Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Меланинообразование у холерных и других вибрионов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Меланинообразование у холерных и других вибрионов"

РГБ ОД

1 и АН!'

На правах рукописи

НАГОРНЫЙ Сергей Игоревич

МЕЛАНИНООБРАЗОВАНИЕ У ХОЛЕРНЫХ И ДРУГИХ ВИБРИОНОВ

03.00.07 - .микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук ',

Саратов - 2000 г.

Работа выполнена на Причерноморской противочумной станции МЗ РФ Департамент ГСЭН.

Научный руководитель - член-корреспондент Российской Академии естествознания РФ, доктор медицинских наук Г.В.Гальцеза.

9

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Ю.Ю.Елисесв; академик РАТН, доктор медицинских наук, профессор Л.К.Адамов

Ведущая организация - Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт.

Защита состоится ^¿л?2000 г. в 'часов на заседа-

нии Диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

. Автореферат разослан " ¿--¿¿у^сУ^ / 2000 г.

С диссертацией можнб ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ

О ! •■

"Микроб".

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук,

профессор Корнеев ГА.

РМУ' -ч, 0

.1

Общая характеристика работы

Атстузш.ность проблемы. С давних времен известна способность многих мн^рс .танизмои. продуцировать пигменты различных цветов и оттенков. Нг ! определенных условиях эти микроорганизмы Moiyr оказаться доминирующими формами. Среди пигментов определенный интерес представляют меланины. занимающие особое положение по способу синтеза. по химической структуре и свойствам.

Меланины (ór греческого MS3AS - черный) от светло-коричневого до почти чс, " лю встречаются у организмов пссх филогенетических уровней и являются очень распрост раненными пигментами не только п мире животных. растений. но и микроорганизмов, ю есть мелапиногенез явление обпте-бнологнчсс..ч;с. Наиболее полно изучены меланины грибов, актиномштстон. млекопитающих.

Образование пигмент меланина не является универсально;) функцией микроорганизмов какою либо рода или вида. Об згом свидетельствуют дачные, о выявлении мелапииообразующих штаммов среди рода: Bacillus. Klebsiella, Escherichia, ¡'rotem, Pseudomonas, Aeromonas, Comamonas, ■ ¡'.nv'tnia.AT.otabtirler. Coryrtehacteriiim. Mycobacterium, Brucella, Legionella.

!\ мелапотенпым микроорганизмам неоднократно обращались микробиологи медицинского профиля. Было показано, чго меланины проявляют антибиотическую акптносп>. обладают ферментчпгнбирующими свойствами. г>ти свойства относятся к проблеме микробного антагонизма и взаимоотношений с атрсссивными факторами микро- и макрооргатнпма и свидетельствуют о приспособительной.функции мслапиногепеза. 13 некоторых случаях образование пигмеи та представляется как результат деграданион-' ною метаболизма, например, при старении культуры. Иногда синтез меланинов осуществляется как реакция детокейкапии различных фенолов: Ультрафиолетовое. радиоактивное, злектромагпитное излучение действует на Микроорганизмы как жесткий -жологический фактор отбора, к которому быстрее приспосабливаются пигмептообразующие варианты бактерии.

Известны провоцирование канцерогенеза некоторыми видами меллпи-i;a и противоопухолевые свойства меланинов, а именно тормозящее влияние пигмента на клетки опухоли г)рлиха. бластомы Брауна, лимфосаркомы. Интерес представляет промежуточный продукт синтеза меланина - диоксифе-ннлаланип (ДОФА) используемый в фармакологии. Хорошее продуценты [.-ДОФА из тирозина были найдены среди штаммов Vibrio и Pseudomonas. обеспечивающие наибольший выход продукта. Налажено получение препарата в Японии.

Появление тс: но-коричневого пигмента в культурах вибрионов от мечали Carbone D. (1907). Г-орошщ-Власова JI.M. (19111 Около ч Ф. (1928). Коробкоаа Е.И. (1959), Наумшина М.С., Котлярова Р.И. Г1976). Unit D.O.. Evans W. (1976). Гальцева Г.В. (1979), Parker Ch. et al. (1979). Bruce H.. Ivins B.E., Holmes R.K. (1980), Кудрякова T.A„ Дрожевкина M.C. (1982). Смирнова Н.И., Ерошснко TA. (1982). Адамов A.K.-, Наумшина M.C. (¡984). Смирнова Н.И. с соавт. (1985), 1Цуркина И.И. с соавт. (1992). Coyne V.E. et

fll (1992), Кудрякова 'Г.Л. с соавт. (1994).

Изучил коллкпию нигмсшообразуюших вибрионов Гальцева Г.В. (1983), идентифицирована пигмент как меланин и высказала предположение о потенциальной способности всех представителей Г. cholerae с'ишезн-(ровать меланин. Однако, до настоящего времени не были выделены и охарактеризованы ферменты различных вибрионов.

В отечественных и зарубежных руководствах но сис1смагккс бакюрий. инструктивно-методических- указаниях и рекомендациях но лабораторной диагностике холеры, парагемолитических и друтх условно-патгенны.^ вибрионов не указано, чго вибрионы содержат фермент тнрозипазу п способны синтезировать темно-коричневый пигмент меланин.

• Опыт работы показал, что при исследовании материала на холеру и патогенные для человека вибрионы отбирают и идснжфицируки только типичные гладкие, пртрачпме и полупрозрачные колонии. Заболевания, вызванные пигментообразуюшнми вибрионами, как правило, не подтвержда-. ются бактериологическими исследованиями, так как атипичные пигмеиш-руюшис колонии не опирают для дальнейшего изучения.,

Таким образом, изучение меланиногенсза вибрионов, выделение ферментов и пигмента перспекгивно как для совершенствования лабораторной диагностики холеры и заболеваний, обусловленных патогенными вибрионами (К speciespluralis). так и для научных и прикладных целей.

Цель н задачи исследовании. Целью настоящего исследования яви- • лрсь изучение мслаш:нообразовапия и его роли в жизнедеятельности вибрионов различных тасономических групп рода Vibrio, для совершенствования лабораторных методов исследования по проблеме: „Холера и патоген-'лые для человека вибрионы".

Поставлены задачи: ' - определить распространенность пигментообразоиания среди видов V.chn-Icrae и V.species pluralis (V.parahaemolyticus, V. vulnificus. I '"-fluvialis и лр.).

- изучить характер детерминирования признака нигменгообразовання у вибрионов;

- выделить и изучить у вибрионов фермешы пигмеикиснсза:

- выделить и идентифицировать пигменты вибрионов;

- изучить влияние пигмента меланина на жизнедеятельност ь и свойства холерных и других вибрионов.

Научная ношпна и теоретическая .Значимость работы;

- Впервые, выявлена 100% потенциальная способность к пигментообразова-нию, которая возникает при синтезе в клетках фермента тирозиназы. V штаммов- У. cholerae cholerae, Г. cholerae ehor, V. cholerae поп Оl в том числе V. cholerae .0139. V. albensis и других патогенных вибрионов (/ '. species). ' ' .' .

- Впервые доказано, что признак тирозиназпой активности стабилен. 1спы (tye*) имеют хромосомную локализацию и, соответственно, тирозиназа яв-

ляетсч конститунтивным ферментом.

- Фенотипически признак пигментообразования (Pgm*) проявляется спонтанно или индуцирование п результате повышенной проницаемости клеточной стенки или целостности клеток в зависимости от условий обитания в различных экосистемах.

- Впервые выделен, охарактеризован и идентифицирован фермент - тирози-наза (монофенол, диоксифенилаланин : Ог-оксидоргду'стаза) холерных вибрионов, обеспечивающая синтез пигментов меланинов. Разработаны химико-микробиологические методы качественного и количественного определения ферментативной активности.

- Нами предложен метод экспресс-индикации тирозиназной активности с использованием индикаторного тест-штамма Staphylococcus saprophytics 221, который депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

- Впервые выделены и идентифицированы пигменты меланнново"; природы вибрионов различных таксономических групп. Проведен анализ химического состаза пигмента вибрионов и изучены его сравнительные характеристики.

г Доказано, что появление пигмента в клетках вибрионов не оказывает влияния на основные таксономические признаки. Отмечено влияние пигмента на выживаемость вибрионов в различных экосистемах. Очень важна информация о фотопротекторной функции пигмеи га меланина для вибрионов.

Научное значение имеет информация о признаках как (ус* Pgm* так и tye*Pgm холерных и других вибрионов, что должно найти отражение в определителях бактерий и научных работах по таксономии и систематике вибрионов. Генетика тирозиназ представляет раздел проблемы регулирования синтеза функциональных белков клетки, в котором этот энзим рассматривается как молельная система. Изучение тирозиназ вибрионов позволит расширить наши знания о молекулярных механизмах реализации генетиче-:коп информации и путях ее фенотипнческого выражения.

Практическая значимость работы. Знание свойств и особенностей -¡игментообразутоших вибрионов, их ферментов и пигментов позволяет по-зысить качество и эффективность лабораторной диагностики не только хо-юры, но и заболеваний обусловленных различными представителями V. species. Эти признаки имеют значение при проведении эпидемиологическо-"О анализа, генетических исследований с целью выявления диапазона изменчивости вибрионов. Пигментообразующие вибрионы могут быть ис-юльзованы как тест-штаммы при определении качества питательных сред m наличие ароматической аминокислоты - тирозина и как продуценты Фермента тирозпназы, пигмента меланина и промежуточных продуктов мс-[анинеебразования. Разработанная нами система выделения и очистки >ермента позволяет получать тирозиназу в препаративных количествах и спользовать энзим в различных областях медицины, биологии, микребио-

в

логин и примышленною производства.

Депонирован тссышамм S. sapmphyíicus 221 с целью использования его при индикации мслапнпообразовапия вибрионов. Депонированы авюр-ские штаммы новых ссротипов V. albensis 2369. 1794. 1799. ЗОН. 2953. которые также обладают тирозиназной активностью и способны сишезнро-вать пигмент меланин.

IIa основе материалов диссертации составлены "Методические укам-ния ио выявлению н изучсЛию пигмеитообразующих вибрионов", упн-р-жденные заместиicjicm председателя ГКСГШ РФ.

Основные нолоннчши, пьшосиммс на защиту.

- Потенциальная способность к синтезу пигмешов у предокиипслсй вида l'.cholcrae и некоторых видов / '. specic.spluralis.

-Характер детерминирования признака нигментообразоиания у вибрионов

- Методы индикации .тирозиназной активности и условия кулыивиронапия для образования меланина.

• - Фермент меланннообразовапии вибрионов - монофенол, диоксифеннлала-нин : 02-оксидоредуктаза.

- Механизм мелапинообразования, мето, ..[деления и фи мко-химичсекис характеристики пигментов.

- Полифункциональный xapaKicp пигмеитообразопания п его значение и жизнедеятельности вибрионов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-организащ.онных советах Причерноморской противочумной станции (Новороссийск. 1990. [991, 1995, 1998. 1999 гг.). Российской научной конференции (Волгоград, 1992 г.. Киров. 1998 г.). на конференциях н Ставропольском НИПЧИ (Ставрополь, 1995. 1996 гг.). на краевой конференции микробиологов (Краснодар, 1994 г.),- на заседаниях общества эпидемиологов, бактериологов и паразитологов (Краснодар 1991. 1993 гг.: Новороссийск 1995г 1996 rrj. Теоретические положения и пракшческн значимые результаты рабош включены в цикл лекций и используются при проведении курсов и семинаров ио совершенствованию диагностики холеры и заболеваний, вызванных патогенными для человека вибрионами.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе методические рекомендации.

Структура дкссергл.'кш. Диссертация изложена па 184 cipaiinnax машинописи и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 31 s источников, в том число 145 - зарубежных. Работа иллюсфировапа 24 ри- • сунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАЬОТЫ -Материала и методы нгслсдоиапки.

В работе использовано i 100 штаммов различи!,:?; таксономических групп рода Vibrio, 6t:;n mint-, ctio.'i'roc и cliur ■ 63 ниаммоп. ¡'. cliobnic ног

01 различных серогрупп -193, V. albensis- 488, в том числе 17-ти известных серогрупп. V, metschnikavii - 2, V. parahaemolyticus - 107, V. alginolyticus -81, V , • ..¡¡ficus - 19, V. mimicus - 24, V.jJuvialis - 44, V. harveyi - 40, V. ar.quil-larum - 29, V. pelagius - 2, V. campbellii - 2.

Штаммы изучили по основным тестам в соответствии с "Определителем бактерий Берджи" (1997), "Лабораторными методами для диагностики холерных вибрионов и других вибрионов" (1992) института Пастера, "Методическими рекомендациями по лабораторной диагностике патогенных для че.°о?ека вибрионов" (1994), "Инструкцией но организации и проведению противохолерных мероприятий" (1995).

Использовали среды с рИ (7,6 - 7,8) на основе морской воды (Lee J.V. et al., 1979), TCBS (Kobayaslii et al., 1963) и ее модификацию НХЛ (Гальцева Г.В. с соавт., 1996) разработанную в лаборатории холеры ППЧС, а также среду JVagatsuma, модифицированные нами среды М9 и Bhaska: \n-Rowley (1956). Применяли минимальные синтетические среды с аминокислотами, витаминами, с добавлением азотистых оснований, а также различные сочетания-компонентов по Holliday R.А.(1956)'. Для выделения пигмента нами разработана синтетическая среда (Гальцева Г.В. с соавт., 1994). Влияние антибактериальных препаратов на синтез фермента и пигмента изучали на средах с антибиотиками и сульфаниламидами.

Для электронномикроскопического исследования вибрионы фиксировали 1,5% глутаровым альдегидом, осмием и марглицевохислым калием, обезвоживали спиртом и помешали в метакрилат. Ультратонкие срезы получали при немощи микротома LKB типа 8801 А, контрастировали растворами 3% уранил-ацетата и уксуснокислого свинца. Люминесценцию клеток вибрионов определяли на люмимометре LKB - 1250 фирмы "LK3". *

Холерогенность определяли в соответствии с "Методическими рекомендациями по определению вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков" (Ростов-на-Дону, 1979) и на изолированных петлях по De S.N. il Chatterge D.N. (1953) и оценивали вирулентность комплексным методом (Саратов, 1995).

Для изучения детерминант меланннообразованил клетки вибрионов облучали ртутно-кварцевой лампой ПРК- 4, воздействовали нитрозометил-мочевиной. С целыо определения топографии синтеза фермента тпрозиназы и пигмента получали протопласты и сферопласты (Азизбекян P.P.. ¡980), вибрион! ! обрабатывали акридинами. При изучении вопроса о детерминировании признака пнгментообразования использовали метод коныогации. Антигенные свойс.ва P;>ni и Pgitf штаммов определяли в реакции преципитации в агаре. " ' >

Для определения субстратной специфичности и выяснения характера пнгментообразования использовали модифицированную нами классическую непрямую меланогенную реакцию (Лях СП., 1979) и двуслойный метод приготовления среды с добавлением фенольных предшественников меланина. Определение ферментативной активности вели с использованием

додецилсульфата натрия (ДСП), экспрссс-мстода индикации тирозиназы (Нагорный С.И., 1993; Гальцева Г.В., Нагорный С.И., 1994), и предложено-го нами качественного метода с использованием индикаторного- тест-штамма. Тест-штамм выделен нами из воздуха и идентифицирован как Staphylococcus sapropliyticus 1 биотипа атипичный по сахарозе'по Bergey (1974) или как Staphylococcus cohnii по Kloos W.E., Shleifer K.H. (1975), который был депонирован в институте им.Тарасевича под номером 221. Тест-штамм засевали шириной 0,5 - 0,8 см по диагонали чашки Петри со щелочным агаром (рН 7,4). Полнукг петлю исследуемых агаровых кул„тур вибрионов наносили на расстоянии 2- 3 мм вдоль газона тест-штамма и инкубировали при 37°С 24 - 48 часо!}. Учет результатов проводили по изменению цвета газона исследуемых культур до коричнево-черного. Газон тест-штамма (контроль), оставался непигментнрованным.

При выделении ферментного комплекса клетки вибрионов разрушали в ультразвуковом дезинтеграторе мощностью 500 Вт, ъ..о та 20 кГц при 4°С в течение 5 минут или литическими ферментами с последующим осмотическим шоком. Хроматографию проводили в системе Minicoldlab ("LKB" Швеция) с УФ-детектором типа Uvicord S1I и потенциометрическим регистратором профиля элюции. Использовали хроматографические носители молселект G-25, сефадекс G-100 ("Pharmacia" Швеция), ионообменную хроматографию проводили на катионообменнике ссрвацел КМ52 ("Serva" ФРГ). Тирозиназную активность изучали с применением автоматической ультрамикроаналитической системы «SUMA-121».

Ранее не существовало стандартного метода выделения природных меланинов вследствие химического разнообразия биологического материала. Выделение меланинов вибрионов проводили по модифицированному нами методу Малама А.А. с соаст.(1970). Для идентификации пигмента были использованы тесты, предложенные Aurstad К., Dahle Н.К.. (1972).

Энтеротоксическое действие пигмента проверяли на модели изолированной петли тонкого кишечника кроликов (Bergdoil M.S., 1988), при внут-рикишечном заражении кроликов-сосунков (Dutta N„ Habbu М., 1955), на модели белых мышеи, которым пигмент вводили внутривенно, внутри-бршшишю, внутрикожно, подкожно, per os\ мышам-сосункам вводили внутрмкожпо, penos, per rectum. Отекогенный синдром проверяли на лапках белых мышей. Препаратами фермента и пигмента иммунизировали кроликов. Аншферментную активность определяли методом двойной иммуно-диффузии а геле и исследовали их активность в реакциях агглютинации и нейтрализации.

Результаты и обсуждение.

Сравнительное изучение пигментных и беспигментных штаммов вибрионов различных таксономических групп в зависимости от условий культивирования, выявило вариабельность и изменчивость не только морфологических, культурадьных, но и биохимических, серологических признаков, в пределах соответствующего вида.

Первоначально пигментообразующие штаммы были выделены только в результате спонтанных мутаций (К cholerae eltor - 9183, 9313, 9207, 7679, 1039, V. cholerae поп 0! - 195, 172, 9832, V. albensis - 10034, 1426, 3891, V.parahaemolyticus - 20, 30, 886, 723, V. alginolyticus - 20, 143, 375, 629, 764, 651, 487, 9831,- V.vuln'ißcus - 284, 348, V.fluvialis - 286, 287. Пигментообразующие варианты V. cholerae eltor 9524 и V. cholerae поп 01- 9803 были выделены из иммунного организма кроликов при заражении в желчный пузырь, а также при получении протопластов иод действием пенициллина, при переносе колоний методом реплик на пластинки агара со стрептомицином. Это послужило предпосылкой для дальнейшего изучения вибрионов без внешних признаков образования меланина с целью поиска ферментных систем меланиногенеза, а также определения потенциальной способности к пигментообразованию. Такая способность предполагает наличие ферментной системы пигментообразования (tye+). При оценке распространенности меланинообразования среди беспигментных вибрионов принимались во внимание только феногипические проявления, поэтому количество штаммов способных к меланиногенезу явно занижено и не отражало реальной картины.

При сравнительном изучении роста Pgm* и Pgm' вибрионов в периодической культуре, некоторые фазы роста Pgm* штаммов имели характерные особенности и отличались от таковых у Pgm . Фаза экспоненциального роста, длилась 6 - 6,5 часов и заканчивалась к 8 часам культивирования достижением М - концентрации п • 1011 для /^///"штаммов. Pgm* штаммы к 8 часам не достигали ожидаемой М - концентрации.

На рисунке 1 показан выраженный двухфазный рост Pgm~ штаммов, который у Pgm* штаммов более пролонгирован и наблюдался в более поздние сроки. Вначале экспоненциальной фазы число "п" Pgm' вибрионов в 5 -7 раз, а в дальнейшем на несколько порядков выше, чем у Pgm* .

' Время (чзсы/СУТКИ)

Рис.1 Динамика размножения и выживаемости пигментных и беспигментных штаммов вибрионов *""Рдт+ штаммы -о- Рдт- штаммы

Характеристика кривых роста указывает на замедленный метаболизм у Р^т* штаммов. У Р%т Штаммов с 8 часов культивирования начиналась стационарная фаза и фаза отмирания, в то время как у Рцт и вибрионов продолжается длительная экспоненциальная фаза с достижением М - конпен грации (п • I О10) только к 5 суткам инкубации. В течение 25 суток количество Р£т+ клеток превышало аналогичные показатели Рцт' на I - 2 порядка. Период превышения количества Рцт* клеток совпадал с накоплением и визуальным обнаружением меланина в среде. Следовательно, пигмент не только не является летальным агентом микробных клеток, по и способствует их длительному выживанию в неблагоприятных условиях.

Колонии пигмеитообразующих штаммов вибрионов отличались от беспигментных не только характерной окраской различных оттенков коричневого и черного цвета, но и различным проявлением окраски в пределах отдельных колоний. Такой тип иигментообразованин, можно назван, аутолизным или пигментообразованием старения. Копоши: других штаммов У. с!ю1егае, V. /¡ига/шстп/у^сих, V. а1Ьепх1.ч, V. уиЬц/к'т были окрашены пигментом однородно. Визуально пигмент заметен только тогда, когда происходит его накопление вследствии роста бактериальной популяции. Данный тип гшгментообразовання менее зависим от возраста культуры и .обусловлен штаммовыми особенностями проницаемости клеточной стенки.

При электронномикроскопичсском исследовании клетки Рри- вибрионов полиморфны по величине и форме в пределах общеизвестных. В популяциях вибрионов обнаруживаются не только обычные прямые или изогнутые, короткие или длинные палочки, но м множество значительно

измененных клеток (рис.2).

~ * #

"и • ': *

С ъ .-*й?иПб> i -Л-

^ ЛШк *■ .. с

О

" ¿г

; ■

Л

0

Рис. 2. Морфология пигментообразующих клеток вибрионов

Встречается большое количество "экзотических" форм: колбообраз-иых, длинных, нитевидных, вздутых, со множеством перетяжек. Разнообразна." уфологическая картина свидетельствует о выраженных изменениях клеточной стенки пигментообразующих вибрионов. Методом сканирующей микроскопии выявлено накопление меланина у пигментных клеток я наружном слое клеточной стенки и во внеклеточном пространстве на поверхности клеток.

Для идентификации ферментов пигментообразования вибрионов мы апробировали соответствующие субстраты и пришли к выводу, что у вибрионов преобладает тирозиназный механизм образования пигментов с некоторой в;.^иабелыгостыо. Вибрионы гидроксилировали монофенолы и окисляли О-дифенолы до окрашенных продуктов. Единичные штаммы V. с1ю!егае сИо!сгае, V. с!ю1егае еНог, V. с!ю1егае пап О!, V, а1Ьеп$1з. V. рага-■¡аепю1у!1си.ч, \'.а^то1у1'1сш, У.шщиШагит, окисляли некоторые парафено-лы. Последующее окисление дифенолов у вибопонов может осуществляться как внутриклеточно, так и во внешней среде.

Для выявления потенциальной способности к меланинобразованию и обнаружения ферментов пигментогенеза, мы разработали экспресс-метод с использованием ¿-ДОФА, когор! й является первым промежуточным продуктом з процессе меланинобразования и общим субстратом для фенолок-спдаз всех типов (табл. I).

Таблица 1

Результаты выявлении потенциальной способности вибрионов к ме-ланинобразоааншо

Микроорганизмы Количество штаммов Экспресс-метод с ¿-ДОФА Метод с индикаторным штаммом 5.5 ар гор!¡у/¿с г /.т

V. спокгас О! 68 + 4-

V. с!ю1егае поп 01 193. 4- 4-

V. а1Ьеп$1з 488 т • +

V. теГзскглкоуН 2 4- - +

V. рагакаето1уйси$ 107 + —

V. а1^то!упсиз 81 + 4- ■

V. ги!пЦ1ст 19 + . +

У.АтчаИз 44 Л. —

V. т\т1ст 24 + +

V. ащиШагит 29 - —

V. кагуеуг 40 - — •

V. ре1а%тз <у -

V. саюрЬеИН 2 + +

Примечание: +, 89 % и более положительны — 89 % и более отрицательны

V. ckolcrae О! обладали тирозиназной активностью н потенциальной способностью к образованию меланина в 100% случаен. Отмечена слабая пигментация только у штамма V. choleras cltor 1899. Из штаммов ly. cholera? поп 01 положительные 99,5%. Тирозиназной активностью обладал и штамм V.cholcrac 0139. Среди V.albensis положительных 99,4% и три штамма, в тс.'.; числе типовой 9515, отрицательные. Меланин синтезировали все V. parahacmolyticus и типовой V. parahaemolyticus АТСС 17802, V. algifioly/ieus и типовой А ТСС 17749. Ярко выраженную положительную реакцию давали V. vulnificus, в т. ч. типовой АТСС 27562. V. mimicus, в т. ч. типовой V. mimicus 9839 и вибрионы, идентифицированные как V. cani/ibel-lii. V.fiuvialis проявляли различную степень окраски, в то время как колонии типозго штамма V.fiuvialis 33809 (NCTC 11327) окрашивались пигментом наиболее интенгизно. Из V. anquillanim - только 2 были положительными. Отрицательную тнрозпназную реакцию давали н штаммы идентифицированные как V. harveyi, V. pclagius.

В результате совместного культивирования вибрионов Pgnt- с тест-штаммом S. sap>ophyticas 221 пигментообразовапие этим методом подтверждено у V. ckolcrae Ol, в т. ч. V. cholcrae cholcrae 145, V. cholcrae eltor, V.cholcrae поп 01, г. т. ч. V. cholcrae 0139, V. albensis в 100% случаев. Потенциальная CliOCOUI'OC п. к меланинобразованшо выявлена у V. inelschniko-vii, V. algaiolylicus, V. mimicus, вибрионов, идентифицированных как V.cam-pbcllii. Штаммы V. vulnificus, ьыделенные из морской воды Черноморского побережья, давали ярко пораженную положительную реакцию, в то время как'THHOLOH штамм V. vulnificus АТСС 27562 был почему-то отрицательным.

Трудно аргументировать, почг.му отрицательная реакция шпментгоо-разоьапш: у некоторых штаммов V. parahaemolyticus, V. finvir.il-, так как среди V. parahcsmolyticus и V.fiuvialis неоднократно выделяли и имеем и коллекции пигментные штаммы (:ус+ Pjnr'r) к другими методами выявлена способность к образованию меланинов у илчым'л. Р^п:-.

Таким образом, изучение вибрионе в не только с фенотииическими проявлениями (tyc+ Pgia*), но и имеющих потенциальную способность к мелгтшогенезу (tyc* Рцт ) с помощью различных методов позволило установить широкую распространенность пьгментсобразования среди различных представителен рода Vibrio. Образование пигментов мелашпювой природы реализуется у вибрионов генетически детерминированной конституи-тивней внутриклеточной ферментной системой тирозиназы. Нами доказан многоступенчаты1;] механизм мелапннобразовання.

Изучены активаторы и ингибиторы процесса меланиногенеза. Оптимальной для образования пигмента являлась температура культивирования 35-37°С. Особое влияние оказывало значение рН среды культивирования. Сдвиг/г//ниже 5,5 угнетал рост вибрионов и снижал скорость образования меланина. Стимулировал пигментообразовапие сдвиг рН от 7,4-7,6 до 9,0.

1.1

Фотоактивация меланиногенеза наблюдается у некоторых штаммов вибр'.к,.; ""! при инсоляции в течение 1,5 - 2 часов иа пластины щелочного агора с .гут/гурами. Интенсивность пигмснтогенеза у вибрионов изменяется г, зчгисимости от степени аэрации культур. Концентрация ¿-тирозина от 0,0!.'.5 °о до 0,025 "о вызывала едва заметное образование пигмента, а увеличение до 0,05 - 0.5 и даже I % не сказывалось заметно на росте вибрионов и способствовало усилению пигментогепеза. Избыток тирозина тормозил процесс меланинообразовання. Положительное действие иа роет вибрионов !; пигме.чтообразование оказывали ионы железа (8 - 10 мг/мл), магния (!0 • !5 мг/мл), меди (8- 10 мг/мл). Глюкоза, манпит, сахароза в кон->;/;нгрятпх более 4-5% оказывали тормозящее действие. Не влияли на пигментосбразсзннне поверхностно-активные вещества в концентрациях ог 1,56 да 50 мкг/мл среды. Это позволило прийти к выводу о значительно]"! устоичивссш меланьнсинтезнрующих шгаммо» к действию различных детергентов. В некоторых случаях эта устойчивость была на порядок выше, чей у озсгигмешных штаммов.

Чувствительность к 23 антибактериальным препаратам мы определяли 4 ш'тммсз вибрионов Р^т*, Р^т . Из антибиотиков пеницилиточосо Р':;"', наиболее сильное ннгибиругощее действие на вибрионы оказывал ам-г.гциллин. В то же время резистентность Р^т* штаммов к ампициллин), пеници'.'.пшу. мстипиллнну превышала аналогичные показатели /'.?/••' штаммов в 2- 10 раз. В отношении тетрациклина среди меланннсшпети-рующих ^гаммсв и субкультур встречались как чувствительные, так и резистентные. Устойчивомь некоторых штаммов V. с1ю!сгае с1юг 91 931 3. 9403. 9406 составляла 2,5- 16.0 мкг/мл. К сульфаниламидным препаратам, амипогликозидам, иитрофураиам отмечалась относительная стабильность чувствительности среди Рцт штаммов вибрионов всех видов. Значительную устойчивость к препаратам проявляли субкультуры Р^/п* вибрионов. При изучении воздействия на вибрионы пренараюв иатдиксовой кислоты выявлена тотальная устойчивость Рцт* штаммов, напрямую свякшиая с наличие-! меланина в среде культивирования, которая превышала ана.Т' ные показатели бсспигментных штаммов в 2 - 2(1 раз.

Следует также отметить., что рпфампицнн и линкомннин, напротив, изначально усиливали образование меланина, несмотря на угнетение жт-недеятельности и метаболизма вибрионов.

Сильным ингибитором пигмептообразоваппя является грамицидин. При ког.центрациях свыше 3.5 мкг/мл в среде культивирования он полностью блокирует меллнинобрнзование всех видов Рцт* вибрионов. По характеру подавления меланинобразования "мишепыо" грамицидина является фермент тпрозиназа. Таким образом, помимо устойчивости к некоторым антибиотикам и химическим веществам за счет протсктивных свойств ме-ланинового барьера, вибрионы (!уе* Рцпг) обладают значительном вариабельностью но чуп'.чви1сль:юсIII к антибиотикам.-Такая неоднородное!!.

' популяции пнг.ментооиразующих вибрионов в условиях широкого применения антибактери-альных средств и значительного загрязнения внешней среды ксенобиотиками может способствовать формированию полирезистентных штаммов V. cholcrae Ol и других патогенных для человека вибрионов.

При изучении генетического детерминирования признака пигментооб-разования получали ауксогрофные мутанты из 25 штаммов Pgnt* и Pgnt вибрионов. Анализируя свойства полученных мутантов, пришли.к выводу, чго в геноме V, cholcrae имеется, по крайней мере, один ответственный за синтез фермента lye - локус, мутации в котором ассоциируются с утратой пигментообразования п результате нарушения синтеза фермента тирозина-зы. Мутации, связанные с пню- или п;перпигментацией происходят в участке хромосомы, контролирующем синтез и свойства клеточной стенки.

При воздействии на вибрионы УФ-лучей процен". выживших Pgnt* значительно выше, чем Pgnt клеток. Среднее число выживших клеток составило 19,3 % - 5,8 % ± 1 % для Pgtn штаммов и 1,6 % ± 1 % и 0 % для Pgnt . Следовательно, обладая высокой светопоглощающей способностью, меланины позволяют сохранить жизнеспособность поврежденным пигментным клеткам ß условиях повышенной инсоляции, при облучении УФ и, в конечном итоге, способствуют сохранению вида в условиях неблагоприятной внешней среды.

При решении вопроса о возможной передаче признака пигментообразования в качестве донорнош штамма использовали Е. coli J 53 (NalR) RP4 (\J\ Те", Km"). В качестве рецнпиентных использовали пигментный штамм V.choleras eltor 6691 (Pgu:+, ApS, TcS, XmS)-,i непигментный V. cholcrae eltor 2278 (Pgm , Ap , Te , Kms). Частота переноса плазмидных маркеров составила 1,2-1(Г5для реципиента V. choleras cltor 2278 (Pgnt) и 6,3-Ю-6для V. cholcrae cltor 6691 (Pgm+). Среди пол>чснных трансконыогатов наследование маркеров резистентности к трем антибиотикам и к каждому в отдельности происходило с одинаковой частотой и различалось только числом "«". Трансконьюгаты, содержащие Тп1 в эписомном состоянии, ревер-тировали к исходному типу через 3-5 пассажей на селективной среде. Ре-комбинанть,, несущие признаки транспозон-плазмида были стабильны в отношении наследуемых маркеров и сохраняли свойства после многократных пассажей. Формируемая резистентность во многих случаях возрастала при культивировании па средах с антибиотиками до 200 мкг/мл и более. В результате коныогационного переноса плазмиды RP4 из Е. coli в V. cholcrae Ol, формируемые рекомбинанты наследуют преимущественно интакт-¡IVю плазмиду в автономном состоянии. Наряду с плазмидными признаками многие рекомбинанты приобретали моно- и полиауксотрофность, утрачивали подвижность, проявляли значительную зариабельность в отношении к

монофагам, ХДФ и ферментации углеводов. Из исходного штамма V. choleras eltor 6691 Pgm* получены мутанты с различной степенью пнг-ментообразования.

Во многих случаях вариабельность меланинобразования сочеталась с изменением ферментации сахарозы. Из исходного штамма V. choleras eltor 6691 Pgm+ получены варианты гиперпродуцентов меланина Pg;n , сах . Ар". TcR, KmR, карбепщиплип* , Pgni сах+, Арк, Тс", Km", карбеницкллин'*, нс-омициил и Pgm , сах >ApR, Тс", Кт'\ Pgm , сах*, ApR. TcR, Km".

Помимо транспозонов Тп7 (Tompson J. et al., 1981) и TnlO (Смирнова H. И., 1982), индуцирующих мутации у вибрионов, транепозон Tul, с частотой 2 • 10~8 способен регионально включаться в локус хромосомы, дотер-минирующий ферментацию сахарозы. В дальнейшем, подвергаясь "почти-прецизиозному" вырезанию рсстриктазами, транепозон формирует мутации по типу инсерций, делений и инверсий.

В результате проведенной коныогации установлено, что трзнспозч-руемый элемент с частотой 10~?- 10"9 влиял на экспрессию гена ответственного за синтез и проницаемость клеточной стенки и не влиял на синтез фермента тирозииазы. Рсгертнровавшие к бсспигментности штаммы вибрионов восстановили существующий блок в синтезе предшественников меланина при полной сохранности ферментной системы, обеспечивающей собственно меланиногенез. Этот блок напрямую обеспечиваете;: внутриклеточной равновесной системой восстановления хиноноз - продуктов второй ступени меланиногенеза. Косвенно, этот блок обеспечивают свойства клеточной стенки, обладающей избирательной проницаемостью и поддерживающей гомеостаз, а значит, и равновесные химические превращения.

Поставив задачу выделить и охарактеризовать фермент, вмбрхчн пиг-ментпродуцирующий штамм V. cholerae eltor 6691. В полученном белковом лизате провели разделение методом ультрацентрифугировапия и получили набор фракций. При этом мы апробировали две схемы очистки с дохрома-тографическим этапом ультрацентрифугирования клеточного гомогенаи.. При хроматографичееком разделении белков провели гельфильтрацшо на молселекте G-25 "Reanal", осаждение сульфатаммонийным методом, диализ, фракционирование осажденного белка по молекулярной массе на сс-фарозе4В-200 "Sigma.

В дальнейшем, вместо фракционирования по молекулярной массе на сефарозе, провели фракционирование белка по заряду ионнообмениой хроматографией на катионообменнике сервацел КМ 52. По данным тирозиназ-ной активности отдельных хроматографических фракций в реакции окисления L-ДОФА в ¿-ДОФА-хинон, с последующим образованием меланина, наибольшая удельная активность приходилась на фракции 14, 15 "(/л/с. 3). При разделении дпалнзоваиного белка по молекулярной массе на колонке с сефарозой 4В-200, величины удельной активности коррелировали с концентрацией белка во фракциях, что свидетельствовало о невозможности качс-

ственного разделения белков по молекулярной массе. Дальнейшую очистку ферментного раствора провели на ионообменной матрице сервацел КМ52.

мопсепект G25 сервацел КМ52 fjo фракции

—»— хинон -—меланин

Рис. 3. Удельная активность белковых фракций по накоплению хинонов и меланина

В то время как максимум белка соответствовал фракции 24, наибольшая удельная активность по ¿-ДОФА хинону и меланину приходилась на правое плечо пика - фракцию 29. Выход фермента тирозиназы составил 95%.

Электрофоретический контроль препарата выявил наличие двух компонентов. Гель-фильтрацией установлена молекулярная масса основного белка - 63,1 кДа, второй белок - 2.2 кДа выходил "следовым" пиком. Не исключено, что последний является мономером ферментного белка или одним из изофгрментов тирозиназы. Исследована активность тирозиназного белка с молекулярной массой 63,1 кДа в реакциях с ¿-тирозином и L-ДОФА. По кинетике процесса, константа Михаэлиеа равна Кт= 2,22-10"2 М для субстрата L-ДОФА и Кт=\,9 • 1СГ:' М для ¿-тирозина. Выделенный фермент катализировал и реакцию гидроксилирования ¿-тирозина, и окисление ¿-ДОФА до ¿-ДОФА-хинона. Обе реакции были сопряженными. Эти дан. ные подтверждали тирозиназный характер пигментообразОвания.

Ферментный белок максимально активен в отношении субстратов при рН 7,6, а наиболее стабилен при рН 1,4. Его изоэлектрическая точка лежала при рН 9,9. Термостабильность фермента относительно высока, при 60°С через 20 минут наступала 50 % инактивация фермента. Конверсия L-тирозина и других монофенолов сопровождалась ля.'-периодом от 45 секунд до 8,5 часов, продолжительность которого могла быть сокращена введением в систему Н.4ДН и ¿-ДОФА в следовых количествах. Не исключено, что в реакции гидроксилирования ¿-тирозина ¿-ДОФА играет роль К„-

ферл . пта и ла^-период во многом зависит от скорости накопления каталитических количеств ¿-ДОФА. Активаторами ферментативной активности были также ионы двухвалентной меди в концентрациях п-10~4- п ■ 10"5, и ■ 10"и марганца, железа, магния, цинка. Анионный детергент ДСП служит наиболее эффективным активатором. Оптимальная концентрация для стабилизации и активац'и-л фермента - 6-1(Г5М ДСН. Изучены ингибиторы меланннообразования такие как аскорбиновая, арабоаскор.биновая, лимонная кислота, цистин, цистеин, фенилтиомочевина, днэтилдитиокарбамат, бензидин, бензойная кислота, парааминобензойная кислота, резорцин, гидрохинон, парафенилендиамин, тритон Х-100, азид натрия, натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты. Их можно разделить на редукташиы, хелаторы двухвалентной меди, аналоги субстрата, ингибиторы фенолокси-даз и соли металлов.

Титры полученных к ферменту сывороток составляли 1:1024. Реакция нейтрализации фермента была отрицательной и, следовательно, антнфер-ментная сыворотка не обладала ингибирующим действием по отношению к ферментному белку - тирозипазе. Результаты гистохимической окраски препаратов тирозиназы позволили отнести ее к гликопротеииам. Вероятно активный центр тирозиназы почти полностью представлен агоном. Он, являясь термостабильной небелковой частью фермента содержащей ионы меди, не обладал иммуногенностыо для животных, результатом чего и явилось отсутствие антиферментного эффекта кроличьей сыворотки.

Таким образом доказано, что фермент, осуществляющий механизм пигментообразовання у вибрионов - тирозиназа (монофенол-, диогсснфени-ламии: Огоксидоредуктаза). Тнрозиназа относится к классу мегаллофер-ментсв и обладает низким уровнем специфичности по отношению к используемым субстратам.

Используя общепринятую гипотетическую схему биосинтеза меланина Рэпера-Мсзона и результаты собственных исследований, мы составили обобщенную схему биосинтеза меланина у вибрионов. По нашим данным помимо основных мономерных единиц индолил-5,б-хинона в состав меланина могут входить: ¿-//ОФА-хинон, полухиноновые единицы и структурные единицы феомелашша. Предполагается также, что часть индольныч мономеров распадается до пиррольных фрагментов, которые, в свою очередь, могут включаться в структуру меланинов. Ьиосиптез меланина из различных субстратов осуществляется путем ферментативного окисления фе-нольных предшественников до хннонов и полимеризации и сополммери ¡а-ции высокоактивных хинонов с образованием окрашенных мелаинновых макромолекул.

Модифицировали методику выделения меланина вибрионов и установили существование четырех фракций пигмента (щелоче-, ацетоно-, кнело-торастзоримой и нерастворимой). В количественном отношении превалировали щелоче- и хислоторастпоримыс фракции, а. нерастворимая фракция

присутствовала в минимальных количествах.

Изучение пигментного комплекса по тестам Aurstad К., Dahle H.K. (1972) полностью подтвердило мелаттовую природу пигментов ы.^рио-нов. Образцы меланинов состоят не только из различных мономерных единиц и гетерогенны по химическому составу, но и имеют неупорядоченную пространственную структуру. Спектральные характеристики продуктов мс-ланиногенеза представлены в таблице 2.

Спектры поглощения пигментов V. cholerae Ol

Таблица 2

Процессы меланннообрзования

Да;,пые спектрофотометр»»! з им

Длины волн, регистрируемые ии-динидч. льпые соединении

Длины волн, ретстрнруе-мыс максимумы иогло-ш.ния

Дилпяюп длин волн, регистрируемых соединении

При окислении -• L-ДОФД с участием фермента тирозиназы

- промежуточные соединения

355 -

фраг;

375 ■ 395,

480. 555.

ликароопиловыи мент хромофора ■ 1.2 - бензохинон 430 -хнноновые соединения

500 - ДОФА-хром 580 - полимер индольного __характера

355. 375, 395. 430, 480, 500, 555. 580 -590

355

- конечные соединения

355

375 - 1,2 - бензохинон 395,420 - 430 - хнноновые сс

единения 470 - вещества индольного характера 480. 500-ДОФА-хром 450 - алломелании 520 - фсомсланин 555, 580 - полимер ипдольно! о __характера

355. 375, 385, 395, 420-430, 450. 470, 480, 500, 520. 555, 580

355 - 580

При культивировании V. choleraa Ol из питательно,! среды

355 370,

470

510.

600-

395. 420 - хнноновые соединения • пещееша индольного ха-ракп сра

555, 5Е0- полимер индольного характера полимер индольного характера с более высокой оптической плотностью

355,370, 395. 420-' 430. 470-480,510, 555. 580. 600

355 - 600

Анализируя результаты идентификации и спектрального анализа, пришли к заключению о несовершенстве существующей классификации меланинов. Множество ферментов синергистов и антагонистов, а также различные условия и субстраты, приводят к образованию в результате одного био-

сшггетического процесса огромного количества продуктов, имеющих одну и ту 'же природу, но различных по химической структуре.

-Особый интерес представляет в;.:.яние пигментного комплекса вибрионов на биологические объекты. Полученные нами результат!..! свидетельствуют, что меланины вибрионов не обладают сколько-нибудь выраженной антибактериальной активностью. Определяя влияние мелан. ¡ов на холерогенность штаммов V.cholerac 01 в опытах на изолированных петлях кроликов, к заражающей дозе вибрионов добавляли меланин, полученный из препарата I-ДОФА, от 0,0! до 0,25 мг. Снижение холерогенности наблюдали при концентрациях меланина 0,05 мг/мл и более. Концентрации меланина полностью ипгибирующне холерогенность - 0,15 мг/мл для штаммов из внешней среды и 0,175 мг/мл от человека. Статистический анализ позволил установить высокую степень обратной корреляции количества вводимого меланина и полученных объемов внутрикишечного содержимого (минус 0, 958 при шах = 1,0) для штаммов из внешней среды и (минус 0,95) от человека. Таким образом, наблюдался антитоксический эффект меланина при воспроизведении инфекционного процесса в условиях макроорганизма.

Экстраполяция данных, полученных in vitro, позволяет думать о значительной роли размножения и выживаемости пигментных вибрионов в развитии холерогенного эффекта (табл. 3).

Таблица 3

Холерогенность i: выживаемость V.cholerac 01 с различной степенью

пкгментацнн

Шта мглы Время куль* Течпгрэтура Степень Объем гнут- Котччество OG'ilfe K^JlM'tf-

ТИВГГ/ОВЗИНЯ сультнвиро- ппгментешш рнкишечного чккробных crnoLM КОЕ в

вяиия содержимся о к.тпок в чл полном еъьгчг

час °С б(1\ЧЫ M 7 кНШСЧНОГО содержимого КОС./vi кишечного со-лержнмпго КОС

V.choïerae 18 22 0 11,5 25,6-109 29.4-10"'

2S 37 2 12,0 27,0-10" 32,4-10iU

72 37 ... 5 19,0 40,5-10Ч 77-10"'

К citar 18 22 0 0 0 0

18 37 2 0 . 0 0

72 37 5 7,5 33,7-10" 25.3-10'"

V.chohrae 18 22 0 0 0 0

поп 01 13 37 2 13 20.3-10" 26,4-10'"

72 37 5 ■ 14 34,4-10V 48,2-10'°

В дальнейшем in vivo были использованы штаммы V. cholerr.c OI, V. cholcrae non OI (t)\c+ Pge;¡+).

Анализ результатов показал статистически достоверную корреляцию количества образуемого пигмента с количеством жизнеспособных клеток вибрионов в содержимом кишечника (0,706 - 0,759). А объем кишечного содержимого зависит от количества жизнеспособных клеток (корреляция 0,911 -0,943).

Следовательно, увеличение степени пигментации в большей мере влияло на увеличение количества этих клеток, а в результате увеличивался объем жидкости в петлях. Очищенный пигмент не обладал токсигенпыми, холерогенными или дермопекротическнми свойствами ч не являлся летальным и цитотоксичсскпм агентом. Меланин, полученный в модельных усло-знях, не обладал иммуногенностью для макроорганизма животных.

Рассматривая биологический смысл процесса меланппообразовання вибрионов можно думать, что слабая антигенность и иммуногенность ме-ланиновот) комплекса, находящегося на границе контакта клеток вибрионов с внешней средой, является приспособлением направленным на защиту от функционального действия различных факторов гуморального и клеточного иммунитета. При сохранении основной биологической функции, структура меланинов может варьировать от штамма к штамму. Продукт вторичного метаболизма - меланин, обладая полифункциональными про-тективными свойствами, служит для поддержания гомеостаза и защиты жизненно важных структур клеток вибрионов, а также от воздействия различных биотических и абиотических факторов.

Выводы

1. Доказано, что при определенных условиях культивирования все штаммы V. cholerae cholerae, V. cholerae elior, V. cholerae поп Ol, в том числе V. cholcrae 0139, V.albensis и некоторые представители V. species (V. pamhae-molyticus, V. vulnificus, V.Jluvialis и др.) способны синтезировать пигмент от бурого до темно-коричневого, почти ч. . ного.

2. Установлено, что пигменты образуют вибрионы, обладающие тирозиназ-ной активностью, т.е. структурным геном (генами), контролирующим синтез фермента тирозиназы (tye*Pgm*). Подтверждена хромосомная локализация тирозиназных детерминант.

3. Впервые нами выделен тест-штамм S. saprophytics 22!, который индуцирует в 100% случаез пигментообразование вибрионов вида V. cholerae и некоторых представителей V. species. Штамм S. saprophytics депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича № 221.

4. Экспериментальным путем подобрана система для выделения и очистки фермента - тирозиназы у вибрионов. Определена молекулярная масса выделенных компонентов ферментного белка и получена антиферментная сыворотка.

5. Пигменты, образующиеся из пептидного тирозина при культивировании вибрионов и в результате реакции с ¿-ДОФА в качестве субстрата, имеют меланиновую природу.

6. Реализация механизма пигмеитоо^разования зависит от проницаемости клеточной стенки вибрионов, штаммовых особенностей и условий культивирования. Биосинтез меланина из различных субстратов осуществляется путем ферментативного окисления фенольных предшественников до хино-иов и полимеризации и сополимеризации высокоактивных хинонов с образованием окрашенных меланиновых макромолекул.

7. Пигмент синтезируют жизнеспособные клетки в аэробных условиях, он не является летальным агентом и практически не влияет.на основные функции жизнедеятельности вибрионов.

8. Имеется статистически установленная зависимость антитоксического эффекта от количества меланина вибрионов. Отмечено влияние пигмента на выживаемость вибрионов и величину петельного индекса при внугрики-шечном заражении.

9. Знание свойств и особенностей пигментообразующих вибрионов и пиг-- ментов позволяет использовать этот признак при проведении эпидемиологического анализа, генетических, исследованиях для Выявления диапазона и механизма изменчивости вибрионов, способствует совершенствованию лабораторной диагностики холеры. Утверждены «Методические указания по выявлению и изучению пигментообразующих вибрионов». ГКСЭП РФ. 1994.

Список работ,опубликованных по теме диссертации

1.- Гальцева Г.В., Нагорный С.И. Тирозиназная активность вибрионов // Современные. аспекты проф. зоонозных инфекций: Тез. докл. науч. конф.-Ставрополь, 1991,-С. 235-236.

2. Гальцева Г.В., Нагорный С.И. Staphylococcus saprophyticus 221- индикаторный штамм для выявления tye- активности и функции меланинообрззо-вания у вибрионов //Холера и патогенные для человека вибрионы: Пнформ. бюл,- Ростов-н/Д, 1992,- С. 12-13.

3. Гальцева. Г.В., Нагорный С.И. Staphylococcus saprophyticus (№ 1 НПЧС). 221, предлагаемый в качестве индикаторного для выявления функции мела-

■ нинообразования у вибрионов / Деп. в ГИСК им. Л.А. Тарасовича 13.01.92. №01-15/1. . .

4. Гальцева Г.В., Нагорный С.И., Ус З.И. Дифференциация вибрионов некоторых видов по отношению к лактозе // Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. бюл,- Ростов-н/Д, 1992.- С. 18-19.'

5. Гальцева Г.В., Нагорный С.И., Ус 3,И„ Хайтовнч А.Ь„ Шикулов В.А.. Фриауф Э.В., Мессорош П.Г., Семенова И.А., Юдинова М.И. Выделение новых видов вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. бюл.- Ростов-н/Д, 1992,- С. 18-19.

6. Гурлева Г.Г., Смоликова Л.М., Воронежская Л.Т., Гальцева Г.В., Нагорный С.И.. Ус З.И. Ориентировочная дифференциация патогенных вибрионов различных видов по группам Хенбсрга // Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. бюл,- Ростов-н/Д, 1992.-С. 17-18.

7. Гальцева Г.В., Нагорный С.И. Качественный метод определения тирозиназной активности вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы:

Информ. бюл.- Ростов-и/Д, 1993.-24-25.

8. Нагорный С.И. Экспресс метод определения tye-активности V. cholerac // Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. бюл,- Ростов-н/Д,

1993.-С. 25-26. '

9. Нагорный С.И., Гальцева Г.В., Кирдеев В.К. Морфология и ультраструктура пигмеигообразующ'нх вибрионов // Совр. асп. природной очаговости, эпи-демнол. и профил. особо опасных инфекц. болезней: Тез. докл. науч. конф,-Ставроноль, 1993.-С. 247-248.

10. Гальцева Г.В., Зайденов Д.М., Бруднып P.A., Левкович A.A., Нагорный С И. Вибриофлора водных о6ьс:;гов рекреационных зон Черноморского побережья и ее роль в патологии человека // Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол,- 1994,- № 6,- С. 48- 50.

11. Гальцева Г.В., Ус З.И., Нагорный С.И., Дсрлятко С.К. Перспективы изучения Vibrio anquillanim // Актуал. вопр. профилактики чумы и других инфекционных заболеваний.- Ставрополь, 1994 - С. 123-125.

12. Методические указания по выявлению и изучению пигмент ообразующих вибрионов / Сост. Г.В. Гальцева, С.И. Нагорный, Б.Н. Мишанькии, А.Е. Ли-бинзон, С.К. Дерлятко, P.M. Саямов, Г.Т. Атарова, Л.В. Сгержантова. Причерноморская противочумная станция.-Новороссийск, 1994,- 19с.

13. Нагорный С.И., Гальцева Г.В., Стсржантова Л.В. Спектральный анализ меланина холерных вибрионов / Сб. науч. трудов,- Вып. 1.- Новороссийск.

1994.-С. 197-200. -

14. Стержант^иа Л.В., Нагорный С.И., Гальцева Г.В. Система для выделения и очистки бактериальной тирозиназы / Сб. науч. тр.- Вып. 1.- Новороссийск,

1994.-С. 191-194.

15. Дсрлятко С.К., Гальцева Г.В., Лебедев К.К., Нагорный С.П., Ус З.И. Влияние условий культивирования на гемолитичгскую активность вибрионов /•' Актуал. вопр. профнлак. особо опасных и других инфекционных заболева-

'шш: Матер, науч.-практ. конф. "60 лет противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).- Ставрополь, 1995.- С. 138-139.

16. Нагорный С.И., Гальцева Г.В., Дерлятко С.К., Мельник Т.Б. Пигмснтообра-зование и вирулентность вибрионов // Актуал. вопр. ирофилак. особо опасных и других инфекционных заболеваний: Магср. науч.-практ. конф. "60 лет противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).- Ставрополь.

1995.-С. 197-198.

17. Нагорный С.И., Гальцева Г.В. Система меланинообразозания вибрионов //■ Матер, науч.-практ. конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России.- Саратов, 1997.- Т. 2.- С. 93-94.

18. Нагорный С.И.,'Гальцева. Г.В., Мельник Т.Б. Сравнительное изучение пигментированных и Сеспигмснтных холерных и других вибрионов / Причерноморская противочумная станция,- Новороссийск, 1998,- 8с. Дел. в ВИНИТИ 4.02.98, № 278-В98.

19. Нагорный С.И., Гальцева Г.В., Брудный P.A. Значение tye-активности и мсланинообразования для холерных и других вибрионов // Диап остика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.: Матер, юбилейной науч. коиф., посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ,-Киров, 1998,-С.172-173.