Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль центросомы в динамической организации системы микротрубочек в клетке

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Алиева, Ирина Борисовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ им. А.Н. БЕЛОЗЕРСКОГО

На правах рукописи

Л о¥

АЛИЕВА ИРИНА БОРИСОВНА

¿..у -

-УДК 576.353:576.311

РОЛЬ ЦЕНТРОСОМЫ В ДИНАМИЧЕСКОИ ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В

КЛЕТКЕ.

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада.

МОСКВА - 1999 г.

Работа выполнена в лаборатории клеточной подвижности отдела электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН В.П. Скулачев) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: зав. лаб. клеточной подвижности

ГОСУДАРСТВЕННАЯ доктор биологических наук,

'ВИ6ДЙ0ТБКА И.А. Воробьев.

"Р ПО 7 - РС1

гС гь- л- ч/

77

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Онищенко Г.Е. доктор биологических наук Терских В.В. доктор медицинских наук Ровенский Ю.А.

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда, РАН.

Защита диссертации состоится « 1999 г. в 15 часов на заседании

специализированного биологического совета Д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ, Ученый совет.

С диссертацией виде научного доклада можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Диссертация виде научного доклада разослана «/$» 1999 ]

Ученый секретарь совета, кандидат биологических наук

Е.Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

К настоящему моменту в клеточной биологии сложились два взгляда на центросому. Один базируется в основном на данных, полученных на клетках культуры ткани и, в некоторой степени, на исследованиях выделенных центросом в бесклеточных системах. Согласно этому - общепризнанному -взгляду центросома является центром организации микротрубочек, и проблемы ее изучения сводятся в основном к тому, чтобы понять, каков молекулярный механизм закладки и инициации роста микротрубочек от центросомы. Второй -классический - взгляд на центросому был сформулирован Бовери (Bovery, 1887). Согласно Бовери центросома представляет собой динамический центр клетки, то есть она ответственна за полярность клетки и за все изменения ее формы. В конце прошлого века данное представление могло быть сформулировано только в самой общей форме, поскольку практически ничего не было известно о жизнедеятельности клеток - исследователи работали лишь с фиксированными препаратами и экстраполировали свои выводы на живые клетки и ткани. После введения окраски железным гематоксилином центросома оказалось одной из немногих структур, которые можно было увидеть на фиксированном препарате. Единственность центросомы сразу поставила ее

вместе с ядром над другими органеллами, число и даже существование которых

!

было в то время не слишком очевидным (Wilson, 1898, 1925).

Появление электронной микроскопии, доказавшей реальность существования мембран и универсальность распространения мембранных цитоплазматических органелл, а также мощные биохимические методы исследования клеток отодвинули центросому на второй план, и даже уникальная структура центриолей, детально описанная в середине 60-х годов после введения альдегидной фиксации (Stubblefield, Brinkley, 1967; de Harven, : j8), не смогла восстановить былого интереса к этой структуре. На тжении последних 30 лет центросомой занимаются лишь единичные оратории, изучающие центросому через призму таких проблем, как митоз, :.!ика микротрубочек, внутриклеточный транспорт. И при этом, несмотря ;оголетнюю историю изучения центросомы, ее реальное строение как на ) vrs начала настоящего исследования, так и к 100-летнему юбилею со дня тия этой структуры оставалось неясным. Резюмируя результаты

юбилейной конференции, посвященной этому событию, Стене и Вини (Stearns, Winey, 1997) вынуждены были привести весьма упрощенную схему строения центросомы, процитировав при этом классический труд Вилсона «The Cell in Development and Heredity» (Wilson, 1925): «...центросому легче описать в физиологических терминах, чем в морфологических».

Даже в ставшем классическим учебнике Альбертса с соавторами, последний раз переизданном в 1993 году, центросома изображена крайне схематично и определяется как специализированных район цитоплазмы клетки вблизи клеточного ядра, от которого растут микротрубочки, тянущиеся, не прерываясь, на периферию клетки. Структура центросомы в деталях не проработана, схематично изображена только пара центриолей, но указано, что микротрубочки растут не от самих центриолей, а от электронноплотного перицентриолярного материала, окружающего их.

Следует, однако, отметить, что в отечественной литературе существует значительно более ранняя работа Воробьева и Ченцова (1982), в которой предложена подробная схема тонкого строения клеточного центра. Согласно этой схеме в состав центросомы входит пара центриолей (материнская и дочерняя), на материнской центриоли располагаются перицентриолярные сателлиты. Все микротрубочки, подходящие к центросоме, оканчиваются в ней на следующих структурах: головках перицентриолярных сателлитов, свободных фокусах схождения микротрубочек, боковой поверхности обеих центриолей. При этом авторы полагали, что индивидуальная микротрубочка закреплена на центросоме не постоянно, а лишь во время своего роста, после чего она с некоторой вероятностью отделяется и уходит в цитоплазму, а на ее месте может начаться рост новой микротрубочки. Такую схему функционирования центросомы авторы назвали конвейерной гипотезой сборки микротрубочек и с ее помощью объясняли происхождение свободных микротрубочек в цитоплазме, вопрос о существовании которых вплоть до последних времен большинством исследователей деликатно не поднимался. На протяжении многих лет свободные микротрубочки в цитоплазме, с одной стороны, неоднократно наблюдали, а с другой стороны, факт их существования обходили молчанием и не обсуждали.

В дополнение к предложенной схеме, авторы, не проводя точных подсчетов, оценили количество связанных с центросомой микротрубочек как существенно меньшее, чем в митозе, указав, что от интерфазной центросомы отходят единичные микротрубочки. Позднее, в цикле работ 1983-1986 годов, теми же авторами в соавторстве с Гудимой было оценено количество микротрубочек, отходящих от центросомы, и их приблизительная длина (по категориям - длинные, средние и короткие микротрубочки). Однако из-за особенностей методики подсчетов - на серийных срезах - эти данные также не вполне точны, поскольку часть микротрубочек учитывалась дважды, а другие микротрубочки не учитывались совсем. Кроме того, результаты работы не позволяют ответить на вопрос - сколько микротрубочек тянется, не прерываясь, от ценросомы на периферию клетки.

Таким образом, наиболее подробная из существовавших на момент начала представляемого исследования схема не давала ответа на целый ряд закономерных вопросов, которые можно разделить на три группы.

Первая группа вопросов - взаимоотношение центросомы и микротрубочек - не представляются полностью решенными - например, в части, касающейся длины микротрубочек в интерфазной клетке. В настоящее время это особенно актуально, так как измеренные in vivo параметры динамической нестабильности плюс-конца не позволяют объяснить быстрого обновления системы длинных микротрубочек. Решение проблемы возможно, если принять одно из следующих предположений: либо микротрубочки быстро обмениваются за счет разборки с минус-конца, либо средняя длина микротрубочек значительно меньше, чем принято считать. Для проверки последнего предположения мы полностью реконструировали всю систему связанных с центросомой микротрубочек по стереоснимкам серийных электронномикроскопических срезов. Были исследованы микротрубочки в культивируемых клетках эпителия и фибробластов как вблизи клеточного центра, так и на периферии клеток, что позволило дать ответы на следующие вопросы:

1. Сколько микротрубочек связано с центросомой культивируемых клеток в норме и какова их длина?

з

2. Является ли количество связанных с центросомой микротрубочек одинаковым для клеток одной линии?

3. Является ли количество связанных с центросомой микротрубочек постоянным для клеток одной линии?

4. Существуют ли различия в количестве связанных с центросомой микротрубочек между клетками разных линии?

Вторая группа вопросов касается строения самой центросомы и вытекает из того, что схема Воробьева и Ченцова лишь в самой общей форме дает представление о структурах, входящих помимо пары центриолей в состав центросомы: на ней представлены перицентриолярные сателлиты и исчерченные корешки, а первичная ресничка не представлена совсем. Количественный анализ частоты встречаемости перечисленных компонентов не проводился, не исследовались их взаимосвязи, роль в центросоме и возможные функции, поэтому оставались открытыми такие вопросы, как:

5. Являются ли перицентриолярные сателлиты, первичная ресничка и исчерченные корешки типичными структурами центросомы культивируемых клеток?

6. Как часто и в каком количестве они присутствуют в центросоме?

7. Существуют ли взаимосвязи между структурами, входящими в состав центросомы?

Третья группа - вопрос, посвященный исследованию свойств центросомы, не связанных с полимеризацией микротрубочек. Почти два десятилетия назад впервые появились гипотезы, согласно которым функции центросомы не ограничивались ее ролью как центра организации микротрубочек (ЦОМТ) (Вогпепв, 1979; А1ЬгесШ-ВиеЫег, 1981). Основным их недостатком являлось практически полное отсутствие подтверждающих фактов. Только в 80-е годы нынешнего столетия появились работы, результаты которых описывают не связанные с полимеризацией микротрубочек свойства центросомы (Гудима и др., 1983, 1984, 1986, 1987; Воробьев и др., 1988), названные неканоническими (Воробьев, 1988). Со временем факты накапливались: было показано, что положение центросомы и ее перемещение во многих клетках закономерно и зависит от типа клетки, направления ее движения или движения потока окружающей клетку среды (ТМепеиег, всЬПуа,

4

1982; Гудима и др., 1983, 1984; Rogers, et al„ 1985; Vorobjev, Nadezhdina, 1987). В настоящее время существуют экспериментально обоснованные предположения о возможной роли центросомы как регулятора внутриклеточного транспорта (Freed, Lebowitz, 1970; Weimer et al., 1997; Григорьев и др., 1997). Поэтому, в задачу настоящего исследования входило получение и анализ новых экспериментальных данных, позволяющих в совокупности с литературными данными приблизиться к ответу на вопрос: 8. Имеет ли центросома регуляторную роль в клетке?

Таким образом, в настоящей работе сделана попытка вернуться к классическому представлению о центросоме, показать, что уже накопленные факты позволяют очертить круг явлений, в которых центросома является необходимым, ключевым органоидом.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В работе предложена новая методика реконструкции микротрубочек цитоскелета - восстановление их на основании стереоскопического анализа серийных срезов клеток, лизированных детергентом. Эта методика позволила:

1. доказать, что значительная часть (около половины) подходящих к центросоме микротрубочек не оканчивается в ней на каких-либо электронноплотных структурах (стенке цилиндра центриоли или головке перицентриолярного сателлита), а имеет свободный проксимальный конец;

2. подсчитать количество микротрубочек, отходящих от центросомы в культивируемых клетках различных линий;

3. измерить длины всех микротрубочек, отходящих от центросомы, и вычислить их среднюю длину для клеток эпителиев и фибробластов;

4. показать, что большинство радиально расходящихся от центросомы микротрубочек короткие, они не доходят до периферии клеток и формирование периферической системы мшсротрубочек, по-видимому, не связано с избирательным заякориванием некоторых из них на центросоме;

5. показать, что система микротрубочек, связанных с центросомой, лабильна -количество микротрубочек, расходящихся от центросомы, и их длина изменяются при воздействии как веществ, влияющих непосредственно на микротрубочки (таксол и нокодазол), так и веществ, нарушающих общеклеточный метаболизм (ингибиторы энергетического обмена);

6. доказать, что в цитоплазме клеток существуют микротрубочки, не связанные с центросомой и не направленные к ней, оба конца которых свободны -такие микротрубочки располагаются во всем объеме цитоплазмы и составляют более 90% от общей массы микротрубочек в клетке; их длина существенно превышает дайну микротрубочек, расположенных вокруг центросомы.

В работе впервые показано, что ориентация центриолей по отношению к плоскости субстрата, характерная для клеток культуры ткани в норме, изменяется при действии различных ингибиторов энергетического обмена. Возникновение упорядоченной, преимущественно перпендикулярной ориентации активной центриоли не зависит от уровня АТФ в клетке, а обусловлено только деполяризацией плазматической мембраны. Эти изменения происходят достаточно быстро, через 10 мин после начала воздействия, и сохраняются продолжительное время. Разрушение микротрубочек и микрофиламентов не препятствует возникновению преимущественно перпендикулярной ориентации активной центриоли.

Получены экспериментальные подтверждения возможной регуляторной роли центросомы в клетках: инактивация центросомы как ЦОМТ в К-митозе приводит к возникновению многополюсных митозов после снятия митостатического воздействия. Один из полюсов в таких ана- и телофазных клетках лишен центриолей, он способен обеспечить расхождение хромосом, но не правильную цитотомию - таким образом, в митозе центросома определяет не только формирование веретена деления, но и нормальное протекание его последующих событий.

В ходе выполнения работы были получены кроличьи поликлональные антитела против С-концевого фрагмента человеческого у-тубулина. Афинно очищенные антитела позволили провести количественную оценку содержания данного белка в центросоме. С их помощью было показано, что количество у-тубулина на центросоме непостоянно (возрастает во время профазы, достигая максимума в метафазе, и снижается в ана- и телофазе).

Подробный морфологический и статистический анализ структур, входящих в состав центросомы, позволил заключить следующее:

б

1. перицентриолярные сателлиты ответственны за полимеризацию микротрубочек, расходящихся от центросомы (основная масса микротрубочек отходит от головок перицентриолярных сателлитов, а не от стенки центриолярного цилиндра). Число сателлитов на одну центриоль в норме варьирует незначительно, однако может значительно возрастать в ходе экспериментальных воздействий, что всегда сопровождается возрастанием количества микротрубочек, расходящихся от центросомы;

2. первичная ресничка - компонент, присутствующий в центросоме большинства интерфазных клеток. Количество ресничек колеблется - от 1/4 до 1/3 исследованных клеток имели первичную ресничку, однако ее могло не быть ни в одной клетке (культура клеток НеЬа). По окончании митоза центросома никогда не содержит ресничку (ни в одной клетке из пары дочерних). Первые реснички появляются через 1 ч после перехода клеток в интерфазу и их количество возрастает в ходе дальнейшего культивирования, достигая среднего уровня для несинхронной популяции через 4 ч;

3. исчерченные корешки встречаются у 25-30% клеток в популяции, в среднем 1-2 корешка на центросому. Они могут быть обращены как к активной (материнской), так и к неактивной (дочерней) центриолям. Очень редко они встречаются у обеих центриолей одновременно. Наличие исчерченных корешков не коррелирует с присутствием в центросоме первичной реснички: встречаются центросомы с первичной ресничкой, но без исчерченных корешков, и наоборот, с исчерченными корешками, но без первичной реснички.

Таким образом, в работе получены фундаментальные ультраструктурные характеристики центросомы, показана ее пластичность в ответ на различные внешние воздействия, обосновано представление о центросоме, как о регуляторной структуре, обеспечивающей как нормальное строение микротубулярной сети в интерфазе, так и нормальное протекание фаз митоза.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Работа относится к числу фундаментальных научных исследований. Полученные в ней систематические данные позволяют расширить наши познания о центросоме и конкретизировать представления о ее роли в

жизнедеятельности клетки и динамической организации системы микротрубочек.

Техника трехмерной реконструкции позволяет �