Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регулятор клеточного цикла p21wan: роль в онкоген-индуцированной трансформации и клеточном старении

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Регулятор клеточного цикла p21wan: роль в онкоген-индуцированной трансформации и клеточном старении"



РОМАНОВ Василий Сергеевич

РЕГУЛЯТОР КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА р21"аП: РОЛЬ В ОНКОГЕН-ИНДУЦИРОВАННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ И КЛЕТОЧНОМ СТАРЕНИИ

специальность 03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 В ЯНВ 2011

Санкт-Петербург 2011 г.

004619192

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Поспелова Татьяна Викторовна

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, профессор Имяиитов Евгений Наумович НИИ онкологии им. H.H. Петрова

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет

Защита диссертации состоится «28» января 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного

совета Д. 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

E-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

Факс: 8 (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан "27" декабря 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук / Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Трансформация нормальных клеток онкогенами является перспективной моделью для изучения молекулярных механизмов канцерогенеза. Введение в фибробласты грызунов гена ElAad5 раннего района аденовируса пятого типа человека, одновременно с комплементирующим онкогеном, обладающим антиапоптотическими свойствами, в частности cHa-ras, приводит к трансформации нормальных клеток, которая сопровождается модификацией сигнальных путей, изменением содержания и активности транскрипционных факторов и уровня деградации белков, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. Одной из важнейших мишеней онкогенной трансформации являются ингибиторы циклин-зависимых киназ семейства Cip/Kip, инактивация которых приводит к снятию ограничений прохождения клеткой цикла деления. Наиболее изученный представитель этого семейства - белок p2lWarl,Cl',l) контролирующий переход клеток из фазы G| клеточного цикла в фазу репликации ДНК и блокирующий размножение генетически дефектных клеток и клеток с внеплановой экспрессией онкогенов.

Известно, что основной ролью p21Wafl является инактивация циклин-киназных комплексов Cyclin E-CDK2 и Cyclin A-CDK2, которые отвечают за прохождение фазы G| клеточного цикла и переход клетки в фазу S (Bartek and Lukas, 2001). Взаимодействие p21Wafl с этими комплексами приводит к подавлению активности циклин-зависимой киназы CDK2, потере ее способности фосфорилировать белок pRb и высвобождать транскрипционный фактор E2F1, участвующий в регуляции транскрипции S-фазных генов. Кроме того, p21Wafl может регулировать события клеточного цикла, непосредственно взаимодействуя и инактивируя транскрипционные факторы E2F1, с-Мус, STAT3, С/ЕВР (Delavaine and La Thangue, 1999; Dotto, 2000), а также подавляя репликацию за счет ингибирования субъединицы ДНК-полимеразы 5 белка PCNA (Dotto, 2000). Все эти взаимодействия происходят в ядре и приводят к блоку клеточного цикла.

Несколько другие функции p21Wafl выполняет в цитоплазме. Несмотря на свое название "ингибитора циклин-зависимых киназ", p21Wafl не только не ингибирует, а напротив, принимает участие в сборке и транслокации в ядро циклин-киназных комплексов Cyclin D-CDK4/6 (Dotto, 2000). Кроме того, p21Wafl способен регулировать миграцию клетки через ингибирование каскада RhoA- ROCK1- LlMKl-кофилин за счет инактивации киназы ROCK1, что приводит к потере способности кофилина деполимерирозовать актин (Besson et al., 2004). Таким образом, p21ftafl, находясь в цитоплазме, ингибирует образование стресс-фибрилл и фокальных контактов, способствуя миграции клетки. Кроме того, p21Wafl выполняет в цитоплазме аитиапоптотические функции, подавляя активность проапоптотических киназ ASKI, JNK, р38 и непосредственно ингибируя прокаспазу-3 (Dotto, 2000).

Таким образом, p21Wafl, локализуясь в ядре, подавляет активность циклин-киназных комплексов и прохождение по циклу деления, тогда как, находясь в цитоплазме, выполняет альтернативные функции. В опухолях человека инактивация р21Wufl не связана с мутациями или делециями гена, а происходит на белковом уровне. Во многих типах карцином, сарком, лимфом и

\

\J

лейкимий количество р21у,аП не уменьшено, а даже увеличено, но при этом наблюдается его релокализация в цитоплазму, где он способствует пролиферации и миграции трансформированных клеток, одновременно ингибируя апоптоз, который является одной из тумор-супрессорных программ (Кошпзоп, 2002; С^иеге!, 2003). С другой стороны, р21ЦаП играет важную роль в запуске другой тумор-супрессорной программы - клеточного старения. Показано, что программа старения активируется в клетках с повреждениями ДНК или повышенной экспрессией онкогенов и является, как и апоптотическая программа, одним из способов необратимого подавления пролиферации дефектных клеток. В связи с тем, что р21№а" вовлечен как в онкогенные, так и в анти-онкогенных программы клетки, понимание его роли в этих процессах даст новую информацию, необходимую для эффективной борьбы с канцерогенезом.

Цель и задачи исследования

Целью работы было исследование роли р21ШаП в становлении трансформированного фенотипа Е1А/сНа-Каз-экспрессирующих фибробластов и активации клеточного старения, вызванного ингибитором деацетилаз гистонов (1ШАСл) бутиратом натрия (№В).

Были сформулированы следующие задачи:

1) Сравнить между собой ЕI А/с1 [а-Кая-эктирессируюшке эмбриональные фибробласты мыши (тЕЯах) с полным геномом и с нокаутом гена, кодирующего р2|1Аа", по основным признакам трансформированного фенотипа: высокая эффективность клонирования, способность преодолевать контактное ингибирование, пролиферировать независимо от прикрепления к субстрату и дезорганизовать актиновый цитоскелет, а также повышенная миграция и инвазия.

2) Провести анализ способности трансформантов тЕКаэ осуществлять блок клеточного цикла или активировать программу апоптоза после повреждения ДНК и удаления ростовых факторов из среды культивирования в зависимости от присутствия р21 ч,аП.

3) Оценить способность клеток тЕНав с нокаутом р21ЛаП осуществлять блок клеточного цикла после обработки ЫаВ и проанализировать механизмы его возникновения: исследовать содержание циклинов, циклин-зависимых киназ (СОК), ингибиторов СОК и активность циклин-киназных комплексов.

4) Проанализировать активацию программы клеточного старения в тЕКаэ и шЕЯаз р21-/-после длительной обработки ЫаВ по необратимости блока клеточного цикла, активности 5А-[3-Оа1, реорганизации актинового цитоскелета и распластанности клеток.

5) Исследовать существование корреляции между появлением маркера клеточного старения -гипертрофии клеток, активацией тТ(ЖС1 -каскада и присутствием р21у,аП в трансформантах шЕЯаз.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Е1 А/сНа-Каэ-экспрессируЕОщис эмбриональные фибробласты мыши (тЕКаэ) с нокаутом р21ЛаП, с одной стороны, демонстрируют признаки трансформированных клеток (высокая насыщающая плотность, короткий клеточный цикл, неспособность реализовать блок

клеточного цикла после повреждения ДНК и удаления ростовых факторов из среды культивирования), а с другой стороны, имеют признаки, характерные для нормальных клеток (неспособность формировать колонии в отсутствие прикрепления к субстрату, неспособность пролиферировать в клональной плотности, сохранение фибробласто-подобной морфологии, с выраженной организацией актинового цитоскелета, отсутствие повышенной миграции и инвазии).

2. Трансформация эмбриональных фнбробластов мыши онкогенами Е1Аа<15 и cHa-ras сопровождается частичной релокализацией белка p2lWafl в цитоплазму, что может быть причиной становления ряда признаков трансформированного фенотипа, так как в клетках линии mERas р21-/- эти признаки отсутствуют.

3. Нокаут p21Wafl не приводит к потере способности £7ЛаА5/с#а-га.$-трансформантов останавливать пролиферацию после действия NaB, однако такой р21йаГ1-независимый блок клеточного цикла является обратимым,

4. Следствием нокаута p21Wafl является неспособность NaB реактивировать программу старения в клетках mERas р21 -/-, согласно данным по отсутствию таких маркеров клеточного старения, как активность SA-P-Gal, необратимый блок клеточного цикла, гипертрофия, активация mTORCl и усиление распластывания клеток.

5. Гипертрофия клеток mERas при старении, вызванном действием NaB, связана с активацией mTORCl, которая является p21Wafl-зависимой, что свидетельствует о новой роли p21Wafl в запуске программы клеточного старения.

Научная новизна работы

Впервые показано, что нокаут "опухолевого супрессора" р21 Wa" не только не способствует полной морфологической трансформации нормальных клеток, но, напротив, приводит к потере таких признаков трансформированного фенотипа, как пролиферация в полужидком агаре независимо от прикрепления к субстрату, способность одиночных клеток формировать клоны, дезорганизация актинового цитоскелета и повышенная миграция и инвазия. Показано, что в ходе трансформации эмбриональных фибробластов мыши онкогенами ElAad5 и cHa-ras происходит релокапизация белка p21w"n в цитоплазму, что, по всей видимости, лежит в основе проявления исследованных признаков трансформированного фенотипа, так как нокаут p21Wan приводит к их утрате. Эти данные являются первым экспериментальным объяснением отсутствия делеций и мутаций гена, кодирующего p21Wafl, в опухолях человека in vivo. Также впервые показано, что p21Wafl не является необходимым фактором для остановки пролиферации ElA/cHa-Ras-трансформантов после действия NaB, однако блок клеточного цикла в отсутствие p21Wafl является обратимым, что говорит о ключевой роли p21Wafl в осуществлении программы NaB-индуцированного клеточного старения. Впервые продемонстрировано вовлечение р21Waf 1 в регуляцию активности киназного комплекса mTORCl и гипертрофии при старении EJA/cHa-Ras-экспрессирующих клеток.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные являются важной информацией фундаментального характера, необходимой для эффективной борьбы с размножением опухолевых клеток. В настоящем исследовании показано, что ингибитор циклин-зависимых киназ p21Wafl способен играть роль не только опухолевого супрессора, но, находясь в цитоплазме, может выступать и как обязательный элемент опухолевой трансформации клеток. Экспериментальные данные о зависимости старения опухолевых клеток от p21Wafl подтверждают необходимость дальнейшего исследования его функций в этом процессе для разработки более эффективных подходов лечения онкологических заболеваний. Таким образом, результаты работы могут быть использованы для дальнейшего углубленного изучения механизмов трансформации клеток и запуска программы клеточного старения в опухолевых клетках. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по клеточной биологии и биологии опухолевых клеток.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисных сообщений. Материалы диссертации были представлены на Всероссийском симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 2006 г.), 10-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2006 г.), 2-м съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007 г.), международной летней школе "From Pluripotency to Senescence: Molecular Mechanisms of Development, Disease and Ageing" (Island of Spetses, Greece, 2010 г.). Положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах Института цитологии РАН и на заседании Leibniz Institute for Age Research (Fritz Lipmann Institute) (Jena, Germany).

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста и иллюстрированы 21 рисунком.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты № 04-04-49766-а и № 07-04-01537-а) и гранта по программе президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".

Материал и методика

Культивирование клеток. В работе использованы эмбриональные фибробласты мыши (MEF) и трансформированные клеточные линии, полученные из MEF дикого типа (линия mERas) и MEF с нокаутом p21Wofl (линия mERas р21-/-) путем переноса онкогенов ElAad5 (ранний район аденовируса пятого типа человека) и cHa-ras (аминокислотные замены в положениях 12 и 61). Клетки линии mERas р16-/- получены из MEF с нокаутом р16,лк4а. Клетки обрабатывали адриамицином (0.1 мкг/мл), бутиратом натрия (4 мМ) или рапамицином (200 нМ). Для исследования необратимости блока клеточного цикла, клетки после инкубации с NaB культивировали в новой среде дополнительные 24+48 ч ("отмывка").

Кривые клеточного роста. Пролиферативную активность клеток оценивали как функцию их количества от времени культивирования. Среднее время удвоения популяции считали по формуле 7d=(log22) *i/[log2(Arr/Aro)], где t - время прироста популяции, N, - количество клеток через время /, No - исходное количество клеток.

Оценка эффективности клонирования. Эффективность клонирования определяли по способности одиночных клеток (200 клеток на чашку диаметром 30 мм, т.н. клональная плотность) пролиферировать в отсутствие клеточных контактов и формировать колонии.

Оценка способности клеток пролиферировать независимо от прикрепления к субстрату. Клетки помещали в среду с 0.33% агара и культивировали в течение 8 сут.

Проточная цитометрия. Для анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла, а также для оценки размеров клеток с помощью прямого светорассеяния, использовали метод однопараметрической сортировки клеток в протоке, как описано ранее (Зубова и др., 2007).

Анализ количества белка. Измерение содержания белка, для оценки изменения размеров клеток, проводили методом Бредфорд (Bradford, 1976).

Иммуноблоттинг. Белки разделяли по методу SDS-электрофореза в ПААГ в модификации Лэммли (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозную мембрану и выявляли с помощью антител методом усиления хемилюминесценции. В работе использованы антитела фирм Santa Cruz Biotechnology против Е1А (#sc-25), p21Wafl (#sc-6246), и циклинов D1 (#sc-717), A (#sc-751), E (#sc-481), фирмы Cell Signaling Technology против фосфо-86 (#2211), S6 (#2317),фосфо-кофилин (#3313), кофилин (#3318), BD Biosciences против CDK2 (#610146), Calbiochem против Ras (JTOP40) и Ну TEST Ltd. против GAPDH (#5G4). Денситометрию фосфо-форм белка S6 и их нормировку по общему количеству S6 проводили с помощью программы TotalLab версии 2.01.

In vitro анализ киназной активности. Для анализа активности киназ, ассоциированных с циклинами А и Е, лизаты инкубировали с антителами, осаждали сефарозой и использовали в качестве источника киназ в реакции фосфорилирования субстрата. После SDS-электрофореза гель фиксировали, высушивали и регистрировали излучение на рентгеновской пленке.

Иммунофлуоресценция и цитохимия. Клетки, выращенные на покровных стеклах, инкубировали с антителами фирм Santa Cruz Biotechnology против паксиллина (#sc-5574) и [}-катенина (#sc-7963), Sigma-Aldrich против винкулина (#V9131) и Invitrogen против р21Wafl (#AHZ0422). F-актин окрашивали родамин-фаллоидином, ядра - DAPI. Площадь клеток, а также содержание p21Wafl оценивали с помощью программы ImageJ версии 1.43.

Выявление активности SA-fl-GaL Клетки выращивали на покровных стеклах, фиксировали и инкубировали в растворе, содержащем субстрат X-Gal, как описано ранее (Зубова и др., 2007).

Анализ фрагментированной ДНК в апоптотирующих клетках. Апоптоз выявляли по присутствию нуклеосомных повторов во фракции экстрахромосомной ДНК. Клетки лизировали в гипотоническом буфере, инкубировали с РНКазой А и протеиназой К, проводили депротеинизацию и электрофоретическое разделение экстрахромосомной ДНК.

ОТ-ПЦР. РНК выделяли с помощью раствора Trizol (Invitrogen) и проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ). ПЦР проводили, используя следующие праймеры: cyclinDl (5'-TGTTCGTGGCCTCTAAGATG-3'/5'-TCTGGAAAGAAAGTGCTTG-3'; 386 п. о.); cyclinA2 (У-GCATGAGGGCGATCCTTGTG-375'-ACAGTTTGCAGGCTGCAGGTG-3'; 355 п. о.); CDKN2A (кодирует белок р^"*4"; 5'-CCGAACTCTTTCGGTCGTAC-3'/5'-CAGCGGAACGCAAATATCGC-3'; 280 п. о.); CDKN1A (кодирует белок p21Wafl; 5'-GCCGTGATTGCGATGCGCTCA-375'-ACAGCGACAAGGCCACGTGGT-3'; 256 п. о.). Gapdh был выбран в качестве контроля нагрузки (5'-TGTGATGGGTGTGAACCACG-3 75 '-CCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3'; 301 п. о.). Отжиг праймеров проводили при 53 °С (cyclinDl), 56 °С (CDKN2A), 58 "С (cyclinA2, gapdh) или при 63 °С (CDKN1A). Денситометрию проводили с помощью программы TotalLab версии 2.01.

Анализ миграции и инвазии клеток. На монослой клеток наносили "рану", и через 24 ч оценивали миграционный потенциал, подсчитывая число клеток, заполнивших "рану", и нормируя по числу клеток на соответствующей площади клеточного монослоя за пределами "раны". Способность клеток реорганизовывать цитоскелет для миграции оценивали по их проникновению через поры мембран камер Бойдена (BD Falcon, #353097, BD Biosciences) Для оценки способности клеток к инвазии использовали камеры, покрытые матригелем (BD BioCoat, #354480).

Результаты и обсуждение

1. Анализ клонов £7/1я</5/с.?/я-га$-трансфицированных фибробластов на содержание введенных онкопродуктов и белков-регуляторов клеточного цикла.

В результате переноса онкогенов ElAad5 и cHa-ras в клетки MEF дикого типа и MEF с нокаутом p21Wafl из "фокусов" морфологической трансформации были селектированы линии, в которых было исследовано содержание трансфицированных онкогенов. Методом иммуноблоггинга было показано, что полученные линии, экспрессируют разное количество онкобелков Е1А и cHa-Ras. Так как оба онкогена могут контролировать содержание циклинов, была проведена оценка белков-регуляторов клеточного цикла, и обнаружено, что количество циклинов А2 и Di, но не киназы CDK2, коррелирует с содержанием в них Е1А, причем в случае с Cyclin А2 зависимость прямо пропорциональна, а в случае с Cyclin D1 - обратно пропорциональна

mER»s mER>J

mERai

Рис. 1. Е1А регулирует количество циклинов А и Б на уровне белка, но не на уровне мРНК. (А) Содержание белка анализировали методом иммуноблоттинга. (Б) ОТ-ПЦР. Ген gapdh (ОАРБН) выступает в качестве контроля на1рузки.

(рис. 1А). Сходные результаты были получены и на клонах другой линии - mERas р16-/-, с нокаутом ингибитора циклин-зависимых киназ р!6 а. Данные, полученные методом ОТ-ПЦР, демонстрируют отсутствие взаимосвязи между экспрессией генов циклинов и количеством El А в клонах (рис. 1 Б), что говорит о регуляции онкопродуктами El А содержания циклинов А2 и D1 на уровне стабилизации/деградации белка. Известно, что El А непосредственно влияет на систему убиквитин-протеасомной деградации и, возможно, благодаря этому механизму он регулирует количество Cyclin А2 и Cyclin D1. Для дальнейшей работы был выбран клон mERas р21-/- (4-4), содержащий близкое с mERas дикого типа количество онкобелков Е1А и cHa-Ras.

2. p2l"''" и становление трансформированного фенотипа ElA/cHa-Ras-экспрессирующих фибробластов.

Несмотря на участие белка p2tWafl в сборке комплексов Cyclin D-CDK4/6, инициирующих G|-фазу клеточного цикла, эмбриональные фибробласты мыши с нокаутами генов, кодирующих ингибиторы семейства Cip/Kip, остаются жизнеспособными (Cheng et al., 1999). Эти данные согласуются с результатами нашей работы, демонстрирующими, что El A/clIa-Ras-экспрессирующие МЕР с нокаутом p2!Wafl (mERas р21-/-) жизнеспособны и их пролиферативная активность сопоставима с контрольными трансформантами mERas. Одним из основных свойств трансформированных клеток является преодоление предела Хейфлика и обретение способности к бесконечному количеству делений. Оба типа ElA/cHa-Ras-экспрессирующих линий являются иммортализованными, поскольку, в отличие от нормальных мышиных фибробластов, количество их делений не лимитировано. И mERas, и mERas р21-/- были получены методом селекции, основанном на получении "фокусов" трансформированных клеток, которые пролиферировали в многослойных структурах на монослое нормальных MEF. Это говорит о том, что ElA/cHa-ras-экспрессирующим фибробластам с нокаутом p21Wafl, как и трансформантам с полным геномом, свойственно отсутствие контактного (плотностно-зависимого) торможения пролиферации, которое является одним из главных признаков трансформированного фенотипа.

2. / Скорость пролиферации клеток mERas р21-/- зависит от их плотности.

На кривых клеточного роста (рис. 2А) видно, что обе ElA/cHa-Ras-экспрессирующие линии

л Рис. 2. Среднее время удвоения популяции клеток mERas

р21 -/- зависит от их плотности. При низкой плотности (24 и 48 ч культивирования) клетки mERas р21-/- пролиферируют значительно медленнее, чем клетки mERas, но при достижении большей плотности ускоряют пролиферацию. (А) На кривых клеточного роста представлена функция их количества от времени. (Б) Среднее время удвоения популяции, см. Материал и Методы.

ai

g 150

6 100 «

§

2С 50

—О—mERas — mERas -4—MEF

« !

2<t & Ti se 12» Времач

Клеточная линия Среднее время удвоения популяции

Период 0-49 ч Период 48-1204

mERas 15.0 ч 25.8ч

mERas р2Н- Шжк ■¡gSti'

пролиферируют гораздо быстрее и обладают большей насыщающей плотностью, чем ^трансформированные клетки MEF. Однако важно отметить, что линии mERas и mERas р21 -/отличаются друг от друга по этому признаку. При низкой плотности (24 и 48 ч культивирования) клетки mERas р21 -/- пролиферируют значительно медленнее, чем клетки mERas: среднее время удвоения популяции трансформантов niERas составляет 15 ч, тогда как для клеток mERas р21-/-достигает 34 ч (рис. 2Б). Однако при дальнейшем культивировании mERas р21-/- "догоняют" клетки mERas и через 120 ч после начала культивирования дают даже большую плотность, а среднее время удвоения популяции составляет уже 15 ч для mERas р21 -/- и 26 ч для mERas, что говорит о сокращении продолжительности клеточного цикла нокаутных трансформантов при достижении ими высокой плотности. Эти данные свидетельствуют о взаимосвязи времени удвоения популяции и плотности клеток mERas с нокаутом p21Wafl: при высокой плотности mERas р21-/- пролиферируют со скоростью, сопоставимой с mERas, тогда как при низкой плотности - сопоставимой с нетрансформированными MEF.

2.2 вовлечен в дезорганизацию актинового цитоскелета EÍA/cHa-Ras-трансформантов.

Несмотря на то, что клетки mERas с нокаутом p21Wafl теряют признак контактного торможения пролиферации как и трансформанты с полноразмерным геномом, они имеют различающуюся морфологию. На рис. ЗА представлены фотографии клеток в проходящем свете, на которых видно, что клетки mERas имеют преимущественно округлую морфологию и практически не распластываются на субстрате. При окрашивании таких клеток родамин-фаллоидином видно, что в трансформантах mERas отсутствует выраженная организация актинового цитоскелета, в отличие от нормальных MEF. Подтверждением этому служат и данные иммунофлуоресценции по выявлению фокальных контактов антителами против белков-компонентов этих комплексов: паксиллина и винкулина (рис. ЗБ). В тоже время клетки mERas р21-/- более распластаны, чем mERas, и демонстрируют способность к образованию стресс-фибрилл и фокальных контактов, что свидетельствует о важной роли p21Wafl в дезорганизации актинового цитоскелета при трансформации.

2.3 Дезорганизация актинового цитоскелета и уменьшение фосфорилирования кофилина коррелируют с цитоплазматической локализациейp2l"aJ1 в клетках mERas.

Установлено, что p21Wafl, находясь в цитоплазме, способен ингибировать каскад RhoA-ROCKl-LIMICl-кофилин за счет инактивации Rho-киназы (ROCK.1) и, благодаря накоплению нефосфорилировашюго кофилина, стимулировать деполимеризацию актина, что приводит к разборке стресс-фибрилл и уменьшению числа фокальных контактов (Lee and Helfman, 2004). Как продемонстрировали результаты иммуноблоттинга, фосфо-формы кофилина в клетках mERas, в отличие от mERas р21-/-, не выявляются (рис. 4А). Дня анализа цитоплазматической локализации p2jWafi и ее рОЛИ в процессе фосфорилирования кофилина и дезорганизации актинового цитоскелета в клетках mERas было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание p21Wafl. Как показано на рис. 2Б, p21Waf' обнаруживался преимущественно в ядре, однако его содержание в

А

МЕР

тЕЯа;

тЕЯа; Р21 -/-

\Zinculin

РахИИп

тЕ1?а4

тЕ(!а5 р21 -/-

- . > г ^ир^с О- 1 > ••> V ' 'с? ' .■ •

. ' . . V- Ш : \ • •I У— е 0 2!>

Рис. 4. Клетки шЕКаэ р21 -/- более распластаны, чем тЕЯаБ, и сохраняют способность к образованию стресс-фибрилл и фокальных контактов, что приближает их к нормальным МЕГ (А) Актгаювый цитоскелет окрашивали родамин-фаллоидином (красная окраска). (Б) Винкулин и паксиллин (желтая окраска), основные компоненты фокальных контактов, детектировали методом иммунофлуоресценции. Синяя окраска - ОАР1,

МЕЕ

тЕЯа$

тЕЯа*р21-/-

р-СойИп СоЯНп

Р21"

(¿а «>

».и—' -1 ».Б—1

ОАР1

Рис. 3 Цитоплазматическая локализация р21 в клетках тЕЯаз коррелирует с низким уровнем фосфорилирования кофилина. (А) Фосфорилированная форма и общее количество кофилина выявляли методом иммуноблоттинга. (Б) Иммунофлуоресцентный анализ локализации р21у/аЛ. (В) Денситометрия р21у/аЛ в клетках МЕР и тЕЯаБ в цитоплазме. Количество р21ШаП в цитоплазме или ядре измеряло на одинаковой площади как минимум на трех независимых фотографиях с помощью программы ImageJ. Отношение усредненных значений

флуоресценции р21

цитоплазме и ядре клеток МЕР было принято за 1,

ои—1 1

в )

§ % 2*

3 *

> 5 § '

1

1

1 | 1

х О 8 0.5

С

относительно которого оценивали подобное отношение для тЕКаэ.

цитоплазме трансформантов mERas было в два раза больше, чем в цитоплазме родительских ^трансформированных MEF (рис. 2В). По-видимому, дезорганизация актинового цитоскелета в процессе £7/4/с#а-га?-трансформации MEF связана с частичной релокализацией p21Wafl в цитоплазму и ингибированием RhoA-каскада.

2.3 Роль p21Wafl в миграции и инвазии ElA/cHa-Ras-экспрессирующих фибробластов.

Высокая скорость миграции и инвазии клеток является одним из признаков трансформированного фенотипа, так как опухолевые клетки способны мигрировать и проникать сквозь ткани, что, в конечном счете, определяет метастатические осложнения раковых заболеваний. Показано, что трансформация онкогеном cHa-ras приводит к усилению миграции иммортализованных фибробластов Swiss-ЗТЗ, а активация RhoA-каскада и сборка стресс-фибрилл уменьшают подвижность таких клеток (Sahai et al., 2001). Таким образом, индуцируемый через каскад Raf-MEK-ERK конститутивно-активным Ras белок p21Wafl, локализуясь в цитоплазме и выступая в качестве инактиватора RhoA-ГТФазного каскада (Lee and Helfman, 2004), может стимулировать миграцию трансформированных клеток. В связи с этим, ElA/cHa-Ras-экспрессирующие клетки были протестированы на способность осуществлять миграцию и инвазию через поры мембран камер Бойдена. Как видно на рис. 5А, клетки линии mERas mERas mERas р21-/-

Рнс. 5. В отличие от клеток линии тЕКая, клетки тЕЯаз р21 -/- мигрируют через поры мембран и проникают через матригель с низкой эффективностью. Способность клеток реорганизовывать цитоскелет для миграции оценивали по их способности проникать через поры мембран камер Бойдена (А), тогда как для оценки способности клеток к инвазии, использовали камеры, покрытые матригелем (Б), см. Материал и Методы.

мигрировали с высокой эффективностью, в то время как тЕЖаз р21-/- демонстрировали низкую миграционную способность. Сходные результаты были получены и по анализу инвазии: клетки mERas проникали через покрытые матригелем мембраны камер Бойдена, в отличие от тЕЯав р21-/-, которые оставались на мембране (рис. 5Б). Таким образом, процессы миграции и инвазии Е1А/сНа^аз-экспрессирующих клеток также зависят от р2^аП, поскольку нокаут его гена не позволяет получить трансформанты с выраженным проявлением таких важных признаков трансформированного фенотипа, которые связаны с высокой миграционной и инвазивной активностью.

,, - ^ V - -.-.о . -• . ■*■ Ü, ■ 1 - / ■N -VУ/г.-1' -.4' ••• .

Г

■ i. ''' '.-■• :

2.4 Эффективность клонирования на пластике и пролиферация в полужидком

агаре ElA/cHa-Ras-трансформаитов зависят от p2l""JT.

Нормальные фибробласты не могут пролиферировать в клональной плотности и способность одиночных клеток формировать колонии является признаком трансформированного фенотипа.

Рис. 6. В отличие от клеток линии mERas, mERas p21Wafl не способны пролиферировать в клональной плотности и формировать колонии в отсутствие прикрепления к субстрату. (А) Эффективность клонирования. (Б) Пролиферация в полужидком агаре.

Результаты анализа эффективности клонирования показал», что, в отличие от ElA/cHa-ras-трансформантов с полным геномом, клетки с нокаутом p21w',fl практически лишены способности пролиферировать в клональной плотности (рис. 6А).

Одним из наиболее характерных признаков опухолевых клеток, связанных с дезорганизацией актинового цитоскелета, является их способность к независимой от субстрата пролиферации. На рис. 6Б видно, что сохранение актинового цитоскелета mERas р21 -/- препятствует их пролиферации и формированию колоний в полужидком агаре. Таким образом, неспособность клеток mERas р21-/- пролиферировать в клональной плотности коррелирует с потерей способности формировать колонии в полужидком агаре.

2.6 Стрессорные воздействия на EIA/cHa-Ras-экспрессирующие ME F не приводят

к блоку клеточного цикла, но запускают апоптоз независимо от присутствия р21""л.

Онкогенная трансформация клеток сопровождается нарушением работы программы строгого

контроля над целостностью генома, что, в частности, проявляется в потере способности

трансформированных клеток блокировать пролиферацию после повреждения ДНК. Клетки,

неспособные останавливать клеточный цикл для репарации повреждений, либо запускают

программу апоптоза, либо пролиферируют с генетическими дефектами, повышая генетическую

гетерогенность популяции. Известно, и это нами ранее показано (Bulavin et. al., 1999), что

повреждение ДНК нормальных эмбриональных фибробластов приводит к остановке клеточного

цикла в контрольных точках. В частности, антрациклиновый антибиотик адриамицин (Adr),

известный ДНК-повреждающий агент, блокирует клеточный цикл ^трансформированных клеток

MEF (Attardi et al., 2004). Обе линии ElА/сНа-Ras-экспрессирующих фибробластов не способны

останавливать цикл деления в сверочных точках, а отвечают на обработку адриамицином

клеточной гибелью (рис. 7). Результаты проточной цитометрии показали, что в обеих линиях,

mERas и mERas р21-/-, через 48 ч после действия Adr появляется гиподиплоидный пик ДНК (рис.

7А). Окрашивание клеток красителем DAPI выявило в трансформантах mERas характерные для

апоптоза ядра с плотно конденсированным ярко окрашенным хроматином, которые в клетках

mERas р21-/- сопровождаются еще и появлением микроядер (рис. 7В). Анализ апоптотической

13

гибели по выявлению характерной олигонуклеосомной фрагментации ДНК подтвердил данные, полученные с DAP1 (рис. 7Б), что говорит о запуске программы апоптоза в mERas и mERas р21-/-.

1$48ч

niRas

rrtERa» p21-f-

iiifc-et:

mERas ]

mERas J pn-/- В шЬ-ей: S 5,6*2,4%

К IS Mi К IS Adt

В

mERas

mERas p21-/-

L à»* «t* " M • fm A * л v4 Ï ' i Щ ** »* * 4 * * * Vf 1 • A* щ * * 1 <Jn * v ù ' о %C & » ■> A.. <:" »♦„ AV ', • » * ' ф Sb» * >■• -Ле»

1 > « кг

' i * Ч Г*ь ! * !i® Si %f WCi&L % ' * IrÎ&jfm * V Щ * . »«»■.д548ч N m* % ir* 9 : ЛЙ .¿й- Jag, \ " ТУ " V&, * -, ,« <» » « <« ••Г','" i * * * 1 * % % » ^¿Л^дзадч,

s»* *% fe 4% 9* г# j4 # Ж % -.Л * У* m * ^ ï л » * }. * »#■ ' Wm"' %> Мг&ч с* m W f' %> Adr484

Рис. 7. Адриамицин (Ас1г) и сывороточное голодание (ЬЗ) вызывают апоптоз в обеих клеточных линиях. (А) Проточная цитометрия. На графиках представлена доля разрушенной ДНК (БиЬ-С,). Стандартное отклонение получено при проведении эксперимента в многократной повторности. ДНК фаз О и Сум отмечено как 2С и 4С, соответственно. (Б) Анализ

фрагментированной ДНК на наличие нуклеосомного повтора, см. Материал и Методы. Клетки подвергались обработке адриамицином или сывороточному голоданию в течение 26 ч. М - маркер молекулярного веса. (В) Морфология ядер, окрашенных красителем ПАР1. Характерные для апоптоза ядра с плотно конденсированным ярко окрашенным хроматином отмечены белыми стрелками, микроядра отмечены черными стрелками.

Удаление ростовых факторов сыворотки из среды культивирования также вызывает блок клеточного цикла нормальных фибробластов, а неспособность клеток останавливаться в точке рестрикции при сывороточном голодании является важным свойством трансформированного фенотипа (Blagosklonny and Pardee, 2002). В отличие от нормальных MEF, которые реализуют блок клеточного цикла после удаления ростовых факторов из среды культивирования, в обоих типах Е1 A/cHa-Ras-экспрессирующих клеток запускается апоптоз (рис. 7). Так как известно, что p21Wafl осуществляет анти-апоптотические функции, ответ клеток на действие ДНК-повреждающих и стрессорных агентов в двух Е1 A/cHa-Ras-экспрессирующих линиях мог

Adr484

sub-S,:

%

существенно различаться. Однако полученные нами данные говорят о вовлечении p21Wafl-независимых путей инициации апоптоза при сывороточном голодании и повреждении ДНК адриамицином.

3. p21Wafl и активация клеточного старения ElA/cHa-Ras-экспрсссирующих фнбробластов.

Еще одной тумор-супрессорной программой, стоящей на пути превращения нормальных клеток в опухолевые, является программа клеточного старения. В настоящее время ее рассматривают как один из перспективных способов терапии онкологических заболеваний. Первоначально под старением понимали прекращение пролиферации нормальных клеток по прошествии определенного числа делений - лимита Хейфлика (Hayflick, 1965). Такой тип старения клеток человека, который называют репликативным, является результатом последовательного укорочения теломер с каждым раундом репликации, в отсутствие теломер-восстановливающих ферментов - теломераз (Harley et al., 1990). Однако было обнаружено, что высокий уровень активности онкогенов, например ras, за короткий промежуток времени вызывает клеточное старение фибробластов человека и грызунов (Serrano et al., 1997), которое получило название теломер-независимого ускоренного старения. В настоящее время под клеточным старением понимают последовательность необратимых событий, результатом которых является остановка пролиферации клеток в фазе G| или G2 клеточного цикла, при сохранении их высокой метаболической активности (Roninson, 2003). Это состояние клетки, в отличие от фазы покоя Go, не связано с нехваткой митогенов, а, напротив, является следствием активации митогенных каскадов. Активация программы клеточного старения наблюдается после воздействия ДНК-повреждающих факторов, критического укорочения теломер, цитостатиков, HDACi, ретиноидов, а также повышения активности онкогенов и ряда митоген-активируемых киназ, таких как Ras, Raf-1, B-Raf, МЕК, р38, Akt и PI3K (Blagosklonny, 2006). В ходе онкогенеза программа клеточного старения должна быть подавлена, чтобы клетки могли неограниченно пролиферировать, но в некоторых типах опухолевых клеток ее удается реактивировать цитостатиками, облучением, HDACi или ретиноидами (Roninson, 2003). Необходимо подчеркнуть, что HDACi сейчас находятся на стадии преклинических и клинических испытаний как анти-опухолсвые агенты-цитостатики нового типа, которые используются, в том числе, и для запуска программы клеточного старения. Подавление пролиферации в стареющих клетках инициируется вслед за р53-

„ ,, Wafl —

зависимом активациеи транскрипции р21 , следствием чего является блок клеточного цикла. При этом активация р21Wafl носит временный характер и, после остановки клеточного цикла, его содержание уменьшается, в то время как количество другого ингибитора циклин-зависимых киназ, р1б'"к4а, увеличивается и, благодаря именно этому ингибитору, блок клеточного цикла поддерживается в стареющих клетках (Roninson, 2003). Нами была исследована роль p21Waf1 в реактивации программы старения трансформантов mERas и mERas р21-/- после долговременного действия NaB.

3.1 1ЧаВ блокирует прохождение тЕЛаэ и тЕНав р21-/- по клеточному циклу.

Анализ клеточного цикла методом проточной цитометрии показал, что N88 способен вызывать блок клеточного цикла обеих Е1А/сНа-11а8-экспрессирующих линий (рис. 8А). На диаграммах видно, что количество клеток, находящихся в Э-фазе, падает после действия бутирата натрия, в то время как в фазах С| и вг оно растет. При этом активности Сусйп Е- и СусНп А-ассоциированных киназ падают в обеих линиях (рис. 8Б). По всей видимости, это связано с уменьшением количества циклинов Е и А на белковом уровне (рис. 8В), который, в свою очередь, уменьшается на уровне транскрипции, что было показано методом ОТ-ПЦР (рис. 8Г). По всей видимости, это связано с тем, что НЭАО, и ЫаВ в частности, изменяют экспрессию как в сторону

mERas

аб2+м

24 li 12S 129 NjBW

+ OIV • + 9TV., 1

mERas р21/

Ш1

■«61

G. 47.2 80,2 63.3 76,6 76,8

S 37,5 10,4 21,5 2,1 3,1

G, 15,3 9,4 15,2 21,3 20,1

> H 24 24 * WV. 123 120 ♦ ow.

39,2 60.2 41,5 84.0 42,8

S 50,6 32,6 45,3 9,1 44,2

G, 10,3 7,2 13,2 6.9 13,1

niERas

nïRas p21-i-

iw£Ras

«rtERas ii?1-i-

NaB{4)

21 П 120

24 7i к га ^г no HsB (ч)

!P<Cytilr>E) KHI

1Р(СусЙпА) ннд

mERas

mERaii p21-i-

s га п ш m к и ri 12» m NaB (ч)

Су din A Cdk2 GAPOH

Д

тШч |§|:ÉÉi :

rrtERas

m£Rasp21-i-

Cyelmt | CyclinA

GAPDH

n* '»s Sî1' * n Ui й» N3BW

IHCytlinE» HH1

IP(CydinA) HH1

Рис. 8. Бутират натрия вызывает блок клеточного цикла в обеих ElA/cHa-Ras-экспрессирующих линиях независимо от присутствия p21Wan. Остановка пролиферации сопровождается уменьшением содержания циклинов Е и А на уровне мРНК. Однако такой блок клеток mERas р21-/-, в отличие от блока mERas, является обратимым. (А) Диаграммы результатов проточной цитометрии. В таблице представлена доля клеток, находящихся в соответствующих фазах клеточного цикла, отм. - "отмывка", культивирование клеток в новой среде без NaB (Б) In vitro анализ киназной активности циклин Е/А-ассоциированных киназ. (В) Анализ содержания циклинов Е и А методом иммуноблоттинга. (Г) Анализ экспрессии генов циклинов Е и А методом ОТ-ПЦР. (Д) In vitro анализ киназной активности циклин Е/А-ассоциированных киназ. отм. -"отмывка", культивирование клеток в новой среде без NaB.

усиления, так и в сторону ослабления, до 27% генов, участвующих в проведении сигналов, регулирующих пролиферацию, в том числе и циклинов (Mariadason et al., 2000; Abramova et al., 2006).

3.2 Длительное действие NaB вызывает необратимый блок клеточного цикла в трансформантах mERas, но не mERas р21-/-.

Определяющим признаком клеточного старения является необратимость блока клеточного цикла. Методом проточной цитометрии мы обнаружили, что удаление NaB из среды культивирования восстанавливает пролиферацию клеток mERas р21-/-, но не mERas (рис. 8А). При этом в отличие от mERas, в клетках с нокаутом p21Wan наблюдается восстановление активности Cyclin Е- и Cyclin А-ассоциированных киназ (рис. 8Д). Методом иммуноблоттинга было показано, что в клетках mERas, способных запускать программу старения, происходит накопление p21Wafl через 24 ч после добавления NaB и на третьи сутки (72 ч) наблюдается незначительное снижение его количества (рис. 9А). Такая же динамика наблюдается по данным

А

mERas р21-/-

24 7: lio NaB (ч)

р21 Р27"»1 GAPDH

Рис. 9. NaB вызывает накопление р21 , но не pie""1", содержание которого падает на уровне мРНК. (А) Иммуноблоттинг. (Б) и (В) ОТ-ПЦР. В виде гистограмм представлены результаты денситометрии, полученные с помощью программы TotalLab. GAPDH - контроль нагрузки.

mERas

_ pll-í-

24 72 120 108 К NaB (ч)

mERas

mERas

2d 72 120 ISS

mERas p2X-/-К 24 72 120 168 NaB (Ч)

24 72 120 168 NaB(4)

24 72 120 168

24 72 120 168 NaB (4)

ОТ-ПЦР, где на гистограмме денситометрии хорошо видно накопление, а затем лишь небольшое уменьшение содержания транскриптов гена CDKN1A, кодирующего белок р21Wan, продолжающих экспрессироваться на достаточно высоком уровне (рис. 9Б). Другой ингибитор Cip/Kip семейства, p27Kipl, присутствует в клетках mERas р21-/- в гораздо большем количестве, чем в mERas, и, вероятно, замещает функции p21Wafl, например сборка и перемещение в ядро циклин-киназных комплексов Cyclin D-CDK4/6 (Cheng et al., 1999). Методом ОТ-ПЦР было показано, что экспрессия гена CDKN2A, кодирующего белок pió11*4®, который некоторые авторы причисляют к маркерам старения, не только не увеличивается в клетках mERas после действия NaB, а напротив, падает (рис. 9В). В лаборатории М. Serrano было показано, что HDACi трихостатин А и NaB подавляют экспрессию pl6Intl4a в фибробластах мыши и человека (Matheu et al., 2005), что, видимо,

происходит и в наших клетках. Таким образом, уменьшение содержания р161пМа после действия бутирата натрия говорит о том, что принципиальную роль в поддержании блока клеточного цикла при активации программы NaB-индуцированного старения играет другой регулятор клеточного цикла. Мы предполагаем, что в случае ElA/cHa-ras-трансформантов эту роль выполняет p21Wafl. А К МаВ 24 ч Na8 72 ч NaB 120 ч

mERas

mERas р21-/-

«V

с. # f щ - , у - -.. Л. ~йл . щ 1гч\ i - i. - А :> ¿ f y>

г г. ''. \ * t. , > Л ' & •

V •• Л',, о ¿ \ > ^ - .л v\V • ? <!:-:, "-'i • »

mERas

mERas р21-А

я ш

К NaB72 ч

Высота, мнм 8.50 ±0.89 14.7 ± 1.45

Площадь, мкмг 214.6 i 48.46 654.3 ± 243.29

и SE

К NaB72ч

Высота, мкм 5.14 ±0.93 5.15 ±1.38

ими Площадь, мкмг 278.3 ± 106.80 368.4 ±63.65

В

К NaB 24 ч NaB 72 ч NaB 120 ч NaB 168 ч

Активность 8А-(3-Оа1. (Б) Размеры клеток, полученные с помощью конфокального микроскопа и прмраммы ImageJ. Зеленая окраска - иммунофлуоресценция 3-катекина как маркера клеточных границ. Наблюдается увеличение размеров клеток тЕЛаз обработанных бутиратом натрия, как по высоте клеток, так и по площади распластывания, что говорит об общем увеличении объема, т.е. о гипертрофии клеток. Ядра окрашены ОАР! (синяя окраска). (В) Анализ прямого светорассеяния методом проточной цитометрии, подтверждающий данные конфокальной микроскопии о гипертрофии клеток тЕЯаз после обработки ЫаВ. По оси Y - прямое светорассеяние, по оси X - содержание ДНК.

3.3 Маркеры клеточного старения не выявляются в клетках mERasр2}-/-.

К числу наиболее распространенных маркеров старения относится активность ассоциированной со старением бета-галактозидазы SA-ß-Gal. Согласно полученным данным, этот маркер тесно коррелирует с необратимостью блока клеточного цикла ElA/cHa-Ras-экспрессирующих линий. В клетках mERas уже на третий день действия NaB появляется, а на пятые сутки (120 ч) - еще больше усиливается окраска субстрата SA-ß-Gal (рис. I OA). Однако в клетках mERas р21-/- этот маркер старения не появляется.

Еще одним маркером клеточного старения является гипертрофия. Клеточное старение - это не только необратимый блок клеточного цикла: стареющая клетка не делится, но остается метаболически активной, что приводит к накоплению белка и, как следствие, к увеличению размеров клетки (Blagosklonny, 2006.). Согласно данным иммунофлуоресценции, полученным с помощью антител против ß-катенина (рис. 10Б), клетки mERas, в отличие от mERas р21-/-, увеличиваются в размерах уже через 72 ч после добавления NaB. Как следует из приведенной таблицы (рис. 10Б), наблюдается увеличение как по высоте, так и по площади распластывания клеток, что говорит об общем увеличении объема, т.е. о гипертрофии клеток mERas, обработанных бутиратом натрия, и это подтверждается данными анализа прямого светорассеяния методом проточной цитометрии (рис. 10В). Видно, что клетки mERas, в отличие от mERas р21-/-, увеличиваются в размерах после действия NaB. Увеличение размера клеток коррелирует с накоплением общего количества белка в клетках mERas, которое отсутствует в клетках линии mERas р21-/- (рис. 11А). Эти данные говорят о вовлечении p21Wi,fl в регуляцию гипертрофии при старении клеток mERas и служат еще одним доказательством того, что в отсутствие p21Wafl ElA/cHa-Ras-экспрессирующие фибробласты не могут запустить программу NaB-индуцированного клеточного старения.

3.4 Гипертрофия клеток mERas, индуцированная NaB, осуществляется за счет р2-опосредованной активации mTORCl.

Одной из причин гипертрофии клеток на фоне блока клеточного цикла может быть высокий уровень активности киназного комплекса mTORCl, контролирующего процесс биосинтеза белка за счёт фосфорилирования ключевых регуляторов трансляции мРНК. Комплекс mTORCl активирует киназу S6K1, мишенью которой является субъединица рибосом, белок S6, а также инактивирует ингибитор фактора инициации трансляции eIF4E, белок 4Е-ВР1 (Ruvinsky and Meyuhas, 2006). Используя в качестве индикатора активности mTORCl фосфорилирование S6, мы обнаружили, что NaB вызывает увеличение количества фосфо-форм белка S6 в клетках mERas, но не в mERas р21 -/- (рис. 11Б), что говорит о p2lw"n-опосредованной активации mTORCl в данных условиях. Для выяснения степени участия mTORCl в гипертрофии клеток mERas при запуске программы старения был использован рапамицин, специфический ингибитор mTORCl. Как видно на гистограмме, рапамицин снижает уровень фосфорилирования S6 (рис. 11 Б), но при этом он не отменяет NaB-индуцированный блок клеточного цикла (рис. 11В), однако частично восстанавливает размеры клеток mERas (рис. 11Г). Таким образом, наши результаты показывают,

что механизм NaB-индуцированной гипертрофии при старении клеток mERas является mTORCl-зависимым и для активации этого сигнального пути необходим p2lWatl. 100

с

mERas

® £

И О ^

20 0

Т mERas

Б

0» К i ■

ifi 2 5 -

а. 2 ■

| 15 -

3 1 -

| 0.S -

о 0 ■

i

S

г, s 2 • 1.5 1

9,5 0

24 72 129 168 Г|ав (Ч)

toS Bsp

Rsp

mERas ¡>21 -

Hl

tö8 (ts¡>

im «о ч

mERas í

mERas ptl-f-

flaB 120 ч HaB<Rap120 ч

1 S ,»MS¡> I «.;?S>,785»

1 Si Ml w 1 S¡ 6,544

1 S,¡ 23,00« I «¡;13,S¡№

1 в :U,SS% I Os: 76,53«

ЯМ4Х I S¡1),««

j I [«>; 13.74» 1 в,-13,074

2C 4C

Рис. II. Гипертрофия клеток mERas, индуцированная NaB, осуществляется за счет р21 а -опосредованной активации киназного комплекса mTORCI. (А) Измерение содержания белка в 10 клеток проводили методом Бредфорд, см. Материал и Методы. (Б) Денситометрия результатов иммуноблотгинга фосфо-форм белка S6, мишени mTORC!-каскада. Обработку бутиратом натрия (NaB) или рапамицином (Rap) проводили в течение 120 ч. (В) Проточная цитометрия. Цифрами на графике указана доля клеток, находящихся в соответствующей фазе клеточного цикла. 2С и 4С - диплоидное и тетраплоидное содержание ДНК. (Г) Анализ прямого светорассеяния методом проточной цитометрии. По оси Y - прямое светорассеяние, по оси X - содержание ДНК.

3.5 NaB-индуцированное клеточное старение mERas сопровождается усилением

адгезии клеток.

В связи с тем, что увеличение распластанности клеток также является маркером клеточного старения, была проведена оценка роли NaB в формировании фокальных контактов и организации актинового цитоскелета. С помощью антител против винкулина было показано, что обработка mERas бутиратом натрия приводит к увеличению количества адгезионных контактов, не детектируемых в необработанных контрольных клетках (рис. 12А, Б), тогда как в клетках mERas с нокаутом p21Waf1 NaB существенно не менял число фокальных адгезионных контактов. Аналогичные результаты получены и с другим белком фокальных комплексов, паксиллином (данные не показаны). NaB-индуцированное увеличение количества адгезионных контактов в клетках mERas коррелирует с накоплением неактивной, фосфорилированной по Ser3, формы кофилина (рис. 13Д), который в нефосфорилированном состоянии отвечает за деполимеризацию стресс-фибрилл (Yang et а!., 1998). Клетки линии mERas р21-/-, в которых онкобелок cHa-Ras экспрессируется на сопоставимом уровне (рис. 12В), демонстрируют высокий уровень

фосфорилирования кофилина как в контроле, так и после обработки бутиратом натрия, что совпадает с данными цитохимии по выявлению актиновых стресс-фибрилл (рис. 12А, Б).

А

Vinculin

Rhod.-Phal. DAPI

Б

Vinculin

Rhod.-Phal. DAPI

mERas

ihER.ts p21-/-

NaB 120 ч

К

NaB 120 ч

" ' ■ ■ 1

t > :•-<-•> ч

> t ■А. '

' Л А» № : *v . .-л t£ Х " ■;! > г Á V' V

В

Ras GAPDH

mCRas

nf Ras

píl-/-

к izo к 120 NaB (ч)

Рис. 12. (А) и (Б) NaB-индуцированное клеточное

старение mERas сопровождается усилением адгезии клеток. (Б) -большее увеличение. Винкулин детектировали методом

иммунофлуоресценции. Актиновый цитоскелет окрашивали родамин-фаллоидином (красная окраска), Ядра окрашены DAPI (синяя окраска). (В) Иммуноблоттинг, демонстрирующий сопоставимое количество Ras в обеих линиях и после действия NaB. GAPDH -контроль нагрузки.

3.6 Миграция клеток тЕЯах снижается при старении, а ингибитор киназпого комплекса тТОЯС1 рапамицин способен этому препятствовать.

Как показали опыты по заполнению "раны" клеточного монослоя, обработка клеток шЕЯав бутиратом натрия в течение 72 ч уже существенно подавляет заполнение "раны", а через 7 сут (168 ч) клетки перестают мигрировать полностью (рис. 13А), что, с учетом нормирования на плотность клеток, хорошо видно на диаграмме (рис. 13Б). В то же время, клетки тЕЛаз с нокаутом р21ч,аП способны заполнять "рану" и после их культивирования в течение 7 сут (168 ч) с Аналогичные данные были получены и с миграцией через поры мембран камер Бойдена. На рис. 13Г видно, что необработанные контрольные тЕЯаз мигрируют через поры с относительно высокой эффективностью, а ШВ-обработанные в течение 5 сут (120 ч) клетки полностью теряют миграционный потенциал. При этом ЫаВ не только не уменьшает миграцию клеток тЕКав р21-/-через поры мембран, но даже, наоборот, ее стимулирует. Таким образом, выявлен еще один механизм тумор-супрессорного действия бутирата натрия на Е1А/сНа-Лаз-экспрессирующие фибробласты с полным геномом, однако с чем связано усиление миграции шЕЯаз в отсутствие р21™аП после добавления пока сказать сложно. Мы предполагаем, что такой

противоположный эффект бутирата натрия на миграцию клеток тЕКая и гаЕЯаз р21-/- является следствием различной организации цитоскелета. Интересно отметить, что рапамицин уменьшает количество фосфо-форм белка кофилина (рис. 13Д) в клетках шЕЯаз, культивируемых с ЫаВ, и частично восстанавливает их миграцию через поры мембран камер Бойдена (рис. 13Г) и

А тЕЯа* шЕЯа?р21-/-

Рис. 13. Миграция клеток тЕЯав снижается при старении, а ингибитор киназы тТСЖС1 рапамицин (Яар) способен этому препятствовать. (А) Анализ миграции клеток по заполнению "раны" клеточного монослоя. (Б) и (В) Количественный обсчет миграционного потенциала клеток при заполнении "раны", см. Материал и Методы. (Г) Анализ миграции клеток через поры мембран камер Бойдена. (Д) Содержание фосфо-форм белка кофилин. Обработку НаВ или НаВ+Яар проводили в течение 120 ч (для (В) и (Д)).

Г

тЕР.ге

тЕРгв »21-/-

СоЯНп

р-СоМп

т£11аб

Й "»

тЕйаэ

рМ-.'-

к "» 'С

заполнение "раны" клеточного монослоя (рис. 13В). При этом в №В-обработанных клетках линии шЕКав р21-/- рапамицин не вызывает изменений ни в фосфорилировании кофилина, ни в миграции через поры мембран, ни в заполнении "раны". Таким образом, мы показали, что в случае ШВ-индуцированного старения происходит подавление миграции Е1А/сНа-11аз-трансформированных фибробластов, а рапамицин способен отменять его действие. Важно отметить, что снижение миграционного потенциала, вызванное бутиратом натрия, является

0 1 \Vafl

р21 -зависимым.

Заключение

Полученные данные позволяют говорить о том, что р21ЙМ, с одной стороны, необходим для полноценной трансформации эмбриональных фибробластов мыши онкогенами Е1Аас15 и сЯа-гаг, так как нокаут р21и'аП приводит к потере специфической морфологии, характерной для опухолевых клеток, и таких признаков трансформированного фенотипа, как способность

пролиферировать в клоналыюй плотности и независимо от прикрепления к субстрату, а также повышенные миграция и инвазия. Эти данные можно рассматривать как экспериментальное объяснение отсутствия делеций и мутаций гена, кодирующего p2IWafl, в опухолях человека in vivo. С другой стороны, в ElA/cHa-Ras-трансформированных клетках p21Wail необходим для реактивации тумор-супрессорной программы клеточного старения, а значит, для подавления признаков трансформированного фенотипа. Таким образом, на нашей модели опухолевых клеток мы показали, что p21Wafl является в определенном смысле "двуликим Янусом", который проявляет онкогенные свойства в процессе трансформации (как мы полагаем, за счет локализации в цитоплазме и дезорганизации актинового цитоскелета), но может играть роль опухолевого супрессора, который необходим для реактивации программы клеточного старения.

Выводы

1. Пара комплементирующих онкогенов EIAad5 и clia-ras не способна вызвать полную морфологическую трансформацию MEF с нокаутом p21Wafl. В отсутствие p21Wafl актиновый цптоскелет не дезорганизуется, что приводит к неспособности клеток mERas р21-/-пролиферировать в клональной плотности и независимо от прикрепления к субстрату, а также мигрировать через поры мембран камер Бойдена.

2. Нокаут p21Wafl не препятствует отмене контактного торможения пролиферации при трансформации MEF онкогенами ElAadS и cHa-ras, так как клетки mERas р21-/-, как и mERas, обладают высокой насыщающей плотностью и способностью к многослойному росту.

3. Обе клеточные линии, mERas и mERas р21-/-, не способны реализовать блок клеточного цикла после повреждения ДНК и удаления ростовых факторов из среды культивирования, а запускают программу апоптоза, что говорит о p21Wafl-независимой регуляции этих событий в Е1 A/cHa-Ras-экспрессирующих трансформантах.

4. Трансформация эмбриональных фибробластов мыши онкогенами EIAadS и cHa-ras сопровождается частичной релокализацией белка p21Wafl в цитоплазму, который принимает участие в регуляции каскада RhoA-ROCKl-LIMKl-кофилин и становлении ряда признаков трансформированного фенотипа, отсутствующих в клетках линии mERas р21-/-.

5. Необратимый блок клеточного цикла трансформантов mERas при длительном действии NaB связан с накоплением p21Wan, но не pl6lnk4a. В отсутствие p21Wafl бутират натрия вызывает только обратимый блок клеточного цикла и обратимое подавление активности циклин-киназных комплексов Gi/S-фаз, но не способен запустить программу клеточного старения El A/cHa-Ras-экспрессирующих фибробластов.

6. Гипертрофия трансформантов mERas, вызванная действием NaB, является следствием p21Wafl-зависимой активации рапамицин-чувствительного киназного комплекса mTORCl, что

<-, i Wafi

свидетельствует о новой роли р21 в регуляции клеточного старения.

7. Активация программы клеточного старения Е1 A/cHa-Ras-экспрессирующих фибробластов, индуцированного NaB, приводит не только к блоку пролиферации, но и к mTOR-зависимому подавлению миграции трансформированных клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1) Романов B.C., Бричкина А.И., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2005. Влияние онкогена Е1А на способность ингибитора p21Wafl регулировать блок G|/S после облучения в Е1А-экспрессирующих трансформантах. Цитология. 47: 1063-1070.

2) Зубова С.Г., Быкова Т.В., Зубова Ю.Г., Романов B.C., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2007. Роль киназы р38 в активации программы "ускоренного старения" в трансформированных фибробластах мыши. Цитология. 49: 115-124.

3) Зубова С.Г., Быкова Т.В., Зубова Ю.Г., Романов B.C., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2008. Бутират натрия не индуцирует программу ускоренного старения в трансформантах по стресс-киназам JNK1.2. Цитология. 50: 964-971.

4) Romanov V.S., Abramova M.V., Svetlikova S.B., Bykova T.V., Zubova S.G., Aksenov N.D., Fornace A., Pospelova T.V. and Pospelov V.A. 2010. p21Wafl is required for cellular senescence but not for cell cycle arrest induced by the HDAC inhibitor sodium butyrate. Cell Cycle. 9: 3945-3955.

5) Романов B.C., Поспелова Т.В. 2006. Взаимодействие p21/Wan с онкобелками Е1А не припятствует формированию комплексов p21/WafI с основными регуляторами клеточного цикла в El А-экспрессирующих трансформантах. 10-я Путинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пущино, 17-21 апреля 2006. Сборник тезисов, с. 93.

6) Романов B.C., Аксенов Н.Д., Зубова С.Г., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2006. Ингибиторы циклин-зависимых киназ p21w"n и pl6,nk4a необходимы для реализации клеточного старения в Е1 А-экспрессирующих трансформантах после действия бутирата натрия. Всероссийский симпозиум "Биология клетки в культуре". Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006. Цитология. 48: 796.

7) Зубова Ю.Г., Быкова Т.В., Зубова С.Г., Романов B.C., Аксенов Н.Д., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2006. Стресс-киназа р38а не является необходимой для активации ускоренного старения в трансформированных фибробластах мыши. Всероссийский симпозиум "Биология клетки в культуре". Санкт-Петербург, 17-19 октября 2006. Цитология. 48: 765.

8) Романов B.C., Аксенов Н.Д., Зубова С.Г., Зубова Ю.Г., Быкова Т.В., Поспелов В.А., Поспелова Т.В. 2007. Ингибиторы циклин-зависимых киназ p21Wal1 и pl6,nk4a в становлении трансформированного фенотипа в Е1 А-экспрессирующих клетках. Второй съезд Общества клеточной биологии. Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007. Цитология. 49: 788-789.

9) Romanov V.S., Zubova S.G., Bykova T.V., Pospelov V.A., Pospelova T.V. 2010. p21Wa" is required for cellular senescence but not for cell cycle arrest induced by the HDAC inhibitor sodium butyrate. International Summer School "From Pluripotency to Senescence: Molecular Mechanisms of Development, Disease and Ageing", Island of Spetses, Greece, August 21-30, 2010. Abstract book, p. 106.

Список цитируемой литературы

Abramova M. V., Pospelova Т. V., Nikulenkov F.P., Hollander C.M., Fornace A.J. Jr., Pospelov V.A.

2006. Gl/S arrest induced by histone deacetylase inhibitor sodium butyrate in E1A + Ras-transformed

24

cells is mediated through down-regulation of E2F activity and stabilization of beta-catenin. J. Biol. Chem. 281: 21040-21051.

Attardi, L.D., de Vries, A., and Jacks, T. 2004. Activation of the p53-dependent G1 checkpoint response in mouse embryo fibroblasts depends on the specific DNA damage inducer. Oncogene. 23: 973980.

BartekJ., Lukas J. 2001. Pathways governing G|/S transition and (heir response to DNA damage. FEBS Lett. 490: 117-122.

Besson A., Assoicm R.K., Roberts J.M. 2004. Regulation of the cytoskeleton: an oncogenic function for CDK inhibitors? Nat. Rev. Cancer. 4: 948-955.

Blagosklonny M. V. 2006. Cell senescence: hypertrophic arrest beyond the restriction point. J. Cell. Physiol. 209: 592-597.

Blagosklonny M.V., Pardee A.B. 2002. The restriction point of the cell cycle. Cell Cycle. I: 103-110.

Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt, Biochem. 72: 248-254.

Bidavin D.V., Tararova N.D., Aksenov N.D., Pospelov V.A., Pospelova T.V. 1999. Deregulation of p53/p21Cipl/Wafl pathway contributes to polyploidy and apoptosis of ElA+cHa-ras transformed cells after gamma-irradiation. Oncogene. 18: 5611-5619.

Cheng M„ Olivier P., Diehl J.A., Fero M„ Roussel M.F., Roberts J.M., Sherr C.J. 1999. The p21(Cipl) and p27(Kipl) CDK 'inhibitors' are essential activators of cyclin D-dependent kinases in murine fibroblasts. EMBO J. 18: 1571-1583.

Delavaine L., La Thangue N.B. 1999. Control of E2F activity by p21 Wafl/Cipl. Oncogene. 18: 5381-5392.

Dotto G.P. 2000. p21 Wafl/Cipl: more than a break to the cell cycle? Biochim. Biophys. Acta. 1471: 43-56.

Laemmli V. 1970. Cleveage of structual proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

Lee S„ Helfman D.M. 2004. Cytoplasmic p21Cipl is involved in Ras-induced inhibition of the ROCK/LlMK/cofilin pathway. J. Biol. Chem. 279: 1885-1891.

Mariadason J.M., Corner G.A., Augenlicht L.H. 2000. Genetic reprogramming in pathways of colonic cell maturation induced by short chain fatty acids: comparison with trichostatin A, sulindac, and curcumin and implications for chemoprevention of colon cancer. Cancer Res. 60: 4561-4572.

Matheu A., Klatt P., Serrano M. 2005. Regulation of the lNK4a/ARF locus by histone deacetylase inhibitors. J. Biol. Chem. 280: 42433-42441.

Coqueret O. 2003. New roles for p21 and p27 cell-cycle inhibitors: a function for each cell compartment? Trends. Cell Biol. 13: 65-70.

Roninson I.B. 2002. Oncogenic functions of tumour suppressor p21(Wafl/Cipl/Sdil): association with cell senescence and tumour-promoting activities of stromal fibroblasts. Cancer Lett. 179: 1-14.

Roninson I.B. 2003. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Res. 63: 2705-2715.

Ruvinsky I., Meyuhas O. 2006. Ribosomal protein S6 phosphorylation: from protein synthesis to cell size. Trends. Biochem. Sci. 31: 342-348.

Sahai E„ Olson M.F., Marshall C.J. 2001. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility. EMBO J. 20: 755-766.

Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation ofp53 andpl6INK4a. Cell. 88: 593-602.

Yang N.. Higuchi O., Ohashi K„ Nagata K., Wada A., Kangawa K„ Nishida E„ Mizuno K. 1998. Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization. Nature. 393: 809-812.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 23.12.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 6950Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Романов, Василий Сергеевич

Список сокращений.

ГЛАВА 1. Введение

1.1. Актуальность проблемы.

1.2. Цели и задачи исследования.

ГЛАВА 2. Обзор литературы

2.1. Клеточный цикл нормальных, трансформированных и стареющих клеток.

2.2. Циклин-киназные комплексы и ингибиторы циклин-зависимых киназ.

2.2.1. Циклин-киназные комплексы.

2.2.2. Ингибиторы циклин- зависимых киназ.

2.3. Маркеры клеточного старения.

2.4. Трансформирующее действие онкогенов ElAad5 и cHa-ras.

2.4.1. Влияние онкобелка El А на регуляцию событий клеточного цикла.

2.4.2. Функции белка Ras.

ГЛАВА 3. Материал и методы

3.1. Культивирование клеток.

3.2. Кривые клеточного роста.

3.3. Оценка эффективности клонирования.

3.4. Оценка способности клеток пролиферировать независимо от прикрепления к субстрату.

3.5. Проточная цитометрия.

3.6. Анализ количества белка.

3.7. Иммуноблоттинг.

3.8. Иммунопреципитация и in vitro анализ киназной активности.

3.9. Иммунофлуоресценция и цитохимия.

3.10. Выявление активности SA-p-Gal.

3.11. Анализ фрагментированной ДНК в апоптотирующих клетках.

3.12. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР.

3.13. Анализ миграции клеток по заполнению "раны" клеточного монослоя.

3.14. Анализ миграции и инвазии клеток через поры мембран камер Бойдена.

ГЛАВА 4. Результаты

4.1. Онкобелок Е1А, связываясь с p21Wafl, не препятствует его взаимодействию с циклин-киназными комплексами в £,7Лас/5/с//а-га^-трансформированных фибробластах.

4.2. Анализ клонов £/Ла^5/с#а-га.у-трансфицированных фибробластов на содержание введенных онкопродуктов и белков-регуляторов клеточного цикла.

4.3. р21ЧУай и становление трансформированного фенотипа Е1А/сНа-11а$-экспрессирующих фибробластов.

4.3.1. Скорость пролиферации клеток шЕКаз р21-/- зависит от их плотности.

4.3.2. р21тп вовлечен в дезорганизацию актинового цитоскелета Е1А/сНа-Иа$-трансформантов.

4.3.3. Дезорганизация актинового цитоскелета и уменьшение фосфорилирования кофилина коррелируют с цитоплазматической локализацией р21ХУаП в клетках шЕЯаз.

4.3.4. Роль р21ШаП в миграции и инвазии Е1 А/сНа-Ыаз-экспрессирующих фибробластов.

4.3.5. Эффективность клонирования на пластике и пролиферация в полужидком агаре Е1А/сНа-11а8-трансформантов зависят от р21^п.

4.3.6. Стрессорные воздействия на ЕТА/сЫа-Яаз-экспрессирующис МЕР не приводят к блоку клеточного цикла, но запускают апоптоз независимо от присутствия р21ШаП.

4.4. р21ШаП и активация клеточного старения Е1А/сНа-Каз-экспрессирующих фибробластов.

4.4.1. ИаВ блокирует прохождение шЕКаэ и шЕИаБ р21 -/- по клеточному циклу.

4.4.2. Длительное действие №В вызывает необратимый блок клеточного цикла в трансформантах щЕНав, но не шЕКав р21-/-.

4.4.3.Маркеры клеточного старения не выявляются в клетках шЕКаэ р21-/-.

4.4.4. Гипертрофия клеток тЕЫаз, индуцированная №В, осуществляется за счет р21У/аП-опосредованной активации тТСЖС1.

4.4.5. ШВ-индуцированное клеточное старение тЕИав сопровождается усилением адгезии клеток.

4.4.6. Миграция клеток тЕКав снижается при старении, а ингибитор киназного комплекса тТСЖС 1 рапамицин способен этому препятствовать.

4.4.7. В становление МаВ-индуцированного клеточного старения клеток тЕЯав вовлечена стресс-киназа ЛМК, но не р38.

ГЛАВА 5. Обсуждение.