Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные факторы, влияющие на формирование пигмента меланина у овец

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Основные факторы, влияющие на формирование пигмента меланина у овец"

На правах рукописи

НУРОВ УМЕДЖОН ДЖАЛОЛОВИЧ

ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФОРМИРОВАНИЕ ПИГМЕНТА МЕЛАНИНА У ОВЕЦ

Специальность: 03.01.04- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание учёной степени кандидата биологических наук

Душанбе -2013 005544932

005544932

Работа выполнена на кафедре биохимии Таджикского национального университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Коснмов Раджабек Бобораджабовпч

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

кафедры органической химии и биологии Таджикского государственного педагогического университета им. Сацриддина Айни

Бобпев Гуломкоднр Муккамоловпч

кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Таджикского Государственного Медицинского Университета им. Абуали Ибни Сино

Гулов Махмалн Коднрович

Ведущая организация: Институт животноводства АСХН РТ.

Защита диссертации состоится « £ ъ Слас.упЯ 2013 года в АЗ^а-сов на заседай™ диссертационного советгРд 737. 004.05 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, Республика Таджикистана, г. Душанбе, пр. Рудаки, 17

С диссертацией можно ознакомиться; национального университета

Автореферат разослан « <5

Учёный секретарь днссертацнонн' совета, кандидат биологических пау: доцент

Хамраблева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Установлено, что главные процессы формирования пигмента меланина осуществляются в меланоцитах - большая часть факторов, ингибирующих процесс, действует именно на этом этапе (Фирагут Дж. А. с соавторами 2007). Факторы биохимического характера, контролирующие количество и качество активных молекул фермента ти-розиназы, оказывают прямой эффект на формирование пигмента мелани-

Основным регуляторным механизмом, контролирующим эффективность работы меланоцита, следует считать изменение способности клетки поддерживать внутреннюю стабильную химическую среду (например, концентрацию цистеина или глутатиона) (Prota G. 2008). Видимо, сульфгидрильные соединения (глутатион и цистеин) подавляют активность тнрозиназы, так как связывают медь, активирующую этот фермент. Поэтому изменения концентрации SH-rpynn в среде (в цитоплазме меланоцита) оказывают непосредственное влияние на формирование пигмента меланина. Этот механизм действует при самых разнообразных обстоятельствах, либо ингнбнруя, либо интенсифицируя формирование пигмента меланина.

В качестве объекта для исследований формирования пигмента меланина мы выбрали таджикскую породу овец, так как селекционировалась она по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов. Наблюдаемое в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы в течение первых недель-месяцев постнатального онтогенеза почти полное ингибирование формирования пигмента меланина обусловлено возрастанием концентрации в крови и тканях сульфгидрильных групп, вследствие увеличения интенсивности роста пуховых и переходных волокон.

Клетки предшественников меланоцита приобретают свойства терминальной дифференцированности, когда определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процессы формирования пигмента меланина, прекращают свою функцию, но деление клеток меланобла-

стов не прекращается.

Цель п задачи исследования. Основной целью работы являлось изучение регуляторных механизмов формирования пигмента меланина, то есть выявление влияния биохимических и клеточных факторов, ингибирующих формирование пигмента меланина.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: - исследовать мнтотическую активность меланоцитов и механизм снабжения волос пигментом, провести корреляционный анализ биохимических и морфофнзиологнческих параметров, используемых для построения модели процесса формирования пигмента меланина;- изучить основные биохимические и морфофизнологические характеристики пигментогенеза, провести регрессионный анализ зависимости концентрации пигмента в волосах от отобранных параметров у ягнят различных генотипов окраски;- изучить

з

морфофизиологические процессы формирования пигмента меланина в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы различных генотипов окраски;- изучить клеточный механизм регуляции процесса формирования пигмента меланина, на модели гетерокарионов исследовать природу влияния клеточных факторов предшественника меланоцита (меланобласты) на синтез ДНК в ядрах эмбриональных фибробластов овец (ЭФО).

Научная новнзна работы. Проведены исследования биохимических и клеточных процессов ингибирования формирования пигмента меланина. Выявлен новый механизм транспортирования меланобласта, реализующийся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы, а также биохимические и клеточное основы процесса ингибирования формирования пигмента меланина.

Выяснена зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах клеток меланобластов от пролиферативного потенциала клеток ЭФО. Обнаружен до сих пор неизвестный механизм транспортирования гранул меланина волос, в процессе которого значительная часть пигмента приносится мигрирующими из зоны сосочка меланоцитами. Установлен ранее неизвестный способ переноса пигментных гранул в процессе митотического деления и миграции меланоцитов в растущие волосы.

Идентифицированы негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток предшественника меланоцита. Выявлено, что наибольшее влияние на результат процесса формирования пигмента меланина оказывают такие параметры, как содержание гранулы пигмента меланина в цитоплазме меланоцитов, число меланоцитов в области сосочка и количество митозов пигментных клеток. На модели гетерокарионов установлено угнетающее влияние клеточных факторов на различных стадиях пролиферации на синтез пигмента меланина. Установлено наличие некоторых белковых клеточных факторов, блокирующих репликацию в клетках меланобласта.

Практическая значимость работы. Результаты наших экспериментов позволяют существенно продвинуться в понимании роли митотического деления меланоцитов в процессах формирования пигмента меланина. Эти данные могут быть широко использованы при составлении рекомендации для овцеводов и целенаправленной организации селекционных работ в овцеводстве.

Научные разработки и опубликованные работы могут быть использованы при подготовке методических указаний, а также при чтении спецкурсов и проведении спецпрактикумов по биохимии животных и биохимии формирования пигмента меланина на кафедре биохимии биологического профиля ВУЗ-ов. Опубликованные материалы также могут быть широко использованы для составления методических указаний по изучению биохимии пигментации шерсти и кожного покрова.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-практической конференции «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» (Душанбе 2011), Республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное ис-

4

пользование природных ресурсов» (Душанбе 2012), на апрельских конференциях профессорского-преподавательского состава ТНУ «День науки» (2011, 2012, 2013), на конференциях и научных семинарах биологического факультетам кафедры биохимии ТНУ, на расширенном заседании кафедры биохимии ТНУ (2013).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы; объекты и методы исследования; результаты исследований), заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 117 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 11 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 131 работ, из них 36 зарубежных. Публикации. По материалом диссертации опубликовано 13 работ, из них 4 работы в журналах, рецензируемых ВАК РФ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служила таджикская порода овец. Для изучения биохимических факторов, контролирующих ингибирование формирования пигмента меланина, мы выбрали ягнят таджикской породь^овец различных генотипов окраски: черная Аа/Аа; темно-бурая А" /А Е /Е ; темно-рыжая Aw,/Awt En7Ev; рыжая Aw,/Awl EBr/EBr; светло-рыжая A*VA EBr/Ev; палевая A*1/A1"* EY/EY. Характерные свойства овец таджикской породы заключаются в том, что при достижении 8-9-месячного возраста в волосяных фолликулах (около 96%) шерстного покрова приостанавливается синтез пигмента меланина. Эта порода овец селекционировалась по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов. Клетки приобретают терминальные дифференцированные свойства, т.е. определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процесс формирования пигмента меланина, прекращают свою функцию, но деление клеток - меланобластов не прекращается, то есть синтез ДНК протекает нормально.

Для проведения исследований по митотической активности формирования пигмента меланина, образцы кожи и шерсти брались прижизненно на бочках ягнят. Волосы заливались в парафин и резались на санном микротоме. Толщина срезов составляла 7-8 .wen. Образцы кожи фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезжиривали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпонж. Полутонкие продольные серийные срезы волосяных фолликулов толщиной 2 мкм готовили на ультратоме 8800 Vltrotome III фирмы LKB (Швеция). Срезы помещали на предметное стекло и окрашивали 1% метиленовым синим, окрашивание проводили на гистологической плитке. Для исследования использовали световой микроскоп Olympus ВН 2 (Япония).

Для исследования факторов, блокирующих синтез гранул пигмента меланина (депигментации), мы использовали клетки предшественников ме-ланоцита (меланобласты), которые получали из 1,5- месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса, (1983) но с некоторыми модификациями. Эти клетки были очи-

5

щены на градиенте плотности перколла при центрифугировании в роторе БУ-40 в течение 70 мин при 1=3 ГС.

Слияние клеток осуществляли с помощью электроимпульсной установки в ходе центрифугирования. Метод разработан Абидором И.Г. и Сухаревым С.А., (1989). Партнёрами по слиянию послужили эмбриональные фибробласты овец (ЭФО), которые были получены из 1,5 месячных эмбрионов овец таджикской породы светло-рыжей или палевой окраски по методу Адамса (Адамса, 1983).

Слияние клеток предшественников меланоцита (меланобласты) и клеток ЭФО было проведено с помощью электроимпульсной установки. Метод электрослияния при центрифугировании основан на электропробое мембран контактирующих клеток. С этой целью центрифугируемые клетки подвергались в осадке действию высоковольтных электрических импульсов (2,5 - 3 кВ\см) продолжительностью 30 - 50 мкс. (Абидор И.Г. и др., 1989). После электрообработки клетки меланосомы живут, как правило, не более 14-18 ч, и поэтому через 24 ч можно избежать чрезмерных снабжений клеток-партнеров, которые трудно отличить от слияний. Через 24 ч после слияния с клетками культур ядра клеток меланосомы заметно набухают, но не теряют свою специфически овальную форму. К 36 ч после слияния ядра клетки меланосомы в гетерокарионах подвергаются дальнейшему разбуханию, однако их характерная морфология, как правило, все еще сохраняется. Следует отметить, что для изучения брались только те гетерокарионы, в которых идентификация ядра клеток меланосомы не вызывала затруднений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Митотическая активность меланоцитов и механизм снабжения волос

пигментом

В данном разделе приводятся результаты исследования нового механизма транспортирования меланобластов у ягнят таджикский породы различных генотипов окраски. Миграцию пигментных клеток из зоны сосочка фолликула в волосы бурых, рыжих и палевых ягнят таджикской породы мы рассматриваем в качестве основного механизма подавления формирования пигмента меланина (рис.1.). Проведенное нами исследование срезов волос под световым микроскопом показало, что активный процесс включения меланоцитов в волосы не является уникальным свойством таджикской породы. Причем ярко выражена связь между количеством мигрирующих в волос меланоцитов и интенсивностью пигментогенеза: у черных ягнят число пигментных клеток в волосах на порядок выше, чем у бурых или темно-рыжих и коричневы х.

Маловероятно, что данное явление было присуще исключительно овцам, очевидно, что миграция меланоцитов в волосы типична для млекопитающих вообще. Во многих случаях включенные в волосы пигментные клетки просто не были идентифицированы: так, изучение фотографий срезов волос и качественные и количественные характеристики, представленные в статьях ряда

Рис. 2. Количество меланоцитов в волосе длиной 1 мм ягнят различных окрасок

г у.ш<

авторов, свидетельствуют о том, что описанные ими скопления гранул в волосах овец (Ролдугина, 2005; Фищенко и др., 2007), кошек (Prieur, Collier, 1981), лисиц (Bradbury, Fabricant, 1988) и многих других видов млекопитающих (Searle, 2009) скорее всего являются включенными в волосы меланоц-итами.

Собранные в группы меланосомы на самом деле представляют собой пигментные клетки, мигрировавшие в волосы, которые, вероятно, включаются в волосы и при других генотипах. Для правильной интерпретации данного явления важно учитывать, что на гистологических срезах волос или тем более на просветвленных специальной обработкой "целых" волосах включенные пигментные клетки выглядят как скопления гранул. На полутонких срезах хорошо видна структура меланоцитов и их несложно идентифицировать: это крупные клетки, существенно большие по сравнению с кератиноцитами (рис. 2). Меланосомы обычно локализуются на периферии и в отростках, причем их концентрация в несколько раз выше, чем в окружающих кератиноцитах, часто можно

наблюдать ядро и ядрышки. Проведенные нами исследования показали, что существует иной ранее неизвестный способ переноса пигментных гранул - в процессе митотического деления, миграции заполненных мелакосомами меланоцитов и включения их в волосы.

Результаты наших экспериментов позволяют существенно продвинуться в понимании роли митотического деления меланоцитов в процессах формирования пигмента меланина: следует признать закономерность и регулярность митозов и миграции меланоцитов в растущие волосы, которая, вероятно, служит одним из нормальных, а не патологических механизмов снабжения их пигментом (табл.1).

Таблица I.

Количество меланоцитов и клеток матрикса в волосяных фолликулах

ДтКЛ-ч V

Окраска Количество на фолликул, шт.

Меланоцитов Клеток матрикса

Черная 93,8±8,6 274,2±25,0

Темно-бурая 18,6±2,2 507,5±51,3

Бурая 16,3±1,3 463,3±46,8

Темно-рыжая 13,3±1,1 387,5±34,4

Рыжая 6,8±0,9 263,5±31,0

Светло-рыжая 6,5±0,9 363,2±89,9

Палевая 7,6±1,1 287,5±42,4

Мы проводили исследования на образцах кожи животных, полученных через несколько дней после их рождения: в этот период уже начинается ингибирование пигментогенеза у палевых, светло-рыжих и рыжих живот-

ных. Вероятно, одним из проявлений этого явления угнетения пигментации является наблюдаемое в данном эксперименте подавление митотической активности мёланоцитов.

Корреляционный анализ биохимических и морфофизиологическнх параметров, используемых для построения модели процесса формирования пигмента мелашша При проведении корреляционного анализа ставилась задача качественной оценки характера и степени связи между изучаемыми параметрами и выявления признаков, наиболее тесно связанных с вышеназванными тремя характеристиками - критериями результативности процесса пигментогенеза. Следует подчеркнуть, что из всех параметров, используемых для корреляционного анализа, были отобраны на основе предварительно проведенного исследования связи с удельным содержанием пигмента в волосах всех показателей, полученных как в процессе измерений под микроскопом и на микрофотографиях, так и при математической обработке данных.

Исходя из общепринятых представлений, можно было предположить, что свойства пигментных клеток и эффективность их взаимодействия с кератино-цитами при транспортировании меланобластов в формирующиеся волосы являются главными факторами в исследуемом процессе. Данное положение настолько очевидно, что ни вновь обосновывать его, ни опровергать не имеет смысла. Однако имеется совершенно недостаточно подробных сведений относительно различий в морфофизиолопш и количестве пигментных клеток в волосяных фолликулах ягнят различных генотипов, а также об особенностях и вариантах переноса гранул меланина в волосы ягнят различных генотипов окраски.

Нам не известны также работы, в которых проводился бы специальный анализ влияния биохимических и морфологических свойств фолликула на течение процессов формирования пигмента меланина. В то же время очевидно, что нельзя недооценивать роль фолликула как среды, в которой осуществляется пигментогенез.

Корреляционный анализ позволил отобрать основные параметры, которые в наибольшей степени связаны с удельным содержанием пигмента в волосах. В соответствии с результатами этого анализа их можно расположить в порядке значимости в детерминации интенсивности процессов формирования пигмента меланина: 1. Расстояние между зоной, занимаемой меланоци-тами, и внутренним влагалищем; 2. Абсолютное количество митозов мёланоцитов; 3. Объем меланоцита; 4. Количество мёланоцитов в зоне сосочка волосяного фолликула; 5. Развитие отростков мёланоцитов; 6. Объем ядра меланоцита; 7. Объем ядрышек меланоцита; 8. Объем луковицы волосяного фолликула; 9. Объем сосочка волосяного фолликула.

Прежде всего, подчеркнем еще раз, что первые семь параметров прямо, а два последние косвенно связаны с активностью мёланоцитов, их численностью на сосочке и эффективностью процесса транспортирования мела-нобласта в формирующийся волос, т. е. никаких неожиданных выводов при проведении корреляционного анализа не получено. Пять других параметров: расстояние между зоной мёланоцитов и внутренним влагалищем, ко-

личество митозов меланоцитов, количество меланоцитов в зоне сосочка фолликула, объем луковицы и сосочка фолликула логически связаны и тесно коррелируют друг с другом.

Действительно, митотическая активность меланоцитов непосредственно определяет их количество, что в свою очередь обуславливает степень "оккупации" пигментными клетками пространства луковицы фолликула. В то же время абсолютное число митозов меланоцитов зависит от имеющегося в фолликуле общего количества пигментных клеток, которое при прочих равных условиях непосредственно обусловлено размерами луковицы и развитием сосочка.

Фактически, лишь один параметр из 9 отобранных - «развитие отростков меланоцита», может быть оценен как достаточно независимый от других морфофизиологических параметров: можно предположить, что это свойство пигментной клетки строго детерминируется генетически. Однако трудно представить себе полную независимость такого "физиологичного" процесса, как способность клетки образовывать отростки, заполненные мела-нобластами и проникающие между кератиноцитами. Все данные свидетельствуют о том, что неспособность меланоцитов (например, палевых ягнят таджикской породы) формировать отростки является не результатом мутации, непосредственно влияющей на этот признак, а следствием генетически детерминированного ослабления способности пигментных клеток к пролиферации и снижения функциональной активности.

Видимо, и этот параметр нельзя считать независимым, что подтверждают достоверные коэффициенты корреляции с большинством отобранных признаков: объемом меланоцита, ядра и ядрышек, количеством митозов. Очевидно также, что все семь первых параметров в значительной мере зависят от величины луковицы и сосочка волосяного фолликула, поскольку фолликул является средой, в которой осуществляются все процессы пиг-ментогенеза.

Таким образом, девять отобранных параметров в той или иной степени связаны друг с другом. Иная ситуация была бы противоестественна, поскольку исследуется сложная биологическая система, в которой все процессы осуществляются в комплексе, во взаимодействии. Абстрагируясь от некоторых деталей, можно утверждать, что концентрация гранул в волосе определяется качественными характеристиками пигментных клеток, их количеством в зоне сосочка и характером локализации относительно внутреннего влагалища. Чем эффективнее меланоциты синтезируют гранулы, чем они многочисленнее и чем меньше свободного пространства оставляют клеткам матрикса для "беспрепятственного движения через контролируемую" ими зону, тем более насыщен гранулами будет волос.

Возможно, тот же фактор оказывает прямое воздействие и на качество синтезируемого меланина. Было показано, что переход к синтезу феомеланина сопровождается существенным снижением концентрации меланобластов в волосах и изменением морфофизиологии количества пигментных клеток. Эти два процесса тесно взаимосвязаны.

Регрессионный анализ зависимости концентрации пигмента в волосах от отобранных параметров

Характер влияния каждого из рассматриваемых факторов на выходные параметры процесса формирования пигмента меланина-удельное содержание пигмента в волосах - четко проявляется при анализе формы и угла наклона Линий регрессии.

На рис. 1 и 2 графически представлен корреляционный анализ концентрации гранул меланина в волосах между зоной меланоцитов и внутренним влагалищем у новорождённых ягнят таджикской породы и зависимость концентрации гранул в волосах от расстояния между зоной, занимаемой меланоцитами, и внутренним влагалищем, показано также распределение индивидуальных значений-параметров. Очевиден нелинейный характер зависимости, своеобразным ключевым пунктом является область 17-18 мкм.

________рис. 3,

К'орреляцгюнныГ[анализ концентрации гранул меланина в волосах между зоной меданощпов к внутренним влагалищем у новорожденныхЯГНЯ1 таджикской породы (ДЛИНОЙ -1мкм3)

ю 20 30 40 50 60 70 80 90 100

— ♦ -Зависимость конценг^мции гранул й волосах ст расстояния между зоной, занимаемой меланоцитами

—■—Зависимость концентрации гранул в волосах ст расстоянии между зоной, занимаемой внутренним влагалищем

_____________________________ Рис. 4.

Корретгятягонншганаттт чатгспмоеттг юнпентратрпг гранул к волосах от расстояния ме;4ау 'зоной, занимаемой чеаднещпамп. н внутренним влагалищем (дплноГЫмкм5)

О _______________

ю 20 30 ¿0 50 60 70 80 90 100 — ♦ - Зависимость концентрации гоанул меланина а волосах по количеству митозов

И Зависимое & концентрации гэанул меланина в волосах по волосеной фаликул

При увеличении свободного от меланоцитов пространства уже не происходит заметного уменьшения концентрации гранул в волосах, так как кера-тиноциты могут совершенно беспрепятственно проходить через такие широкие "ворота", не встречая на пути меланоцитЫ, в дальнейшем расширении границ уже нет необходимости. Видимо, при такой ситуации снабжение

волос гранулами меланина может осуществляться, главным образом, за счет поглощения меланобластов из отростков меланоцитов (рис. 3).

________Рис. 5.

Корреладюшып анализ зависимости концгнтрщгаг гранул к

волосах от величины меяанощпов у новорожденных ягнят

— ♦ - Зависимость концентрации пи ментов гранул з золосахэт обьема мелансцитоз

ш Зависимость конценрами гоанул меланина от возрастание удельно осодер.-<; шя

гранул в волосах _______

В то же время сужение "ворот" приводит к резкому возрастанию удельного содержания пигмента в волосах, причем угол наклона линии регрессии становится все более острым по мере уменьшения расстояния (табл. 2).

Таблица. 2

Коэффициент множественной регрессии и множественной корреляции

для ягнят таджикской породы черной и светло-бурой окрасок

Коэффициенты множественной регрессии Коэффици-

э енты мно-

8 Ьо ь, Ь2 Ьз Ь4 Ь5 ь6 ь7 ь8 жествен-

к ной

о Корреля-

ции

0,500 0,483 0,6168

0,709 -0,160 0,387 0,6437

0,853 -0,432 -0,227 0,723 0,6646

1 0,801 0,148 -0,551 -0,193 0,734 0,6765

о- « 0,911 0,326 -0.461 -0,264 0,733 -0,337 0.7119

хг 0,924 0,270 -0,477 -0,267 0,767 -0,373 0,072 0,7145

0,912 0,257 -0,469 0,030 -0,260 0,762 -0,374 0,065 0.7157

0,928 0,249 -0.458 0,032 -0,260 0,753 -0,020 -0,367 0,065 0,7157

0,628 0,392 0,7090

0,625 0,302 0,102 0,7205

1 0,630 -0,092 0,357 0,133 0,7237

1 0,571 -0.074 0.044 0,370 0,130 0,7255

0,538 -0,086 0,045 0,053 0,359 0,129 0,7263

§ 0,516 -0,097 0,047 0,035 0,064 0,347 0,127 0,7268

о 0,519 -0,101 0,014 0.046 0,035 0,060 0,339 0,128 0.7270

0,533 -0,095 -0,030 0,016 0,044 0,050 0,057 0,340 0,125 0,7271

Особенно существенен рост концентрации меланина в волосах, когда

расстояние между зоной меланоцитов и внутренним влагалищем оказывается меньше размера кератиноцита.

Вторым по значимости параметром, согласно проведенному корреляционному анализу, является зависимость концентрации гранул в волосах от величины меланоцитов в волосяных фолликулах у новорожденных ягнят таджикской породы.

Нами выявлена зависимость концентрации гранул в волосах от величины этого признака, показан характер распределения индивидуальных значений параметров. Отдельные точки располагаются по вертикальным линиям на графике, потому что число митозов измерялось в штуках и не выражалось дробной величиной. Для анализа используются данные ягнят таджикской породы различных генотипов окрасок. Видно, что регрессионная зависимость не отличается принципиально от линейной (рис.3).

Еще более четко зависимость концентрации гранул в волосах от количества митозов меланоцитов проявляется при исследовании ягнят таджикской породы различных генотипов окраски (без светло-рыжих и палевых).

Рис. 6.

Корреляционный анализ зависимости концентрации пигментных гранул в волосах от объема меланоцитов у новорожденных ягнят таджикской породы (длиной -1 мкм3)

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 — ♦ - Зависимость содержании пигментах с волосах от объема ядер меланоцитов

—в— Зависимость содержания пигментах в волосах от объема пигментных клеток

Отличие от линейной зависимости также не проявляется достаточно четко, однако при увеличении объема меланоцита более 3000 мкм3 наблюдается несколько более интенсивное возрастание удержания гранул в волосах. Действительно, самые крупные меланоциты локализованы в остевых фолликулах черных ягнят (рис.4).

Зависимость удельного содержания гранул в волосах от количества меланоцитов в фолликулах проявляется четче для ягнят таджикской породы, чем при анализе во всей базе данных.

Это объясняется тем, что в фолликулах черных ягнят таджикской породы меланоциты очень крупные, но их относительно меньше, чем, например, в светло-бурых фолликулах ягнят таджикской породы, что ослабляет связь между числом пигментных клеток и содержанием гранул. При анализе характера волос от объема ядер меланоцитов наблюдается приблизительно та же закономерность, что и для объема пигментных клеток .

Рис. 7.

Корреляционный анализ завпсимосшжониешрацш! гранул в волосах от развшия отростков пюешных клехоку новорожденных ягнят тгданкскон породы (данной-1ьям3)

10 23 30 40 50 СО 70 30 £0 - 4 -Згбиашость содержания гигментсз о волосгх от объема ядез меланои.поь

-♦-ЗгБисиккть содержания гигмонтсз и волоса от обьсма питонтных ллотск

Зависимость концентрации гранул в волосах от развития отростков пигментных клеток близка к линейной (рис. 5). Зависимость выражена довольно четко, о чем свидетельствует достаточно крутой подъем линии регрессии при относительно невысоком разбросе индивидуальных значений. Была показана зависимость концентрации гранул в волосах от объема луковицы волосяного фолликула (табл. 3).

Таблица. 3.

Влияние объема луковицы волосяного фолликула на формирование

пигмента меланина при включении связи, между параметрами

Объем луко- Тип фолли- Уравнение регрессии

вицы фолли- кула

кула Черная Темно Бурая Темно Все особи

бурая рыжая Рыжая таджикской

породы

Средний для 1 273 166 83 84 71 101

пухового 2 274 166 82 85 72 101

фолликула 3 270 168 83 86 71 100

Средний для 1 370 202 108 116 83 152

переходного 2 370 201 107 115 83 153

фолликула 3 351 202 108 117 82 153

Средний для 1 806 333 190 233 123 333

остевого 2 804 335 191 231 124 334

фолликула 3 805 336 191 231 123 335

Таблица 4.

Коэффициенты множественной регрессии и множественной корреляции для ягият таджикской породы для фолликулов различных типов

ч &

§

О С

Ь„

Коэффициенты множественной регрессии

Ь,

Ь3

Ь4

ь8

Коэф-фнци-енты множественной Корреляции

С

0,503 1,344 1,199 1,061 1,112 1,017 1,007 1,050

0.076 0,074

0,107

0,482 0,316 0,213 0,180 0,204 0,155 0,163 0,162

-0,804 -0,703 -0,704 -0,706 -0,664 -0.616 -0,618

0,164 0,173 0,240

0,176 0,195 0,140 0,157 0,197

0,223 0,217 0,213 0,223 0,225 0,228

-0,111 ■0,131 0,116 0,122

0,627) 0,7161 0,7579 0,7645 0,7722 0,7776 0,7787 0,7792

з §

о. о С

0,337 0,876 0,618 0,623 0,782 0,746 0,677

0,566 ■0,504 ■0,355 0,312 0,311 0,332

0,244 0,218 0,184 0,176 0,176

0,061 0,066

-0,146 -0,116 -0,104

0,076

0.058

0,656 0,650 0,615 0,632 0,558 0,535 0,520

-0,155 -0,183 0,166

0,7826 0,8492 0,8615 0,8677 0,8735 0, 8745 0,8756

0,300 0,656 7 7 0,7124

-0,015 0,425 0,576 0,7813

О 0,223 -0,177 0,418 0,446 0,7903

8 0,272 -0,370 -0,140 0,710 0,455 0,7955

0,143 -0,390 -0,099 0,723 0,106 0,463 0,7976

0,146 -0,375 0,056 -0,097 0,704 0,098 0,418 0,7992

0,230 -0,344 0,067 -0,102 0,660 0,089 0,422 -0,076 0,8001

0,240 Н0.057 -0,338 0,068 -0,096 0,663 0,098 0,423 -0,054 0,8003

Эта зависимость менее выражена при объединении ягнят таджикской породы разных генотипов окраски в одну группу и довольно четко проявляется внутри каждого генотипа. Это можно объяснить тем, что характер связи в каждой группе имеет определенную специфику, что видно из различного наклона линий регрессии (табл. 4).

Причем отноаггельное влияние каждого из параметров на течение процесса питенгогенеза и форма их взаимодействия могут быть различным! в волосяных фолликулах ягнят различных пород и генотипов окраски, а также в фолликулах, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы.

Особый интерес здесь представляет исследование характера действия генов, контролирующих процессы формирования пигмента меланина: выявление их эффектов наморфофгоиологическом уровне.

Трудность выражения концентрации меланобластов в волосах в форме окраски шерстного покрова состоит, прежде всего, в том, что волосяной покров овец состоит из волос разных типов (пуховых, переходных и остевых), содержащих различное количество пигмента, т. е. по- разному окрашенных (табл. 5).

Таблица 5.

Формирование пигмента меланина в волосяных фолликулах малого и _большого объема для ягнят таджикской породы_

Тип фолликула Объем фолликула (в мкм) Количество меланоцитов на 1 фолликул (шт)

Темно бурая Бурая Темно рыжая Рыжая

Пух 10,0-29,9 122 77 124 66

Переходный волос 30,0-49,9 329 152 188 101

Ость 50,0- 99,9 503 278 289 123

Примечание; Данные натурных экспериментов свидетельствуют о том, что черные рецессивные и доминантные особи (Аа/Аа и Е/Е ) при любой структуре шерстного покрова остаются черными: поскольку формирование пигмента меланиНа у них весьма интенсивно* reiibt модификаторы не оказывают заметного влияния. Поэтому в этом разделе не рассматриваются животные этих генотипов окраски

Причем, как известно, структура шерстного покрова, т. ё. относительное содержание пуха, переходного волоса и ости, существенно различается у овец различных пород и даже у особей одной породы. Кроме того, относительный вклад в формирование окраски волос различных типов совсем не пропорционален их относительному содержанию в шерстном покрове, так как, например, пух, за некоторым исключением, короче ости и особенно у ягнят вносит малый вклад в окраску. При разработке метода преобразования концентрации пигментных гранул в волосах различных типов в окраску шерстного покрова все эти обстоятельства учитывались.

Роль величины луковицы волосяного фолликула в формировании пигмента меланина

В модели предусмотрена возможность включения и выключения взаимосвязи входных параметров: при выключении зависимости параметров друг от друга можно задавать произвольные значения каждого из параметров, при этом возможны любые их комбинации, которые не Могут наблюдаться в натурном эксперименте. Пользуясь этой возможностью, можно, не прибегая к дополнительным затратам, проверить Многие идеи, в частности, выявить роль отдельных параметров.

Роль каждого из включенных в модель параметров в той или иной мере ясна, однако значите величины луковицы и сосочка волосяного фолликула ранее обсуждалась лишь умозрительно, исходя га морфофизиолопиеских концепций. Поэтому был поставлен следующий вычислительный эксперимент. Объемы луковиц и сосочков пуховых, переходных и остевых фолликулов были зафиксированы в одном и том же значении для ягнят каждой окраски (приблизительно в соответствии со средними для таджикской породы реальными данными); все остальные параметры также фиксировались, но значения были одинаковы для всех типов фолликулов на каждом этапе эксперимента (при этом значения nais

раметров брались не произвольно, а в соответствии со средними для отдельных окрасок и типов фолликулов).

Прежде чем начать анализ вышеприведенной таблицы, еще раз подчеркнем, что вычислительный эксперимент проводился в режиме выключения взаимосвязей входных параметров, при этом каждый морфофизиологический показатель оказывал самостоятельное влияни на результат процесса формирования пигмента меланина. Очевидно, что при этих условиях фиксированные значения объема фолликулов, формирующих пуховые, переходные и остевые волосы, оказывали влияние на выходные параметры модели, точно соответствующее их коэффициенту в уравнении множественной регрессии. У особей, формирование пигмента меланина которых описывается уравнением с низкими коэффициентами для объемов луковицы и сосочка фолликула (черные, бурые, темно-рыжие), различия в концентрации меланобластов в пуховых, переходных и остевых волосах несущественны (что логично, так как остальные параметры для всех типов фолликулов идентичны на каждом этапе эксперимента). Для темно-бурых и рыжих особей объем фолликула имеет принципиальное значение, соответствующие коэффициенты в уравнениях наиболее высокие. Причем эта закономерность особенно четко проявляется у особей темно-бурой окраски, когда входные параметры модели имеют низкие значения.

Очевидно, что величина луковицы и сосочка могут столь ярко демонстрировать свое самостоятельное влияние на результат процесса формирования пигмента меланина лишь в искусственных условиях отклонения взаимосвязей между параметрами. Реально фолликул является средой, детерминирующей характер реализации генетического потенциала развития всех параметров, определяющих эффективность формирования пигмента меланина. Это можно представить себе следующим образом: в эмбриогенезе при формировании волосяных фолликулов различных типов в них мигрируют меланобласты, которые митотически размножаются и заселяют область сосочка; морфофизиологические характеристики сформировавшихся меланоц-итов, их количество и характер взаимодействия с окружающими клетками есть результат реализации их генотипа в среде данного фолликула.

Данное положение хорошо иллюстрирует вычислительный эксперимент, в котором фиксируется объем луковицы волосяных фолликулов и включается реально существующая взаимосвязь между признаками. Действительно, данные таблицы однозначно свидетельствуют о том, что развитие всех исследуемых входных параметров, равно как выходные параметры модели, жестко детерминируется генотипом и объемом луковицы фолликула. Мы полагаем, что вышеприведенный анализ является хорошим объяснением того, почему у млекопитающих пух всегда слабее пигментирован по сравнению с остью, что особенно ярко проявляется у животных бурой и рыжей окрасок.

Влияние структуры, густоты и скорости роста шерсти

В натурном эксперименте, проведенном на ягнятах таджикской породы, различающихся по густоте шерстного покрова, было показано четко выраженное ингибирующее влияние на формирование пигмента меланина возрастания густоты шерстного покрова. Анализ свидетельствует о том, что

16

увеличение скорости роста волос имеет тот же эффект, угнетающий пиг-ментогенез.

Овцы разной окраски различаются по структуре, густоте и скорости роста шерсти. Влияние этого уникального разнообразия на течение процессов пигментогенеза по понятным причинам невозможно исследовать в натуральном эксперимента. Данная проблема исследовалась в специально проведенном вычислительном эксперименте, результаты которого представлены в табл. 3 и 4.

В этих экспериментах важно было показать процесс и направление изменения характера формирования пигмента меланина параллельно изменению структуры, густоты и других характеристик шерстного покрова. При этом ставилась задача выявления существующих закономерностей, а не получения точных количественных данных.

Результаты моделирования свидетельствуют о том, что характер шерстного покрова оказывает принципиальное влияние на течение формирования пигмента меланина, что в полной мере совпадает с ранее проведенным анализом выдвинутой гипотезы и ее подтверждением в натурном эксперименте.

Согласно выдвинутой теории, причиной ингабирования пигментогенеза является ярко выраженное развитие шерстных качеств в постнаталь-ном онтогенезе ягнят. Оно заключается в возрастании густоты и скорости роста шерсти. При этом рассматривается влияние на формирование пигмента меланина трех вариантов развития шерстных качеств. Из полученных данных следует, что у лучших по шерстным характеристикам ягнят происходит абсолютное ингибирование пигментогенеза, а среди большинства ягнят, характеризующихся средним для породы развитием шерстности, если они темно-бурые или темно-рыжие, полного подавления формироваши пигмента меланина не достигается. Худшие же по шерстным качествам ягнята остаются пигментированными в различные оттенки рыжей окраски. Это надо понимать следующим образом: после первой стрижки (в возрасте 4,5 - 5 мес.) в шерстном покрове ягнят сохраняется некоторое количество пигментированных остевых и переходных волос, которые и могут создавать эффект чало-рыжей окраски; в случае светло-рыжей и палевой окрасок пигментация практически незаметна.

На основании полученных данных также можно прийти к заключению, что у изученных ягнят значительная часть меланина приносится в волосы мигрирующими меланоцитами. Причем процессу включения пигментных клеток в волосы, видимо, предшествует их деление: картину, свидетельствующую о такой последовательности событий, можно наблюдать в волосяных фолликулах ягнят различных генотипов, особенно четко она выражена у черных и темно-бурых ягнят. Мелацоциты, видимые в световой микроскоп (на полутонких срезах), лежат очень плотно друг к другу и их митотическое деление может происходить в любой зоне их типичной локализации, как у основания сосочка, так и в области его вершины.

По окончании митоза одна из двух дочерних клеток сохраняет свою позицию на поверхности сосочка, а другая смещается к периферии или

апикальной части фолликула и вовлекается потоком кераноцитов в зону корня волоса. Причем обе дочерние клетки содержат большое число ме-ланиновых гранул. Данная закономерность проявляется в максимальной степени в меланоцитах светло-рыжих и палевых ягнят, функциональная активность которых к моменту взятия биопсии кожи уже в значительной мере подавлена, а митотическая активность ингибирована полностью.

Здесь отметим, что частота митозов пигментных клеток, несомненно, является одним из главных факторов, обуславливающих в комплексе, во взаимодействии с рядом других фундаментальных генетически контролируемых свойств меланоцитов эффективность процесса пигментогенеза. Наиболее результативно, мощно работающие меланоциты черных таджикских ягнят характеризуются максимальным митотическим индексом, а угнетенные пигментные клетки светло-рыжих и палевых ягнят уже не способны митотически делиться.

Концентрация гранул в пигментных клетках оказывается достаточно стабильной величиной и, вероятно, ингибирование меланогенеза (по крайней мере для изученных в наших экспериментах случаев) осуществляется именно путем нарушения нормального взаимодействия меланоцитов с кера-тиноцитами (у палевых ягнят практически отсутствуют отростки пигментных клеток) и подавления митотической активности (что действительно подтверждено нашими экспериментами). Видимо, угнетение способности меланоцитов к синтезу меланосом и формированию меланопротеида в них осуществляется на самом последнем этапе.

Выяснение природы влияния клеточных факторов предшественника меланоцита (меланобласты) на синтез ДНК в ядрах эмбриональных фнбробластов овец (ЭФО)

В экспериментах, проведенных главным образом на лабораторных млекопитающих, установлены общие особенности формирования пигмента меланина и определены основные этапы генетической детерминации пигментации шерстного покрова (Альберте Б.Д. и др., 2002). В литературе имеются данные о природе блока пролиферации различных типов клеток, где выявлены клеточные факторы, контролирующие блокировки пролиферации у клеток перитонального экссудата и других клеток лабораторных животных (Прудовский И. А. 1991).

В подавляющем большинстве случаев ядра терминально дифференцированных клеток характеризуются диплоидным содержанием ДНК. Это дает основание считать, что в процессе дифференцировки они были блокированы в О] периоде клеточного цикла. При переводе этих клеток в культуру они не вступают в синтез ДНК, несмотря на присутствие в среде различных факторов роста. Какие механизмы предотвращают вступление дифференцированных клеток в репликативный период, остается невыясненным.

Можно представить себе несколько возможностей: 1. Постоянная продукция внутриклеточных негативных регуляторов, предотвращающих вступление ядер дифференцированных клеток в 8-период клеточного цикла. 2. Продукция высокостабильных негативных регуляторов на заключи-

18

тельных стадиях дифференцировки и их сохранение в дифференцированных клетках в течение всего срока существования последних. 3. Происходящее в процессе дифференцировки изменение структуры ключевых генов, отвечающих за подготовку клеток к вступлению в Б-период клеточного цикла.

Таблица 6.

Синтез ДНК в гетерокарионах предшественника меланоцита и клеток

асинхронных культур эмбриональных фнбробластов овец (ЭФО)

Время после слияния (ч) 18 24 36

Меченые неслившие-ся клетки культуры (%) 11,5 ±3,2 1Э,2±2,0 62,4+5,4

Меченые ядра клеток культуры в гетерокарионах (%) 16,5 ±3,6 1Я,3±5,4 53,5±5,7

Получение гетерокарионов клеток предшественников меланоцита (меланобласты) и клеток с ограниченной способностью к пролиферации -меланобластов было проведено с помощью электроимпульсной установки. Клетка с ограниченной способностью к пролиферации - ЭФО (эмбриональный фибробласт овец) была партнером клетки предшественник меланоцита по слиянию. Нам стало интересно выяснить природу влияния клеточных факторов, имеющих диплоидный эмбриональный фибробласт овец.

Для получения гетерокарионов «эмбриональный фибробласт овцы + клетки предшественника меланоцита» культуру клетки меланобласта, йо-лучали из 1,5-месячного эмбриона овцематок таджикской породы, имеющего палевую окраску и кроющие волосы на голове. В гетерокарионах предшественника меланоцитов и клеток с ограниченной способностью к пролиферации эмбриональный фибробласт овец не было обнаружено достоверного снижения доли синтезирующих ДНК ядер клеток культур по сравнешно с неслившнмся клетками (табл. 6)

Предварительные исследования показали, что при инкубации в течение 18, 24 и 36 ч в полной культуралыюй среде с 3Н-тимиднном более чем 60 % метки включается в ядра ЭФО и клеток предшественника меланоцита. Через 24 ч после слияния клеток предшественника меланоцита + ЭФО, примерно в 17% гетерокарионов с ядрами ЭФО, синтезировавшими ДНК, происходит подавление реплИкацци в ядрах последнего.

Более продолжительная инкубация, до 36 ч, приводит к существенному увеличению индекса подавления синтеза ДНК в ядрах клеток ЭФО. В отдельных опытах обнаружено более сильное подавление синтеза ДНК в ядрах ЭФО. Индекс подавления составлял через 24 ч 52-56%, а к 36 ч существенно не изменялся. Возможно гены, контролирующие блок пролиферации клеток предшественника меланоцита, локализованы в одном локусе с генами, подавляющими формирование пигмента меланина. Однако в опытах с асинхронными культурами можно было и не заметить угнетения вступления ядер в Б-период* если в момент слияния лишь относительно небольшая доля клеток находилась в С]. Поэтому были проведены специ-

19

альные опыты по слиянию предшественника меланоцита с синхронизированными ЭФО, находящимися на разных этапах выхода из состояния покоя. После 5 суток пребывания в среде с 0,25% сыворотки клетки стимулировали к пролиферации средой с 10% сыворотки и сливали с макрофагами через 2, 8, 12 и 20 ч после стимуляции. Ни в одном случае, даже через 2 ч после стимуляции, то есть в момент перехода из Go в Gi, когда по имеющимся литературным данным фибробласты наиболее чувствительны к эгзогенным негативным регуляторам пролиферации, не было обнаружено ингибирующего действия предшественников меланоцита на ядра ЭФО.

В опытах по слиянию предшественника меланоцита с асинхронными клетками ЭФО было обнаружено достоверное снижение частоты синтеза ДНК в ядрах клеток культур в гетерокарионах по сравнению с несливши-мися клетками (табл. 6). Сама по себе процедура слияния не вызывала подавления синтеза ДНК в ядрах клеток культур, что было показано при определении частоты синтеза ДНК в гомокарионах. Представляло интерес выяснить, блокируют ли предшественники меланоцита уже идущий синтез ДНК или же только предотвращают вступление ядер клеток-партнеров в S-период. ЭФО переводили в состояние покоя, затем сливали с предшественниками меланоцита и стимулировали к пролиферации сывороткой. Клетки предшественники меланоцита эффективно ингибировали вступление ядер клеток-партнера в S-период. Ингибирующий эффект предшественников меланоцита был выражен гораздо сильнее, чем в опытах с асинхронными клетками.

В отдельном опыте продемонстрировано, что слияние предшественника меланоцита с ЭФО не приводит к подавлению уже идущего синтеза ДНК. Действительно, в гетерокарионах асинхронных ЭФО и предшественника меланоцита через 2-6 ч после слияния не было обнаружено достоверного снижения доли репликацирующих ядер ЭФО. Слияние предшественника меланоцита с ЭФО в различные сроки после стимуляции к пролиферации показало, что ЭФО утрачивают чувствительность к инги-бирующему эффекту эритроцитов через 15-18 ч после стимуляции, то есть в тот момент, когда часть ЭФО уже входит в S-период. Таким образом, можно считать, что ЭФО чувствительны к ингибирующему эффекту предшественника меланоцита в Gi - периоде клеточного цикла.

Таким образом, слияние с клетками предшественника меланоцита, влияет на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО и подавляет вступление последних в S-период. Было необходимо выяснить, влияет ли слияние клеток ЭФО с клетками предшественника меланоцита, на текущий синтез ДНК в ядрах ЭФО. С этой целью клетки предшественника меланоцита, сливали с ЭФО частично синхронизованными в S-фазе клеточного цикла (24 часа после сывороточной стимуляции покоящейся культуры). Фиксацию проводили через 2 и 4 ч после слияния. Индекс реактивации в ядрах предшественник меланоцита, через 2 ч и 4 ч после слияния существенно уменьшался.

В опытах по слиянию предшественника меланоцита с клетками асинхронных культур было показано, что предшественники меланоцита обла-

дают ингнбирующим действием на синтез ДНК в ядрах ЭФО. Коэффициент подавления репликации составляет для ЭФО 31-37% (табл. 7).

Таблица 7.

Синтез ДНК в ядрах синхронных клеток эмбриональных фибробла стов овец в гетерокарионах с предшественниками меланоцита

Культура, Синхронизация Меченые неслившиеся клетки (%) Меченые ядра клеток культуры в гетерокарионах (%)

ЭФО - 53,6±3,4 31,3±2,1

ЭФО - 58,0±3,6 37,0±2,5

ЭФО Не 78,3±4,1 26,8±1,9

ЭФО Не 43,0±2,8 16,07±1.3

ЭФО См 59,0±3,7 16,08±1,5

не- синхронизация с помощью низкой концентрации сыворотки см- синхронизация путем встряхивания метафаз.

В специальных опытах выясняли внутриклеточную локализацию негативных регуляторов репликации в клетках предшественников меланоцита. Клетки предшественника меланоцита энуклеировали с помощью цитоха-лазина В путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла по Wigler М.Н. and Weinstein J. В. (1995). Полученные кариопласты содержали ядра, окруженные очень тонким ободком цитоплазмы. При слиянии ка-риопластов предшественника меланоцита с ЭФО через 24 ч не было обнаружено подавления синтеза ДНК в образующихся кариобридах.

Таблица 8.

Синтез ДНК в кариобридах ЭФО + карнопласт предшественника ме-

ланоцита (24 часа после слияния

Опыт № Доля меченых среди неслившихся ЭФО Доля меченых ядер ЭФО в кариобридах (%) Индекс подавления (%)

1 75,2±4,3 74,0±4,3 1,6

2 87,5±3,3 97,2±7,4 9,5

Полученные данные позволяют предположить, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме предшественника меланоцита. Результаты этих опытов приведены в таблице 8. Полученные результаты позволяют считать, что негативные регуляторы синтеза ДНК локализованы не в ядре, а в цитоплазме клеток предшественника меланоцита.

После обычной процедуры очистки клетки предшественника меланоцита, инкубировали в течение 4 ч при 37° в полной культуральной среде с 5 мкг\мл циклогексимида. (В контроле проводили аналогичную инкубацию, однако в этом случае среда не содержала циклогексимида). Затем клетки отмывали от циклогексимида и сливали с асинхронными ЭФО.

Оказалось, что предобработка клеток предшественника меланоцита циклогексимидом снижала более чем в 2 раза ингибирующий эффект кле-

ток предшественника меланоцита на синтез ДНК в ядрах ЭФО. Полученные данные позволяют сделать вывод, что ингибиторы репликации из клеток предшественника меланоцита имеют белковую природу и постоянно синтезируются в клетках предшественника меланоцита.

Таблица 9.

Влияние предобработки клеток предшественника меланоцита цик-логексимидом на их способность ингибировать синтез ДНК в гетеро-

карионах с ЭФО

Предобработка Опыт Доля меченых среди Доля меченых Индекс по-

предшественни- № несливщихся ЭФО ядер ЭФО в гете- давления (%)

ка меланоцита (%) рокарионах (%)

циклогексими-

дом

опыт (+) 1 86,5±3,4 64,8±8,4 24,3

контроль (-) 1 86,7±3,4 31,5±8,9 63,4

опыт (+) 2 86,8±3,6 63,6±8,3 26,5

контроль (-) 2 86,5±3,5 32,9±9,5 60,8

Опыты с кариобридами отчетливо указывают на цитоплазматическую локализацию негативных регуляторов в клетках предшественника меланоцита. Подавляющий эффект клеток предшественника меланоцита на репликацию в гетерокарионах не связан со снижением общей транскрипционной активности в ядрах клеток-партнеров. По-видимому, если он и опосредован снижением экспрессии генов, то только определенных, ответственных за подготовку клеток к S- периоду (табл. 9).

Ранее другим автором в такого рода опытах in vitro было доказано, что факторы, предотвращающие репликацию, присутствуют в «стареющих» клетках и влияют на клетки находящихся в состоянии искусственно вызванного покоя фибробластах овец (Жилякова B.C., 2001). Предстояло выяснить, блокируют ли клетки меланомы уже идущий синтез ДНК или же только предотвращают вступление ядер клеток-партнеров в S - период клеточного цикла. Клетки предшественника меланоцита эффективно ин-гибировали вступление ядер клеток-партнеров в S -период. Ингибирую-щий эффект клеток предшественника меланоцита был выражен гораздо сильнее, чем в опытах с асинхронными клетками. В опытах по слиянию синхронных клеток ЭФО с клетками предшественника меланоцита синхронизацию проводили путем сбора метафаз после действия нокодазола, поскольку все эти клетки не переходят в состояние покоя. Слияние проводили через 2 ч после метафазы, когда клетки культур находились в Gi. Однако в этом случае, как и в опытах с асинхронными клетками, не удалось обнаружить ингибирующего эффекта клеток предшественника меланоцита.

Таким образом, опираясь на результаты этих опытов, мы попытались идентифицировать негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток предшественника меланоцита, а также охарактеризовать кодирующие их гены. Большой интерес вызвало проведение частичных анализов регуляции синтеза ДНК в гетерокарионах, образованных активно проли-ферирующими клетками и клетками предшественника меланоцита, полученными у овец наиболее светлой окраски шерсти. Известно, что у этих

животных активность меланоцнта уже почти подавлена. В гетерокарионах клеток предшественника меланоцнта и клеток с ограниченной способностью к пролиферации (ЭФО) не было обнаружено достоверного снижения доли синтезирующих ДНК ядер клеток культур, по сравнению с неслив-шимися клетками

Выводы

1. Установлено, что наибольшее влияние на результат процесса формирования пигмента меланина оказывают такие параметры, как содержание гранулы пигмента меланина в цитоплазме меланоцитов, число меланоцитов в области сосочка и количество митозов пигментных клеток. Эти параметры в значительной мере зависят от величины луковицы и сосочка волосяного фолликула.

2. Выявлены основные типы и механизмы миграции меланоцитов у ягнят таджикской породы овец различных генотипов окраски. Установлено, что неспособность меланоцитов формировать отростки является не результатом мутации, непосредственно влияющей на этот признак, а следствием генетически детерминированного ослабления способности пигментных клеток к пролиферации и снижения функциональной активности.

3. Показано, что существует иной, ранее неизвестный способ переноса пигментных гранул в процессе митотического деления и миграции ме-ланощгтов в растущие волосы, который, вероятно, служит одним из нормальных механизмов снабжения их пигментом. У изученных ягнят значительная часть меланина приносится в волосы мигрирующими меланоцитами.

4. Обнаружена закономерность и регулярность митозов и миграции меланоцитов в растущие волосы, которые служат одним из нормальных механизмов снабжения их пигментом. По мере ослабления интенсивности процесса формирования пигмента меланина закономерно понижается митотическая активность пигментных клеток, что довольно четко Проявляется при сравнении черных, темно-бурых, бурых и темно-рыжих ягнят.

5. Впервые нами на модели гетерокарионов установлено угнетающее влияние клеточных факторов на различных стадиях пролиферации на синтез пигмента меланина. Установлено наличие некоторых белковых клеточных факторов, блокирующих репликацию в клетках меланобласта. Опыты с кариобридами отчетливо указывают на ци-топлазматическую локализацию негативных регуляторов в клетках.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях

1. Нуров У. Дж., Гоибов Х.Р. Косимов Р.Б. Выявление некоторых биохимических и генетических факторов регуляции ингибирования ме-ланогенеза шерсти у овец таджикской породы. Вестник ТНУ. Душанбе: - «Сино» №6(70)2011. С. 65-68

2. Нуров У. Дж., Косимов Р.Б. Изучение концентрации отдельных гранул меланина и их скоплений в шерстном покрове ягнят таджикской породы различных окрасок. Вестник ТНУ. Душанбе: - «Сино» №12(76)2011. С. 45-47

3. Нуров У Дж., Гоибов Х.Р, Косимов Р.Б. Использование корреляционного анализа для оценки относительного влияния на меланогенез различных параметров с учётом типа фолликула и его морфологии. Известия АН РТ, Отд. биол. и мед. наук, №4(177) 2011. С.51-56.

4. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р, Абдурахимов X. Изучение влияния генов — модификаторов на меланогенез у ягнят таджикской породы. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 7-9.

5. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р, Абдурахимов X. Изучение ингибирующего влияния на меланогенез генов, определяющих высокую шерстную продуктивность овец. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 11-12.

6. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р. Изучение механизма заполнения меланосом меланоцитами и включение их в волосяные фолликулы ягнят разничных пород овец. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 13-15.

7. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р, Абдурахимов X. Оценка влияния на меланогенез различных параметров с учётом типа фолликула и его морфологии. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011.С. 17-19.

8. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р. Совершенствование таджикской породы овец в условиях племенного хозяйства имени С. Шерназарова Хурасанского района. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011 .С. 27-29.

9. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р, Абдурахимов X. Изучение продуктивности овец таджикской породы в условиях племенного хозяйства имени С. Шерназарова Хурасанского района. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 37-39.

10. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р. Живая масса годовалых ягнят таджикской породы при бонитировке. Международная научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 43.

11. Косимов Р.Б, Нуров У.Дж, Тешаева Б.З, Гоибов Х.Р, Абдурахимов X. Годовой настриг шерсти в физической массе у овец таджикской породы в зависимости от условий содержания. Международная

научно-практическая конференция «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» Душанбе 2011. С. 47-48.

12.Нуров У. Дж., Косимов Р.Б. Изучение митотической активности ме-ланоцитов, локализованных на сосочке волосяной фолликулы ягнят таджикской породы различных окрасок. Вестник ТНУ. Душанбе: -«Сино» №1/1(77)2012. С.186-188

13.Нуров У. Дж., Косимов Р.Б. Разработка биохимических генетическо-селекционных аспектов пигментогенеза, экологически чистой шерсти таджикской породы овец. Материалы Республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов» Душанбе 2012. С. 168-170.

Сдано в набор 28.10.2013 г. Подписано в печать 01.11.2013 г. Формат 60x84 '/16. Заказ № 35. Тираж ¡00 Отпечатано в типографии ТНУ, ул. JIaxymu 2.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нуров, Умеджон Джалолович, Душанбе

Таджикский Национальный Университет

04201453349

На правах рукописи

УДК 591.636.32

НУРОВ УМЕДЖОН ДЖАЛОЛОВИЧ

ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ФОРМИРОВАНИЕ ПИГМЕНТА МЕЛАНИНА У ОВЕЦ

Специальность: 03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Косимов Р.Б.

ДУШАНБЕ - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................5-9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..............................................10-11

1.1. Биохимические основы изучения формирования пигмента меланина.........................................................................11-14

1.2. Биосинтез пигмента меланина..............................................14-24

Заключение по обзору литературы..........................................24-26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............27-31

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСНОВНЫХ ФАКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА ФОРМИРОВАНИЕ ПИГМЕНТА МЕЛАНИНА У ОВЕЦ.........32-37

3.1. Изучение механизма заполнения меланоцитов меланобластами и включение их в волосяные фолликулы ягнят различных

окрасов...................................................................................37-40

3.2. Митотическая активность меланоцитов и механизм снабжения волос пигментом...............................................................................40-45

3.3. Митотическая активность меланоцитов и клеток матрикса в фолликулах ягнят таджикской породы различных генотипов

окраски...................................................................................45-46

3.4. Роль величины луковицы волосяного фолликула в формировании пигмента меланина..............................................................................................47-51

3.5. Влияние структуры, густоты, скорости роста шерсти на характер ингибирования формирования пигмента меланина в постнатальном онтогенезе ягнят.......................................................................51-57

3.6. Оценка влияния на формирование пигмента меланина различных параметров с учетом типа фолликула и его морфологии......................57-62

Заключение по главе 3................................................................62-65

ГЛАВА 4. КОРРЕЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИ БИОХИМИЧЕСКИХ И МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ПОСТРОЕНИЯ МОДЕЛИ ПРОЦЕССА ФОРМИРОВАНИЯ ПИГМЕНТА МЕЛАНИНА........................................................66-68

4.1. Регрессионный анализ зависимости концентрации пигмента в волосах от отобранных параметров..............................................................68-79

Заключение по главе 4...............................................................79-81

ГЛАВА 5 . ВЫЯСНЕНИЕ ПРИРОДЫ ВЛИЯНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ ПРЕДШЕСТВЕННИКА МЕЛАНОЦИТА (МЕЛАНОБЛАСТА) НА СИНТЕЗ ДНК В ЯДРАХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ОВЕЦ (ЭФО)................................................81-86

5.1. Исследование влияния предобработки клеток предшественника меланоцита ингибитором синтеза белка на их способность подавлять репликацию в гетерокарионах.......................................................86-88

Заключение по главе 5................................................................88-90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................90-99

ВЫВОДЫ..............................................................................99-103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................101-117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДОФА - дигидрооксифенилаланин УФ - ультрафиолет

ЭФО - эмбриональный фибробласт овец ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Установлено, что главные процессы формирования пигмента меланина осуществляются в меланоцитах - большая часть факторов, ингибирующих процесс, действует именно на этом этапе (Фирагут Дж. А. с соавторами 2007).

Факторы биохимического характера, контролирующие количество и качество активных молекул фермента тирозиназы, оказывают прямой эффект на формирование пигмента меланина.

Основным регуляторным механизмом, контролирующим эффективность работы меланоцита, следует считать изменение способности клетки поддерживать внутреннюю стабильную химическую среду (например, концентрацию цистеина или глутатиона) (Рго1а О. 2008).

Видимо, сульфгидрильные соединения (глутатион и цистеин) подавляют активность тирозиназы, так как связывают медь, активирующую этот фермент. Поэтому изменения концентрации 8Н-групп в среде (в цитоплазме меланоцита) оказывают непосредственное влияние на формирование пигмента меланина.

Этот механизм действует при самых разнообразных обстоятельствах, либо ингибируя, либо интенсифицируя формирование пигмента меланина.

В качестве объекта для исследований формирования пигмента меланина мы выбрали таджикская порода овец, так как селекционировалась она по шерстной продуктивности, что привело к глубоким преобразованиям характера волосяного покрова, формированию новых свойств волосяных фолликулов.

Наблюдаемое в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы в течение первых недель-месяцев постнатального онтогенеза почти полное ингибирование формирования пигмента меланина обусловлено возрастанием

5

концентрации в крови и тканях сульфгидрильных групп, вследствие увеличения интенсивности роста пуховых и переходных волокон.

Клетки предшественников меланоцита приобретают свойства терминальной дифференцированности, когда определенные участки ДНК, в частности блок генов, контролирующих процессы формирования пигмента меланина, прекращают свою функцию, но деление клеток меланобластов не прекращается.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы являлось изучение регуляторных механизмов формирования пигмента меланина, то есть выявление влияния биохимических, и клеточных факторов, ингибирующих формирование пигмента меланина.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- исследовать митотическую активность меланоцитов и механизм снабжения волос пигментом, провести корреляционный анализ биохимических и морфофизиологических параметров, используемых для построения модели процесса формирования пигмента меланина;

-изучить основные биохимические и морфофизиологические характеристики пигментогенеза, провести регрессионный анализ зависимости концентрации пигмента в волосах от отобранных параметров у ягнят различных генотипов окраски;

-изучить морфофизиологические процессы формирования пигмента меланина в волосяных фолликулах ягнят таджикской породы различных генотипов окраски;

-изучить клеточный механизм регуляции процесса формирования пигмента меланина, на модели гетерокарионов исследовать природу влияния клеточных факторов предшественник меланоцита

(меланобласты) на синтез ДНК в ядрах эмбриональных фибробластов овец (ЭФО).

Научная новизна работы. Проведены исследования биохимических и клеточных процессов ингибирования формирования пигмента меланина. Выявлен новый механизм транспортирования меланобласта, реализующихся в процессе митотического деления пигментных клеток, их миграции из зоны сосочка фолликула и включения в формирующиеся волосы, а также биохимические иклеточное основы процесса ингибирования формирования пигмента меланина.

Выяснена зависимость ингибирования синтеза ДНК в ядрах клеток меланобластов от пролиферативного потенциала клеток ЭФО. Обнаружен до сих пор неизвестный механизм транспортирования гранул меланина волос, в процессе которого значительная часть пигмента приносится мигрирующими из зоны сосочка меланоцитами.

Установлено ранее неизвестный способ переноса пигментных гранул в процессе митотического деления, и миграции меланоцитов в растущие волосы. Идентифицированы негативные тормозящие регуляторы пролиферации клеток предшественника меланоцита.

Выявлено, что наибольшее влияние на результат процесса формирования пигмента меланина оказывают такие параметры, как содержание гранулы пигмента меланина в цитоплазме меланоцитов, число меланоцитов в области сосочка и количество митозов пигментных клеток.

На модели гетерокарионов установлено угнетающее влияние клеточных факторов на различных стадиях пролиферации на синтез пигмента меланина. Установлено наличие некоторых белковых клеточных факторов, блокирующих репликацию в клетках меланобласта.

Практическая значимость работы. Результаты наших экспериментов позволяют существенно продвинуться в понимании роли митотического деления меланоцитов в процессах формирования пигмента меланина.

Эти данные могут быть широко использовании при составление рекомендации для овцеводов и целенаправленной организации селекционных работ в овцеводстве.

Научные разработки и опубликованные работы могут быть использованы при подготовке методических указаний, а также при чтении спецкурсов и проведении спецпрактикумов по биохимии животных и биохимии формирования пигмента меланина на кафедре биохимии биологического профиля ВУЗ-ов.

Опубликованные материалы также могут быть широко использованы для составления методических указаний по изучению биохимии пигментации шерсти и кожного покрова.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-практической конференции «Продовольственная безопасность: состояние и перспективы» (Душанбе 2011), Республиканской научной конференции «Экологические проблемы и рациональное использование природных ресурсов» (Душанбе 2012), на апрельских конференциях профессорского-преподавательского состава ТНУ «День науки» (2011, 2012, 2013), на конференциях и научных семинарах биологического факультета и кафедры биохимии ТНУ, на расширенном заседании кафедры биохимии ТНУ (2013).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 глав (обзор литературы; объекты и методы исследования; результаты исследований), заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 117 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 11

рисунков. Список цитируемой литературы содержит 131 работ, из них зарубежных.

Публикации. По материалом диссертации опубликовано 13 работ, из них работы в журналах, рецензируемых ВАК РФ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В данной главе тщательно проанализированы работы, посвященные изучению регуляторных механизмов формирования пигмента меланина, то есть выявления влияния биохимических, морфофизиоло-гических и клеточных факторов, ингибирующих формирование пигмента меланина. Проблеме пигментации животных и человека посвящен ряд фундаментальных монографий, обзоров и сборников работ (Алиев Г. А. и др., 1989 1995; Булке П., 2005; Косимов Р.Б. 2009). На лабораторных млекопитающих установлены общие особенности формирования пигмента меланина и определены основные этапы биохимической детерминации пигментации шерстного покрова.

Для большинства видов домашних животных выявлено несколько генов, оказывающих сильное воздействие на окраску (Хатт Ф., 2004). Но эффекты взаимодействия этих генов в их различных комбинациях у всех животных предстоит еще исследовать. Берг, в свою очередь, также отмечает разновидность генов окраски, их взаимодействие с другими генами, принадлежащими к различным генным локусам (Berge S., 2004). Очевидно, возникла острая необходимость в обобщении многочисленных разрозненных фундаментальных исследований по биохимии окраски животных, проведенных в последние годы в разных странах мира (Барсегянц Л.О., 2002).

Дж. Е. Роджерс описывает два варианта переноса гранул меланина из меланоцита в кератиноцит: согласно первой версии, гранулы инъецируются из отростков меланоцита в клетки волоса, при предварительном растворении клеточных мембран в месте их соприкосновения; вторая версия объясняет процесс фагоцитированием кератиноцитами гранул меланина из отростков пигментных клеток (Rogers G. Е., 2005). Таким образом, комплекс

меланоцит-кератиноцит является функциональной единицей формирования пигмента меланина.

1.1 . Биохимические основы изучения формирования пигмента меланина

По мере заполнения меланосом премеланосомы превращаются в мелонобласты и поступают в отростки меланоцита, где интенсивно продолжается синтез меланина. Типичный активно функционирующий меланоцит представляет собой дендритную клетку с большим числом гранул пигмента меланина (меланобласт). Взаимодействие меланоцитов, с кератиноцитами (клетками волосяного фолликула, производящими белок волоса кератин), обуславливает проникновение гранул меланина в клетки волоса.

Полученные данные свидетельствуют о том, что синтез меланина под действием фермента тирозиназы продолжается и в меланобластах, а также о поступлении гранул пигмента в кератиноциты (Косимов Р.Б. 2009). Широкий спектр окрасок обусловлен присутствием в волосах двух форм пигмента меланина: черно-коричневого эумеланина и желто-оранжевого феомеланина (Аварьянов И. Я., 2003, Браун Ф.А 2004).

Рис. 1.

Гипотетическая схема метаболических путей, приводящих к формированию различных типов меланина

ТИРОЗИН-ДО ФА

ФЕРМЕНТ X

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ -ПРОДУКТЫ ИНДОЛА

- Э УМЕ Л АН! ШЫ

ЦЫСТЕИН

ФЕРМЕНТ

ДОФА-ХИНОН

ГЛУТАТИОН

ГЛУТАТ1ЮН-ДОФА

ФЕРМЕНТ

ЦИСТЕИН - ДОФА' ФЕОМЕЛАШ'ШЫ ---_ТРИХОХРОМЫ

Превращение тирозин в 3,4 диоксифенил аланин (ДОФА) и затем в ДОФА-хинон происходит под действием фермента тирозиназы. Окисление индол 5-6- хинона в меланин протекает, вероятно, спонтанно, без участия ферментов. Скорость реакции окисления тирозина невелика, а превращение ДОФА в ДОФА - хинон осуществляется быстро (Косимов Р.Б. 2004, 2007, 2009).

Глутатион или цистеин могут подавлять активность тирозиназы или реагировать с промежуточными продуктами при синтезе меланина (рис. 1). Установлено, что в культуре меланоцитов сульфгидрильные соединения могут стимулировать переход к синтезу феомеланина, причем для разных генотипов необходима концентрация, различающаяся несколькими порядками (Даминов Р. А. и др., 2004; Григорян Э.Н. 2008).

Показано, что тирозин является предшественником для обеих форм меланина. Распределение меланина, содержащегося в клетках, также может влиять на окраску (Мецлер Д., 2005). Феомеланин обладает лучшей растворимостью, вероятно, менее устойчив к воздействию ряда физических и химических факторов (Уайт А. и др., 2006). Имеются достоверные сведения о том, что изменение строения белкового компонента меланопротеида оказывает влияние на окраску (Бриттон Т. 1986; Всеволодов Э. Б., 2005).

Изучение гранул меланина под электронным микроскопом показало, что их размер составляет обычно 0,4 -0,5 мкм, в светло - коричневых волосах встречаются крупные гранулы - до 0,9 мкм (Рубин Е.Л., 2005). Однако не получено сведений о фактах, обуславливающих слияние гранул в крупные глубокие по структуре, на желто-оранжевом фоне, хорошо выраженное в коричневых волосах.

Таким образом, если абстрагироваться от ряда деталей, окраска волоса зависит от абсолютного содержания в нем меланина в форме черно-коричневых гранул на желто-оранжевом фоне, причем, увеличение

содержания меланина в волосе сопровождается увеличением количества темно-коричневых гранул, желтый фон при этом становится менее заметным.

1.2. Биосинтез пигмента меланина

Меланин, высокомолекулярный полимер индол-5,6-хинона, взаимодействует с белком и образует меланопротеид. Предшественником индол-5,6-хинона является тирозин. Его превращение в 3,4-диоксифенилаланин (ДОФА) и затем в ДОФА-хинон происходит под действием основного фермента меланогенеза - тирозиназы. Окисление индол-5,6-хинона в меланин протекает, по мнению большинства авторов, спонтанно, без участия ферментов.

Скорость реакции окисления тирозина невелика, а превращение ДОФА в ДОФА-хинон осуществляется быстро. Общепринятой является схема синтеза меланина по Д. Мицлеру (2007). Данная схема с незначительными вариациями приводится в работах многих исследователей (Жданова Н.Н.2006; Алексеевич Л. А. 2003; Уайт А. и др., 2004), однако подчеркивается, что детали процесса биосинтеза меланина и его регуляции, а также ряд особенностей строения конечного продукта пока не совсем ясны. Так, в 2004 г. опубликована статья Корнер и Павлек (Korner Ann and Pawelek John, 2004), авторы которой показали наличие дополнительного фактора, способствующего превращению ДОФА-хрома в индол-5, 6-хинон; этот фактор, вероятно, действует в комплексе с тирозиназой.

В одной из работ С. Прота и А. Сирла (2005) высказывается мнение, что под собирательным названием «феомеланин» объединяются разнообразные пигменты светлой окраски с различными химическими и физическими свойствами, встречающиеся в рыжих волосах человека и животных (Prota and Searle A. G., 2005). Эти ученые подчеркивают, что,

несмотря на различия в молекулярном весе и общих свойствах, эумеланины и феомеланины связаны биогенетически и происходят из одного метаболического пути, в котором ключевым промежуточным пунктом является ДОФА-хинон. В меланоцитах животных темной окраски ДОФА-хинон превращается в эумеланин в результате нескольких спонтанных реакций.

Однако существует механизм, переключающий синтез на производство серосодержащих феомеланинов. Важную роль в этом могут играть сульфгидрильные соединения: глутатион и цистеин. Они вступают в соединение с ДОФА-хиноном и при неферментативной очень быстрой реакции превращаются в цистеин-ДОФА, а при