Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурные и функциональные изменения клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Структурные и функциональные изменения клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ МЛ.ЛОМШОСОВА

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА ИРИНА АНАТОЛЬЕВНА --

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

КЛЕТОК КУЛЬТУРЫ СПЭВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ИНГИБИТОРОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА

03.00.11 - ЭМБРИОЛОГИЯ, ГИСТОЛОГИЯ И ЦИТОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ ддрсертепнн на соискание ученой степени кандидата биологических наук

^ Москва 1881

Работа выполнена да кафедре литологии ж гистологии биологического факультета 15Г7.1Ш.ЬиБ.Ломоносова

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Ю.С.Ченцов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

Е.Н.Мохова

кандидат. биологических наук М.Н.Болтовская

-Ведущее учреждение - Институт биологии развития

АН.-.СССТ

ОП

Задета состоится 18 апреля 1991 т. в.15 яа .заседании специализированного совета.Д.053.05.68 при Московском государственном университете шл.К.В.Ломоносова по ацрэсу: 119 8Э9, Москва, Ленинские горн, СУ, биологический факультет, аудитория 1.5—1.

С диссертацией.можно ознакомиться в библиотеке, биологгческо1 факультета МГУ им.Ы.В.Ломоносова.

- Автореферат разослан 18 марта 1991 т.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат-биологических наук

ЕЛ.Калистратова

• • *

(

■.т^Л | - ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

.Актуальность проблемы.

Изучение изменений клетки и ее органелл в ответ на различные воздействия является важной задачей, решение которой необходимо дая понимания многих вопросов клеточной патологии, адаптации клеток к неблагоприятным условиям и воздействиям, возможностей репарации клеток а их органоидов. До настоящего времени предметом дискуссий является Вопрос о том, зависит ли ответная реакция клетки от характера альтерирующего фактора или при разнообразных клеточных повреждениях развивается ряд неспецифических изменений органедл, отражающих степень падения их функций. Неизвестно также, до какого момента эти изменения обратимы, ■

Изучение метаболизма клетки при ее жизнедеятельности в условиях резко отличающихся от нормальных, важны для понимания механизма угнетения, приспособления и реактивации функций. Исследование различных патологических изменений клетки имеет большое прикладное значение, т.к. позволяет искать истоки патологических состояний, органов и тканей на клеточцом уровне, а также разрабатывать пути их устранения.

Удобным объектом дая изучения влияния.альтерирующих факторов на клетки могут служить перевиваемые клеточные культуры, т.к. они являются относительно однородными клеточными популяциями, хорошо растущими в стандартных условиях на полусинтетических средах. Кроме того, на клеточных культурах можно изучать непосредственные ответы клеток на те или иные воздействия, т.к. отсутствует интегрирующее влияние организма, его гуморальной и нервной систем.

Весьма важным для изучения процессов повреждения и репарации является использование ингибиторов, специфически выключающих определенные звенья обмена веществ. В этих исследованиях можно проследить за динамикой развития метаболических и улмраструктурныг изменений,

сравнить эту динамику в случав действия разных ингибиторов, определить первичные и вторичные изменения структуры клеток и терминальную картину повреждений различными веществами, а танке изучить репарационные возможности клеток при снятии действия альтерирующего фактора.

Окислительное фосфорилирование является сложным многоступенчатым процессом, который обеспечивает живые клетки энергией, необходимой для их жизнедеятельности. Ингибиторы окислительного фосфоршшрования, имеющие разные точки приложения в механизме этого процесса, лишают клетки энергии, необходимой им для синтетических, транспортных и других процессов. Применение ингибиторов энергетического метаболизма позволяет изучить энергозависимость различных.сторон жизнедеятельности клетки. ;

Большое значение дай понимания механизмов развития ответной реакции клетки имеет изучение проблемы корреляции изменений морфологии клеток и их обмена веществ. Для решения этой проблемы необходимо сочетать в исследованиях морфологические методы изучения клеток с методами, оценивавшими их функциональное состояние. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение морфологических и функциональных изменений клеток культуры СШВ и, особенно, их митохондрий, вызываемых ингибиторами энергетического метаболизма с разным механизмом действия, а также возможности репарации клеток после снятия альтерирующего воздействия.

Были поставлены следутацие задачи:

1) исследовать влияние ингибиторов энергетического метаболизма на пролиферацию клеток культуры СЮВ;

2) охарактеризовать дыхание клеток культуры СШВ при действии этих ингибиторов; ; '

Л) дгп з*ого метод полярографического измерения дыхания

клоток монослойной культуры баз снятия их со стекла;

4) исследовать в динамике соотояние мембранного потенциала митохоид-рий и трехмерную организацию митохондриального ретикулума клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов окислительного фосфоршшро-

вания с помощью флуоресцентного красителя родамина 123;

♦

5) изучить в динамике картину ультраструктурных изменений клеток и, особенно, их митохондрий при действии ингибиторов цепи переноса электронов и ингибиторов АТФ-синтетазы;

6) выяснить, являются ли изменения клеточных структур сходными или действие каждого ингибитора имеет свои особенности;

7) изучить возможности восстановления пролиферативной активности культуры, мембранного потенциала и морфологии митохондрий и репарации повреждений ультраструктуры клеток после снятия альтерирующего воздействия.

Научная новизна работы.

В настоящей работе показана специфичность изменений пролиферации клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма, а также возможность восстановления нормальной митотической активности культуры после снятия альтерирующего воздействия. Впервые даны функциональные характеристики митохондрий клоток монослойной культуры СПЭВ, Для этого разработан и впервые применен полярографический метод определения скорости дыхания клеток монослойной культуры без снятия их со стекла. При помощи этого метода установлены закономерности изменения дыхания клеток культуры СПЭВ при воздействии разных ингибиторов окислительного фосфорилирования. С помощью флуоресцентного красителя родамина 123 впервые изучена динамика изменений мембранного потенциала митохондрий и морфологии хондриома меток СГОВ при действии различных ингибиторов. Впервые прослежена динамика ультраструктурных изменений глоток культуры при действии ингибиторов шюрге-

тического метаболизма. Показано, что структурные и функциональные изменения клеток при действии ингибиторов имели как общие черты, так и специфические особенности. Внявленнве различия заключались в характере, интенсивности и динамике' развития нарушений. Установлена способность к восстайовленню структуры и функции клеток при перенесении их в среду, свободную1 от ингибитора» Показано, что характер и динамика репаративннх процессов в клетках зависят от природа примененного ингибитора» Научно-практическое значение работы.

Выполненная работа в целой имеет теоретический' характер ж ее значение заключается, главным образом, в установлении закономерностей' развития патологических процессов в клетке в условиях подавления отдельных звеньев энергетического метаболизма. Результаты работы позво-, ляют определить направление и методические подходы дальнейших исследований регуляторных механизмов энергетического обмена. Результаты проведенных исследований нашли применение в учебном процессе кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ. Разработанный метод полярографического изучения потребления кислорода клетками -культуры, позволяющий характеризовать митоховдриальное дыхание ин-тактннх клеток.любой монослойной' культуры, которая находится на стекле в стандартной среде для культивирования клеток, используется для изучения влияния различных биологически активных веществ на дыхание клеток в культуре тканей. Апробация диссертационного материала»

Основные результаты были долонены на X Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Москва,. 1976), XI Всесоюзном симпозиуме "Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции" (Пущино, 1981), Бсе-соязгом совещании "Клеточная репродукция: сравнительные аспекты и т^хглшэш г^гуляпии" (Ленинград;, 1981), I Всесоюзном Биофизическом

съезде (Москва, 1982), III и IУ Всесоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1982, 1987), Всесоюзной совещании "Биология клетгси в культуре" (Ленинград, 1983), симпозиуме "Реактивность клеточных органелл" (Тбилиси, 1983), 1У конференции "Ультраструктурные основы патологии органов и тканей" (Тбилиси, 1989), III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Пущино, 1990), заседании кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета Ш.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Структура и объем работы,

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов ж методов, собственных результатов, обсуждения полученных результатов и выводов. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 124 фотографии, 39 рисунков и 31 таблицу. Список цитированной литературы включает 178 работ отечественных и 162 работа зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проводились на монослойной культуре клеток линии СПЭВ (почка эмбриона свиньи). Клетки выращивали в стационарных условиях на покровных стеклах в пеницшшшовых флаконах на среде 199 с добавлением 10$ бычьей сыворотки и пенициллина (100 ед/мл) при 37°С. Через двое суток после посадки культуры в пузырьки добавлялись ингибиторы: амитал - 6,6 Ш, ротенон - 2 мкМ, антимицин А -I мкг/мл, олигомицин - I мкг/мл, дициклогексилкарбодиимид (ДЦКД) -100 мкМ. Исследования 2-3-суточных культур, находящихся в логарифмической фазе роста, проводили через 30 минут, 2,6,10,14,18 и 24 часа поело добавления ингибиторов. Для изучения обратимости изменений проводили отмывание культуры. Для этого стекла с клетками, инку-

бировашимися с ингибиторами| переводили в чистую культуральную сроду, Для изучения общей морфологии культуры клетки фиксировали 96° этанолом п/окрашивали гематоксилином Караччи. На полученных препаратах просчитывали митотический ивдекс культуры. Все количественные данные обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента.

Измерение скорости потребления кислорода клетками культуры СПЭВ проводили по разработанному наш методу полярографического изучения старости дыхания клеток монослойной культуры, растущих на стеклах, без перевода их во взвесь (Полякова и др., 1983). Скорость потребления кислорода клетками измерялась на полярографе ьР-7 (ЧСФР) с использованием закрытого электрода типа Кларка.

Состояние мембранного потенциала митохондрий оценивалось по накоплению в их матриксе проникающего флуоресцирующего катиона - рода- . мина 123. Для определения интенсивности флуоресценции митохондрий покровные стекла о клетками помещали в культуральную среду, содержащую 10 мкг/мл родамина 123 и инкубировали 10 минут при 37°С. Затем стекла с культурой промывали в среде, не содержащей родамин, в течение 1-3 минут. Окрашенные таким образом препараты помещали в камеру для наблюдения, заполненную культуралъной средой, и просматривали на флуоресцентном микроскопе УШВАР ("Райхерт", Австрия). Фотографирование проводили на пленку чувствительностью 1600 ЛЗА.

Для электронномикроскопического изучения клетки на стеклах фикси-рояались 2,Ъ% глутаровым альдегидом на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) с. последующей дофиксацией 1% раствором осмиевой кислоты на фосфатном буфере. Культуры заливались в эпон по стандартно!! ме-тс д:к;о. Покровные 'стекла после полимеризации удалялись жидким азо-то>:. Ультрат'лткио срезы клеток культуры получали на микротоме ЬКВ. Ст<'->н г.оигр-члти^йраллоь'уранилацетатом и цитратом свища по РеНнольд-и щдапдтрггядкеь в электронном микроскопе ¿ЕМ-ЮО В.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ '•

I. Изменения пролиферативной активности клеток культуры СШВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма.

Уровень штотической активности является показателем физиолОгичес-• кого состояния культуры, поэтому по степени его изменений.можно судить об эффекте действия различных адьтерирущих факторов. Процессы пролиферации клеток культуры СПЭВ нарушаются при действии всех изученных нами ингибиторов.

При действии на клетки СПЭВ амитала происходит снижение митотичес-кого индекса культуры, начиная с 30-минутного действия ингибитора, и через 18 часов митозы полностью отсутствуют.

При действии на клетки культуры СПЭВ ротенона происходит возрастание штотического индекса культуры. Через 6 часов воздействия количество митозов возрастает в 6 раз по сравнению с контролем. Высокий митотический индекс (16,7$) сохраняется в культуре до 24 часов воздействия ингибитора. Это увеличение митотического индекса происходит за счет накопления в культуре при действии ротенона к-:метафаз, которые практически не встречаются в норме. Уже через 30 минут действия. ингибитора количество нормальных митозов уменьшается наполовину, через 6 часов доля к-метафаз составляет 95$. -Резкое увеличение митотического индекса за бчет накопления к-метафаз - это картина, характерная для действия колхицина и других антитубулиновых агентов. Ротонон, по данным Бршпсли (Вг1пк1еу et а1., 1974) , также является антимитотн-че'ским колхициноподобным агентом, блокирующим делящиеся клетки' в метафазе.

При действии на клетки СПЭВ антимшщна А происходит некоторое снижение числа митозов: митотический индекс составляет 70,2 от контроля. При этом происходит снижение количества нормальных митозов и увеличение числа к-мэтафаз. Этот процесс значительно болоо р-лотииуг ю »ри.ма-

ни, чем при действии ротенона: через 14 часов действия антимицина А доля к-митозов составляв? 41% и только к 18 часам она достигает 86%.

При действии олигомицина происходит падение митотического индекса культуры, начиная с 30-минугного действия ингибитора. Через 14 часов число митозов уменьшается на 93% по сравнению с контролем, через 24 часа митотическая активность полностью подавлена. Динамика падения митотического индекса при действии олигомицина очень сходна с той, какую мы наблюдали при действии амитаца на клетки СПЭВ..В отличие от всех других изученных нами ингибиторов при действии олигомицина не наблюдалось появления и накопления к-митотических клеток.

При действии ДЦКД происходит увеличение митотического индекса культуры, хотя не столь значительно, как при действии ротенона: к 10 часам воздействия митотический индекс превышает контрольный уровень на 36%. Это увеличение происходит за счет накопления в культуре к-митозов: уже через I час воздействия половина митозов являются к-ыетафазами, а через 6 часов нормальные митозы полностью отсутствуют. Через 14 часов митотический индекс снижается и до 24 часов соответствует контрольному уровню. Это снижение,, по-видимому, определяется гибелью к-митотических клеток. Можно предполагать, что ДЩ так же, как ротенон, является антимитотическим агентом, разрушающим митотический аппарат.

Результаты наших исследований показывают, что при действии ингибиторов окислительного фосфорилирования происходят два типа изменений: снижение митопиеской активности или накопление в культуре к-митозов. Интересно отметить, что наличие или отсутствие этих типов изменений, их характер, динашка и степень выраяенности зависят от природы при-гонешюго ингибитора. Они различаются даже для ингибиторов с одинаковой точкой приложения в механизме энергетического метаболизма. Амитал г елпгомщин отллчгятся по механизму действия на процессы окислитель-

ного фосфорилирования. Но они обладают сходным действием на процессы пролиферации клеток культуры СПЭВ и отличаются от.действия аналогичных им по механизму ингибиторов - ротенона и ДЦКД.

2. Изменения уровня дшсация клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов дыхательной цепи и митохондриальной АТФ-синтетазы.

Потребление кислорода клетками является одним из основных показателей энергетического обмена. Наш был разработан метод измерения дыхания клеток монослойной культуры, прикрепленных к стеклам, которые помещаются в полярографическую ячейку без перевода клеток во взвесь, что исключает повреждение клеток и изменение их функционального состояния. Для этого в стандартной полярографической ячейке были сделаны ■ специальные прорези, в которые вставлялись 7 покровных стекол (7x10 мл) с культурой СПЭВ (всего около 500 тысяч клеток). Измерение проводилось . закрытым кислородным электродом типа Кларка в 1,2 мл среды для культивирования клеток, которая перемешивалась с помощью магнитной мешалки. Скорость потребления кислорода была линейной во времени при концентрации 02 от 480 до 200 наноатомов на I мл среды инкубации. Электронно-микроскопическое изучение клеток культуры СПЭВ показало, что после измерения скорости дыхания в течение 2-4 часов ультраструктура клеточных органоидов, в том числе митохондрий, не меняется. При добавлении в полярографическую ячейку разобщителя, 2,4-дшштрофенола, дыхание клеток увеличивается в 3-5 раз по сравнению с эндогенной скоростью дыхания. Стимуляция дыхания наблюдается, начиная с 30 мкМ ДНФ, и возрастает с увеличением концентрации ДНФ. Максимальная стимуляция дыхания достигается при 270-390 мкМ, а при дальнейшем повышении концентрации ДНФ сменяется торможением дыхания. Таким образом, зависимость скорости дыхания клеток от концентрации разобщителя имеет "колоколообразный" характер. Максимально стимулированное ДНФ дыхание клеток'культуры без заметной лагфазы почти полностью подавляется I М цианида натрия.

Разработанный метод полярографического, измерения дыхания клеток культуры тканей позволяв? характеризовать митохоццриальное дыхание нативных клеток любой монослойной культуры, которая находится на стекле в стандартной среде культивирования. Используя этот, метод мы изучили изменения скорости поифебления кислорода при действии ингибиторов энергетического метаболизма на клетки культуры СГОВ..

Все исследованные ингибиторы дыхательной цепи (амитал, ротенон и антимицин А) практически полностью подавляют, потребление кислорода клетками культуры. Ингибиторы АТФ-синтетазы - олигомицин и ДЦКД - подавляют дыхание в 2,5-5. раз. Амитал подавляет дыхание сразу же после его добавления в ячейку, а ротенон,.антимицин А, олигомицин и ДЦКД через некоторое время (10-15 минут). Это объясняется тем, что амитал является водорастворимым ингибитором так же как, например, цианид, и быстро проникает в клетку, а остальные ингибиторы являются спирто-растворимыми веществами и медленнее проникают в клетку.

Угнетение дыхания олигомицином и ДЦКД снимается ДЙФ. Однако, несмотря на стимуляцию дыхания разобщителем* скорость потребления кислорода клетками при действии олигомицина и ДЦКД остается ниже, чем скорость дыхания контрольной культуры. Интересным являе1ся тот факт, что максимальная стимуляция дыхания в клетках, подвергнутых действию олигомицина и ДЦКД, достигается при более низких концентрациях ДНФ, чем в контрольных культурах, что, по-видимому, объясняется зачислением цитоплазмы клеток при действии ингибиторов, а ДНФ более эффективно действует при кислых рН (Лнберман и др., 1968).

Таким образом, в нашей работе мы показали изменения скорости потребления кислорода клетками монослойной культуры, растущей на стекле, которые возникают при нарушении процессов энергетического метаболизма и зависят от характера примененного ингибитора. /

3. Изменения мембранного потенциала митохондрий и морфологии мито-

. хондриального ретикулуыа клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма.

Состояние мембранного .потенциала митохондрий клеток культуры СПЭВ мы изучали с помощью флуоресцентного красителя родамина 123, являющегося проникающим катионом. Накопление родамина 123 в матриксе митохондрий пропорционально величине электрической составляющей мембран-'цого потенциала, возникающего в результате функциональной активности дыхательной цепи. Таким образом, по интенсивности флуоресценции можно оценивать изменение.потенциала, а следовательно, и функциональную активность митохондрий.

В нашей работе мы получили изменения состояния мембранного потенциала митохондрий при действии всех изученных ингибиторов, но динамика этих изменений была специфична для каждого ингибитора. При действии ингибиторов дыхательной цепи частичное снижение уровня флуоресценции наблюдалось через 30 минут и 2 часа, а через 14 и.24 часа состояние мембранного потенциала митохондрий было различным. При действии амитала и антймицина А через 14 и 24 часа флуоресценция утрачивалась полностью, а при действии ротенона соответствовала контрольному уровню, При действии олигомицина через 30 минут, 2 и 6 часов уровень флуоресценции не отличается от контрольного, через 14-24 часа флуоресценция практически отсутствует, что говорит о падении мембранного потенциала.

Реакция клеток СПЭВ на действие ДЦКД имеет специфические особенности, по сравнению с реакцией на воздействие других ингибиторов. При действии ДЦКД в течение I и 6 часов интенсивность флуоресценции митохондрий сохраняется на уровне контроля, так ге как при действии олигомицина, но при этом через 6 часов воздействия происходит сильное .набухание штохонцрий и можно наблюдать ярко светящиеся крупнш

гранулы, значительно превышающие по размерам митоховдрии контрольных клеток. Через 14 часов воздействия интенсивность флуоресценции практически полностью утрачивается, как и при действии на этот срок амигала, антимицина А и олигомицина, но.при действии ингибитора в течение 24 часов можно наблюдать слабую флуоресценцию отдельных крупных набухших митохондрий.

Помимо изменения функциональной активности митохондрий, ш также показали, что при действии всех изученных ингибиторов нарушается трехмерная организация хонцриома клеток СПЭВ: уже через 30 минут воздействия митоховдриальная сеть, состоявшая из длинных митоховд-риалышх нитей распадается на мелкие округлые органеллы. Происходит фрагментация шгохоцдриального ретикулума. Такая картина сохраняется до 24 часов действия ингибиторов.

В литературе имеются данные о подобной реакции митохондриального рэтккулума при различных воздействиях (Зоров, 1988; Chen, 1989). (Ложно предполагать, что фрагментация митохондрий является неспецифи-чэской общеклеточной реакцией на неблагоприятное воздействие, запускаемой через систему вторичных посредников. Биологический смысл этого изменения морфологии хондрлома клетки остается неясным и требует дальнейшего изучения.

Помимо фрагментации, ш наблюдала еще один тип нарушения структуры митохондриального ретикулума. При действии ротенона в тех клетках, где сохраняются палочковидные митохондрии, они теряют правильную ориентацию и митохондриальная сеть выглядит "спутанной". Как известно, ротенон,. помимо ингибитора дыхания, является колхициноподобным агентом, препятствующим полимеризации тубулина. В клетке существует корреляция пажду распределением митохондрий и микротрубочек. Для пра-•яьльной организации длинных прямых митохондрий в клетке необходимо ••-•лгп"! с о "л кнтактгшх микротрубочек. При разрушения микротрубочек

ротеноном прямые нитевидные митохондрии становятся изогнутыми и скрученными.

Таким образом, при действии ингибиторов энергетического метаболизма происходит падение мембранного потенциала митохондрий и нарушается морфология митоховдриалыюго ретикулума клеток культуры СПЭВ. Характер, степень и динамика этих изменений зависят от механизма действия примененного ингибитора.

4. Изменения ультраструктуры клеток СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма.

При нарушении энергетического метаболизма наблюдаются существенные изменения ультраструктуры клеток СПЭВ. При действии ингибиторов дыхательной цепи через 15-30 минут происходит.дезагрегация полисом с образованием большого числа одиночных рибосом. В цитоплазме появляются электронноплотнне "ядрышкоподобные" гранулы с тонковолокнистой структурой, содержащие РНП. Наблюдается конденсация митохондрий, которая характеризуется увеличением внешнего компартмента и внутрикристного пространства с соответствующим уменьшением объема матрикса и увеличением его электронной плотности.

По мере дальнейшего действия ингибиторов стадия конденсации сменяется постепенным набуханием митохондрий. Через 6-14 часов воздействия митохондрии превращаются в светлые вакуоли с одиночными кристами. Появляется большое количество длинных узких каналов эндоплазматическо-го ретикулума.-Хроматин в ядрах значительно конденсирован. В некоторых ядрах наблюдается расширение перинуклеарного пространства.

Действие ингибиторов АТФ-синтетазы вызывает значительные изменения ультраогруктуры клеток. Через 30 минут - I час воздействия происходит уменьшение числа полисом и появление большого количества одиночных рибосом. В цитоплазме появляются "ялрншкоподобнне" гранулы. Происходит постепенное набухание митохондрпИ без стадии их копденглш'.и.

Через 14-24 часа инкубации клеток с ингибиторами ядра приобретают неправильную изрезанную форму. Хроматин в них сильно коцценсировая, церинуклеарное пространство расширено. При действии олигомицина происходит сильное набухание каналов гранулярного эвдоцлазматического рети-кулуыа, при действии ДЦКД они остаются длинными и узкими. При действие олигомицина митохондрии превращаются в светлые вакуоли практически без крист. При действии ДЦКД, по-видимому,.происходит процесс объединения одиночных набухших митохондрий, т.к. в клетках можно видеть многокамерные образования, состоящие из округлых одиночных вакуолей. Каждая такая вакуоль окружена.мембраной, а вся многокамерная структура покрыта второй мембраной..

. Как известно, клетки отвечают на альтерирующее воздействие ограниченным числом ультраструктурных изменений (Авцын, Шахламов, 1979; Ченцов, 1984). При действии ингибиторов окислительного фосфорилирова-ния мы наблвдали рад изменений клеточных органоидов, сходных для дейотвия всех исследовавшихся веществ и характерных также и для других альтерирующих факторов. Вместе с тем для действия каждого ингибитора мы находили какие-то специфические изменения клеток или динамику и степень выраженности, по -которым отличался ответ, на действие разных ингибиторов. При 9том отличался ответ на действие даже веществ с одинаковой точкой приложения повреждающего воздействия в механизме окислительного фосфорилирования, например, ротенон и амитал, олигомицин и ДШД.

Распад полисом, конденйация ядерного хроматина, расширение пери-нуклеарного пространства и появление алектроннощштных гранул - это общие ультраструктурные изменения, характерные для всех исследованных нами ингибиторов.

Помимо общих реакций, каждый ингибитор или группа ингибиторов вызывали также специфические ультраструктурные перестройки клеток. Так,

например, для действия ротенона были характерны изменения ультраструктуры ядрышка: оно разрыхлялось, становилось сетчатым, в нем появлялись просветленные участки; ядрышки становились кольцевидными с центральной вакуолью.

При действии на клетки культуры амитала, аятвдицияа А и олигоми-цина через 30 минут можно видеть, что вакуоли и цистерны аппарата Гольджи слегка расширены. Это небольшое набухание аппарата Гольджи сохраняется все врет действий ингибиторов, а в случае антимпцина А к 6 часам происходит нормализация ультраструктуры этого органоида. Более существенные изменения ульграегрукгуры происходят при действии ДЦКД: наблвдается увеличение количества и сильное набухание элементов аппарата Гольда.

Ультраструктурные изменения гранулярного эндоплазматического ре-тикулума различаются при действии разных ингибиторов окислительного фосфорилирования. При действии ротенона л антишцина А каналы ретику-лума остаются узкими, с с ерш электронноплотным содержимым, но значительно удлиняются. При действии амитала наблюдается небольшое набухание каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума. Наиболее сильные изменения претерпевает ретикулум при действии олигомицина: чорэз 20 часов воздействия каналы сильно набухают и превращаются в раздутые цистерны, имеющие неправильную разветвленную форму. Интересно отметить, что хотя ДЦКД также является ингибитором АТФ-синтетазы, как и оллгомицин, он не вызывает нарушений ультраструктуры гранулярного эндоплазматического ретикулума. • .

Ультраструктурные изменения митохондрий, вызываемые ингибиторами энергетического метаболизма, зависят от механизма действия этих веществ. Ингибиторы дыхательной цепи вызывают сначала конденсацию мн-тохоадрлй (через 15-30 минут), а затем их набухание (через 2 часа воздействия). Эта динамика изменений митохондрий одинакова при доГ.ст-

вии всех трех ингибиторов, но степень конденсации выше при воздействии адатала. При действии ингибиторов АТФ-синтетазы наблюдается постепенное набухание митохондрий. Хотя общая направленность процесса набухания одинакова при действии обоих ингибиторов, динамика и сте-цещ выраженности этого явления существенно различаются. Уже через 15-30 ыинут действия ДЦКД начинается набухание митохондрий, и через I час они все имеют вид светлых вакуолей, а при действии олигомицина такая картина наблодается лишь через 8 часов. Дяя действия ДЦКД характерно появление, начиная с 6 часов, многокамерных структур, образующихся, по-видимому, в результате слияния отдельных митохондрий, чего не наблвдается при действии олигомицина.

Таким образом, действие ингибиторов окислительного фо с формирования приводит к цепи сложных и взаимосвязанных реакций, следствием которых являются общие и специфические изменения ульграструктуры клеток.

5, Репарация повреждений клеток культуры СПЭВ после действия ингибиторов энергетического метаболизма.

I

В нашей работе мы показали возможности восстановления нормальной митотической активности, восстановление мембранного потенциала и морфологии митохондриалъного ретикулума, а также возможность репарации ультраструктурных нарушений клеток культуры СПЭВ после снятия альтерирующего воздействия.

Било установлено, что характер, степень и динамика восстановительных процессов в клетках имели различия в зависимости от механизма действия применяемого ингибитора.

При отмывании клеток СПЭВ от ингибиторов дыхательной цепи в культуре через 2-6 часов восстанавливалась нормальная митотическая активность, соответствующая контрольному уровню.

При удалении олигомицина и ДЦКД из среды культивирования наблюда-лооь частичное восстановление митотической активности. Через 2 часа

оплывания олигомицина митотический индеко составлял 79/2 контрольного уровня. При отмывании ДЦКД в культуре появлялись нормальгше митозы, которые отсутствовали при действии ингибитора. Увеличение количества нормальных митозов по мэре увеличения срока отмывания и уменьшение 'гасла к-метафаз свидетельствует о том, что клетки выходят из блока в к-метафазе и восстанавливают способность к нормальному делению. Кроме нормальных митозов и к-метафаз при отмывании ДЦКД в культуре встречаются многополюсные штозы, чего не наблщается при отмывании других ингибиторов. Возшшювоние индуцированных многополюсных митозов определяется снятием действия ДЦКД. Многополюсные штозы представляют собой клетки, восстанавливающиеся после блока в к-метафазе..Результатом многополюсных митозов является образование доликариоцитов, содержащих микроядра, которые наблюдаются на всех сроках отмывания ингибитора.

При удалении ингибиторов дыхательной цепи из среды культивирования через 2 часа наблюдалось полное восстановление мембранного потенциала митохондрий: интенсивность свечения соответствовала контрольному уровню. При отмывании от олигомицина можно наблюдать картину частичного восстановления функциональной активности митохондрий: интенсивность флуоресценции еще пике, чем в контроле, но значительно вше, чем до момента отмывания. При отмывании от ДЦКД восстановления мембранного потенциала не происходит.

Восстановление нормального штохондриального ретикулума в клетках культуры СПЭВ наблюдалось только при удалении ротэяона из среды культивирования. При отмывании других изученных ингибиторов митохондриаль-ная сеть оставалась фрагментированной.

При отмйвании клеток культуры СПЭВ от ингибиторов дыхательной цепи мы подошли полное восстановление уль'траструктупы моток: митохондрии приобретали орто,го::сальнуп конформацию, рибосолн бати собраны в полисом!, ядра т:оли :п*сузнз расположенный хро;'ат::н.

При отмывании клеток культуры от ингибиторов АТФ-синтетазы наблю-далаоь картина лишь частичного восстановления. Ультраструктуру клеток, наиболее близкую к норме, мы наблвдали через 24 часа отмывания после 14-часового воздействия олигомицина, хотя и в этом случае в клетках, иараду о ортодоксальными, встречались набухшие ыитоховдрии. При отмывании после 24-часового воздействия ингибитора в клетках, наряду с нормализацией удыраструктуры, сохранились картины повреждения органоидов.

Сходная картина наблодается при отмывании клеток после часового действия Д1Щ. В клетках развивается два типа процессов. С одной стороны наблюдаются явления, характерные для продолжающегося действия ингибитора. С другой стороны можно видеть частичную нормализацию ультраструктуры клеток. Создается впечатление, что действие связавшегося с клеткой ДЦКД продолжается, но оно значительно слабев при от- ■ мывании ингибитора, чем при постоянном контакте клеток с ДЦКД.

Сравнивая результаты, полученные нами при изучении восстановления митотической активности, мембранного потенциала, морфологии митохонд-риального ретикулуыа и ультраструктуры клеток при удалении ингибиторов из среды культивирования, необходимо отметить, что они хорошо коррелируют друг с другом. При этом ингибиторы энергетического метаболизма образуют последовательный ряд по степени восстановления изученных параметров.

Полное восстановление структуры и функции клеток по веем изученным параметрам наблюдалось только при отмывании ротенона. При отмывании культуры от амитала и антимицина 'А происходило восстановление проли-феративной активности, мембранного потенциала й ультраструктуры клеток, но митохондриальная сеть оставалась фрагментированной, т.о. но восстанавливалась нормальная морфология хондриома клетки. При отмывании клеток культуры от олигомицина происходило частичное восстановло-

низ всех изученных показателей. При удалении ДЦКД из среды культивирования наблюдались два типа процессов: одни связаны с продолжающимся действием ингибитора, другие приводят к частичной нормализации структуры и функции клеток.

Различия в степени отмывания ингибиторов дыхательной цепи и мито-хонцриальной АТФ-синтетазы, вероятно, объясняются механизмом их действия. Олигомицин и ДЦКД образуют в клетке более прочные химические связи, поэтому степень поврачщения будет больше, а возможность восстановления будет меньше, чем при действии ингибиторов дыхательной цепи.

Таким образом, можно заключить, что характер, степень и динамита репарационных процессов в клетках имеют различия в зависимости от •механизма действия примененного ингибитора, так же как и характер, степень и динамика изменения структуры и функции клеток специфичны для действия каждого ингибитора.

ВЫВОДЫ

Исследование морфо-функциональных изменений, возникающих в клетках • культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического метаболизма позволяет сделать следующие выводы:

I. Происходит нарушение пролиферативной активности культуры СПЭВ в

зависимости от механизма действия ингибитора:

а) полное подавление митотических делений клеток при действии амитала и олигомицина;

б) частичное снижение митотического индекса при накопления к-кегэ-фаз и уменьшение числа нормальных метафаз при действии антими-цина А;

в) увеличение митотического индекса культуры за счет накопления к-метафаз при одновременном резком стгг.пшга числа нпрг^льннх «итогов при действии ротенона л ДШД,

2. Разработан метод полярографического изучения потребления кислорода клетками культуры, который позволяет характеризовать митохондриаль-ное дыхание клеток любой монослойной культуры, находящейся на стекле в стандартной среде для культивирования. Этот метод может быть 'использован дая изучения интактннх клеток и влияния различных биологически активных веществ на дыхание клеток в культуре тканей.

3. Клетки культуры СГОЕ характеризуются высокой степенью сопряжения дыхания и фосфорилирования, о чем свидетельствует увеличение потребления кислорода в 3-5 раз при добавлении разобщителя-дшштрофенола.

4. Максимально стимулированное ДНФ дыхание клеток культуры СПЭВ практически полностью подавляется ингибиторами цепи переноса электронов - цианидом, амиталом, ротеноном, антимицином А.

5. Дыхание клеток культуры СПЭВ изменяется при действии ингибиторов митохондриальной АГФ-синтетазц:

В) эндогенное дыхание клеток тормозится олигомицином и ДЦКД;

б) дыхание, подавленное при действии олигомицина и ДЦКД, стимулируется при добавлении ДНФ, но несмотря на эту стимуляцию, скорость потребления кислорода клетками при действии олигомицина и ДЦКД остается ниже, чем скорость дыхания контрольной культуры;

в) максимальная стимуляция дыхания в клетках, подвергнутых действию олигомицина и ДЦКД, достигается при более низких концентрациях ДНФ, чем в контрольных культурах, что.вызвано закислением Цитоплазмы клеток при действии ингибиторов.

6. Происходят морфо-функциональше изменения митохондриальной системы клеток культуры СПЭВ:

а) падение мембранного потенциала и, следовательно, функциональной активности митохондрий через 14-24 часа действия ашт&ла, анти-мицина А, олигомицина и ДЦКД, о чем свидетельствует отсутствие флуоресценции митохондрий после окрашивания родамином 123;

б) штохоццриальная сеть фрагментируется на мелкие округлче орга-неллы при действии всех изученных ингибиторов через 30 минут, и эта фрагментация сохраняется в течение суток; ..

в) наблюдаются два типа изменений ультраструктуры митохондрий:

1) конденсация, сменяющаяся последующим.набуханием при действий ингибиторов1 цепи переноса электронов;.

2) постепенно® набухание без стадии, конденсации при действии ингибиторов- штоховдриальной' АТФ-синтетазн.

7. Наблюдаются изменения ультраструктуры других органоидов клеток культури СГОВ; Ряд ультраструктурйых нарушений - дезагрегация полисом на одиночные рибосомы, конденсация ядерного хроматина, расширение перинуклеарного пространства, появление ядрышкоподобннх гранул в цитоплазме- - характерен для всех изученных ингибиторов. Другие изменения - набухание аппарата Гольджи и каналов гранулярного эндошгазматического- ретикулума - наблюдаются только при дейст-

. вии некоторых ингибиторов.

8. Наблюдается полная или частичная1, в зависимости от использованного ингибитора, обратимость возникаю: в клетках изменений:

а) полное восстановление нормального- митотического режима при перенесении в чистую среду клеток,, шжубировавяихся с ингибиторами дыхательной цепи; частично® восстановление пролиферативной активности клеток, на которые воздействовали ингибиторы мито-хондриальной АТФ-синтетазы;

б) мембранный потенциал митохондрий поляостбю восстанавливается при отмывании от амитала, ротенона ег гзтгмицина А, частпчно восстанавливается при удалении олатос^сзтст: и но восстанавливается при отагоании от ДЦКД;

в) полное восстановление морфологии.хондриома клеток наблюдается только при отмывании от ротенона; при удалении всех друтих ингибиторов из среды культивирования митохондриальная сеть остается фрагментированной; .г) полное восстановление нормальной ультраструктуры клеток, инкубировавшихся . о ингибиторами дыхательной цепи через 24 часа после отмывания; частичное восстановление ультраструктуры клеток при отмывании от ингибиторов митохондриадьвой АТФ-синтетазы.

9. Структурные ц функциональные изменения клеток культуры СГОВ, вызываемые ингибиторами энергетического метаболизма, и репаративные процессы в этих клетках имеют рад общих черт, характерных для развития общей неспецифической реакции клеточных органоидов на повреждение. Вместе с том совокупность этих изменений, степень их выраженности и динамика развития имеют особенности, характерные для действия каждого отдельного ингибитора.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. ПоляковаИ.А., Лейкина М.И. Действие олигомицина на клетки культуры СПЭВ //Тезисы.докладов X Всесоюзн, конф, по электронной микроскопии. -М., 1976. - С.155-157.

2. Полякова И,А,, Зоров Д.Б., Лейкина М.И., Ченцов Ю.С. Изучение сво-ррсти дыхания и ультраструктуры клеток культуры СПЭВ при действии ингибиторов энергетического обмена //Митохондрии. Механизмы сопря-

. жения и регуляции. - Пущино, 1981. - С,II,

3. Лейкина М.И., Внукова З.Е,, Полякова И.А, Изменение ультраструктуры митохондрий и скорости дыхания в клетках культуры СПЭВ при действии цианида //Митохондрии. Механизмы сопряжения и регуляции. -Пувдно, 1981. - С. 12.

4. Лейкина М.И., Полякова И.А., Ченцов Ю.С. Пролиферация клеток в культуре тканей при действии ингибиторов энергетического обмена //Цитология.. - 1981. -Т.23, №10. -. C.I206-I207.

5. Полякова И.А., Зоров Д.Б., Лейкина М.И» Полярографический анализ дыхания клеток монослойной культуры //I Всесоюзн..биофизический съезд: Тез докл. стендовых сообщений. - T.I. -Ii., 1982. - С.294.

6. Полякова И.А., Зоров Д.Б., Лейкина М.И., Действие олигомицина на ультраструктуру и дыхание Клеток //I Всесоюзн. ..биофизический съезд: Тез. докл. стендовых сообщений. - T.I. -М.,1982. - С.294.

7. Лейкина М.И., Полякова И.А., Чендов Ю.С. Ультраструктура митохондрий при действии различных ингибиторов энергетического обмена //ШВсесоюзн. конф. по патологии клетки. - М., 1982. - С.73-74.

8. Полякова И.А., Лейкина М.И., Ченцов Ю.С. Изменения ультраструктуры клеток при подавлении активности митохондриальной АТФ-азы

//III Всесоюзн. конф. по.патологии клетки. - М., 1982. - С.76-77.

9. Полякова И.А., Зоров Д.Б., Лейкина М.И. Полярографическое изучение дыхания клеток в культуре тканей //Цитология. - 1983. - Т.25,

2. - С.162-167.

Ю.Полякова. И.А., Лейкина М.И., Быстревская В.Б., Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С. Индукция патологических митозов в культуре клеток ингибитором митохондриальной АТФ-азн //Цитология. - 1983. - Т.25, Ä 9. - C.I09I.

II.Лейкпна М.И., Полякова И.А., Ченцов Ю.С., Зоров Д.Б. Динамика реактивных изменений ультраструктуры митохондрий в клетках монослойной культуры при переводе.ее во взвесь //Реактивность клеточных оргаяелл. - Тбилиси, 1984. - С.63-66.

12, Дейкина М.И., Полякова И.А., Балосорочко Е.В., Зоров Д.Б.

Морфо-функциональные изменения митохондрий в культивируемых клетках при действии и отмывании.ротекона //1У Всесоюзн, конф. по . патолрщи. клетки, -Ы,, 1987, - С,25.. . •

13,'Дейкина М.И., Драчук Л.П., Полякова И,А. Особенности изменений ультраструктуры опухолевых клеток в культуре тканей при действии ингибиторов энергетического метаболизма //Цитология и генетика. -1989. - Т.23, * J, - С.7т8,. * . .

14, Дейкина М.И,, Полякова И.А,, Ченцов Ю.С. Ультраструктурные изменения в клетках монослойной культуры при действии различных ингибиторов энергетического метаболизма //Ультраструктурные основы патологии органов и тканей, - Тбилиси,.1989. - C.I67-I69,

Ig. Полякова И,А,, Дейкина М.И., Зоров Д.Б,, Ченцов Ю.С. Морфо-функцио-нальные изменения клеток монослойной культуры при ингибировании вдтохоцдриальной АТФ-синтетазы //Ультраструктурные основы патологии органов и тканей. - Тбилиси, 1989.. - С.218-219, .

16. Дейкина М.И,, Дитинская Д.Л., Полякова И.А., Зоров Д.Б. Изменение дыхания и внутриклеточного.рй в клетках.культуры СПЭВ при действии олигомицина //ДАН СССР..г 1990, - Т.312, И 5. -С.1253-1256.

17, Дейкина М.И., Дитинская Д.Л., Полякова И.А., Зоров Д.Б,, Оглоб-дица Т,А. Внутриклеточный рН и интенсивность дыхания как показа- . ¡Годи реакции' культивируемых клеток на действие ингибиторов энер-

. готического метаболизма //III Всесоюзн. совещание "Культивирование клеток кивотных иччеловека". - М., 1990. - С.32-33.