Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации клеток

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации клеток"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ТЕОРЕТИЧЕСКОЙ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОФИЗИКИ

на правах рукописи

Г Б ОД

... Соловьева Нарина Евгеньевна

•<: д. <••«!/,

УДК 577.332,463:576.5

Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации клеток

( 03.00.02 - биофизика)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино 1994.

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: кандидат физико-математических наук, В.С.Акатов,

доктор технических наук, З.И.Лежнев.

Официальные оппоненты: доктор физкко-катекатическнх наук, В.В.Снолянинов, доктор биологических наук, В.П.Зинченко.

Ведущая организация: Московский Государственный Университет, биологический факультет. .„ _ , „ .

„ // -гг-ФКсЛ

Защита диссертации состоится п/и " » 1994 г. в

•/Х*< 1)0 часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН ( г.Пушино, Московская обл.,142292). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретической и экспериментальной биофизики

Автореферат разослан 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат // < биологических наук

7 Ь

А.Нелипович.

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Выяснение взаимосвязи кежду прикреплением к твердому субстрату и запуском пролиферации субстратзависимых клеток представляет интерес как с теоретической стороны, для изучения механизмов регуляции пролиферации, так к с практической точки зрешгя, для оптимизации процессов культивирования клеток, размножение которых зависит от прикрепления к подложке. Изучение адгезии в разной степени трансформированных клеток способно также внести вклад в понимание механизмов трансформации и регуляции метабо-лизна таких клеток.

В последнее время предпринято несколько попыток связать субстратную зависимость пролиферации с величиной внутриклеточного рН <рн^). Роль рН^ в иетаболизме активно обсуждается в течение 13 лет. Известно, что активный метаболизм в большинстве случаев проходит при повышенных по сравнению с состоянием покоя значениях рН^. Показано, что трансформация клеток изменяет их рН^-регуляцию, ведя к нарушению взаимосвязи между адгезией и пролиферацией. Сам процесс адгезии ведет к тому, что на определенной его стадии происходит подъем рН^, сравнимый по величине с защелачиванием, вызываемым ростовыми факторами. Таким образом, хотя роль рН^ в метаболизме еще окончательно не установлена, представляется возможным, что изменение рН^ в процессе прикрепления субстратзависимых клеток к твердой подложке может инеть значение для развития каскада событий, которые ведут в итоге к запуску пролиферации этих клеток. Однако многие вопросы еще окончательно не выяснены. Показано, например, что подъем рН^ при адгезии может иметь место в таких условиях, когда пролиферация не происходит, например, в физиологическом растворе. Практически отсутствуют данные относительно того, за счет каких механизмов регуляции внутриклеточного рН осуществляется защелачивание цитоплазмы при контакте с субстратом (исключая работы Марголиса с соавторами, где показана роль Иа+/Н+ антипорта в этом процессе). Нет сведений о том, какова связь между адгезией, рН^ и пролиферацией клеток, растущих как в суспензии, так и в прикрепленном состоянии.

Таким образок, изучение адгезки к вызванных ею изменений на примере клеточных линий, пролиферация которых в разной степени зависит от прикрепления, могло бы прояснить некоторые стороны проблемы

субстратной зависимости пролиферации, а также внести вклад в разви] представлений относительно роли рН^ в регуляции иетаболизиа.

Цель работы. Изучение взаимосвязи между внутриклеточным рН, прикреплением к твердой подложке клеток с различной зависимостью ростЕ от прикрепления и запуском их пролиферации, а также исследование не личия отдельных систем рИ-регуляции и их роли в защелачивании, вы; ваекок адгезией.

Основные задачи:

1. Исследование с помощью двухволнового флуоресцентного метода опрЕ деления рН^ изменений внутриклеточного рН в ходе культивирования клеток с ранних этапов прикрепления (или высева в суспензию), до ос тановки пролиферации.

2. Изучение с помощью флуоресцентного метода, а также методики загрузки кислотами и основаниями систем регуляции рН^ исследуемых клеток.

3. Изучение с помощью флуоресцентного метода в средах с измененным составом систем рН-регуляции, ответственных за подъем рН^ в ходе прикрепления клеток к стеклу.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение кинет» внутриклеточного рН в процессе культивирования клеток, отличающихся по субстратной зависимости их пролиферации, в том числе исследована взаимосвязь между адгезией к твердому субс трату, защелачиванием цитоплазмы и размножением клеток, пролиферирующих как в суспензионной, так и в прикрепленной культуре.

Установлено наличие корреляции кежду пролиферацией субстратзави-схных клеток и подъемок рн^ на 0.2-0.3 ед.рН, а также отсутствие такой корреляции для субстратнезавис иного роста, который может проходить при рН^, практически не отличающихся от рН^ непролифери-рующих клеток.

Оценена различная роль сыворотки и прикрепления в защелачивании цитоплазмы субстратзависимых клеток. Высказана гипотеза и получены экспериментальные данные относительно взаимодополняющего влияния на рН^ сыворотки и адгезии.

Показано, что подъем р1Ь при адгезии может обеспечиваться различ ной по длительности активацией нескольких рН-регулирующих систем, включая транспорт НС03 в клетку, а также НСО^- и N3 -независимую.

нечувствительную к анилориду и олигомицину систему, причем активация На+/Н+ обмена ножет не происходить.

Практическая ценность. Полученные экспериментальные данные расширяют представление о роли рн^ в метаболизме, а также о механизмах, посредством которых контакт с субстратом стимулирует пролиферацию.

Работа вносит вклад в развитие представлений относительно участия и роли Na+/H+ обмена, транспорта бикарбоната в цитоплазму, С1 /НС03 обмена и независимой от натрия и бикарбоната системы в регуляции рН^.

Публикации. Результаты работы были изложены на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" (г.Ленинград,1989), а также на 3 Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека" (Г.Путино,1990) и совещании "Биология клетки в культуре" (г.С.-Петербург,1992). По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы И'методы исследования, результаты и их обсуждение, заключение и выводы. Список цитируемой литературы состоит из ссылок на 173 источника, в том числе 154 зарубежных. Обьем работы составляет страниц, в ток числе 23 рисунка и 3 таблицы.

Материалы и методы, в работе использовали:

фибробластЫ китайского хомячка линии B-II-d-ii-FAF-28, клон 431, выращиваемые в снеси сред Игла я 199 на солевом растворе. Эрла с бикарбонатным буфером (2,2 г/л), 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС) и 100 мкг/мл канамицина.

фибробласты NIH-3T3, выращиваемые на среде ДМЕ с 3,7 г/л бикарбоната натрия, 100 мкг/мл канамицина и 10% фатальной телячвй сыворотки.

клетки эпителия почки поросенка СПЭВ, выращиваемые на среде 199 с 2,2 г/л бикарбоната натрия, 100 мкг/мл канамицина и 10% КРС.

фибробласты сирийского хомячка ВНК-21, выращиваемые в суспензии (среда Игла для суспензионных культур, включающая 20 мМ бика-рбонатного буфера, 5 г/л гидролизата лактальбумина, 0,3% метил-целлюлозы, 4 г/л глюкозы, 150 мкг/мл гантамицина,10% КРС) либо на твердом субстрате, в среде Игла (MEM) с 10% КРС и 150 мкг/мл гентамицина.

фибробласты мыши LS, выращиваемые в среде Игла для суспензи-

- ч -

оиных культур того же состава, что и для ВНК-21.

клетки адаптированной к росту в монослое сублинии LSM, полученной в Институте цитологии АН СССР из клеток LS, выращивались в среде Игла, модифицированной Дальбекко, с добавлением 100 мкг/мл ка-намицина и 10 % сыворотки крупного рогатого скота.

Указанные выше среды применялись также без сыворотки; в раде опытов бикарбонатный буфер заменялся на HEPES. В работе использовали также глюкоз но-солевую среду (3 ММ КС1Г 2мИ СаС12, 1 KM МдС12, 5 мН глюкозы, 130 мИ NaCl или холинхлорида, 20 МИ HEPES, рН 7.4) и глюкоз но-глюконатную среду (130 мМ глюконата натрия, 10 мм глюкозы, 20 нМ HEPES, рН 7.4). Использовали амилорид в концентрации 1 мН, олигомицин в концентрации 2- 10 мкг/мл. Адгезию исследовали при посеве клеток на покровные стекла в культуральные флаконы или чашки Петри при 5% СО^ над средой.

Рост в суспензии исследовали в биореакторах объемом 150 кл с перемешивающим магнитнын стержнем при 100 об/мин.

Величину рН£ определяли по методу соотношения флуоресценции на двух длинах волн 530 и 570 нм с вычетом фоновой флуоресценции среды непосредственно около клеток, окрашенных 10 5-10 е И флуоресцеиндиа цетата (FDA) или 10 е М ацетоксиметилового эфира бискарбоксиэтилкар боксифлуоресцеина. Использовали двухканальный микроспектрофлуори-метр, связанный с компьютером. Определяли среднее по популяции рН^ по результатам измерения соотношения флуоресценции 40 - 60 отдельны клеток. Эксперименты проводили в 5 - 7 повторностях (п).Ошибка в определении среднего р!Ь не превышала 0,02 ед. рН.

Калибровочные кривые строили по методике Томаса с соавторами ,

для чего клетки помещали в среду с высоким содержанием калия (130 м

КС1, 1 ИМ ИдС12, 20 KM HEPES, 5-10 мкг/мл нигерицхна) и определен

ным значением рН (забуференнын с помощью Tris или НС1). Для контрол

за приборок использовали калибровочные кривые, построенные в той же -5

среде с 10 М флуоресцеина. Все эксперименты и измерения pH¿ вели при 37° С.

Подсчет числа клеток осуществляли на гемоцитометре, ошибка в определении не превышала 10Х.

Наличие и активность систем регуляции внутриклеточного рН опреде ляли по стандартным нетодикам (кислотной и щелочной загрузки с пос-

ледующей отмывкой и восстановлением рН^ в средах определенного состава) . Удельную активность систем рН-регуляции определяли как скорость восстановления р!Ь до начальных значений в данной среде после удаления соответствующей загрузки.

Основные результаты работы и их обсуждение.

1. Динаника изменений внутриклеточного оН в. процессе адгезии к твердому субстрату клеток, пролиферация которых зависит от прикрепления■

Опыты этой серии проводили в ростовой среде, в присутствие бикарбоната. Вначале определяли величину внутриклеточного рН суспендированных клеток, помещая окрашенную пробу в стеклянную камеру высотой 1 мм, сверху накрываемую стеклом. Измерения вели в течение 7-10 кинут до наступления этапа подъема рН^ в результате контакта с субстратом. Избегали длительного освещения одного и того же участка препарата с целью предохранить окрашенные клетки от фотоповреждения. Значения рН^ суспендированных в среде без сыворотки клеток различных линий находились в диапазоне 6.7 - 6.93 (см. табл. 2). Присутствие в среде сыворотки вело к повышению рН^ клеток в суспензии на 0.1 - 0.18 ед.рН. Этот подъем мог быть непродолжительным, как у фибробластов китайского хомячка, где рН^ через 30 минут возвращался к первоначальному уровню, в других линиях субстратзависимых клеток - ШН-ЗТЗ и СПЭВ наблюдали более устойчивое защелачивание цитоплазмы, которое поддерживалось в течение 0.5- 2 суток. Но сыворотка была не способна вызвать пролиферацию неприкрепленных клеток.

Измерение рН^ в процессе прикрепления осуществляли следующим образок. Суспензию клеток (в данной серии опытов - фибробластов китайского хомячка, ШН-ЗТЗ, клеток СПЭВ) помещали на покровные стекла в пенициллиневые флаконы или чашки Петри. Через 15 минут окрашенные РЭА клетки на стекле помещали в стеклянную камеру со средой и измеряли среднее рН^ популяции. Как в среде с сывороткой, так и в отсутствие сыворотки наблюдали подъем рН^ через 20 минут после высева на величину 0.2 - 0.35 ед.рН (рис.1,данные для фибробластов как видим, этот подъем превышал по амплитуде защелачивание в ответ на ростовые факторы. Однако длительность защелачи-вания, вызываемого адгезией, зависела от присутствия в среде сыворо-

- б -

тки. В среде без сыворотки, как видно из рис.1, через определенное врекя уровень рН^ снижался до значений, близких к рН.^ суспендированных клеток или клеток в стационарной фазе роста. В среде с сывороткой поддерживался повышенный уровень рН^, что коррелировало с пролиферацией. Переход в стационарную фазу роста сопровождался постепенный снижениен р1Ь до значений, близких к клеток в суспензии. «

М 7.2

7.0

■6В

6.6

6В 6.6

у см2

■5Ю5

1Г

/¿их-6

V«'«.- V

рН: • • 5

7.2.

1..

9.0 1?

6.8 *

6.6

6 ■ • ¿» ■ ■ «а ■ ' 'чао

г

&в

6.6

"сЯг-

о и &"гм

Рис.1.Динамика внутриклеточного

О 4 ' & нас-

рН в процессе культивирования на

твердом субстрате с сывороткой (а) и без сыворотки (б), в суспензии с сывороткой (в) и без сыворотки (г) фибробластов КХ.Ошибка в определении среднего 0.01-0.02 ед.рН . X—* - кривые роста.

Таким образом, очевидно, что, взятые отдельно, ростовые факторы не способны вызвать повышение рН^ до уровней, характерных для пролиферирукпцих субстратзависимых клеток, а подъем рН^ при контакте с субстратом в отсутствие ростовых факторов непродолжителен.

2. Динамика изменений рН^ клеток, пролиферация которых не зависит от прикрепления к субстрату.

Клетки ВНК-21 в суспензии без сыворотки имели рН^ В.73, в суспензии с сывороткой 6.76 в фазе логарифмического роста, и значение рН^ 6.7 в стационарной фазе. Как видим, добавление сыворотки практически не влияет на величину внутриклеточного рН этих клеток. При посеве на твердый субстрат через "30 минут рН^ клеток ВНК-21 поднимался до 7.0 - 7.2 (рис. 2), но спустя 12 - 16 часов (т.е. вреня, соответствующее лаг-периоду) рН^ начинал понижаться,

достигая значения В.8 к концу первых суток, и рост клеток продолжался при рн^ 6.8, практически как в суспензии. Т.е. значения рН^ клеток ВНК-21 при пролиферации и в суспензии, и в прикрепленном состоянии незначительно отличались от рН^ непролиферирующих клеток

Рост клеток ЬЭ происходил только в присутствии сыворотки, при этом рН. суспендированных клеток поддерживался на уровне 7.03.

\NZS_

р"1 7.06.866

^ Ут-Ч?. •• -У »:

О 20 4о' 60' 60' АХ> час.

&

№ и*

68 ¿у,"

О 8

■16 14 32 40 чв

¿0/! Без сыворотки, а также при

переходе в стационарную фазу роста рН^ был равен 6.95 - 6.97. Таким образом, пролиферация этих клеток также имела место при рН^, практически не превышающих рН1 непролиферирующих клеток. При попытке выяснить, какие изменения рН^ происходят в процессе адгезии к твердому субстрату, оказалось, что клетки ЬЭ неплотно прикреплялись к 1 Ш.С. стеклу (перенос в камеру без

встряхивания не вызывал их открепления) и не распластывались. рН^ прикрепленных клеток равнялся 7.07, т.е. защелачивания

Рис.2. Динамика внутриклеточного рН в процессе культивирования клеток ВНК-21 в суспензии (а) и на твердом субстрате (б) в среде с сывороткой. Ошибка среднего 0.01- 0.02. при адгезии практически не проис-X—X -кривая роста. ходило. Возможно, именно осла-

бление необходимости повышения р!Ь для пролиферации изученных в данной работе субстратнезависимых клеточных линий (к которым можно отнести, кроме ЪЭ, клетки ВНК-21 и ЬЭМ) определяет их способность расти без адгезии как фактора, вызывающего защелачивание цитоплазмы.

3.Динамика рН^ в процессе культивирования клеток линии ЬЭМ, частично зависимой от прикрепления к субстрату.

Клетки линии ЬЗМ, представляющие из себя популяцию суспензионной линии ЬЭ, адаптированную к росту в монослое, в суспензии без сыворотки имели рН^ 6.97, а добавление 10 % сыворотки вело к подъему рН^ на 0.15 - 0.17 ед.рН. При посеве на твердый субстрат в течение первых 20 минут происходил подъем рН^ на 0.2 ед.рН, и

в среде с сывороткой рН^ был равен 7.32, а в среде без сыворотки - 7.18. Наблюдалось поддержание повышенного уровня прикрепленных клеток в течение длительного времени как в среде с сывороткой, так и в среде без сыворотки. Это вызвало предположение, что в среде без сыворотки также имеет место пролиферация. Действительно, в этих условиях клетки пролиферировали. Более того, обнаружили,что пролиферация происходила также и в суспензии, независимо от присутствия сыворотки. Однако темп пролиферации зависел от условий культивирования и коррелировал с величиной рН. (табл. 1). В

Таблица 1.

Величина рН^, время удвоения и пролиферативный индекс клеток ЬБМ в зависимости от условий культивирования.

условия культивирования время удвоения пролиферативный индекс величина рН^ 1од-рост покой

тв.суб., сыв. 29 час. 8-12 7.32 7.10

тв.суб.,без сыв. 40 час. 4 - В 7.18 7.13

суСП., сыв. 37 час. 3-5 7.13 6.95

сусп., без сыв. >, 49 час. 2-3 6.97 6.95

более оптимальных условиях, в присутствие сыворотки и при контакте с субстратом, время удвоения составляло 29 часов, а рН равнялся 7.32. Наличие только одного из условий- сыворотки или контакта с субстратом- снижало темп пролиферации, при этом рН^ был также понижен по сравнению с наиболее оптимальными условиями. При отсутствии обоих факторов, повышающих рН^, то есть в суспензии без сыворотки, темп пролиферации был наиболее низким, что коррелировало с рН^ 6.97, характерным или даже более низким, чен рН^ не-пролиферирующих клеток. Таким образом,как видно из таблицы 1, при наличии контакта с субстратом обеспечиваются более высокие скорости пролиферации как в присутствие, так и в отсутствие сыворотки, что совпадает с более высокими значениями рН^.

4. Результаты изучения систем регуляции внутриклеточного рН.

Ча+/Н+ антипорт. При исследовании наличия данной системы регуляции рН. пользовались стандартной методикой. Клетки инкубировали

в глюкозно-солевой среде с хлоридом аммония (30-50 ММ) и отмывали в среде, где К1а+/н+ обмен был блокирован амилоридом ( 1 мМ)

р»с "7./ 6.967. 6.S

льсе

л/duCt

■талин хлорид

-Л«/'

или заменой натрия на эквимо-лярное количество холина. Во всех изученныых клеточных линиях такая обработка предотвращала восстановление рН^ до первоначального значения, и рН^ поддерживался на уровне 6.5 - 6.7 (рис.3). Удаление амилорида, а ~90 также перенос клеток в среду с

+ 130 мМ ЫаС1 вело к восстановлению до первоначального уро вня (7.0 - 7.1) за 10 - 20 минут, в зависимости от типа клеток, это говорит о наличии и активном участии Иа+/Н+ антипорта в защите цитоплазмы от за-

О ¿о бО

Рис 3.Демонстрация наличия Иа^/Н обмена путем восстановления концентрации натрия после кислотной загрузки в среде с холинхлоридом 1- фибробласты китайского хомячка (ФИ), 2- кпетки ВНК-21. ошибка среднего не превышала 0.02. кисления в изученных линиях клеток.

Транспорт бикарбоната в цитоплазму.

Роль НС03 в восстановлении рН1 после кислотной загрузки изучали путем добавления 20 мМ КаНС03 к клеткам, отмытым от МН4СХ в среде с амилоридом. В фибробластах китайского хомячка участие системы транспорта бикарбоната в восстановлении рН^ после кислотной загрузки практически не было обнаружено. В клетках ВНК-21, ЭТН-ЗТЗ» СПЭВ, ЬЭИ, ЬЭ наличие в среде бикарбоната вело к восстановлению рН^ клеток, обработанных амилоридом (рис.4). В клетках ВНК-21, ЬБМ это восстановление рН. происходило за 10 минут, тогда как в клетках N111-ЗТЗ, СПЭВ и Ы - за 30 - 60 минут. Необходимо отметить, что инкубируемые в глюкозно-солевой среде с 20 им НС03 клетки этих линий имели рН^ на 0.1 - 0.2 ед.рН выше, чем в среде без бикарбоната. Это также свидетельствует о наличии в данных линиях клеток системы переноса НС03 в цитоплазму, участвующей в защелачива-нии внутриклеточного содержимого. В фибробластах китайского хомячка как в.присутствие, так и в отсутствие бикарбоната рН^ был практически одинаков.

льсе

Рис.4. Демонстрация наличия транспорта бикарбоната в цитоплазму путем добавления 20 ми НСО к клеткам,

Л?

отмытым от в среде с 1 мН ами-

лорида и 130 кМ ЫаС1. 1-ФКХ, 2-ВНК-21.65

С1/НСОд натрий-независимый обмен. Этот обненник, активирующийся при защелачивании и работающий в направлении вывода щелочных эквивалентов из цитоплазмы, так же был найден не во всех клеточных линиях. Перенос клеток в среду без хлора (замена на глюконат) вызывал защелачивание клеток ВНК-21 на 0.3 ед.рН в отсутствие НС03, клетки ШН-ЗТЗ в присутствие

-СГ

рИ

7.6 7А-«-1 7.0

00

бикарбоната защелачивались на 0.7 ед. рН, а клетки ЬЭ и ЬЭМ - на 0.1- 0.2 ед.рН (что указывает на низкую активность обмена). Восстановление концентрации ионов С1 вело к возврату рН^ на первоначальный уровень. Замена ионов Иа+ на К+ или холин не оказывала влияния на эти изменения рН^, что говорит о независимости обменника от катионов. В

о го чо

Рис.5.Демонстрация наличия С1 /НС03 обмена путей восстановления концентрации С1о после щелочной загрузки клеток в бесхлорной среде. 1-клетки ШН-ЗТЗ, 2- ЬЭ.

фибробластах китайского хомячка и клетках СПЭВ обменник не был обнаружен.

5.Влияние сыворотки на величину внутриклеточного рН. В таблице 2 сопоставлены данные по стимуляции 10 У. сывороткой изученных клеточных линий в среде с бикарбонатом с результатами изучения их рН-регулирующих систем. Как известна, ростовые факторы оказывают стимулирующий эффект не только на Ыа+/Н+ обменник.

ки. Причем в зависимости от типа клеток активация какой-то ионной

но и на катион-зависимыи и катион-независимый НСО 3/С1- обменни

системы может быть более выражена, что ведет к сдвигу рН^ (напри-

Таблица 2

Наличие и активность систем рН^-регуляции у изученных линий клеток.

клетки величина рН^ /н+ транспорт С1 /НСО^

без сыв. 10% сыв. антипорт нс0з обмен

удельная активность, ед рН/мин*

ФКХ 6, .7 6. .88 0 .04 0 .002 -

шн-зтз 6, .9 7 . .0 0 .02 0 .009 0.09

СПЭВ 6. .95 7. .1 0 .015 0, ,018 -

ВНК-21 6. .7 6. .76 0. .013 0 .028 0.07

6. .97 7. .03 0. .056 0. .016 0.026

ьэм 6. .97 7. . 13 0, .08 0. .04 0.05

"ошибка в определении среднего не превышала 107.

мер, более сильная активация натрий-независимого обменника ведет к закислению цитоплазмы). В нашей работе не наблюдалось снижения рНА при стимуляции клеток сывороткой. Из таблицы 2 видно, что эащелачиванхе при стимуляции сывороткой происходило даже в тех клетках, где суммарная активность систем вывода протонов была меньше активности работающего на закисление С1 /НС03 обмена. То есть на основании данных лишь об удельной активности, полученных из опытов с восстановлением рН^ после кислотного (щелочного) шока, судить об активации обменников митогенами (а следовательно, и о рН^-ответе на стимуляцию) невозможно, так как даже однотипные системы регуляции рН^ имеют различные пороги активации и диапазоны активности в различных клеточных линиях. Необходимо отметить, что в культуральной среде без сыворотки в присутствие бикарбоната рН^ клеток ШН-ЗТЗ и СПЭВ, имеющих системы переноса НСО отличался от рН клеток в среде без бикарбо ната на 0.03 -0.03 ед.рН. То есть в отсутствие сыворотки бикарбонат неспособен повысить рН^ до уровней, которые достигаются при стимуляции. Напротив, в глю-козно-солевой среде добавление ИаНСО^ ведет к защелачиванию цитоплазмы на величину, сравнимую с рН^-ответом на ростовые факторы. Возможно, расхождение данных о влиянии бикарбоната на рИ^ объясняется изменениями рН-регуляции в зависимости от состава сред инкубации.

6.Активация систем регуляции внутриклеточного рН при адгезии клеток к твердому субстрату.

На примере трех субстратзависимых клеточных линий - фиброблас-тов китайского хомячка, Ы1Н-ЗТЗ и СПЭВ изучали, за счет каких систем рН-регуляции происходит защелачивание цитоплазмы при адгезии клеток к твердому субстрату.

Фибробласты китайского хокячка, высеянные на покровные стекла в ростовой среде в присутствие 1 мм ингибитора Иа+/Н+ обмена ами-лорида, в течение 30 минут закислялись от 6.85 до 6.5. При слабом прикреплении отсутствовало распластывание, клетки собирались в агрегаты, через 10 - 12 часов наступала их полная гибель (что может быть объяснено побочными эффектами амилорида на клеточный метаболизм) . Факт угнетения прикрепления на ранних этапах и отсутствие зацелачивания при ингибированном Иа+/Н+ обмене свидетельствует о ключевой роли ангипорта не только в восстановлении рН^ после кислотной загрузки в данной клеточной линии, но и в развитии рН^ответа на адгезию.

В клетках ШН-ЗТЗ и СПЭВ, как показано выше, система регуляции внутриклеточного рН более сложная. Роль Ла+/Н+ обмена в развитии рН-ответа на адгезию изучали в среде без бикарбоната. Эксперименты проводились как в культуральной среде без сыворотки, забуфе-ренной НЕРЕБ, так и в глюкозно-солевой среде.

При адгезии клеток N111-313 в среде ДМЕ происходил кратковременный подъем рН.^ от 6,94 до 7.26, затем к концу первого часа рН^ начинал снижаться, достигая значения 7.07 и далее поддерживался на уровне 7.05. Первоначальный кратковременный пик рН^ отсутствовал при ингибировании Ыа+/Н+ обмена амилоридом, при этом происходило повышение рН^ в течение 20 - 30 минут после посева от 6.87 до 7.07 и поддержание этого уровня рН^ в течение 6 часов наблюдения. В глюкозно-солевой среде с натрием наблюдали подъем р!Ь от 7.05 - 7.1 до 7.30 - 7.35 и падение до первоначального уровня к концу второго часа. При замене натрия на холин, а также при ингибировании На+/Н обмена амилоридои наблюдали подъем рН^ через 20 минут после посева от 6.95 - 7.0 до 7.25 и падение до первоначального уровня в течение 1-1.5 часа. То есть, кроме активации Ыа+/Н+ антипорта, при адгезии клеток ШН-ЗТЗ происходит активация системы повышения рН^,не зависимой от присутствия в среде бикарбоната и не чувствительной к амилориду ( в глюкозно-солевой среде этот подъем также не зависит от натрия, как показал опыт с хопин-

Рис.6. Динамика рН^ фибробластов ШН-ЗТЗ в процессе прикрепления к подложке (1,1',2,2') и в суспензии (3,3',4,4') в глюкозно-солевой среде, содержащей а) 130 мМ МаС1; б) 130 мН НаС1 и 1 мм амя-лорида. Стрелкой отмечен момент добавления 20 мМ ИаНСОд. 1',3',2', 4' — соответствуют динамике рН^ после добавления бикарбоната. Ошибка среднего не превышала 0.02 ед.рН. хлоридом).

Добавление 20 мМ МаНС03 к клеткам в среде ДМЕ при адгезии вызывало более длительное защелачивание, независимо от наличия в среде амилорида, хотя уровень рН^ в среде с амилоридом был ниже на 0.08 ед.рН. Аналогично этому, добавление бикарбонатного буфера к.клеткам, прикрепившимся в глюкоз но-солевой среде с амилоридом, в течение 15 - 20 кинут вызывало защелачивание цитоплазны (вслед за тем, как рН клеток понижался после первоначального подъема). Причем этот подъем рНА по скорости и амплитуде (0.23 - 0.3 ед.рН) превышал реакцию суспендированных клеток на добавление бикарбоната (рис.В). Таким образом, при адгезии клеток N111-3X3 также происходит активация транспорта бикарбоната в цитоплазму.

Аналогичные опыты были поставлены с клетками СПЭВ. Как видно из рис. 7, несмотря на наличие №+/Н+ обмена и транспорта ЛСО^ в цитоплазму, при адгезии этих клеток к твердому субстрату происходил подьем р!Ь, независимый от наличия в среде бикарбоната и не чувствительный к амилориду (амплитуда подъема была практически одинакова как в среде с бикарбонатом, гак и в среде без бикарбоната, независимо от наличия анилорида). Опыты в глюкозно-солевой среде показали, что замена натрия на холин или ингябирование ами-

лоридом Иа /Н обмена снижало абсолютную величину рН^ как суспендированных, так и прикрепленных клеток , но амплитуда рН^-отеета на адгезию при этой не менялась. Факт снижения рН^ в этих условиях говорит о том, что Ма+/Н+ обкен играет роль не только в восстановлении р1Ь после кислотного шока, но и в поддержании рН^ в физиологических условиях. Неизменность аплитуды повышения

Рис.7.Динамика рН^ в процессе прикрепления к стеклу клеток СПЭВ в среде 1Э9 в отсутствие бикарбоната (а) и при добавлении «ОС20 ни ЫаНС03 ( б), при адгезии к твердону субстрату (1,2) и в суспензии (3,4). 1,3-без амилорида, 2,4- с 1 мМ амилорида. Ошибка среднего не превышала 0.01 ед.рН.

рН^ говорит о том, что происходит активация не Иа+/Н+ обмена и не транспорта бикарбоната, а именно N8- и НСОд-независимой системы. Независимость подъема рН^^ при адгезии клеток ШН-ЗТЗ и СПЭВ в глюкоз но-солевой среде от Иа^ исключает также вероятность участия в защелачивании Иа-монокарбоксилатного котранспорта, который в ряде клеток играет роль в восстановлении рН^ от кислотной загрузки. Проверили, не является ли найденный механизм Н+-АТФазой.

Ингибитор митохондриальной АТФазы олигомицкн в концентрации 2 -10 мкг/мл не изменял рН^-ответ клеток на адгезию, известно, что существует несколько типов АТФазы с различными фармакологическим* свойствами. На основании результатов можно заключить, что если при адгезии и активируется Н+-помпа, то это помпа, нечувствительная к олигомицину.

Основные результаты и выводы.

1. Обнаружено, что адгезия субстратзависиных клеток ( ШН-ЗТЗ, фибробластов китайского хомячка, СПЭВ) вызывает повышение их рН^ на 0.2- 0.3 ед. рн, тогда как стимуляция ростовыми факторами ведет к защелачиванию их цитоплазмы на 0.1- 0.18 ед. Пролиферация

этих клеток коррелирует с поддержанием их р!К на уровне, достигаемом при адгезии. Поддержание этого уровня на временах; превышающих длительность лаг-фазы, обеспечивается только при наличии в среде сыворотки.

2. Пролиферация субстратнезависнмых клеток ВНК-21 и ЬЗ происходит при средних по популяции рН^, которые практически не отличаются от рН^ непролиферирующих клеток. Адгезия клеток ВНК-21 вызывает непродолжительное по времени и необязательное для их пролиферации повышение рН^.

3. Рост клеток ЬЭМ в суспензии также может осуществляться практически без подъема рН^. Адгезия клеток ЬйМ вызывает устойчивый подъем рН^, что коррелирует с ускорением темпов их пролиферации в прикрепленном состоянии по сравнению с суспензионной культурой.

4. Подъем рН^ при адгезии в фибробластах китайского хомячка осуществляется за счет активации Из+/Н+ обменника, в клетках ШН-ЗТЭ- вследствие кратковременной активации /Н+ обменника и более длительной - транспорта НС03 в цитоплазму и Ка+, НС03- независимой системы, нечувствительной к амилориду и олигомицину. В клетках СПЭВ зателачивание при адгезии осуществляется за счет Ма+, НСО^-независимой системы, нечувствительной к амилориду

и олигомицину, которая практически не участвует в восстановлении рН^ после кислотной загрузки.

5. Процесс распластывания как субстратзависимьге, так и способных к росту в суспензии клеток (ВНК- 21,ЬЗМ) коррелирует с повышением уровня рН^. Однозначного соответствия между состоянием ра-спластанности и величиной рН^ не существует, и в отсутствие роста распластанные клетки поддерживают рН^, близкое к рН^ сферических клеток. Процесс распластывания может протекать независимо от На+/Н+ обменника, при активации других имеющихся в клетке систем вывода протонов.

6. Полученные результаты позволяют сформулировать гипотезу о том, что субстратная зависимость пролиферации связана с необходимостью защелачивания цитоплазмы клеток, которое обеспечивается за счет адгезии. Сыворотка не способна обеспечить необходимый для пролиферации уровень рН^, но оказывает пролонгирующее действие, поддерживая значение рн^, достигнутое при адгезии. Таким образок,

адгезия к твердому субстрату является для субстратзависямых клеток индуктором пролиферации, действие которого поддерживается промотором -растворимыми ростовыми факторами (сывороткой).

7. Выдвинуто предположение, что частичная субстратная зависимость пролиферации клеток, способных расти в суспензии, которая состоит в ускорении темпа размножения клеток при их адгезии к твердому субстрату, также связана с повышением уровня р!Ь за счет прикрепления.

8. Способность к росту в суспензии может быть связана с тем, что по крайней мере у ряда субстратнезависимых клеток отсутствует необходимость повышения рН^ для запуска их пролиферации и, следовательно, отсутствует необходимость в адгезии как факторе, вызывающем эащэлачивание.

Список публикаций.

1.Акатов В.С.,Гробова И.Е.,Кошевой ю.В.Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации клеток // Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Актуальные вопросы клеточной биологии".

Цитология. 1989. Т.31. С.1091.

2.Акатов В.С.,Гробова Н.Е.,Кошевой Ю.В.,Векслер А.В. Внутриклеточный рН и зависимость пролиферации клеток от их прикрепления к субстрату // Тезисы докладов 3 Всесоюзного совещания "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.12-13.

3.Акатов В.С.,Гробова И.Е.,Кошевой Ю.В.,Векслер А.В. Внутриклеточный рН и регуляция пролиферации клеток ВНК-21 в суспензии // там же. С.19-20.

4.Кошевой Ю.В.,Акатов В.С.,Гробова М.Е. Микроспектрофлюоржметр для измерения внутриклеточного рН (МИК-рН) f/ В сб. "Приборы и оборудование для исследований в области физико-химической биологии и биотехнологии. Пущино. 1990. с.8 - 14.

5.Акатов В.С.,Гробова М.Е.,Кошевой Ю.В. Внутриклеточный рН и субстратная зависимость пролиферации фибробластов китайского хомячка // Цитология. 1991. Т.33. N7.0.87 - 95.

6.Акатов В.С.,Гробова И.Е.,Кошевой Ю.В. Внутриклеточный рН и пролиферация клеток ВНК-21 // Цитология. 1991. Т.33. N7.С.96 - 104.

7.Гробова И.Е., Акатов В.С.Внутриклеточный рН и пролиферация клеток линии ЬЭ и ее производной ЬЭМ, адаптированной к -росту в монослое // Цитология. 1992. Т.ЗФ.Ы 1. С.58-65.

8.Акатов В.С.,Гробова И.Е. Активация систем регуляции внутриклеточного рН при адгезии клеток к твердоку субстрату // Биологические мембраны. 1992. Т.9. N7. С.700-710.

Э.Акатов B.C., Берестовская Н.Г., Лавровская В.П., Соловьева М.Е. Контактная зависимость пролиферации клеток в мультислойных культурах // Тезисы докладов и сообщений , представленных на совещание "Биология клетки в культуре". Цитология. Т.34.К9. с.45.

Ю.Акатов B.C., Соловьева М.Е. Зависимость пролиферации клеток от прикрепления связана с влиянием адгезии на внутриклеточный рН // там же. С.45-46.

11.Соловьева М.Е., Акатов B.C. Активация систем регуляции внутриклеточного рН при прикреплении клеток к твердому субстрату // там же. С.106-107.

12 .V. S .Akatov and М.Е .Grobova. Activation of intracellular pH-regulating systems upon cell adhesion to solid substrate // Biol.Mem. 1993. Vol'.6(7). P.917-934.

4.05.94 г. Зак.6081Р. Tup.100 экз. Уч.-изд.л. I.О Отпечатано на ротапринте в ОНГИ ПНЦ РАН