Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование блока репликации в сегментоядерных лейкоцитах на модели гетерокарионов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование блока репликации в сегментоядерных лейкоцитах на модели гетерокарионов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А.Энгельгаодта

На правах рукописи КОСИМОВ РадхаОек БоОорадхаОович

УДК 576.312.6 '

ИССЛЕДОВАНИЕ БЛОКА РЕПЛИКАЦИИ В СЕГМЕНТОЯДЕРНЫХ ЛЕИКОЦИТАХ НА МОДЕЛИ ГЕТЕРОКАРИОНОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва. 1991.

Работа выполнена в лаооратории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Академии Наук СССР

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин,

кандидат биологических наук

И.А.Прудовския.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.А.Кук, кандидат биологических наук В.С.Прасолов

Ведущая организация: МГУ им. М.В.Ломоносова

Зашита состоится "

ЛЪ- /Ьс^ ,991 Г. в /О

часов

на заседании специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта'АН СССР по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат химических наук

А.М.Крииын

ОБИАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из важных проОлем современной биологии является изучение механизмов блока пролиферации в терминально дифференцированных клетках.

Терминально дифференцированные клетки не синтезируют ДНК как в организме, так и в культуре, несмотря на наличие в среде ростовых факторов. Это позволяет предположить наличие в таких клетках специальных механизмов, удерживавших их в нереплицирующем состоянии.

Для исследования блока репликации в терминально дифференцированных клетках применяют метод клеточной гибридизации (cm.Zelenln and Prudovsky, 1989 1. Этот метод дает возможность обнаруживать в дифференцированных клетках наличие факторов, препятствующих репликации ДНК в ядрах пролиферируюших клеток-партнеров.

Отталкиваясь от результатов, полученных методом клеточной гибридизации, можно в дальнейшем перехолить к выделению и биохимической характеристике негативных регуляторов пролиферации.

Интересную информацию дает использование клеток культур, трансформированных различными онкогенами, для гибридизации с дифференцированными клетками. Таким образом удается выявить влияние онкогенов на чувствительность клеток к негативным регуляторам пролиферации, а также зависимость реактивации синтеза ДНК в ядрах дифференцированных клеток от активности онкогенов.

Анализ блока репликации в дифференцированных клетках методом клеточной гибридизации был проведен для макрофагов, ядерных эритроцитов и миоцитов (см. Zelenln and Prudovsky,1989l.

Особый интерес представляют данные, полученные в опытах с макрофагами, которые оказались неспособными подавлять репликацию в ядрах пролиферируюших клеток (Prudovsky et.al., 1985).

В настоящей работе проведены аналогичные исследования на сегментоядерных лейкоцитах (СЛ> из перитонеальной полости мыши, подавляющее большинство которых представлено неитрофилами, имеющими общее происхождение с макрофагами.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что несмотря на близкое родство нейтрофилов и макрофагов, механизмы, ответственные за блок пролиферации этих клеток, по-видимому различаются.

Цель и задачи работы:

Целью работы было исследование блока репликации в сегментоядер-ных лейкоцитах методом клеточной гибридизации. При этом ставились следующие задачи:

1. Выяснить, зависит ли реактивация ядер сегментоядерных лейкоцитов (СЛ> в гетерокарионах от пролиферативного потенциала клеток-партнеров и от наличия в них активных онкогенов.

2. Узнать, обладают ли СЛ способностью ингибировать синтез ДНК в ядрах пролиферируюших клеток-партнеров.

3. В случае положительного ответа на второй вопрос выяснить:

а) Зависит ли чувствительность Пролиферируюших клеток к ингибиторам из СЛ от злокачественности этих клеток и от наличия в них активированных онкогенов ? б I В каком периоде цикла клетки чувствительны к ингибирующему действию СЛ ?

в I Сопровождается ли ингибирующий эффект СЛ в гетерокарионах сни-жениэм обшей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров ?

4. Выяснить локализацию (ядро или цитоплазма) в СЛ факторов, подавляющих репликацию.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые исследован блок репликации в сегментоядерных леикоцитах. Показано, что синтез ДНК в ядрах сегментоядерных лейкоцитов реактивируется в составе гетерокарионов как с клетками, имеющими ограниченную способность к пролиферации, так и с иммортальными клетками. Вместе с тем. иммортализация (как спонтаная, так и с помощью иммортализуюших онкогенов ) повышает способность клеток реактивировать синтез ДНК в ядрах СЛ. Обнаружено подавление синтеза ДНК в ядрах пролиферируюших клеток-партнеров в гетерокарионах с СЛ. Оно не связано с подавлением общей транскрипционной активности. Показано, что факторы, подавляющие репликацию, локализованы в цитоплазме СЛ.

Малигнизаиия клеток (как спонтанная, так и с помощью вируса БУ40 или онкогена с-К1-гаБ I вызывает резкое снижение их чувсти-вительноси к ингибирующему действия СЛ. Результаты работы могут послужить фундаментальной основой для разработки методов противоопухолевой терапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Конкурсе работ молодых ученых Института молекулярной биологии АН СССР (1990 год); X Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (1990, Гродно); IV Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Пер спективные направления и новые методы в молекулярной биологии" (1990, Рига); III Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" (1989, Москва).

Структура диссертации. .Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемои литературы В списке литературы В4 наименования, из них 62 иностранных источника. Работа содержит страниц, включая 22 рисунка и 13 таблиц.

СОКРАЩЕНИЯ:

ГК - гетерокарион.

СЛ - сегментоядерный лейкоцит.

ЭФМ - эмбриональный фибробласт мыши.

ЭФК - эмбриональный фибробласт крысы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Клетки

Выход СЛ в перитонеальную полость стимулировали,инъецируя самкам мышей СВА интраперитонеально за 1 ч до получения экссудата 0,5* раствор крахмала. Очистку СЛ от других клеток экссудата проводили в градиенте плотности Перколла по методу iDe Weger et. al, 1983). Очищенная фракция содержала не менее 96Я СЛ, среди которых, как показало окрашивание по Романовскому, не менее yat были неятрофилами. Партнерами СЛ по слиянию были клетки, имеющие различный пролиферативныи потенциал: эмбриональные фибробласты мыши 1ЭФМ) и крысы (ЭФК) .иммортализованные клетки NIH3T3, Е2 и NIH3T3, трансформированные онкогеном v-myc (ЗТЗтус), а также малигнизированные клетки NCC-2, L-929, SV3T3 и Не239.

Культуры ЭФМ и ЭФК получали по Адамсу (1983) с некоторыми модификациями. Культуры NIH3T3 и NCC2 были любезно предоставлены нам В.С.Прасоловым (ИМБ АН СССР), а культура Е2 - Т.В.Поспеловой

- 4 -

из Института цитологии АН СССР (Ленинград).

I клетки клона 1-929 были получены из лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИМБ АН СССР. Клетки БУЗТЗ мы получили от П.М.Чумакова |ИМБ АН СССР). Культура клеток Не239 была любезно предоставлена нам Г.И.Деячман из Института канцерогенеза ВОНЦ АМН СССР.

2.Слияние клеток

Для получения гетерокарионов использовали метод электрослияния при центрифугировании, разработанный в Институте электрохимии им.'А.Н.Фрумкина АН СССР (Абидор и др., 1989, ЗикЪагеу 1989). В отдельных опытах были использованы также метод электрослияния в монослое и метод слияния с помощью инактивированного вируса Сендая.

Метод электрослияния при центрифугировании был выбран как основной после апробирования других методов слияния. Было обнаружено, что при слиянии СЛ с клетками культуры с помощью полиэти-ленгликолей как в суспензии, так и в монослое, происходит быстрая гибель большинства СЛ, а индекс слияния (процент гетерокарионов в культуре) оказывается низким (4%). При слиянии клеток с помощью вируса Сендай гибель СЛ выражена очень слабо, но и индекс слияния невелик (6*). Хороший индекс слияния (12*) при достаточно высокой жизнеспособности клеток был достигнут при электрослиянии в суспензии в процессе центрифигугирования.

3. Идентификация гетерокарионов и изучение синтеза ДНК и РНК.

Идентификация гетерокарионов не представляла сложности ввиду явных морфологических отличий ядер СЛ (сегментированных или кольцевидных) от ядер клеток-партнеров по слиянию (овальных или круглых). Через 24 и 48 ч в гетерокарионах, как правило, сохранялась характерная морфология ядер СЛ. Клетки для исследования окрашивали красителем Гимза, выявляющим структуру цитоплазмы и ядра. Синтез ДНК исследовали авторадиографически по включению "Н-тими-дина. В препаратах гетерокарионов, меченных ,5Н-тимидином, определяли следующие показатели: 1) доля меченых неслившихся клеток культуры (I,': 2) доля меченых ядер в гомодикарионах, образованных при слиянии клеток культуры друг с другом II,); 3) доля меченых ядер клеток культуры в гетеродикарионах с СЛ <I >; 4) индекс подавления

синтеза ДНК в гетерокарионах 14 = —?— *100%; 5) индекс реактива-

1

иии < X5), т.е. доля меченых ядер СЛ в гетеродикарионах с мечеными ядрами клеток культуры. Синтез РНК в гетерокарионах исследовали по включению в ядра 3Н-уридина.

4. Энуклеация и получение кариоОридов

Энуклеацию СЛ проводили по методу Wlgler and Weinstein 11975) путем центрифугирования СЛ при 26 ООО об/мин в содержавшем цито-халлаэин В (10 _рг/мл1 градиенте плотности фиколла 400 следующего состава: 12,5%; 14%; 16%; 18%; 20%; 22%; 24%; 26%; 28%; 30%: 32%. После центрифугирования в зонах 24%-26% содержалось более 95% кариопластов. Цитопласты сосредотачивались в зонах 16%-20%.

Для получения кариобридов кариопласты сливали с ЭФМ методом электрослияния при центрифугировании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для слияния с СЛ использовали клетки культур трех типов: с ограниченной способностью к пролиферации; иммортализованные незлокачественные; малигнизированные.

1 . Гетерокарионы сегиентоядерных лейкоцитов и клеток с ограниченной способностью к пролиферации

Два типа клеток с ограниченной способностью к пролиферации были партнерами СЛ по слиянию ЭФМ и ЭФК.

1.1. Гетерокарионы "эмбриональный фиоробласт мыши + сегментоядерныи

лейкоцит".

Предварительные исследования показали, что при инкубации в течение 24 ч в полной культуральной среде с ,5Н-тимидином метка включается в ядра менее, чем 0,1% СЛ как из перитонеального экссудата, так и из транссудата. Через 24 ч после слияния СЛ из перитонеального экссудата с ЭФМ 3-4 пассажа примерно в 30% гетерокари-онов с ядрами ЭФМ, синтезировавшими ДНК, происходит реактивация репликации в ядрах СЛ (Табл. 1). Более продолжительная инкубация.

- О -

Таблица 1. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах СЛ + ЭФМ

Срок Стиму- |Число|Доля ме- Доля мече- Доля мече- Индекс Индекс

пос- ляция ¡иссле^еных ных среди ных среди подавления реак-

ле выхо- дован-)ядер несливших- ядер ЭФМ синтеза тива-

сли- да СЛ |ных |ЭФМ в ся ЭФМ в ГК ДНК в яд- ции

яния крах- |ГК. ¡гомока- (%). (г). рах клеток ядер

I ч 1 . малом . ¡рионах культуры СЛ в

| ( % 1. в ГК (% ). ГК (% )

24 + | 211 | 80,2±3,8 92,3 ±1.9 23,2 ±5.8 74.8 30,6

24 + | 388 | 85,2±3,5 89,7 ±1,7 17.5 ±3,8 80,5 36,8

48 + | 441 | 86,0+3,1 91 ,4 ±1.7 24.4 ±4,0 73 ,3 35,2

24 - | 398 | 85,2+3,8 90,2 ±1 ,5 20,8 ±4.1 76,9 28,9

48 - | 212 | 88,7±3,1 95,2 ±1 ,5 21,2 ±5,6 77,7 28,9

(до 48 ч), не приводит к существенному увеличение индекса реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ. Синтез ДНК в ядрах СЛ практически не наблюдался в гетерокарионах с нереплицируюшими ядрами ЭФМ. В тех же опытах наряду с реактивацией синтеза ДНК в ядрах СЛ обнаружили сильное подавление синтеза ДНК в ядрах ЭФМ. Индекс подавления составлял через 24 ч 70-80%, а к 48 ч существенно не изменялся.

Подавление синтеза ДНК в гетерокарионах нельзя обьяснить самим процессом клеточного слияния. Действительно, доля меченых ядер в гомодикарионах "ЭФМ * ЭФМ" практически та же, что и среди неслив-шихся ЭФМ (таблица 1I. Это справедливо и для клеток других использованных культур.

Представляло интерес выяснить, влияет ли слияние с СЛ на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФМ. С этой целью СЛ сливали с ЭФМ, частично синхронизованными е 5-фазе (24 часа после сывороточной стимуляции покоящейся культуры). Фиксацию проводили через 2 ч и 4 ч после слияния. Через 2 часа не было обнаружено подавляюшеюго действия СЛ на синтез ДНК в ядрах ЭФМ. Уже через 4 часа было обнаружено небольшое, но достоверное подавление синтеза ДНК в гетерокарионах. Таким образом, слияние с СЛ не влияет на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФМ, но подавляет вступление последних в 5-период. (рис 1 I.

В отдельном опыте ЭФМ сливали с СЛ не из экссудата, а из перито-неального транссудата, т.е. с СЛ из невоспаленной брюшной полости. В этом случае через 24 ч после слияния наблюдалась реактивация

Рис.1. Регуляция синтеза ДНК в гетерока рионах СЛ и частично синхронизованных

ЭФМ

X

2 ч после слияния 4 ч после слияния

ГЛ I ЯШ 2 ШИШ 3

Доля иечених ядер ЭФЫ в неслившихся клетках культуры (1). в гетерокарионах (2). Индекс реактивации в ядрах СП (3)

синтеза ДНК в ядрах СЛ и подавление его в ядрах ЭФМ, выраженные примерно в той же степени, что и в опытах с СЛ из экссудата |табл.1 )

1.2.Гетерокарионы: "эмбриональный ФИОробласт крысы + сегментоядерныя лейкоцит".

Закономерности реактивации синтеза ДНК в гетерокарионах. образованных СЛ и ЭФК. оказались в общем такими же, как и в гетерокарионах СЛ с ЭФМ (табл. 21. Правда, в этом случае индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ был очень низок (5-8%) как через 24 ч. так и через чб ч после слияния. Индекс подавления синтеза ДНК в ядрах ЭФК превышал 80% через 21 ч после слияния и не уменьшался к 48 ч

Итак, опыты по слиянию СЛ с клетками, обладавшими ограниченной способностью к пролиферации, показали, что последние способны реактивировать синтез ДНК в ядрах СЛ. В то же время, для СЛ продемонстрирована четко выраженная способность подавлять синтез ДНК в ядрах "смертных" клеток.

Таблица 2. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и ЭФК в гетерокарионах

Срок | Число Доля мече- Доля мече- |Доля мече- Индекс | Индекс

после| иссле- ных ядер ных среди ных среди подавления ¡реакти-

слия-| дован- ЭФК в го- несливших- ¡ядер ЭФК синтеза ДНК вации

ния, | ных мокарионах ся ЭФК | в ГК в ядрах ЭФК ¡ядер

1ч). | ГК. (г). \% I. | ( X I. в ГК т. | СЛ в

| ГК (%).

24 | 191 75 ,6±4,2 80,1±3.9 | 12 ,6±4 ,8 84,3 1 8,0

48 | 77 77,4±4 ,1 82 ,2±3 ,8 | 9,5± 6.6 88,4 1 1 5,2 1

24 | 117 68,2+4,4 78,1 ±4,1 | 10 ,2±5 ,5 86,9 1 1 5,5 ■

48 | 68 82,3±4,1 72 ,7±4,5 | 11 , 8±7 ,8 83.7 1 1 5,9

2. Гетерокариони сегментоядерних лейкоцитов и иииортализованних клеток

Исследовали синтез ДНК в ядрах СЛ в гетерокарионах с клетками трех культур, иммортализованных спонтанно или с помощью онкогенов.

2.1 Гетерокарионы " клетка ШНЗТЗ + сегментоядерныи лейкоцит".

Клетки ШНЗТЗ являются спонтанно иммортализованными мышиными фибробластами, способными в условиях сывороточного голодания переходить в состояние покоя. Эти клетки "бессмертны", но не злокачественны. Ядра СЛ, находясь в цитоплазме клеток ШНЗТЗ, востанавли-вают утраченную способность к репликации. Индекс реактивации через

Таблица 3. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток ШНЗТЗ в гетерокарионах

Срок |Число |Доля мече- |Доля мече- |Доля мече- | Индекс | Индекс

после слия- |иссле-\ дован- ных ядер |ШНЗТЗ в ных среди ¡несливших- ных ядер 1М1НЗТЗ в |подавления | ¡синтеза ЛНК| реактивации

ния . ( ч I . | ных | ГК. 1 |гомокари-¡онах (Г.). |ся ШНЗТЗ. | ( % ). 1 в ГК, 1 (г). | в ядрах | | ШНЗТЗ I | в ГК (%). | ядер СЛ в ГК 1%)

24 | 293 | 75.0+4.5 I 79.7+2,0 1 23 ,2±4,9 I 70.8 | 39.7

48 | 170 | 83,3±4,5 | 95.6+1,2 1 28,8+6,7 1 69.е | 69.3

24 | 386 | 77,0±4,3 | 84,5+1,6 16 , 5±3 ,8 1 80,4 | 31 .2

48 | 157 | 81,4±4,7 | 91 ,0±2,0 20,4+6,4 1 77,5 | 68,7

24 ч после слияния составлял зи-чоз. (табл. 3 1. К 4в часам индекс реактивации увеличивался примерно в два раза. Индекс подавления синтеза ДНК в ядрах ШНЗТЗ составлял через 24 ч и 48 ч после слияния 70-60%.

2.2. Гетерокарионы "клетка Е2 + сегментоядерныи леикоиит".

Клетки Е2 получены путем трансформации ЭФК имморталиэующим аденовирусным онкогеном Е1А. Они спосооны к неограниченно продолжительной пролиферации, но вместе с тем незлокачественны. Регуляция синтеза ДНК в гетерокарионах Е2 и СЛ сходна с таковой в гетерокари-онах СЛ и ШНЗТЗ (таол.4). Как и ШНЗТЗ, Е2 оказались высокочувствительными к ингибирующему действие СЛ: индекс подавления синтеза ДНК в гетерокарионах составил 70-95% как через 24 ч, так и через 40 ч после слияния. Индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ через 24 ч после слияния варьировал в разных опытах от 24 до 37%, а через 48 ч неизменно возрастал еще вдвое. Как и в случае К1НЗТЗ, не было обнаружено реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ, находящихся в гетерокарионах с нереплицируюшими ядрами Е2. Основным отличием £2 от их нетрансформированных предшественников 13ФК1 была гораздо более высокая способность реактивировать синтез ДНК в ядрах СЛ.

Таблица 4. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток Е2, в гетерокарионах

Срок | Число Доля мече- |Доля мече- Доля мече- Индекс 1 Индекс

после | иссле- ных ядер |ных среди ных ядер подавления |реакти-

слия- | дован- Е2 в |несливших- в синтеза ДНК|вации

ния | ных гомокари- | ся Е2 ГК, в ядрах |ядер

14 1. 1 ГК. онах (%). | ( % i. (%). Е2 |СЛ в

в ГК (% . |ГК t*i,

24 | 143 85,1±5,4 | 95 , 4±2,1 26, 6 ±7 ,3 72.1 1 23,7

48 | 100 85 , 3±4 ,5 | 97,111,6 30, 0±2 8 69,3 1 » | 50,0

24 | 441 82,б±4,У | 86 , 4±3 ,4 13, 4±3 2 84,5 1 37,3

48 | 351 83 , 7±5,1 1 90,4*2,9 13, 6±3 6 84,9 | 64,6

24 | 245 79 ,6±4,9 | 87.1±3,3 30, 6±2 0 64,9 | 32,0

48 | 69 81,4±4,7 1 87,9±3,2 10, 1 ±7 2 88,5 | 57,1

2.3. Гетерокарионы "клетка ЗТЗшус + сегментоядерныи лейкоцит".

Клетки ЗТЗтус были получены путем трансформации культуры Н1НЗТЗ вирусным онкогеном v-myc. Клетки эти, подобно ШНЗТЗ и Е2, иммортальны, но не злокачественны. СЛ при слиянии с ЗТЗтус вызывали к 24 ч четко выраженное угнетение синтеза ДНК в ядрах последних. Коэффицент подавления составлял 60-70*, т.е. был лишь слегка ниже, чем в гетерокарионах СЛ + ШНЗТЗ. Вместе с тем, индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ в гетерокарионах с реплицирующими ядрами ЗТЗтус был через 24 ч выше, чем в гетерокарионах СЛ + ШНЗТЗ: около 60» (табл. 5).

Итак, показано, что как спонтанная имморталиэация клеток, так и трансформация иммортализуюшими онкогенами резко повышают способность реактивировать синтез ДНК в ядрах СЛ и в то же время, практически не влияют на чувствительность клеток к подавляющему действию СЛ.

Таблица 5. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток культуры ЗТЗтус, в гетерокарионах

Срок Число |Доля мече- |Доля мече- |Доля мече- | Индекс |Индекс

после иссле- ных ядер ных среди ных ядер ¡подавления |реакти-

слия- дован- |ЗТЗтус в |несливших- | ЗТЗтус в |синтеза ДНК|вации

ния ных |гомокари- |ся ЗТЗтус | ГК |в ядрах |ядер

(ч). ГК. |онах (%). | (%). | (%). |ЗТЗтуе в I СЛ в

1 1 1 | ГК (%). | ГК 1%).

24 107 | 72,3±4,9 I 76, 5±4,2 | 28.9±8,7 I 62,2 1 64,5

24 113 | 79 ,6±4 ,9 | 84,0±3,6 | 27,4±8,3 1 67,3 1 58,1

3. Гетерокарионы сегментоядерных лейкоцитов и злокачесвен-

ных клеток

3.1.Гетерокарионы "клетка ИСС2 + сегментоядерныи лейкоцит" Высокозлокачественные клетки ИСС2 были получены путем трансформации клеток ШНЗТЗ онкогеном с-К1-гаБ. По сравнению с исходными клетками ШНЗТЗ, клетки ЫСС2 гораздо менее подвержены ингибирую-щему действию СЛ в гетерокарионах. Через 24 ч после слияния индекс подавления составлял всего 10-40% (табл.6 1. Вместе с тем, реактивирующий эффект клеток ЫСС2 не превышал таковой в клетках ШНЗТЗ: индекс реактивации через 24 ч варьировал от 12 до 36%.

Таблица 6. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток ЫСС2, в гетерокарионах

Срок I Число Доля мече- |Доля мече- Доля мече- Индекс |Индекс

после | иссле- ных ядер ных среди ных ядер подавления (реакти-

слия- | дован- ИСС2 в |несливших- ИСС2 в синтеза ДНК вации

ния | ных гомокари- |ся ЫСС2 ГК в ядрах |ядер

( ч ). 1 ГК. онах (%>. | (X ). ( X I . ЫСС2 в |СЛ в

1 ГК (*). |ГК (X).

1 24 | ПО 70 ,3±5,5 1 80,7±3,9 63 , 6±9,1 21,2 1 18,6

1 24 | 100 51 ,1±6 ,2 | 72,5±4,4 42 , 0±9,8 42,1 1 12,0

1 24 | 107 91,1±2 ,6 | 93, 7±2,4 54,2±9,6 42,1 | 36.2

1 24 | 103 91,9±2 ,5 | 92,5±2 ,6 82,5+7,4 10,8 | 35,3

3.2. Гетерокарионы "клетка 1,929 + сегментоядерныя лейкоцит" Культура 1.929 является субклоном культуры I. полученной в свое время путем трансформации фибробластов мыши, которой инъецировали канцероген метилхолантрен. Эти иммортальные клетки способны расти при низких концентрациях сыворотки и с небольшой частотой образует опухоли у бестимусных мышей. Через 24 ч после слияния с СЛ индекс подавления синтеза ДНК в ядрах клеток 1.929 в гетерокари-

Таблица 7. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток 1.929 в гетерокарионах

Срок | Число Доля мече- |Доля мече- Доля мече- Индекс Индекс

после| иссле- ных ядер ных среди ных ядер подавления реакти-

слия- 1 дован- 1.929 в |несливших- 1.929 в синтеза ДНК вации

ния | ных гомокари- |ся 1929 ГК в ядрах ядер

14). 1 ГК. онах (XI. | 1X1. (%). 1929 в СЛ в

ГК (XI. ГК (Ж).

24 | 120 89 ,8±3,6 1 95.2+2,1 69,8±8,3 26,7 63,8

48 | 205 89,2±3,5 | 93,3±2 ,5 64,9±6,6 30,4 62,4

24 | 145 90 ,3±3,7 | 97,2±1 ,6 37,2+8,0 61 .7 59.2

48 | 108 89,3±3 ,5 | 94,8+2,2 40,5+9,4 57,3 73,5

24 | 64 89,4±4 ,0 | 95,2+2,0 55,2 ±12 ,4 42,8 48,6

48 | 102 91,4±3 ,5 | 93 , 2±2 ,5 64,7±9,4 30,6 1 60,6

• ! - 12 -

он&х был ниже, чем в случае гетерокарионов ЭФМ и СЛ (табл.1 >. При этом он варьировал от опыта к опыту в довольно широких пределах: от 27 до 62Х. Индекс реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ через 24 1 был весьма высок: от 49 до 74*, к 48 ч после слияния оба индекса (подавления и реактивации) существенно не изменялись. Результаты, полученные в опытах по слияние СЛ и 1.929, приведены в таблице 7.

3.3. Гетерокарионы "клетка гУЗТЗ + сегментоядеоныя лейкоцит".

Клетки БУЗТЗ, полученные в результате трансформации клеток ЗТ: Ва1Ь/с вирусом ЗУ40, являются высокозлокачественными. По сравнени« с другими клетками они оказались в наименьшей степени подвержены ингибируюшеыу действию СЛ. Индекс подавления синтеза ДНК в гетеро-карионах был через 24 ч не более 23Х. Вместе с тем, индекс реактивации СЛ в этот же срок был весьма высоким - от 35 до 70Х (табл.8)

Таблица 8. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток БУЗТЗ, в гетерокарионах

Срок после

слияния (ч).

24 24 24 24

Стимуляция выхода СЛ крахмалом.

Число

иссле

дован

ных

ГК.

115 155 63 196

Доля меченых ядер ЭУЗТЗ в гомока-рионах т.

100,0±0,0 97,5*1,5 94,1*2,6 97,3*1,4

Доля мече-|Доля меченых среди ных среди несливших-(ядер БУЗТЗ ся БУЗТЗ | в ГК IX). IX)

100,0±0,0 99,0*0,9 96,5*1,6 100,0*0,0

| Индекс ¡подавления ¡синтеза |ДНК в ядрах ЭУЗТЗ В ГК (X).

95,6*3,8 76,8*6,7 76,2*10,7 77,5*5,9

4,4

22.4 21 ,0

22.5

|Индек ¡реактивации ¡ядер |СЛ в |ГК IX

I 54,5

I

I 34,4

I

I 54,2

I

I 69,7

В одном из опытов для слияния с гУЗТЗ были использованы СЛ из пе-ритонеального транссудата. Результаты, полученные в этом опыте не отличались по характеру от результатов обычных опытов с использованием СЛ из экссудата.

Низкая чувствительность асинхронных злокачественных клеток БУЭТЗ к ингибируюшему эффекту СЛ могла обьяснятся тем, что эти клетки обладают чувствительностью к ингибиторам из ЗУЗТЗ лишь в короткий отрезок времени в начале С1-периода. Для проверки этого

предположения СЛ сливали с 5УЗТЗ, синхронизованными в раннем . Клетки БУЗТЗ блокировали в митозе нокодозолом, собирали митозы стряхиванием, переводили в среду без нокодазола и через 2 ч после этого сливали с СЛ, Опыты по слиянии СЛ с синхронизованными 5УЗТЗ, дали столь же низкие индексы подавления, как и в опытах с асинхронными клетками: 2-25* (табл. 9). В то же время, индексы реактивации были существенно ниже, чем в гетерокарионах с асинхронными БУЗТЗ: 14-34*.

Таблица 9. Синтез ДНК в клеток

ядрах СЛ и предварительно синхронизованных ЭУЗТЗ в гетерокарионах

Срок после слияния 1ч)

Число исследованных ГК.

93 64 103 193

Доля меченых ядер ЭУЗТЗ в гомокари-онах (*).

(Доля меченых среди несливших-ся БУЗТЗ (X).

89,3 ±2 ,8 87,0±3 ,0 87,2±3,0 89,6±2,6

93,7±2,4 92,5±2,6 92,2±2,7 98,2±1,3

Доля меченых ядер ЭУЗТЗ в ГК ( XI.

84,1±7 ,6 90,6±7,3 78,6±8,0 73,6±6,3

Индекс |Индекс подавления |реакти-синтеза ДНК|вации в ядрах ¡ядер БУЗТЗ |СЛ в в ГК (X). |ГК (*>.

8,6 2,0 14,7 25,0

-I-

| 33,7 I

I 22,4

I

I 13,6

I

| 26,0

3.4. Гетерокарионы "клетка Не239 + сегментоядерныя лейкоцит" Клетки Не239 представляют собой фибробласты сирийского хомячка, трансформированные вирусом ЗУ40. Подобно клеткам БУЗТЗ они практически не обладают чувствительностью к ингибирующему эффекту "Л. Вместе с тем, индекс реактивации ядер СЛ в гетерокарионах с <летками Не239 - 30-45*, что существенно ниже, чем в случае асинх-эонных клеток 5УЗТЗ (табл. 10).

Итак, малигнизация клеток, вызванная химическим канцерогеном «етилхолантреном, онкогенным вирусом 6У40 или онкогеном с-К1-газ )риводит к резкому снижению или исчезновению чувствительности :леток к подавляющему эффекту СЛ. Вместе с тем, способность реак-■ивировать синтез ДНК в ядрах СЛ выражена у малигнизированлых :леток не в большей степени, чем у незлокачественных иммортализо-анных.

Таблица 10. Регуляция синтеза ДНК в ядрах СЛ и клеток Не239,

в гетерокарионах

Срок (Число |Доля мече-|Доля мече-|Доля мече-| Индекс (Индекс

после |иссле-слия- ¡дован-ния | ных 1ч). | ГК.

| 104

I

| 60

| 66 I

I 65

ных ядер Не239 в гомокари-онах (X).

|ных среди |ных ядер ¡подавления |реакти

|несливших-|Не239 в |синтеза ДНК|вации

| с я Не239 I ГК |в ядрах ¡ядер

| 1%). I (X). |Не239 |СЛ в

| | | в ГК (%). |ГК IX).

-I

90 ,6±3,1 | 94 , 0±2,4

88,8±2,9 | 92 ,0±2,7

96 ,6±1 ,7 |ю0,0±0,0

89,6±2,8 | 94,2±2,3

82,9± 5,5 | И ,8

78,3±10,6 92,6± 6.3 72,2±11 ,1

14,9 7,4 23,3

I 28.4

I

I 44,7 I

I 36,5 I

I 37,9

4. Синтез РНК в гетерокарионах "эмбриональный фиОробласт мыши ♦ сегментоядерный лейкоцит"

Негативный эффект СЛ на репликацию в ядрах клеток-партнеров мог быть вызван неспецифическим подавлением транскрипционной активности последних и, как следствие, нарушением подготовки к Э-периоду. Для проверки этой возможности изучали влияние СЛ на транскрипцию в ядрах ЭФМ в составе гетерокарионов. Для того, чтобы различия в содержании ДНК не вносили слишком больших разбросов при определении уровня транскрипции в ядрах, для слияния с СЛ использовали синхронизованные ЭФМ. В культуре фибробластов, достигшей монослоя, меняли полную культуральную среду на среду с 0,251 сыворотки и инкубировали ее з&тем в течение пяти суток. Покоящиеся клетки сливали с СЛ с помощью электроимпульса при центрифугировании. Известно, что при переходе в покой ЭФМ задерживаются в С]-периоде, и содержание ДНК в их ядоах соответствует диплоидному. После слияния клетки переводили в полную среду.помешали в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами и инкубировали в течение двух часов при температуре 37°, с тем, чтобы они прикрепились и распластались, после чего добавляли 10 мкКи/мл 3Н-уридина. Через 15 мин. клетки фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1 и подвергали авторадио графической обработке. Подсчитывали количества зерен над ядрами ЭФМ в гетерокарионах и в одноядерных неслившихся клетках.

Рис.2.Синтез РНК в ядрах ЭФМ в гетеро-карионах с сегментоядерными лейкоцитами

I I гетерок&рионы неслившиесв ЭФМ

По оси абсцисс-количество зерен серебра на ядро ЭФМ, по оси ординат-% ядер ЭФМ

Результаты исследования транскрипции в гетерокарионах ЭФМ+СЛ приведены на рис. 2.

Среднее число зерен на ядро составляло для гетерокарионов Вб,5±6,б, а для неслившихся клеток 83,5±8,1. Таким образом, оказалось, что СЛ существенно не влияют на транскрипцию в ядрах ЭФМ.

5. КариоОриды "эмбриональный фиОробласт мыам + кариопласт сегментоядерного лейкоцита"

Ядра СЛ отличаются высокой степенью конденсации хроматина. Иожно было предположить, что ядерные белки, ответственные за инактивацию генома СЛ, вызывают обнаруженное нами подавление синтеза IHK в гетерокарионах. В связи с этим представляло интерес выяснить, •де, в ядре или в цитоплазме СЛ. локализованы факторы, подавляющие :интез ДНК в гетерокарионах.

Для ответа на этот вопрос СЛ энуклеировали с помощью цитохала-1ина В путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла по

Wlgler and Weinstein (1975). Полученные кариопласты СЛ содержали ядра, окруженные лишь тонким ободком цитоплазмы. При слиянии ка-риопластов СЛ с ЭФМ через 24 ч не было обнаружено подавления синтеза ДНК в образующихся кариобридах. Полученные результаты позволяют считать, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме СЛ. Результаты этих опытов приведены на таблице 11.

Таблица 11. Регуляция синтеза ДНК в кариобридах ЭФМ и кариопластов сегментоядерных лейкоцитов

Срок |Число исследованных ГК.

после слияния (ч).

24 24

100 120

Доля меченых ядер ЭФМ в гомокари-онах (S).

|Доля мече-|Доля меченых среди |ных ядер несливших-¡ЭФМ в ся ЭФМ ¡кариобри-(* >. |дах (% ).

67,2±4,7 81 , 5±3 ,9

| Индекс | Индекс ¡подавления ¡реакти-¡синтеза ДНМвации ¡в ядрах ЭФМ¡ядер СЛ ¡в кариоОри-jb кариойр | дах (*). |дах (*).

75,2±4,3 | 74 ,0±4,3 I

87,5±3,3 | 79, 2±7,4

1 .6 9,5

9,5 6,4

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты настоящей работы показали, что в отношении способности претерпевать реактивацию синтеза ДНК ядра СЛ ведут себя подобно ядрам других дифференцированных клеток - куриных эритроцитов (Капник и др., 1989 1: как иммортализованные клетки, так и клетки с ограниченным пролиферативным потенциалом могут вызвать реактивацию синтеза ДНК в ядрах СЛ. Сделанное в отношении ядер макрофагов заключение (Егоров и др., 1984, 1985, Прудовский и др., 1985, Гуменюк и др., 1966, 1988) о том , что для реактивации синтеза ДНК в покоящемся ядре может быть необходима конститутивная активность онкоге-нов-имморталиэаторов в клетках-партнерах,к СЛ не относится.

Однако, следует отметить, что трансформация клеток иммортализу-юшими онкогенами Е1А и у-шус приводила к значительному повышению их способности реактивировать синтез ДНК в ядрах СЛ.

Подавляющее большинство полученных нами СЛ было представлено нейтрофилами, то есть клетками, имеющими в гемопоэзе общих с макрофагами предшественников. Можно было ожидать, что подобно родственным им макрофагам, нейтрофилы не способны подавлять

репликацию при слиянии с пролиферируюшими незлокачественными клетками (Егоров и др.. 1963). Однако, результаты настоящей работы свидетельствует об обратном: репликация в ядрах незлокачественных клеток, как "смертных", так и иммортализованных, оказалась в высокой степени подверженной ингибируюшему эффекту СЛ. Судя по нашим данным, текупмя синтез ДНК в ядрах пролиферируюших клеток нечувствителен к негативным регуляторам из СЛ. По-видимому, эти регуляторы подавляют некие этапы подготовки к репликации, происходящие в С1-периоде.

Опыты с кариобридами отчетливо указывают на цитоплазматическую локализацию негативных регуляторов в СЛ. Подавляющий эффект СЛ на репликацию в гетерокарионах не связан со снижением обшея транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров. По-видимому, если он и опосредован снижением экспреси^ генов, то только определенных, ответственных за подготовку клеток к Б-периоду.

Ранее было обнаружено, что макрофаги, не влияющие на репликацию з ядрах незлокачественных клеток, вызывают мооное подавление синтеза ДНК в ядрах малигнизированных клеток (Ргийоу&ку еЬ &1., 1985; 'уменюк и др., 1988). Поведение СЛ в гетерокарионах почти противо-голожно этому - резко ингибируя репликацию в ядрах неопухолевых клеток, они лишь в небольшой степени (хотя и достоверно) ингибируют синтез ДНК в ядрах злокачественных клеток.

Итак, можо полагать, что несмотря на происхождение от общих |редшественников, СЛ, по-видимому, резко отличаются от макрофагов по ому способу, с помощью которого они* поддерживаются в нереслициру-ипем состоянии. Вместе с тем, анализ регуляции синтеза ДНК в етерокарионах обнаруживает большое сходство между неятрофилами и дерными эритроцитатами. В неятрофилах, как и в куриных эритроци-ах, присутствуют негативные регуляторы, способные предотвращать ступление ядер незлокачественных клеток в Б-период.

- 1в -

выводы

1.Синтез ДНК в ядрах сегментоядерных лейкоцитов возобновляется в составе гетерокарионов как с клетками, обладающими ограниченной способностью к пролиферации, так и с клетками иммортальных и малигнизиров&нных культур.

2 .Сегыентоядерные лейкоциты эффективно подавляют вступление в 3-период ядер незлокачественных клеток в гетерокарионах. Клетки злокачественных культур подвержены ингибируюшему действию сегыентоядерных лейкоцитов в гораздо меньшей степени.

3. МнгиОируоший эффект сегыентоядерных лейкоцитов на синтез ДНК в гетерокарионах не сопровождается снижением обшей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров.

4. Различные онкогены! введенные в геномы клеток культур, неодинаково влияет на реактивацию и подавление синтеза ДНК в гетерокарионах этих клеток и сегыентоядерных лейкоцитов.

а) Трансформация "смертных" клеток иммортализуюшим онкогеном Е1А приводит к резкому повышению уровня реактивации синтеза ДНК в ядрах СЛ в гетерокарионах с этими клетками. Однако, чувствительность клеток к ингибируюшему действию СЛ при этом не изменяется.

б) Супертрансформация спонтанно иммортализованных клеток имморта-лиэуювмм онкогеном у-вус приводит к повышению в два раза индекса реактивации в ядрах СЛ в гетерокарионах. При этом чувствительность клетох к ингибируюшему действию СЛ не изменяется.

в> Малигнизируююй онкоген с-К1-гав при трансформации незлокачественных иммортальных клеток ШНЗТЗ существенно не влияет на реактивирующие свойства этих клеток. Однако, он почти полностью снимает чувствительность клеток к ингибируюшему действию сегыентоядерных лейкоцитов.

5. Показано, что факторы, подавляющие репликацию в ядрах кле-ток-пяртнеров в составе гетерокарионов с СЛ, по-видимому локализованы в цитоплазме СЛ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ОТРАЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1. А.В.Зеленин, И.А.Прудовский, Р.Р.Гуменюк, Е.Е.Егоров, Е.М.Капник. Р.Б.Косимов, Ю.В.Федоров. Исследование природы блока пролиферации в дифференцированных клетках на модели гетерокарионов: различные типы отсутствия пролиферации в клетках при терминальной дифференцировке. Онтогенез, 1990, т. 21, N 1. с.32-40.

2. Р.Б.Косимов, С.И.Сухарев, Т.В.Поспелова, И.А.Прудовский, А.В.Зеленин. Синтез ДНК в гетерокарионах, полученных при слиянии сегментоядерных лейкоцитов и культивируемых клеток, обладающих различным пролиферативным потенциалом. Цитология, 1991, т. 33, N 2, с. 48-55.

3. Р.Б.Косимов, С.И.Сухарев, И.А.Прудовский. Позитивный и негативный контроль синтеза ДНК в сегментоядерных лейкоцитах

|эксперименты на гетерокарионах). Тезисы X Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Гродно, 1990, с.97.

4. Р.Б.Косимов. Реактивация и ингибирование синтеза ДНК в гетерокарионах сегментоядерных лейкоцитов и клеток культур, обладавших различным пролиферативным потенциалом. Тезисы IV Всесоюзной школы-семинара молодых ученых "Пер спективные направления и новые методы в молекулярной биологии". Рига, 1990, с.47.

В печать 14.03.91 Изд.гё 20п ^ор/.ат 60x84/16 Уч. -изд. л. 1,06 Печ. л. 1,^5 Тираж 100 экз.

Разгаюг.ено в ЦНШШТ1КПК

Заказ * отпечатано в ПОРЫ

иа^/ ластах, в/¿^экземплярах