Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Олигомицины, биологическое действие и новые продуценты

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Олигомицины, биологическое действие и новые продуценты"

На правах рукописи

Грамматикова Наталия Эдуардовна

ОЛИГОМИЦИНЫ, БИОЛОГИЧЕСКОЕДЕЙСТВИЕ И НОВЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ

03.00.23 - биотехнология 14.00.31 - химиотерапия и антибиотики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии «Государственном Научном Центре по Антибиотикам».

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, с.н.с. Бибикова М.В.

доктор медицинских наук Катлинский А.В.

доктор биологических наук проф. Градова Н. Б.

доктор биологических наук с.н.с. Лапчинская О. А.

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится 2005 года в часов на заседании

диссертационного совета Д М 212.204.0 в РХТУ им. Д.И. Менделеева (125047 Москва, Миусская пл., д.9) в аудитории

С диссертацией можно ознакомится в Информационном библиотечном центре РХТУ имени Д.И. Менделеева.

Автореферат диссертации разослан

2005 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

ДМ 212.204.13 кандидат технических наук

Формат 60 х 94/16. Объем 1,5 печ л. Тираж 100 экз. Заказ № 11 Типография «Атомполиграфсервис» Москва, ул Нагатинская Д.4А Тел 111-24-48

Шакир И.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время в биотехнологии новых природных соединений наблюдается смещение акцента к поиску фармакологически активных соединений, механизм действия которых основан на регуляции определенных ферментных систем клетки. Эта тенденция связана с развитием фундаментальных исследований природы различных неизлечимых заболеваний, включая аутоиммунные, опухолевые, сердечно-сосудистые. Новые знания о природе заболеваний определяют и подход к поиску биологически активных соединений. Важнейшим моментом становится изучение известных структур с точки зрения новых знаний и новых тестов.

В последнее время резко возрос интерес к макролидным антибиотикам, в том числе подавляющим активность FoF1-АТФазы. К этим антибиотикам, общим элементом структуры которых являются близкие макролидные агликоны, относятся олигомицины, оссамицин, цитоварицин, рутамицин и апоптолидин.

О синтезе комплекса олигомицинов культурой Streptomyces diastatochromogenes появились публикации в 1954 г. В дальнейшем были идентифицированы такие структуры как оссамицин, цитоварицин, олигомицины D-G, и их близкие аналоги, продуцируемые стрептомицетами: X hygroscopicus var.ossamycetius С 8158, 8 sp. WK-6150, 8 bottropensis, 8 ауеттШШ. Многие новые продуценты и антибиотики олигомициновой группы защищены патентами. Об образовании антибиотика олигомициновой группы апоптолидина, продуцируемого редким микроорганизмом Nocardiopsis sp. было сообщено в 1997 г. Вся группа рассматриваемых антибиотиков обозначается как группа олигомицинов по названию первого соединения, выделенного из культуральной жидкости Streptomyces diastatochromogenes. Ввиду интересных особенностей их биологических свойств проводятся работы по получению полусинтетических аналогов этих антибиотиков. Осуществлен полный синтез некоторых из них. Проводятся исследования по изучению их биологической активности.

Рассматриваемые макролидные антибиотики обладают выраженным антифунгальным действием. МПК антибиотиков олигомициновой группы в отношении многих мицелиальных грибов, включая патогенные, находятся в пределах 0,1-1,0 мкг/мл. Некоторые продуценты олигомициновых антибиотиков были выделены при поиске ингибиторов фитопатогенных грибов. Так олигомицин F проявил высокую активность в отношении Fusarium culmorum, Erysiphegraminis и др.

Показано, что олигомицины проявляют иммунодепрессивную активность. Она четко выражена у олигомицинов А, В, С, олигомицина F и 41-деметилгомоолигомицина В. В экспериментах in vitro олигомицины ингибировали активацию лимфоцитов в смешанной пробе в концентрации 0,1 мкг/мл. Оба антибиотика в очень низких концентрациях ингибировали продукцию IgG. Эти данные свидетельствуют, что олигомицины А и F являются потенциальными супрессорами В-клеток. Показана высокая активность олигомицина F в отношении линии Meth А клеток саркомы.

Для поиска новых препаратов существует несколько подходов, в том числе: расширение известных классов антибиотиков, переоценка их действия и, в дальнейшем, получение на их основе полусинтетических производных.

Макролидные антибиотики, структурно подобные олигомицину, широко исследуются. Установлены многие специфические свойства этих антибиотиков. Особый акцент уделяется способности этих антибиотиков влиять на апоптоз, проявлять иммунодепрессивную активность, селективную цитотоксичность в отношении раковых клеток, подавлять открытие запасных кальциевых каналов, блокировать Cl-активированный поток через мембраны.

Поиск и изучение соединений макролидной природы с иммунодепрессивными свойствами позволил расширить представления о биологическом действии аналогов олигомицина А в связи с их структурными особенностями и перспективностью их клинического применения.

Цель работы. Целью данной работы были поиск и изучение иммуносупрессоров макролидной природы, синтезируемых актиномицетами, изучение условий биосинтеза этих соединений и их биологического действия.

Для осуществления этой цели потребовалось решение следующих задач исследования:

1. Провести скрининг продуцентов иммуносупрессоров макролидной природы среди актиномицетов.

2. Провести изучение биологических свойств отобранных соединений.

3. Провести микробиологическое изучение и создание условий биосинтеза изучаемых антибиотиков, включая:

а) изучение культурально-морфологических свойств и идентификацию продуцентов;

б) получение линий продуцентов, превышающих исходные по образованию антибиотика.

в) изучение условий биосинтеза для отобранных штаммов, создание метода культивирования отобранных при скрининге штаммов.

Научная новизна. В результате проведенного скрининга были найдены новые продуценты соединений макролидной природы, относящиеся к структурным аналогам олигомицина.

Изучен новый продуцент олигомицинового комплекса А, В, С, продуцент олигофусцина (нового аналога олигомицина А) и новый продуцент олигомицина F.

1. Определены соединения составляющие комплексы BSK-14, BSK-17 и BSK-31, и изучены их биологические свойства.

2. Впервые показана особенность действия различных концентраций олигомицина А на дерматофитные грибы и Malasseziafurfur ATCC 14521.

3. Проведено сравнительное исследование действия олигомицинов А, В, олигофусцина и олигомицина F на Candida albicans ATCC 885653.

4. Проведена сравнительная оценка противоопухолевой активности выделенных олигомицинов.

5. Для продуцентов 182, 162 и 31 путем селекции были получены линии с активностью превышающей исходные штаммы.

6. Созданы среды для культивирования и отработаны оптимальные условия биосинтеза, для максимального накопления антибиотиков продуцентами.

В результате скрининга выделен оригинальный продуцент олигомицинового комплекса А, В, С Streptomyces albogriseolus 182 (Benedict et al. 1954), ранее не описанный в качестве продуцента олигомицинов. Продуцент синтезирует комплекс олигомицинов А, В, С в соотношении 80:15:5. Охарактеризован продуцент Streptomyces virginiae 162 (Grundy et al, 1952), синтезирующий иммунодепрессивное соединение отличающийся от олигомицина А заместителями в 7 и 10 положении. Отобран оригинальный продуцент Streptomyces virginiae 31, синтезирующий олигомицин F описанный ранее как иммуносупрессивный агент. Изучены антибиотические свойства отобранных соединений.

В процессе изучения сравнительной эффективности структурных аналогов олигомицина впервые была определена специфичность их действия на дерматофитные грибы и дрожжи. Выявлено, что определенные для каждого аналога низкие концентрации подавляют рост этих грибов, средние не оказывают влияния, а более высокие вновь ингибируют рост.

Впервые определена специфичность действия аналогов олигомицина - А, В, олигофусцина и F, на подавление роста Candida albicans ATCC 885653 показано, что на среде без глюкозы все изучаемые олигомицины, кроме олигомицина В, усиливают свою активность.

Выделенные олигомицины проявляют выраженный иммунодепрессивный эффект.

Олигофусцин не индуцируя апоптоз покоящихся лимфоцитов, значительно усиливал апоптоз лимфоцитов, стимулированных ФГА, а также клеток линии Jurkat и мононуклеаров крови больных лимфобластным миелолейкозом.

При изучении таксономического положения и определении нуклеотидных последовательностей 16S рРНК-генов установлено, что культура 182 относится

к S. albogriseolus 182, культура 162 к Streptomyces virginiae 162, культура 31 к S. virginiae 31.

В результате физиолого-биологических исследований созданы среды и условия культивирования продуцентов (олигомицины А, В, С, Б и олигофусцин).

Работа проводилась в рамках программы МЗ РФ "Получение новых перспективных для клиники иммуносупрессоров микробного происхождения и установление механизма их действия на субклеточном и молекулярном уровне" утвержденной на Межведомственном Научном Совете.

Научно-практическая значимость работы. Результаты работ имеют значение для проведения скрининга аналогичных соединений, а также для развития работ по выявлению взаимосвязи между структурой и функцией в ряду антибиотиков олигомицинового ряда и послужить основой для создания терапевтических средств для использования в фармакологии.

Апробация работы. Итоги научно-исследовательской работы, составляющие основу диссертации, были доложены на I съезде Микологов России (Москва 2002), 1 и 2 Международном Конгрессе "Биотехнология -состояние и перспективы развития". (Москва 2002, 2003), Международной Конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск 2001), 1 и 2 Всероссийском Конгрессе по Медицинской Микологии, (Москва 2003, 2004), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ. (Москва 2001), 1У-м съезде дерматологов и венерологов республики Беларусь. (Гомель 2001), 6-м Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (С-Петербург 2003), на семинарах ФГУП ГНЦА.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 144 страницах, включают 36 таблиц, 28 рисунков, 7 фотографий и приложение. Список цитируемых

источников включает 145 наименования отечественной и иностранной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Объект исследования. Объектом исследования служили штаммы, выделенные из почвенных образцов различных регионов. При первичной оценке антигрибной активности культуральных жидкостей и находящихся на разных стадиях выделения образцов исследуемых антибиотиков использовали штамм Aspergillus niger 137а. В качестве тестов для определения спектра антимикробного действия использовали следующие культуры из коллекции культур ГНЦА: Aspergillus fumigatus 132a, Tolypocladium inflatum 2223, Fusarium oxysporum 54, Curvularia lunata 645, Trichoderma alba F-32, Penicillium brevicompactum 234, Trichophyton rubrum ВКПГ248/700, Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale ВКПГ 268, Microsporum canis ВКПГ 326/316, Candida albicans ATCC 885-653, Malassezia furfur (Pityrosporum ovale) ATCC 14521..; Staphylococcus aureus ФЕСС 29213, Staphylococcus aureus 6538, Staphylococcus aureus 209P, Escherichia coli ATCC 25922, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus subtilis Var Л2 Bacillus cereus Var mycoides HB, Bacillus cereus var mycoides luteus 537, Bacillus pumilis NCTC 8241.

Методы исследования. Посев образцов почв проводили из разведений с последующим высевом на питательные среды, содержащие 100 мкг/мл эритромицина ("синтез АКОМ"). Для поддержания и выращивания штаммов актиномицетов использовали овсяную среду и среду Гаузе 1, с добавлением эритромицина (производство Синтез АКОМ) в дозе 100 мкг/мл среды. В процессе поиска для культивирования отобранных актиномицетов использовали жидкую питательную среду Ml.

Биосинтез антибиотических комплексов. Засев среды проводили агаровым блоком выросшей культуры. В глубинных условиях исследуемые культуры стрептомицетов выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, со 100 мл питательной среды в течение 6 суток при 28 °С - на начальных этапах

исследования в питательной среде Ml и в последствии на разработанных индивидуально для каждого продуцента средах.

Образование антибиотических комплексов оценивали по активности ацетоновых экстрактов из мицелия продуцента в отношении тест-микроорганизмов и по интенсивности пятен, полученных методом ТСХ на пластинках Silufol (Чехословакия) в системе: бензол-ацетон (2:1). Проявляли в парах йода и оценивали интенсивность пятен в сравнении с лабораторными образцами индивидуальных соединений или антибиотических комплексов. Для биопроявления пластинку с нанесенным образцом после разделения в указанной системе помещали в лотки с агаровой средой, содержащей споры Aspergillus niger 137а., выдерживали 20 минут, удаляли, инкубировали в термостате при 37 °С в течение 15-18 часов. Активности фракций оценивали по диаметрам зон подавления роста тест-организма.

Для выделения антибиотических комплексов биомассу отделяли центрифугированием. Антибиотические комплексы экстрагировали, экстракт отделяли и удаляли растворитель до водного остатка. Водный остаток реэкстрагировали в хлороформ, реэкстракт концентрировали. Из остатка осаждали антибиотические комплексы петролейным эфиром. Осадок отделяли, промывали гексаном и сушили в вакуум сушильном шкафу при 40 °С.

Для фракционирования полученные антибиотические комплексы растворяли в метаноле. Комплексы разделяли на составляющие фракции с использованием колоночной хроматографии. Каждую фракцию проверяли на антигрибную активность. Биологически активные фракции были охарактеризованы на однородность, по Rf, УФ, ИК спектрам. Для выделения олигомицинов А. В. С. комплекс BSK-14, выделяли из мицелия ацетоном (4 объема растворителя на 1 объем биомассы). Экстракт концентрировали, прибавляли избыток петролейного эфира и выдерживали в холодильнике до осаждения препарата. Выпавший осадок отфильтровывали и сушили. Полученный антибиотический комплекс разделяли на индивидуальные компоненты с помощью препаративной ВЭЖХ. Эта часть препаративной

процедуры выполнялась научным сотрудником института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Даниленко А.Н.

Выделение олигофусцина (Sell). Экстракцию комплекса BSK-17 из мицелия проводили двукратно ацетоном при соотношении 2:1 (ацетон - биомасса). Из объединенных экстрактов удаляли ацетон, реэкстрагировали хлороформом. Из хлороформенного экстракта удаляли растворитель до масляного остатка, растворяли в метаноле, центрифугировали и метанольную фазу разделяли методом ВЭЖХ.

Выделение олигомицина F. Экстракцию комплекса BSK-31 из мицелия ацетоном осуществляли в соотношении 1:4 (мицелий: ацетон соответственно), фильтровали. Ацетон удаляли. Из водной фазы экстрагировали антибиотический комплекс хлороформом (на одну часть водной фазы брали одну часть хлороформа). Фазу хлороформа отделяли, экстракт концентрировали до масляного остатка. Масло растворяли в петролейном эфире. Выпавшие кристаллы антибиотика отделяли, высушивали, растворяли в метаноле и прибавляли при перемешивании равный объем дистиллированной воды. Раствор выдерживали при -15 °С в течение 15 часов полученные кристаллы растворяли в метаноле и разделяли методом полупрепаративной ВЭЖХ.

Оценка биологической активности антибиотических комплексов и отдельных фракций BSK-14. BSK-17 и BSK-31. Определение спектра антибиотической активности проводили в соответствии с методикой рекомендованной Государственная фармакопея СССР. Активность исследуемых образцов в отношении всех тест-микроорганизмов определяли методом диффузии в агар. Растворы исследуемых образцов использовались в концентрациях 0,1 мкг, 1 мкг, 10 мкг, 100 мкг. Об антибиотической активности судили по зонам подавления роста тест-культур.

Определение активности (МПК) сырцов препаратов и фракций в отношении Candida albicans ATCC 885-653 и Malassezia _furfur (Pitvrosporum ovale) ATCC 14521. В качестве препарата сравнения при определении

антидрожжевой активности был использован клотримазол ("Акрихин") в концентрации 0,05 мкг/мл. Жидкую среду с исследуемыми образцами в концентрациях 0,1 мкг/мл; 1 мкг/мл; 10 мкг/мл и 50 мкг/мл и контрольную без антибиотика засевали 0,1 мл двухсуточной суспензией клеток Candida albicans или Malasseziafurfur содержащей 1x103 колония образующих единиц (КОЕ) в миллилитре (КОЕ/мл) подсчитанных в камере Горяева.

Для определения таксономического положения выделенных культур актиномицетов определяли родовую принадлежность по морфологическим признакам: вид спороносцев методом световой и электронной микроскопии, характер роста на наборе сред, химический состав клеточной стенки. Для идентификации выделенных культур использовали определители (Bergeys, Manual, 1980, Г.Ф. Гаузе, Т.П. Преображенская, 1983). Видовую принадлежность уточняли также с помощью молекулярно-биологических методов по нуклеотидным последовательностям гена 16S рибосомальной ДНК. Экстракцию ДНК проводили по методике, разработанной Поспихом и Нойманном для грам-положительных бактерий (Pospiech A., Neumann В 1995), с некоторой модификацией. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в качестве исходных взяли условия (состав реакционной смеси, температуру и продолжительность стадий), разработанные Сонг и Ли (Song J, Lee S-C 2004) для рибосомальных генов актиномицетов. Затем условия были несколько модифицированы для достижения большей концентрации и чистоты ампликона. Праймеры заказывали в ЗАО "Синтол", в соответствии с последовательностями, подобранными по базе данных "The European ribosomal RNA database" и публикации (Song J., Lee S.-C. 2004) с соавторами, для амплификации 16S участка использовали пару праймеров 3474 и 3475 и 1427.

Для оценки качества ПЦР-продукта проводили электрофорез в 1% агарозном геле, содержащем бромид этидия, наблюдали полосы ПЦР-продукта с помощью трансиллюминатора. Проведение секвенирования: концентрацию очищенного ПЦР-продукта определяли визуально, сравнивая с маркером известной концентрации на 1% агарозном геле, содержащем бромид этидия.

Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН, организованном при поддержке РФФИ (грант №00-04-55000). Электрофореграммы получали в виде *.abi файлов, которые редактировали в текстовом формате с помощью программы Chromas. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили вручную с помощью пакета BioEdit 4.8.9 9 Hall. Филогенетический анализ проводили на основе критерия максимальной парсимонии при помощи программного пакета MEGA 2.1.

Селекция продуцентов Streptomyces albogriseolus №182, Streptomyces virginiae 162 и Streptomyces virginiae 31. Изменчивость штаммов изучали на наборе сред для актиномицетов, оценивали через 7-14 суток роста. Уровень антибиотикообразования определяли для 10-15 клонов. Образование антибиотика оценивали по активности ацетоновых экстрактов мицелия в отношении Aspergillus niger 137а или Candida albicans ATCC 885-653 и методом ТСХ. Для проведения индуцированной селекции использовали УФ облучение в дозах от 1000 до 4000 эрг/сек и антибиотики: олигомициновый комплекс А, В, С, доксициклин и рифампицин в различных концентрациях. Биосинтез антибиотического комплекса, образуемого Streptomyces albogriseolus №182, Streptomyces virginiae 162 и Streptomyces virginiae 31. В качестве среды для культивирования использовали горохово-крахмальную среду (M1) или разработанные для каждого продуцента среды. Количественное определение биомассы проводили гравиметрическим методом. Объемное содержание влажной биомассы в культуральной жидкости рассчитывали по формуле: ß(%) = Vвл.б./ ^.ж. х 100, где Vвл.б - объем влажного осадка после центрифугирования 10 мл пробы культуральной жидкости при 2000 об/мин в течение 10 мин., Vk-ж - объем культуральной жидкости (10 мл). Ошибка метода определения составляет 10% при п=11 и а=0,95. рН культуральной жидкости определяли потенциометрически. При разработке оптимального состава питательных сред использовали методы математического планирования эксперимента - метод случайного баланса и аддитивно-решетчатого описания

процесса (метод латинских прямоугольников). Проводили статистическую обработку результатов общепринятыми методами математической статистики с помощью электронных статистических программ Excel 97.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Поиск стрептомицетов устойчивых к эритромицину и проявляющих антифунгальную активность.

В процессе поиска, почвенные образцы из различных регионов рассевали на среды, содержащие 100 мкг/мл эритромицина, что позволило выделить 340 штаммов. Ацетоновые экстракты мицелия отобранных штаммов оценивали по антифунгальной активности в отношении Aspergillus niger 137а, успешно использованной при поиске иммуносупрессора циклоспорина. Из выделенных 340 штаммов были отобраны 3 штамма, проявляющие наибольшую антифунгальную активность. Препараты-сырцы штаммов 182, 162 и 31 получили рабочее название BSK-14, BSK-17 и BSK-31 соответственно. Изучение активности методом ФГА-индуцированной бласттрансформации показало выраженное иммунодепрессивное действие этих соединений в диапазоне концентраций 1-100 нг/мл. Изучение антимикробного действия ацетоновых экстрактов мицелия отобранных штаммов, показало, что в отношении Candida albicans ATCC 885-653 активен только BSK-31 начиная с дозы 1 мкг. Комплекс BSK-31, проявлял активность в отношении Bacillus cereus var. mycoides luteus 537 и в меньшей степени в отношении В. subtilis ATCC 6633 (таблица. 1).

Таблица 1. Антимикробная активность комплексных препаратов.

Тест-микроорганизм BSK-14 BSK-17 BSK-31

мкг в лунку

1 10 100 1 10 1 100 1 10 100

Диаметр зон подавления (мм)

Bacillus subtilis ATCC 6633 - - - - - 7 - ± 7

В. cereus var. mycoides luteus 537 - - - - - - - 7 10

Candida albicana ATCC 885-653 - - ± - - 10 17 30

Aspergillus niger 137a 11 15 25 13 16 28 12 18 226

Staphvlococcus aureus 209P - - - -

Escherichia coli ATCC 25922 - - - - - - - -

Таким образом, три отобранные культуры (182, 162 и 31) оказались схожи в устойчивости к эритромицину и продуцировали антибиотики с антифунгальной и иммунодепрессивной активностью, различающиеся по антимикробному спектру действия.

Идентификация отдельных компонентов антибиотических комплексов BSK-14, BSK-17 и BSK-31.

При изучении физико-химических свойств отобранных антибиотических комплексов, проведенных совместно с научным сотрудником Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля А.Н. Даниленко, было показано, что все соединения входящие в состав комплексов относятся к одной химической группе, а именно к семейству олигомицинов. Антибиотический комплекс Б8К-14, продуцируемый культурой Streptomyces 182 состоит из олигомицинов А, В и С в соотношении 80:15:5, соответственно. Определена структура олигомицина А, продуцируемого культурой 182. Следует отметить, что описанные в литературе штаммы X diastatochromogenes образуют комплекс олигомицинов А, В, С в соотношении 60:30:10, а X avermitilis образует комплекс с содержанием олигомицина А более 95%.

Из антибиотического комплекса Б8К-17 выделены и охарактеризованы два соединения, для одного из которых определена структура. Показано, что антибиотик отличается от олигомицина А заместителями в положениях 7 и 10. Новый антибиотик олигомицинового ряда не был охарактеризован ранее по антибиотическому спектру действия. В японском патенте представлено сходное соединение под названием олигомицин II, и описывается только его противоопухолевое действие (в отношении клеточной линии Р 388). Соединение названо нами олигофусцин. Второе соединение по физико-химическим свойствам аналогично олигомицину О. Этот компонент синтезируется в очень низких концентрациях, и на этом этапе работы нам не удалось накопить его для полной химической идентификации.

Антибиотический комплекс Б8К-31 состоит из олигомицинов А, В и Б. Последний был описан и запатентован как иммуносупрессивное соединение по

<

\

реакции бласттрансформации активированных митогеном смеси лимфоцитов. Соотношение этих компонентов комплекса олигомицинов А Вир было -72: 6: 22 соответственно.

Таким образом, в результате проведенного скрининга были выделены новые штаммы стрептомицетов, продуцирующие соединения олигомицинового ряда. При этом, помимо олигомицина А, были выделены его аналоги -олигомицин р и олигофусцин (8е II).

Биологическая активность выделенных комплексов и индивидуальных компонентов.

При изучении антимикробной активности отобранных соединений было показано, что они обладают различным спектром действия как на грибные тесты, включая дрожжи, так и на бактериальные (таблица.2).

Таблица 2. Антимикробная активность выделенных олигомицинов.

Тест-микроорганизм Антибиотики

МПК (мкг)

A В олигофусцин F

Aspergillus niger\37 а 0,5 1 0,5 0,01

Candida albicans ATCC 885653 10 - - 0,5

Bacillus subtilis ATCC 663 - - >50 10

В. cereus var. micrococcus luteus 537 - - >50 0,5

B. cereus var. mycoides HB - - >50 1

B. pumilis NCTC 8241 - - >50 1

Как видно из таблицы 2, самым широким антибиотическим спектром обладал олигомицин р. Это соединение отличается от олигомицина А заменой радикалов в трех положениях: -СН3 вместо Н, - Н вместо СН3 и Я6 - Н вместо СН3. Олигомицин В проявлял активность только в отношении A, niger 137а и не был активен в отношении остальных представленных в таблице 2 тест-культур. Олигомицин В, как известно, отличается от олигомицина А только по изменению заместителем в положении Я4, у олигомицина В находится гидроксильная группа вместо водорода. Олигофусцин отличается от олигомицина А в положениях Я7 и где О меняется на ОН и СН3 на Н соответственно для олигомицина А и олигофусцина (рис. 1).

40 R, 37 Я6

i ^3» j ! I

ОН О OH R/

: H '45

Олигомицин R. R2 R3 R, R 5 R« Rt r8

А Н СНз н Н он СНз о СНз

В Н СНз н ОН он СНз о СНз

F СН3 Н н н он н о СНз

G Н СНз н н он СНз о СНз

олигофусцин Н СНз н н он СНз он Н

Рис. 1. Химическая структура олигомицинов A-G и олигофусцина.

При изучении действия олигомицинов в отношении Candida albicans выявлено, что олигофусцин, не ингибирующий рост этого микроорганизма, растущего в присутствии глюкозы, в отсутствии глюкозы проявляет ингибирующее действие. МПК олигофусцина на среде без глюкозы составила 1 мкг, действующая доза олигомицина А в этих условиях снизилась в 10 раз, а олигомицина F - в 5 раз. Олигомицин В не влиял на рост Candida albicans в дозе до 10 мкг (таблица 3).

Таблица 3. Действие выделенных олигомицинов в отношении Candida albicans на средах с глюкозой и без глюкозы.

Препарат МПК препарата (мкг/мкл)

На среде:

С глюкозой Без глюкозы

Олигомицин А 10 0,1

Олигомицин В - -

Олигофусцин 1

Олигомицин F 0,1 0,05

Выявлена особенность действия комплекса олигомицинов А, В, С на дерматофиты Trichophyton rubrwn, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis и на Malassezia furfur. При воздействии 0,01-1 мкг/мл олигомицинового комплекса на эти грибы проявляется выраженный ингибирующий эффект. Повышение концентрации снижает активность комплекса. Аналогичные результаты получены при действии комплекса олигомицинов А, В, С на Malassezia furfur. МПК комплекса на этот тест микроорганизм составила 1 мкг/мл. Увеличение концентрации от 10мкг/мл не наблюдалось подавления роста, повышение концентрации до 50 мкг/мл и выше вновь проявляется антибиотическая активность комплекса олигомицинов А, В, С. Такой эффект не был описан ранее для комплекса олигомицинов.

Совместно с сотрудниками лаборатории, возглавляемой проф. А.А. Ярилиным института иммунологии (Минздрав РФ), проводили изучение действия отобранных соединений олигомицина А и олигофусцина на трансформированные клетки линии Jurkat и мононуклеары крови больных лейкозом в дозах от 1 до 100 нг/мл с максимумом эффекта при концентрации 10 нг/мл. Наиболее значимый эффект был получен от действия олигофусцина. Выявлено, что инкубация мононуклеаров крови человека с олигофусцином не влияет на апоптоз покоящихся лимфоцитов, но усиливает апоптоз активированных к трансформированных клеток. Доля апоптотических клеток, стимулированных фитогемагглютининами (ФГА), возрастала с 4,4% до 15,3%. При изучении влияния олигомицина на апоптоз клеток линии Jurkat определено, что процент апоптотических клеток увеличивался с 14,1 до 23,5%. Олигофусцин значительно усиливал ранний апоптоз мононуклеаров крови больных лимфобластным миелолейкозом (с 1,5% до 23,3%). Совместно с д.б.н. Ю.Н. Корыстовым (лаборатория регуляции пролиферации и гибели клеток; Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН г. Пущино) показано, что олигомицины вызывают гибель клеток Р388 по типу апоптоза: олигомицин В при концентрациях больше 1, а олигофусцин — больше 3 нг/мл. Исследование действия олигофусцина на множественную лекарственную

устойчивость клеток линии Р388 при анализе по устойчивости к винкристину показало, что препарат является эффективным ингибиторами МЛУ клеток лимфолейкоза Р388ВР.

Таксономическое положение культур продуцентов Б5К-14, Б5К-17и Б5К-31.

На основании изучения культурально-морфологических признаков и физиологических свойств штамм 182 продуцент комплекса BSK-14 (олигомицины А, В, С) был отнесен к виду 81геритусез albogriseolus. Штамм 162 продуцент комплекса BSK.-17 (олигофусцина и олигомицина G) по морфологическим признакам наиболее близок к lavendulae и у^тае. Штамм 31, продуцент комплекса BSK-31 (олигомицины А, В, F), наиболее близок к racemochromogenes и lavendulae или у^Шае. Продуценты олигомицинов среди представителей этих видов ранее не были описаны.

Для уточнения видовой принадлежности штаммов проведен анализ участка нуклеотидных последовательностей ^ рРНК.

После проведения секвенирования и бласт-поиска, для полученных нуклеотидных последовательностей ДНК было установлено полное сходство штамма 182 (продуцент BSK-14) с соответствующими последовательностями albogriseolus ^-24-25-1, JCM 4616). Для штаммов 162 (продуцент BSK-17) и 31 (продуцент BSK-31) было выявлено полное сходство с соответствующими последовательностями virginiae ^85118, D85122), а также отличие с lavendulae ^85 111, D85115, D85116) лишь в одной нуклеотидной позиции.

Учитывая морфологические характеристики и результаты, полученные молекулярно-биологическим методом, можно заключить, что штамм 182 относится к виду - 5. albogriseolus, штаммы 162 и 31 были отнесены к Streptomyces virginiae.

Полученные нами результаты подтверждают известный факт, что одни и те же антибиотики могут образовываться разными видами микроорганизмов. В литературе описано 3 продуцента олигомицинового комплекса А, В, С: Streptomyces diastatochromogenes, 8. avermitilis и недавно описанный libani.

Олигофусцин (Sell) образуется грам-отрицательной энтеробактерией Pantoea agglomerans.

Применение генетико-селекционных методов для повышения продуктивности выделенных культур.

Начальная активность штаммов не превышала 10-20 мкг/мл. Для повышения продуктивности проводили селекцию естественных клонов по признаку антибиотикообразования и использование ступенчатой селекции с применением в качестве мутагенных факторов УФ облучения и антибиотиков.

При изучении естественной изменчивости культур была выявлена гетерогенность популяции, как по морфологическим признакам, так и по признакам антибиотикообразования при культивировании на минеральных и органических агаризованных средах. Селекция культур S. albogriseolus 182, S. virginiae 162 и S. virginiae 31 проводилась с морфологическими вариантами, проявившими максимальную способность к антибиотикообразованию. Продуценты S. albogriseolus 182 (олигомицины А, В, С), S. virginiae 162 (олигофусцин и олигомицин G) образуют преимущественно олигомицины проявляющие антифунгальную активность, в отношении которой проводили отбор активных естественных вариантов. Штамм S. virginiae 31 синтезирует комплекс олигомицинов А, В и F. Изучение биологической активности показали, что олигомицин F в отличие от остальных выделенных нами олигомицинов проявляет высокую активность в отношении Candida albicans. В качестве критерия селекции продуцента с преимущественным синтезом олигомицина F использовали его способность подавлять рост Candida albicans.

При изучении летального мутагенного эффекта УФ-облучения определено, что для культуры S. albogriseolus 182 оптимальная доза облучения при максимальной морфологической изменчивости, составила 3000 эрг/сек. Для естественного варианта культуры S. virginiae 162, обладающего большей чувствительностью, оптимальная доза облучения составила 2000 эрг/сек. При использовании УФ облучения был получен клон 1461 культуры S. albogriseolus

182, продуцирующий 300-350 мкг/мкл олигомицинового комплекса А, В, С. Клон 17-15 культуры у^тае 162 превосходил уровень

антибиотикообразования исходного штамма в 5 раз и составил 50 мкг/мл. Этот клон отличался от исходного варианта более медленным ростом и слабо развитым воздушным мицелием. При микроскопии растущего на агаризованной среде варианта 17-15 наблюдалась дифференциация мицелия на палочковидные и кокковидные клетки. При росте в жидкой питательной среде наблюдалось дифференциация мицелия на палочковидные фрагменты. Активность культуры регистрировалась только в стадии палочковидной фрагментации, что затрудняло работу с продуцентом.

Изучение влияния на изменчивость исследуемых культур комплекса олигомицинов, антибиотика тетрациклинового ряда (доксициклина), а также ансамициновой группы рифампицина, определено, что наибольшее влияние при отборе высокоактивных вариантов изучаемых культур albogriseolus 182 и 5. у^тае 162 проявил рифампицин. Таким образом, применение УФ облучения с последующим рассевом на фоне селектирующего агента рифампицина, позволило отобрать варианты, превышающие исходный уровень антибиотикообразования, для 5. albogriseolus 182 клоны 146\14 и 146\19 с активностью составившей 600-700 мкг/мл. Для 5. у^тае клон 17-15-9 с продуктивностью 150 мкг/мл.

Изучение совокупности морфологии и антибиотикообразования позволил выявить корреляцию между этими признаками для высокопродуктивных штаммов. Наибольшее выражение морфологического типа и антибиотикообразования определено для варианта культуры 5. у^тае 162. Если для исходного штамма максимальное образование антибиотика было сопряжено с медленным ростом, слабо развитым воздушным мицелием, то для варианта 17-15-9 отмечалось наличие хорошо развитого воздушного мицелия. При культивировании в жидкой питательной среде не было отмечено дифференциации мицелия на палочковидные фрагменты, развитие при

инкубации на агаризованных и в жидких средах осуществлялось с образованием хорошо развитого мицелия, типичного для стрептомицетов.

Для Streptomyces albogriseolus 182, также выявлена корреляция морфологических признаков и антибиотикообразования. Для высокопродуктивных вариантов 146/14 и 146/19 было характерно образование воздушного мицелия ровного серого цвета без белых вкраплений, характерных для исходного варианта.

Изучениеусловий биосинтеза выделенныхштаммов-продуцентов.

Изучение условий образования антибиотиков выявил значительные отличия в предпочтении культур в источниках питательных компонентов. Культура albogriseolus 182 в качестве органического источника азота для оптимального биосинтеза использует овсяную муку и глюкозу. у^тае 162 не образует антибиотика при наличии в среде глюкозы и соевой муки. Культуре 5. у^тае 31 для образования олигомицина Б требуется пептон. При морфологическом изучении продуцентов было отмечено, что культура 5. у^тае 162 плохо растет на всех источниках углерода, за исключением мальтозы. Введение в среду культивирования мальтозы в концентрации 2% увеличило выход антибиотика олигофусцина в 1,5 раза. Установлено, что для оптимального биосинтеза олигомицина Б культурой 5. у^тае 31, помимо глюкозы необходимо введение подсолнечного масла в концентрации 2% к объему питательной среды. Использование неорганического азота культурами также оказывало значительное влияние на биосинтез антибиотиков. Культура 5. albogriseolus №182 при введении N^N0, в количестве 0,05% к объему культуральной жидкости увеличивала биосинтез олигомицинового комплекса А, В, С. В отличие от albogriseolus №182, культуры у^Шае 31 и у^тае 162, использовали для оптимального биосинтеза КК03 в концентрации 0,3 и 0,4% соответственно, от объема ферментационной среды. 5. у^тае 31 продуцент комплекса олигомицинов А В и Б, при введении КЫ03 в концентрации 0,3 % синтезируется преимущественно олигомицин Б.

Таким образом, с использованием монофакторного подбора и математические методы планирования эксперимента были созданы питательные среды для роста и биосинтеза штаммов S. albogriseolus 182 (высокоактивный вариант 146\14), S.virginiae 162 (высокоактивный вариант 117-15-9) и S. virginiae 31. Подобраны оптимальные условия культивирования для этих штаммов.

В итоге продуктивность штаммов в разработанных условиях составила:

S. albogriseolus 182 синтезировал олигомициновый комплекс А, В, С на уровне 1200 мкг/мл, продуктивность высокоактивного клона повышена в 1,7 раз. S. virginiae 162, синтезировал до 250 мкг/мл олигофусцина, что превосходило начальный уровень штамма на 60%. S. virginiae 31 синтезировал до 80 мкг/мл олигомицина F, что в 2,5 раза превосходило уровень биосинтеза на контрольной среде Ml.

Выводы

1. Отобраны 3 штамма, синтезирующие соединения с высокой антифунгальной и иммунодепрессивной активностью.

2. Определено, что культура Streptomyces albogriseolus 182 продуцирует олигомициновый комплекс — олигомицины А, В и С, в соотношении 80:15:5 соответственно; культура Streptomyces virginiae 162 синтезирует олигомициновый комплекс, состоящий из олигофусцина и минорного компонента, аналогичного олигомицину G; культура Streptomyces virginiae3\ синтезирует олигомициновый комплекс, состоящий из олигомицинов А, В и F, в соотношении - 72:6:22.

3. Впервые определена сравнительная антибиотическая активность выделенных соединений: МПК в отношении A. niger 137а составляет для олигомицина F - 0,01 мкг, олигомицина А, олигофусцина - 0,5 мкг и олигомицина В - 1 мкг. МПК в отношении Candida albicans ATCC 85-653 составляет для олигомицина F - 1 мкг, олигомицин А - 10 мкг. Олигомицин В и олигофусцин не проявляют активность в отношении Candida albicans.

4. Впервые показано, что на среде без глюкозы активность в отношении Candida albicans ATCC 85-653 олигомицина А, олигофусцина и олигомицина F возрастает. Олигомицин В не проявляет активности в отношении Candida albicans ATCC 85-653 растущей на среде в присутствии и отсутствии глюкозы.

5. Установлено, что олигофусцин в большей степени активирует апоптоз трансформированной клеточной линии Yurkat, чем олигомицин А. Олигофусцин не индуцирует апоптоз покоящихся лимфоцитов, но значительно усиливает апоптоз лимфоцитов, стимулированных ФГА.

6. Показано, что олигомицины вызывают гибель клеток линии Р388 по типу апоптоза: олигомицин В при концентрациях больше 1, а олигофусцин — больше 3 нг\мл.

7. Таксономическое определение культур с использованием фенотипических характеристик и определению нуклеотидных последовательностей 16S рРНК показало: штамм 182 отнесен к Streptomyces albogriseolus 182, штамм 162 отнесен к Streptomyces virginiae 162, штамм 31 отнесен к S. virginiae 31.

Эти культуры являются оригинальными продуцентами антибиотиков олигомицинового ряда.

8. В результате генетико-селекционных исследований получены варианты культур^. albogriseolus —с продуктивностью 600-700 мкг/мл, Streptomyces virginiae 162-с продуктивностью 150 мкг/мл.

9. Разработаны среды и подобраны условия культивирования, при которых: штамм Streptomyces albogriseolus 146/14, синтезирует комплекс олигомицинов А, В, С на уровне 1200 мкг/мл, штамм Streptomyces virginiae 17-15-9, синтезирует олигофусцин на уровне 250 мкг/мл, штамм Streptomyces virginiae 31, синтезирует олигомицин F в количестве 80 мкг/мл

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Катлинский А.В. Новый антидерматофитный препарат микробного происхождения.//

«Биотехнология на рубеже двух тысячелетий»: Материалы Международной Научной Конференции. Саранск, 2001- с.176-177.

2. Дмитриев ГА, Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Наволоцкая Т.И., Катлинский А.В. Первые результаты исследования нового антидерматофитного препарата микробного происхождения на культуре Malassezia (Pityrosporum).// Патогенез, диагностика, терапия и профилактика инфекций передаваемых половым путем и кожных заболеваний: Материалы IV съезд дерматологов и венерологов Республики Беларусь.- Гомель, 2001. - с.219-220.

3. Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Грамматикова Н.Э, Кабанов А.А., Использование модели отбора гиполипидемических соединений для поиска продуцентов иммуносупрессоровУ/ Современная микология России: Тезисы доклада. 1 съезд микологов России - Москва, 2002. - с.250-251.

4. Дмитриев Г.А, Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Наволоцкая Т.Н., Катлинский А.В. Микробиологические исследования действия нового антидерматофитного препарата микробного происхождения.// Вестник дерматологии венерологии - 2002, № 2. с. 7-9.

5. Дмитриев ГА, Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Наволоцкая Т.Н., Катлинский А. В. Изучение действия in vitro препарата БСК-14 на дрожжеподобные грибы, обнаруживаемые в перхоти У/ Тезисы доклада 1 съезд микологов России.- Москва 2002. - с. 226.

6. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Спиридонова И.А., Кабанов А.В., Катлинский А.В. БСК-14 - антибиотик с иммуносупрессивной активностьюУ/ Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тез. докл. 1-й Международный Конгресс - Москва 14-18 октября 2002. - с. 37-38.

7. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Кабанов А.В., Катлинский А.В. Изучение условий биосинтеза антибиотика БСК-14У/ Биотехнология - состояние и перспективы развития: Тез. докл. 1-й Международный Конгресс - Москва, 2002, - с. 223.

8. Бибикова М.В., Сазыкин Ю.О., Грамматикова Н.Э., Катлинский А.В. Иммуносупрессоры микробного происхождения.// Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - №5, с.25-32.

9. Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В., Спиридонова И.А., Кабанов А.Е., Катлинский А. В. Новый продуцент антибиотиков олигомициновой структуры Streptomyces griseolus 182. Таксономия, ферментация и выделение.// Антибиотики и химиотерапия. - 2003, - №6, с.11-15.

10. Кабанов А.Е., Даниленко А.Н., Спиридонова И.А.., Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Орехов С.Н., Катлинский А.В. Определение структуры основного компонента антибиотического комплекса, образуемого Streptomyces griseolus 182.//Антибиотики и химиотерапия. - 2003, - №10, с.16-20.

11. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Кабанов А.Е., Сазыкин Ю.О., Катлинский А.В.

Механизм биологической активности макролидных антибиотиков -ингибиторов Р0Б1 - АТФазы.// Антибиотики и химиотерапия. - 2003, - №12. с.33-40.

12. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э, Кабанов А.Е. Орехов СИ., Катлинский А.В. Макролидные антибиотики - ингибиторы - АТФазы: продуценты, структура, биологическая активность.// Биотехнология: состояние и перспективы: Тез. докл. II Московский Международный Конгресс, 2003. - с.85-86.

13. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Чмель ЯЗ., Катлинский А.В., К вопросу о специфике антигрибного действия антибиотика БСК-14.// Успехи медицинской микологии: Материалы первого всероссийского конгресса по медицинской микологии - Москва, 2003 - том 1, с. 233.

14. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Спиридонова И.А., Кабанов А.Е., Даниленко А.Н., Катлинский А.В. Антигрибные и иммуносупрессивные свойства антибиотика БСК-17. //Успехи медицинской микологии: Материалы второго всероссийского конгресса по медицинской микологии. - Москва, 2004, - с. 46-48.

i '' г. \

/ ?' V ' -■> I I - -, u t. "

\ y "V /

16 omm^ jy ° -

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грамматикова, Наталия Эдуардовна

ВВЕДЕНИЕ

1 ЧАСТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I МАКРОЛИДНЫЕ АНТИБИОТИКИ В АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ

V ТЕРАПИИ.

ГЛАВА II МАКРОЛИДЫ В СЕЛЬСКОМ ХОЗЯЙСТВЕ.

2.1.Тилози н.

2.2. Авермектин.

ГЛАВА III МАКРОЛИДЫ В ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ ТЕРАПИИ.

3.1. FK-506.

3.2. Рапамицин.

3.3. Различий между способами действия циклоспорина, FK506 и рапамицииа в связи со структурными особенностями.

3.4. Иммуносупрессор в стадии изучения.

ГЛАВА IV МАКРОЛИДЫ, ИНГИБИТОРЫ АТФаз.

4 1. Продуценты и структура макролидных антибиотиков ингибиторов Fo Fi -АТФазы.

4.2. Биологическая активность макролидных антибиотиков ингибиторов FoFi -АТФазы.

4.3. Механизм действия макролидных антибиотиков группы f олигомицинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Олигомицины, биологическое действие и новые продуценты"

В настоящее время в биотехнологии новых природных фармакологически активных веществ наблюдается смещение акцента к поиску соединений, механизм действия которых основан на регуляции определенных ферментных систем клетки. Эта тенденция связана с развитием фундаментальных исследований природы различных неизлечимых заболеваний, включая аутоиммунные, опухолевые, сердечно-сосудистые. Новые знания о природе заболеваний определяют и подход к поиску биологически активных соединений. Важнейшим моментом становится изучение известных структур с точки зрения новых знаний и новых тестов.

В последнее время резко возрос интерес к макролидным антибиотикам, в том числе подавляющим активность FoFi -АТФазы. К этим антибиотикам, общим элементом структуры которых являются близкие макролидные агликоны, относятся олигомицины, оссамицин, цитоварицин, рутамицин и апоптолидин.

О синтезе комплекса олигомицинов культурой Streptomyces diastatochromogenes появились публикации в 1954 г. В дальнейшем были идентифицированы такие структуры как оссамицин, цитоварицин, олигомицины D-G, и их близкие аналоги, продуцируемые стрептомицетами: S. hygroscopicus var.ossamycetius С 8158, S. sp. WK-6150, S. bottropensis, S. avermitelis. Многие новые продуценты и антибиотики олигомициновой группы защищены патентами. Об образовании антибиотика олигомициновой группы апоптолидина, продуцируемого редким микроорганизмом Nocardiopsis sp. было сообщено в 1997 г. Вся группа рассматриваемых антибиотиков обозначается как группа олигомицинов по названию первого соединения выделенного из культуральной жидкости Streptomyces diastatochromogenes. Ввиду интересных особенностей их биологических свойств проводятся работы по получению полусинтетических аналогов этих антибиотиков. Осуществлен полный синтез некоторых из них. Проводятся исследования по изучению их биологической активности.

Рассматриваемые макролидные антибиотики обладают выраженным антифунгальным действием. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибиотиков олигомициновой группы в отношении многих мицелиальных грибов, включая патогенные, находятся в пределах 0,1-1,0 мкг/мл. Некоторые продуценты олигомициновых антибиотиков были выделены при поиске ингибиторов фитопатогенных грибов. Так олигомицин F проявил высокую активность в отношении Fusarium culmorum, Erysiphe graminis и др.

Показано, что олигомицины проявляют иммуносупрессивную активность. Она четко выражена у олигомицинов А, В, С, олигомицина F и 41-деметилгомоолигомицин В. В экспериментах in vitro олигомицины ингибировали активацию лимфоцитов в смешанной пробе в концентрации 0,1 мкг/мл. Для подавления митоген стимулированной пролиферации лимфоцитов периферической крови человека требовались дозы в 6 раз более высокие для олигомицина F и в 26 раз - для олигомицина А. Оба антибиотика в очень низких концентрациях ингибировали продукцию IgG Эти данные свидетельствуют, что олигомицины А и F являются потенциальными супрессорами В клеток. Показана высокая активность олигомицина F в отношении Meth А линии клеток саркомы.

Цель работы.

Целью данной работы были поиск и изучение иммуносупрессоров макролидной природы, синтезируемых актиномицетами, изучение условий биосинтеза этих соединений и их биологического действия.

Для осуществления этой цели потребовалось решение следующих задач исследования:

1. Провести скрининг продуцентов иммуносупрессоров макролидной природы среди актиномицетов.

2. Провести изучение биологических свойств отобранных соединений.

3. Провести микробиологическое изучение и создание условий биосинтеза изучаемых антибиотиков, включая: а) изучение культурально-морфологических свойств и идентификация продуцентов; б) получение линий продуцентов, превышающие исходные по образованию антибиотика. в) изучение условий биосинтеза для отобранных штаммов, создание метода культивирования отобранных при скрининге штаммов.

Научная новизна

В результате проведенного скрининга были найдены новые продуценты соединений макролидной природы, относящиеся к структурным аналогам олигомицина. Изучен новый продуцент олигомицинового комплекса А, В, С, продуцент олигофусцина (нового аналога олигомицина А) и новый продуцент олигомицина F.

1. Определены соединения составляющие комплексы BSK-14, BSK-17 и BSK-31, и изучены их биологические свойства.

2. Впервые показано особенность действия различных концентраций олигомицина А на дерматофитные грибы и Malassezia furfur АТСС 14521.

3. Проведено сравнительное исследование действия олигомицинов А, В, олигофусцина и олигомицина F на Candida albicans АТСС 885653.

4. Проведена сравнительная оценка противоопухолевой активности изучаемых олигомицинов.

5. Для продуцентов 182, 162 и 31 путем селекции были получены линии с активностью превышающей исходные штаммы.

6. Созданы среды для культивирования и отработаны оптимальные условия биосинтеза, для максимального накопления антибиотиков продуцентами.

В результате скрининга выделен оригинальный продуцент олигомицинового комплекса А, В, С Streptomyces albogriseolus 182 (Benedict et al. 1954), ранее не описанный в качестве продуцента олигомицинов. Продуцент синтезирует комплекс олигомицинов А, В, С в соотношении 80:15:5. Охарактеризован продуцент Streptomyces virginiae 162 (Grundy et al/ 1952), синтезирующий оригинальное иммуносупрессивное соединение макролидной природы отличающийся от олигомицина А заместителями в 7 и 10 положении. Отобран оригинальный продуцент Streptomyces virginiae 31, синтезирующий олигомицин F описанный ранее как иммуносупрессивный агент. Изучены антибиотические свойства отобранных соединений.

В процессе изучения сравнительной эффективности структурных аналогов олигомицина впервые была определена специфичность их действия на мицелиальные грибы и дрожжи. Выявлено, что определенные для каждого аналога низкие концентрации подавляют рост микроорганизмов, средние не оказывают влияние на рост и развитие грибов и вновь ингибируют рост при увеличении концентрации.

Впервые определена специфичность действия аналогов олигомицина - А, В, олигофусцина и F, на подавление роста Candida albicans АТСС 885653 при отсутствии глюкозы в среде. Показано, что на среде с глюкозой все изучаемые олигомицины, кроме олигомицина В, усиливают свою активность.

Выделенные олигомицины проявляют выраженный иммунодепрессивный эффект.

Олигофусцин не индуцируя апоптоз покоящихся лимфоцитов, значительно усиливал апоптоз лимфоцитов, стимулированных ФГА, а также клеток линии Jurkat и мононуклеаров крови больных лимфобластным миел о лейкозом.

Исследованные олигомицины оказались эффективными ингибиторами МЛУ клеток лимфолейкоза РЗ 88ВР устойчивых к винкристину.

При изучении таксономического положения и определение нуклеотидных последовательностей 16S рРНК-генов позволило установить, что культура 182 относится к S. albogriseolus 182, культура 162 к Streptomyces virginiae 162, культура 31 к S. virginiae 31.

В результате физиолого-биологических исследований созданы среды и условия культивирования продуцентов синтезирующих соединения макролидной структуры (олигомицины А, В, С, Б и олигофусцин).

Работа проводилась в рамках программы МЗ РФ "Получение новых перспективных для клиники иммуносупрессоров микробного происхождения и установление механизма их действия на субклеточном и молекулярном уровне" утвержденной на Межведомственном Научном Совете.

Научно-практическая значимость работы.

Результаты работ имеют значение для проведения скрининга аналогичных соединений, а также для развития работ по выявлению взаимосвязи между структурой и функцией в ряду антибиотиков макролидной природы олигомицинового ряда и послужить основой для создания терапевтических средств для использования в фармакологии.

Апробация работы

Итоги научно-исследовательской работы, составляющие основу диссертации, были доложены на I съезде Микологов России (Москва 2002), 1 и 2 Международном Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития". (Москва 2002, 2003), Международной Конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск 2001), 1 и 2 Всероссийском Конгрессе по Медицинской Микологии, (Москва 2003, 2004), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ. (Москва 2001), 1У-м съезде дерматологов и венерологов республики Беларусь. (Гомель 2001), 6-м Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (С-Петербург 2003), на семинарах ФГУП ГНЦА.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ

Объем и структура работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 145 страницах, включают 38 таблиц, 27 рисунков, 7 фотографий и приложение. Список цитируемых источников включает 144 наименования отечественной и иностранной литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Грамматикова, Наталия Эдуардовна

ВЫВОДЫ

1. Применение метода отбора по совокупности устойчивости стрептомицетов к эритромицину и проявлению ими антигрибных свойств позволило отобрать 3 штамма стрептомицетов синтезирующие соединения с высокой антигрибной и иммуносупрессивной активностью.

2. Определено, что культура Streptomyces albogriseolus 182 продуцирует олигомициновый комплекс - олигомицины А, В и С, в соотношении 80:15:5 соответственно,

Культура Streptomyces virginiae 162 синтезирует олигомициновый комплекс, состоящий из двух соединений, одно из которых олигофусцин отличающийся от олигомицина А заместителями в положении 7 и 10 и минорного компонента, аналогичного олигомицину G.

Культура Streptomyces virginiae3\ синтезирует олигомициновый комплекс, состоящий из олигомицина А и В и их структурного аналога, описанного как олигомицин F, в соотношении - 72:6:22.

3 Впервые определена сравнительная антибиотическая активность выделенных соединений: МПК в отношении Aspergillus niger 137 составляет для олигомицина F - 0,01 мкг, олигомицина А, олигофусцина - 0,5 мкг и олигомицина В - 1 мкг. МПК в отношении Candida albicans АТСС 85-653 составляет для олигомицина F -1 мкг, олигомицин А -10 мкг. Олигомицин В и олигофусцин не проявляют антикандидную активность.

4. Впервые показано, что на среде в отсутствие глюкозы, антибиотическая активность олигомицина А, олигофусцина и олигомицина F усилилась. Олигомицин В не проявляет активности на среде в присутствии и отсутствии глюкозы.

5. Показано, что все выделенные олигомицины подавляет бласттрансформацию стимулированную ФГА на 98 - 95%, т. е проявляют выраженную иммуносупрессивную активность.

6. Установлено, что олигофусцин в большей степени активирует апоптоз трансформированной клеточной линии Yurkat, чем олигомицин А. Олигофусцин не индуцирует апоптоз покоящихся лимфоцитов, но значительно усиливал апоптоз лимфоцитов, стимулированных ФГА. Олигофусцин значительно усиливала ранний апоптоз мононуклеаров крови больных лимфобластных миелолейкозом (с 1,5% до 23,3%) и в меньшей степени - поздний апоптоз этих клеток (с 13,8% до 17,2%).

7. Показано, что олигомицины вызывают гибель клеток линии Р388 по типу апоптоза: олигомицин В при концентрациях больше 1, а олигофусцин — больше 3 нг\мл.

8. Проведено таксономическое определение культур с использованием фенотипических характеристик и определению нуклеотидных последовательностей 16S рРНК-генов показано: штамм 182 отнесен к S. albogriseolus 182 штамм 162 отнесен к S. virginiae 162 штамм 31 отнесен к S. virginiae 31.

Эти культуры являются оригинальными продуцентами антибиотиков олигомицинового ряда.

9. В результате генетико-селекционные исследования получены варианты культур: S. albogriseolus - клоны 146\14 и 146\ 19 с продуктивностью 600-700 мкг/мл

S. virginiae sp. 162- клон 17-15-9 с продуктивностью 150 мкг/мл

10. Разработаны среды и подобраны условия культивирования, при которых: штамм S. albogriseolus 146N14, синтезирует комплекс олигомицинов А, В, С на уровне 1200 мкг/мл. штамм S. virginiae 17-15-9, синтезирует олигофусцин на уровне 250 мкг/мл, штамм S. virginiae 31, синтезирует олигомицин F до 80 мкг/мл

125

7.4.3аключение

Для оптимизации условий биосинтеза олигомицинов проведен подбор состава питательных сред с применением математических методов планирования эксперимента для поиска оптимальных условий в многофакторных процессах. Были использованы как матрицы случайного баланса для большего охвата факторов для установления влияния большего количества компонентов, так и аддитивно-решетчатое описание процесса для выявления концентрационной зависимости отобранных факторов. В результате было определено влияние компонентов стимулирующих и ингибирующих биосинтез антибиотиков культурами.

В итоге проведенных исследований получены среды для штамма Б^ерютусея а1Ьо^15во1из 146/14, обеспечивающие биосинтез антибиотического комплекса В8К-14 на уровне 1200 мкг/мл.

Создана среда и подобраны условия культивирования ВБК-П активным вариантом № 17-15-9 продуцента БРерЮтусея гггфтае 162, увеличившая биосинтетическую способность до 250 мкг/мл, что превосходило начальный уровень штамма на 60%.

Создана среда для биосинтеза, осуществляемого культурой Б^ер^тусез угг&тае 31, на которой продуцент синтезирует до 80 мкг/мл олигомицина Р, что в 2,5 раза превосходит уровень биосинтеза на контрольной среде М1.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Появление сообщений о выделении из природных источников макролидных соединений семейства олигомицинов, характеризующихся как иммуносупрессивные и противоопухолевые агенты, расширило интерес к этому классу антибиотиков.

Первые описанные структуры олигомицинов относились к олигомицинам А, В, С, получившим применение в качестве реактивов для молекулярно-биологических исследований. Эти соединения проявляют специфичный ингибиторный эффект в отношении F АТФаз митохондрий, хлоропластов. F АТФазы состоят из гидрофильной части Fo участвующей в транслокации Н* и гидрофильной части Fi, построенной из 5 субъединиц и содержит центры связывания нуклеотидов и ионов Mg2+. Олигомицины нарушают проток протонов по каналу Fo, одновременно подавляя синтез АТФ в активном центре Fi., что сопряжено в этом случае с ингибированием фосфорилирования [138].

В настоящее время список олигомицинов пополнился такими их аналогами, как олигомицин D или рутомицин В, 44-гомоолигомицины А и В, олигомицины Е, F и G. Все перечисленные олигомицины содержат 26 членный макролактон с различными заместителями и синтезируются стрептомицетами. Олигомицины проявляют активность в отношении мицелиальных грибов.

Иммуносупрессоры макролидной природы занимают одно из ведущих положений в трансплантологии. FK506 (такролимус) и рапамицин (серолимус) приобретают важное значение не только при трансплантации органов и тканей и при лечении аутоиммунных заболеваний, но и как противоопухолевые средства (рапамицин) и антигрибковые средства, применяемые в дерматологии [139, 140]. Макролидные иммуносупрессоры по механизму действия отличаются от циклоспорина А большей специфичностью. Изучение тонких механизмов ингибирования продукции цитокинов, активирование апоптоза трансформированных клеток новыми иммуносупрессорами определили стратегию поиска иммуносупрессоров с иной спецификой действия.

В настоящей работе применена система первичного скрининга олигомицинов: поиск их продуцентов устойчивых к эритромицину и обладающих антигрибным потенциалом. В процессе поиска, почвенные образцы из различных регионов рассевали на среды, содержащие 100 мкг/мл эритромицина, что позволило выделить 340 штаммов. Ацетоновые экстракты мицелия отобранных штаммов оценивали по антигрибной активности при использовании в качестве тест-микроорганизма Aspergillus rtiger 137а успешно использований при поиске иммуносупрессоров типа циклоспорина. Из выделенных 340 штаммов были отобраны 3 штамма проявляющие максимальную антигрибную активность. Препараты-сырцы штаммов 182, 162 и 31 получили рабочее название BSK-14, BSK-17 и BSK-31 соответственно. Изучение иммуносупрессивной активности методом ФГА индуцированной бласттрансформации показано выраженное иммуносупрессивное действие этих соединений. Изучение антимикробного спектра ацетоновых экстрактов мицелия отобранных штаммов показало, что в отношении Candida albicans АТСС 885-653 не обнаружена активность для комплекса соединений получивших рабочее название BSK-17 и BSK-14. В отличие от них, комплекс BSK-31 проявлял выраженную активность и в отношении Candida albicans, начиная с дозы 1 мкг. Комплекс BSK-31, проявлял активность в отношении Bacillus cereus var mycoides luteus 537 и в меньшей степени в отношении Bacillus subtilis АТСС 6633.

Таким образом, три отобранных стрептомицета (182, 162 и 31) проявили схожие свойства - устойчивость к эритромицину, продуцировали антибиотики с антигрибной и иммуносупрессивную активность, и отличались по антимикробному спектру действия.

При изучении физико-химических свойств отобранных соединений, проведенных совместно с научным сотрудником Института биохимической физики им. Н.М. Эммануэля Даниленко А.Н. было показано, что все соединения относятся к одной химической группе, а именно к семейству олигомицинов. Антибиотический комплекс BSK-14, продуцируемый культурой Streptomyces 182 состоит из олигомицинов А, В и С в соотношении 80:15:5, соответственно. Была определена структура олигомицина А, продуцируемого культурой 182. Следует отметить, что описанные в литературе штаммы S. diastatochromogenes образуют комплекс олигомицинов А, В, С в соотношении 60:30:10, a S. avermitilis образует комплекс с содержанием олигомицина А более 95% [71,77].

Из антибиотического комплекса BSK-17 выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам два соединения, для одного из которых определена структурная формула, показано, что антибиотик отличается от олигомицина А заместителями в положениях 7 и 10. Новый антибиотик олигомицинового ряда не описан ранее как иммуносупрессивное соединение. В японском патенте представлено сходное соединение, название олигомицин Sc II и описывается его противоопухолевое действие (только в отношении клеточной линии Р 388). Соединение названо нами олигофусцин, в соответствии с видовым названием продуцента. Второе соединение по физико-химическим свойствам аналогично описанному ранее олигомицину G, Этот компонент синтезируется в очень низких концентрациях, и на этом этапе работы нам не удалось накопить его для полной химической идентификации. Изучение структуры второго компонента антибиотического комплекса BSK-17 продолжается.

Антибиотический комплекс BSK-31 представляет собой смесь олигомицина А, В и олигомицина F, последний был описан и запатентован как иммуносупрессивное соединение по реакции бласттрансформации активированных митогеном смеси лимфоцитов. Соотношение этих компонентов комплекса - 6:72:22 - олигомицин В, А и F соответственно.

Таким образом, в результате проведенного скрининга выделены новые штаммы стрептомицетов, продуцирующие соединения олигомицинового ряда; при этом помимо олигомицина А, выделены его аналоги - олигомицин F, олигофусцин (Sc II). Для всех изучаемых соединений подтверждены иммуносупрессивные свойства на модели ФГА индуцированной бласттрансформации лимфоцитов здоровых доноров.

При изучении антимикробной активности отобранных соединений было показано, что они обладают различным спектром действия как на грибные тесты, включая дрожжи, так и на бактериальные.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грамматикова, Наталия Эдуардовна, Москва

1. Страчунский JI.С., Козлов С.Р. Макролиды в современной клинической практике: 1998; Смоленск, "Русич".

2. Страчунский JI. С., Козлов С.Н., Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей: 2002, М.: Боргес.

3. Retsema J., Fu W., Macrolides: structures and microbial targets. Int J Antimicrob Agents: 2001; 18 (Suppl 1), 3-10.

4. Макролиды. Под ред. А.М.Попковой, А.Л. Верткина, С.В.Колобова. М.: Диалог-МГУ, 2000, с 108.

5. Синопалъников А.И., Страчунский, Л.С., Сивая О.В., Новые рекомендации по ведению взрослых пациентов с внебольничной пневмонией: диагностика, оценка степени тяжести, антибактериальная терапия, профилактика. М., 2002.

6. Ray WA, Murray KT, Meredith S, Narasimhulu SS, Hall K, Stein СМ.: Oral Erythromycin and the Risk of Sudden Death from Cardiac Causes. N Engl J Med.: 2004, 351, ppl 089-96.

7. Bahal N., Nahata M.C. The new macrolide antibiotics: azithromycin, clarithromycin, dirithromycin, and roxithromycin. Ann Pharmacother: 1992, 26, pp46-55.

8. Zuckerman J.M., Kaye K.M. The new macrolides: azithromycin and clarithromycin. Infect Dis Clin North Am: 1995,9, pp731-45.

9. A.M. Егоров, Ю.О. Сазыкин, В.П. Иванов, Развитие антимикробной химиотерапии и новые парадигмы. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2001, том 3 №2, стр 98-104.

10. Koch СС, Esteban DJ, et. al., Apoptosis, oxidative metabolism and interleukin-8 production in human neutrophils exposed to azithromycin: effects of Streptococcus pneumoniae. J Antimicrob Chemother: 2000, Jul, 46(1), ppl9-26.

11. Woo, P. C. K, H.-W. Tsoi, L.-P. Wong, H. C. H. Leung, andK.-Y. Yuen. Antibiotics modulate vaccine-induced humoral immune response. Clin. Diagn. Lab. Immunol.: 1999. 6, pp832-837.

12. Woo P.C.Y., Lau S.K.P., Yuen K-y. Macrolides as Immunomodulatory Agents: Review and Future Directions; Medicinal Chemistry Reviews Online: 2004, April vol. 1, n 2. pp 151-161.

13. Morikawa K, Oseko F, Morikawa S, Iwamoto K. Immunomodulatory effects of three macrolides, midecamycin acetate, josamycin, and clarithromycin, on human T-lymphocyte function in vitro, Antimicrob Agents Chemother.: 1994, Nov 38,11, pp2643-7.

14. HmuMÖaeea P.C., http://www.cea.ru/~rimma/Tyland.htm

15. Hamill RL, Haney ME Jr, Stamper M, Willey PFTylosin, a new antibiotic. II. Isolation, properties, and preparation of desmycosin, a microbiologically active degradation product. Antibiot Chemother.: 1961, May, 11, pp328-34.

16. Hinz, K.H. In vitro sensitivity of Mycoplasma gallisepticum field strains to tiamulin and tylosin. Deutsche Tierärztliche Wochenschrift: 1980, 87, pp220-223.

17. Truscott RB, Onoviran O, Ruhnke HL, Fish NA, Barker CA. In vitro antimicrobial sensitivity of Mycoplasmas isolated from the bovine genital tract, Can J Comp Med.: 1975, Oct; 39(4), pp416-20.

18. Bigland CH. Experimental control of Mycoplasma meleagridis in turkeys by the dipping of eggs in tylosin and spiramycin, Can J Comp Med.: 1970, Jan; 34(1), pp26-30.

19. Brennan, J., G. Moore, S. E. Poe, A. Zimmermann, G. Vessie, D. A. Barnum, and J. Wilson. Efficacy of in-feed tylosin phosphate for the treatment of necrotic enteritis in broiler chickens, Poult. Sei.: 2001, 80, ppl451-1454.

20. Synek M, Mrzena B, Bebrova E, Lochmann O. Immunologic aspects of macrolide antibiotics, Cas Lek Cesk.: 1980, Mar 17, 128(12), pp372-4.

21. Matsubara H, Miyano K, Nakagawa A, Omura S., Chemical transformation of tylosin, a 16-membered macrolide, and its structure-activity relationship, Chem Pharm Bull (Tokyo): 1982, Jan; 30(1), pp97-110.

22. Wilson D. Lee, Andrew N. Flynn, et. al. Tilmicosin-induced bovine neutrophil apoptosis is cell-specific and downregulates spontaneous LTB4 synthesis without increasing Fas expression, Veterinary Research: 2004 Vol. 35 No. 2, pp. 213.

23. Burg RW, Miller BM, et.al: Avermectins, new family of potent anthelmintic agents: producing organism and fermentation. Antimicrob Agents Chemother.: 1979, Mar; 15(3), pp361-7.

24. J. R. Egerton, D. A. Ostlind, Avermectins, New Family of Potent Anthelmintic Agents: Efficacy of the Bia Component. Antimicrob Agents Chemother.: 1979, March; 15(3), pp372-378.

25. Campbell W.C. (edit.). Ivermectin and Abamectin, Springer-Verlag: 1989, New York, USA, 363 p.

26. Rao U.R., Chandrashekar R., Subrahmanyan D. Effect of ivermectin on serum dependent cellular interactions to, Dipetaloma viteae microfilariae, Trop. Med. Parasitol.:1987, 38, pp 123127

27. Lammie P. J., Hightower, A. W„ et al. Alterations in filarial antigen-specific immunologic reactivity following treatment with ivermectin and diethylearbamazine, Am. J. Trop. Med. Hyg.:1992,46, pp292-295.

28. YU. N. Korystov, V. A. Mosirt, at al. Induced by radiation and dexamethasone, Acta Vet. Brno: 1999,68, pp23-29.

29. Kino T., Hatanaka M., Hashimoto Met al. FK-506, a novel immunosuppressant isolated from a Streptomyces. I. Fermentetion, isolation and physicochemical, biological, and biochemical characteristics, J.Antibiot.:1987, v.40, pp1249-1255.

30. Damont F.J.Byrne K.M., Sigal N.H. et al., Novel immunosuppressuve agents. Eur. Pat.0.323.865.: 1989.

31. Shafice A., Chen TS., Byron S. et al. Enzymatic synthesis and immunosuppressive activity of novel desmethylated immunomycins (ascomycins), J.Antibiot.: 1993, v.46, pp.1397-1405.

32. Jones T.K., Mills S.G., Reamer R, As kin D., Desmond R., Volante R.P. and Shinkai I. Total Synthesis of the Immunosuppressant (-)-FK-506, Journal of the American Chemical Society: 1989, 111,pp.1157-1159

33. Vezina C., Kudelski A.,Sehgal S.N. Rapamycin (AY22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle. J.Antibiot.: 1975, v.28, pp.721-726.

34. Hashemolhosseini S., Nagamine Y., Morley SJ. et al., Rapamycin inhibition of G-l to S transition is mediated by effects on cyclin D1 mRNA and protein stability, J-Biol-Chem.: 1998 D2, v.273/23, pp. 14424-14429.

35. Berset C., Trachsel H., Altmann M. The TOR (target of rapamycin) signal transduction pathway regulated the stability of translation initiation factor eIF4G in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Proc-Natl-Acad-Sci-USA: 1998, v.95/8, pp.4264-4269.

36. Ritchie KJ, Zhang DE, ISG15: the immunological kin of ubiquitin, Semin Cell Dev Biol.: 2004 Apr, 15 (2), pp.237-46.

37. Hoyt MA, Coffino P, Ubiquitin-proteasome systemUbiquitin-free routes into the proteasome, Cell Mol Life Sci.: 2004 Jun, 61 (13), pp.1596-600.

38. Rangachari M, Penninger JM, Negative regulation of T cell receptor signals, Curr Opin Pharmacol.: 2004, Aug, 4(4), pp.415-22.

39. Cardoso F, Ross JS, Picart MJ, Sotiriou C, Durbecq V, Targeting the ubiquitin-proteasome pathway in breast cancer, Clin Breast Cancer.: 2004, Jun, 5(2), pp. 148-57.

40. Brooks CL, Gu W, Dynamics in the p53-Mdm2 Ubiquitination Pathway, Cell Cycle.: 2004, Jul 2; 3 (7).

41. Sun L, Chen ZJ, The novel functions of ubiquitination in signaling, Curr Opin Cell Biol.: 2004 Apr, 16(2), pp. 119-26.

42. Knowles LM, Axelrod F, Browne CD, Smith JW, A Fatty Acid Synthase Blockade Induces Tumor Cell-cycle Arrest by Down-regulating Skp2, J Biol Chem.: 2004, Jul 16, 279(29), pp.30540-5.

43. Roos-Mattjus P, Sistonen L, The ubiquitin-proteasome pathway, Ann Med.: 2004, 36(4), pp .285-95.

44. Nakamura M, Tanigawa Y, Ubiquitin-like polypeptide inhibits cAMP-induced p38 MAPK activation in Th2 cells., Immunobiology: 2004,208(5), pp.439-44.

45. D. L. Davis andS. J. Soldin, Biochim. Biophys. Res. Commun: 2000,277, p325.

46. A. I. Denesyuk, K. A. Denessiouk, V. P. Zav'yalov, J. Lundell andT. Korpela, Design and Structure-Based Study of New Potential FKBP12 Inhibitors, Comput. Chem: 1998, 22, p.339.

47. Fehr T, Sanglier J J, Schuler W, et. al, Antascomicins A, B, C, D and E. Novel FKBP12 binding compounds from a Micromonospora strain., J Antibiot (Tokyo): 1996 Mar; 49(3), pp.230-3.

48. Morisaki M, Arai T., Related Articles, Identity of immunosuppressant FR-900520 with ascomycin. J Antibiot (Tokyo): 1992, Jan; 45(1), pp. 126-8.

49. Wiedeman PE, Fesik SW, Petros AM, et. al., Retention of immunosuppressant activity in an ascomycin analogue lacking a hydrogen-bonding interaction with FKBP12., J Med Chem.: 1999 Oct 21,42(21), pp.4456-61.

50. Laatsch H, Kellner M, Wolf G, Lee YS, Hansske F, et. al., Oligomycin F, a new immunosuppressive homologue of oligomycin A, J Antibiot (Tokyo): 1993, Sep, 46(9), pp. 1334-41.

51. Kim HS, Han SB, Kim HM, Kim YH, Lee J J., 41-Demethylhomooligomycin B, a new immunosuppresant antibiotic from Streptomyces ostreogriseus., J Antibiot (Tokyo): 1996 Dec, 49(12), pp. 1275-7.

52. Romo, D.; Rzasa, R. M.; Shea, H. A.; Park, K.; et. al., Smk is known to deprotect N-benzyloxy 3-lactams, J. Am. Chem. Soc.: 1998, 120, pl2237.

53. M. J. Remuinan and G. Pattenden, Total síntesis of(-)-pateamine, a novel polyene bis -macrolide with immunosuppressive actitity from the sponge Mycale sp., Tetrahedron Letters: 2000,41, pp.7367-7371.

54. Christoph Steinschulte, Timucin Taner, Angus W. Thomson, et. al., Sanglifehrin A, a Novel Cyclophilin-Binding Immunosuppressant Blocks Bioactive IL-12 Production by Human Dendritic Cells, The Journal of Immunology. 2003,171, 542-546.

55. Nicolaou K.C., Murphy F., Barluenga S., et. al., Total Synthesis of the Immunosuppressant Sanglifehrin A, J. Am. Chem. Soc.: 2000,122, pp.3830-3838.

56. M. Duan and L. A. Paquette, Enantioselective Total Synthesis of the Cyclophilin-Binding Immunosuppressive Agent Sanglifehrin A, Tetrahedron Lett: 2000,41, p.3789.

57. Tanaka Y, Komaki H, Yazawa K, Mikami Y, et al., Brasilinolide A, a new macrolide antibiotic produced by Nocardia brasiliensis: producing strain, isolation and biological activity, J Antibiot (Tokyo), 1997, Dec, 50(12), pp. 1036-41.

58. Woo JT, Shinohara C, Sakai K, Hasumi K, Endo A, Isolation, characterization and biological activities of concanamycins as inhibitors of lysosomal acidification., J Antibiot (Tokyo): 1992 Jul, 45(7), pp.1108-16.

59. Bindseil, Kai Uwe, Axel Zeeck, Chemistry ofunusual macrolides. 1. Preparation ofthe aglycons of concanamycin A and elaiophylin, J. Org. Chem.: 1993, 58, pp.5487-5492.

60. T. Jyojima, M. Katohno, N. Miyamoto, M. Nakata, S. Matsumura and K. Toshima, Synthetic studies on concanamycin A: Synthesis of the C5-C13 and C20-C28 segments, Tetrahedron Lett.: 1998, 39, pp.6003-6007.

61. T. Jyojima, N. Miyamoto, M. Katohno, M. Nakata, S. Matsumura, K Toshima, Synthetic studies on concanamycin A: Total synthesis of concanolide A (concanamycin F), Tetrahedron Letters: 1998,39, pp.6007-6010.

62. I. Paterson, V. A. Doughty, M. D. McLeod and T. Trieselman, Total Synthesis of (+)-Concanamycin F, Angew. Chem. Int. Ed.: 2000, 39, No. 7, pp.1308-1312.

63. Carter G.I, Structure determination of oligomycin A and C, J.Org.Chem.:1986, v.51, p.42-64.

64. Glehn MJ, Norrestam R., Kierkegaard P., et al., Three-dimensional structure of oligomycin B, FEBS Lett.: 1971, v.20, pp.267-269.

65. Hayakawa Y., Kim J. W. et al., Structure of apoptolidin; a specific inducer in transformed-cells, J.Am.Chem.Soc.: 1998, v.120, pp.3524-3525.

66. Smith RM., Oligomycin, a new antifungal antibiotic, Antibiot. Chemother.: 1954, v.4, p.962.

67. Nakakita Y., Nakagawa M., Sakai #., Isolation of oligomycin A as a result of screening for antagonists of lipids, J. Antibiot.: 1980, v.33, pp.514-516.

68. Wuthier D., Keller-Schierlein W., Wahl В., Isolierung und strukturaufklarung von rutamycin B, Helv.Chim.: 1984, v.67, pp.1208-1216.

69. Laatschi H., Kellner M., Wolf G. et al., Oligomycin F, a new immunosuppressive homologue of oligomycin A, J. Antibiot.: 1993, v.46, pp.1334-1341.

70. Enomoto Y„ Shiomi K, Matsumoto A. et al, Isolation of a new antibiotic oligomycin G produced by Streptomyces sp. WK-6150, J. Antibiot.: 2001, v.54, n3, pp.308-313.

71. Дриняев B.A., Кругляк Е.Б., Аппинянская JI.M. и др., Streptomyces avermytilis продуцент олигомицина, Биотехнология: 1994, № 7, стр. 30-35.

72. Yamashita Т., Yamazaki М„ Tsuchiya Т. et al., Production of antibiotic NK 86-0279 by Streptomyces bottropensis, Eur. Pat. Appl.: 1987, 322 748 (C1C07D493/20) may 7.

73. Nishikiori Т., Yamazaki M., Saito S. et al., Novel antibiotic NK 130119, process for production of the same application of the same., Eur. Pat. Appl.: 1990, 381 124 A2 (C1C07D493/20) aug. 8.

74. Kim J. W, Adachi H., Shin-ya К et al., Apoptolidin, a new apoptosis inducer in transformed cells from Nocardiopsis sp., J.Antibiot.: 1997. v. 50, pp. 628-630.

75. Panek JS, Jain NF., Total synthesis of rutamycin В and oligomycin C, J. Org. Chem.: 2001, v.66, n8, pp.2747-56.

76. Salomon A.R., Zhang Y. et al., Structure-activity relationships within a family of selectively cytotoxic macrolide natural products, Organic letters.

77. Salomon A.R., Voehringer D. W., Herzenberg L.A., Khosla C. Understanding and exploiting the mechanistic basis for selectivity of polyketide inhibitors of F0 Fi ATFase., PNAS: 2000, v.97, n.26, pp. 14766-71.

78. Зайцева JI.Г. FoFj -АТФаза: строение мембранного сектора и импорт некоторых субъединиц в митохондриальный матрикс, Автореф. канд. дис. Москва, 2000.

79. Ruiz Antonio, Papathanassiu Adonia, United States Patent Application: Composition and method for the treatment of mycobacterial infections, 20040087489, Al, May 6,2004

80. Boyer, P.D., The binding change mechanism for ATP synthase: some probabilities and possibilities, Biochim. Biophys. Acta.: 1993,1140, pp.215-250.

81. Arato-Oshima T., Matsui H. et ah, Mechanism responsible for oligomycin-induced occlusion of Na+ within Na/K-ATFase, The American society for biochemistry and molecular biology: 1996, v.271, n.41, pp. 25604-25610.

82. Cho JH, Balasabrama M, Chernaya G. et al, Oligomycin inhibits store-operated channels by mechanism independent of its effects on mitochondrial ATF, Biochem. J.: 1997, v.324, pp.971980.

83. Sukchareva M„ Morisette J., Coronado R., Mechanism of chloride-dependent release of Ca 2+ in the sarcoplasmic reticulum of rabbit skeletal muscle, Biophys. J.: 1994, v.61, pp.751-765.

84. Simon SM., Schindler M., Cell biological mechanism of multidrug resistance in tumors, Proc. Natl. Acad. Sci USA: 1994, v.94, pp.3497-3504.

85. Wang X, Wall DM, Parkin JD et al., P-glycoprotein expression in classical multidrug resistant leukemia cells does not correlate with enhanced chloride channel activity, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.: 1994, v.21, pp.101-108.

86. Valverde MA, Diaz M, Sepulveda FV et al, Volume-regulated chloride channels associated with the human multidrug-resistance P- glycoprotein, Nature: 1992, v.355, pp.830-833.

87. Lee Y.J., Shacter E., Oxidative stress inhibits apoptosis in lymphoma cells, J.Biol-Chem.:1999, v.274, pp. 19792-8.

88. Kroemer G., Dallaporta B., Resche-Rigon M., The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis, Annu Rev Physiol.: 1998, v.60, pp.619-642.

89. Otter I, Conus S, Ravn U, et. al, The binding properties and biological activities of Bcl-2 and Bax in cells exposed to apoptotic stimuli, J.Biol. Chem.:1998, v.273, pp.6110-6120.

90. Liu X., Kim CN, Yang Jet al., Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome C, Cell: 1996, v.86, nl, pp.147-157.

91. Stefanelli C., Bonavita F., Static I. et al., ATF depletion inhibits glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis, Biochem-J.: 1997, v. 322 (pt 3), pp.909-917.

92. Liu H., Hu YP, Saavaraj N. et al., Hypersensitization of tumor cells to glycolytic inhibitors, Biochemistry: 2001, v.40, pp.5542-7.

93. Kiara JK, Njogu MR., Oligomycin-sensitivity of hexose-sugar catabolism in the bloodstream form of Tripanosoma brucei brucei, Biotechnol. Appl. Biochem.: 1994, v.20, pp.347-356.

94. Chinnery PF, Turnbull D.M., Epidemiology and treatment of mitochondrial disoders, Am. J. Med. Genet.: 2001, v.106, pp.94-101.

95. Manfredi G„ Gupta N. et al., Oligomycin induces a decrease in the cellular content of a pathogenic mutation in the mitochondrial ATPase 6 gene, J.Biol.Chem.: 1999, v.274, issue 14, pp. 9386-9391.

96. Mills KI, Woodgate LJ, Gilkes AF et al., Inhibition of mitochondrial function in HL60 cells is associated with increased apoptosis and expression of CD 14, Bioch. and Bioph. Reseach Comm.: 1999, v 263, num. 2, pp. 294-301.

97. Bauer BE, Wolfger H, Kuchler K.s Inventory and function of yeast ABC proteins: about sex, stress, pleiotropic drug and heavy metal resistance, Biochim. Biophys.: 1999, v. 1461, pp.217236.

98. Hallstrom TC., Lambert L., Schorling S. et al, Coordination of sphingolipid biosynthesis and multidrug resistance in Saccharomyces cerevisiae, J.Biol.Chem.: 2001, v.276, pp.23674-23680.

99. Pinson A, Zilberman Y, Tirosh R, Trembovler V, Shohami E, High oligomycin concentrationsaugment 6-keto-PGFl alpha production in ventricular cardiomyocytes, Biochim Biophys Acta.f1994 Mar 24, 1211(3), pp.283-8.

100. Nakakita Y, Nakagawa M, Sakai H: Isolation of oligomycin A as a result of screening for antagonists of lipids. //J Antibiot (Tokyo). 1980 May;33(5), pp.514-6.

101. Ю.Н. Корыстов, JI.H. Кублик, A.A. Кудрявцеву др. Противоположные эффекты низких концентраций олигомицина на апоптоз нормальных и опухолевых клеток, Доклады академии наук: 2003, Том 392, № 6, стр. 475-7.

102. Бибикова М.В., Рыбакова A.M., Вострое С.Н., Спиридонова И.А, Иваницкая Л.П.: Поиск иммуносупрессоров направленного действия, Успехи в области изучения и производства антибиотиков: 1991, вып. XX, стр.8-13.

103. Семенов С.М., Лабораторные среды для актиномицетов и грибов, М. «Агропромиздат», 1990.

104. Бибикова М.В., Селехова Г. Н„ Вострое С.Н. и др. Оптимизация состава ферментационной среды для выделения продуцентов антибиотиков из микромоноспор, Антибиотики и медицинская биотехнология, 1981, №12, стр. 899-904.

105. Государственная фармакопея СССР, Министерства здравоохранения СССР, издательство "Медицина", Москва: 1989г.

106. Д! Бирюков В. В. Практическое руководство по применению математических методов планирования эксперимента для поиска оптимальных условиях в многофакторных процессах. Москва: 1967

107. Гаузе Г. Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А, и др. Определитель актиномицетов. Москва.: 1983

108. Shirling, В., D. Gottlieb, Int. J. Syst.Bacteriol.: 1968. 61, ррЗ 13-340.

109. Бондарцев А.С. Трутовые грибы европейской части СССР и кавказа.- M.-JL: 1954, Изд-во МГУ, стр. 681-685.

110. Hasegawa Т., Takizawa М., Tanida S. A rapid analysis for chemical grouping of aerobic actinomycetes, J. Gen. Appl. Microbiol.: 1983. Vol. 29. pp. 319-322.

111. Lechevalier M.P. Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance, J. Lab. Clin. Med.: 1968. Vol. 71. pp. 934-944.

112. Staneck J.L., Roberts L.D. Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography, Appl. Microbiol.: 1974. Vol. 28. pp. 226-231

113. Becker, В., Lechevalier, and H.A. Lechevalier, Chemical composition of cell-wall preparations from strains of various form genera of aerobic actinomycetes, Appl. Microbiol.: 1965. 13: 236 -2431.

114. Dietz A, Thayer D.W. Actinomycete taxonomy ed. 1980, The Upjohn Compani «All Right1. Reserved».

115. Красилъников P.A.,. Актиномицеты: 1972, Москва, "Наука".

116. Shirling E.B. and D. Gottlieb, Mrthods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol.: 1966,16, pp313-340.

117. Lee, S. D„ S. O. Kang, Y. C. Hah, Int. J. Syst. Evol. Microbiol: 2000,50 (3),ppl 103-1 111.

118. Pospiech A., Neumann В. A versatile quick-prep of genomic DNA from Gram-positive bacteria, Trends in Genetics: 1995, nl 1, pp217-218.

119. Belgium, University of Gent, http://oberon.fVms.ugent.be:8080/rRNA. 128 http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html.

120. Kumar et al., 2001, http://www.megasoftware.net.

121. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Медгиз: 1963.-180 с.

122. Selva Е, MontaniniN, Stella S, Sqffientini A, Gastaldo L, Denaro M. Targeted screening forelongation factor Tu binding antibiotics, J Antibiot (Tokyo): 1997 Jan;50(l):22-6.

123. Методические рекомендации по экспериментальному изучению иммунотоксических свойств фармакологических средств.- М., 1992.- 39 с.

124. Kamimura D., Kuramoto М., et al., Oligomycin SC compounds of Pantoea agglomerans as anticancer agents., Jpn. Kokai Tokkyo Koho JP 09.208.587, 1997.

125. Sugita, Т., Takashima, M„ Kodama, M., Tsuboi, R., Nishikawa, A., Description of a New Yeast

126. Species, Malassezia japonica, and Its Detection in Patients with Atopic Dermatitis and Healthy Subjects., J. Clin. Microbiol.: 2003, n 41, pp4695-4699.

127. Leung, D. Y. M., Atopic dermatitis: new insights and opportunities for therapeutic intervention,

128. J. Allergy Clin. Immunol.: 2000, n 105, pp 860-876.

129. Салова Т. В., Разработка научно-методических основ и биотестсистем скрининга иммуносупрессоров, 1999 Диссертация канд. биол. Наук, Российский химико-технологический университет.

130. Stackebrandt Е, Witt D, Kemmerling С, Kroppenstedt R, Liesack W., Designation of streptomycete 16S and 23 S rRNA-based target regions for oligonucleotide probes, Applied and Environmental Microbiology: 1991, 57, pp.1468-1477.

131. Медведев C.C. Электрофизиология растений, СПб. Изд-во С.-Петерб. ун-та: 1998.

132. Abraham R.J., Wiederrecht G.J., Immunopharmacology of rapamycin. Annu Rev Immunol: 1996; 14: 483-510.

133. Сазыкин Ю.О., Быков В.А., Новые природные иммуносупрессоры. Сопоставление по механизму действия с циклоспорином А., Антибиотики и химиотер.: 2000; 45, 1, стр. 25-31.

134. Woese C.R. Bacterial evolution. Microbiol. Rev.:1987, 51:221-271.

135. Stackebrandt E, Goebel BM. (1994) Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology, International Journal of Systematic Bacteriology,: 1994,44: 846-849.

136. Rosstllo-Mora (R) et Amann (R.): Review. The species concept for prokaryotes. FEMS Microbiol. Rev.: 2001,25, 39-67.

137. Stoesser G, Baker W, van den BroekA, Camon E, Garcia-Pastor M, Kanz C, et al., The EMBL Nucleotide Sequence Database. Nucleic Acids Research: 2002, 30,21-36.

138. Stackebrandt E, Witt D, Kemmerling C, Kroppenstedt R, Liesack W„ Designation of streptomycete 16S and 23 S rRNA-based target regions for oligonucleotide probes, Appliedand Environmental Microbiology: 1991,57, 1468-1477.