Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур

Акатов, Владимир Семенович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур"

На правах рукописи

АКАТОВ ВЛАДИМИР СЕМЕНОВИЧ

АДГЕЗИЯ КЛЕТОК И РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук.

Санкт-Петербург 1996Г.

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Официальные оппоненты: - доктор физико-математических наук,

профессор С. Я.Френкель доктор физико-математических наук профессор В.В.Смолянинов доктор биологических наук профессор Г.П.Пинаев

Ведущая организация: - Институт биологии развития РАН.

Защита состоится " " ¿С^ОЛ^ ) 1996г. в /7 часов на заседании диссертационного совета Д 063.38.23 при С.-Петербургской государственной техническом университете <195251, С.-Петербург, ул. Политехническая, 29 >.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке С.—Петербургского государственного технического университета

Автореферат разослан " " 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ.—мат. наук

О.Л.Власова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Диссертационная работа связана с проблемой >егуляции размножения клеток и посвящена исследованию роли адгезии слеток, межклеточных контактов, массопереноса между клетками и штательной средой в регуляции роста однослойных и многослойных слеточных культур. По сути, в работе рассматриваются две важные фоблемы биологии клетки в культуре. Первая проблема - каким эбразом адгезия минимально трансформированных и нормальных клеток : твердым подложкам стимулирует их пролиферацию и,

:оответственно, рост клеточных культур. Эта проблема субстратной ¡ависиности клеточной пролиферации включает в себя вопрос о том, ючему рост сильно трансформированных, опухолевых клеток, обычно, ie зависит от их адгезии к твердому субстрату <ТС). Вторая фоблема - какова роль межклеточных контактных взаимодействий, 1еааслеточной адгезии в торможении роста однослойных культур шнимально трансформированных и нормальных клеток, каким образом южно устранить торможение роста однослойных культур и добиться жогослойного "тканеподобного" роста клеток, каковы особенности >егуляции многослойного роста. Понимание основ регуляции шогослойного роста нормальных и минимально трансформированных : леток является принципиальным не только в теоретическом плане, но [ в практической цитотехнологии для выращивания многослойных :леточных культур.

Изучению субстратной зависимости пролиферации клеток в штературе уделено достаточно много внимания. Однако вопрос о 1еханизме этой зависимости до сих пор остается открытым. В конце Ю-х годов появились работы, в которых наметилась тенденция к [сследованию влияния адгезии клеток к подложке на внутриклеточные юказатели. В этих работах (Margolis et al.,1983, Schwartz et il.,1989) показано влияние адгезии клеток к ТС на внутриклеточный >Н <pHi>, который в литературе рассматривается как один из важных »акторов в регуляции клеточной пролиферации. Однако подъем pHi при [дгезии в этих работах наблюдался и в таких условиях, когда не >ыло клеточного роста. Поэтому оставался открытым вопрос о ¡заимосвязи субстратной зависимости клеточной пролиферации с >лиянием адгезии клеток на внутриклеточный рН.

В исследовании плотностного торможения роста клеточных культур : началу 80-х годов сложилось представление о том, что причиной

торможения иогут быть как ограничения нассопереноса между клетками и культуральной средой (диффузионные ограничения клеточного роста), так и межклеточные контактные взаимодействия (Васильев, Гельфанд, 1981). Однако оставалось неясный в какой степени каждый из этих факторов определяет торможение роста однослойных и многослойных клеточных культур, каковы особенности стимуляции и торможения многослойного роста зависимых от прикрепления клеток в культуре.

Цель работы. Цель настоящей работы состояла в выяснении роли адгезии клеток в регуляции клеточного роста in vitro.

Основными задачами работы являлись;

- Определение роли внутриклеточного рН в зависимости пролиферации клеток от их адгезии к твердому субстрату.

- Выяснение роли межклеточной адгезии и диффузионных ограничений нассопереноса в регуляции однослойного и многослойного роста зависимых от прикрепления клеток в культуре

- Изучение кинетики пролиферации и особенностей состояния клеток в многослойных клеточных культурах;

- Разработка методов и аппаратуры выращивания и исследования многослойных клеточных культур.

Научная новизна.

- На основе экспериментальных результатов сформулировано новое представление о связй пролиферации нормальных и минимально трансформированных клеток с влиянием их адгезии к ТС на pHi.

- Используя разработанные оригинальные методики измерения рН и содержания кислорода непосредственно около клеток получено прямое экспериментальное доказательство определяющей роли нассопереноса в торможении роста однослойных культур.

- Впервые показано, что торможение роста однослойных зависимых от прикрепления клеточных культур можно устранить за счет ускорения нассопереноса без механического влияния на нежклеточные контакты. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что причиной тормохения роста изученных клеток в монослое являлись не межклеточные контакты, а ограниченный массоперенос.

- Теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность получения многослойного роста зависиных от прикрепления клеток in vitro без перфузии путем выращивания на подложках с малым радиусом кривизны, например, на тонких волокнах, за счет быстрого диффузионного нассопереноса.

— Впервые на основе анализа диффузионной модели теоретически юказана и экспериментально подтверждена возможность управления многослойным ростом клеток в культуре путем регуляци их диффузионного массообмена со средой.

— Получены новые данные о кинетике пролиферации и об особенности состояния клеток в многослойных клеточных культурах в сравнении с однослойными неперфузируемыми культурами.

— Обнаружено предельное ограничение роста многослойных терфузируемых культур зависимых от прикрепления клеток при тлотностях в 20-30 раз превышающих плотности насыщения однослойных меперфузируемых культур.

— На основе полученных экспериментальных данных сформулирована оригинальная гипотеза об определяющей роли межклеточных контактов з передаче сигналов стимуляции пролиферации зависимых от прикрепления клеток в многослойных культурах. Предложен механизм, обьясняющий предельное ограничение многослойного роста клеток хп

— Разработаны новые способы и аппаратура для исследования тараметров околоклеточной среды, для исследовани. адгезии клеток к твердому субстрату, для выращивания многослойных клеточных сультур.

Практическая ценность. Совокупность представленных в диссертации данных можно рассматривать как значительный вклад в эазвитие нового научного направления в биологии клетки в культуре, з цитотехнологии - выращивание многослойных "тканеподобных" слеточных культур. Представленные в диссертации результаты и зыводы имеют практическую ценность как основа для разработки методов выращивания многослойных клеточных культур.Принципиальными являются данные о том, что не межклеточные контакты, а

ограниченный массоперенос определяет торможение роста зависимых от прикрепления нормальных и минимально трансформированных клеток з исследованных однослойных культурах. Важное практическое значение имеют данные о кинетике пролиферации и об особенностях метаболизма клеток в многослойных культурах, о предельных ограничениях роста многослойных клеточных культур, о механизме зтого ограничения. Эти результаты учитывались при разработке лредставленных в диссертации способов и аппаратуры для

зырадивания многослойных клеточных культур.

Результаты исследования зависимости пролиферации клеток от

адгезии к твердому субстрату и ее связи с pHi имеют практическую ценность, поскольку определяют конкретное направление в исследовании механизма субстратной зависимости пролиферации клеток. Они также представляют интерес для понимания того, почену рост опухолевых клеток, как правило, не зависит от их адгезии к твердому субстрату.

Практическую ценность имеют также результаты разработки методов исследования клеток в культуре, методов и аппаратуры для выращивания многослойных клеточных культур.

Результаты, представленные в диссертации, использовались в НПО "Биоприбор" АН СССР при разработке совместно с Институтом биологической физики АН СССР комплекса приборов для камерного культивирования клеток. Изложенные в диссертации положения, разработанные методы, аппаратура могут быть рекомендованы к внедрению в Институтах РАН, РАМН, Мин.Сельского Хозяйства, связанных с использованием клеточных культур в научных и практических целях.

Личный вклад автора. Результаты и выводы, представленные в диссертации, получены либо лично автором, либо при непосредственном участии автора.

Аппробация работы. Основные результаты работы докладывались на I международной конференции по измерениям в биологии и медицине ИМЕКО <1981 г., Суздаль), на I Биофизическом сьезде <1982 г., Москва), на I, II, III, IV Всесоюзных совещаниях по культивированию клеток животных и человека <1983, 1985, 1990, 1994 гг., Пущино), на I Международной конференции молодых ученых по биофизике <1985 г., Братислава), на III Всесоюзной конференции по производству ветеринарных биопрепаратов <1987 г., Москва), на Всесоюзной конференции "Гидродинамика и процессы переноса в биореакторах" <1988 г., Новосибирск), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" <г.Ленинград, 1989 >, на совещании "Биология клетки в культуре" <1992 г., Санкт-Петербург), на международной конференции по межклеточным коммуникациям <1994- г., Пущино)

Публикации. Основные результаты и выводы, представленные в диссертации, изложены в 27 публикациях в журналах и сборниках статей, в 10 тезисах в сборниках конференций, в 8 авторских свидетельствах на изобретение и патентах.

Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из 7 глав,

заключения, изложения основных результатов и выводов, приложения и списка литературы. Первая глава посвящена обзору литературы, анализу литературных данных, формулировке цели и задач исследования. Во второй главе описаны материалы и методы исследования. В следующих 5 главах изложены основные результаты работы. Диссертация изложена на 256 страницах текста. Список литературы включает 407 работ на русском и английской языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

I. ЗАВИСИМОСТЬ РОСТА КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ОТ АДГЕЗИИ КЛЕТОК К ТВЕРДОМУ СУБСТРАТУ СТС). РОЛЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО рН (рНО.

На протяжении 80-х годов было получено много данных, свидетельствующих о подъеме рН1 под действием ростовых факторов в клетках многих типов. Это дало основание предполагать связь стимуляции клеточной пролиферации с изменением рН1. В конце 80-х годов возникло предположение, что адгезия нормальных и минимально трансформированных клеток к ТС стимулирует их пролиферацию также через подъем рШ, Было показано, что адгезия клеток к ТС действительно вызывает подъем рН1. Однако это происходило не только в ростовой среде, но и в средах, в которых роста не наблюдалось. Для того, чтобы выяснить, существует ли корреляция между пролиферацией и влиянием адгезии на рН1. мы изучали кинетику рНг в ходе культивирования зависимых и независимых от прикрепления клеток в условиях роста и без роста. рН1 и рост зависимых от прикрепления клеточных культур.

Изучали кинетику рНг зависимых от прикрепления фибробластов китайского хомячка ССН), клеток N114 ЗТЗ и СПЭВ при культивировании на стекле в среде с сывороткой (есть рост> и без сыворотки <нет роста), а также в суспензии с сывороткой и без сыворотки (нет роста). На рис.1 представлены результаты измерений для клеток 1Ч1Н ЗТЗ. На стекле в среде с сывороткой клетки пролиферировали с

характерными для этой линии временем удвоения около 20 ч и

плотностью насыщения 60-80 тысяч кл./см . В первые 15-30 мин после посева наблюдался подъем рНг от 6.85 до 7.25-7.3. Среднее по популяции рН1 в ходе роста культуры было 7.20 ± 0.02. По мере выхода в стационарную фазу (60-70 ч) начиналось падение рН1 к величине 6.93 ± 0.01. На стекле в среде без сыворотки клетки также прикреплялись, распластывались, но не пролиферировали. Величина рШ в первые 15-30 мин поднималась от 6.8-6.9 до 7.3, и через 3-4 часа начинала падать, достигая к 5-7 часам начального значения

около 6.85. В суспензии клетки не пролиферировали независимо от наличия сыворотки в среде. Величина рШ в суспензии без сыворотки после посева была около 6.9 и в течении суток оставалась в диапазоне 6.85-6.9. В суспензии с сывороткой в первые минуты происходил подъем рН1 от 6.9 до 7.0, а затем к 4 часу рН1 уменьшался до 6.9 и мог оставаться на этом уровне длительное время.

Динамика рН1 клеток СН и СПЭВ была аналогично той, что для 1Ч1Н ЗТЗ, но наблюдались свои особенности. Например, у клеток СН (рис.2> адгезия к стеклу в среде без сыворотки, как и в среде с сывороткой, вызывала подъем рН1 от 6.6 до 7.2, но падение рН1 в среде без сыворотки начиналось позднее, через 12 часов, и заканчивалось на уровне 6.6 через 24-28 ч. Т.е., в отличие от ЫХН ЗТЗ, величина рН1 клеток СН оставалась высокой, хотя и недолго, при временах, превышающих длительность лаг-фазы (около 12 ч), но роста культуры не наблюдалось. У клеток СПЭВ падение рН1 после подъема, вызванного адгезией, было еще более медленное, чем у СН. Представленные данные не являются простым следствием изменения рН среды (рНо), поскольку получены в диапазоне рНо 6.9-7.4, в котором по нашим наблюдениям рНх не зависел от рНо. На основе изложенных результатов можно сделать следующие выводы.

Пролиферация зависимых от прикрепления клеток изученных модельных линий коррелировала с повышенным уровнем рНх. Адгезия клеток к стеклу вызывала повышение рН1 до величин, характерных для пролиферирующих клеток, но в среде без сыворотки это защелачивание было непродолжительным. Пролонгирование характерного для пролиферации защелачивания клеток, вызванного адгезией к ТС, происходило только при наличии сыворотки в среде. Сыворотка вызывала повышение рНх до зн <ений меньших, чем у пролиферируюпих клеток.

рН1 и рост независимых от прикрепления клеточных культур.

Кинетику рН1 независимых от прикрепления клеток также изучали в различных условиях культивирования: на стекле с сывороткой в среде, в суйпензии с сывороткой и без сыворотки. В исследовании использовали 3 линии клеток, способных расти в суспензии: ВНК-21,

и 1_5М. На рис. 3 показана кинетика рН1 в ходе пролиферации клеток ВНК—21 в суспензии (А), на стекле <В> и при культивировании в суспензии без сыворотки <нет пролиферации) (Б). В суспензии с сывороткой после разведения культуры в стационарной фазе свежей

О 10 20 50 70 ч О 10 20 ч

Рис.1. Кинетика внутриклеточного рН в ходе культивирования :леток N114 ЗТЗ на стекле в среде с сывороткой (А> и без сыворотки :Б), в суспензии с сывороткой <В> и без сыворотки (Г). По оси |бсцисс —время после посева по оси ординат слева — рН1,

:права- число клеток на 1 см , логарифмическая шкала; х - кривая >оста. Здесь и далее, каждая точка — среднее значение рНг для ¿10 :леток. Стандартная ошибка среднего рЩ— не более 0.03 ед. рН

■ Н1 '.2

'.О

.. 8

20 40

.0 -

60 ч

i «

8 24

рН1 7.2

7.0

5 6. 8

6. 6

7.0 6.8 6.6

- Б 0 • •

— 1 • *• 0

• • •

- •

г ■ I 1 • I

0 20 40 ч

• 1 1 1 « //-1-

24 ч

Рис.2. Кинетика внутриклеточного рН в ходе культивирования леток СН на стекле в среде с сывороткой (А) и без сыворотки (Б>, суспензии с сывороткой (В) и без сыворотки (Г). По осям - как а рис.1.

ростовой средой <1:20- 1:10) ^усредненная по всем экспериментам

величина рН1 в первые 10 минут была 6.7 ± 0.02. В первые 5 ч

лаг—периода роста усредненный рШ равен 6.73 ± 0.02. Среднее

значение рН1 в фазе роста - 6.76 ± 0.02. В стационарной фазе при

рН среды не ниже 6.9 рН1 понижался до 6.70 ± 0.02. В суспензии без

сыворотки клетки не пролиферировали и усредненная величина рН1

оставалась равной 6.70 ± 0.02 в ходе культивирования <60 - 80 ч)

во всех экспериментах. При посеве на стекло клетки прикреплялись и

начинали распластываться в первые 1-3 ч, после лаг-периода <15 ч>

начиналась клеточная пролиферация с временем удвоения, как и в

суспензии 13 ч, а после 60 ч наступала стационарная фаза с

5 2

плотностью насыщения около 3x10 клеток/см . Кинетика рНг

отличалась от той, что была в суспензионной культуре. В ходе распластывания в первые 8 часов наблюдался подъем усредненных по популяции значений рШ до 6.9-7.2, а затем происходило уменьшение рН1 до значения 6.8 к 16-20 ч после посева. В фазе роста культурьг величина рЩ, усредненная по всем экспериментам, составляла 6.80 + 0.02, что практически совпадало с рН1 растущих в суспензии клеток.

Клетки линии растут в суспензии и на стекле в присутствии сыворотки в среде <время удвоения 17ч). Прикрепление к стеклу слабое, распластывания не происходит. В среде без сыворотки пролиферации не наблюдается. Кинетика среднего по популяции рШ в суспензии с сывороткой и без сыворотки была подобна той, что у клеток ВНК-21. В ходе лаг-периода и фазы роста усредненная по 6 экспериментам величина р1Н была 7.03 ± 0.01 и в стационарной фазе снижалась до 6.85 ± 0.03. В суспензии без сыворотки рШ в ходе все: экспериментов практически не изменялся, и среднее значение составляло 6.97 ± 0.01. Кинетика рШ клеток растущих на стекле

была такой же, как в суспензии. Усредненная по 5 экспериментам величина рШ в лаг—фазе и в фазе роста была почти как в суспензии - 7.06 ± 0.02.

Несколько иная ситуация наблюдалась при изучении кинетики рНх клеток линии 1_ЗМ, полученной в результате селекции субпопуляции распластывающихся клеток культуры СБ. Клетки Ь5М растут в среде ОМЕ с сывороткой на твердом субстрате в распластанном состоянии (время удвоения - 29 ч) ив суспензии. Мы обнаружили также пролиферацию этих клеток в среде без сыворотки на стекле и в суспензии. Время удвоения и величина рШ в состоянии роста и покоя клеток в среде с сывороткой и без сыворотки, на стекле и в

>Hi

Г.О i. 8

i. 6

7. 2 7. 0 S>. 8 b.6

pHi

7.0 6. 8 6. 6

• » i i » л* ••,.• ». , •

10"

i i '_i

O 20 40 60 80

O 8 16 24 32 ч

Рис.3. Кинетика внутриклеточного рН в ходе культивирования клеток ВНК-21 в суспензии с сывороткой <А> и без сыворотки (Б), на стекле в среде с сывороткой <В>. По оси абсцисс -время после посева <ч>, по оси ординат слева - рН1. справа - число клеток в 1 мл, логарифмическая шкала, х — кривая роста. Каждая точка — среднее значение рЩ для 40 клеток. Стандартная ошибка среднего р)Н- не более 0.03 ед. рН. Представлены данные 8 (А), 4. (Б), 5 <В) экспериментов.

Таблица 1.

Показатели роста и рШ клеток 1.5М в разных условиях культивирования.

условия культивирования время удвоения индекс пролиферации величина pHi рост покой

на стекле 102 сыворотки 29 ч 8-12 7.32 7.10

на стекле без сыворотки 40 ч 4-6 7.18 7.13

суспензия 10S сыворотки 37 ч 3-5 7.13 6.95

суспензия без сыворотки 48 ч 2-3 6.97 6.95

суспензии представлены в таблице 1. Рост этих клеток без сыворотки связан, по всей видимости, с аутостимуляцией, поскольку лаг-фаза сильно зависела от посевной концентрации. Представленные в табл. 1 результаты показывают, что переход от состояния пролиферации к покою без сыворотки происходил без существенного изменения рН1 (£ 0.05), пролиферация в некоторых условиях наблюдалась при значениях рШ меньших или равных рН1 в состоянии покоя в других условиях. Следовательно, у клеток [.БМ нет однозначного соответствия между рШ и клеточным росток. Переход от покоя к росту может осуществляться, как и у клеток ВНК-21 и ив, без существенного защелачивания цитоплазмы. С другой стороны, есть корреляция между скоростью пролиферации и величиной рН1 в разных условиях культивирования. Кроме того, эти клетки проявляют частичную зависимость от прикрепления. Она состоит в том, что скорость пролиферации в одной и той же среде на стекле выше, чем в суспензии.

Таким образом, данные для способных расти в суспензии клеток ВНК—21, и 1_БМ позволяют сказать, что пролиферация этих клеток может осуществляться без существенного защелачивания цитоплазмы (в сравнении с состоянием покоя), которое обеспечивается наличием сыворотки в среде без прикрепления к стеклу. Адгезия к стеклу вызывала либо непродолжительное повышение рШ, необязательное для пролиферации (ВНК-21), либо длительное повышение рН», которое коррелировало с увеличением скорости пролиферации (ЦБ!")). Данные получены при рН среды <рНо) в оптимальном для пролиферации клеток диапазоне 6.9-7.4., в котором рН1 не изменялся.

Адгезия клеток и рШ.

Учитывая приведенные выше результаты вызывают интерес вопросы о соотношении кинетических особенностей адгезии клеток к твердому субстрату и рН1, о механизме повышения рШ в результате адгезии, о взаимосвязи между рШ и распластаиностыо клеток, о влиянии межклеточной адгезии на рШ. В диссертации приведены некоторые данные, касающиеся этих вопросов.

Исследование кинетики морфологических изменений клеток при адгезии к стеклу на примере клеток СН, выполненное с помощью разработанного автором метода нарушенного полного внутреннего отражения <НПВ0), свидетельствует о существовании двух этапов. На первом этапе, длительностью не более 5 -10 мии, происходит быстрое частичное уплощение нижней поверхности клетки <около 20« площади

роекции клетки на твердый субстрат), ее приближение к твердому убстрату на расстояние 100—300 ни и прикрепление. На втором этапе [лительностью около часа происходит дальнейшее медленное уплощение леточной поверхности, обращенной к стеклу, распластывание клеток, спользуемый метод НПВО основан на изучении рассеяния света летками на стекле в режиме полного внутреннего отражения от раницы стекло — раствор: зависимость рассеяния света от угла адения светового пучка определяется формой клеточной поверхности, бращенной к стеклу, и показателен преломления кортикального слоя итоплазмы.

Исследование кинетики рН1 в первые минуты адгезии показало, что одъем рН1 происходил в первые 15-20 мин, то есть, на первом этапе дгезии <рис.4>. По всей видимости, по этой причине мы не бнаружили разницу между рНа распластанных и прикрепленных ферических клеток в первые 1-2 часа после посева.

Необходимо отметить, что у всех исследованных клеточных линий аблюдали повышение рН1 в процессе адгезии клеток к стеклу. Однако осле завершения адгезии величина рН1 у распластанных клеток могла нижаться до уровня, характерного для неприкрепленных клеток <у леток ВНК-21 - перед фазой роста, у клеток СН, 1Ч1Н ЗТЗ и СПЭВ - в реде без сыворотки и в стационарной фазе культивирования, ис.1,2,3). По—видимому, адгезия клеток сопряжена с ащелачиванием цитоплазмы, но однозначного соответствия между рН1 поддержанием распластанного состояния клеток не существует.

Рис.4. Кинетика рН1 при адгезии клеток СН в среде с сывороткой. По оси абсцисс - время после посева (мин).

О 10 20 30 мин

Относительно влияния межклеточных контактов можно сказать, что

0 мере роста культур клеток СН, СПЭВ, Ы1Н ЗТЗ величина рН1 ставалась практически на одном уровне в редких (одиночные клетки)

1 в плотных культурах контактирующих друг с другом клеток. Можно акже отметить данные о том, что величина рН1 зависимых от [рикрепления клеток СН, СПЭВ и Ы1Н ЗТЗ оставалась в суспензии с •Ывороткой и без сыворотки низкой независимо от того, были они ■диночными или в агрегатах. То есть, адгезия зависимых от

прикрепления клеток друг к другу в исследуемых культурах не стимулировала клеточный рост и не влияла на величину рЩ.

В диссертации приведены данные, касающиеся механизма повышения рШ в результате адгезии клеток к стеклу. В клетках СН адгезия вызывает защелачивание цитоплазмы путей активации Ма+/Н+ обмена. В клетках 1Ч1Н ЗТЗ адгезия клеток вызывала кратковременную <0.5-1 ч> активацию Ма+/Н+обмена, длительную активацию транспорта бикарбоната в цитоплазму, а также повышение рН1, независимое от наличия в среде № и бикарбоната и нечувствительное к олигомицину. Адгезия клеток СПЭВ к стеклу вызывала подъем ■ рН1 независимо от присутствия ионов № и бикарбоната в среде, не'активировала Ыа+/Н+ обмен и транспорт бикарбоната в цитоплазму, несмотря на высокую активность этих систем регуляции рШ в данной клеточной линии. Эти данные указывают на разнообразие путей повышение рН1 при адгезии клеток различных типов. Часть имеющихся в клетке систем регуляции рЩ может активироваться, а часть нет. Наблюдается активация и №+/Н+ обмена, и транспорта бикарбоната и другие пути повышения рН1.

Приведенные в разделе I данные для зависимых и независимых от прикрепления клеток позволяют сформулировать представление о связи между субстратной зависимостью клеточной пролиферации и влиянием адгезии на рН1. Оно состоит в том, что для роста зависимых от прикрепления клеток необходимо повышение рНх, которое вызывает адгезия клеток к твердому субстрату. Без сыворотки это повышение непродолжительно и роста клеточной культуры не происходит. Сыворотка сама не обеспечивает необходимого для пролиферации повышения рН1, но оказывает пролонгирующее действие на защелачивание цитоплазмы, вызванное адгезией. Пролиферация независимых от прикрепления клеток может осуществляться при небольшом защелачивании цитоплазмы, которое обеспечивается присутствием сыворотки в среде, или без защелачивания. Поэтому для роста независимых от прикрепления клеток нет необходимости в адгезии, как в факторе, вызывающем повышение рНх, хотя адгезия может вызывать повышение рН1 и увеличение темпа пролиферации. Необходимо подчеркнуть, что гипотеза не подразумевает рН1 в качестве единственного внутриклеточного показателя, регулирующего пролиферацию клеток.

II. ТОРМОЖЕНИЕ РОСТА ОДНОСЛОЙНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. РОЛЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ И ДИФФУЗИОННЫХ ОГРАНИЧЕНИЙ МАССОПЕРЕНОСА.

Во второй разделе представлены экспериментальные данные, полученные с целью выяснения роли межклеточных контактов и массопереноса в торможении роста однослойных культур.

Концентрации веществ_в_околоклеточной_области_в

однослойных культурах. Диффузионные ограничения массопереноса.

Согласно гипотезе диффузионных ограничений рост в плотных культурах тормозится вследствие медленного массопереноса от клеток в среду. В результате этого околоклеточная среда обедняется по питательным компонентам, насыщается ингибирующими рост продуктами метаболизма и становится неблагоприятной для клеточного роста. При этом среда вдали от клеток может оставаться благоприятной для роста. Для проверки этой гипотезы мы разработали метод измерения показателей околоклеточной среды. Он основан на том, что в качестве подложки для клеточных культур используется мембрана электрода. Мы использовали этот метод для измерения

околоклеточных рН и содержания кислорода.

Для измерения околоклеточного рН клетки высевали на плоскую мембрану рН электрода, которая является дном культурального сосуда (рис.5). Анализ измерения в присутствии живых и фиксированных клетох на мембране, в условиях перемешивания среды и без перемешивания свидетельствуют о том, что в присутствии монослоя клеток при существующих потоках кислых метаболитов из них этим методом измеряется рН среды непосредственно над клетками, на расстояниях, превышающих дебаевский радиус экранирования от зарядов клеточной поверхности (0.8 нм). Анализ измерения при малых количествах клеток на мембране электрода, выполненный в приближении периодической функции рН вблизи мембраны на основе решения уравнения Лапласа для распределения потенциала внутри мембраны, с учетом характерного времени диффузионного переноса в

среде в плоскости: мембраны, показал, что при. толщине мембраны 300

мкм и при равномерном распределении клеток при плотностях > 10

клеток/см измеряемая величина равна среднему значению рН в околоклеточной области. На рис.бА показана кинетика рН околоклеточной среды для клеток СН после посева при плотности, равной плотности насыщения монослоя и в 3 раза меньше. На рис.бБ представлена кинетика околоклеточного рН после замены среды над монослоем клеток СН на свежую в стационарной фазе культвирования.

Рис.5. Схема измерения рН околоклеточной среды: 1-рН электрод с плоской ненбраной <2), 3-клетки, 4—электрод сравнения, 5 -хлорсеребряный полуэлемент, Ь - рН-метр.

Рис. 6. А -кинетика рН околоклеточной среды <1,2) и ^рН на расстоянии^ см от клеток^СН <3) при плотностях посева 5x10 <1,3) и 2x10 <2) клеток/см . Б - кинетика околоклеточного рН после замены культуральной среды над мoнocлoeg клеток СН ^ стационарной фазе на свежую. Плотность культуры—5x10 клеток/см . По оси абсцисс - время после посева и замены, ч; по оси ординат -околоклеточный рН. <],) - выключение перемешивания.

la рис 6A показана также кинетика рН среды на расстоянии 2 си от юнослоя клеток. Согласно полученным данным околоклеточный рН при 1Лотностях больших или равных плотности насыщения монослоя уменьшается за 5-6 ч от 7.2-7.5 до значений 6.5-6.6, при которых ■фоисходит ингибирование клеточной пролиферации. Это происходит сак при плотном посеве в начале культивирования, так и при замене сультуральной среды на свежую над монослоем в стадии торможения >оста. Величина рН среды , удаленной от клеток на расстояние ).5-2см, оставалась в это время благоприятной для клеточного >оста. Эти результаты непосредственно показывают, что накопление :ислых продуктов метаболизма в околоклеточной среде в результате 1едленного массопереноса между клетками и средой является >актором, тормозящим рост прикрепленных клеточных культур в :тационарных условиях.

Попытка измерения содержания кислорода вблизи монослоя клеток >ыла предпринята ранее (Glinos, Werrlein, 1974). Для этого юпользовали микроэлектрод. Полученные этими авторами значения удержания кислорода вблизи клеток (около 20 мм Нд) были меньше, ен вдали <150 мм Нд). Однако, при таких значениях в литературе отмечается рост клеток в культуре, поэтому оставалось неясно, вляется ли низкое содержание кислорода около клеток фактором, ормозящим рост плотных культур. Можно предполагать, что рисутствие микроэлектрода вблизи монослоя способно вызвать икроциркуляцию среды вблизи клеток, и это приведет к завышенному качению содержания кислорода вблизи клеток. Мы измеряли одержание кислорода около клеток используя схему, изображенную на ис.7. Клетки помещали на газопроницаемую мембрану кларковского ислородного электрода. Клетки могли распластываться и расти на ембране. Тем самым условия измерения были максимально приближены условиям культивирования по массопереносу. Измеряли показания лектрода без клеток и в присутствии монослоя живых и иксированных клеток на мембране, в условиях перемешивания ультуральной среды и после прекращения перемешивания, при нгибированном дыхании и без ингибирования. На рис.8 представлены екоторые кинетические кривые после прекращения перемешивания, нализ таких кривых в указанных выше различных условиях позволил делать вывод о том, что присутствие клеток без дыхания не влияло а показания кислородного электрода. Все отличия в кинетике оказаний электрода с клетками и без клеток на мембране были

Рис.7. Схема установки для измерения кинетики содержания кислорода в околоклеточной области. 1 - платиновый катод; 2 анод; 3 - газопроницаемая мембрана кислородного электрода, которая одновременно служит в качестве подложки для клеток; 4 - электролит кислородного электрода; 5 - устройство для непрерывной регистрации тока электрода; 6 - клетки; 7 - культуральная среда; 8 пневматическое устройство для перемешивания культуральной среды.

О '<»0 80 минуты

Рис.8. Кинетика показаний кислородного электрода при перемешивании и после прекращения перемешивания(|)без клеток и в присутствии клеток на мембране электрода. 1 - кинетика показаний после внесения в ячейку раствора сульфита; 2 - в присутствии монослоя распластанных клеток либо досле посева ^с плотностью.^ равной пл2Тности насыщения - 5x10 клеток /см и 3 2x10 клеток/см ; 4 - без клеток, в присутствие монослоя клеток, фиксированных формалином; 5 - в присутствии монослоя клеток при ингибировании их дыхания цианидом.

связаны с дыханием. Сравнивая кинетику показаний датчика после прекращения перемешивания среды в присутствие клеток и без клеток на мембране мы показали, что монослой клеток уменьшает содержание кислорода в околоклеточной среде за 20 мин от 100-150 мм Hg до 1-2 мм Hg, то есть, до значений, при которых по данным литературы наблюдается' ингибирование клеточной пролиферации. Следовательно, в плотных культурах клеток СН вследствие медленного массопереноса состояние ингибируюией рост гипоксии наступает еще быстрее, чем ацидоз.

Полученные результаты измерения околоклеточных pH и содержания кислорода непосредственно демонстрируют быстрое обеднение околоклеточной среды до ингибирующих рост значений по компонентам питания и насыщение ингибируюдими рост метаболитами вследствие медленного массопереноса между клеточной культурой и питательной средой, подтверждая гипотезу диффузионного ограничения роста прикрепленных клеточных культур.

Устранение плотностного торможения роста однослойных культур в условиях перфузии питательной средой. Роль межклеточных контактов.

Известно, что перфузия прикрепленной культуры питательной средой устраняет торможение клеточной пролиферации в монослое и инициирует многослойный рост клеток (Kruse, Miedema, 1965). Это можно объяснить не только интенсификацией массообмена клеток со средой (Stoker, 1973), но также изменением межклеточных контактных взаимодействий при воздействии движущейся среды на клетки (Curtis, Seehar, 1978). В диссертации приведены данные, полученные с целью однозначного выяснения справедливости этих предположений. Для этого изучали пролиферацию клеток вблизи пористой мембраны, отделяющей клетки от протекающей среды и устраняющей движение среды в околоклеточной области.

Клетки культивировали на стеклянных подложках в специально разработанной и запатентованной камере (рис. 9). Выбирая толщину подложки можно задавать различное расстояние (0.2-Ю мм) от клеточной культуры до протекающей над мембраной среды. Для культур клеток СН, NIH ЗТЗ, СПЭВ наблюдали многослойный рост в таких перфузионно-диффузионных камерах. При расстояниях от подложек для клеток до пористой мембраны около 0.2 мн плотность выросших многослойных культур в 10-15 раз превышала плотность насыщения монослоя без перфузии. Для того чтобы выяснить, было ли при перфузии среды над мембраной движение среды под мембраной в лунках

около клеток, которое можно рассматривать как причину изменения межклеточных взаимодействий, исследовали характер массопереноса под мембраной. Для этого теоретически определяли, какова должна быть кинетика выхода красителя из лунки 1 (рис.9} в протекающую среду при диффузионном массопереносе, то есть без движения среды в лунке 1. Затем сравнивали с ней кинетику, полученную экспериментально на основе фотометрического изучения выхода красителя фенолового красного из лунки в протекающий над мембраной раствор, не содержащий фенолового красного. Изменение концентрации красителя в лунке находили решая нестационарное уравнение диффузии:

__О 0 < 1 )

9 Ь а х2

с граничными условиями третьего рода , в которой заложено равенство нулю концентрации красителя над мембраной:

С(х,0>=С0 при 0< X <Ь; С<х,Ъ)=0 при х > Ь+Ь0;

° 1х~ ПРИ < 2 )

С — концентрация красителя, О - его коэффициент диффузии. Полагали, что проницаемость мембраны (3 определяется соотношением 13=йу/Ъ^ ,где Иф - толщина мембраны, у — пористость мембраны, х-координата в направлении, перпендикулярном плоскости мембраны, х=0: на дне лунки, х=И на поверхности мембраны, обращенной к лунке. Решением уравнения (1) с граничными условиями <2) является быстро сходящийся ряд <Лыков, 1967), в котором можно ограничиться первым членом, учитывая реальные экспериментальные условия: С(х,Ъ)=2С051П(1.35)со5(1-35х/Ь)ехр<—1.80Ъ/Ь2)(1,35+в1п<2.7)/2) СЗ) Подставляя решение <3) в уравнение <1Ф/йх=—КС<х,ЮФ, описывающее изменение светового потока, проходящего через раствор красителя, и учитывая пропорциональность тока фотоумножителя I падающему световому потоку Ф, находили в результате интегрирования кинетику тока 1<<:) при диффузионном выходе красителя из лунки:

1<Л)=1о ехрС-АЬ ехр С-1.804/Ь2)) <4)

Хо - ток в отсутствие красителя, А- паранетр не зависящий от I.

Экспериментальные зависимости в координатах Хп С—Хп (Ю)/1о))

от 1 <рис.10), как и теоретические, согласно (4), были линейны, их

наклон обратно пропорционален 11 , и они не зависели от потока среды О, за исключением малых О, при которых нарушалось допущение <2) о равенстве нулю концентрации красителя в растворе над

Рис.9. Схеиа экспериментальной установки для изучения [ногослойного роста клеточных культур и участок камеры в разрезе, -лунка, одно из сквозных отверстий в пластине 2; 3-нижнее плоское :текло камеры; 4—подложка для клеток 5; 6—пористая мембрана; 7— герфузионная среда; 8—насос; 9-емкость со средой для герфузии; 10— емкость со свежей резервной средой; 11—емкость для )Тработанной среды; 12- инвертированный микроскоп;

3-фотоэлектронная приставка ФМЭЛ-1 и фотокамера; 14-регистратор ■ока фотоумножителя приставки; 15- блок приготовления и подачи ■азовой смеси; 16- 19 — газовые фильтры; 20-22 - клапаны •правления режимом перфузии; 23— осветитель микроскопа.

'ис.10. Экспериментальная :инетика выхода красителя 13 лунки 1 (рис.9) (дока->ательство диффузионного :арактера массопереноса в |унке при движении среды |ад мембраной), [о оси абсцисс-время после [ачала выхода красителя, [ин; по оси ординат величина п (-1п (1(1;)/1о), I <1; > -ок фотоумножителя. - Ь=1мм, поток раствора 1=6 мл/мин; 2- Ь=1мм, !—1 мл/мин; 3 - Ь=0.5мм, !—6 мл/мин.

мембраной, которое использовалось при выводе формулы <4).

Вычисленное согласно этой формуле из наклона экспериментальной

зависимости значение коэффициента диффузии для фенолового красного -5 2

равно (О.8+0.15)х10 см /сек, что соответствует значениям Ь для подобных молекул. Все это свидетельствует о диффузионном характере массопереноса в лунках и об отсутствие в ней потоков среды при ее протоке над мембраной. Поскольку в этих условиях мы наблюдали многослойный рост клеточных культур, то это означает, что торможение роста клеток в монослое устранялось исключительно за счет интенсификации массопереноса без движения среды над клетками и, следовательно, без влияния на межклеточные взаимодействия. Го есть, причиной торможения роста прикрепленных клеточных культур в стационарных условиях были не межклеточные контакты, а медленный массоперенос.

Устранение плотностного торможения роста однослойных культур на поверхностях с мальм радиусом кривизны.

Из утверждения о том, что причиной торможения роста клеточных культур на твердом субстрате в стационарных условиях является медленный массоперенос между клетками и средой, а не межклеточные контакты, можно предположить, что многослойного роста можно добиться без перфузии, за счет увеличения скорости диффузионного массопереноса в культуральных флаконах. Известно, что изменение характера диффузии с одномерного на двух или трехмерный увеличивает скорость массопереноса с единицы поверхности (Ландау, Лифшиц, 1963). Исходя из этого можно предположить устранение торможения роста клеток в монослое и многослойный рост клеточных культур при выращивании их на отдельных тонких волокнах или на сферических носителях с малым радиусом кривизны. Для того, чтобы определить, насколько можно ожидать увеличение плотности насыщения на поверхностях с малым радиусом кривизны, теоретически оценивали кинетику накопления ингибитора около плотных культур клеток, расположенных на плоскости, на тонком волокне и на сферической микрочастице. Увеличение концентрации (С) метаболита вблизи клеток находили интегрированием функции источников на плоскости (Ландау, Лифшиц, 1963):

С<0,Ъ)= Г ---;г-= = 2ар (Ь/лЮ

Т (ттии-т))0-5

°'5 (5)

где а - удельная продукция метаболита клеткой, р - плотность культуры, О-коэффициент диффузии метаболита, t - время

диффузионного переноса;

на цилиндре радиусом г, предполагая г /Т)Ь « 1

с<г,«- Г = а р г ЕН?> / (6)

4 я О (Ъ-т)

где ЕН{> - интегральная показательная функция , при значениях !Г=г2 / эг « 1

С(г,1:) =а р г (1п (г2/<Ю1;) +■ 0.577) /(20 (7)

на сфере радиусом г, предполагая г /Т>Ь « 1 ! * 2

С<г,Ъ>= Г = а р г <1-.г»<20> (8)

8 <7! о <1;-т))1,э

где ? = г /йОЪ, егf(2(') - интеграл ошибок.

Анализ накопления метаболита вблизи клеток на плоскости (5), на цилиндре (6), на сфере (8> показал, что при значении г = 0.5—1мм нарастание концентрации за время удвоения культуры до ингибирующего рост значения на плоскости, на цилиндре и на сфере будет одинаковым, если плотности культур будут на цилиндре в 3-10 раз и на сфере в 10-30 раз больше, чем на плоскости. Это дает основание ожидать многослойный рост клеточных культур при культивировании клеток на удаленных друг от друга на расстоянии 5-10 мм тонких волокнах и на микросферах дианетром около 1 мм и менее. Удаление необходимо для того, чтобы не было взаимного влияния диффузионных процессов от разных волокон (микросфер), поскольку в таком приближении выполнен представленный выше анализ.

Экспериментально изучали рост клеток СН, N114 ЗТЗ и СПЭВ на стеклянных волокнах дианетром 0,5-1 им. Был обнаружен многослойный рост этих культур на отдельных волокнах с плотностью в 10-15 раз выше плотности насыщения монослоя на 'плоской поверхности культуральных флаконов. При посеве на плотно уложенные на дне флакона волокна многослойного роста не наблюдали. Это позволяет думать, что многослойный рост на отдельных тонких волокнах был связан не с неким влиянием искривленной подложки на пролиферацию, а с интенсификацией массообмена клеток со средой.

III. РЕГУЛЯЦИЯ РОСТА МНОГОСЛОЙНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР.

Из результатов и выводов предыдущего раздела следует, что управляя массообменом клеток со средой можно регулировать многослойный рост клеточных культур. Возникают вопросы, существуют

ли ограничения роста многослойных культур зависимых от прикрепления клеток, каковы особенности кинетики пролиферации и состояния клеток в многослойных культурах. В данной главе представлены экспериментальные результаты, касающиеся этих вопросов

Диффузионный иассоперенос и ограничения роста многослойных

клеточных культур. Предельные плотности насыщения многослойных

клеточных культур.

Используя установку, схематически представленную на рис. 9,

изучали рост многослойных клеточных культур, устанавливая

различную скорость диффузионного массопереноса путем изменения

расстояния между культурой и пористой мембраной, отделяющей клетки

от протекающей среды. Предварительно теоретически оценивали

зависимость плотности насыщения р^ культуры от расстояния Ь между

культурой и пористой мембраной. Рассматривали квазистационарные

условия, когда характерное время массопереноса от клеток до 2

мембраны т (т = Ь /О) существенно меньше времени удвоения числа

клеток. Из этого следует, что величина Ь не должна превышать 3-5

мм. Уравнение диффузии некоторого субстрата в лунке 1 (рис.9)

между клетками и пористой мембраной имеет вид: 2

с £ = 0 (9)

йх

с граничными условиями:

Л С С0 ~ С<0) О -— = Ву ---------- при х = О

„С 0

С <1х ~ а Р ПРИ х = ~Ь <10:>

где а - скорость потребления субстрата клеткой, р - плотность культуры, х- координата в направлении от слоя клеток к мембране, х=0 на поверхности мембраны, обращенной к клеткам, х=-Ь на поверхности слоя клеток, С0~ концентрация субстрата в протекающей

среде, - толщина мембраны, у — ее пористость. Решая уравнени 9 и $

и полагая, что при С( —= С происходит торможение роста культуры с плотностью насыщения р^, находили зависимость между р^ и Ь : 1 1 а Ь

> <С0 - с*> О

<11 >

При ингибировании роста культуры метаболитом при концентрации С*

* *

вид зависимости такой же, но вместо <С0~С ) будет С .

Используя подложки различной толщины (рис.9). изучали зависимость плотности насыщения многослойных культур СН, 1М1Н ЗТЗ и

СПЭВ от расстояния между подложками и пористой мембраной, отделяющей клетки от протекающей среды. При Ь > 0.2 мм и при реальной толщине многослойных культур расстояния от мембраны до подложки и до культуры, на ней расположенной, близки. Экспериментальные данные для клеток СН и ШН ЗТЗ представлены на рис. 11 и находятся в соответствии с теоретическим предсказанием. Видно также, что наклон зависимости 1/ от I) для фибробластов СН почти на порядок выше, чем для клеток ШН ЗТЗ. Для клеток СН рост в монослое прекращается при удалении благоприятной для роста протекающей среды на расстояние 1-2 мм. Следовательно, рост культуры СН в культуральных флаконах при толщине слоя среды 4-5 мм может прекратиться до того, как вся среда станет неблагоприятной для клеточной пролиферации, и это действительно наблюдается. В отличие от этого, для клеток N14 ЗТЗ плотность насыщения приближается к плотности монослоя в стационарных условиях при Ь около 8 —10 мм. Это означает, что для их роста требуется не столь быстрый массообмен со средой в сравнении с клетками СН, и поэтому можно ожидать зависимость плотности насыщения культуры во флаконах без перфузии от толщины слоя питательной среды в диапазоне 2-10

мм. Мы обнаружили повышение плотности насыщения культуры клеток

4 6 2

1М1Н ЗТЗ от 8x10 до 1 .5x10 клеток/см при увеличении слоя среды

во флаконах от 3 до 8 мм. Следовательно при обычных условиях

культивирования во флаконах при толщине слоя около 4 мм плотность

культуры СН ограничивается скоростью массопереноса от клеток в

среду, а плотность культуры Ы1Н ЗТЗ - массообменной емкостью всей

среды. Согласно формуле <111 это определяется коэффициентом

а/<Сф—при ингибировании недостатком субстрата или а/С* Б при

ингибировании метаболитом. Результаты для эпителиоподобных клеток

СПЭВ близки к результатам для клеток N14 ЗТЗ.

Если плотностью насыщения многослойных культур можно управлять задавая скорость диффузионного массопереноса, то естественно предположить, что рост многослойных культур можно регулировать также скоростью перфузии среды непосредственно над клетками. Было показано, что, действительно, при малых скоростях перфузии плотность насыщения культур выше, чем при высоких. Вместе с тем, было также обнаружено существование предельной плотности насыщения. Этот предел для клеток СН составляет <6-8>х10Ь

(плотность насыщения во флаконах без перфузии — 4x10 >

2 6 клеток/см , для клеток N114 ЗТЗ - 2x10 (плотность насыщения без

О. 5

О. 3

0. 1

0. 5

0. 3

О. 1

0.5 1 мм 4 8 мм

Рис.11. Зависимость плотности насыщения культур клеток СН <А) и

N1H ЗТЗ (Б) от расстояния h между подложкой, на которой

расположены клетки, и пористой мембраной, отделяющей клетки от

перфузионной среды. По оси абсцисс - величина h, мм; по оси

ординат - отношение плотности насыщения монослоя клеток без

5 2 4 2

перфузии (4x10 клеток/см для СН и 8x10 клеток/см для NIH ЗТЗ)

к величине плотности насыщения при перфузии р (h).

Рис.12 Кривые роста (1,2) и распределение по 5 и ^цо)

фазам клеточного цикла клеток СН в перфузируемой (А) и неперфузируемой (Б) культурах. По оси абсцисс - время после посева, сутки; по оси ординат: справа- доля клеток в Э и

фазах, слева — число клеток на см^. 1— счет по трипсинизированным клеткам; 2- счет по ядрам, выделенным из клеток раствором лимонной кислоты; 3,5 - доля клеток в - в Э периодах во

всей культуре и в нижнем слое распластанных клеток соответственно. Скорость перфузии - 2.7 мл/мин.

- 25 -

4 2

перфузии (6-3)хЮ ') клеток/см . Предел плотности насыщения для клеток 1М1Н ЗТЗ наступал при меньших скоростях перфузии благоприятной для пролиферации средой, чем для клеток СН, Предельное ограничение плотности насыщения многослойных культур не связано ни с истощением перфузионной культуральной среды, ни с потерей пролиферативного потенциала клеток, поскольку при посеве клеток из многослойных культур в культуральные флаконы в использованную для перфузии среду наблюдали нормальный однослойный рост со стандартными пролиферативными характеристиками и морфологическими особенностями.

Представленные данные свидетельствуют, что рост многослойных культур также ограничивается массообменом с культуральной средой, и, регулируя только скорость массопереноса, можно управлять плотностью насыщения многослойных культур. Однако, наступает предел плотности насыщения многослойной культуры, когда дальнейшее ускорение массопереноса между клетками и средой не инициирует рост культуры. Вопрос о механизме предельного ограничения роста многослойных культур рассмотрен ниже.

Морфологические особенности роста многослойных культур.

Были выявлены морфологические отличия растущих многослойных

культур различных типов зависимых от прикрепления клеток. В

растущих многослойных культурах фибробластов СН наблюдается нижний

слой распластанных клеток с расположенными на нем многослойными

образованиями сферических клеток, которые можно отделить путем

интенсивного встряхивания. По мере нарастания верхних слоев вид

распластанных клеток нижнего слоя визуально не изменяется. Вид

многослойных культур эпителиоподобных клеток СПЭВ сходен с тем,

что наблюдается у фибробластов СН. Многослойный рост фибробластов

N14 ЗТЗ выглядит совсем иначе, чем у культур СН и СПЭВ. По мере

превышения плотности насыщения монослойных культур в стационарных

условиях происходит поджатие клеток, изменяется форма распластанных

6 2

клеток, и при больших плотностях (1-2 хЮ клеток/см ) невозможно визуально увидеть в прижизненной культуре отдельную клетку. Окраска фиксированных 10 % формалином культур выявляет участки плотно упакованных и расположенных друг над другом ядер, что говорит о многослойности. После обработки диссоциирующими агентами (смесь трипсина с версеном ) получается суспензия живых клеток, из которых в стационарных условиях вырастают культуры, имеющие пролиферативные характеристики и вид, типичные для этой линии.

Последнее утверждение справедливо также для клеток СН и СПЭВ. Индивидуальные морфологические особенности многослойных культур исследованных линий не зависели от того, выращивались ли они в условиях перфузии среды непосредственно над клетками, над мембраной, отделяющей клетки от перфузионной среды или на тонких волокнах в стационарных условиях. Кинетика роста многослойных клеточных культур.

Кинетику роста многослойных культур СН, 1М1Н ЗТЗ и СПЭВ исследовали в условиях перфузии питательной средой непосредственно над культурой. Клетки вьгсевали на подложки одинаковой площади, расположенные на дне камеры. По мере роста извлекали подложки, отделяли клётки и подсчитывали их число. На рис. 12, 13 представлены кривые роста и распределение клеток по Э и в, уг,\ (в

\ А \

01 и вф) периодам клеточного цикла клеточных линий СН и N14 ЗТЗ в условиях перфузии и без перфузии. Распределение клеток по клеточному циклу изучали методом проточной цитометрии, Анализ полученных данных показал, что время удвоения числа клеток в условиях перфузии и без перфузии практически совпадают, Поскольку плотность многослойных культур на порядок больше плотности монослоя, то это позволяет думать, что клетки растут не только в нижнем слое распластанных клеток, но и в верхних слоях многослойных структур. Это утверждение подтверждается данными проточной цитометрии для клеток СН. Верхние слои растущей многослойной культуры клеток СН отделяли от нижнего слоя распластанных клеток встряхиванием, затем отделяли распластанные клетки и проводили их цитометрический анализ раздельно. Доля клеток в Б фазе и кинетика ее изменения по ходу роста в верхних слоях и в нижнем слое была одинакова. Это непосредственно показывает рост клеток в нижнем и в верхних слоях многослойных культур СН. Торможение роста многослойных культур связано с переходом в фазу покоя, поскольку доля клеток в Э фазе митотического цикла становилась равной нулю {рис.12,13), клетки сосредотачивались преимущественно в Фазе < рис. 14), и

процент жизнеспособных клеток оставался таким же высоким, как в фазе роста, до тех пор, пока среда оставалась благоприятной для клеточной пролиферации. Аналогичные данные были получены для клеток СПЭВ.

Особенности состояния клеток в многослойных культурах.

Оценивали энергетический метаболизм клеток в перфузируемых

Рис.13 Кривые роста (1) и распределение по Э <3> и ^¡(д)

фазан клеточного цикла клеток Г41Н ЗТЗ в перфузируемой <А) и неперфузируемой <Б> культурах. По оси абсцисс - время после посева, сутки; по оси ординат: справа- доля клеток в В и О

фазах, слева — число клеток на см^. Скорость перфузии - 2.7 мл/мин.

J 1 ■

180

360

180

360

Рис.14. ДНК-гистограммы клеток СН <А> и NIH ЗТЗ (Б> в условиях перфузии на ранней стадии насыщения многослойных 2культур с предельной плотностью (6-8>х10 и 2хЮ клеток/см

соответственно. По оси абсцисс - номер канала цитометра; п<? оси ординат-относительное число клеток. В гистограммах по 2x10 клеток.

многослойных культурах СН в сравнении с условиями без перфузии в монослойных культурах. Ранее в литературе отмечалось, что в перфузируемых культурах скорость утилизации глюкозы после достижения монослоя не изменяется, но не было данных, как она соотносится со скоростью утилизации глюкозы без перфузии среды, какое значение имеет на стадии торможения.

На рис. 15 показаны данные об изненении концентрации глюкозы и

лактата в неперфузируемой и перфузируемой по замкнутому контуру 2

<100 ил на 10 сн ростовой поверхности) культурах СН. В таблице 2 представлены скорости утилизации глюкозы и продукции лактата, полученные из подобных результатов. Из приведенных данных следует, что скорость утилизации глюкозы и, соответственно, продукции лактата, в перфузируемых культурах была значительно выше, чем в культурах без перфузии как в фазе роста, так и в стационарной фазе. Это может быть следствием того, что перфузия интенсифицирует массоперенос. Следует отметить, что если падение скорости утилизации глюкозы без перфузии связано с ограничением в массопереносе между клетками и средой, то в перфузируемой культуре это не так. Периодическая смена среды на свежую не предотвращала предельного ограничения роста культуры и падения скорости утилизации глюкозы несмотря на то, что посев культуры в сменяемой среде показывал ее полноценность для роста клеток СН. Данные в таблице 2 показывают также, что вопреки высказываемому .в литературе мнению не обнаруживается однозначного соответствия между состоянием пролиферации и скоростью потребления клетками глюкозы.

Механизм стимуляции роста зависимых от прикрепления клеток в многослойных культурах. Причина предельного ограничения роста многослойных клеточных культур. Роль межклеточных контактов.

Как было отмечено выше, пролиферация зависимых от прикрепления клеток происходит не только в нижнем слое, контактирующем с подложкой, но и в верхних слоях многослойных культур. С другой стороны межклеточная адгезия не стимулировала пролиферацию этих клеток. Возникает вопрос, каким образом осуществляется стимуляция пролиферации клеток в верхних слоях многослойных образований, не связанных непосредственно с твердым субстратом <ТС>. Можно предположить, что имеется некий медиаторный механизм передачи сигнала стимуляции клеточной пролиферации от распластанных на ТС клеток в клетки верхних слоев, связанный с межклеточной адгезией.

Рис.15. Потребление глюкозы (11> и образование лактата (I) по ходу роста (III) неперфузируемой (А) и перфузируемой (Б) культур клеток СН. По оси абсцисс — время после посева, ч. По оси ординат: слева - концентрация глюкозы ^СП) и лактата (I), нМ, справа -плотность культуры, клеток/см , логарифмическая шкала (III).

Таблица 2.

—13

Скорости утилизации глюкозы (х10 ноль/ч/клетку> и продукции -13

лактата (хЮ моль/ч/клетку) в перфузируемой и неперфузируемой культурах клеток СН.

Условия культивирования Фаза роста глюкоза лактат фаза покоя глюкоза лактат

Перфузируемая 4. 86±0. 56 11.0±1 8 1. 57±0. 14 4. 11±0. 50

культура

Неперфузируемая 1.88+0.20 4.30+0 56 0. 21 ±0. 08 0.58±0.06

культура

Для того чтобы проверить это предположение использовали корреляцию между пролиферацией клеток СН и внутриклеточным рН (раздел 1>. Было показано, что при многослойном росте клеток, также, как и при однослойном без перфузии среды, величина рН1 пролиферирующих клеток составляла 7.00 ± 0.02, а покоящихся - 6.60 ± 0.02 как в верхних слоях сферических клеток, так и в нижнем слое распластанных клеток. После встряхивания верхние слои многослойных образований могли отделяться, иа подложке оставались распластанные клетки и связанные с ними многослойные структуры. Повторив встряхивание можно было полностью удалить с распластанных клеток многослойные образования. Обнаружили, что после такого встряхивания растущей культуры величина рН1 распластанных клеток и оставшихся связанными с ними сферических клеток оставалась на уровне 7.0, в то время, как рЩ отделенных клеток, как одиночных, так и в агрегатах,уменьшалась с 7.0 до 6.6, что свидетельствует об их переходе в состояние покоя. Аналогичная ситуация наблюдалась и после повторного встряхивания с полным удалением многослойных образований сферических клеток с распластанных. Полученные данные дают основание думать, что в многослойных клеточных культурах зависимых от прикрепления клеток сигнал стимуляции пролиферации передавался от нижнего слоя распластанных на ТС клеток в верхние слои за счет межклеточной адгезии, межклеточных контактов. Приведенные выше данные о стимуляции пролиферации зависимых от прикрепления клеток СН в верхних слоях многослойных образований дают также основание для гипотезы о механизме ограничения роста многослойных культур. Гипотеза состоит в том, что по мере роста многослойной культуры в нижнем слое распластанных клеток, наиболее удаленном ' от перфузируемой среды, вследствие активного метаболизма, ограниченного массопереноса в многослойной структуре усиливается голодание, накопление ингибируюдих рост продуктов метаболизма. Это приводит сначала к торможению пролиферации расЬластанных клеток, и, соответственно, к исчезновению в них медиаторов стимуляции пролиферации. После этого прекращается подача стимулирующих рост сигналов от распластанных клеток в верхние слои, осуществляемая благодаря межклеточной адгезии, межклеточным контактам, и прекращается рост клеток во всей многослойной структуре.

IV. ПОВЕДЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ ПЕРФУЗИИ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДОЙ. В разделе IV представлены результаты изучения поведения первичной тканевой культуры эксплантатов поджелудочной железы новорожденных кроликов и фибробластов плода человека в условиях перфузии и без перфузии питательной средой.

Культура эксплантатов поджелудочной железы новорожденных кроликов.

Исследовали рост тканевых перфузируемых и неперфузируемых культур эксплантатов поджелудочной железы новорожденных кроликов. Первичный материал поджелудочной железы новорожденных кроликов в тщательно измельченном виде (размер эксплантатов 0.1—1.0 мм) доставляли из Института трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) МЗ РФ, г.Москвы. На начальном этапе культивирование осуществляли без перфузии, по методике, разработанной в НИИТиИО, где эти культуры используются в ксенотрансплантации для лечения больных сахарным диабетом. Включение перфузии после завершения образования зон роста в стационарных услових стимулировало усиленный рост клеток (наблюдались митозы). формирование узлов многослойного роста. Перфузия тканевой культуры поджелудочной железы инициировала сложные структурные реорганизации, указывающие на существование в ее составе различных популяций эпителиоподобных клеток, механизмы взаимодействия которых пока не ясны. Культура первичных фибробластов человека.

Культуру первичных фибробластов плода человека (ФПЧ) выращивали

в условиях перфузии и без перфузии. Без перфузии среды клетки ФПЧ

4 2

имели низкую плотность насыщения — около 3x10 клеток/см .

Включение перфузии инициировало дальнейший рост до 1.5x10^ 2

клеток/см . Таким образом, перфузия первичных культур ФПЧ устраняет торможение роста в монослое, и ведет к увеличению плотности насыщения в сравнении с неперфузируемыми культурами до 30-50 раз.

V. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ И АППАРАТУРЫ ВЫРАЩИВАНИЯ МНОГОСЛОЙНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР. Бесферментный способ пассирования многослойных клеточных культур.

На основании результатов исследования многослойного роста клеток на поверхностях с малый радиусом кривизны разработан способ бесферментного пассирования клеток. Способ состоит в том, что клетки высевают на поверхность тонких (< 1мм) волокон,

связанных с крышкой культурального флакона эластичными трубками. После прикрепления клеток к поверхности волокон, крышкой с волокнами перекрывают флакон со свежей питательной средой и культивируют до образования на волокнах многослойных структур. Затем встряхиванием удаляют многослойные образования с волокон в культуральную среду. На волокнах остается часть культуры в виде монослоя распластанных клеток и многослойных структур. Крышку с волокнами вставляют в культуральный флакон с питательной средой и повторяют цикл культивирования. По нашим наблюдениям клетки из полученных таким способом многослойных образований передвигались на твердый субстрат, распластывались , и-имели такие же ростовые характеристики (время удвоения, плотность насыщения), как и клетки, взятые из монослойных культур. Метод проверен на клеточных культурах СН, СПЭВ и N114 ЗТЗ.

Проточно-диффузионные камеры комплекса приборов для камерного культивирования клеток (ПКК-01).

Для выполнения исследований многослойного роста клеточных культур в НПО "Биоприбор" совместно с нами был разработан комплекс приборов для камерного культивирования клеток (ПКК-01). Разработка прибора основана на исходных требованиях, составленных в соответствии с реультатами исследований и разработок, представленными в диссертации. В состав прибора вошел набор перфузионно-диффузионных камер (биореакторов), разработанных при непосредственном участии автора. Этот набор включает камеру с плоской мембраной, отделяющей протекающую среду от клеток, расположенных в лунках на подложках, позволяющих изменять расстояние от клеток до мембраны. Разработана также камера, допускающая в процессе культивирования изменение характера массообмена культуры со средой с диффузионного на проточный с дозировкой протока. Разработан набор камер включающих в себя полые пористые волокна в плоской и трехмерной упаковке. Выполнены биотехнические испытания камер, показавшие их перспективность для изучения многослойного роста клеток. Нами был разработан также метод измерения рН среды непосредственно в биореакторах, основанный на поглощение света рН-индикатором и не зависящий от рассеяния света клетками.

Особенности выращивания клеток на полых волокнах.

В качестве модели тканеподобного многослойного роста клеточных культур с перспективой биотехнологического использования была

волокнах в условиях пульсирующей перфузии. 1-биореактор с полыни волокнами 2; 3- насос на входе в биореактор; 4-клапан для периодического перекрывания выхода среды из биореактора; 5-таймер управления клапаном; 6-емкость для питательной среды контура перфузии; 7-емкость для питательной среды сообщающаяся с межволоконным пространством; 8,9-емкости для инокулята и для отбора среды на анализ, 10 -фильтры для стерилизации газа.

предложена <Кпагек,1974) камера, содержащая пучок пористых полых волокон, через которые осуществляется проток среды, а клетки растут на внешней поверхности волокон. В диссертации представлен анализ проблем такого моделирования, намечены пути решения некоторых из них. Одна из проблем связана с возникновением перепадов давления при протекании среды в волокнах и, как следствие, с газообразованием в волокнах и между волокнами. Это ведет к накоплению пузырьков газа в некоторых волокнах, к прекращению протока среды через них и, соответственно, к гибели клеток в многослойных структурах вблизи этих волокон. Мы попытались преодолеть эту трудность, используя пульсирующий режим перфузии, поскольку при пульсации возникает ударная волна, которая должна выбивать пузырьки газа из всех волокон. На рис.16 представлена запатентованная нами установка для культивирования клеток животных,в которой для возникновения пульсирующего режима

перфузии на входе среды в волоконный биореактор установлен непрерывно работающий насос, а на выходе установлен клапан для периодического открывания и перекрывания потока среды. При перекрывании клапана в биореакторе увеличивается давление, среда нагнетается в волокна, через их поры в межволоконное пространство и далее в герметично закрытый сосуд 8. После открывания клапана 5 возникает ударная волна, которая выбивает пузыри из волокон, среда из межволоконного пространства частично возвращается в волокна, и после следующего включения клапана цикл повторяется. Таким образом в предложенном методе пульсирующей перфузии моделируются, хотя и грубо, 2 физиологические особенности: пульсирующий режим кровотока и поток из больших кровеносных сосудов в капилляры. На установке зкспериментально показано, что при непрерывной перфузии в волокнах образуются пузырьки газа, после включения клапана пузырьки удаляются. Используя пульсирующий режим перфузии удалось повысить концентрацию клеток в растущих в межволоконном пространстве культур гибридомы НХ14.32.2 и фибробластов СН с <4-6)х10 до (2-4)х10 ^клеток/мл, увеличив при этой жизнеспособность клеток в культуре с 15-25» до 85-95Й.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Показано, что пролиферация зависимых от прикрепления 1 клеток СН, СПЭВ и N14 ЗТЗ коррелирует с повышенным уровнем рН1. Адгезия клеток к стеклу вызывала повышение рШ до величин, характерных для пролиферирующих клеток, но в среде без сыворотки это заиелачивание было непродолжительным. Пролонгирование характерного для пролиферации защелачивания клеток, вызванного адгезией к стеклу, происходило только при наличии сыворотки в среде. Сыворотка вызывала либо устойчивое, либо непродолжительное повышение рН1 до значений меньших, чем у пролиферирующих клеток. Адгезия клеток друг к другу не инициировала повышение рН1, что коррелировало с отсутствием клеточного роста.

2. Для клеток ВНК-21, 1.5 и ЬБМ, способных расти в суспензии, установлено, что их пролиферация может осуществляться без существенного защелачивания цитоплазмы (в сравнении с состоянием покоя), либо при небольшом защелачивании, которое обеспечивается наличием сыворотки в среде без прикрепления клеток к стеклу. Адгезия клеток к стеклу вызывала либо непродолжительное повышение рН1, необязательное для пролиферации (клетки ВНК-21), либо

лительное повышение рН1, коррелировавшее с увеличением скорости ролиферации (клетки |_8М) .

3. На основе полученных данных сформулировано представление о заимосвязи между влиянием адгезии на рН1 и зависимостью ролиферации нормальных и минимально трансформированных клеток от рикрепления к твердому субстрату. Она состоит в том, что для □ста зависимых от прикрепления клеток необходимо повышение рН1, эторое вызывает адгезия клеток к твердому субстрату. Без ыворотки это повышение непродолжительно и роста клеточной ультуры не происходит. Сыворотка сама не обеспечивает ^обходимого для пролиферации повышения рН1, но оказывает ролонгируюшее действие на защелачивание цитоплазмы, вызванное дгезией. Таким образом, адгезия к ТС является индуктором ролиферации и индукция связана с повышением рНо., а сыворотка -ромотор в стимуляции пролиферации, и ее промоторное действие эпряжено с пролонгированием вызванного адгезией защелаЧивания итоплазмы. Пролиферация независимых от прикрепления клеток может ;уществляться при незначительном защелачивании цитоплазмы, эторое обеспечивается присутствием сыворотки в среде, или без эщелачивания. Поэтому, для роста независимых от прикрепления петок нет необходимости в адгезии, как в факторе, вызывающем эвышение рН1.

4. Разработаны методы измерения рН и содержания кислорода в солоклеточной области. На примере зависимых от прикрепления леток СН экспериментально показано быстрое истощение по кислороду 15-20 мин) и насыщение кислыми метаболитами (около 5 часов) до чгибирующих рост значений рН околоклеточной среды в плотных /льтурах, что является прямым доказательством определяющей роли зссопереноса в торможении роста культур в стационарных условиях.

5. Установлено, что торможение роста в однослойных зависимых от зикрепления клеточных культурах СН, СПЭВ и М1Н ЗТЗ можно гтранить за счет интенсификации массообмена без движения среды соло клеток и, следовательно, без механического влияния на ?жклеточные контакты. Из этого следует вывод. что причиной эрможения роста в однослойных культурах являлись не межклеточные энтакты, а ограничения в массообмене между клетками и питательной зедой.

6. Теоретически предсказана и экспериментально подтверждена эзможность получения многослойного роста клеточных культур путем

выращивания на подложках с малым радиусом кривизны, например, на тонких волокнах, за счет ускорения диффузионного массопереноса при переходе от одномерной к двух и трехмерной диффузии.

7. Выявлены морфологические отличия многослойного роста различных клеточных культур. При морфологическом сходстве однослойных культур разных типов их многослойные культуры могут иметь различный вид. При значительных отличиях вида однослойных культур разных типов их многослойные культуры могут бьгть похожи.

8. Теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность управления плотностью насыщения многослойных клеточных культур путем регуляции их диффузионного массообиена с протекающей культуральной средой.

<3. Установлено, что время удвоения и распределение по фазам клеточного цикла в растущих многослойных культурах такое же, как в однослойных культурах без перфузии среды. Методом проточной цитометрии показано, что при многослойном росте пролиферация зависимых от прикрепления клеток осуществляется не только е нижнем слое распластанных клеток, но и в верхних слоях многослойных образований.

10. Обнаружено предельное ограничение роста многослойных культур зависимых от прикрепления клеток в условиях перфузии при плотностях в 20—30 раз превышающих плотности насыщения однослойных культур.

11. Выявлена более высокая скорость потребления глюкозы * продукции лактата в многослойных культурах в сравнении с неперфузируемыми однослойными как на стадии роста (в 2-3 раза), так и в состоянии покоя (в 8 раз).

12. Показано, что в условиях перфузии питательной средоВ устраняется торможение роста в монослое и наблюдается многослойны? рост в первичных культурах изолированных фибробластов плодг человека и в тканевых культурах поджелудочной железы. Перфузи; тканевых культур поджелудочной железы инициирует сложну* стуктурную реорганизацию.

13. Обнаружено, что для поддержания характерного дл$ пролиферации внутриклеточного рН зависимых от прикрепления клето» СН в верхних слоях многослойных культур необходим адгезивный контакт с нижним слоем распластанных на твердом субстрате клеток.

1й. На основе полученных экспериментальных данныз сформулирована гипотеза о том, что в многослойных зависимых от

рикрепления культурах сигналы стимуляции пролиферации передаются лагодаря межклеточной адгезии, межклеточный контактам от нижнего лоя прикрепленных к твердому субстрату клеток в верхние слои ногослойных образований. С другой стороны, ограничение роста аких многослойных культур связано с тем, что по мере насыщения ультуры в наиболее удаленном от культуральной среды нижнем слое аспластанных клеток в силу ограниченности массопереноса и ктивного метаболизма в многослойной структуре возникает едостаток питания, накопление ингибирующих рост метаболитов. Это ызывает торможение их пролиферации. Прекращается передача игналов стимуляции пролиферации от прикрепленных к твердому убстрату клеток в верхние слои и, соответственно, происходит орможение роста клеток во всей многослойной культуре.

15. Разработаны способы и аппаратура для выращивания и сследования многослойных клеточных культур в стационарных словиях, в перфузионных и в перфузионно-диффузионных биореакторах применением плоских мембран и пористых полых волокон.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Акатов B.C., Кудрявцев А.А.,Лежнев Э.И., Векслер A.M. зучение адгезии клеток к стеклу с помощью эффекта нарушенного олного внутреннего отражения.// Биофизика. 1931. т.26. N1. С.138.

2. Акатов B.C., Лежнев Э.И., Векслер A.M., Кублик Л.Н. Изучение |инамики изменения рН среды в околоклеточной области.// Цитология. 932. т.24. N 3.С.352-356.

3. Akatov U.S. Application of frustrated total reflection for tudying cells in vitro. // J.Microsc. 1985.v.137. N 2. P.115-128.

4. Akatov U.S., Leshnev E.I., Vexler A.M., Kublik L.N. Low pH alue of pericellular medium as a factor- limiting cell proliferation in dense cultures. // Exp.Cell Res. 1985. v.160. p.412-413.

5. Акатов B.C., Лежнев Э.И. Управление физико-химическими войствами околоклеточного микроокружения. // Тез. докл. II сесоюзного совещания "Культивирование клеток животных и еловека". Пудино.1985. С.5-6.

6. Акатов B.C., Ермакова Т.М., Лавровская В.П., Остапенко .Ф.Емельянова Н.П. Применение капилляров из пористого стекла для ультивирования клеток. // Тез. докл. II Всесоюзного совещания Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1985.С.119.

' 7. Акатов B.C., Казаков В.П. Измерение концентрации

растворенного кислорода под клетками в культуре. // Тез. докл. II Всесоюзного совещания "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1985. С.20.

8. Акатов B.C., Векслер A.M. рН околоклеточной среды и регуляция пролиферации клеток in vitro.// Тез. докл. Международной конференции "Биофизика мембран, белков, и нуклеиновых кислот". Братислава.1985. С.79.

9. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В., Векслер A.M. Внутриклеточный рН и индукция пролиферации клеток в культуре. // Цитология. 1989. т.31. N 9.С.1091.

10. Акатов B.C. Метод и устройство исследования околоклеточного микроокружения в культуре. У/ Сб. статей "Приборное оснащение и автоматизация экспериментальных исследований в области биотехнологии". Пущино. 1986. С.3—7.

11. Акатов B.C., Лавровская В.П., Гробова М.Е., Лежнев Э.И. Проточно-диффузионная камера для исследования клеток в культуре. // Цитология. 1990. т.32. N Л.-С. 399-404.

12. Акатов B.C., Гробова М.Е., Лавровская В.П. Селективная проницаемость некоторых отечественных ультрафильтрационных мембран. // Сб.тез докл. III Всесоюзн.совещ. "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.154.

13. Акатов B.C., Лавровская В.П. Многолуночная перфузионно-диффузионная камера для культивирования клеток и тканей животных. //Сб.тез. докл. III Всесоюзн.совещ. "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.155.

14. Акатов B.C., Лавровская В.П. Кинетика мультислойного роста клеток NIH ЗТЗ и фибробластов китайского хомячка в перфузируемых культурах. // Сборник статей "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1992. С. 3-9.

15. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В., Векслер A.M. Внутриклеточный рН и зависимость пролиферации клеток от их прикрепления к субстрату.//Сб. тез. докл. III Всесоюзн.совещ. "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.12.

16. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В., Векслер A.M. Внутриклеточный рН и регуляция пролиферации клеток ВНК-21 в суспензии. // Сб. тез. докл. III Всесоюзн.совещ. "Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.19.

17. Кошевой Ю.В., Акатов B.C., Гробова М.Е.

Микроспектрофлуориметр для измерения внутриклеточного рН <МИКрН).

/Сб. статей " Приборы и оборудование для исследований в области изико-химической биологии и биотехнологии". Пуиино. 1990. С.8-14.

18. Латылов 3.3., Тарабукина Н.Н. , Прохоренко И. С., Редькин .А.,Лежнев Э.И., Акатов B.C., Попова И.И. Автотитратор отозлектрический<АТФ-01).//Сб. тез. докл. III _ Всесоюзн.совещ. Культивирование клеток животных и человека". Пущино. 1990. С.160.

19. Акатов В.С.,Попова И.И., Латылов 3.3. Фотоколориметричёский атчик рН для рассеивающих сред.//Сб. статей " Сенсоры и датчики", ущино. 1991. С.3-12.

20. Акатов B.C., Лавровская В.П. Зависимость плотности асьпцения мультислойных культур от их массообмена со средой. /Цитология. 1991. т.33. N 1. С.64-72.

21. Акатов B.C., Лавровская В.П., Лежнев З.И. Особенности ролиферации клеток в культуре при перфузии среды.// Цитология. 991. т.33. N 1. С. 73-80.

22. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В. Внутриклеточный рН субстратная зависимость пролиферации фибробластов китайского

омячка.// Цитология. 1991. т.33. N 7. С. 86-94.

23. Акатов B.C., Гробова М.Е., Кошевой Ю.В. Внутриклеточный рН пролиферация клеток ВНК-21.// Цитология. 1991. т.33. N 7.

.86-94.

24. Берестовская Н.Г., Акатов B.C.,Лавровская В.П. [ультислойный рост эпителиоподобных клеток СПЭВ в перфузируемых ультурах.// Цитология. 1991. т.33. N 12. С. 79-83.

25. Акатов B.C., Берестовская Н.Г., Лавровская В.П., Лежнев ■И. Особенности регуляции пролиферации клеток в монослойных и ультислойных культурах.// Цитология. 1992. т.34. N 9. С.44.

25. Акатов B.C., Берестовская Н.Г., Лавровская В.П., Соловьева I.E. Контактная зависимость пролиферации клеток в мультислойных ультурах.// Цитология. 1992. т.34. N 9. С.45.

26. Акатов B.C., Гробова М.Е. Активация систем регуляции нутриклеточного рН при адгезии '.клеток к твердому субстрату.// иол. Мемб. 1992. N 7. С.700-709.

27. Акатов B.C., Соловьева М.Е. Зависимость пролиферации клеток it прикрепления связана с влиянием адгезии на внутриклеточное начение рН.// Цитология. 1992. т.34. N 9. С.45.

28. Акатов B.C., Гробова М.Е. Внутриклеточный рН и пролиферация леток линии LS и ее производной LSM адаптированной к росту в онослое.// Цитология. 1992. т.34. N 1. С.58-65.

- АО -

29. Соловьева М.Е., Акатов B.C. Активация систем регуляции внутриклеточного значения рН при прикреплении клеток к твердому субстрату.// Цитология. 1992. т.За. N 9. С.107.

30. Берестовская Н.Г., Акатов B.C., Лавровская В.П. Изненение скоростей потребления глюкозы и выделения лактата в перфузируемой и неперфузируемой культурах.// Цитология. 1993.т.35. N 2. С.75-80.

31. Akatov M.S., Grobova li.E. Activation of intracel lulor pH regulating systems upon cell adhesion to solid substrate.// Biol.Membr. 1993, V.6<7>, P.917-934.

32. Акатов B.C., Скалецкий H.H., Берестовская Н.Г., Лавровская

B.П., Кирсанова Л.А., Петрова И.А. Перфузируемые культуры клеток поджелудочной железы новорожденных кроликов.// Цитология. 1994. т.36. N6. С.511.

33. Акатов B.C., Берестовская Н.Г., Лавровская В.П. Бесферментный способ пассирования клеточных культур.// Цитология. 1994. т.36. N6. С.510.

34.. Акатов B.C., Соловьева М.Е. О механизме контактной зависимости пролиферации клеток.// Цитология . 1994.' т.36. N6.

C.499.

35. Akatov M.S., Lavrovskaya V.P., Berestovskaya N.G., Solovyeva M.E. The role of intercellular pH in regulation of multilayered growth of anchorage—dependent cells in vitro.// In Abstracts of Worcshop on intercellular communication. Pwshchino 1994. P.19.

36. Solovyeva M.E., Akatov V.S. The role of intercBJ pH in anchorage dependence of cell prolifeation.// In Abstracts of Workshopeon intercellular communication. Pushchino. 1994. P.84.

37. Патент N 1594211 от 31.12.1992. Акатов B.C., Лавровская В.П. Камера для культивирования клеток. , Б.И. 1990. N35 .

39. А.С. N 1634010. Латыпов 3.3., Тарабукина Н.Н, Прохоренко И.С., Огоньков Ю.Н., Лежнев Э.И., Акатов B.C., Попова И.И, Фотоэлектрическое устройство регулирования уровня рН среды. Б.И., 1991, N.5.

40. А.С. N 1693037. Акатов B.C., Лежнев З.И., Лавровская В.П., Попов Ю.А., Иванов Е.Г., Бондарев В.А., Хохлов A.M. Камера для культивирования клеток и тканей. Б.И.,1991. N 43.

41. А.С. N 1671681. Акатов B.C., Лавровская В.П..Лежнев Э.И., Попов Ю.А., Иванов Е.Г., Хохлов A.M., Бондарев В.А. Камера для культивирования и исследования клеток или тканей. Б.И. 1991. N 31.

<12. A.C. N 1710574.. Акатов B.C., Лежнев Э.И., Лавровская .П.,Попов Ю.А., Иванов Е.Г., Бондарев В.А., Хохлов A.M. Камера ля культивирования клеток. Б.И. 1992. N5.

43. Патент N 1747479 от 15.07.1992. Акатов B.C., Лавровская .П.,Манцыгин Ю.А. Установка для культивирования животных клеток.

44. A.C. N 1799907. Акатов B.C., Берестовская Н.Г., Лавровская •П. Способ пассирования клеток животных и устройство для его гуществления. , Б.И. 1993. N9

45. Патент N 1486894 от 25.02.1993. Акатов B.C., Попова И.И., äтылов 3.3. Устройство для регулирования pH.

э.03.96 г. Зак.6968Р. ТирЛОО экз. Усл.печ.л. 2,5

Отпечатано на ротапринте в 0Н1И ПНЦ РАН

Информация о работе

Акатов, Владимир Семенович
доктора физико-математических наук
Санкт-Петербург, 1996
ВАК 03.00.02

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адгезия клеток и регуляция роста клеточных культур
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика