Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Реактивация синтеза ДНК в ядрах непролиферирующих клеток в ответ на повышение внеклеточной концентрации ионов калия

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Реактивация синтеза ДНК в ядрах непролиферирующих клеток в ответ на повышение внеклеточной концентрации ионов калия"

од

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМЕНИ В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

УДК 577.2' 3 : 577.2.04 576.312.6:576.3

ФЕДОРОВ Юрий Валентинович

РЕАКТИВАЦИЯ СИНТЕЗА ДНК В ЯДРАХ НЕПРОЛИФЕ)РИРУЮЩИХ КЛЕТОК В ОТВЕТ НА ПОВЫШЕНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ КАЛИЯ

03.00.03 — Молекулярная биология 03.00.25 — Клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1994

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта Российской Академии Наук.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. В. Зеленин, кандидат биологических наук Е. Е. Егоров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук В. В. Терских, доктор биологических наук Е. С. Надеждина.

Ведущая организация — Институт вирусологии РАМН.

Защита состоится « / (. » . . . . 1994 г.

в « ./.(■ » часов на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии РАН.

Автореферат разослан « ,<Г. » . 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

фицын

обоая характеристика'работы.

1К1МаЫИ2С1Ь_0ЕйСД(ши •

Регуляция пролиферации клеток является одной из важнейших 1роблем в современной биологии. В то время как размножение )дноклеточных организмов напрямую зависит от доступности 1итательных факторов среды . клетки многоклеточных организмов а, в частности, млекопитающих, вовлечены в сложную, много-<омпонентную систему контроля¿роста. Управление пролиферацией осуществляется п основной не прямо, питательными факторами, а опосредованно - растворимыми стимуляторами и ингибиторами роста, а также фактораии микроокружения: мембранами соседних «леток, компонентами внеклеточного матрикса (гликозамино-г.ликаны л др.). Необходимо отметить, что многие, если не все, регуляторы пролиферации проявляют функциональную двунаправ-ленность. Гак, показано, что EOF,bFGF,TGF-fi могут выступать в зависимости от типа клеток либо как стимуляторы, либо как ингибиторы пролиферации iKaaata et al., I9ü6: Schviegerer et ai. ,lSS7;l£friot2,l991). Все это в значительной мере затрудняет понииание оошея картины регуляции пролиферации клеток многоклеточных организмов.

Не так давно было показано, что способностьа подавлять рост клеток и in vitro и in vivo обладает такие компоненты внеклеточного матрикса, как гепарансульфат и его структурный и функциональный аналог гепарин iCastellot et al.,1967; Vlscher «. Buddecke ,1991).

Для нормалышх клеток многоклеточных организмов характерна способность переводить в состояние пролиферативного покоя tЕпифанова, 19аз!. Культивируемые клетки могут находиться в состоянии покоя продолжительное время не размножаясь, но оставаясь яизнеспособныии. Такие клетки готовы перейти к пролиферации под действием адекватного стимула.

In vitro прекращение размножения клеток ыогно наблюдать при их лмффэррншфрвке, при отсутствии в среде культивирования факторов роста, при действии на клетки ингибиторов пролиферации (в частности таких компонентов внеклеточного матрикса, как гепарин и г°п-лрансульфат i, при достижении высокой плотности монослоя клеток г. культуре и в некоторых других случаях, in

- 4i -

vivo в состоянии покоя могут находиться как дифференцированные, так и не дифференцированные клетки. Причем дифференниров-ка очень часто связана с прекравдэнием пролиферации, хотя не всегда - с необратимым.

Переход клеток в непролифер^руюшее состояние обычнс сопровождается значительным у&еличекием трансыембранногс потениила (Blngelll ь Weinstein,1906>. Однако не ясно, является ли подобное повышение трднсмензранного потенциал« необходимым для подавления пролиферации клеток. Одним и: способов ответа на этот вопрос являете?, искусственна.' деполяризация плазмалеммы и последующе« исследована пролиферапюнои активности клеток.

Ранее, в экспериментах на нейронах спинного мозга птиц на лимфоцитах периферической крови человека было показано, чт эти дифференцированные клетки могут выходить из состояни пролиферативного покоя под действием агентов , деполяриэуюши клеточную мембрану. Одним из наиболее удобных в работ деполяризующих факторов является попцшепие внеклеточно концентрации ионов калия. Нам представилось интереснь исследовать возможное воздействие подобного поиышзну внеклеточной концентрации ионов калия на клетки •,, пролиферащ которых подавлена в результате терми.чг.яьноя дчффзрзнцировю или при достижении высокой плотности монослоя, а> также ni деиствиии ингибиторов пролиферации.

li£3b..H-235a3a..BaQöIU•

Целью данной работы было исследование влияния кратковременно! повышения внеклеточной концентрации ионов калия на клетк пролиферация которых подавлена: а) в результате терминалы! дифференцировки: б) при достижении высокой плотности моносло в) под влиянием ингибитора пролиферации - гепарина. При эт ставились следующие задачи:

1. Выяснить, возможна ли реактивация синтеза ДНК з клетка пролиферация которых подавлена в результате достижения высок плотности монослоя, при повышении внеклеточной концентра1 ионов калия.

2. Сравнить различные дифференцированные клетки по » способности к реактивации синтеза ДНК в ответ на повыше» внеклеточной концентрации ионов калия.

3. Исследовать закономерности подавления пролиферации клеток под действием гепарина.

4. Выяснить, возможна-Jfa реактиваций синтеза ДНК в ядрах клеток,пролиферация которых подавлена под действием гепарина fe ответ на повышение внеклеточной концентрации ионов калия.

!18*зта_вваиааа_м_ак11!ааь1шс1ь_вайв1н-

Впервые проведено сравнительное исследование реактивации синтеза ДНК в ядрах различных непролиферируюших клеток ¡в ответ на кратковременное повышение внеклеточной концентраций ионов калия.

Показано, что кратковременное повышение концентрации ионов калия приводит к реактивации синтеза ДНК в клетках , находящихся в состоянии контактного торможения. Показано так же, что подобная реактивация возможна в ядрах терминально дифференцированных in vivo нейронов спинальных ганглиев мыши и з ядрах шотуб, сформированных при дифференцировке In vitro крысиных ыиобластов линии L6.

Проанализировано влияние гепарина на пролиферации клеток различных культур. Показано сходство механизмов, осуществляющих подавление пролиферации клеток при действии на них гепарина и при высокой плотности клеток в культуре.

йвваАаиаа-в&йвхи-

Материалы диссертации были представлены на совещании "Биология клетки в культуре"!Санкт-Петербург, 1992), а также на конкурсе научных работ ИМБ РАН 11994).

С1взг!шве_ди££ев12шзи •

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. В списке литературы /fZ. наименования, из них /fZ иностранных источника. Работа содержит /оg страниц, включая уд рисунков и «¡""таблиц.

ЭФЧ - эмбриональные фибробласты человека ГМАК - гладкоыышечные клетки аорты крысы

- б -

катериалы н методу-

БШКИ*

Макрофаги получали из перитонеальной полости »ышея линии СБА без предварительной стимуляции. Перитонеальную полость двухмесячных самок мышей промывали холодным пастворо*

Хэнкса с гепарином I 50 ед/мл > и полученную суспензию клето* разливали по чашкам Петри. Через час препараты промывали, удаляя неприкрепившиеся клетки. Через сутки препарать обрабатывали в течение часа растворов трипсина I 0.25Х, 37°С), снимая таким образом все клетки, кране макрофагов, обладавши) высокой трипсинрезистентностыо. Через сутки после трипсиновор обработки макрофаги использовали в экспериментах.

Для получения культур клеток спинальных ганглиев мыши, обогащенных нейронами, использовали эмориока 16-20 дня развития или новорожденных мышей 11-7 суток) линии СБА.

Умерщвление животного проводили путои декапитации. Затем ; животного извлекался позвоночник и помешался п холодный (+4°С раствор Хэнкса содержавший по 1000 ед/мл пенициллина 1 стрептомицина. После снятия кожного покрова, и мышц с поаош&] пинцетов, глазными ножницами производили два параллельны: продольных надреза по всей длине позвоночника на еп дорзальноа стороне, открывая таким образом доступ к спинном мозгу. Спинноя мозг удаляли вместе с оболочками. Гангли извлекали с помощью часовах пинцетов с игольчатыми браншами помешали в холодный раствор Хэнкса . Затем ганглии переносил в чашки Петри с нанесенными на дно царапинами, заливал раствором трипсина 10,25* на фосфатном буфере РМ16) инкубировали 15-20 минут при 37° С. Действие трипсин останавливали введением сыворотки 120%>, после чего раство трипсина аккуратно отсасывали. При этом ганглии оставались я сетке царапин на дне чашки Петри.

Диссоциацию клеток проводили в среде культивирования содержавшей 101 сыворотки, с помощью пипетирования вначал через стеклянную пипетку объемом 5мл, затем - объемом 2мл Остатки соединительнотканных капсул ганглиев и нерво задерживались на сетке царапин на дне чашки Петри .

После прединкубации суспензию клеток разливали

- г -

мастиковые 25-ячеечные платы с покровными стеклами 116x1 в JM), предварительно обработанными полилизином i лоли-Ш.-лизии, Serva). Клетки спинальных ганглиев инкубировали в течение :уток в среде культивирования с юх сыворотки при 37°С в атмосфере, содержавшей 5* С<^ , и затем использовали в экспериментах.

Эмбриональные липлэидные фибробласты человека были любезно предоставлены нам ВЛ.Кухаренко li Институт генетики человека, АМНРI. В работе использовались клетки как ранних пассажей (10-20 пассая), так и поздних (45-50 пассаж).

■ Фибробласты мыши ЗТЭ Swiss аы получили от доктора Н.Ф.Салливана (Dr. N.F.Salllvan, Imperial Cancer Research Fund, United Kingdom). Это иммортализованная линия незлокачественных клеток, которые способны переходить в покоя в условиях сывороточного голодания и обладает контактный торможением пролиферации.

Гладкомышечгые клетки аорты крыс были предоставлены О.Ю.Принцевоп < ВКНЦ АМНР). Эта иммортализованная линия незлокачественных клеток была получена из1 стенки аооты крысы линии Вистар .

Миобласты крысы линии L6 получены от ¡^И.Фридляндскоя (Институт цитологии РАН). Зто способные к дифференцировке клетки кимортальной культуры, которые были в свое вреия изолированы при длительном культивировании In vitro клеток скелетных мышц крысы (Yafre,l960l.

Клетки ниелоыоноцитарноя лейкемии человека HL60 были получены из Коллекции клеточных культур США (American Туре Culture Collection).

Клетки линий Ei (карцинома мочевого пузыря человека) и RD tрабдомиосаркома человека), обладающие высокозлокачественным фенотипом, были предоставлены М.А.Родовой (ИМБ РАН).

Клетки 5V3T3 (фибробласты мыши Balb/сЗТЗ, трансформированные вирусом SV401 мы получили от П.М.Чумакова (ИМБ РАН). Это злокачественные клетки, не способные переходить в покой ни при отсутствии сыворотки в ростовой среде, ни при высокой плотности монослоя.

В работе мы также использовали L-клетки клона L929, полученные в свое время из лаборатории Г.П.Георгиева (ИМБ

РАН,). Это мышиные злокачественные фкбробдастоподоб"уе клетки, выделенные из индуцированных метилхолантреноы опухолей мышей линии, СЗН.

Cesassub.

В экспериментах по исследовании влияния гепарина на пролиферацию клеток нгцм бцли использованы раствор гепарина (неопределенного молекулярного веса1. с активностью 5000 ед/мл 1 Московский эндокринный завод ) и раствор адакци:: гепарина с Mr кЛа, активностью 25000 ед/мл tFra^min, Lafcoratolres Fournler s.a. .France>. в большинстве случаьв- ¡слетки инкубировали в ростовой среде, содержавшей 500 ед/мл гепарина. tSBaiMEBüueuiiQg-BüRtícüHMe.BHSKaeioHUQQ.

Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия осуществляли путем инкубации клеток в соответствугиих рабочих растворах. Рабочие растворы представляли собой либо стандартный фосфатно-солевоя буфер 0,01Ы рН7,2 без двухвалентных катионов с увеличенной концентрацией ионов калия (от 10 до 200 мМ К* , в большинстве экспериментов - 50 мМ К* . Это увеличение обеспечивалось либо путем добавления соответствующего количества хлорида калия (рабочие растворы для обработки по первой схеме), либо путем замещения должного количества хлорида натрия на хлорид калия (рабочие растворы для обработки по второй схеме)).

Обработку клеток рабочими растворами проводили по двум схемам. По первой схеме культуры клеток обрабатывали рабочими растворами пять раз по семь минут при комнатной температуре. Между обработками ■ клетки инкубировали в течение 5 минут в ростовой среде в тех же условиях . По второй схеме клетки инкубировали в рабочих растворах в течение 2 часов . В этом случае в растворы добавляли сыворотку (ЮЖ>. Инкубацию проводили при 37°С в СО.^-инкубаторе. После окончания обработки клетки переводили в ростовую среду .

В контрольных экспериментах клетки обрабатывали либо 0,01М фосфатно-солевым буфером рН7,2 с нормальным содержанием ионов калия (5,5мМ), либо 0,01М фосфатно-солевым буфером Дульбекко рН 7,2 так же с нормальным содержанием К.+ .

Иэхзение_сав18аа_да-

Пролиферативная активность клеток оценивалась по наличию синтеза ДНК в их ядрах, который определялся благодаря включению 3Н-тимидина (удельная активность 2,5 Ки/мМ>. Для продолжительного печения 124 часа) использовали среды.

Л

содержавшие Н-тимидин с активностью 0,5 мкКи/мл, для импульсного tl час 1 - 5 мкКи/мл.

По завершении инкубации с радиоактивным предшественником клетки промывали средой без сыворотки и фиксировали. В большинстве случаев фиксацию проводили 96* этанолом в течение 10 минут. Культуры клеток спинальных ганглиев мыши фиксировали спесью этанол-ацетон (1:1), подвергали иммуноцитохимическоя обработке и затем осуществляли авторадиографию.

Препараты окрашивали красителем Гимза (Merck) (кроме препаратов клеток спинальных ганглиев мыши). Просмотр препаратов осуществляли на микроскопе Leitz Orthomt. ЬшгшшнвЗЕШиал

Идентификацию нейронов на препаратах культур клеток спинальных ганглиев мыши осуществляли как по морфологическому, так и по иммуноцитохимическому критериям. Выявление неярон-спецнфических антигенов проводили непрямым иымунопероксидазным методом.

Нами было использовано несколько препаратов антител полученных против специфических маркеров нейронов: кроличьи поликлональные антитела против неиронспецифическои енолаэы человека (Dakopats), мышиные моноклональные антитела против белков нейрофиламентов с Mr 160кДа (Ataersham) и Mr 68 кДа (НПО Биотехнология).

На препаратах подсчтывали процент ядер клеток , вступивших в фазу синтеза ДНК за время инкубации с 3Н-тимидином..

В экспериментах по исследованию действия гепарина на пролиферацию клеток определяли индекс подавления I*):

доля меченных клеток в опыте Ип" 1 1 ~ доля меченых клеток в контроле ' х 100%

Доверительные интервалы определяли по формуле: % /Р Я

Л - А/—

где д - интервал, в который с определенной вероятность» попадают все значения измеряемой величины,

г - уровень значимости 1использовали г»1,96, что соответствует вероятности 95й),

п - количество просчитанных клеток , р - доля меченых ядер 15), q - ЮО-р.

Н& графиках каждая временная точка соответствует не менее чем трем независимым опытам.

результаты исследовании

Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации

ионов калмя на синтез ДНК в адрьх клеток, пролиферация котормх подавлена вмсокоп плотностью кокослоя.

Пролиферацию, клеток культур эмбриональных диплоидных фибробластов человека и фибробластов мыши ЗТЗ исследовали при различных плотностях монослоя . Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия в случае плотных культур клеток, пролиферация которых подавлена по сравнению с разреженными культурами, вызывает значительное увеличение доли клеток, синтезирующих ДНК (Рис.1). По абсолютному значению эта доля практически равна таковой в случае разреженных культур . Данный эффект наблюдается не ранее чем через 12 часов после инкубации клеток в условиях повышенной внеклеточной концентрации ионов калия IРис.2).

Была исследована также зависимость реактивации синтеза ДНК в ядрах клеток от значения внеклеточной концентрации ионов калия . Обнаружено, что в случае плотных культур фибробластов человека эффект появляется уже при концентрации ионов ^ 12мМ и дальнейшее возрастание концентрации вплоть до 200 мм на него не влияет.

доля печеных клеток (*) * *

□ - еэ-жозтрсль спит

Рис.1 Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия на пролиферацию эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ) и фибробластов мыши ЗТЗ.

В случае фибробластов мыши ЗТЗ эффект постепенно нарастает с увеличением концентрации от 12 до 50 мМ и не изменяется при дальнешеы ее увеличении до 200 мм .

Использование рабочих растворов с увеличенной концентрацией ионов натрия (до 250 мМ1, а также отсутствие или наличие ионов кальция (1,5 им) и магния (1 мМ) в рабочих растворах не приводило к достоверному различию между контрольными и опытными препаратами г.о доле ДНК-синтеэируюших клеток.

Эффект кратковреиенного повышения внеклеточной концентрации ионов калия зависит от наличия в среде сыворотки. Плотные культуры фибробластов человека и мыши теряют способность отвечать на подобное воздействие увеличением "доли синтезирующих ДНК клеток уже через 1 час после отмыва сыворотки. Клетки, плотных культур, в течение 3 суток инкубированные в среде с низким содержанием сыворотки (0,2X1, приобретают способность реагировать на кратковреиенное повышение внеклеточной концентрации ионов калия только через 6 часов после введения нормального количества сыворотки (10*1 в ростовую среду .

Как следует из полученных нами данных плотные культуры фибробластов человека, находящихся на ранних (14-19) и поздних (46-46) пассажах, не различаются по способности отвечать синтезом ДНК на кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия (Рис.3).

доля меченых клеток {%)

_____т

A dm яйн „л™ 1

4 в а и» а

ВРЕМЯ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ (ч)'

Рис.2 Динамика изменения количества ДНК-синтеэируюшнх клеток в культурах фибробластов мыши ЗТЗ Swiss после кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия.

В опытах на культурах с низкой плотностью и на культурах клеток, пролиферация которых не зависит от плотности монослоя /клетки линий 1929 и ЭУЗТЗ >, нами было обнаружено,что кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия не оказывает влияния на пролиферативную активность клеток (Рис.1 ,ТабЛ ).

Таблица I

Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия на пролиферацию злокачественных клеток.

тип клеток доля меченых клеток (% > плотность культур клеток 1 клеток/мм2)

опыт контроль опыт контроль

L929 90-3,5 450-150 soo^oo

SV ЗТЗ 92-3,5 91-3 550-200 490±120

Обработку клеток рабочим и контрольным растворами проводили по первой схеме. 3Н-тимидин вводили в среду сразу после обработки. Клетки фиксировали через 24 часа после добавления н-тимидина.

ДОЛЯ МЕЧЕНЫХ клеток (%)

количество пюйдгнньн плссайей

Рис.3 Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия на пролиферацию эмбриональных фибробластов человека, прошедших разное количество пассажей.

Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации

ионов калия на дифференцированные клетки. 1. Нейроны спинальных ганглиев мыши.

Применение подходов, описанных выше в разделе "Материалы и методы", позволило получить первичную культуру клеток спинальных ганглиев мыши, обогащенную нейронами. Через 24 часа после посадки подобные культуры содержали до 65* нейронов (для сравнения - при упрощенной методике получения культур клеток спинальных ганглиев доля нейронов не превышала 40-50»). К этому сроку Ю-20х нейронов уже имели четко выраженные нейриты, которые позднее у некоторых клеток достигали значительной длины. Форма тела этих клеток обычно округлая, реле овальная, распластывание слабое. Крупные круглые ядра нейронов содержали обычно одно ядрышко.

Все морфологически определяемые нейроны в полученных нами культурах были позитивны по неиронспецифическои енолазе и белку нейрофиламентов Мг60 кДа. Однако, лишь 10* этих клеток окрашивалось антителами к белку нейрофиламентов Мг 160 кДа.

Кроме нейронов в культурах присутствовали глиальные клетки, фибробласты и шванровские клетки, которые по своей морфологии четко отличались от нейронов и в которых не выявлялись неиронспецифические маркеры.

При последующем культивировании доля нейронов в культурах резко падала за счет их гибели и пролиферации других клеток. К 72 часам после посадки культуры доля нейронов в ней составляла

от 10 до 50* . Выживаемость нейронов в культуре повышалась при добавлении среды, кондиционированной L-клетками, а также при наличие в ростовой среде фактора роста нервов (50 иг/мл).

Возраст мышей на качество культуры и скорость гибели (снижение удельной доли) нейронов влияния не оказывал. Сходные результаты были получены как в опыта:: с эмбрионами мышей (18-20 день развития), так и с новорожденными мышами (с 1 по 7 день после рождения).

Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия до SO мМ приводило в наших экспериментах к реактивации синтеза ДНК в ядрах терминально дифференцированных нейронов, позитивных по нейронспецифическои енолазе 12,5-6* меченых 3Н-тимидином клеток) и к белку некрофиламентов Мгбв кДа (2,6-5,5* меченых клеток) 1Таб.11,). Обе схемы обработки клеток растворами с высокой концентрацией ионов калия дали в экспериментах почти одинаковые результаты (Таб.П). В контрольных экспериментах подобный эффект не наблюдался.

Инкубация культур клеток спинальных ганглиев в присутствии ингибитора ДНК полимеразы-ct афидиколина (5 мкг/мл) в течение 24 часов после кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия приводила к полному подавлению реактивации синтеза ДНК. .

В ядрах нейронов позитивных' по белку нейрофилаиентов Мг1б0 кДа после обработки клеток растворами с высокой концентрацией ионов калия реактивации синтеза ДНК обнаружено не' было.

2. Миобласты крысы.

В экспериментах на миобластах крыс было показано .что обработка клеток растворами с высокой концентрацией ионов калия приводит к реактивации синтеза ДНК в 5* ядер в миотубах,сформированных миобластами при дифференцировке 1п vitro .В контрольных экспериментах подобный эффект не наблюдался.

3.Макрофаги и гранулоциты.

В отличие от нейронов спинальных . ганглиев мыши и дифференцированных миобластов крысы перитонеальные макрофаги мыши не реагировали на кратковременное повышение внеклеточнор

з

концентрации ионов калия. Доля меченых Н-тимидином ядер эти>

клеток в опыте не превышала таковую в контроле (Таб.III. Сходные данные были получены нами и з экспериментах с дифференцированными in vitro клетками миеломоноцитарнои лейкемии человека HL60. Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия неспособно вызвать реактивацию синтез ДИК ни в ядрах макрофагоподобных, ни в ядрах гранулоиито-подобных клеток этой линии!Таб.11).

Таблица II

Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия на дифференцированные клетки.

N опыта тип клеток доля меченых клеток количество проанализированных клеток тип обработ

опыт контроль опыт контроль ки

1 Нейроны1 3 0 100 100 5x7 мин

2 Нейроны1 2,5 0 2с0 200 5x7 мин

3 Нейроны 7.5 0 200 100 120 мин

4 Нейроны2 2.5 0 200 200 120 ыин

5 Нейроны2 5,5 0 200 ' 200 120 мин

6 Нейроны' 0 0 100 100 120 мин

7 Нейроны5 0 0 150 100 120 мин

а Миотубы 5 0 200 200 120 мин

9 Ммотубы 5 0 200 200 120 мин

10 Макрофаги 0 0 200 200 120 мин

И Макрофаги 0 0 200 200 120 мин

12 |Ш.60-мак- 10 10 300 300 120 мин

13 рофаги 3 5 300 300 120 мин

14 hl60-rpa- 7 8 300 300 1 120 мин

]5 нулоциты 7 6 300 300 120 мин

1- окрашивание на неярон-специфическую енолазу

г- окрашивание на неирофилаыенты (63 кДа)

з- окрашивание на нейрофиламенты (160 кДа)

- ю -

Влияние гепарина на пролиферацшэ клеток lrt vitro.

В экспериментах по исследованию влияния гепарина на пролиферацию клеток было показано, что гепарин подавляет размножение клеток асинхронных культур нормальных эмбриональных фиОробластов человека, фибробластов мыши ЗТЗ Swiss, гладкомышечных клеток аорты крыс, а также синтез ДНК в их ядрах (TaO.III, IV •). Эффект гепарина зависит от его концентрации в среде (Таб.У).

Для того, чтобы выяснить в какой периоде клеточного цикла клетки подвержены ингибируюшвму действию гепарина,мы определяли пролиферативную активность клеток асинхронных культур в различные сроки после введения гепарина в среду культивирования. Достоверное подавление синтеза ДНК наблюдалось уже через 2 часа после введения гепарина. Кроме того, кривая, отражающая изменение индекса подавления имеет еше два подъема: через 6-ю часов и через 16-26 часов 1Рис.41. Исходя из этих данных, можно предположить, что изученные клетки обладают наибольшей чувствительностью к гепарину в Gl-периоде. Для более точной оценки точки клеточного цикла, чувствительной к гепарину, были предприняты эксперименты с клетками синхронизованных культур. Клетки переводили в состояние покоя, инкубируя в течение 3 суток в среде,

ТаблицаШ

Влияние инкубации в присутствии гепарина (300 ед/мл) на пролиферацию клеток.

1 тип I Время после введения гепарина*ч» | j j контроль опыт i

клеток 0 24 46 0 24 48

| ЭФЧ* 10,9 16,7 25,1 10,9 13,7 14,2

1 *« | ЗТЗ 16,5 30,6 47,0 16,5 22,3 22,2

1 ** | Г МАК 11 .6 32,6 101,3 U ,6 19,3 16,4

1 1 количество клеток на поле зрения |

Клетки на препаратах подсчитывали на микроскопе Nikon Dlaphot » - увеличение xlOO »» - увеличение х200

содержавшей 0,25» сыворотки. Затем клетки стимулировали к пролиферации, доводя содержание сыворотки в среде до ю», и использовали в работе.

Оказалось, что в этом случае существенны? подавляющий эффект- гепарина проявляется не позднее чем через и часов после стимуляции. При этом максимальная чувствительность клеток к гепарину наблюдалась в первые несколько часов после стимуляции и за 2-4 часа до начала синтеза ДНК .

Гепарин подавляет пролиферацию клеток обратимо. После 20-часовой инкубации клеток в присутствии гепарина (500 ед/мл) среду с гепарином меняли на свежую среду без гепарина, предварительно промыв препараты средой культивирования.

Для всех трех типов клеток характерно небольшое, но достоверное снижение индекса подавления через 4 часа после удаления гепарина, что говорит об остановке части клеток в позднем С1-периоде, за несколько часов до начала синтеза ДНК. Более значительное уменьшение значения индекса подавления в случае ГМЛК и клеток ЗТЗ наблюдалось через 0-10 часов (что соответствует остановке клеток в ранней И-периоде), а в случае ЭФЧ - через 14 часов после удаления гепарина (т.е., через время, сравнимое с временем, необходимым этим клеткам для Еыхода из состояния пролиферативного покоя).

. Таблица IV

Влияние гепарина на пролиферацию клеток асинхронных культур

1 тип | клеток | индекс подавления (x)

|эфч 94

¡ЗТЗ Swiss 65

¡гмак !

к 929 1

Jrd 1

1 iej 1 <1 |

Длительная инкубация , 172 часа) клеток в присутствии гепарина несколько изменяло кинетику реактивации синтеза ДНК. В случае ЭФЧ и Г МАК достоверное снижение индекса подавления приходилась на 16-20 часов после отмыва гепарина . В случае фибробластов мыши ЗТЭ существенное уменьшение индекса подавления наблюдалось уже через 1 час после удаления гепарина длительность инкубации в присутствии гепарина не вносила изменений в кинетику реактивации синтеза ДНК .

В наших экспериментах .мы обнаружили, что гепарин не только подавляет процессы предшествующие синтезу ДНК, но и препятствует вступлению клеток в митоз. В отдельной серии опытов нами было просчитано количество митозов в культурах клеток после удаления гепарина. В случае фибробластов человека наибольшее число митотических клеток наблюдали через 2 часа, а в случае гладкомышечных клеток аорты крыс - через 5 часов после удаления гепарина!Рис.6). В случае фибробластов мыши ЗТЗ изменений в количестве митотических клеток не наблюдали. Действие гепарина избирательно - он не влияет на пролиферация злокачественных клеток линия 1.929, Е,Ь ЙО (Табл.IV).

Таблица 1

Зависимость пролиферации клеток асинхронных культур от концентрации гепарина в среде культивирования.

| | концентрация гепарина в среде |

| и | культивирования (ед/мл) |

клеток 50 100 250 500

ЭФЧ 30 25 30 ' 60'

ЗТЗ 10 20 30 50

ГМАК 17 17 за 42

индекс подавления (*)

Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрат^ ионов калия на клетки .пролиферация которых подавлена по действием гепарина.

Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионе калия приводит к реактивации синтеза ДНК в ядр£ клеток,пролиферация которых подавлена под действием гепари-нг

индекс подавления (*>

э*ч~ эта" гелк

Рис.4 Подавление пролиферации клеток асинхронных культур ЭФЧ, ЗТЗ и ГМАК под влиянием гепарина .

индекс подавления (*)

-р- - -л- - -эфч зтз гмак

Рис.5 Динамика изменения индекса подавления после удаления гепарина из среды культивирования асинхронных культур, пролиферация клеток которых была подавлена под его влиянием.

Эти данные были получены в опытах с ЭФЧ, ГМАК и фибробластами мыши ЗТЗ. В контрольных экспериментах указанный эффект не наблюдался.

Для всех трех типов клеток характерно, что динамика снижения индекса подавления практически совпадает с таковой в случае удаления гепарина из среды культивирования IРис.7).

доля цитотических клеток (x)

Рис.6 Динамика изменения доли митотических клеток после удале ния гепарина из среды культивирования асинхронных культур, пролиферация клеток в которых была подавлена под его влиянием

Влияние гепарина на клетки, предъооработанние антителами к Фактору адгезивностм нейронов.

Поскольку клетки, прекратившие пролиферацию под действие! гепарина и в условиях высокой плотности монослоя, сходные образом (реактивацией синтеза ДНК) отвечают на кратковременно« повышение внеклеточной концентрации ионов калия, былс выдвинуто предположение о сходстве механизмов подавление пролиферации в этих случаях

Чтобы проверить данную гипотезу, были предприняв эксперименты с использованием кроличьих поликлональны^ антите; против фактора адгезивности нейронов (neural cell adhesloi .Bolecule, NCAM; сыворотка иммунизированного крысиным NCAl кролика;Chemlcon, USA). Ранее было показано, что контактно! торможение пролиферации в случае мышиных фибробласто! опосредовано именно NCAM. При двухчасовой прединкубацш

клеток в присутствии антител к NCAM эффект ингибировани: гепарином их пролиферации значительно снижался (Рис.8) Контрольные антитела (поликлональные кроличьи антитела i фактору чувствительности к сыворотке (pö7), предоставлен! доктором С.Г.Рувьер, Unlverslte de Montpellier, France ) таки действием не обладали.

- 21 -ИНДЕКС ПОДАВЛЕНИЯ (*>

МЧ ЭТЗ гилк

Рис.7 Влияние кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия на репликацию ДНК в клетках асинхронных культур, пролиферация которых подавлена под воздействием гепарина.

яндекс подавления (*)

вш _ си - са -пик этз ЭФЧ

Рис.8 Влияние антител к ПСАМ на подавление пролиферации клеток асинхронных культур гепарином.

1- инкубация в присутствии гепарина

2- пред<!инкубация с контрольными антителами

3- пред«инкубация с антителами к НСАМ

обсуждение

Результаты настоящей работы показали, что кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия, вызывает стимуляцию к пролиферации клеток, размножение которых подавлено в результате контактного торможения. Данный эффект зависит от концентрации К+ и от наличия сыворотки в среде

культивирования. Время, необходимое для запуска синтеза ДНК, i этом случае сравнимо с временем, необходимым клеткам покоящимся в результате сывороточного голодания, дл: вступления в 5-фазу клеточного цикла при стимулирования сывороткой. Известно, что для перехода в S-фазу клеточной цикла клеткам, утратившим пролиферативную активность i результате сывороточного голодания, нужны не только ростовьи факторы сыворотки, но и набор незаменимых аминокислот Временная точка, контролируемая присутствием этих аминокисло1 в случае клеток ЗТЗ расположена в середине пререпликативног< периода, за 6 часов до начала синтеза ДНК I Pardee, 1909). И: полученных нами данных следует, что покоящиеся в результат» сывороточного голодания, клетки плотных культур фибробласто) мыши ЗТЗ становятся чувствительными к кратковременном: повышению внеклеточной концентрации ионов калия через 6 часо! после стимуляции сывороткой, то есть именно в середин пререпликативного периода. Таким образом, вполне возможно, 4Ti реактивация • синтеза ДНК при кратковременном повышена внеклеточной концентрации ионов калия происходит при участи! механизма, связанного с транспортом аминокислот.

Однако, как следует из полученных нами данных длительность периода между кратковременным повышение внеклеточной концентрации ионов калия и началом синтеза ДН равняется примерно 12 часам, а не 6, как можно было б ожидать. Это указывает на возможность наличия и други механизмов действия кратковременного повышения внерлеточно концентрации ионов калия на клетки.

Зависимость эффекта кратковременного повышени внеклеточной концентрации ионов калия от наличия сыворотки среде культивирования позволяет предположить, что реактиваци синтеза ДНК может быть следствием промотирования деистви фактров роста на клетки, пролиферация которых подавлена результате контактного торможения. Это подтверждается тем что:- 1) совпадают длительности пререпликативных периодов пр стимуляции клеток к пролиферации кратковременным повышение внеклеточной концентрации ионов калия ib случае контактног торможения) и при стимуляции клеток сывороткой (в с луча состояния покоя в безсывороточной среде); 2) зффек

ратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов алия не наблюдается при отсутствии сыворотки и 3) при тарении m vitro чувствительность фибробластов человека к ыворотке и к кратковременному повышению внеклеточной онцентрации ионов калия снижается одновременно.

В серии экспериментов. посвященных исследованию ерминально дифференцированных клеток, было обнаружено, что ифференцирозанные клетки некоторых типов способны . к еактивации синтеза ДНК под действием кратковременного овышения внеклеточной концентрации ионов калия . Данный ффект имеет место в случае нейронов спинальных ганглиев мыши миотуб крысы, образованных миобластами скелетных мышц линии 6 при дифференцировке in vitro.

Однако, кратковременное повышение внеклеточной онцентрацми ионов калия действует подобным образом не на все ипы дифференцированных клеток: В ядрах макрофагов еритонеальной полости мыши а также в ядрах макрофагоподо'бных гранулоцитоподобных клеток, полученных при дифференцировке n vitro клеток миеломоноцитарной лейкемии человека HL60 озобнозления синтеза ДНК в данных условиях не обнаружено, аким образом, между дифференцированными клетками вероятно ушествует различие по механизму осуществления состояния ролиферативного покоя.

Каким образом кратковременное повышение внеклеточной онцентрации ионов калия действует на дифференцированные летки, пока не ясно. Наши результаты позволяют предположить, то в данном случае механизм реактивации синтеза ДНК может ыть сходным с механизмом стимуляции к пролиферации клеток, азмножение которых подавлено высокой плотность» (так как летки в обеих ситуациях одинаково отвечают на кратковременное овытение внеклеточной концентрации ионов калия Г.

Данные, полученные в результате нашей работы по сследованию гепарина, подтверждают обнаруженную ранее поссбность этого гликозаминогликана обратимо подавлять ролиферацию некоторых типов клеток (Castellot et al.,1967). увствительность клеток к гепарину видимо появляется в 1-периоде. Мы обнаружили, что в митотическом цикле клеток по раянея мере трех типов - ЭФЧ, .спонтанно трансформированных

фибробластов ' мыши ЗТЗ и ГМак,- существует несколько точек, прохождение которых контролируется гепарином. Одна из ни: расположена за несколько часов до начала синтеза ДНК. йт клеток 3J3 характерна также остановка непосредственно пере, началом S-фазы.Кроме того, часть клеток ЗТЗ и ГМА1 останавливаются в раннем G1-периоде. Мы обнаружили также, 4Ti часть клеток в культурах ЭФЧ и ГМАК под действием гепарин; останавливаются не только в Gi- но и в С2-периоде. Обобша р-'зультаты наших экспериментов по исследованию действи гепарина на пролиферацию клеток In vitro мы можем сказать, чт в ыитотическом цикле таких клеток, как фибробласты человека гладкоыышечные клетки аорты крыс существует три точки контролируемые гепарином: 3) в раннем пререпликатиено периоде; 2) в позднем Gl-периоде; 3) в С2-периоде. Дл фибробластов мыш ЗТЗ характерна остановка в точках 1 и 2, также непосредственно перед началом s-фазы - то-есть только G1-периоде клеточного цикла. Таким образом, наши данны позволяют -говорить о множественности точек контрол прохождения клеточного цикла .

Механизм действия гепарина пока не ясен. Известно, что с способен связываться с некоторыми факторами роста и, частности с PDGF (Surges, Mac lag, 19(59i. Некоторые авто[ полагают, что именно благодаря этому гепарин подавляе пролиферацию клеток (Fager et а1.,19дб). Однако, покоящимся результате недостатка ростовых факторов клеткам PDCF необход1 лишь в течение короткого времени (60 мин) в нача.1 пререпликативного периода (Pardee,1909). Гепарин препятствует вступлению клеток в S-фазу будучи введен в cpej 'значительно позднее - вплоть до 11 часов после стимуляш клеток сывороткой. Более того, известно, что для пррхожден! клетками ЗТЗ последних двух часов пререпликативного перио, вообще не требуется присутствие факторов роста (Pardee,1969 Тем не менее, гепарин ингибирует запуск синтеза ДНК в эт клетках, будучи добавлен всего за 1 чаг до начала S-фазы ( часов после стимуляции сывороткой, ИП=65*). Таким образо механизм действия гепарина видимо не зависит от е способности связывать факторы роста.

Как следует из полученных нами данных, кратковременн

повыше:::^ внеклеточной концентрации ионов калия приводит к реактивации синтеза ЛНК в ядрах клеток, пролиферация которых блокирована под действием гепарина. Это позволяет предположить, что механизмы остановки пролиферации под действием гепарина и при контактном торможении вероятно сходны, так как клетки в обеих ситуациях одинаково отвечают на воздействие высокой концентрации ионов калия.

Иаия была предпринята попытка прямой проверки этой гипотезы. Нэд&вно было обнаружено, что в осуществлении контактного торчожения пролифер&ции фибробластов человека и иаши возлетны поверхностные гликопротеины (УЛеэег ег а1., 1965; Аок1 ег а1.,1990). Одним из наиболее вероятных /частников процессов подавления размножения кле+ок в этих условиях является фактор адгезии нейронов 1ИСАМ).

В своих экспериментах мы обнаружили, что предъинкубаиия клеток в присутствии поликлональных антител к КСАМ значительно ;низкает ингибируюшее дейстие гепарина на их пролиферацию." Эти цанныэ позволяют предположить, что воздействие гепарина на <летки опосредовано фактором адгезивности нейронов.

Таким образом данные, полученные нами в этих экспериментах юдтверждают выдвинутое предположение о сходстве механизмов >становки пролиферации под действием гепарина и при контактном торможении.

Совокупность полученных нами данных и данных имевшихся в штературе позволяет предположить, что помимо управления 1ролиферации, опосредованного действием растворимых :тимуляторов и ингибиторов роста, существует и другой путь >егуляции размножения клеток, связанный с процессами ■узнавания" клетками ближайшего микроокружекия. Результаты [аших экспериментоз дают возможность полагать, что именно по •акому пути идет подавление пролиферации нормальных и [инимально трансформированных клеток млекопитающих, ¡аблыдаемое при контактном торможении, при воздействии на .летку гепарина и при терминальной дифференцировке некоторых кпов клеток.

- 26 -ВЫВОДЫ:

1. Проведено сравнительное исследование действия кратковременного повышения внеклеточной концентрации исноа калия на различные неделяшиеся клетки. При этой обнаружено следующее:

а) Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия вызывает реактивацию синтеза ДНК в клетках, пролиферация которых подавлена высокой плотностью монослоя. То же воздействие на разреженные культуры клеток не вызывает эффекта.

б) Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия не оказывает влияние на синтез ДНК в клетках культур, не обладавших способностью к контактному торыохгэни» .

в) Наблюдаемый эффект реактивации синтеза ДНК зависит от концентрации ионов калия и от наличия в среде сыворотки.

г) Кинетика возобновления синтеза ДНК, вызванного кратковременным повышением внеклеточной концентрации ионов калия, совпадает с кинетикой реактивации репликации, вызванной добавлением сыворотки к клеткам, покояшиыся в результате сывороточного голодания.

д) Дифференцированные неделяшиеся клетки различаются по реакции на кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия . В случае одних клеток (нейроны спинальных ганглиев мыши и дифференцированные in vitro миобласты крыс I наблюдается реактивация синтеза ДНК. в случае, других (перитонеальные макрофаги мыши и клетки миеломоноиитарной лейкемии человека HL60, дифференцированные m vitro) реактивации не было обнаружено.

2. Проведено исследование влияния гепарина на пролиферации клеток различных культур. Обнаружено, что:

а) Гепарин блокирует вступление клеток культур ЭФЧ, ГМАК v, ЗТЗ -Swiss в S-период, задерживая их как в раннем, так и е позднем G1-периоде.

б) Гепарин также может задерживать клетки в 0.2-перкоде .

в I Гепарин не влияет на пролиферацию клеток, лишенных способности к контактному торможению пролиферации ( клетки

линия L929,EJ,fiD, ).

3. Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия в присутствии гепарина отменяет ингибируишии эффект последнего. Клетки пролиферация, которых заторможена под действием гепарина, вступают в репликацию под воздействием кратковременного повышения внеклеточной концентрации ионов калия так же, как и при удалении гепарина.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Fedorov Yu.V., Yegorov Y.E., Zelenln A.V. The short-term increase m extracellular potassium concentration Causes DNA replication onset in density-Inhibited cells. // Exp.Cell Res.,1992, v.203, p.430-490.

2. Федоров Ю.В., Егоров E.E., Зеленин А.В. Кратковременное повышение внеклеточной концентрации ионов калия индуцирует реплихативньт синтез ДНК в заторможенных плотностью клетках. Тезисы конференции "Биология клетки в культуре". // Цитология. 1992. Т.34. т. С.112.

3. Fedorov Yu.V., Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenln A.V. The comparison of DNA synthesis lnduclblllty by high potassium treatment In various nonprollferatlng cells. // Exp.Cell Res.,1993, v.209,p.156-159.

4. Федоров Ю.8., Егоров E.E., Зеленин А.В. Гепарин тормозит пролиферацию эмбриональных фибробластов человека в разных периодах клеточного цикла. // ДАН, 1994, (в. печати).