Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поведение центросомы и связанного с ней цитоскелета в цитопластах

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Поведение центросомы и связанного с ней цитоскелета в цитопластах"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Рг6 од

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГОРПШЗЕ ЛАНА АНЗОРОВНА

УДК 576.353:576.311

ПОВЕДЕНИЕ ЦЕНТРОСОМЫ И СВЯЗАННОГО С НЕЙ ЦИТОСКЕЛЕТА В

ЦИТОПЛАСТАХ

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1994 г.

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии Института Зизико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН В.П. Скулачев) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

И.А. Воробьев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Б.С. Надеждина.

кандидат биологических наук, О.Ю. Плетшкина

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгарта, РАН.

30 Защита диссертации состоится 1994 г. в

15"часов на заседании специализированного биологического совета д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: II9899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет ИГУ, Ученый совет.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "Д/" ^vi/W/o-V 1994 г.

Ученый секретарь оовата кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Центросома - это область цитоплазмы, содержащая центриоли и окружающие их специфические структуры. Наиболее заметным компонентом центросомы являются центриоли - пожалуй единственные клеточные структуры, имеющие столь значительную геометрическую правильность. Центросома является основным центром организации микротрубочек в клетках животных. Микротрубочки принимают активное участие как в митозе, так и в жизнедеятельности интерфазной клетки (Brinkley et al., 1980; Dustia, 1984; Bershadsky, Gelfand, 1991).

йце со времени открытия центриолей исследователей интересовал ВОПРОС Об ИХ аВТОНОМНОСТИ В клетке (Wilson, 1898; 1925).

К автономным свойствам центросомы следует отнести, во-первых, способность к редупликации центриолей, которая может реализовываться в отсутствие синтеза некоторых клеточных макромолекул (De Foor, Stubblefield, 1974).

В последнее время получены данные, выявившие свойства центриолей, не связанные непосредственно с полимеризацией микротрубочек, которые было предложено назвать "неканоническими" (Воробьев, 1988). Сада нунно отнести, в первую очередь, способность центриолей ориентироваться перпендикулярно субстрату в ответ на различные воздействия (Гудима и др., 1983; Алиева, Воробьев, 1990). Показано, что под действием ингибиторов энергетического обмена (динитрофенол, динитрофенол с дезоксиглпко-зой, ФКФ) возрастает доля активных центриолей, располагающихся перпендикулярно (под углом свыше 74°) к субстрату. Экспериментами с уабаином доказано, что этот эффект зависит от сброса потенциала на плазмалемме (Алиева, Воробьев, 1990).

Кроме того, весьма интересным представляется вопрос об автономности всего связанного с центросомой цитоскелета, о чем в литературе имеются лишь отрывочные данные (Гельфанд и др., 1934; Karsenti et al., 1984).

Удобной экспериментальной моделью для изучения автономности поведения центросомы и цитоскелета служат безъядерные клеточные фрагменты - цитопласты, получаемые с помощью цитохалази-на (Prescott et al., 1972; Goldman et al., 1975; Karsenti et

al., 1984; Carón et al., 1985; Pittenger, Cleveland, 1985; Ken-nerly, Donald, 1987; ПрУДОВСКИЙ, Зеленин, 1978).

Целью настоящей работы было изучить поведение центросомы и связанного с ней цитоскелета в цитопластах, получаемых из культивируемых in vitro .клеток.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) исследовать, как ведет себя центросома в цитопластах после воздействия уабаина - вещества, деполяризующего клеточную мембрану.

2) выяснить возможность репликации центриолей в цитопластах.

3) изучить динамику микротрубочек и поведение промежуточных филаменюв в цитопластах в сравнении с ядерными клетками.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В работе получены новые данные об автономном (независимом от ядра) поведении центросомы.

Показано, что от центросомы в цитопластах отходит больше микротрубочек, чем в ядерных клетках, и существует субпопуляция микротрубочек, которая в цитопластах намного устойчивее к ноко-дазолу, чем в клетках.

В результате воздействия, уабаина на цитошасты активные центриоли (как и в ядерных клетках) ориентируются перпендикулярно го отношения к плоскости субстрата; в цитопластах, полученных из синхронизированных в митозе клеток, которые далее были энуклеироваянн в Gi периоде, происходит редупликация центриолей. Все это указывает на автономность этих свойств центросомы от ядра.

• После инкубации синхронизированных в митозе ядерных клеток в актияоыивдне d репликации процентрюлей не происходит, а в аналогичных условиях в цитопластах центриоли реплицируются. Таким образом, впервые показано, что клеточное ядро оказывает негативное влияние ва репликацию центриолей.

Описан коллапс промежуточных филаментов при старении вдто-пластов, а также прослежено аналогичное явление в ядерных клетках- после искусственного подавления синтеза РНК и белка.

г

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Результаты данного исследования имеют теоретическое научное значение, так как способствуют более глубокому пониманию роли центросомы в регуляции жизнедеятельности клетки. Использованные в работе методические подхода могут быть применены для изучения различных процессов в индивидуальных клетках.

Полученные з работе данные используются в чтении курсов лекций, посвященных цитоскелету и центросоме."

АПРОБАДИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Функциональная морфология клетки" (Санкт-Петербург, 1991), а таете на ряде семинаров в НИИ им. А.Н.Белозерского МГУ и в зарубежных университетах (Калифорнийский университет в Ирвине, Колорадский университет в Боддере, Университет Сев. Каролины в Чапел-Хилл - США, Торонтский университет, Торонто, Канада, Институт молекулярной генетики ЦНРС, Жиф-сюр-Иветт, Франция).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыты были выполнены на перевивной культуре СПЭВ (эпителий почки эмбриона свиньи) и ь-фибрсОлзстах. Клетки высаживали на круглые покровные стекла за 2-3 суток до эксперимента. Для выращивания культуры клеток использовалась среда 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (стрептомицина с пенициллином или генташщша). Клетки выращивали в пластиковых чашках Петри (диаметр 4 см) на покровных стеклах в газовой среде с Ъ% С02 при температуре 37°С.

Для получения цитопластов использовался раствор цитохала-зина о. Конечная концентрация цитохалазина о в культуральной среде составляла I мкг/мл. Раствор вводили в среду культивирования и инкубировали клетки в течение 4-6 часов (культура СПЭВ) или в течение 1-2 часов (ь-фибробласты), после чего стекла клетками вниз монтировали в капроновые вкладыши для центрифужных пробирок. Во вкладыш наливали ту же среду с цитохалазином

d. Клетки СПЭВ центрифугировали при Г0000 об/мин в течение I часа, а ь-фибробласты - при 8000 об/мин в течение 30 минут при 37°С. Центрифугирование проводили в роторе js-I3 на центрифуге J2-2I фирмы весктап (США). Далее стекла переносили в чистые чашки Петри, промывали тремя сменами среды без цитохалазина (по 10 минут) и помещали.. в термостат (37°С) на ночь.

Для анализа функционального состояния митохондрий цито-пласты окрашивали родамином-123 по методу Джонсона с соавторами (Johnson et ai., 1980). Флуоресценцию окрашенных цитопластов, возбужденную светом 480 нм,наблюдали во флуоресцентном микроскопе -Opton" (ФРГ). Препараты живых цитопластов фотографировали на пленку РФ-3 (чувствительность 1200 ед. ГОСТа).

Уабаин (sigma) вводили в среду культивирования цитопластов (СПЭВ) в конечной концентрации 1мМ.

Митотические х.-клетки собирали с помощью инкубации субсли-ваотегося монослоя в среде с нокодазолом (0,1 мкг/мл) в течение 4-6 часов. Далее ыетафазные клетки стряхивали в 2-мл пробирки "Эшендорф" и центрифугировали при 1000 об/мин 3 раза по 3 мин, отмывая при этом чистой средой от нокодазола. Метафазные клетки, находящиеся в осадке, сажали на стекла в капле до полного прикрепления клеток к стеклу. Через 0,5-1 час в чашки Петри доливали среду до полного объема (2-3 мл). Клетки энуклеировали через 16ч после посадки и фиксировали для электронной микроскопии через I; 8; 16; 20 и 24 часа. Перед фиксацией клетки лизи-ровали в смеси, стабилизирующей микротрубочки, как описано ранее (Гудима и др., 1988).

Электронная микроскопия

В работе использовалась стандартная процедура подготовки образцов для электронной микроскопии (по Уитли, 1975 год с небольшими модификациями). Цитопласты на покровных стеклах фиксировали 2,5Я раствором глутарового альдегида (мегск) на фосфатном буфере при рН=7,3 в течение I часа, дофиксировали 1% четы-рехокисью осмия 1,5-2 часа, далее контрастировали уранилацета-том в течение ночи, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне и после пропитки в смесях ацетона с эпоном

заливали в смесь Эпон-812.

Для детального изучения структуры клеточного центра клетки перед фиксацией лизировали в смеси, стабилизирующей микротрубочки, в течение 15 минут. После лизиса клетки споласкивали тем же раствором, но без детергента и глицерина, и фиксировали IX глутаровым альдегидом на фосфатном буфере при рН=6,8 в течение I часа. Дальнейшая подготовка для электронной микроскопии была стандартной. Пространственный анализ строения центросомы и расположения микротрубочек вокруг нее проводился на стереоснимках серийных срезов толщиной 0,25-0,30 мкм. Стереопары фотографировали под углом 10° при увеличении 12000х на электронном микроскопе Н-700 (Hitachi, Япония) с катодом из гексаборида лантана и боковым гониометром, работапцем при ускоряющем напряжении 150175 Jcv.

Анализ расположения микротрубочек вокруг центросомы

Расположение микротрубочек в районе клеточного центра изучали на стереопарах серийных срезов. Анализируемые серии включали все срезы, содержащие центриоли, а также по одному срезу, лежащему выше и ниже центриоли (площадь исследуемого участка составляла 3,6 х 4,6 мкм2, толщина - 0,8-1,5 мкм). Анализ стереоизображений позволил совместить конец кавдой микротрубочки, выходящей за пределы одного среза с ее продолжением на другом срезе, а такяе идентифицировать все микротрубочки, закрепленные в клеточном центре, или имевдиз свободные проксимальные концы в пределах реконструируемой части цитопласта или целой клетки. Классификация микротрубочек проводилась по следующим признакам. Учитывалась длина микротрубочки, местонаховдение ее произямаль-ного конца относительно одного из ЦОМТ (свободных фокусов схождения микротрубочек, головок перицентриолярных сателлитов, стенки цилиндров активной и неактивной центриоли) и расстояние от проксимального конца микротрубочки до этого ЦОМТ.

По длине микротрубочек и по удаленности их проксимальных концов от ЦОЫТ выделяют 4 класса микротрубочек: i - короткие прикрепленные микротрубочки - их проксимальный конец находится на расстоянии нэ более 100 нм от поверхности

центриоля (или от головки перицентриолярного сателлита, или от электронноплотного свободного фокуса схождения микротрубочек), а дистальный - удален от них менее, чем на 2 мкм.

2 - длинные прикрепленные микротрубочки- их цроксимальный конец расположен аналогично I, а дистальный удален более, чем на 2 мкм.

3 - короткие неприкрепленные микротрубочки - их цроксимальный конец удален более чем на 100 мкм, а дистальный удален менее чем на 2 мкм.

4 - длинные неприкрепленные микро трубочки - их проксимальный конец расположен аналогично 3, а дистальный удален более чем на 2 мкм.

Определение ориентации центриолей по отношению к плоскости субстрата.

Для экспериментального определения ориентации центриолей по отношению к плоскости субстрата использовалась методика, предложенная в 1979 году Альбрехг-Беллером и Еушнелл

(Albrecht-Beller, Bushnell, 1979). УГОЛ НЭКЛОНЭ ЦвНТрИОЛЯрНОГО

цилиндра к субстрату определи по длине проекции микротрубочек центриолей на плоскость среза (при этом плоскость среза при серийной резке на ультратоме была параллельна плоскости стекла, на котором росли клетки, с точностью до 1-2°). Толщина среза предполагалась, равной 70 нм. Таким образом, угол наклона ценг-риоли составлял <*=arctg t/70, где t - длина проекции микротрубочки триплета в вы (она измерялась на негативах, снятых при стандартном увеличении 20000х) (Васильев и др., 1988). Для удобства описания в дальнейшем центриоли, чей угол наклона к плоскости субстрата был не менее 74°, мы будем называть перпендикулярными.

Для проверки того, отвечает ж распределение центриолей по углу наклона к плоскости, субстрата в популяции клеток случайно ожидаемому, экспериментально полученные гистограммы сравнивали с теоратичесюоя.рассчитаннымиВасильевым с соавторами (1988). Сравнение гистограмм проводили, используя критерий х2.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Для выявления системы микротрубочек цитопласты на покровных стеклах лизировали при 20°С в растворе, стабилизирующем микротрубочки. Далее клетки фиксировали 0.5% глутаровым альдегидом на физиологическом фосфатном буфере (pbs) при рН=7.3, восстанавливали несвязавшиеся альдегидные группы в трех сменах ыавн4 (2 мг/ш1 на pbs ) по ГО мин. Затем цитопласты последовав тельно обрабатывали моноклональными антителами к тубулину (sigma), фИТЦ-мечеными кроличьими антителами против мыши и, для повышения контрастности, ФИТЦ-мечеными мышиными антикроличьими антителами.

Для более детального изучения поведения микротрубочек в цитопластах обоих культур были поставлены опыты, в которых клетки и цитопласты (2-х часовые и суточные) предварительно обрабатывали нокодазолом (Aidrich Chemie), который хранился в виде матричного раствора в концентрации 1-2 мг/мл. конечная концентрация нокодазола в среде составляла 0.3 мкг/мл и 5 мкг/мл. Цнклогексишд (sigma) вводили в культуральную среду в конечной концентрации 500 мкг/мл.

Актиномидан D (serva) вводили в культуральнув среду в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.

Наличие синтеза ДНК в синхронизированных клетках определяли по включению 5-бромдезоксиуридина (Brdu), выявляемого впоследствии моноклональвыми антителами. Brdu в концентрации 2 мкг/мл вводатг в среду культивирования на I час, начиная от 6 часов после посадки митозов на стекло и заканчивая 25 часами (через каждый час). Затем клетки споласкивали раствором Хенкса, лизировали и фиксировали i% формалином на pbs в течение 20 минут. Далее проводили частичный гидролиз ДНК в 4M соляной кислоте (30-40 минут) и 01фашивали моноклональными антителами к

BrdU.

Полученные препараты заключали в мовиол (caiMochem), просматривали на микроскопе opton (ФРГ) и фотографировали на пленку РФ-3 (Тасма).

Для выяснения активности актиномицина d мы поставили опыт с 3н-уридином на культуре L-клеток. Зн-уридин вводили в среда

культивирования на I час в конечной концентрации 10 мкК (400 кВк). Затеи клетки фиксировали смесью 96° этанола с уксусной кислотой (3:1) в течение 30 мин, промывали проточной и дистиллированной водой, высушивали и клетками вверх наклеивали на предметные стекла. Дальнейшая обработка клеток для авторадиографии была стандартной.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. / Центросома в ядерных клетках '

В интактннх клетках СПЭВ центросома лежит около ядра, расстояние между активной и неактивной центриолями не превышает I мкм. Ыикотрубочки в клеточном центре прикрепляются к боковой поверхности обеих центриолей, а также к головкам перицентрио-лярных сателлитов. Свободные фокусы схождения микротрубочек в интактннх клетках СПЭВ, как известно, отсутствуют (Алиева, Воробьев, 1989). Мы их также не обнаружили. Чаще всего на активной центриоли находятся 1-2 сателлита. Примерно в четверти клеток имелась исчерченные корешки, которые отходили как от активной, так и от неактивной центриоли.

В тех ядерных клетках, в котори центриоли располагаются в непосредственной близости от ядерной оболочки, МТ отходят строго в сторону клеточной мембраны. В ядерных клетках распределение активных центриолей по углам наклона к плоскости стекла, на котором росли клетки, не отличалось достоверно от случайного. Ни одна из 10 центриолей не была перпендикулярна к плоскости стекла.

Центросома в_ядерных клетках после инкубации с уабайном

Через 30 мин после внесения уабаина в среду распределение активных центриолей по углу наклона к плоскости субстрата в ядерных клетках отличалось от случайного (4 из 10 располагались перпендикулярно). отличие между ними были статистически достоверны (р<0,01). Расстояние между активными и неактивными центриолями составляло в среднем I мкм и практически не отличалось от такового в контроле.

е

Цитопласты: морфология.

При исследовании в фазовоконтрастном микроскопе видны одиночные цитопласты и островки их- размером до нескольких десятков энуклеированных клеток в соседстве с малочисленными ядерными клетками. Некоторые островки клеток при центрифугировании сползают, что хорошо видно по характерной границе, которая остается на стекле от бывшего островка. Через 1-2 часа после энуклеации цитопласты имели веретеновидную или отросчатую форму, при окраске родамином-123 видна сеть хаотично расположенных митохондрий, которые занимают в основном центр цитопласта и не заходят в отростки.

На следующий день после энуклеации не все цитопласты имели полигональную форму интактных клеток культуры СПЭВ. Часть их имела веретеновидную или отросчатую форму. Полигональную форму имели цитопласты в островках, а веретеновидную или отросчатую -в основном одиночные цитопласты. При окраске родамином-123 видна сеть митохондрий, которая равномерно заполняет всю цитоплазму. в том числе отростки цитопласта. Через 15-16 часов после центрифугирования митохондрии ярко флуоресцировали не во всех цитопластах, в части их такая флуоресценция отсутствовала. Это говорит о том, что через 15-16 часов после энуклеации часть цитопластов начинает погибать, хотя при наблюдении в фазовом контрасте они еще ничем не отличаются от яивых.

Электронная микроскопия показала, что в цитопластах, полученных из клеток СПЭВ, и шэиаи полигональную форму, клеточный центр находится примерно в их геометрическом центре. В цитопластах, имеющих веретеновидную ила отросчатую форму, клеточный центр нередко оказывался в одном из цитоплазматических выростов.

Через 2 ч после энуклеации центросома в цитопластах не отличается по своему строению от центросома в ядерных клетках. Через 14-16 ч после энуклеации у части цитопластов клеточный центр был окружен большими вторичными лизосомаш, содержащими ламеллярные тельца, и крупными Кировыми каплями. В этом случае клеточный центр выглядел как светлый дворик, и его было очень легко идентифицировать в цитоплазме. При отсутствии вторичных

лизосом и жировых капель область клеточного центра была обычно "размыта" и мало отличалась от окружающей ее цитоплазмы.

Материнская и дочерняя центриоли в цитопластах обычно сближены и находятся в разных цитопластах под разными углами друг к другу. В некоторых случаях центриоли расходились на расстояние до нескольких микрон. Такое разбегание имело место как в норме, так и после воздействия уабаина. На активной (материнской) центриоли имеются придатки и от I до 3 сателлитов. Кроме перицентриолярных сателлитов в цитопластах изредка обнаруживаются свободные фокусы схождения микротрубочек. В цитопластах, как и в ядерных клетках, к центриолям иногда подходят 1-2 исчерченных корешка.

Цитопласты, полученные из ь-клеток, имеют форму классических фибробластов. Электронная микроскопия показала, что клеточный центр находится в геометрическом центре цитопласта в соседстве с крупными жировыми каплями. Кроме центриолей микротрубочки подходят также к I - 3 свободным фокусаг^хоздения микротрубочек, которые присутствуют в части цитопластов. Также оказалось, что через 16-18 ч после удаления ядра примерно в 80% цитопластов, полученных из L-клеток, центросома окружена широким кольцом из промежуточных филаментов. После энуклеации ь-фибро-бластов во всех цитопластах присутствовали обе центриоли.

Известно, что в результате энуклеации центриоли остаются в цитопластах примерно в середине клеточного тела (Goldman et

al-, 1975; Brown et al., 1976). В НЭШИХ экспериментах ДО 20%

цитопластов, полученных из клеток культуры СПЭВ, содержали только одну центриоль - активную или неактивную, и примерно столько же оказались вообще без центриолей. Следовательно, можно предположить, что центриоли в фнбробласгах слабее связаны с ядром, чем в элителноидных клетках.

Центросома в цитопластах (СПЭВ) после инкубации с уабаином

Ультраструктура центросомы в цитопластах после 30-минутной инкубации с уабаином не отличается от таковой в обычных цитопластах. Иногда активная и неактивная центриоли расходились на расстояние до нескольких мкм. Изредка обнаруживались решшциро-

ю

ванные ценгриоли. В этом случае решшшрованшми были обе цент-риоли и длина процентриолей не превышала половину длины материнских центриолей. Однако около половины активных вднтриолей (14 из 32) оказались ориентированными перпендикулярно по отношению к плоскости стекла. Распределение неактивных центриолей по углу наклона к плоскости стекла под воздействием уабаина не изменилось.

В работах Алиевой и Воробьева (1989, 1990) было показанр возникновение-преимущественно перпендикулярной ориентации материнской (активной) центриоли по отношению к плоскости субстрата под воздействием ингибиторов энергетического обмена (под воздействием таких разобщителей, как динитрофенол, ДНФ с ДОГ, ФКФ возрастает доля активных центриолей, располагающихся под углом свыше 74° к субстрату). В наших опытах с цитопластами культуры СПЭВ под воздействием уабаина большинство активных центриолей также располагается под углом, большим чем 74°. Следовательно, реакция центросомы на деполяризацию клеточной мембраны является ее автономным свойством, и не зависит от ядра.

Система микротрубочек в цитопластах и ядерных клетках

На светооптическоы уровне сеть микротрубочек в цитопластах очень похоаа на сеть микротрубочзк в ядерных клетках (Karsenti

Qt al., 1984; Pittenger, Cleveland, 1985). ТаКЗВ ИЗВвСТНО, ЧТО

ядерные и энуклеированные клетки сходным образом реагируют на вещества, деполимеризувдие микротрубочки (caroncet al., 1985). После инкубации в среде с небольшими концентрациями нокодазола (0,1-0,5 мкг/мл) разбираются, главным образом, неприкрепленные микротрубочки, а стабильными оказываются микротрубочки, связанные С центром (Karsenti et al., 1984; Tassin et al., 1985).

Исследуя полутонкие срезы лизированных клеток и цитоплас-тов культуры СПЭВ, мы обнаружили, что сеть микротрубочек вокруг центриолей во многих цитопластах гораздо гуще, чем в ядерных клетках. В то же время, при окрашивании микротрубочек обеих культур антителами к тубулину большой разницы мезду густотой всей сети микротрубочек в ядерных клетках и цитопластах не вид-

но. Микротрубочки, изгибаясь, идут в разных направлениях, равномерно заполняя всв цитоплазму, при этом в некоторых клетках можно четко идентифицировать район центросомы. В цитопластах через 15-16 часов после энуклеации сеть микрогрубочек часто наиболее густая в центральной области цитопласта, и район центросомы в этом случае не выявляется. Так как некоторое увеличение числа микротрубочек в цитопластах все-таки наблюдалось нами при исследовании полутонких срезов, то мы решили поставить опыт с нокодазолом (0,3 мкг/мл, I час). При данных условиях, как известно (тазз1п et а1., 1985), разбираются микротрубочки, не прикрепленные к центрам схождения. В результате данного воздействия от центросомы в цитопластах отходит гораздо больше микротрубочек, чем от центросомы в ядерных клетках. Микротрубочки в цитопластах были намного длиннее, чем в ядерных клетках. Это может быть следствием двух причин: либо прикрепленных к центросоме микротрубочек в цитопластах больше, либо эти микротрубочка более стабильны.

Для выяснения этого вопроса мы поставили второй опыт: клетки и цитопласты (ранние и суточные) проинкубировали в присутствии нокодазола (5 мкг/мл) в течение 30 мин., I; 1,5; 2 и 3 часов для культуры СПЭВ и в течение 30 мин., I; 1,5 и 2 часов для ь-фибробластов. Через 30 мин. воздействия нокодазола в ь-клетках и цитопластах микротрубочек примерно столько не, сколько в контроле; в цитопластах, полученных из клеток СПЭВ, при этих условиях микротрубочек меньше, чем в контроле, но гораздо больше, чем в ядерных клетках. Через Г час после инкубации с нокодазолом в цитопластах, полученных из обеих культур, оставалось намного больше микротрубочек, чем в ядерных клетках; через 1,5 часа в 90% ядерных клеток микротрубочки были почти полностью разобраны, в то время как в цитопластах микротрубочки еще были хорошо различимы. Через 2 часа воздействия нокодазола ¡микротрубочки в ядерных клетках не выявлялись, тогда как в цитопластах присутствовала доволйю густая сеть микротрубочек, и даже через 3 часа в цитопластах, которые были получены из клеток СПЭВ, микротрубочки еще сохранялись. Интересно отметить, что в цитопластах, полученных из обеих культур, при окраске антителами к тубулину сеть микротрубочек представляет собой

либо звезду, либо микротрубочки равномерно распределяются по цитоплазме.

Данные, полученные в наших экспериментах, говорят о том, что в цитопластах, полученных из клеток обеих культур, имеется субпопуляция макротрубочек, устойчивых к нокодазолу, в то время, как в ядерных клетках таких микротрубочек практически нет.

Репликация центриолей

Некоторые цитопласты, полученные из клеток СПЭВ, содержали процентриоли. Так как после энуклеации в наших экспериментах прошло 13-15 часов, что составляет около половины клеточного цикла СПЭВ, то необходимо было предположить, что либо репликация произошла еще в ядерной клетке, а после энуклеации процесс роста процентрилей остановился, либо центриоли начали реплицироваться уяе после удаления ядра центрифугированием (то есть в отсутствие синтеза ДНК и РНК). Для ответа на этот вопрос были поставлены эксперименты- на штошгастах, получаемых из синхронизированных L-фиОробластов.

Метод синхронизации клеток с помощью воздействия нокодэзо-ла позволил получить до 93-94& метафззных клеток. При иммуно-флуоресцентном окрашивании синхронизированных в метафазе клеток антителами к Brdu процент окрашиваемых ядер достигал 91% через 25 часов после посадки клеток на стекло и падал до 3,5% через 31 час. (рис. I). Таким образом, в наших опытах s-фаза у синхронизированных клеток наступала через 22-23 часа после посадки на стекло. Такая задержка может бить следствием того, что синхронизированные с помощью ногсодазола (0,1 мкг/мл) клетки в наших экспериментах высаживались на стекла в довольно низкой концентрации, а это само по себе может удлинять клеточный цикл

(Но, Tucker, 1989).

Известно, что репликация центриолей в ь-клетках происходит в начале s-фазы (Rattner, Phillips, 1973; Воробьев, Ченцов, 1987). Электронная микроскопия показала, что в наших условиях первые процентриоли появляются через 17 часов после посадки митотических клеток на стекло. Через 20 часов после посадки митотических клеток на стекло в 8 из 10 клеток центриоли были

гэ

% 100 г

80 -

60 -

40 -

20 ■

0

13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33

t (час)

Рисунок I. Кинетика мечения вгеш клеток в синхронизированной культуре L-фибробластов. По оси X - время после посадки синхронизированных клеток на стекло (в часах); по оси У - % меченных клеток.

реплицированы; а через 25 часов - центриоли были реплицированны во всех клетках (10 из 10). Процентриоли имели длину 0,25 ± 0,01 мкм.

Используя эти данные, мы поставили следующий опыт: синхронизировали клетки, посадили их на стекло, через 16 ч провели энуклеацию и зафиксировали цитопласты для электронной микроскопии через I; 8; 16; 20 и 24 часа после отмывки от цитохэлазина о. Одновременно в качестве контроля фиксировали ядерные клетки через 16; 18; 20; 22; 24; 32; 36 и 40 часов после синхронизации. Результаты этого опыта приведены в таблице I.

В вдтопластах через 8, 16 и более часов после энуклеации были обнаружены процентриоли. Все процентриоли имели длину 0,20 ± 0,02 usai.

В цитопластах, которые были получены через 12 часов после посадки синхронизированных клеток и зафиксированы через 20-23 часа, процентриоли найдены не были.

Из литературных данных известно, что ингибирование синтеза

РНК ПОДаВЛЯвТ реПЛИКаЩШ ЦвНТРИОЛеЙ (De Foor, Stubblefield,

1974). Однако, в наших опытах с цитопластами, когда в результа-

Таблица I. Репликация центриолей в синхронизированных в метафазе ь-клетках и в цитопластах, которые были из них получены.

УСЛОВИЯ ОПЫТА* КОЛИЧЕСТВО ИССЛЕДОВАННЫХ КЛЕТОК ИЛИ ЦИТОПЛАСТОВ КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК ИЛИ ЦИТОПЛАСТОВ С ПРОЦЕНТ-РИОЯЯМИ

16 (I) II 0

16 (8) II 8

16 (16) 20 9

16 (20) 10 8

16 (24) 13 6

12 (20-23) 13 I

контроль (ядерные клетки)

Г6 5 0

18 9 3

20 6 3

22 7 5

24 10 7

32 24 6

36 10 5

40 10 5

*Первое число - время после посадки митотических клеток на стекло (в часах). В скобках указано время фиксации цитопластов после энуклеации (в часах).

те удаления ядра отсутствует синтез как ДНК, так и РНК, репликация центриолей все-таки происходит. Поэтому мы решили поставить опыт на ядерных ь-клетках с актиномищшом о. Для проверки активности этого антибиотика был проведен опыт по радиоавтографии с 3Н-уриданом. Интенсивность подавления синтеза РНК актино-мицином и определяли путем подсчета среднего числа зерен вос-

становленного серебра на 100 ядер. В контроле на одно ядро приходилось 233,45 4 9,61 зерен; при воздействии актиномицина о в течение I часа - 8,52 ± 0,99 зерен. Как видно из подсчетов, актиношцин о в данной концентрации подавляет синтез РНК более чем на 96Я5.

Чтобы проверить, как будет действовать актиномицин о на репликацию центриолей, ь-клетки синхронизировали в митозе, посадили на стекла и инкубировали с актиномицином о, начиная с 16 часов после посадки, в течение 4, 8 и 16-ти часов. Одновременно в качестве контроля в те же сроки фиксировали клетки, которые не инкубировали с актиномицином о.

Результаты опыта с актиномицином о приведены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние актиномицина й на образование процентриолей в синхронизированных ь-клетках.

УСЛОВИЯ КОЛИЧЕСТВО ИССЛЕДОВАННЫХ КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК С

ОПЫТА * КЛЕТОК ПРОЦЕНТРИОЛЯМИ

16 (4) II I

16 (8) 21 I

16 (16) 12 I

к 0 н т Р 0 , Л ъ

16 10 I

20 10 5

24 20 15

32 II I

*Первое число - время после посадки митотических клеток на стекло (.в часах). В скобках указано время инкубации с актиномицином о (в часах).

Как видно из таблицы' 2, ингибирование синтеза РНК в синхронизированных клетках с помощью актиномицина и подавляет репликацию центриолей почти на 1СШ, в то время как в контрольных клетках, ко тоще не инкубировали с актиномицином о, центриоли реплицируются нормально.

Интересно было бы проверить, как будут вести себя центрио-ли в цитопластах, которые получены из синхронизированных в ме-тафазе клеток, и далее проинкубированы с актиномицином о, то есть не подавляет ли актиномицин и процесс репликации центрио-лей непосредственно. Для этого мы поставили следупдий опыт: синхронизировали в митозе ь-клетки, провели энуклеацию через 16 часов после посадки метафазных клеток на стекло, и проинкубировали полученные цитопласты с актиномицином о в течение 8-и ча^ сов. Из восьми цитопластов процентриоли были найдены в шести. В ядерных клетках, которые оставались на стекле после центрифугирования, процентриоли найдены не были. В контрольных цитопластах (которые не инкубировали с актиномицином ъ), процентриоли найдены через 8 часов после фиксации (табл. 3).

В наших опытах репликация центриолей в цитопластах происходит, несмотря на очевидное отсутствие синтеза не только ДНК, но и РНК в результате удаления ядра. С другой стороны, после инкубация синхронизированных в штозе ядерных ь-клеток в акти-

Таблица 3. Влияние актшомицина о на образование процентрколей в цитопластах, полученных из синхронизированных ь-клеток.

УСЛОВИЯ КОЛИЧЕСТВО ИССЛЕДО- КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК

ОПЫТА* ВАННЫХ КЛЕТОК ИЛИ ИЛИ ЦИТОПЛАСТОВ

ЦИТОПЛАСТОВ С ПРОЦЕНТРИОЛЯМИ

16 (8) (цитопл.) 8 6

16 (8) (ЯД. КЛ.) 6 0

к о н т р 0 л ь

16 (I) (цитопл.) 12 0

16 (4) (цитопл.) 12 I

16 (8) (цитопл.) 8 7

16 (8) (ЯД. КЛ.) II 8

*Первое число - время после посадки митотических клеток на стекло (в часах). В скобках указано время инкубации цитопластов в среде с актиномицином и (в часах) после энуклеации.

номицине б (4; 8 и 16 часов) процентриоли не были обнаружены. Актиномицин и в наших оштах подавлял синтез РНК только на 96%, так что синтез 4% РНК продолжал происходить. Так как репликация центриолей наблюдалась наш в цитопластах, полученных из синхронизированных ь-клеток, где синтез всех ядерных РНК полностью отсутствует, то мошо заключить что репликация центриолей происходит в том случае, если синтез РНК в клетке либо находится на нормальном уровне, либо подавлен на 100%. Следовательно, можно предположить, что определенные РНК оказывают на процесс редупликации центриолей негативное воздействие.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов позволяют высказать предположение о негативном влиянии ядра на процесс репликации центриолей,-

Извесгао, что в цитопластах, полученных из синхронизированных в метафазе клеток китайского хомячка энуклеацией в С1-периоде, процентриоли не были обнаружены в период, соответствующий Б-фазе (Киг1уата, воПзу, 1981); а в цитопластах, полученных из синхронизированных в б-фазе клеток, рост процентрио-лей происходил с. такой же скоростью, как в ядерных клетках (киг1уата, вог1ву, 1981). В наших экспериментах, когда мы синхронизировали ь-клетки в митозе и удаляли ядро в последней четверги С1-периода (через 16 часов после посадки синхронизированных клеток на стекло), в большинстве цитопластов центриоли были реплицированы. Однако, при удалении ядра на несколько часов раньше'.(через 12 часов после синхронизации), центриоли в цитопластах найдены не были. По-видимому, это можно объяснить тем, что необходимые команда для репликации центриолей в наших экспериментах клетка получает между 12 и 16 часами. В опытах киг-1уата и Вопэу энуклеация ядерных клеток производилась 'не в конце С1-периода; а несколько раньше, следовательно, южно предположить, что необходимые для репликации центриолей сигналы из ядра еще не поступили.

Поведение промежуточных (виментиновых) филамёнтов в цитопластах и при подавлении синтеза макромолекул

При окраске цитопластов, зафиксированных через 1-2 часа

после центрифугирования, антителами к Валентину расположение промежуточных филаментов не отличалось от нормы. Тяжи филамен-тов радиально расходились от центраболее или менее равномерно заполняя всю цитоплазму; в ядерных клетках, которые оставались на стекле после центрифугирования, расположение промежуточных филаментов также не отличалось от нормального.

В цитопластах, зафиксированных через 15-16 часов после энуклеации, промежуточные £иламенты собирались в толстые жгуты (коллапсировали). Промешу точные филаменты в данном случае имели форму либо одного кольца в центре цитопласта, либо нескольких петель, расположенных по его периферии. В ядерных клетках, которые остаются на стекле после центрифугирования (15-16 часов после энуклеации), видимых изменений в системе променуточнх филаментов не происходило.

Есть данные о том, что в состав центросомы входят белки промежуточных филаментов (Schatten et al., 1987). Иногда в цитопластах, зафиксированных через 15-16 часов после энуклеации, антителами к виментину окрашивалась также центросома в виде яркой точки в центре цитопласта. Часто она округанз толстым жгутом промежуточных филаментов. Центросома при окрёске ядерных клеток антителами к виментину никогда не окрашивалась. При этом, как в 1-2 часовых, так и в I5-X6 часовых цитопластах не наблюдалось никаких изменений в сети митохондрий и микротрубочек.

Как известно, в клетках довольно многих типов сеть промежуточных филаментов по расположению в цитоплазме очень напоминает сеть микротрубочек. Например, во многих линиях культивируемых фибробластов микротрубочки и промежуточные 4иламенты ви-ментинового типа тесно ассоциированы, и в ламеллоплазме микротрубочки и промежуточные филаменты могут идти практически идентично (Geiger, Singer, 1980). в наших экспериментах при окраске ь-клеток антителами к виментину видно, что промежуточные филаменты тянутся параллельно микротрубочкам от центра клетки к периферии.

Нормальное распределение виментиновых промежуточных филаментов напрямую зависит от их взаимодействия с интерфазной сетью микротрубочек и в меньшей степени от взаимодействия с

плазматической мембраной (тгаиъ, 1985). Это говорит о том, что взаимодействие между променуточными филаментами данного типа и мшсротрубочками функционально однонацравленно: когда происходит разрушение микротрубочек, это неизбежно приводит к нарушению в организации промежуточных филаментов; с другой стороны, разрушение промежуточных филаментов не приводит к дезорганизации сети микротрубочек (Lin, Feramisco, 1981).

Коллапс промежуточных филаментов вокруг ядра происходит также после воздействия на клетки антитубулиновых реагентов или ИОНОВ ванадиевой КИСЛОТЫ (Goldman, 1971; Goldman and Knipe, 1972; Franke et al., 1978; Wang and Choppin, 1981). Также КОЛлапс можно наблюдать при воздействии некоторых веществ, которые непосредственно не влияют на микро трубочки. К ним относятся: актиномицин d, эметин, циклогексимид, пуромицин, азид натрия,

ОЛИГОМИЦИН, акриламид И т.д. (Klyrakowsky, 1988).

В цитопластах, полученных из ь-клеток, через 12 часов после энуклеации происходил коллапс промежуточных филаментов, тогда как в цитопластах, полученных из клеток СПЭВ, через 15-16 часов после центрифугирования расположение пучков промежуточных филаментов не отличалось от ядерных клеток..

Известно, что через 24 часа после энуклеации ь-клеток включение Зн-лейцина в цитопласты практически не удается выявить (Прудовский и др., 1987). Так как коллапс промежуточных филаментов начинался через 12 часов после энуклеации, то есть в "стареющих" цитопластах, а в ï-2-часовых цитопластах расположение промежуточных филаментов не отличалось от ядерных клеток, то необходимо предположить, что поддержание нормального вимен-тинового каркаса в цитоплазме осуществляется какими-то определенными белковыми факторами и со временем, прошедшем с момента энуклеации, происходило падение концентрации этих белков в цитоплазме. '

Для проверки этого предположения мы поставили опыт с цик-логексимидом на ядерных ь-клетках. Через 20 часов инкубации в циклогексимиде практически во всех клетках промежуточные фила-менты были коллапсираваны, что подтверждает предположение о существовании относительно нестабильных белков, поддерживающих сеть прожиточных филаментов. Только в случае воздействия цик-

логексимида промежуточные филаменты собирались с одной стороны ядра в виде плотной "шапочки". Это говорит о том, что в поддержании нормального расположения промежуточных филаментов в клетке принимают активное участие не только белковые факторы, но и ядро в целом, фи искусственном подавлении синтеза белка в ядерных клетках с помощью циклогексиыида в наших экспериментах коллапс наступал уже через 6 часов. Так как в энуклеированных клетках промежуточные филэыента коллапсируют, начиная с 12 часов после центрифугирования, то это не полностью подтверждает наши предположения о белковых факторах: при полном подавлении белка посредством циклогексимида коллапс наступает гораздо раньше, чем в случае цитопластов, где синтез белка падает постепенно, с течением времени (Прудовский и др., 1987).

При действии актиномицина о на ь-клетки в наших опытах коллапс промежуточных филаментов наступал также через 6 часов, следовательно, как и в случае репликации центриолей в цитоплас-тах, полученных из синхронизированных ь-клеток, некоторая часть РИС, которая остается в клетках в результате неполного подавления синтеза, оказывает на сеть промежуточных филаментов негативное воздействие: коллапс промежуточных филаментов в цито-дластах, где синтез всех РНК полностью подавлен, начинается чорэз 12 часов после энуклеации.

ВЫВОДЫ

1. Часть цитопластов, полученных из клеток СЕЭВ, не содержит центриолей, в некоторых имеется только одна центриоль -активная или неактивная. В цитопластах, полученных из ь-клеток, всегда содержится по две центриоли.

2. В результате ЗО-ти минутного воздействия уабаина почти 50Ж активных центриолей клеток и цитопластов культуры СПЭВ располагаются перпендикулярно к плоскости субстрата. Таким образом, активная центриоль способна ориентироваться по отношению к субстрату в отсутствие ядра.

3. В большинстве цитопластов обеих культур вокруг центросомы располагается больше микротрубочек, чем в ядерных клетках. Сеть микротрубочек в цитопластах не изменяется в течение 16-18 часов после энуклеации.

4. Микротрубочки в цитопластах при воздействии нокодазола разбираются гораздо медленнее, чем микротрубочки в ядерных клетках при аналогичном воздействии. Таким образом, в цитопластах отсутствуют факторы, обеспечивающие высокую чувствительность микротрубочек к деполимеризующим воздействиям.

Устойчивые к нокодазолу микротрубочки в цитопластах, полученных из культур СГОВ и ь, располагаются в виде "звезды", или свободно распределены по цитоплазме.

5. В цитопластах ь-клеток, полученных через 16 часов после синхронизации клеток в метафазе. (энуклеация в последней четверти ^-периода),происходит репликация центриолей. В цитопластах, полученных через 12 часов после синхронизации клеток в метафазе, репликация центриолей не происходит.

6. После инкубации синхронизированных в митозе ядерных клеток в актиномицине р репликации цроцентриолей не происходит. В цитопластах актиномицин о не подавляет репликацию центриолей. Таким образом, клеточное ядро оказывает негативное влияние на репликацию центриолей.

7. В стареющих цитопластах, полученных из ь-клеток, наблюдается коллапс промежуточных филаментов и появляется окрашивание центросомы могоклональными антителами к виментину. Коллапс начинается через 12 часов после энуклеации.

8. После инкубации ь-клеток в даклогексимиде или в актиномицине о также происходит коллапс промежуточных филаментов. Филаменты собираются в тонкое полукольцо или кольцо правильной формы вокруг ядра. Коллапс при этом наступает гораздо раньше, чем в цитопластах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Горгидзе Л.А., Воробьев И.А. Ультраструктура центросомы в цитошшстах и ее изменения под действием уабаина. Цитология,

1992, ТОМ 34, N 10, стр. 45-51.

Горгидзе Л.А., Воробьев И.А. Центросома в цитопластах способна к репликации в отсутствие ядра. Цитология (в печати). .

Горгидзе Л.А., Воробьев И.А. Расположение микротрубочек вокруг центросомы. - Материалы Всесоюзного совещания "Функциональная морфология клетки". (С.-Петербург, 1991г.).

L. A. Gorgidze, I. A. Vorobjev. Centrosome and microtubules in the cytoplasts of cultured cells. - Fourth European Congress of Cell Biology (Prague, Czech Republic June 26 - July 1, 1994).