, получивших важное практическое значение не за счет своей антибиотической активности, первое место несомненно занимает и м муносу прессор циклоспорин А. Этот циклический ундекапептид - представитель семейства циклоспоринов в настоящее время, производимый фирмой «Sandoz», широко используется при пересадке органов и тканей, а также при лечении аутоиммунных заболеваний. Циклоспорин А был получен из оригинального штамма продуцента Tolypocladium inflatum subsp. blastosporum в лаборатории изыскания культур продуцентов ГНЦА (Л.П. Иваницкая, М. В.Бибикова, А.Н. Рыбакова). Фармакологическое изучение циклоспорина А проводилось в медико-биологическом отделе ГНЦА (И.П. Фомина, A.B. Никитин); были разработаны лекарственные формы отечественного препарата циклоспорина А (Л. К. Граков-ская) и проведены успешные испытания в клинических учреж-

дениях г. Москвы.*

Механизм биологической активности циклоспорина А на уровне межклеточных взаимодействий и на уровне внутриклеточной мишени в Т лимфоцитах и других животных клетках интенсивно изучаются в течение ряда лет во многих лабораториях мира.

Циклоспорин А впервые был обнаружен по своей антифун-гальной активности, но изучение особенностей его действия на клетки грибов проводилось недостаточно. Это объяснялось тем, что спектр его антифунгального действия был определен как относительно узкий, а эффективность in vivo невысокой. В то же время в последние годы непрерывно расширяется поиск продуцентов новых иммуносупрессоров среди почвенных микроорганизмов, растет интерес к методам их первичного скрининга. Первичный скрининг с использованием в качестве тест-объекта животных клеток или бесклеточных ферментных систем встречается с существенными затруднениями. Наличие многочисленных примесей как в кулыуральной жидкости, так и в неочищенных экстрактах из мицелия изучаемых микроорганизмов, искажает результаты испытания. В соответствии с этим периодически сообщается о попытках создания различных модельных тест-систем, позволяющих вести целенаправленный первичный скрининг иммуносупрессоров.

Представленная работа была выполнена в рамках федеральной целевой программы «Развитие медицинской промышленности в 1998-2000 гг и на период до 2005 г» по приорететным направле-

* Автор приносит глубокую благодарность заведующему лабораторией культур продуцентов ГНЦА члену - корреспонденту РАМН, профессору Л.П. Иваницкой за предоставление препаратов новых антибиотиков с иммуносупрессорными свойствами.

ниям: № 3 - «Разработка новых оригинальных лекарственных средств и их компьютерное моделирование.» и №5 - «Создание научно-методических основ и перспективных биотестсистем для обеспечения фундаментальных медикобиологических исследований».

Цель и задачи исследования. Целью работы является создание научно-методических основ первичного скрининга биологически активных веществ, обладающих иммуносупрессорньши свойствами; разработка биотест системы для отбора близких по механизмам биологической активности к циклоспорину А веществ, используя особенности их антифунгального действия. Конкретными задачами исследования являлись:

1. Поиск достоверных и информативных биотестсистем для отбора иммуносупрессорных агентов.

2. Подбор специфичных микробных тест-объектов для определения иммуносупрессоров. тестирование выбранной системы на отобранных биотест-объектах.

3. Изучение на морфологическом уровне особенностей антифунгального действия циклоспорина А на эти тест-объекты.

4. Изучение и сравнение влияния антибиотиков макролидной, аминогликозидной, стероидной структуры, соединений, включенных в биоэнергетические процессы и новых иммуносупрессоров микробного происхождения на антифунгальную активность циклоспорина А.

5. Изучение характера ультраструктурных нарушений грибной клетки тест-объекта, вызываемых циклоспорином А.

6. Изучение проницаемости цитоплазматической мембраны тест-объектов (грибов) при воздействии на неё антифунгальными агентами - циклоспорином А и амфотсрицином В.

7. Обоснование возможности использования в качестве тест-объекта протопластов Tolypocladium inflaíum.

8. Изучение действия циклоспорина А на протеолитические ферменты грибов в условиях in vitro и in vivo, обоснование целесообразности применения их в качестве тест-объектов. Научная новизна работы. Определен набор модельных тестов

для выявления веществ, обладающих иммуносупрессорными свойствами.

Впервые обнаружены характерные особенности действия циклоспорина А на грибы, которые могут быть использованы для скрининга.

В результате сопоставления морфологических изменений, вызываемых циклоспорином А у чувствительных к нему культур грибов сделан вывод о способности циклоспорина А являться индуктором диморфизма у грибов.

Обнаружено, что антагонистический эффект на антифунгаль-ную активность циклоспорина А антибактериальных макролидов и некоторых других соединений зависит от последовательности контакта циклоспорина А с этими соединениями.

Обнаружена способность циклоспорина А нарушать проницаемость цитоплазматической мембраны A. niger и резко усиливать по этому тесту эффект липосомального препарата амфотери-цина В.

Впервые показано, что экзогенный циклоспорин А нарушает проницаемость мембраны протопластов своего продуцента - Т. inflation. Степень нарушения находилась в обратной зависимости от продуктивности штамма.

Обнаружено в опытах с A. niger, что циклоспорин А является ингибитором активности протеолитических ферментов in

vivo и in vitro.

Впервые испытано действие новых иммуносупрессоров природного происхождения, находящихся на стадии изучения, на некоторые из перечисленных эффектов циклоспорина А.

Научно-практическая значимость исследования заключалась в разработке биотест-системы для выявления и первичной оценки отбираемых при скрининге веществ с иммуносупрессорной активностью. Разработанные тесты (в их совокупности) позволяют быстро, исходя из данных, полученных на модельных объектах -грибах, делать предварительную оценку сходства и различий по биологическим эффектам между циклоспорином А и новыми, еще не идентифицированными агентами.

Резкая стимуляция циклоспорином А действия на проницаемость цитоплазматической мембраны A. niger липосомального амфотерицина В может служить новым направлением исследований в области комбинированной антифунгальной химиотерапии. Подробное изучение этого явления может привести к уменьшению концентрации в макроорганизме каждого из компонентов, используемых в комбинации при лечении, а значит и к уменьшению побочных эффектов. Важную роль здесь могут иметь аналоги циклоспорина А, лишенные иммуносупрессорной активности.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА 1 Вторичные метаболиты микроорганизмов. Новые аспекты их использования и проблемы скрининга.

Почвенные микроорганизмы, прежде всего грибы, актиномице-ты и эубактерии во второй половине нашего века стали постоянным источником биологически активных вторичных метаболитов, находящих самое разнообразное практическое применение. Особенно велико их значение в различных областях медицины. К настоящему времени описано около двадцати тысяч индивидуальных природных низкомолекулярных веществ, относящихся к вторичным метаболитам, проявивших те или иные виды биологической активности. Большинство из них известны как антибиотики (41) и им с большим или меньшим основанием применительно к тем или иным структурам приписывается как основная функция подавление роста конкурентов в природных биоценозах. Это не означает, однако, что антибиотики, по крайней мере многие из них, не могут иметь регуляторных функций в цикле развития их продуцентов, являться сигнальными молекулами при перестройке метаболизма в ответ на меняющиеся условия окружающей среды (12,20,21,22).

В течение 40-х - 60-х годов открываемые вторичные микробные метаболиты отбирались по антибиотической активности и изучались именно как антибиотики. В соответствии с этим, при слабой активности, узком спектре антибиотического действия или неудовлетворительном химиотерапевтическом индексе, т.е., в целом, неспособности конкурировать с уже внедренными в клинику препаратами - изучение прекращалось. Для подобных новых структур сохранялось значение лабораторных или биохимических реагентов и возможность немедицинского применения.

С 60-х-70-х годов интерес к вторичным микробным метаболитам стал более широким. С этого времени микроорганизмы целенаправленно изучаются как продуценты не только антибиотиков, но и ценных для клиники фармакологически активных веществ, корректоров метаболизма клетки млекопитающих. Это находит отражение в обобщенных данных, в которых сопоставляются по годам количество описанных и изучаемых антибиотиков и биологически активных метаболитов, не имеющих антимикробных свойств (к последним принято относить также вещества с очень слабо выраженными и лишь в особых условиях проявляющимися антибиотическими свойствами).

В 1990 году количество описанных за год веществ, принадлежащих ко второй группе, впервые превысило количество, описанных за этот год антибиотиков (41). Эта тенденция сохраняется и в последние годы.

Классификация по биологической активности не относимых к антибиотикам вторичных микробных метаболитов является в известной мере условной. Она зависит не только от особенностей и глубины изучения механизма их действия, но отражает направление работы и интересы конкретных исследовательских групп. Примером здесь могут служить постоянно употребляемые рубрики «ингибиторы ферментов», «антиметаболиты», «фармакологически активные вещества», по крайней мере, частично налагающиеся друг на друга, поскольку они могут отражать функции одного и того же вещества на биохимическом, молекулярном или физиологическом уровне (4,6,7,28,41). Усложняет положение с классификацией и то обстоятельство, что понятие слабой антибиотической (в данном случае антимикробной) активности довольно неопределенно и не имеет строгого количественного критерия.

Все это наглядно иллюстрируется рисунками в проблемной

статье Берди (ХВегду) (41), в которой утверждается, что перекрывание одними терминами других означает, в частности, и то, что известное первоначальное определение понятия «антибиотик» в какой-то мере уже изжило себя, Так называемые, побочные эффекты некоторых антибиотиков, механизмы действия которых сейчас раскрываются, привлекают внимание с новых позиций. Задачей становится не их преодоление, а наоборот, использование для целенаправленного воздействия на клетки специализированных человеческих тканей.

В настоящее время, в соответствии с программами направленного скрининга среди вторичных метаболитов ведется поиск ингибиторов и (косвенно) стимуляторов самых разнообразных метаболических реакций в клетках млекопитающих. Многие из них признаны перспективными для решения проблемы борьбы с разного рода обменными заболеваниями (7,14,15). Наибольшие практические успехи достигнуты в результате поиска избирательно и обратимо действующих имму-носупрессорных агентов. Получены были: циклоспорин А, РК506, ра-памицин, а также некоторые другие, менее изученные, но уже проходящие пред клинические и�