Негативный эндогенный контроль пролиферации клеток в культуре

Сетков, Николай Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Негативный эндогенный контроль пролиферации клеток в культуре
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Негативный эндогенный контроль пролиферации клеток в культуре"

Российская академия паук Сибирское отделение Институт биофизики

На правах рукописи

СЕТКОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

НЕГАТИВНЫЙ ЭНДОГЕННЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

03.00.25 - клеточная биология 03.00.02 -биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Красноярск: - 1998

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН, Красноярск

Официальные оппоненты:

академик РАН Никольский H.H.

доктор биологических наук, профессор Нефедов В.П.. доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М.

Ведущая организация - Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова.

Защита состоится « У" » ил&рто^"_» 1998г. в час.

на заседании диссертационного совета Д. 003.45.01 при Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, Красноярск, Академгородок, Институт биофизики.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики.

Автореферат разослан « ^ » 1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета докт.тех.наук

Шевырногов А.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопросы регуляции размножения клеток, изучения типов и механизмов контроля клеточной пролиферации являются одними из ключевых в биофизике клетки и клеточной биологии.

Регуляцию размножения клеток в целом рассматривают на двух основных уровнях ее организации - экзогенном (внешнем по отношению к клетке) и эндогенном (внутриклеточном). В течение долгого времени главное внимание уделялось изучению внеклеточных факторов и процессов, контролирующих размножение клеток. К началу данной работы сведения об эндогенных механизмах регуляции клеточной пролиферации носили разрозненный и противоречивый характер. В частности, не было ответа на вопрос о том, происходит ли регуляция размножения клеток по принципу позитивного контроля с участием эндогенных стимуляторов или же существует негативный контроль этого процесса и переход клеток в состояние покоя обусловлен образованием эндогенных ингибиторов пролиферации.

Важнейшее свойство состояния покоя - его обратимость. Это позволило О.И. Епифановой и В.В. Терских (1969) постулировать, что в основе размножения клеток лежит периодическое чередование в их жизненном цикле состояний покоя и пролиферации. Отсюда возникла задача выяснения биофизических и биохимических механизмов, контролирующих смену этих состояний. С тех пор сравнительно более или менее хорошо были изучены процессы, обеспечивающие прохождение меткой разных периодов митоти-ческого цикла, а также пусковые события, включающие переход покоящейся клетки в цикл. В то же время, обратный: процесс - переход клетки в состояние покоя, а также процесс поддержания этого состояния в течение неопределенно длительного времени, до сих пор остаются малопонятными событиями в жизненном цикле клетки.

Одним из подходов к решению проблемы является метод слияния клеток, позволяющий объединять в одной цитоплазме ядра клеток, находящихся в разных физиологических состояниях и прослеживать за их дальнейшей судьбой. Выяснение взаимного влияния клеток в гетерокарионах (например, покоящихся и пролиферирующих) создает возможности для вскрытия характера и детального изучения механизмов эндогенной регуляции размножения клеток.

Цель и задачи исследования. Поскольку в общей проблеме изучения механизмов, контролирующих размножение клеток, один из центральных вопросов заключался в выяснении характера внутриклеточных сигналов, определяющих смену состояний покоя и пролиферации, прежде всего была поставлена задача определить какой тип эндогенного контроля (негативный или позитивный) имеет место при переходе клеток в состояние покоя. Решение этой задачи позволило наметить главную цель работы - рассмотрение всех звеньев негативной эндогенной регуляции, обеспечивающей возникновение и поддержание состояния пролиферативного покоя.

В частности, были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать методом слияния клеток способность покоящихся клеток углубляться в состояние покоя.

2. Исследовать роль чувствительных к окадаевой кислоте протеинфосфотаз в регуляции перехода клеток в состояние покоя.

3. Исследовать роль повышенного протеолиза и разных типов протеаз в регуляции перехода клеток в состояние покоя.

Также была поставлена задача выяснить: связано ли прекращение пролиферативной активности клеток при дифференцировке с появлением в них негативных сигналов?

Научная новизна и научно-практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены экспериментальные данные, однозначно свидетельствующие в пользу существования негативного эндогенного контроля размножения клеток в культуре. Показано, что ингибиторы биосинтеза белка могут не только коммитировать покоящиеся клетки в цикл, но и стимулировать, подобно факторам роста, переход клеток в период синтеза ДНК.

Впервые сформулировано положение о том, что главное условие возникновения состояния готовности (компетентности) клеток к выполнению пререпликативных реакций включает в себя как облигатное событие - снижение уровня внутриклеточной концентрации эндогенного ингибитора(ов) пролиферации.

Впервые показано, что контроль перехода клеток в состояние покоя может быть связан с протеинфосфатазами типа РР2А и РР1.

Сформулировано также представление о существовании неспецифического механизма контроля клеточной пролиферации, основанного на кратковременных метаболических сдвигах в клетках.

С точки зрения теории регуляции результаты работы в целом позволяют по новому рассматривать многие фундаментальные клеточные процессы, например, трансформацию клеток - как следствие потери механизма негативной регуляции деления клеток. Полученные данные могут быть положены, в частности, в основу разработки химиотерапевтических подходов для поражения покоящихся клеток в опухолях, путем воздействия на метаболические процессы и реакции, активирующиеся в покоящихся клетках.

Поскольку работа выполнена на одной из широко распространенных моделей клеточной биологии, ее результаты носят эталонный характер и могут быть использованы не только в научных исследованиях, но и в учебном процессе в курсах клеточной биологии и биофизики клетки.

Апробатшя работы. Материалы диссертации докладывались на:

1. Всесоюзном совещании "Клеточная репродукция: сравнительные аспекты и механизмы регуляции" (Ленинград, 1981).

2. 11-ом совещании Европейской рабочей группы по изучению клеточной пролиферации (ESGCP) (Aarhus, Дания, 1981).

3. Специальном симпозиуме FEBS "Функции и дифференицировка клеток" (Афины, Греция, 1982).

4. 12-ом совещании ESGCP (Будапешт, Венгрия, 1983).

5. Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1993).

6. 10-ом Европейском симпозиуме по клеточному циклу (La Rochelle, Франция, 1993)

7. 4-ом Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, Чехословакия, 1994).

8. 20-ом совещании ESGCP (Лондон, Великобритания, 1995). Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 32 работах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, описания полученных результатов и их обсуждения (9 глав), заключения, описания основных результатов и выводов, а также списка цитированной литературы, вгслючаю-

щего 1027 наименований. Текст работы изложен на 300 страницах и содержит 90 рисунков и 28 таблиц.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования была однослойная перевиваемая линия NIH ЗТЗ фибробластов мыши. В отдельных экспериментах использовали фиброб-ласты линии СЗН10Т1/2.

Культивирование клеток линии NIH ЗТЗ проводили в смеси сред: Иг-ла+аМЕМ (1:1), в среде DMEM, a клеток линии СЗН10Т1/2 в смеси сред DMEM+F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячей сыворотки (ЭТС), 1,0 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES буфера и антибиотиков (пенициллин-стрептомицин или канамицин сульфат) (Flow Lab., USA или BDSL, UK).

Подготовка культуры клеток к опытам. Получение покоящихся и стимулированных клеток. Для опытов по кинетике клетки высевали в 24-луночные платы (Linbro, Costar) на круглые покровные стекла "Lux" (ЗОхЮ3 клеток/ячейку). В опытах по слиянию клеток использовали более низкую концентрацию клеток (15х103 клеток/ячейку).

Покоящиеся клетки получали путем культивирования их в среде с 0,2% ЭТС в течение 3-7 сут. в зависимости от задачи опыта. Стимуляцию меточной пролиферации проводили путем смены среды на свежую, содержащую 10% ЭТС.

Процедура слияния клеток. Слияние клеток проводили с помощью поли-этиленгликоля (ПЭГ, Mr«6000, "Merck"). Приготовляли два раствора ПЭГ в чистой среде - 45% и 25% (вес:объем). Стимулированные клетки трипсини-зировали и приготовляли их суспензию в кондиционированной среде с 0,2% ЭТС (20х103 клеток в 1 мл среды). По 2 мл полученной суспензии добавляли в ячейки с покоящимися клетками и после центрифугирования плат для осаждения стимулированных клеток на покровные стекла удаляли надоса-дочную жидкость и приливали в каждую ячейку по 0,5 мл 45% раствора ПЭГ. Через 1 мин добавляли еще 0,5 мл 25% раствора ПЭГ при легком покачивании платы, а затем через 1-1,5 мин добавляли 2 мл чистой среды и проводили многократную отмывку меток от ПЭГ чистой средой. После слияния

клетки инкубировали либо в кондиционированной среде с 0,2% ЭТС, либо в среде с 10% ЭТС в зависимости от условий опыта.

Маркирование клеток с помощью изотопов. Для идентификации ядер, принадлежащих покоящимся или стимулированным клеткам, был применен метод двойного изотопного маркирования клеток (Schultze, 1969; Camplejohn et al., 1980). В специальных экспериментах было установлено, что предварительное мечение покоящихся клеток 14С-тимидином в низкой концентрации (9,25 кБк/мл) и инкубация продуктов слияния в присутствии 3Н-тимидина в высокой концентрации (370 кБк/мл), позволяет получать радиоавтографы с наиболее четким различием 14С-"метки" и 3Н-"метки".

Стимулированные к пролиферации клетки оставляли немечеными. Инкубацию клеток после слияния в присутствии 3Н-тимидина проводили в течение 16 ч.

Радиавтография. Для радиоавтографии обработанные по стандартной методике препараты покрывали раствором желатина. Фотоэмульсию типа "М" (ГОСНИИХИМФОТОПРОЕКТ, Москва) или типа К-2 (Ilford, Mobberlly, UK) наносили на препараты дважды с помощью проволочной петли диаметром 2,5 см.

Первый тонкий слой эмульсии получали нанесением разбавленной (1:1) 0,5% раствором КВг эмульсии. Препараты высушивали на воздухе и экспонировали в течение 2 сут при 4°С, после чего проявляли в амидоловом проявителе. Затем наносили второй слой неразбавленной эмульсии, который проявляли через 3-4 сут. Окрашивали препараты по Гимза в буфере (Jurr 65500) при рН 6.8 Анализ препаратов проводили на микроскопе "Jenaval" (Zeiss) с помощью иммерсионного объектива Н190/1.30 и окуляра PKIOX. Радиоактивность, включившуюся в клетки, подсчитывали также на счетчике Бета-1 в толуольном или диоксановом сцинтилляторах в зависимости от задач опытов.

Идентификация слившихся клеток. Покоящимися (R-клетки) одноядерными (монокарионы) и двуядерными (гомодикарионы) клетками считали клетки, в которых одно или соответственно два ядра были мечены 14С-тимидгагом.

Стимулированными (Р-клетки) одноядерными (монокарионы) и двуядерными (гомодикарионы) клетками считали клетки, ядра которых не со-

держали 14С-тимидина. Гетеродикарионами, полученными при слиянии покоящихся и стимулированных клеток, считали двуядерные клетки, в которых одно ядро обязательно содержало метку 14С-тимидина. Ядра всех типов клеток, вступившие в S-период, включали также 3Н-тимидин, в результате чего ядра R-клеток становились мечеными сразу двумя изотопами - 3Н и 14С. Ядро считалось меченым двумя изотопами, если плотность зерен серебра в нижнем слое эмульсии была по крайней мере в два раза выше, чем в верхнем, и зерна серебра в верхнем слое лежали также за пределами ядра. В противоположность 14С, 3Н-изотоп "давал" сплошной с четкими контурами слой зерен серебра.

Подсчитывали также различные типы трехъядерных клеток, в которых одно, или два ядра были мечены 14С-ти;.тидином. В некоторых повторных опытах цитоплазму стимулированных клеток (Р-клетки) метили с помощью латексных шариков диаметром 0,75 мкм (Polysciences Inc.) по методу (Levine, Сох, 1978).

Специальные реактивы. Для стимуляции пролиферативной активности клеток использовали фактор роста из кровяных пластинок (PDGF, ß-ß гомо-димер, рекомбинантный из Е. Coli), эпидермальный фактор роста (EGF) (GIBCO), инсулин (Serva) и плазму крови человека группы AB,. Для подавления активности протеинфосфатаз РР1 и РР2А использовали окадаевую кислоту (OA) из Prorocentrum sp. (Sigma).

Внутриклеточный протеолиз подавляли с помощью специфических ингибиторов сериновых протеаз - апротинина и SBTI, цистеиновых протеаз (катепсинов) - цистатина, лейпептина и пепстатина А, Са2+-зависимых нейтральных протеаз (кальпаинов) - цистамина и цистина и лизосом в целом -хлороквина, метилового эфира изолейцина и 3-метиладенина. Норсерн-блот-анализ РНК. Для выявления РНК-транскриптов протоонко-генов c-fos, c-jun и c-myc клетки лизировали и тотальную РНК экстрагировали гуанидий-тиоцианатным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Очищали РНК с помощью центрифугирования в растворе CsCl и переосаждения из супернатанта этанолом, подкисленным уксусной кислотой.. По размеру РНК фракционировали в 1,2% денатурирующем агарозном геле, содержащем 3% формальдегида (10 мкг на дорожку), переносили на найлоновые мембраны (Hybond-N, Amersham) и иммобилизовали УФ-светом. Мембраны гибриди-

зировали в течение ночи при 42°С с фрагментами кДЫК c-myc, c-fos, c-jun и тубулина мыши (маркер), меченными 32Р по методу (Felinberg, Vogelstein, 1983). Радиоавтографию проводили при -80°С с использованием усиливающего экрана.

Анализ клеточного цикла с помощью метода проточной цитофлуоромет-

рии. Покоящиеся клетки линий NIH ЗТЗ и СЗН10Т1/2 обрабатывали цикло-гексимидом или пуроммцином согласно протоколам экспериментов. Для определения распределения клеток по циклу их трипсинизировали, осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 180 мкл окрашивающего раствора, содержащего 2% ПЭГ (Мг=8000) 50 мкг/мл йодистого пропидия (PI), 180 ед./мл панкреатической рибопуклеазы A (Bochringer), 0,1% Тритона X-100 и 4 мМ цитрата натрия (piï 7,8). После окрашивания при комнатной t в темноте в течение 1 ч 180 мкл солевого раствора (2% ПЭГ, 50 мкг/мл PI, 0,1% Тритона Х-100, 0,4 M NaCl) добавляли к каждой пробе. Затем клетки ресуспендировали пипетированием и оставляли при комнатной t еще на 1 ч. Анализ проводили на клеточном сортере FACSstar (Becton Dickinson, US), используя для обработки данных программу ModFit LT.

Слияние фибробластов и гспатоцитов. Гепатоциты получали из иптактной печени взрослых мышей, печени после частичной эктомии, эмбриональной печени и печени животных, отравленных in vivo циклогексимидом или CCI4.

Работа выполнена на мышах-самках линии BALB/c массой 22-25 г.

Гепатоциты печени взрослой мыши выделяли с помощью нерециркуляционной двухэтапной перфузии печени по методу Дудиной-Барковской и Миттельмана (1981) и культивировали в среде NCTC-135 (Flow Lab.), содержащей 0,2% инактивированной при 56°С ЭТС, 0,1% БСА, 0,1% глюкозы, 0,5 мкг/мл инсулина (Serva), 50 нг/мл дексаметазона, 0,1 мМ р~ меркаптоэтанола, 20 мМ HEPES буфера и 100 мкг/мл канамицина сульфата. С целью улучшения адгезии гепатоцитов с покровными стеклами их покрывали коллагеном, полученным из сухожилий хвостов крыс по методу (Danielsen, 1987).

Гепатоциты эмбриональной печени получали от 15-16 суточных эмбрионов путем механического разрушения печени в холодном (4°С) бескальциевом бикарбонатном буфере, содержащем 0,02% ЭГТА.

Частичную гепатоэктомию проводили по стандартной методике (Huiggins, Anderson, 1931). Гепатоциты получали через 48-50 ч после операции с помощью нерециркуляционной двухэтапной перфузии.

С целью стимуляции пролиферативных процессов в печени за 48 ч до ее взятия мышам вводили внутрибрюшинно циклогексимид (3 мкг/г массы).

Индукцию экспериментального посттоксического цирроза у самок мышей вызывали многократной ингаляцией CCI4 по методу (Rabinovici, Wiener, 1961).

Слияние клеток проводили в опиленных пенициллиновых флаконах, в которые помещали 13-миллиметровые покровные стекла "Lux" с покоящимися или стимулированными фибробластами. Сверху на них наслаивали суспензию гепатоцитов (2 мл, ЮОхЮ3 клеток/флакон) и осаждали клетки центрифугированием. С целью снижения токсического воздействия раствора ПЭГ использовали 35% ПЭГ с Мг 1500 (Merck) с добавлением 15% ДМСО и 15 мМ HEPES буфера. В некоторых экспериментах для увеличения слипания клеток использовали ФГА (10 мкг/мл, Sigma). После слияния клетки помещали в смесь сред DMEM+NCTC-135 (1:1), содержащую 0,5 или 10% ЭТС, 0,2 мМ L-глютамина, 0,1 мМ ß-меркаптоэтанола, 20 мМ НЕ PES буфера, 100 мкг/ мл канамицина сульфата и 37 кБк/мл 3Н-тимидина. В этой среде клетки культивировали до фиксации в течение 16-22 ч.

На радиоавтографах подсчитывали число меченых и немеченных 3Н-тимидином ядер в гетерокарионах и в неслившихся фибробластах и гепато-цитах (монокарионах). Поскольку в печени взрослых мышей часть парен-химных клеток двуядерные (около 50% по данным Урываевой и Фактор, 1974; около 40% - Новиковой и Боровкова, 1987; в наших опытах таких клеток было около 30%), их считали как монокарионы. Гетерокарионы с одним и двумя мечеными и немечеными ядрами гепатоцитов суммировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.Парамстры роста культуры клеток линии N111 ЗТЗ в различных условиях культивирования.

После переноса экспоненциально растущей культуры в среду с низким содержанием сыворотки (0,2-0,5%) через 3 сут при непрерывной инкубации клеток с 3Н-тимидином в течение 24 ч. индекс меченых клеток снижается с 75-80% до 7-8%. Клетки такой культуры считали покоящимися. В течение последующих 4 сут. 3Н-тимидин включает не более 2% клеток, а через 14 сут. на препаратах встречаются только единичные меченые клетки.

Смена среды на свежую, содержащую 10% сыворотки (ЭТС), вызывает подъем индекса меченых клеток по прошествии пререпликативного периода продолжительностью »12 ч. Через 24 ч при непрерывной инкубации клеток с 3Н-тимидином метится 80% клеток. При кратковременной (30 мин) инкубации с 3Н-тимидином максимальный подъем индекса меченых клеток наблюдается через 20 ч после добавления 10% ЭТС, а затем начинает снижаться.

1.1 Вступление в в-нериод ядер покоящихся и стимулированных клеток в гстеродикарионах. С целю решения основной задачи исследования, заключающейся в ответе на вопрос, какой тип эндогенного контроля (негативный или позитивный) имеет место при переходе клеток в состояние покоя, проводили слияние покоящихся клеток, со стимулированными клетками, которые брали для слияния в течение 16 ч после добавления 10% ЭТС. О взаимном влиянии ядер в гетерокарионах судили по их способности вступать в Б-период на основании включения 3Н-тимидина. На рис. 1 приведены результаты опытов, отражающие характер вступления в Б-период ядер стимулированных клеток, после слияния их с покоящимися клетками и последующей инкубации в течение 16 ч в кондиционированной среде с 0,2% ЭТС. Как показывают данные рис. 1 в гетеродикарионах наблюдается значительное снижение индекса меченых ядер по сравнению с моно- и гомодикарионами, что говорит о подавлении вступления ядер стимулированных клеток в Э-период. Это влияние покоящихся клеток на ядра стимулированных клеток удобно называть эффектом подавления, а степень подавления выражать в

виде индекса редукции, определяемого по формуле К(-(АГ-Ат)х100/Ат, где АТ и Ат - индексы мечения ядер стимулированных

А Б

□10213

Рис. 1. Включение 3Н-тимидина в ядра стимулированных клеток после слияния их с покоящимися клетками и инкубации в кондиционированной среде с 0,2% ЭТС (А) или в среде с 10% ЭТС (Б). По горизонтали - время между добавлением в среду 10% ЭТС и слиянием клеток, час. По вертикали - индекс меченых ®Н-тиммдином ядер стимулированных клеток в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), L¡,

клеток в гетероди- и монокарионах соответственно. Оказалось, что R¿ сохраняется практически на одном уровне (»-60%) независимо от того, на каком этапе пререпликативного периода брали стимулированные клетки для слияния. Если клетки были взяты для слияния через 14-16 ч после начала стимуляции, то индекс меченых ядер в гетеродикарионах не отличался от индекса в моно- и гомодикарионах, т.е. клетки, приступившие в момент слияния к синтезу ДНК, продолжали его и в гетеродикарионах.

При инкубации клеток после слияния в среде с 10% ЗТС (рис. 1,Б) так же имеет место эффект подавления. Однако степень его значительно меньше, и составляет в среднем -26%. К тому же эффект подавления сохраняется и для клеток, находившихся до слияния в среде с 10% ЭТС в течение 14 и 16 час.

Анализ синтеза ДНК ядрами покоящихся клеток в гетеродикарионах показал, что присутствие ядер стимулированных клеток в гетеродикарионах не приводит к стимуляции вступления в S-период ядер покоящихся клеток.

Возникает вопрос, является ли наблюдаемое в гетерокарионах подавление вступления в S-период ядер стимулированных клеток только след-

сткием прекращении реакций подготовки ядер к синтезу ДНК, или ядра стимулированных клеток возвращаются в состояние покоя?

Как показывают данные рис. 2, ядра стимулированных клеток после пребывания в одной цитоплазме с ядрами покоящихся меток в течение 24 ч в значительной степени теряют способность вступать в Б-период в среде с 10% ЭТС.

60 40 20 0

Рис. 2. Включение 3Н-тимидина в ядра стимулированных клеток (10 ч стимуляции) после слил-01 ния их с покоящимися клетками. После слияния

□2 клетки инкубировали: а) в течение 16 ч в среде с

дЗ 10% ЭТС; б) в течение 24 ч в кондиционирован-

ной среде с 0,2% ЭТС, а затем в течение 16 ч в среде с 10% ЭТС. По вертикали - индекс меченых 3Н-тимидином ядер стимулированных клеток в моно- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), Li, %.

На основании полученных данных можно предположить, что покоящиеся клетки вырабатывают эндогенный ингибитор клеточной пролиферации, предотвращающий в гетеродикарионах переход в S-период ядер стимулированных клеток. Однако эти результаты, строго говоря иеодназначны, поскольку их можно объяснить также и с точки зрения противоположной гипотезы, согласно которой пролиферирующие клетки образуют стимулятор пролиферации, но при слиянии клеток в результате увеличения объема цитоплазмы происходит снижение (разбавление) его концентрации, что не позволяет ядрам в гетеродикарионах приступить к синтезу ДНК. Неоднозначность полученных результатов мы попытались разрешить несколькими путями.

1.2 Синтез ДНК в гетеротрикарионах. Во-первых, возник вопрос о зависимости степени подавления синтеза ДНК от соотношения ядер стимулированных и покоящихся клеток в гетерополикарионах. Подсчет индекса меченых ядер стимулированных клеток в гетеротрикарионах с одним или с двумя покоящимися ядрами и соответственно с двумя или с одним стимулированным ядром показал, что в гетеротрикарионах с двумя покоящимися ядрами, индекс меченых ядер стимулированных клеток ниже, чем в гетеротрикарионах с двумя стимулированными ядрами или в гетеродикарионах, т.е. эффект подавления носит концентрационно зависимый характер.

1.3 Углубление клеток в состояние покоя. Еще Аугенлихт и Базерга (Augenlicht, Baserga, 1974) на культуре диплоидных фибробластов человека линии WI-38 показали, что чем дольше клетки находятся в состоянии покоя, тем больше продолжительность пререпликативного периода после стимуляции пролиферации и тем меньше число клеток, вступающих в S-период. С тех пор в литературе накоплено много фактов, свидетельствующих о том, что свойства клеток меняются по мере пребывания их в состоянии покоя (Misca, Bosman, 1980, 1S82; Wallen et al., 1984; Cosensa et al., 1988; Owen et aL, 1989; Donigan et al., 1993).

Однако, высказывались соображения, что увеличение продолжительности пререпликативного периода после стимуляции клеток по мере пребывания их в состоянии покоя связано только с реакцией клеток на истощение питательной среды, а не является следствием функциональных изменений (Duncan et al., 1982). По-видимому, судить о способности клеток углубляться в состояние покоя только на основании данных об увеличении продолжительности пререпликативного периода и снижении числа клеток, вступающих в S-период после стимуляции, недостаточно.

В настоящей работе этот вопрос был изучен с двух сторон. Параллельно с опытами по кинетике выхода клеток из состояния покоя после пребывания в среде с низким содержанием сыворотки в течение разного времени, исследовали также их способность подавлять в гетеродикарионах вступление в S-период ядер пролиферирующих клеток.

Данные, представленные на рис. 3, показывают, что число клеток,

Рис. 3 Кинетика выхода из сотояния покоя после стимуляции клеток линии NIH ЗТЗ. Клетки находились в среде с 0,2% ЭТС в течение 3, 7 и 14 сут. По вертикали - индекс меченых клеток при постоянной экспозиции с ЗН-тимидином, %. По горизонтали -время после смены среды на свежую с 10% ЭТС.

меченных 3Н-тимидином, снижается, а длительность пререпликативного периода возрастает по мере пребывания клеток в среде с 0,2% ЭТС

С целью выяснения зависимости эффекта подавления от продолжительности пребывания клеток в состоянии покоя, проводили слияние стимулированных клеток с клетками, находившимися в среде с 0,2% ЭТС в течение 3, 5 и 7 суток.

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что клетки, находившиеся в среде с 0,2% ЭТС в течение 7 суток, сильнее подавляют вступление в Б-период ядер стимулированных клеток, чем клетки, находившиеся в среде с 0,2% ЭТС в течение 5 и 3 суток.

Таблица 1. Степень подавления вступления в Э-период ядер стимулированных клеток (10 ч стимуляции), представленная в виде индекса редукции, в гетеродика-рионах с покоящимися клетками, находившимися в среде с 0,2% ЭТС в течение 3, 5 и 7 суток.

Продолжительность пребывания покоящихся клеток в среде с 0,2% ЭТС до слияния, сут РГсследованные клетки Индекс меченых ядер стимулированных клеток (Ц, %), х+Бх, и индекс редукции (И;)

и, % 11;

3 Монокарионы Гетеродикарионы 44,9+1,8 18,8±1,2 -58,2

5 Монокарионы Гетеродикарионы 43,а±1,9 17,б±0,9 -59,6

7 Монокарионы Гетеродикарионы 46,8±2.1 13,7±8,0 -70,6

В связи с этим была поставлена задача сравнить способность к вступлению в Б-период ядер в гетеродикарионах, полученных в результате слияния клеток, находившихся в состоянии покоя в течение 3 и 7 суток, а затем после слияния стимулированных средой с 10% ЭТС. Результаты, представленные на рис. 4 показывают, что в гетеродикарионах наблюдается подавление вступления в Б-период ядер клеток, находившихся в состоянии покоя в течение 3 суток. Напротив, присутствие ядра клетки, находившейся в состоянии покоя в течение 3 суток, не способствует переходу в Б-период ядра 7-суточной покоящейся клетки.

□ 1 □2

Рис. 4. Включение 3Н-тимидина в ядра покоящихся клеток, находившихся до слияния в состоянии покоя в течение 3 и 7 сут. После слияния клетки ин-ВЗ кубировали в среде с 10% ЭТС в течение 16 ч. По

вертикали - индекс меченых 3Н-тимидином ядер в moho- (1), гомоди- (2) и гетерод1жарионах (3).

Таким образом, полученные данные говорят о том, что эффект подавления зависит от состояния покоящейся клетки. Однако, главное свидетельство в пользу представления о негативном типе эндогенного контроля перехода клеток в состояние покоя было получено в экспериментах с ингибиторами трансляции.

2. Эксперименты с ингибиторами трансляции.

Мы предположили, что образование эндогенного ингибитора пролиферации в покоящихся клетках представляет собой активный процесс, зависящий от биосинтеза белка. Если это так, то подавление трансляции в покоящихся клетках с помощью ингибиторов биосинтеза белка должно блокировать образование эндогенного ингибитора пролиферации и приводить к снятию эффекта подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах.

Для подавления биосинтеза белка использовали циклогексимид (актидион). Предварительно была изучена динамика подавления биосинтеза белка в пролиферирующих и покоящихся клетках линии N111 ЗТЗ в присутствии разных концентраций циклогексимида (СН) и при различной продолжительности экспозиции клеток. Результаты показали, что включение

14С

-лейцина снижается на 84-93% при инкубации клеток в течение 1 ч в присутствии 7,5 мкг/мл циклогексимида. Б тоже время уровень биосинтеза белка восстанавливается полностью в среде с 10% ЭТС через 5 ч после удаления CH.

2.1 Циклогексимид снимает эффект подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах. С целью выяснения зависимости эффекта подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах от биосинтеза белка в покоящихся клетках проводили слияние покоящихся клеток, обработанных в течение 0,5-4 ч СН, с

клетками, стимулированными к пролиферации. Результаты, представленные на рис. 5, а показывают, что СИ при экспозиции с ним покоящихся клеток в течение 2 ч полностью снимает эффект подавления синтеза ДНК в гетеро-дикарионах.

□ 1 □ 2 из

К 0,5 1 2 3 4

Рис. 5. Включение % -тимидина в ядра пролиферируюхцих (а и б) и покоящихся (в и г) клеток после слияния их между собой. Покоящиеся клетки перед слиянием обработаны в течение 0,5-4 ч циклогексимидом (СН) (а и в). Покоящиеся клетки перед слиянием обработаны СН в течение 3 ч, а затем переведены на 3 ч в среду с 0,2% ЭТС (б и г). Стимулированные клетки взяты для слияния через 10 ч после добавления в среду 10% ЭТС. После слияния клетки инкубировали в течение 16 ч в кондиционированной среде, с 0,2% ЭТС. По вертикали - индекс меченых ядер (%) в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), %. К - контроль. По горизонтали -продолжительность преипкубации покоящихся клеток с СН, час.

Однако, покоящиеся клетки могут восстанавливать свою ингиби-торную способность после удаления СН из среды и переноса их в кондиционированную среду с 0,2% ЭТС, при этом R¿=-55%, что соответствует R¡=-59% в контроле {рис. 5,6).

Анализ синтеза ДНК ядрами покоящихся клеток показывает, что СН стимулирует вступление их в ^-период в гетеродикарионах (рис. 5, в). Этот результат навел на мысль, что ядра обработанных СН покоящихся клеток, становятся восприимчивыми к факторам, привносимым в гетеродшеарион стимулированной клеткой, в результате чего они и вступают в 5-период в среде, не способной вызывать пролиферативный ответ.

2.2 Пуромицин снимает эффект подавления синтеза ДНК в гетеродика-рионах. Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемые эффекты СН могут быть атрибутами его некоторых неизвестных свойств были проведены опыты с пуромицином.

Данные, представленные на рис. 6, показывают, что обработка покоящихся клеток пуромицином перед слиянием их со стимулированными

Рис. 6. Включение ^Н-тимидина в ядра стимулированных клеток после слияния их с покоящимися клетками, обработанными в течение 2-4 ч пуромицином (10 мкг/мл). После слияния клетки инкубировали в течение 16 ч в кондиционированной среде с 0,2% ЭТС. К -контроль.

По вертикали - индекс меченых ядер в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродикарио-нах (3), %

клетками также снимает эффект подавления синтеза ДНК в гетеродикарио-нах, хотя и позднее на 1-1,5 ч, чем при воздействии СН.

Результаты этих экспериментов говорят в пользу представления о негативном типе эндогенного контроля пролиферации клеток, осуществляемом при участии ингибитора(ов) пролиферации. Отсюда можно предположить, что одно из условий возникновения состояния готовности (компетентности) клеток к выполнению пререплнкативных реакций - снижение внутриклеточной концентрации эндогенного ингибитора пролиферации. Именно поэтому ядра покоящихся клеток, обработанных циклогексими-дом в течение 2-4 ч (рис. 5, в), вступают в Б-период в гетеродикарионах. Напротив, клетки прекращают деление и переходят в состояние покоя, когда внутриклеточный уровень ингибитора(ов) достигает определенных пороговых значений.

Если эти рассуждения верны и переход клеток в состояние покоя связан с синтезом негативных регуляторов, то покоящиеся клетки, обработанные ингибиторами трансляции, должны вступать в митотический цикл и среде без митогенов.

2.3 Ингибиторы биосинтеза белка стимулируют синтез ДНК в покоящихся клетках линии N111 ЗТЗ. Прежде всего возник вопрос, изменяется

ли пролиферативный ответ покоящихся клеток, обработанных СН, на сыворотку. Данные, представленные на рис. 7, показывают, что обработка покоящихся клеток СН в течение 3 ч, с последующей стимуляцией средой с 5% ЭТС повышает пролиферативный ответ клеток на 30% (Р<0,005).

Сравнение пролиферативиого ответа покоящихся клеток на воздействие сыворотки, Р1)ОГ и СН показало, что обработка покоящихся клеток СН в течение 1-2 ч увеличивает включение 3Н-тимидина в среде с 0,2% ЭТС до величин, равнозначных тем, которые наблюдаются при

Рис. 7. Кинетика вступления в 8-период клеток, стимулированных из состояния покоя свежей средой с 59) ЭТС. 1 - покоящиеся клетки в течение 3 ч до стимуляции средой с 5% ЭТС инкубировали с СН (7,5 мкг/мл); 2 -контроль (5% ЭТС). По вертикали -индекс меченых 3Н-тимидином клеток (%). По горизонтали - продолжительность инкубации клеток в среде с 5% ЭТС, час.

стимуляции клеток в течение 2 ч средой с 10% ЭТС или с РБОР (10 нг/мл) (табл. 2). При этом обработка клеток СН в течение 2 ч вызывает наибольший пролиферативный ответ.

Оказалось, что пуромицин также стимулируют включение 3Н-тимидина в покоящиеся клетки в среде с 0,2% ЭТС. На стимулирующий эффект пуромицина, как и в случае с циклогексимидом, не влияет дальнейшая инкубация клеток с ЕОГ, что отражено в данных табл. 3.

Таким образом, кратковременное (1-2 ч ) подавление биосинтеза белка в покоящихся клетках с помощью циклогексимида или пуромицина не только коммитирует их в цикл, но и стимулирует переход в Э-период. 2.4 Анализ пролиферативной активности клеток, обработанных ингибиторами биосинтеза белка, с помощью проточной цитометрии. Для того, чтобы получить наиболее полную картину перехода покоящихся клеток в мито-тический цикл под воздействием - циклогексимида или пуромицина были

Таблица 2. Включение 3Н-тимидина в ядра покоящихся клеток после обработки их циклогексимидом (СН);

имп/мин, (х±Бх)

Продолжительность инкубации кл. в среде с 0,2% ЭТС после предобработки циклогексими дом, час Контроль Продолжительность предобработки клеток СН, час

0,2% ЭТС 10% ЭТС 2 ч, затем 0,2% ЭТС РБОГ, 10 нг/мл 2ч, затем 0,2% ЭТС 1 2 3 6

Концентрация СН (мкг/мл)

1 10 1 10 1 10 1 10

2 151+66 276±50 182168

12 1230+14 - 832+94 331± 30 466+57 210±49 252±41 280±44 194±64 154+23 120+14

18 362±52 1921±281 1299± 150 1422+70 1354± 182 1057±39 510+136 3061118 332129 148116

24 7761274 1856±102 1610± 180 2407+ 798 2247+ 605 2283±9 828±178 678+131 9101139 1024+33

36 416+42 2665+604 2791±433 2544+ 289 2593± 188 3117± 183 3058+ 320 1340+65 1540+ 329 1524+ 371 1224189

Таблица 3. Индекс меченых 3Н-тммидином ядер покоящихся клеток (%), обработанных пуромицином (10 мкг/мл) б течение 45 мин, а затем инкубированных в бессывороточиой среде с или без ЕОК. В контроле клетки были инкубированы в бессывороточной среде (Р<0,01).

Обработка клеток Время после предобработки клеток пуромицином, ч

0 8 16 24 36 48

Риг, затем 8,0+0,8 13,7±1,9 - 18,0±2,5 23,6±0,1

Риг, затем среда без сыворотки 13,6+0,7 9,2+2,8 17,3+3,3 24,1±1,8 24,0+0,6

Контроль 2,5±0,9 3,9±1,0 6,8+1,9 7,4+0,9 6,9±1,7 4,3+1,1

выполнены эксперименты с использованием метода проточной цитометрии.

Данные, представленные в табл. 4, показывают, что подавление биосинтеза белка в покоящихся клетках линии NIH ЗТЗ в течение 4 ч цикло-гекеимидом или пуромицином, наиболее сильно увеличивают в популяции долю циклирующих клеток (5 фаза + Gg/M фазы цикла).

Таблица 4. Распределение клеток по разным фазам митотического цикла в культуре покоящихся клеток линии NIH ЗТЗ, обработанных эквимолярньши концентрациями циклогексимида {СН) (10 мкг/мл) или пуромицина (Риг) (20 мкг/мл), %.

Фазы ми-тотическог о цикла Контроль (К-клет- ки) СН 2 ч СН 4 ч СН 6 ч Риг 2 ч Pur 4 ч

GO/GÎ 86,22 62,43 39,84 43,12 54,98 37,05

S 8,95 32,59 51,45 47,39 41,96 51,28

g2/M 4,84 4,98 8,71 9,49 3,06 11,67

£+G2/M 13,79 37,57 60,16 56,88 45,02 62,95

Оказалось, что пролиферативный ответ клеток в значительной степени зависит от глубины подавления биосинтеза белка в покоящихся клетках, а для инициации событий митотического цикла необходимо, по крайней мере, 55% подавление биосинтеза белка (табл. 5).

В случае, когда покоящиеся клетки линии ЗТЗ были обработаны в течение 4 ч различными концентрациями пуромицина только наивысшая концентрация (20 мкг/мл) индуцировала клетки к вступлению в митотиче-

ский цикл (табл. 5 и рис. 8, А), тогда как обработка покоящихся клеток возрастающими концентрациями циклогексимида приводила в результате к постепенному увеличению пролиферативного ответа клеток (табл. 5 и рис.8, В).

Таблица 5. Зависимость пролиферативного ответа покоящихся клеток линии NIH ЗТЗ от степени подавления биосинтеза белка.

Циклогексимид Пуромицин

Концентра ция ингибиторов мкг/м л 0,0 0,1 1,0 10,0 0,0 0,2 2.0 20,0

мкМ 0,00 0,335 3,55 35,5 0,00 0,355 3,55 35,5

% подавления биосинтеза белка 0 37 55,1 69 0 14,9 52,3 74,0

Кратность увеличения числа клеток в фазах 5 + й2/М 1. 1Д 2,0 3,7 1 1.0 1,2 5,4

Примечание: покоящиеся клетки были обработаны СН или Риг с течение 4 ч в присутствии смеси 14С-аминокислот.

¡г

5 20

О +

Ю « 10

О +

¡2. в с о et

; Ю

0,2 2 мкг/мл

0,1 1 мкг/мл

Рис. 8. Влияние различных концентраций пуромидина (Л) и цлклогексимида (В) на прогрессию покоящихся клеток линии Дг/Я ЗТЗ в митотический цикл. Экспозицию клеток с СН и Риг проводили в течение 4 ч.

Дополнительные опыты, выполенные на клетках линии СЗН10Т1/2, показали, что только высокая концентрация пуромицина (20 мкг/мл; 35,5 мкМ) индуцировала пролиферативный ответ клеток.

Сравнение пролиферативного ответа покоящихся клеток линии СЗН10Т1/2 на воздействие оптимальной (20 мкг/мг) концентрации пуромицина и сыворотки (10%) показало, что сыворотка вызывает значительно более слабый ответ клеток, чем луромицин (рис. 9).

Рис. 9. Влияние пуромицина или сыворотки на прогрессию в митотический цикл фиб-робластов мыши линии СЗШ0Т1/г- Покоящиеся клетки обрабатывали пуромицином (20 мкг/мл) в течение 1-4 ч (1) или ЭТС (10%) в течение 4 ч (2). После чего отмывали и культивировали в течение 24 ч в среде с 0,5% ЭТС, а затем проводили стандартную процедуру подготовки клеток к проточной цитометрии. По вертикали -кратность увеличения числа циклирующих (S+Gj/M) клеток. По горизонтали - продолжительность инкубации клеток с пуромицином, час.

Таким образом, ингибиторы биосинтеза белка при кратковременном (45 мин -6 ч) воздействии на покоящиеся клетки, индуцирует, подобно факторам роста, переход клеток в митотический цикл.

3. Экспрессия протоонкогепоп c-fos. c-jun и c-mvc под влиянием факторов роста и ингибиторов трансляции.

Известно, что циклогексимид стимулирует экспрессию, так называемых супериндуцибельных генов, в число которых входят протоонкогены c-fos, c-jun и c-myc (Lau, Nathans, 1987; Bravo, 1990). Считается, что индукция и супериндукция транскрипции некоторых генов под влиянием цикло-гексимида имеет место в том случае, когда гены находятся под негативным контролем с участием лабильных белков-репрессоров (Leder et al., 1983; Kelly et al., 1983; Sassone-Corsi et al., 1988; Subramaniam et al., 1989; Morello et al., 1990).

Однако другие исследователи (Mahadevan, Edwards, 1991; Edwards Mahadevan, 1992) представили доказательства, поддерживающие альтернативную гипотезу, согласно которой циклогексимид и анизомицин, но не пу-ромицин и эметин, при концентрациях, не подавляющих биосинтез белка, активируют транскрипцию c-fos, c-jun и c-myc не через элиминацию негативных регуляторов, а через фосфорилирование хроматинассоциированных белков ррЗЗ и рр15. В связи с этим возникает неясность относительно механизма снятия эффекта подавления синтеза ДНК гетеродикарионах ингибиторами трнсляции.

Поэтому была поставлена задача исследовать внутриклеточные события, вовлеченные в коммитирование покоящихся клеток в цикл, под воздействием факторов роста или ингибиторов биосинтеза белка. Прежде всего был исследован характер экспрессии с-1оз, с-]ип и с-шус при стимуляции покоящихся клеток РБСЕ. Показано, что экспрессия всех трех протоонкоге-нов минимальна в клетках, находящихся в состоянии покоя.

РБ&Е (10 нг/мл) вызывает резкую и преходящую индукцию экспрессии мРНК всех трех протооккогенов уже после 0,5 ч экспозиции с ним клеток. Через 2 ч транскрипты с^оэ исчезают, а экспрессия с-]ип становится незначительной. Экспрессия с-тус носит бифазный характер, поднимаясь до максимума через 2 и 8 часов и снижаясь до базального уровня в остальные часы.

3.1 Циклогенсимид индуцирует экспрессию с-£о5, с^'ип и с-тус в покоящихся клетках с характеристиками, подобными тем, что имеют место при воздействии на ыих РООР. Данные, представленные на рис. 10 показывают, что транскрипты с^оэ и с-]ип не определяются в покоящихся клетках (первая линия слева), но появляются при обработке клеток СН. Максималь-наый уровень экспрессии наблюдается в течение первого часа, а затем падает до уровня, характерного для покоящихся клеток.

хз го

СН-10 гтпп

СН-45 гта'л

СН-4 Ьг

Ь 'о 0.5 2 8 1 2 "0 0.5 2 8 12 "о 0.5 2 8 12'

99999999Щ9Щ

с-тус

с^оэ

с-]ип

1иЬиПп

Рис. 10. Влияние циклогексимида на экспрессию протоонкогенов с-Гоб, с-}ип и с-тус в покоящихся клетках линии КГ1Н ЗТЗ. Клетки были обработаны СН (10 мкг/мл) в течение 10 мин, 45 мин и 4 ч. РНК была экстрагирована через 0, 0,5; 2; 8 и 12 ч культивирования клеток в бессывороточной среде ЮМЕМ как обозначено над линиями. Затем была выполнена Норсерн-бдот-гибридизация.

Экспрессия с-шус продолжается более продолжительное время, достигая пиковой величины в пределах 2х первых и 12 часов при 45-минтутной экспозиции клеток с СП. Таким образом, общий характер экспрессии с-Гоэ, с-]ип и с-тус подобен тому, что наблюдается при действии РЦСБ, включая бифазную экспрессию с-шус, хотя временные точки пиковых величин полностью не совпадают.

3.2 Пуромицин индуцирует экспрессию с-йге, с-^ип и с-шус в покоящихся клетках при концентрациях, подавляющих биосинтез белка. Данные рис. 11 показывают, что кратковременная экспозиция покоящихся клеток с 0,2 и 2 мкг/мл пуромицина индуцирует преходящую экспрессию, с-1оз, с-^ип и с-шус. В то же время экспрессия сильнее выражена при 20 мкг/мл пуромицина и продолжительности обработки клеток от 45 мин до 6 ч.

Риг-0,2 __Риг-2 Риг-20_

0 1 0.25 0Л5 ~г б"1 ' 0.25 075 2 7 0.25 0.75 2 6

es» щ m 1 ,ubu,in

Рис. 11. Влияние пуромицина на экспрессию протоонкогенов c-fos, c-jun и с-шус в покоящихся клетках линии NIH ЗТЗ. Клетки были обработаны пуромицином (0,2; 2 и 20 мкг/мл), (Pur-0,2; Pur-2 и Риг-20) в различные временные интервалы (0,25-6 час), указанные над линиями. Клеточная РКК была экстрагирована и выполнена Норсерн-блот-гибридизация.

В то же время экспрессия отсутствует в случае одновременной экспозиции покоящихся клеток с пуромицином и актиномицином D или с одним актиномицином D (рис. 12).

Рис. 12. Влияние пуромицина на экспрессию протоонкогенов c-fos, с-jun и с-шус в покоящихся клетках в присутствии актиномицина D. Покоящиеся клетки были обработаны 20 мкг/мл Pur в присутствии 5 мкг/мл ActD (ActD + Pur) или одним ActD. Продолжительность инкубации (час) указана над каждой линией.

ActD+Pur ActD

I-1 I-1

Û 0.75 2 Д 0.75 2 4

На следующем этапе работы было решено проверить снимает ли цик-логексимид эффект подавления в присутствии актиномицина D?

Данные, представленные на рис. 13, показывают, что актиномицин D не препятствует действию циклогексимида.

Рис. 13. Включение Н-тимидина в ядра стимулированных клеток после слияния их с покоящимися клетками, обработанными одновременно циклогексимидом (7.5 мкг/мл) и ак-тиномицином D (1 мкг/мл) (а), или одним актиномицином D (1 мкг/мл) (б) в течение 2 и 3 ч. По вертикали З-тт

индекс меченых Н-тимидином ядер в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродика-рионах (3), %. К - контроль.

Подобно циклогексимиду пуромицин также снимает эффект подавления в присутствии актиномицина Б. Таким образом, снятие эффекта подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах ингибиторами трансляции происходит путем ее остановки в покоящихся клетках и не нуждается в предшествующей транскрипции.

Оказалось так же, что СН проявляет свое действие на покоящиеся клетки при субингибиторных (0,5 мкг/мл) концентрациях. Однако при этом для получения полного снятия эффекта подавления необходима более продолжительная экспозиция покоящихся клеток с СН.

К тому же, в присутствии актиномицина Б низкая концентрация СН не снимала полностью эффект подавления даже в течение 4 ч преинкубации покоящихся клеток.

Результаты экспериментов позволяют предположить, что для снятия эффекта подавления требуется определенный уровень супрессии биосинтеза белка в покоящихся клетках, который при меньших концентрациях СН достигается позднее. С другой стороны, полученные результаты можно объяснить предположив, что СН в действительности снимает эффект подавления несколькими внутриклеточными путями. При высокой концентрации - бы-

а б

стро подавляет трансляцию и образование эндогенного ингибитора. При низкой - снятие эффекта подавления происходит через стимуляцию транскрипционных процессов, как при действии на покоящиеся ¡слетки факторов роста.

4. Синтез ДНК в гетеродикарионах, полученных при слиянии ллительпо стимулированных клеток с кратковременно стимулированными клетками

Поскольку состояние покоя обратимо и при действии митогенов клетки переходят в митотический цикл, можно заключить, что при стимуляции покоящихся клеток факторами роста прекращается образование эндогенного ингибитора(ов) и, как следствие этого, снижается его внутриклеточная концентрация. В связи с этим возникает вопрос: как быстро покоящиеся клетки теряют под действием сыворотки или РБСР свою способность подавлять в гетеродикарионах переход в Б-период ядер стимулированных клеток? 4.1. Покоящиеся клетки, стимулированные сывороткой или РРОЕ, теряют свою способность подавлять в гетеродикарионах синтез ДНК в ядрах стимулированных клеток. Данные, представленные на рис. 14 показывают, что через 3 ч инкубации покоящихся клеток в среде с 10% ЭТС они полностью утрачивают свою способность подавлять в гетеродикарионах вступление в Б-период ядер поздних стимулированных клеток. По сравнению с СН, снятие эффекта подавления сывороткой происходит позднее на 1-1,5 ч.

Несмотря на то, что сыворотка является сложной смесью факторов роста, гормонов и др. веществ, РБОР, снимает эффект подавления, как и

К <*5 1 2 3 4

СШ11 G2D2E293—0—4

Рис. 14. Включение ЗН -тимидина в ядра стимулированных клеток, взятых для слияния в позднем пререпликативном периоде (10 ч), после их слияния со стимулированными клетками, взятыми в раннем пререпликативном периоде (0,5-4 ч). По вертикали - индекс меченых ядер в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), индекс редукции (R¡) - (4), %. По горизонтали - продолжительность стимуляции покоящихся клеток средой с 10% ЭТС, час. К - контроль.

СН, на 1-1,5 ч раньше чем сыворотка (рис. 15, а). Однако воздействие РБСГ полностью прерывает актиномицин Б (рис. 15, б и табл. 6).

□ 1 □ 2 ВЗ

К 0,5 1 1,5 2 3 4

2 3 4

Рис. 15. Включение ЗН -тимидина в ядра стимулированных клеток после их слияния с покоящимися клетками, преинкубированными с PDGF (10 нг/мл) в течение 0,5-4 ч (а), с PDGF + ActD (1мкг/мл) в течение 2-4 ч (б). По вертикали - индекс меченых 3Н-тимидином ядер в moho- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), %. По горизонтали - продолжительность обработки покоящихся клеток, час.

Группы воздействия имп/мин

Контроль (0,2% ЭТС) 750 + 34

PDGF (10 нг/мл), 16 ч 12735 ±902

PDGF (10 нг/мл) + ActD (1 мкг/мл), 16 ч 797 ± 186

Таблица 6. Включение ЗН-тимидина в ядра покоящихся клеток, стимулированных РБйР и РБйР в присутствии А^Б

В то же время сыворотка сохраняет свою способность снимать эффект подавления в присутствии актиномицина Б (рис. 16).

БО

□ 1 П2 мз

К 0,5 1 2 3 4

Рис. 16. Включение -тимидина в ядра стимулированных клеток после слияния их с покоящимися клетками, стимулированными 10% ЭТС в присутствии ActD (1 мкг/мл). По вертикали - индекс меченых ядер в моно- (1), гомоди- (2) и гетеродикарионах (3), %. К - контроль (0,2% ЭТС). По горизонтали - продолжительность преинкубации покоящихся клеток в среде с 10% ЭТС и актиноми-цином D, час.

Однако, стимуляции вступления в S-период ядер покоящихся клеток в moho-, гомоди- и гетеродикарионах, при этом не происходит.

Таким образом, сыворотка как сложная смесь митогенов в отличие от PDGF может приводить к снятию эффекта подавления в гетерокарионах в присутствии актиномицика D, однако без стимуляции перехода покоящихся клеток в S-период.

Эксперименты по кинетике стимулированной пролиферации также показали, что циклогексимид и пуромицин быстрее выводят клетки из состояния покоя, чем сыворотка. Это подтверждается данными, полученными с помощью проточной цитометрии. Данные табл. 7 показывают, что 4-х часовая обработка покоящихся клеток СН или Pur дает значительно больший процент циклирующих клеток, чем 4-х часовая стимуляция покоящихся клеток средой с 10% ЭТС.

Данные, представленные в табл. 7, также показывают, что новые транскрипционные процессы и новый биосинтез белка необходимы в течение и после задержки трансляции для вступления покоящихся клеток в цикл. Но, с другой стороны, снятие эффекта подавления синтеза ДНК в гетероди-карионах ингибиторами биосинтеза белка протекает на фоне подавления транскрипции, в то время как для проявления действия PDGF транскрипция необходима.

Таким образом, механизм снятия эффекта подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах может контролироваться на транскрипционном и трансляционном уровнях. Остается непонятным, почему сыворотка .медленнее, чем PDGF, снимает эффект подавления, хотя содержит больше факторов и снятие ею эффекта подавления, скорее всего, может происходить разными путями. Поэтому возникает вопрос о влиянии факторов прогрессии, содержащихся в сыворотке, на синтез ДНК в гетерокарионах.

4.2. Факторы прогрессии не снимают эффект подавления в гетерокарионах. Слияние покоящихся клеток, обработанных в течение 4 или даже 10 ч плазмой крови (10% АВ плазмы человека) или 10 мкг/мл инсулина (гиперфизиологическая концентрация), со стимулированными клетками показало, что эти факторы не снимют эффект подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах. В то же время совместное воздействие PDGF (4 нг/мл) и

Таблица 7. Необходимость транскрипции и трансляции de novo для индукции про-лиферативного ответа вслед за кратковременной задержкой биосинтеза белка в покоящихся клетках линии NIH ЗТЗ.

Группы воздействий Доля клеток в %, находящихся в различных фазах цикла

V°1 S g2/m s + g2/m

0,2% ЭТС 24 ч 90,56 6,7 2,74 9,44

СН (10 мкг/мл) 74,63 23,19 2,18 25,37

СН + ActD 95,16 1,14 3,7 4,84

CH/ActD 94,98 1,44 3,59 5,03

Pur (20 мкг/мл) 62,26 28,52 9,22 37,74

Pur + ActD 95,55 1,11 3,34 4,45

Pur/ActD 96,38 3,48 0,14 3,62

ActD (5 мкг/мл) 95,06 0,95 3,99 4,94

CH/CH 100,00 0,00 0.00 0,00

Pur/Pur 89,17 7,65 3,17 10,82

10% ЭТС (4 ч) +0,2% ЭТС (24 4) 84,01 9,79 6,2 15,99

10% ЭТС (24 ч) 38,19 13,66 48,16 61,82

Примечания: покоящиеся клетки были обработаны в течение 4 ч С H (10 мкг/мл) vuiu Риг (20 мкг/мл) (СН и Риг группы) или ингибиторалт биосинтеза белка в присутствии актиномщина D (1 мкг/мл) (СН + ActD и Pur+ ActD группы). После отмывки клетки были инкубированы в течение 24 ч в среде с 0,2% ЭТС с последующим проведением цитометрического анализа. Другие группы клеток были обработаны в течение 4 ч СН или Pur, а затем культивированы в течение 24 ч в среде с 0,2% ЭТС в присутствии 1 мкг/мл СН или 2 мкг/мл Pur (СН/СН и Риг/Риг группы) или 1 мкг/мл ActD (CH/ActD и Риг/ActD группы) В контроле клетки не были обработаны ингибиторами (0,2% ЭТС 24 ч) или инкубированы в течение 4ч в среде с10% ЭТС, а затем в среде с 0,2% ЭТС или 10% ЭТС последующие 24 ч.

плазмы (10%) или PDGF (4 нг/мл) и инсулина (1 мкг/мл) не только полностью снимало эффект подавления ДНК в гетеродикарионах, но и стимулировало синтез ДНК в ядрах покоящихся клеток как в гетероди-, так и в гомо-ди-и монокарионах.

Таким образом, эффект подавления синтеза ДНК в ядрах стимулированных клеток в гетеродикарионах сохраняется в присутствии факторов прогрессии.

5. Роль процессов дефосфоридиропания в регуляции перехода клеток в состояние пролиферативного гтокоя и в поддержании этого состояния

Самое крупное открытие в клеточной биологии последнего времени -обнаружение общности генетического контроля размножения клеток на уровне молекул у всех эукариотов (от дрожжей до человека). Более того, оказалось, что митотический цикл в разных его точках регулируется при участии ключевых молекул белка, называемых циклин-зависимыми киназа-ми (СОК), которые входят в состав белковых комплексов, обеспечивающих как С2"->-М, так и С}-»Б переходы в цикле.

Резонно предположить, что и выход клеток из состояния покоя в цикл переход) также находится под контролем подобного механиз-

ма. Отсюда, участие в негативном контроле пролиферации протеинфосфа-таз, обращающих кшгазные реакции, кажется наиболее вероятным. Особое внимание привлекают протеинфосфатазы РР1 и РР2А. Если они вовлечены в процесс задержки цикла, то можно ожидать, что выключение их с помощью специфических ингибиторов будет имитировать киназные реакции и тем самым стимулировать в клетках пролиферативные процессы.

В настоящей работе исследовали роль чувствительных к окадаевой кислоте (ОА) протеинфосфатаз РР2А и РР1 в регуляции перехода клеток линии N111 ЗТЗ в состояние пролиферативного покоя.

5.1 Влияние окадаевой кислоты на пролиферативную активность клеток линии МН ЗТЗ. Данные, представленные на рис. 17 показывают, что имп/мин )х103

—•—1 —ж—2 —Л—3

Рис 17. Кинетика выхода из состояния покоя клеток линии NIH ЗТЗ, преинку-бированных в течение 2 ч в среде, содержащей различные концентрации 0,1(1), 1(2), 10(3) и 100 (4) нМ окадаевой кислоты (ОА), а затем переведенных в среду с 0,2% ЭТС. Контроль - 0,2% ЭТС (5); ОА (10 нМ) постоянно присутствовала в среде с 0,2% ЭТС (6). 3Н-тимидин вводили импульсно за 1 час до каждой точки фиксации клеток. По горизонтали - продолжительность экспозиции клеток в среде с 0,2% ЭТС после отмывки их от ОА, час.

все исследованные концентрации ОА (от 0,1 до 100 нМ) при кратковременном воздействии (45 мин - 2 ч) стимулируют вступление покоящихся клеток в Б-период. Напротив, постоянное присутствие в среде О А (10 нМ) в течение 24 ч снижает интенсивность включения 3Н-тимидина даже по сравнению с контролем (0,2% ЭТС). Максимальный пролиферативный ответ клеток вызывает О А при концентрации 10 нМ. Сравнение пролиферативного ответа покоящихся клеток на 2-часовое воздействие 10 нМ О А и 10% ЭТС показало, что степень его одинакова в обоих случаях. Кроме того, ОА препятстует переходу пролиферирующих клеток в состояние покоя в среде с 0,2% ЭТС при многократном импульсном (2 ч) воздействии (рис. 18). (имп/мин) х 103

Рис. 18. Окадаевая кислота (ОА) препятствует переходу клеток линии ШН ЗТЗ в состояние покоя в среде с низким содержанием сыворотки (0,2%). 1 - опыт (каждые 12 ч клетки на 2 ч переводили в среду с 10 нМ ОА); 2 - контроль (каждые 12 ч клетки на 2 ч переводили в чистую среду); 3 - в среде постоянно присутствовала ОА). "Метка" импульсная, 3Н-тимидин вводили в среду за 2 ч перед каждым сроком фиксации клеток. По горизонтали - время в течение которого клетки инкубировали в среде с 0,2% ЭТС, час.

5.2. Окадаевая кислота снимает эффект подавления синтеза ДНК в ядрах стимулированных клеток в составе гетеродикарионах. В связи с тем, что ОА стимулирует выход клеток из состояния покоя следовало предположить, что она снимет эффект подавления синтеза ДНК в гетеродикарионах. Действительно, данные, представленные на рис. 19, показывают, что обработка покоящихся клеток ОА (1 и 10 нМ) уже в течение 45 мин приводит к полному снятию эффекта подавления в гетеродикарионах. Кратковременная (45 мин) обработка клеток ОА после их слияния также снимает эффект подавления в гетеродикарионах. В то же время преинкубация покоящихся клеток, обработанных ОА, в. кондиционированной среде с 0,2% ЭТС в течение 6 ч полностью восстанавливает эффект подавления, т.е влияние окадаевой кислоты на синтез ДНК в гетеродикарионах обратимо. Было также обнаружено, что ОА препятствует восстановлению эффекта подавления при культи-

вании покоящихся ¡слеток, обработанных СН, в кондиционированной среде, однако, пи совместное, ни последовательное воздействие на покоящиеся клетки ОА и СН не вызывает увеличение нролиферативного ответа клеток, а скорее снижает его (табл. 8).

а б

Рис. 19. Включение 3Н-тимидина в ядра стимулированных клеток после слияния их с покоящимися клетками. Покоящиеся клетки обработаны до слияния ОА (0,1, 1 и 10 нМ) в течение 45 мин (а) или 2 ч (б); По вертикали - индекс меченых ядер в moho- (1), го-моди- (2) и гетеродикарионах (3), По горизонтали - концентрация ОА, нМ. К - контроль.

Таблица 8. Включение 3Н-тимидлна в ядра покоящихся клеток после слияния их со стимулированными клетками. Покоящиеся клетки обработаны перед слиянием циклогексимидом (СН) и окадаевой кислотой (ОА).

Экспериментальные группы Индекс меченых ядер, %±Sx

монокарионы гомодикарионы гетеродикарионы

Контроль 3,7 ± 0,3 4,2 ± 1,1 5,1 ± 2,1

СН (2 ч) 8,2 + 3,1 7,4 ± 1,3 16,1 ± 3,5

СН (2 ч), затем 0,2% ЭТС (3 ч) 7,8 ± 0,4 8,8 ± 2,8 9,3 ± 1,4

ОА (2 ч) 10,2 ± 0,6 11,3 ± 0,7 19,5 ± 3,7

СН (2 ч), затем ОА (3 ч) 7,9 ± 1,7 9,4 ± 0,2 10,3 ± 1,5

СН + ОА (2 ч) 6,7 ± 2,3 8,4 ± 0,6 12,6 + 1,2

Обнаружено также, что кратковременное (2 ч) воздействие ОА на покоящиеся клетки на подавляет в них биосинтез белка.

Поскольку снятие эффекта подавления в гетеродикарионах наблюдается при действии низких {0,1-1 нМ) концентраций ОА можно сделать вывод, что в негативной регуляции участвует, скорее всего, РР2А, так как она в 10 раз более чувствительна к ОА, чем РР1.

□1D2B3

Таким образом, подавление активности фосфатаз как в покоящихся клетках, так и в гетеродикарионах приводит к снятию эффекта подавления синтеза ДНК и стимулирует переход покоящихся клеток в цикл.

6. Роль протеаз и активного протеолиза в регуляции размножения эука-риотических клеток

Переход клеток в состояние покоя сопровождается усиленной деградацией макромолекул, прежде всего белков, которая обусловлена высокой активностью лизосомных и нелизосомных протеаз в покоящихся клетках (Amenta et aL, 1978; Papadopoulos, Pfeifer, 1987). Большое разнообразие протеаз и четкая зависимость их активности от пролиферативного статуса клетки позволяют предположить, что в задержке клеточной пролиферации протеолиз может играть вполне определенную роль.

Можно предположить несколько сценариев биологической роли повышенного протеолиза в покоящихся клетках:

1) Он играет исключительно адаптивную роль, препятствуя несбалансированному росту клеток в условиях, при которых отсутствуют возможности для их деления. При этом пререпликативные процессы в клетках блокированы при участии специальных ингибиторов. В этом случае повышенный протеолиз - лишь следствие перехода клетки в состояние покоя.

2} Избирательная активация протеаз препятствует накоплению в клетке белков, необходимых для прохождения пререпликативного периода. В этом случае усиленный протеолиз может быть причиной удержания метки в состоянии покоя.

3) Повышенный протеолиз - лишь один из ряда специфических метаболических процессов в покоящихся клетках, удерживающих ее в этом состоянии.

Если верны два последних сценария, то подавление активности протеаз с помощью высокоспецифических ингибиторов, может повышать степень готовности покоящихся клеток к выполнению пререпликативных реакций или даже стимулировать их переход в митотический цикл. С целью выяснения роли протеаз различных классов (сериновых, цистеиновых, аспара-гиновых и лизосом в целом) в механизмах, контролирующих пролифера-тивную активность клеток, были выполнены опыты по кинетике стимулиро-

ванной пролиферации, в которых покоящиеся клетки одновременно или перед стимуляцией сывороткой (5%) обрабатывали в течние 2-6 ч физиологическим ингибиторами протеаз.

Данные, представленные на рис. 20, показывают, что предварительная обработка покоящихся клеток апротинином или 8ВТ1 в течение 2-6 часов не только повышает пролиферативный ответ клеток на сыворотку (5%), но и стимулирует их переход в цикл в среде с 0,2% ЭТС. Ингибиторы лизо-сомных цистеиновых протеаз (катепсипов) - циста тин и лейпептин также

а б

12 16 го 24 12 16 20 24

Рис. 20. Включение мС-тимидина в ядра покоящихся клеток, обработанных в течение 2ч (1), 4ч (2), и 6ч (3) апротинином (100 мкг/мл) или БВТ1 (300 мкг/мл), а затем переведенных в среду с 5 или 0,2% ЭТС. а) - апротанин, затем 5% ЭТС; б) -БВТГ, затем 5% ЭТС; в) - апротинин, затем 0,2% ЭТС; г) - БВТ1, затем 0,2% ЭТС. По вертикали - радиоактивность (имп/мин )х103, определенная как разница между значениями, полученными в опыте и контроле. Контроль - 5% или 0,2% ЭТС -горизонтальные линии. По горизонтали - продолжительность инкубации клеток в среде с 5 или 0,2% ЭТС после отмывания клеток от ингибиторов, час. ("Метка" -кумулятивная).

повышают (на 30-40%) пролиферативный ответ покоящихся клеток на сыворотку, в то время как стимулирующий эффект пепстатина А значительно менее выражен.

Обработка покоящихся клеток хлороквином, повышающим рН в лизо-сомах и выключающим тем самым все кислые лизосомные гидролазы, не

только не стимулирует, а напротив, значительно редуцирует пролифератив-ный ответ клеток на сыворотку (рис. 21).

Рис. 21. Включение 14С-тимидина в ядра покоящихся i клеток, обработанных в тече-

ние 2, 4 и 6 ч лизосомотроп-ным агентом хлороквином (200 мкМ), а затем переведенных в среду с 5% ЭТС. Остальные Ц обозначения те же, что и на

рис. 20.

Другие лизосомотропные агенты (метиловый эфир L-изолейцина и 3-метиладеяин) незначительно повышают пролиферативный ответ покоящихся клеток на сыворотку при кратковременном (1-2 ч) воздействии. Увеличение срока обработки клеток до б ч приводит в последующем к снижению пролиферативного ответа клеток на сыворотку. Наконец, ингибиторы нели-зосомных Са2+-зависимых нейтральных протеаз (кальпаинов) - L-цистамин и L-цистин при кратковременном (2-6 ч) воздействии на покоящиеся клетки повышают их пролиферативный ответ на сыворотку (5%) и стимулируют включение меченого тимидина в клетки в среде с 0,2% ЭТС. В то же время постоянное присутствие в среде ингибиторов Са2+-активируемых цистеино-вых нейтральных протеаз - L-цистамика и L-цистина, также как и ингибиторов лизосомных кислых цистеиновых протеаз - цистатина, лейпептина и пепстатина А не оказывает влияние на синтез ДНК в стимулированных сывороткой клетках. Напротив, лизосомотропные агенты - хлороквин, метиловый эфир L-изолейцина и 3-метиладенин резко (в 4; 3 и 1,5 раза соответственно) редуцируют пролиферативный ответ клеток на сыворотку (табл. 9).

Полученные данные говорят о том, что кратковременный сдвиг метаболизма в сторону анаболизма существенен для изменения пролиферативного статуса клетки. Возможно, что этого сдвига достаточно для изменения содержания короткоживущих регуляторных белков. Эти данные противоречат гипотезе "дамбы и шлюзы" (Nasmyth, Hunt, 1993), согласно которой путем протеолиза деградируют не циклины, а ингибиторы циклин зависимых

киназ (Сс1к1). Если это так, то ингибиторы протеаз должны предотвращать разрушение Сс1к1 и, тем самым, подавлять пролиферацию, а не стимулировать ее.

Таблица 9. Включение 14С-тимидина ("метка" кумулятивная, 24 ч) в ядра покоящихся клеток, стимулированных Ъ% ЭТС в присутствии ингибиторов различных протеаз.

Подавляемые протеазы Экспериментальные группы Радиоактивность, имп/мин, Х±Эх

контроль, 5% ЭТС 60649 + 1970

Сериновые нелизосом-иые протеазы апротинин + 5% ЭТС 72420 ± 1970

БВТ1 + 5% ЭТС 79342 + 2484

Цистеиновые лизосомные протеазы цистатил + 5% ЭТС 59648 ± 2492

лейпептин + 5% ЭТС 54948 ±5152

пепстатин А + 5% ЭТС 58134 + 4138

Нелизосомные Са2+-ак-тивируемые протеазы (кальпаины I и II) Ь-цистамин + 5% ЭТС 57024 ± 1646

Ь-цистин + 5% ЭТС 58288 + 1262

Лизосомные гидролазы хлороквин + 5% ЭТС 15892 ± 1742

метиловый эфир изолей-цина + 5% ЭТС 20148 ± 1224

3-метиладенин +5% ЭТС 40546 ± 5176

7. Эндогенный контроль в дифференцированных клетках Механизм прекращения пролиферативной активности дифференцированными клетками остается еще не выясненным. Поскольку некоторые дифференцированные клетки (за исключением терминально дифференцированных) сохраняют способность возвращаться в цикл при воздействии адекватных стимулов, можно предположить, что в них, по крайней мере на ранних этапах дифференцировки, прекращение пролиферативной активности связано с появлением негативных сигналов.

Для выяснения правомочности ингибиторной гипотезы прекращения пролиферации при дифференцировке целесообразно использовать клетки, сохраняющие межклеточные контакты и способность к делению в интакт-ных тканях.

В качестве такой модели нами были выбраны паренхимные клетки печени. Клетки интактной печени взрослых животных характеризуются низким темпом пролиферации, однако не теряют способности к ней и при частичной гепатоэктомии и некоторых других воздействиях переходят к активному размножению.

С целью выяснения механизма снижения пролиферативной активности гепатоцитов "взрослой печени" в настоящей работе проводили слияние гепатоцитов интактной печени взрослых животных, печени после частичной эктомии, печени животных, отравленных циклогексимидом или гепатотокси-ном CCI4 и эмбриональной печени с покоящимися или стимулированными фибробластами линии NIH ЗТЗ.

В экспериментах по слиянию клеток и в опытах по совместному культивированию в среде с 0,5% ЭТС стимулированных (10 ч) фибробластов линии NIH ЗТЗ и гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей обнаружено, что вступление в S-период фибробластов как в моно- так и гетерокарионах значительно ингибировано в присутствии гепатоцитов.

Гепатоциты, полученные через 24 ч после частичной гепатоэктомии (ЧГЭ), не подавляют вступление в S-период ядер стимулированных фибробластов в среде с 0,5 или 10% ЭТС) ни в moho-, ни в гетерокарионах. Напротив, в гетерокарионах реактивируется синтез ДНК в ядрах гепатоцитов и возрастает включение 3Н -тимидина в ядра стимулированных фибробластов (взаимная стимуляция).

Гепатоциты, полученные через 48 ч после ЧГЭ, резко снижают свою пролиферативную активность в гетерокарионах, однако при этом не подавляют синтез ДНК в ядрах стимулированных фибробластов.

Гепатоциты, полученные: 1) из эмбриональной печени, 2) печени мышей, которым за 48 ч до получения гепатоцитов вводили внутрибрюшинно цик-логексимид (3 мкг/г веса), 3) печени мышей с экспериментальным посттоксическим циррозом, также не подавляют синтез ДНК в ядрах стимулированных фибробластов. Напротив, как показывают данные, представленные на рис. 22, ядра покоящихся фибробластов в гетерокарионах с такими гепа-тоцитами активно включают 3Н-тимидин. Стимуляция синтеза ДНК происходит и в монокарионах, хотя и в меньшей степени, чем в гетерокарионах. Эти данные позволяют заключить, что в печени, стимулированной in vivo

различными способами, образуются факторы, стимулирующие пролифера-тивную активность клеток мезенхимного происхождения.

□ 1 ¡32

а б о г

Рис. 22. Включение 3Н-тимидина в ядра покоящихся фибробластов после слияния ¡ix с различными гелатодитами. Ге-патоциты получали: а - из интактной печени взрослых мышей, б - из регенерирующей печени через 24 ч после ЧГЭ, в - из печени мышей, которым предварительно за 48 ч вводили циклогексимид (3 мкг/г веса), г - из печени мышей, отравленных СС14. После слияния клетки культивировали в течение 16 ч в среде с 0,5% ЭТС. По вертикали - индекс меченых ядер в монокарионах (1) и гетерока-рионах (2), %.

Можно сделать несколько предположений, объясняющих полученные результаты.

1. В гепатоцитах не образуются ингибиторы пролиферации; переход их в состояние покоя обусловлен механизмами, отличными от тех которые вызывают переход фибробластов в состояние покоя.

2. Гепатоциты интактной печени взрослых животных находятся не в истинном состоянии покоя (Go- или К j-период), а задержаны в Gi-периоде. При этом какая-то функция Gj-периода в интактных гепатоцитах блокирована. В гетерокарионах эта функция обеспечивается за счет фибробластов (комплементация функций), и в ядрах гепатоцитов индуцируется синтез ДНК.

3. В результате эксплантации гепатоцитов из организма in vitro в них исчезают ингибиторы пролиферации.

4. Ингибиторы пролиферации действуют только на ранних стадиях дифференцировки, а затем непролиферативный статус клеток поддерживается за счет других механизмов,

5. Можно также предположить, что переход гепатоцитов в состояние покоя на этапе прекращения регенеративных процессов в печепи после индуцированной гепатогжтомией пролиферации обусловлен появлением негативных сигналов. Однако при слиянии стимулированных фибробластов с ге-патоцитами из регенерирующей печени, когда в последней происходит ени-

жение пролиферативной активности (48-50 ч после ЧГЭ), также не обнаружено ингибирующего влияния гепатоцитов.

6. Негативные регуляторы репликации из дифференцированных клеток обладают специфичностью действия

8. Заключение.

Регуляция численности клеточных популяций в эукариотах достигается путем регулярной смены состояний активной пролиферации и пролифе-ративного покоя в результате координированного взаимодействия между внутриклеточными (эндогенными) ингибиторами роста и экстраклеточньши (секретируемыми) ингибиторами и стимуляторами роста (факторами роста). Постоянное взаимодействие разных уровней регуляции (экзогенного и эндогенного) приводит к тому, что экзогенные факторы изменяют характер развертывания внутренней программы клетки.

Состояние пролиферативного покоя это - специфическое физиологическое состояние клетки, поддерживаемое избирательно активированными метаболическими процессами.

Способность прекращать и при необходимости возобновлять клеточную пролиферацию предполагает существование тонкой внутриклеточной регу-ляторной сети, включающей как позитивные, так и негативные контрольные элементы.

Во всех эукариотах, от дрожжей до человека, порядок прогрессии клеток в цикле регулируется при участии одних и тех же основных молекул. Активность регуляторных белков и их ассоциация в комплексы управляются множественными реакциями фосфоршшрования-дефосфорилирования, происходящими в определенных контрольных пунктах цикла. Поэтому ключевые роли в регуляции клеточного цикла играют не только цикл-зависимые протеинкиназы, но и некоторые протеинфосфатазы. Эксперименты с окадаевой кислотой демонстрируют определенную функциональную значимость в супрессии меточного роста протеинфосфатаз РР2А и РР1.

Данные, полученные в экспериментах по слиянию покоящихся и стимулированных клеток, показывают, что внутриклеточные ингибиторы роста могут быть коротко-живущими репрессорными белками. Возможный механизм, посредством которого ингибиторы биосинтеза белка стимулируют про-

лиферацию покоящихся клеток, связан с элиминацией репрессорных белков, удерживающих клетку в состоянии по коя. Эти представления поддерживают исследования биологической роли фактора элонгации 2 (eEF-2) (Ryazanov, Spirin, 1990; 1993).

Возобновление пролиферативной активности покоящихся клеток должно включать в себя как облигатный шаг снижение уровня эндогенного ингибитора(ов).

Во всех этих рассуждениях главными являются два вопроса, на которые еще не получены ответы. 1. Какой ключевой процесс должен быть блокирован, чтобы не только прекратилась прогрессия клеток в цикл (им может быть, например, процесс транскрипции любого гена раннего пролифератив-ного ответа (Heikkila et al., 1987)), но и клетка перешла в состояние покоя? 2. Какой из известных ингибиторных белков может играть роль эндогенного ингибитора пролиферации?

Скорее всего, клетка будет находиться вне цикла до тех пор пока будут активны: 1) короткоживущие репрессорные белки, подавляющие транскрипцию ключевых генов пререпликатиЕного периода; 2) ингибиторы определенных транскрипционных факторов; 3) ингибиторы циклин-зависимых киназ; 4) фосфатазы, ревертирующие некоторые ключевые киназные реакции (например, дефосфорилирование pRb). Однако, переход клетки в истинное состояние пролиферативного покоя, по-видимому, связан с функционированием всех звеньев сложного многофункционального ингибиторного комплекса клетки, включающего в себя протеинфосфатазы, короткоживущие репрессорные белки, pRb и другие ингибиторы транскрипционных факторов, ингибиторы циклин-зависимых киназ и, вероятно, еще не идентифицированные факторы с антипролиферативной активностью. Остается также неясным, формируется ли метаболический статус покоящейся клетки вследствие подавления реакций пререпликативного периода или эти процессы протекают параллельно? По крайней мере участие повышенного протеолиза белков в покоящихся клетках в деградации Gx-циклинов, как необходимом регуляторном моменте, вполне объяснимо.

В настоящее время могут быть предположительно очерчены три уровня негативного эндогенного контроля перехода клеток из состояния активной пролиферации в состояние покоя и обратно (R«-»P).

1. Быстрые процессы (фосфорилирования/дефосфорилировашш), обеспечивающие временный блок клеточного роста в различных точках цикла.

2. Переход клетки в состояние пролиферативного покоя с продолжительной продукцией ингибиторов, включая короткоживущие репрессорные белки, блокирующие транскрипцию генов раннего пролиферативного ответа.

3. Долговременное поддержание состояния покоя, обеспечиваемое путем изменения метаболизма клетки (сдвиг в сторону катаболических процессов), увеличения степени конденсации хроматина, стабилизации плазматической мембраны и других процессов, не связанных с образованием ингибиторов пролиферации.

9. Основные экспериментальные результаты.

В настоящей работе с помощью метода слияния клеток был изучен характер эндогенной (внутриклеточной) регуляции смены состояний активной пролиферации и покоя в жизненном цикле культивируемых фибробла-стов мыши линии N111 ЗТЗ. Проводили слияние покоящихся в условиях низкой концентрации сыворотки (0,2-0,5%) клеток с клетками, стимулированными к пролиферации путем переноса в среду с 10% сыворотки и методом радиоавографии исследовали характер синтеза ДНК в гетерокарионах.

1. Разработаны методические приемы, позволившие идентифицировать ядра клеток, не имеющих морфологических различий (покоящиеся и стимулированные клетки), после их слияния методом двойного изотопного маркирования с помощью 14С- и 3Н-тимидина.

2. Установлено, что в гетерокарионах, полученных путем слияния покоящихся и стимулированных клеток, происходит подавление вступления в Э-период ядер стимулированных клеток, находившихся в момент слияния в пререпликативном периоде (эффект подавления).

3. Показано, что ядра стимулированных клеток, находившихся в момент слияния в Б-периоде или за 1,5-2 ч до его начала беспрепятственно синтезируют ДНК в гетерокарионах.

4. С увеличением числа ядер покоящихся клеток в гетерополикарионах возрастает степень подавления вступления в Б-период ядер стимулированных клеток (дозовый эффект).

5. Ядра покоящихся клеток а гетерокарионах не вступают в Б-период даже, если ядро стимулированной ¡слетки синтезирует ДНК.

6. Пребывание ядер стимулированных клеток в течение 24 ч в общей цитоплазме с покоящимися клетками в среде с низким содержанием (0,2-0,5%) сыворотки, не только препятствует их переходу в Э-период, но и приводит к возвращению в состояние покоя (эффект отбрасывания).

7. По мере пребывания клеток в состоянии покоя не только возрастает продолжительность пререпликативного периода и падает число клеток, способных отвечать на пролиферативный стимул, но и возрастает способность таких покоящихся клеток подавлять в гетерокарионах вступление в 5-период ядер стимулированных клеток. Для снятия эффекта подавления требуется большая продолжительность инкубации таких клеток с сывороткой.

8. Покоящиеся клетки, стимулированные в течение 3-4 ч сывороткой или 23 ч фактором роста из кровяных пластинок (РБОР) теряют свою способность подавлять в гетерокарионах вступление в Э-период ядер стимулированных клеток. Актиномицин Б блокирует влияние РВСР на покоящиеся клетки, тогда как сыворотка сохраняет свою способность снимать эффект подавления в гетерокарионах в присутствии актиномицина Б.

9. Покоящиеся клетки, обработанные перед слиянием в течение 1,5-2 ч циклогексимидом, полностью утрачивает свою способность подавлять вступление в Э-период ядер стимулированных клеток в гетерокарионах. Этот же эффект достигается более короткой (0,5 ч) обработкой циклогексимидом гетерокарионов.

Ю.Влияние циклогексимида на синтез ДНК в гетерокарионах обратимо -эффект подавления восстанавливается при инкубации покоящихся клеток, обработанных циклогексимидом, в кондиционированной среде с низким содержанием сыворотки.

11. Пуромицин при эквимолярных концентрациях как и циклогексимид снимает эффект подавления в гетерокарионах.

12. Кратковременная (45 мин -4 ч) обработка покоящихся клеток ингибиторами биосинтеза белка не только повышает их чувствительность к факторам роста, но и стимулирует переход в Б-период.

13. Стимулирующий эффект циклогексимида определяется не столько концентрацией, сколько продолжительностью экспозиции клеток с ним. Эк-вимолярные концентрации циклогексимида и пуромицина вызывает одинаковый пролиферативный ответ клеток. Сравнение влияния циклогексимида и пуромицина на уровень биосинтеза белка и на индукцию проли-феративных процессов показало, что для инициации событий цикла необходимо 55%-ное подавление биосинтеза белка в покоящихся клетках. Ингибиторы биосинтеза белка стимулируют переход в Б-период и фибробла-стов линии СЗН10Т1/2.

14. Циклогексимид и пуромицин индуцируют экспрессию протоонкогенов с-Ноб, с^ип и с-тус в покоящихся клетках с характеристиками, подобными тем, что имеют место при воздействии на них фактора роста из кровяных пластинок. Актиномицин Б блокирует экспрессию протоонкогенов, вызванную ингибиторами биосинтеза белка, однако не препятствует снятию ими эффекта подавления синтеза ДНК в гетерокарионах.

15. Плазма крови (10%) и инсулин не снимают эффект подавления синтеза ДНК в гетерокарионах, однако инсулин в гиперфизиологической концентрации, добавленный к клеткам после слияния, снимет эффект подавления в гетерокарионах. Актиномицин О полностью блокирует действие инсулина.

16. Окадаевая кислота при кратковременной (45 мин -2 ч) экспозиции покоящихся клеток снимает эффект подавления синтеза ДНК в ядрах стимулированных клеток в гетерокарионах и стимулирует переход покоящихся клеток в митотический цикл.

17. Ингибиторы внутриклеточных протеаз (лизосомных и нелизосомных), подавляя активный протеолиз в покоящихся клетках повышают их восприимчивость к экзогенным митогенным факторам. Часть клеток в популяции при подавлении в них активного протеолиза приобретают способность вступать в период синтеза ДНК. Подавление активности лизосом в целом с помощью лизосомотропных агентов, напротив, снижает пролифе-ративную активность клеток в ответ на воздействие экзогенных митоген-ных стимулов.

18. Гепатоциты, полученные из интактной печени взрослых мышей, снижают пролиферативную активность стимулированных фибробластов линии

NIII ЗТЗ при совместном культивировании, а в опытах па слиянию клеток снижают в гетерокарионах пролиферативную активность ядер стимулированных клеток и тормозят вступление в цикл ядер покоящихся фибробластов в среде с 10% сыворотки. В то же время в гетерокарионах со стимулированными фибробластами в ядрах гепатоцитов реактивируется синтез ДНК.

19. Гепатоциты регенерирующей после частичной эктомии печени (ЧГЭ), а также эмбриональные гепатоциты и гепатоциты печени мышей, отравленных циклогексимидом или гепатотоксином ССЦ, не тормозят синтез ДНК в ядрах стимулированных фибробластов, а напротив, стимулируют синтез ДНК в ядрах покоящихся фибробластов. В гетерокарионах в ядрах гепатоцитов реактивируется синтез ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Эксперементальные данные, полученные в работе, однозначно свидетельствуют в пользу существования негативного эндогенного контроля размножения клеток в культуре и позволяют считать, что переход клеток в состояние пролиферативного покоя и его поддержание связаны с выработкой и накоплением ингибитора (ингибиторов) пролиферации, действие которого направлено на подавление реакций подготовки клетки к синтезу ДНК.

2. Главное условие возникновения состояния готовности (компетентности) клеток к переходу в период синтеза ДНК включает в себя как облигатное событие снижение уровня внутриклеточной концентрации эндогенного ингибитора(ов). Поэтому период коммитирования клеток в цикл можно рассматривать как этап пререпликативного периода, когда происходит «выключение» активных механизмов подавления клеточной пролиферации.

3. Приобретение покоящимися клетками компетентности под воздействием факторов роста связано со стимуляцией ими экспрессии генов раннего пролиферативного ответа - c-fos, c-jun, а также с-тус. В противоположность факторам роста ингибиторы биосинтеза белка не только стимулируют экспрессию c-fos, c-jun и c-myc, но и через прямое подавление трансляции приводят к элиминации эндогенного ингибитора(ов) пролифе-

радии. Поэтому внутриклеточный путь стимуляции синтеза ДНК ингибиторами трансляции должен быть короче, чем при воздействии факторов роста.

4. Эндогенный контроль перехода клеток в состояние покоя связан с активностью протеинфосфатаз типа РР2А и, возможно, РР1. Подавление РР2А с помощью окадаевой кислоты стимулирует выход покоящихся клеток в цикл.

5. Высокая протеолитическая активность в покоящихся клетках - один из механизмов, способствующих удержанию их в состоянии пролифератив-ного покоя. Кратковременное подавление или сдвиг катаболических процессов в покоящихся клетках в сторону анаболических способствует переходу клеток в цикл. Таким образом, кроме специфического лиганд-рецепторного механизма стимуляции клеточной пролиферации (факторы роста) существует неспецифический механизм, основанный на кратковременных метаболических сдвигах.

6. В целом полученные результаты подтверждают представление о состоянии пролиферативного покоя, как особом физиологическом состоянии клетки, которое поддерживается с помощью специфических (внутриклеточные ингибиторы) и неспецифических (изменение метаболизма) механизмов.

7. Регуляция размножения гепатоцитов осуществляется по типу позитивного контроля с участием митогенных факторов, образующихся в проли-ферирующих гепатоцитах, вне зависимости от способа их стимуляции (гепатоциты регенерирующей после частичной эктомии печени, эмбриональной печени, или печени, стимулированной in vivo токсическими воздействиями). Поэтому различные токсические и другие повреждении паренхимы печени (цирроз) приводят к образованию в ней митогенного фак-тора(ов), стимулирующего пролиферативную активность фибробластов, что является причиной разрастания соединительно-тканной основы органа.

8. Гепатоциты интактной печени взрослых животных, скорее всего, находятся не в истинном состоянии покоя, или переход их в состояние покоя обусловлен механизмами не связанными с образованием эндогенных инги-

биторов, или, наконец, ингибиторы гепатоцитов обладают высокой клеточной специфичностью.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТИЦИИ РАБОТ

1. Терских В.В., Епифанова О.И., Зосимовская А.И., Полуновский В.А., Сетков Н.А. Поведение стимулированных к пролиферации клеток в зависимости от времени, проведенного в состоянии покоя // Цитология.-1981.-Т. 23, № 10.-С. 1217.

2. Terskikh V.V., Epifanova O.I., Polunovsky V.A., Setkov N.A. Characteristics of stimulated cells depending upon the time spent on the state of rest. / /Cell Tissue Kinet.-1981.-V. 14, N 6.-P. 687.

3. Сетков H.A. Состояние покоя и регуляции размножения клеток высших организмов. В кн.: Некоторые проблемы цитологии и генетики высших растений. М.: Изд-во МГПИ им. Ленина, 1982.-С. 3-21.

4. Epifanova O.I., Setkov N.A., Polunovsky V.A., Terskikh V.V. Cellular rest as an active metabolic state. In.: Cell Function and Differentiation. Part A. /Ed. by C. Akoyunoglou et al. /New. York: Aian R. Liss, 1982.-P. 231-242.

5. Epifanova O.I., Setkov N.A., Polunovsky V.A., Terskikh V.V. Cellular rest /Abstr. of the Special FEBS Meeting/ Athens, Greece, 1982.-P. 41.

6. Сетков H.A., Полуновский B.A, Епифанова О.И. Подавление синтеза ДНК в ядрах пролиферируюндих клеток после слияния с покоящимися клетками // Докл. АН СССР.-1983.-Т. 269, № 4.-С. 954-957.

7. Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. Изучение регуляции клеточного размножения методом слияния клеток // Цитология.-1983.-Т. 25, № 9.-С. 1094.

8. Polunovsky V.A.., Setkov N.A., Epifanova O.I. Onset of DNA replication in nuclei of proliferation and resting NIH 3T3 fibroblasts following fusion // Exp. Cell Res.-1983.-V. 146.-P. 377-383.

9. Polunovsky V.A.., Setkov N.A., Epifanova O.I. Entry into the S-period of nuclei in heterodikaryons formed by resting and stimulated NIH 3T3 fibroblasts /Abstr. ХП-th Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation / Budapest, 1983.-P. 36.

Ю.Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. Синтез ДНК в ядрах покоящихся и пролиферирующих клеток линии NIH ЗТЗ в монокарионах, гомо- и гетеродикарионах // Цитология.-1984.-Т. 26, № 6.-С. 691-689.

И.Сетков Н.А., Полуновский В.А., Епифанова О.И. Зависимость вступления клеток линии NIH ЗТЗ в период синтеза ДНК от длительности их предварительного пребывания в состоянии покоя // Цитология.-1984.-Т. 25, № 8.-С. 936-942.

12.Polunovsky V.A.., Setkov N.A., Epifanova O.I. Entry into S-phase of nuclei in heterokaryons formed by resting and stimulated NIH 3T3 fibroblasts // Cell Tissue Kinet.-1984.-V. 17, N 3.-P. 36.

13.Сетков H.A., Казаков B.A. Синтез ДНК в ядрах стимулированных клеток линии NIH ЗТЗ в гетеродикарионах, полученных при слиянии этих клеток с покоящимися клетками, обработанными циклогексимидом // Цитолошя.-1989.-Т. 31, № 11.-С. 1339-1343.

14.Сетков Н.А., Андреева Т.В., Казаков В.Н. Покоящиеся клетки, преинкубированные с актиномицином D, не подавляют синтез ДНК в гетерокарионах со стимулированными клетками // Докл. АН СССР.-1991.-Т. 318, № 4.-С. 986-787.

15.Сетков Н.А., Казаков В.Н., Андреева Т.В. Гепатоциты в гетерокарионах не тормозят вступление в S-период ядер стимулированных фибробластов // Цитология.-1991 .-Т. 33, № 6.-С. 76-83.

16.Сетков Н.А., Казаков В.Н., Андреева Т.В. Влияние циклогексимида на вступление в S-период ядер в гетеродикарионах //Цитология.-1991.-Т. 33, № 12.-С. 73-78.

17.Сетков НА., Казаков В.Н., Андреева Т.В., Седов К.Р. Гепатоциты из печени мышей с экспериментальным посттоксическим циррозом стимулируют в гетерокарионах синтез ДНК в ядрах покоящихся фибробластов линии NIH ЗТЗ // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1991.-№ 9.-С. 298-301.

18.Сетков Н.А., Казаков В.Н. Гепатоциты, стимулированные к пролиферации in vivo, индуцируют синтез ДНК в ядрах покоящихся фибробластов в гетерокарионах // Докл. АН СССР.-1992.-Т. 323, № 1.-С. 162-164.

19.Setkov N.A., Kazakov V.N., Rosenwald I.B., Makarova G.P., Epifanova O.I. Protein synthesis inhibitors, like growth factors, may render resting 3T3 cells

competent for DNA synthesis: a radioautographic and cell fusion study // Cell ProIif.-1992.-V. 25.-P. 181-191.

20.Сетков H.A., Казаков B.H. Влияние апротинина на синтез ДНК в ядрах гетерокарионов, полученных при слиянии покоящихся и стимулированных клеток линии NIH ЗТЗ // Докл. АН СССР,-1993.-Т. 333, № З.-С. 398-401.

21.Rosenwald I.B., Setkov N.A., Epifanova O.I. Induction of immediate early genes and cell growth by protein synthesis inhibitors // Europ. J. Cell Biol.-1993,-V. 61 (Suppl. 38).-P. 18

22.Сетков H.A. Апротинин тормозит действие циклогексимида на синтез ДНК в ядрах гетерокарионов, полученных при слиянии покоящихся и стимулированных клеток линии NIH ЗТЗ // Докл. АН СССР.-1994.-Т. 339, № 2.-С. 269-271.

23.Rosenwald I.B., Setkov N.A., Epifanova O.I. Induction of cell cycle events by growth factors and protein synthesis inhibitors / Abstr. of the IV-th European Cell Biology Congress, Prague, 1994 // Cell Biol. Intern.-1994.-V. 19, N 5.-P. 578.

24.Сетков H.A. Ингибитор протеинфосфатаз типа 1 и 2А - окадаевая кислота - стимулирует синтез ДНК в покоящихся клетках линии NIH ЗТЗ // Докл. AH СССР.-1995.-Т. 340, № 1.-С. 114-118.

25.Rosenwald I.B., Setkov N.A., Epifanova O.I. Induction of cell cycle events by PDGF and protein synthesis inhibitors /Abstr of the XX-th Meeting of the European Study Group for Cell Proliferation, London, 1995// Cell Prolif.-1995.-V. 28.-P. 183.

26.Rosenwald I.B., Setkov N.A., Kazakov V.N., Chen J.-J., Ryazanov A.G., London I.M., Epifanova O.I. Transient inhibition of protein synthesis induces expression of proto-oncogenes and stimulates resting cells to enter the cell cycle // Cell Prolif.-1995.-V. 28.-P. 631-644.

27.Сетков H.A. Негативный контроль пролиферации зависит от биосинтеза белка в покоящихся клетках // Докл. РАН.-1996.-Т. 346, № 5.-С. 708-711.

28.Сетков II.A., Казаков В.Н. Синтез ДНК в гетеродикарионах, полученных при слиянии длительно стимулированных клеток линии NIH ЗТЗ с кратковреммено стимулированными клетками // Цитолошя.-1996.-Т. 38, № З.-С. 336-345.

29.Сетков Н.А. Ингибиторы биосинтеза белка стимулируют синтез ДНК в покоящихся клетках линии NIH ЗТЗ // Докл. РАН.-1996.-Т. 347, № 4.-С. 552-555.

30.Сетков Н.А. Влияние ингибиторов внутриклеточных протеаз на синтез ДНК в фибробластах мыши линии NIH ЗТЗ // Цитология.-1997.-Т. 39, № 4/5.-С. 305-319.

31.Сетков Н.А. Ингибиторы лизосомных цистеиновых протеаз могут коммитировать покоящиеся клетки линии NIH ЗТЗ в митотический цикл //Докл. РАН.-1997. Т. 454, № 3. С,- 405-408.

32. Setkov N.A., Epifanova O.I. Brief exposure of resting fibroblasts to okadaic

acid stimulates DNA synthesis // Cell Prolif.-1997.-V. 30, N l.-P. 7-21.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сетков, Николай Александрович, Красноярск

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

а правах рукописи

СЕТКОВ Николай Александрович

НЕГАТИВНЫЙ ЭНДОГЕННЫЙ КОНТРОЛЬ ПРОЛИФЕРАЦИИ

КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ

03.00.25 - клеточная биология 03.00.02 -биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Красноярск - 1997

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение.................................................................................................................................................................................1

Глава I. Обзор литературы..................................................................................................................................................................................................7

1. Пролиферирующие и покоящиеся клетки. Клеточный цикл

и периоды покоя (история вопроса)..............................................................................................................................7

2. Состояние покоя как особое физиологическое состояние клетки......................................................................................................................................................................................................................................................................................10

3. Уровни регуляции размножения клеток........................................................................................................15

4. Косвенные данные о наличии эндогенного механизма регуляции размножения клеток.................................................1..................................................................16

5. Реактивация ядер покоящихся клеток. Позитивный тип эндогенного контроля размножения клеток......................................................................................18

6. Негативный тип эндогенного контроля размножения клеток........................................................................................................................................................................................................................................................................................................21

7. Экзогенная негативная регуляции................................................................................................23

8. Ингибиторы гемопоэтических стволовых клеток............................................................30

9. Подавление пролиферации клеток в плотных культурах (ингибиторы, связанные с клеточной поверхностью)........................................32

10. Аутокринный механизм подавления пролиферации клеток........................................................................................................................................................................................................................................................................................................37

11. Гены и их продукты, экспрессирующиеся селективно в покоящихся клетках............................................................................................................................................................................................................41

12. Трансформированные клетки и негативный контроль пролиферации............................................................................................................................................................................................................................................43

13. Дифференцировка клеток и прекращение пролиферации... 45

14. Потеря стареющими клетками пролиферативного потенциала и негативный контроль пролиферации.....................................................47

15. Гены и их продукты, обладающие антипролиферативной

и антиопухолевой активностью....................................................................................................................................................53

16. Протеинкиназы - регуляторы клеточного цикла........................................................80

17. О!-циклины, как факторы, лимитирующие скорость прохождения клеткой О ^-периода........................................................................................................................................................87

18. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (СБ1з)......................................................................89

19. Другие внутриклеточные ингибиторы..............................................................................................................99

20. Фосфорилирование/дефосфорилирование белков и негативный контроль пролиферации..............................................................................................................................................101

Глава II. Материал и методы исследования................................................................................................105

1. Характеристика объекта исследования..........................................................................................................105

2. Культивирование клеток......................................................................................................................................................................................106

3. Подготовка культуры клеток к опытам. Получение покоящихся и стимулированных клеток....................................................................................................................................109

4. Процедура слияния клеток..........................................................................................................................................................................109

5. Маркирование клеток с помощью изотопов......................................................................................110

6. Приготовление препаратов для радиоавтографического исследования..............................................................................................................................................................................................................................................................112

7. Идентификация слившихся клеток................................................................................................................................113

8. Эксперименты с факторами роста....................................................................................................................................115

9. Эксперименты с ингибиторами биосинтеза белка и РНК................117

Ю.Эксперименты с окадаевой кислотой......................................................................................................................117

11.Сбор клеток и измерение включившийся радиоактивности.........................................................................................................................................................................................................117

12. Норсерн-блот-анализ РНК........................................................................................................................................................................118

13. Анализ клеточного цикла с помощью метода проточной

цитоф луорометрии....................................................................................................................................................................................................................118

14. Слияние фибробластов и гепатоцитов............................................................................................................119

Глава III. Изучение характера эндогенного контроля пролиферации клеток линии NIH ЗТЗ в культуре......................................123

1. Параметры роста культуры клеток линии NIH ЗТЗ в различных условиях культивирования. Пролиферация клеток

после переноса в среду с низким содержанием сыворотки... 123

2. Слияние покоящихся клеток с клетками, стимулированными к пролиферации: ядра стимулированных клеток в гетеродикарионах с покоящимися клетками не вступают в S-период..........................................................................................................................................................................................................................................................................125

3. Синтез ДНК в гетеротрикарионах........................................................................................................................................138

Глава VI. Углубление клеток в состояние покоя....................................................................141

Глава V. Изучение механизмов, контролирующих пролиферацию клеток, с помощью ингибиторов биосинтеза белка........................................................................................................................................................................................................................................................................149

Глава VI. Экспрессия генов раннего пролиферативного ответа (протоонкогенов) под влиянием факторов роста и ингибиторов биосинтеза белка......................................................................180

Глава VII. Синтез ДНК в гетеродикарионах, полученных при слиянии длительно стимулированных клеток с кратковременно стимулированными клетками......................................192

Глава VIII. Синтез ДНК в гетеродикарионах в различных

условиях культивирования клеток..........................................................................................................207

Глава IX. Роль процессов дефосфорилирования в регуляции перехода клеток в состояние пролиферативного покоя и в поддержании этого состояния..........................................................................213

1. Фосфорилирование - дефосфорилирование белков как единый биохимический принцип, лежащий в основе регу-ляторных механизмов....................................................................................................................................................................................................213

2. Протеинфосфатаза 2А (РР2А) и ее функции в клетке..........................215

3. Окадаевая кислота и ее биологические эффекты....................................................218

4. Влияние окадаевой кислоты на пролиферацию клеток линии NIH ЗТЗ......................................................................................................................................................................................................................................................220

Глава X. Роль протеаз и активного протеолиза в регуляции размножения эукариотических клеток........................................................235

1. Влияние ингибиторов сериновых протеаз на пролиферацию клеток линии NIH ЗТЗ........................................................................................................................................................................239

2. Влияние ингибиторов лизосомных цистеиновых протеаз

на пролиферацию клеток линии NIH ЗТЗ..............................................................................................250

3. Другие лизосомотропные агенты 259

4. Влияние ингибиторов нелизосомных Са2+-зависимых ней-

тральных протеаз на пролиферацию клеток линии ШН

ЗТЗ........................................................................................................................................................................................................................................................................................................261

Глава XI. Изучение эндогенного контроля в дифференцированных клетках............................................................................................................................................................................................................269

Белки - негативные регуляторы - возможные кандидаты

на роль эндогенного ингибитора пролиферации..............................289

Заключение...............................................................................................................................................................292

Основные результаты..............................................................................................................................................................................................................295

Выводы..................................................................................................................................................................................................................................................................................................................298

Литература............................................................................................................................................................................................................................................................................................301

ВВЕДЕНИЕ

"Значение проблемы клеточного деления настолько ясно, что, говоря о ней, невозможно избежать банальностей."

Д.Мэзия

Реальные клеточные системы - органы и ткани - образованы клетками, различающимися по темпу пролиферации. Многие нормальные ткани содержат значительную по размерам фракцию неразмножающихся клеток. Клетки, не участвующие в общем пролиферативном процессе, были обнаружены и в более простых, чем ткани, клеточных системах - культурах клеток. Поскольку в начале 60-х годов появились данные о том, что клетки, не участвующие в активной пролиферации всей популяци, задерживаются в митотическом цикле до начала Б-периода возникла идея пролиферативного покоя как специфического физиологического состояния клетки (Ьа^Ьа еЬ а1., 1962; Ьа^Ьа, 1963; Ваэе^а, 1968; Ер1£апоуа, ТегзЫкЪ, 1968; 1969). Согласно существующим в настоящее время представлениям, жизненный цикл клетки включает в себя как период активной пролиферации, так и периоды пролиферативного покоя (периоды выхода клеток из митотического цикла).

Переход клеток в состояние покоя означает неограниченное во времени прекращение пролиферативной активности клеток при полном сохранении ими способности к делению.

Важнейшее свойство состояния покоя - его обратимость. Под влиянием соответствующего стимула покоящиеся клетки могут вновь вернуться в митотический цикл. Обратимость состояния покоя позволила Епифановой и Терских (1968) постулировать, что в основе регуляции размножения клеток лежит периодическое чередование в жизненном цикле клетки состояний покоя и активной пролиферации. Тем самым была поставлена задача выяснения механизмов, контролирующих смену этих состояний. С тех пор сравнительно более или менее хорошо были изучены процессы, обеспечивающие прохождение клеткой разных периодов митотического цикла, а также

пусковые события, включающие переход покоящейся клетки в цикл, события, протекающие в течение пререпликативного периода. В то же время обратный процесс - переход клетки в состояние покоя, а также процесс поддержания этого состояния в течение неопределенно длительного времени до сих пор остаются с биохимической точки зрения мало понятными событиями в жизненном цикле клетки.

Общая закономерность, выявленная при изучении размножения клеток в культуре, состоит в том, что нормальные диплоидные клетки, а также клетки многих постоянных линий размножаются только при добавлении к питательной среде сыворотки крови или специальных веществ полипептидной природы - факторов роста. В отсутствие в питательной среде таких экзогенных стимуляторов пролиферации клетки переходят в состояние про-лиферативного покоя. Более того, нормальные клетки и клетки ряда минимально трансформированных линий всегда отвечают на субоптимальные условия роста переходом в состояние покоя (Баркан, Никольский, 1985). Согласно ранним представлениям в культурах с субоптимальными условиями роста происходит общее угнетение метаболизма клеток, что естественно сказывается на их пролиферативной активности. Однако подробный сравнительный анализ метаболизма покоящихся и пролиферирующих клеток, проведенный Епифановой (Ер1£апоуа, 1977; 1979; Епифанова и др., 1982), показал, что состояние пролиферативного покоя характеризуется не только снижением общего метаболизма клеток, но и избирательной активацией в них отдельных метаболических процессов. Было сформулировано представление об избирательной активности метаболических процессов как необходимом условии существования покоящихся клеток. Состояние покоя стало рассматриваться не как проявление общего угнетения клеточного метаболизма, а как особое активное физиологическое состояние клетки. Усиление определенных метаболических процессов в покоящихся клетках (обновление долгоживущих макромолекул, активация ферментов катаболизма и т.д.) направлено, главным образом, на выживание клеток и на супрессию клеточного роста с целью предотвращения его несбалансированности в условиях

прекращения деления клеток (Епифанова и др., 1982). В последующем накопление данных о регуляции размножения клеток в культуре привело к возникновению представлений о функционировании в них системы внутриклеточного (эндогенного) контроля пролиферации. Переход клеток в состояние покоя стал рассматриваться как результат функционирования эндогенной системы контроля пролиферации.

В настоящее время регуляцию размножения клеток в целом рассматривают на двух основных уровнях ее организации - экзогенном (внешнем по отношению к клетке) и эндогенном (внутриклеточном). В некоторых случаях такое разделение контролирующих пролиферацию механизмов на два уровня регуляции оказывается не совсем правомочным, поскольку клетки могут образовывать и выделять в среду регуляторные вещества, воздействующие на сами клетки продуценты, - аутокринная регуляция. В случае гетерогенных клеточных систем можно говорить о паракринной регуляции. Усложняет общую картину и взаимодействие клеток через межклеточные контакты, изменяющее их пролиферативную активность. При этом сигналы, генерируемые во всех регуляторных звеньях, могут быть как позитивные (стимулирующие пролиферацию), так и негативные (подавляющие пролиферацию).

Основной задачей работы является рассмотрение всех звеньев эндогенной регуляции негативного типа, обеспечивающей возникновение и поддержание состояния пролиферативного покоя.

Вопросы, возникающие при анализе механизмов, контролирующих

деление клеток в культуре

В общей проблеме изучения механизмов, контролирующих пролиферацию клеток, один из центральных вопросов заключается в выяснении характера внутриклеточных сигналов, определяющих смену состояний покоя и пролиферации в жизненном цикле клетки.

Теоретически можно допустить следующие варианты эндогенного контроля перехода клеток в состояние покоя:

1. Позитивный тип контроля, при котором в размножающихся клетках имеются факторы, стимулирующие пролиферативные процессы. При этом переход клетки в состояние покоя вызывается прекращением синтеза и истощением эндогенных стимуляторов, или же отсутствием их полного набора.

2. Негативный тип контроля, когда в определенный момент цикла в клетке активируются метаболические процессы, приводящие к появлению эндогенного ингибитора (ингибиторов), препятствующего переходу клетки в очередной этап цикла. При негативном типе эндогенного контроля вступление покоящейся клетки в цикл должно регулироваться снижением концентрации внутриклеточного ингибитора, а не появлением стимулятора пролиферации. Негативный тип контроля может носить: а) специфический характер, когда ингибитор действует на сторого определенный процесс; в этом случае ингибитор может заранее синтезироваться на каком-то этапе клеточного цикла, но действие его проявится только тогда, когда будет протекать чувствительный к нему процесс подготовки клетки к делению; б) неспецифический характер, когда ингибитор, появившись в момент перехода клетки в состояние покоя, блокирует любые процессы, связанные с подготовкой клетки к синтезу ДНК.

Переход клетки в состояние покоя после завершения митоза (Од-состояние), а также блок пролиферации в Ох-, Сг2~ и Даже Б-периодах и, наконец, многопричинность этого состояния (повышение плотности клеток, истощение компонентов среды или отсу

Информация о работе

Сетков, Николай Александрович
доктора биологических наук
Красноярск, 1997
ВАК 03.00.25

Диссертация

Негативный эндогенный контроль пролиферации клеток в культуре - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы