Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль динеин-динактинового комплекса в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль динеин-динактинового комплекса в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках"

На правах рукописи

ЖАППАРОВА ОЛЬГА НАИЛЕВНА

РОЛЬ ДИНЕИН-ДИНАКТИНОВОГО КОМПЛЕКСА В ОРГАНИЗАЦИИ СИСТЕМЫ МИКРОТРУБОЧЕК В ИНТЕРФАЗНЫХ КЛЕТКАХ

03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

□ □34460137

003446997

Работа выполнена на кафедре молекулярной биологии биологического факультета Московски о государственного университет имени М В Ломоносова и в Институте беяка РАН, Пушнно Московской области

Научные руководители-

доктор биологических наук Надеждина Елена Сергеевна,

кандидат биологических наук Шанина Нина Александровна,

Официальные оппонешьг

доктор биоюгических наук, профессор

Зацепина Ольга Владимировна,

доктор био loi ических наук, профессор

Ширинский Вчадимир Павлович

Ведущая организация' Институт биологии гена РАН

Защита диссертации состоится 17 октября 2008 т в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 501 001 76 по защите кандидатских и докторских диссертаций при Московском гос} дарственном университете им MB Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ НИИ физико-химической биологии имени А H Беюзерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московскою юсударствеиного университета имени М В Ломоносова

Авгорефсрл разослан «_» сентября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, S*?1

кандидат биоло! ических наук 'у \ Крашенинников И А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками (МТ), актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток

Интерфазные микротрубочки, как правило, организованы в радиальную систему к периферии клетки они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома На центросоме начинается рост микротрубочек и заякориваются их «минус»-концы Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков -специализированных механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам динеинам и кинезинам Динеины перемещаются по направлению к «минус»-концу микротрубочек, а кинезины - к «плюс»-концу Таким образом, радиальная организация микротрубочек обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта

Регуляция активного внутриклеточного транспорта чрезвычайно важна для поддержания жизнеспособности клетки и организма в целом Однако регуляция работы моторных белков изучена недостаточно Считается, что основным регулятором активности динеина является динактин Динактиновый комплекс осуществляет связь динеина с перевозимым грузом и, кроме того, обеспечивает процессивность мотора за счет одной из своих субъединиц - р150О1ш:<1 Белок р150с|ие() взаимодействует одновременно с тубулином и с промежуточной цепью динеина, помогая удерживать моторный комплекс на микротрубочке Это должно быть особенно важно при транспорте на протяженные расстояния, например, в случае ретроградного транспорта в аксонах Однако до сих пор не было получено данных об особенностях регуляции работы динеин-динактинового комплекса в нервных клетках

Наряду с обеспечением внутриклеточного транспорта, динеин-динактиновый комплекс, вероятно, участвует и в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках и во время митоза Динеин и динактин концентрируются на центросоме интерфазных клеток и в полюсах веретена митотического деления, а ингибирование динеина и разрушение динактинового комплекса приводят к хаотизации системы микротрубочек и дезорганизации полюсов веретена деления Однако роль динеин-динактинового комплекса в организации микротрубочек пока исследована недостаточно В частности, не ясно, в каком же из двух процессов нуклеации микротрубочек или их заякоривании на центросоме принимает участие динеин-динактиновый комплекс

Организация микротрубочек в клетках зависит от активности центросомы, а регуляция последней может осуществляться с помощью обратимого фосфорилирования белков перицентриолярного материала К немногим известным протеинкиназам, регулирующим работу центросомы, относится киназа LOSK (LOng Ste20-hke Kinase), ассоциированная с микротрубочками По предварительным данным (Бураков и др, 2005), ингибирование ее активности вызывает хаотизацию системы микротрубочек, однако ни субстрат, ни сигнальные каскады, через которые LOSK может участвовать в этом процессе, не были до сих пор идентифицированы

Полученные нами результаты проясняют некоторые особенности взаимодействия динактина с микротрубочками в зависимости от типа тканей, а также предоставляют новые данные о механизме регуляции системы микротрубочек протеинкиназой LOSK и об ее участии в других внутриклеточных процессах, в частности, в поляризации клеток

Цель и задачи исследования.

Целями работы было установление роли динактина и протеинкиназы LOSK в формировании радиальной системы микротрубочек в культивируемых клетках животных и изучение структурных и функциональных отличий двух изоформ субъединицы динактинового комплекса - белка pl50GIued

Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи

1) Определить, влияет ли ингибирование динеин-динактинового комплекса на нуклеацию микротрубочек или на их заякоривание на центросоме in vivo и in vitro

2) Подавить экспрессию протеинкиназы LOSK методом РНК-интерференции и определить, сохраняет ли система микротрубочек радиальное строение в отсутствие этого белка

3) Идентифицировать сайт фосфорилирования для протеинкиназы LOSK в белке pl50Glued

4) Проверить, влияет ли фосфорилирование протеинкиназой LOSK на взаимодействие pl50olued с микротрубочками т vitro и на радиальное расположение микротрубочек в клетках

5) Сравнить степень сродства двух изоформ pl50Glued к микротрубочкам т vivo при экспрессии в клетках и м vitro при соосаждении с микротрубочками

6) Исследовать тканеспецифичность экспрессии и соотношение изоформ р150О1им1 в различных тканях методом RT-PCR

7) Получить поликлональные антитела, специфически узнающие изоформу pl50olucd-lA Изучить тканеспецифичность экспрессии изоформ pl50olued методом иммуноблоттинга

9) Определить локализацию изоформы pl50olued-lA в культивируемых клетках с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания специфическими поликлональными антителами

Основные положения, выносимые на защиту.

Научная новизна работы.

В работе впервые показано, что ингибирование динактнн-динеинового взаимодействия не влияет на нуклеацию микротрубочек на центросоме животных клеток in vivo и ¡n vitro, хотя приводит к нарушению радиального расположения микротрубочек Впервые изучено влияние на клетки нокдауна протеинкиназы LOSK и показано, что подавление экспрессии киназы приводит к нарушению радиальной организации микротрубочек, истощению центросомного пула динактина и в дальнейшем к гибели клеток Впервые идентифицирован сайт фосфорилирования динактина протеинкиназой LOSK и показано, что это фосфорилирование уменьшает сродство белка к микротрубочкам Впервые продемонстрировано, что мутантная форма pl50Glucd, имитирующая фосфорилирование протеинкиназой LOSK, обращает эффект хаотизации интерфазных микротрубочек, вызванный ингибированием этой киназы Впервые выявлены две изоформы динактина-1 (pl50Glued), одна из которых (pl50clucd-lB) лишена 20 а о в N-концевой части молекулы, и продемонстрировано, что длинная изоформа pl50GI°l;d-]A имеет существенно большее сродство к МТ, чем pl50Glued-lB Впервые показано, что изоформа pl50Glued-lA специфично экспрессируется в нервных тканях, а также в культивируемых клетках, вышедших из контактного торможения, в то время как изоформа pl50G1"cd-lB представлена повсеместно

Теоретическое и практическое значение работы.

В работе достигнут значительный прогресс в понимании регуляции системы интерфазных микротрубочек в животных клетках Впервые выявлены особенности динеин-динактиновой системы в клетках различного тканевого происхождения Оказалось, что существует изоформа динактина pl50Glued-lA, минорная для культивируемых фибробластоподобных и эпителиоподобных клеток и мажорная для нервных клеток, которая прочно связывается с микротрубочками и может обеспечивать особые пути ретроградного транспорта или же опосредовать связь микротрубочек с плазмалеммой В конфлюэнтных культурах и в не-нервных тканях организма эта изоформа отсутствует, в них синтезируется изоформа pl50Glued-lB, имеющая слабое сродство к микротрубочкам Вероятно, найден новый путь клеточной регуляции - смена изоформ динактина-1, вовлеченная в регуляцию локомоции клеток по субстрату и рост клеточных отростков, в том числе нейритов В работе показано, что фосфорилирование изоформы pl50°lued-lA протеинкиназой LOSK необходимо для формирования радиальной системы микротрубочек в интерфазе, т е найден новый путь передачи регуляторного сигнала в клетке, приводящий к морфогенетическим перестройкам Результаты работы открывают новые возможности для исследования механизмов перемещения клеток по субстрату и роста отростков нервных клеток Следует в дальнейшем обратить внимание на протеинкиназу LOSK как на

возможную мишень фармакологических препаратов, направленных на лечение онкозаболеваний, особенно в плане предотвращения метастазирования, а также, возможно, нейродегенеративных заболеваний Также представляется перспективным исследование изоформы pl50Glued-lA динактина-1 как возможного маркера тканевых повреждений и пролиферативных процессов в организме или маркера нейродифференцировки Материалы диссертации могут быть также использованы в учебных лекционных курсах по молекулярной и клеточной биологии Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах группы клеточной биологии Института белка РАН, кафедры молекулярной биологии МГУ им М В Ломоносова, лаборатории цитоскелета НИИ физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ, а также на ежегодных научных конференциях Института белка РАН Материалы работы докладывались на конференциях

- 45th and 47th ASCB Annual Meetings, 2005 and 2007

- ASCB/ECF summer meeting «Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems», 2007

- Международные симпозиумы «Биологическая подвижность фундаментальные исследования и практика», Пущино, 2006 и 2008

- Международная конференция «Структура, функция и биосинтез белка», Пущино, 2007

- II съезд Российского общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 2007

- IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008 Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 статьи, сделано 4 устных доклада, 2 стендовых сообщения на всероссийских конференциях и 3 стендовых сообщения на международных конференциях

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа написана по обычному плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярное клонирование

Для трансфекции культивируемых клеток использовали ДНК-конструкты на основе векторов pEGFP-Cl, pEGFP-C2 и dsRed-Cl (Clontech), для экспрессии белков в Е coli - на основе pGEX4T-l и pGEX4T-3 (GE Healthcare) Для РНК-интерференции использовали вектор pG-Shin2, любезно предоставленный Ш Кожима (США) Встройки для РНК-интерференции LOSK

конструировали, согласно рекомендациям производителя специфические 19-нуклеотидные последовательности были комплементарны 278-297 нт (5'- gcttctagatgccttctat - 3') и 3202-3221 нт (5'- agagcaagactgcccaaga -3') кодирующей последовательности LOSK (конструкты pG-Shtn2-4 1 и pG-Shin2-6 1 соответственно)

Все реакции молекулярного клонирования проводили, используя реактивы фирмы Fermentas, для сайт-направленного мутагенеза использовали набор реактивов QuickChange И Site-directed Mutagenesis Kit (Stratagene) Праймеры были синтезированы фирмой Синтол Для выделения плазмидной ДНК и экстракции ДНК из агарозного геля (Biorad) использовали наборы реактивов фирмы Qiagen RT-PCR

Тотальная РНК из образцов органов человека (спинального ганглия, тригеминального ганглия, мозжечка, гиппокампа, легких, почек, печени, селезенки, лимфатического узла) была любезно предоставлена Л Дергуновой (Институт молекулярной генетики РАН) Тотальную РНК из органов мыши (больших полушарий мозга, ствола, мозжечка, легких, печени, почек, сердца, селезенки, диафрагмы) и клеточных культур (HeLa, Vero, первичных и трансформированных мышиных фибробластов) выделяли набором реактивов RNeasy kit (Qiagen) кДНК синтезировали с помощью First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) или с обратной транскриптазой SuperScript II (Invitrogen), в обоих случаях используя случайные гексануклеотидные праймеры кДНК изоформы pl50°'ued-lA амплифицировали, используя следующие праймеры Izo-for (forward) 5' -atg agt gcg gag gca age gee - 3' и Izo-var (reverse) 5' - ctt ggg teg ccg agt tgt ggt - 3' Для амплификации изоформы pl50Glued-lB использовали Izo-for (forward) и Izo-short (reverse) 5' - tgg gcg cgt ggg cag ttt gca g - 3' В качестве контроля амплифицировали GAPDH (GAPDH-for 5' -ttagcacccctggccaagg - 3' и GAPDH-rev 5' - cttactccttggaggccatg - 3') или ß-актин (Act-for 5' - gaa gat caa gat cat tgc tcc tcc - 3' и Act-rev 5' - ctg gtc tea agt cag tgt аса gg - 3') ПЦР проводили с помощью набора реагентов GenePak PCR Core (Изоген)

Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг Образцы тканей механически гомогенизировали в 2-4-кратном избытке 4-кратного SB и прогревали при 100°С в течение 6 мин Клеточные культуры, растущие на чашках Петри, дважды промывали PBS, затем кратко водой и гомогенизировали в подходящем объеме 2-кратного SB Электрофорез проводили в 7,5%, 10%, 12%, 15% или в градиентном 6-12% ПААГ в денатурирующих условиях (Laemmh, 1970) Полусухой перенос проводили как описано Kyhse-Andersen (1984) Нитроцеллюлозную мембрану блокировали растворами 3% бычьего сывороточного альбумина, 5% обезжиренного сухого молока или 0,1% желатина Вторичные антитела были конъюгированы с пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch) или с щелочной

фосфатазой (KPL) Для проявки использовали 3, З'-диаминобензидин/ЬЬОг или BCIP/NBT(KLP), соответственно

Экспрессия в бактериях и аффинная очистка

Для работы с векторами pGEX использовали штамм Е coli BL21-3DE Индукцию проводили 50 мМ IPTG 4 часа при комнатной температуре Аффинную очистку на глутатион-агарозе (Sigma) проводили согласно рекомендациям производителя Очищенные белки диализовали в соответствующем буфере в течение ночи с двукратной сменой раствора Соосаждение белков с микротрубочками

Тубулин выделяли из мозга крыс (Castoldi and Popov, 2003) Для сборки микротрубочек 6 мг/мл тубулина в BRB80 (80mM PIPES pH 6 8, 1тМ MgCl2, lmM EGTA), lmM GTP (Sigma) инкубировали 20 мин при 37°C, затем добавляли 2 мкМ паклитакселя (Sigma), инкубировали при 37°С еще 15 мин, затем добавляли паклитаксель до конечной концентрации 20мкМ, инкубировали при 37°С еще 15 мин Качество полученных микротрубочек проверяли микроскопией дифференционного интерференционного контраста Затем 1 мг/мл микротрубочек, I mMGTPh 15 мМ паклитакселя инкубировали с рекомбинантными очищенными фрагментами динактина в разных концентрациях 30 мин при 37°С Затем смесь наслаивали на теплую глицериновую подушку (4 М глицерин, 1 мМ GTP, 5 мкМ паклитакселя на BRB80 буфере) и центрифугировали в роторе TLS55 (Beckman) при 50 ООО об/мин, 25°С 30 мин Супернатанты собирали, трижды промывали подушку водой, отбирали подушку и ресуспендировали осадки (обычно невидимые) в равном объеме 2-кратного SB Антитела

В работе были использованы следующие первичные антитела поликлональные кроличьи антитела к LOSK pol3D2 (Зиновкина и др, 1997, ¡998), маннозидазе II (аЫ2277, Abeam), у-тубулину (любезно предоставленные Р Узбековым), моноклональные мышиные антитела к а-тубулину DM-1A (Т9026, Sigma), динамитину р50 (BD Transduction Laboratories), pl50Glued (BD Transduction Laboratories), промежуточной цепи цитоплазматического динеина DIC (741, Со vanee), ß-актину (А-5441, Sigma), перицентрину (BD Transduction Laboratories), GFP (Унифект-груп), фосфотреонину (Zymed), моноклональные крысиные антитела к а -тубулину (ab6161, Abeam) В качестве вторичных антител использовали козьи или ослиные антитела к иммуноглобулинам мыши, кролика или крысы, конъюгированные с FITC, TRITC, Су5, пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch), с щелочной фосфатазой (KPL)

Для получения антител к изоформе pl50GI°ed-lA кролика иммунизировали синтезированным в Е coli и аффинно очищенным белком, состоявшим из глютатион-S-трансферазы, слитой с фрагментом 131-151 pl50Glued Иммунизацию проводили по стандартной

схеме первичная иммунизация с полным адъювантом Фрейнда, подхлест с неполным адъювантом и два подхлеста без адъюванта На каждое введение брали по 300-1000 мкг антигена

Культивирование клеток и иммунофлуоресцентное окрашивание

Клеточные культуры Vero (эпителий почки зеленой мартышки) и HeLa (карцинома шейки матки человека) и первичные культуры мышиных или крысиных эмбриональных фибробластов, полученные по стандартной методике, выращивали при температуре 37°С, содержании углекислого газа 5%, на среде, состоящей из 50% DMEM и 50% F12 (Панэко) с добавлением 7,5% эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко) и 80 мкг/мл гентамицина (Sigma)

Для липосомной трансфекции клеток использовали Lipofectamine™2000 (Invitrogen) или TransIT®-LTl (Mirus) согласно рекомендациям производителя Результаты трансфекции наблюдали через 24 ч

Клетки фиксировали абсолютным метанолом при -20° 5 мин, затем переносили в 3% параформальдегид при +4° на 15 мин, или фиксировали 3% параформальдегидом при комнатной температуре 15 мин, а затем инкубировали в 0,1% Tnton Х-100 5 мин, или использовали 0,5% глутаровый альдегид 15 мин при комнатной температуре с последующей отмывкой 0,5% боргидридом натрия 2 раза по 15 мин Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили по стандартной схеме Отбор клеток по флуоресценции GFP проводили на клеточном сортере FACSVantage SE system (BD Biosciences)

Микроскопия

Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания наблюдали, используя микроскоп Carl Zeiss Axiophot, снабженный 12-битной 1 MHz CCD MicroMax камерой (Roper Scientific) и программным обеспечением WinView 32 software (Princeton Instruments) Также использовали инвертированный микроскоп Carl Zeiss Axiovert 200M, снабженный 12-битной камерой AxioCamHR и программным обеспечением Axiovision (Carl Zeiss) Интенсивность флуоресценции на 12-16-битных изображениях обсчитывали с помощью программы Scionlmage software (Scion Corporation)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Радиальная система микротрубочек в клетках формируется в результате двух процессов нуклеации микротрубочек и их последующего заякоривания на центросоме или на расположенных в непосредственной близости к ней органеллах (например, на аппарате Гольджи) Образование затравок для роста МТ происходит на кольцевых комплексах гамма-тубулина, а в удержании МТ принимают участие несколько белков - PCM-1 (Dammermartn et al, 2006), Сер 13 5 {Uetake et al„ 2004), найнеин (Delgehir et al, 2005), CAP350 и FOP (Yan et al, 2006) У

заякоренных микротрубочек минус-конец защищен от деполимеризации, что позволяет удерживать растущие МТ в виде звезды в перицентриолярной области.

Известна способность цитоплазматического динеина нуклеировать и стабилизировать микротрубочки в опытах in vitro (Malikov et al., 2004). Также существуют данные об участии динеина в не зависящей от центросомы самоорганизации системы микротрубочек в меланофорах рыб (Rodionov, Borisy, 1997; Vorobjev et al., 2001) и в доставке на центросому y-TuRC (Young et al., 2000) и найнеина (Delgehir el al, 2005; Casenghi et al., 2005). Исходя из этого, можно предположить участие динеина как в нуклеации, так и в удержании микротрубочек на центросоме или в координации работы нуклеирующих и удерживающих комплексов центросомы.

Для изучения роли динеина в организации микротрубочек можно ингибировать его активность моноклональными антителами 74.1 к промежуточной цепи (dynein intermediate chain (DIC)) (Dillman et al., 1994), а также разобщением с его кофактором динактином.

Динактин - сложный белковый комплекс, в состав которого входит крупный (150 кДа) белок pl50°'"ed. На N-конце pl50°'"ed расположен МТ-связывающий участок, состоящий из глобулярного CAP-Gly (38-114 а.о.) и основного BMBD (Basic MT-Binding Domain) домена (1 ISMS а.о.), богатого положительно заряженными аминокислотами и имеющего неопределенную вторичную структуру. Далее следует протяженная фибриллярная часть, включающая в себя два суперскрученных участка-СС1 (217-548 а.о.) и СС2 (925-1050 а.о.) (Рис. 1).

СС1 (217-548) p150-ô-head (151-1317)

СС1

СС2

217

548

926 1049

1340

CAP-Gly (38-110) BMBD (115-145)

Вариабельный участок (131-151)

38

110 115

145 15?

131

Рис. 1. Схема строения pl50Glucd. Связывающий микротрубочки участок (38-145 а.о.) состоит из двух доменов: CAP-Gly (Cytoskeleton-Associated Protein Gly-Rich) и обогащенного положительно заряженными аминокислотами BMBD. Далее следуют два участка со структурой скрученной спирали CCI и СС2 (Coiled-Coil-1 и Coiled-Coil-2). Вариабельный для изоформ pl50Glucd-lA и pl50ol"ed-lB участок расположен между 131 и 151 а.о.

Взаимодействие pl50Glucd с динеином осуществляется в области 200-811 а о, а основная часть взаимодействий приходится на район CCI (Coiled Coil-1) (217-548 а о) С фрагментом pl50GIuc<f-CCl взаимодействует iV-концевой участок DIC с 1 по 123 а о (Karki et al, 1995) Избыток pl50Glucd-CCl приводит к ингибированию активности динеина, вероятно, за счет разобщения последнего с динактином (Karkt et al, ¡995, Kmg et al, 2003)

Ингибирование динеина, вызванное разобщениел! с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.

Для изучения роли динеин-динактинового комплекса в организации микротрубочек мы клонировали кДНК фрагмента pl50Glucd - CCI, слитого с GFP для экспрессии в клетках млекопитающих и слитого с GST для экспрессии в бактериях

Ингибирование динеина при действии CCI в наших экспериментах подтверждалось нарушением динеин-зависимого внутриклеточного транспорта Так, инъекция аффинно очищенного белка CCI, слитого с GST, в меланоциты тернеции вызывала нарушение агрегации пигментных гранул, которая в норме развивается в ответ на добавление адреналина и является хорошо изученным динеин-зависимым процессом А при экспрессии GFP-CC1 в культивируемых клетках Vero происходило диспергирование элементов аппарата Гольджи, обычно собранных в компактную структуру в околоядерной области, благодаря работе динеина

Экспрессия GFP-CC1 приводила к нарушению радиальной организации микротрубочек в клетках HeLa и Vero в 80% клеток микротрубочки начинали располагаться хаотично, в то время как в контроле таких клеток было не более 20% При этом общее число микротрубочек в клетке оставалось постоянным Аналогичные результаты были получены ранее другими авторами (Qumtyne et al, 1999) Однако механизм хаотизации микротрубочек до сих пор оставался неясным

Чтобы выяснить, нуклеация или заякоривание микротрубочек на центросоме нарушается при экспрессии CCI, мы наблюдали за нуклеацией МТ после их экспериментальной разборки Для этого клетки Vero обрабатывали нокодазолом до полной разборки микротрубочек, затем помещали в среду без нокодазола, фиксировали через определенные промежутки времени и окрашивали антителами к тубулину Через 3 мин после начала отмывки во всех клетках, контрольных или экспрессирующих GFP-CC1, формировались звезды из коротких микротрубочек, расходящихся из района центросомы Через 10 мин эти звезды сохранялись, но микротрубочки в них удлинялись и достигали края клеток Через 60 мин отмывки проявлялась специфика клеток, экспрессирующих GFP-CC1, - в них система микротрубочек становилась

хаотичной, тогда как в контрольных микротрубочки оставались радиальными (Рис. 2, А). Таким образом, мы обнаружили, что при экспрессии в клетках CCI центросома сохраняет способность нуклеировать микротрубочки, но не может удерживать их в виде звезды длительное время.

Для подтверждения того, что центросома сохраняла нуклеирующую активность, мы провели сборку МТ на центросомах in vitro. Для этого разбирали нокодазолом микротрубочки в клетках Vero, затем обрабатывали клетки Тритоном Х-100, удаляя растворимые цитоплазматические белки, после чего инкубировали клеточные «тени» с выделенным из мозга крыс тубулином (Рис. 2, Б). В результате на центросомах формировались звезды микротрубочек, визуализированные по иммунофлуоресцентному окрашиванию антителами к тубулину (Рис. 2, В).

А :-;Г Ш-... .. 3' •Д ■ *р;ч 4 /' s у - $ 10'

Б ......."\Triton Х-10р-"+тубулин

В -тубулин »." ... - . ■" :'.■■< +тубулин '.'V Ш ' Щйр 1 *ту бу л и н • V"-

Рис. 2. Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, нарушает заякоривание микротрубочек на центросоме. А - Восстановление микротрубочек после их разборки нокодазолом в клетках Vero. Клетки, экспрессирующие GFP-CC1, отмечены черными стрелками; контрольные нетрансфицированные клетки - белыми стрелками. 3', 10', 60' - время после отмывки клеток от нокодазола. Б - Схема эксперимента по сборке микротрубочек на центросомах in vitro: в клетках Vero разбирали микротрубочки нокодазолом, затем обрабатывали Тритоном Х-100 и инкубировали полученные «тени» с очищенным тубулином. В - Сборка микротрубочек на центросомах клеточных «теней» in vitro. Клеточные «тени» без тубулина (слева), после инкубации с тубулином (в центре) и после инкубации с тубулином в присутствии CCI (справа).

После предварительной инкубации «теней» с GST-CC1 звезда микротрубочек, отходящая от центросомы, наблюдалась в 79% клеток по сравнению с контролем, и количество микротрубочек в звездах было уменьшено примерно на 20% Такое же незначительное уменьшение нуклеирующей активности центросомы наблюдалось и при инкубации «теней» с ингибирующими динеин антителами 74 1 При этом центросома клеточных «теней» содержала как динеин, так и динактин, что было подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием

Вероятно, существенную, основную роль в нуклеации микротрубочек на центросоме динеин-динактиновый комплекс не играет, несмотря на способность динеина к нуклеации микротрубочек т vitro (Mahkov et a1, 2004) Хаотизация микротрубочек в клетках при подавлении динеин-динактиновых взаимодействий связана с ингибированием удержания микротрубочек на центросоме Это ингибирование, возможно, происходит из-за нарушения динеин-зависимой доставки в центросому заякоривающих белков (Young et а!, 2000, Quintyne et al, 2002, Fumoto et al, 2006) Она также может быть связана и с диспергированием аппарата Гольджи, который может принимать участие в организации микротрубочек в клетках (Бураков, Надеждина, 2006) Возможно также, что динеин-динактиновый комплекс участвует в «передаче» микротрубочек с нуклеирующих на заякоривающие белковые комплексы или непосредственно участвует в заякоривании

Ингибирование протеинкииазы LOSK приводит к хаотизации системы микротрубочек, уменьшению содержания динактина на центросоме и нарушению поляризации аппарата Гольджи на краю раны в монослое

В последнее время были обнаружены протеинкииазы, участвующие в регуляции нуклеации и удержания микротрубочек на центросоме Так, протеинкиназа Nek7 регулирует взаимодействие комплексов гамма-тубулина с центросомой в интерфазе (Kim el al, 2007) и в митозе (Abe et al, 2006) GSK-Зр контролирует динеин-зависимую доставку найнеина -центросомного белка, участвующего в заякоривании микротрубочек (Fumoto et al, 2006) А работа протеинкииазы Aurora А обеспечивает заякоривание микротрубочек на центросоме во время митоза (Barros et al, 2005)

Одной из киназ, участвующих в организации МТ, является ассоциированная с микротрубочками Ser/Thr протеинкиназа LOSK (LOng Ste20-like Kinase) Ранее в нашей лаборатории было показано, что ее ингибирование вызывает нарушение радиальной организации микротрубочек Данные были получены при экспрессии доминантно-негативного конструкта киназы (Kimut) (Бураков и др, 2005), а в настоящей работе мы подтвердили наблюдаемый эффект

методом РНК-интерференции, позволяющим практически полностью элиминировать изучаемый белок из клеток.

Клетки Vero трансфицировали вектором pG-Shin2, несущим встройку, комплементарную участку мРНК протеинкиназы LOSK. Короткие шпилечные РНК, транскрибирующиеся с вектора, на 8-9 день вызывали уменьшение количества белка в клетках, наблюдаемое по иммунофлуоресцентному окрашиванию антителами. Также элиминация LOSK была подтверждена Вестерн-блоттингом трансфицированных клеток, которые предварительно отбирали на цитосортере по флуоресценции GFP, закодированном в векторе pG-Shin2 (Рис. 3, А).

Рис. 3. Ингибирование нротеинкиназы LOSK приводит к нарушению радиальной организации микротрубочек в клетках Vero. А - Уменьшение количества LOSK при РНК-интерференции на 8 день после трансфекции конструктом pG-Shm2-4.1 (4.1): иммуноблоггинг лизатов клеток Vero, отобраных на цитосортере по флуоресценции GFP, окрашенный антителами к LOSK и р-актину. Б - Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к киназе LOSK и к тубулину. В - Количество клеток (%) с радиальной системой микротрубочек в контроле (в клетках, трансфицированных pG-Shin2), при экспрессии доминантно-негативного мутанта LOSK (Kimut) и при РНК-интерференции LOSK (4.1).

На следующий день после драматического падения количества киназы клетки погибали, что свидетельствует о важности LOSK для поддержания жизнеспособности клеток.

В клетках Vero с нокдауном LOSK наблюдалось разрушение радиальной звезды микротрубочек (Рис. 3, Б, В). При этом нуклеирующая активность центросомы сохранялась. Это было подтверждено опытами по восстановлению микротрубочек после их разборки нокодазолом: в первые минуты после отмывки нокодазола вокруг центросомы формировалась звезда микротрубочек, однако уже через 15 минут микротрубочки становились хаотичными, в то время как в контрольных клетках они сохраняли радиальность.

А

Б

Флуоресценция GFP ИФО

В

При элиминации ЬОБК происходило заметное уменьшение содержания динактина (р50 и р 150о,ие<1) на центросоме (Рис. 4), при этом общее количество динактина в цитоплазме клеток сохранялось на прежнем уровне. Это согласуется с ранее полученными данными при экспрессии доминантно-негативного конструкта киназы и позволяет предположить, что центросомная локализация динактина зависит от активности протеинкиназы ЬОБК.

Наряду с хаотизацией микротрубочек и уменьшением количества центросомного динактина ингибирование протеинкиназы ШБК вызывало нарушение перемещения аппарата Гольджи в поляризованных клетках.

нокдаун контроль LOSK

ц >-

ю

s

5

2рт

>s о

х

ш

g_100-Ф л Cl2

§,8 80-СО

о з-gs

m о 40

%

о

®о 20

4.1

у-тубулин динамитин

Рис. 4. Подавление экспрессии протеинкиназы LOSK приводит к уменьшению содержания динактина на центросоме. Иммунофлуоресцентное окрашивание центросомы антителами к гамма-тубулину и к динамитину (р50) в контроле (К) и при РНК-интерференции LOSK (4.1).

Поляризованные клетки получали спустя два часа после нанесения экспериментальной раны в конфлюэнтном монослое клеток Vero. Аппарат Гольджи визуализировали по иммунофлуоресцентному окрашиванию фиксированных препаратов антителами к маннозидазе II (Рис. 5).

В контрольных клетках аппарат Гольджи при поляризации смещался в 120°-сектор, обращенный к ведущему краю. При ингибировании киназы LOSK аппарат Гольджи оставался компактно собранным в околоядерной области, однако не переориентировался в сторону ведущего края клетки (Рис. 5). Поскольку компактность аппарата Гольджи не изменялась, можно предположить, что при таком воздействии динеин-зависимый транспорт не нарушался. Тогда наблюдаемый эффект, скорее всего, связан с участием LOSK в поляризации клеток, о чем свидетельствуют некоторые данные других авторов (Wagner et al, 2002).

фазовый контраст флуоресценция GFP ИФО

Л0- GFP-Kimut

* * ' V ■ • I ' anu- mannosidase 11

ШШК V ','

С5 SO оо

í

Рис. 5. Ингибирование протеинкиназы Ь08К приводит к нарушению перемещения аппарата Гольджи в поляризованных клетках на краю раны монослоя. В клетках, трансфицированных доминантно-негативным конструктом Ь08К (ОРР-КлтиО, аппарат Гольджи не перемещался в 120°-сектор, обращенный к ведущему краю. В качестве контрольных использовали клетки, экспрессирующие каталитически активный домен ЬОЭК (Кл) и нетрансфицированные клетки (К). Пунктирной линией обозначена доля клеток (33%) со случайной ориентацией аппарата Гольджи.

Субъединица динактинового комплекса белок pi50Glued является субстратом фосфорилировашш LOSK in vitro. Фосфорилирование динактина по этим остаткам способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек.

Протеинкиназа LOSK важна для организации микротрубочек и поляризации клеток,

однако каскады сигнальных реакций и возможные субстраты ее фосфорилирования до сих пор не

были идентифицированы. Нам удалось обнаружить, что субстратом фосфорилирования LOSK in

vitro является компонент динактинового комплекса - белок pi50Glucd. Киназные реакции in vitro

проводили с выделенными из бактерий рекомбинантными аффинно очищенными фрагментами

р 150Glued и киназным доменом LOSK (1-342 а.о.), с использованием у32Р-АТР.

Рис. 6. Протеинкиназа LOSK фосфори-лирует pl50GIued по Thr145 .147 ifl Vitro.

Идентификация сайта фосфорилирования в белке pl50olttcd. Киназные реакции in vitro проводили с использованием аффинно очищенных белков, слитых с GST: каталитически активный домен LOSK (Ki) инкубировали с универсальным субстратом МВР (Myelin Basic Protein), N-концевым фрагментом (1-157 а.о.) pl50Glued дикого типа (pl50(N)-WT), с заменой ThrMs.nv на Ala (pI50(N)-3TA) или с pl50-8-head (151-1277 а.о.). Р - окрашивание Понсо. R/a -радиоавтограф. Звездочками отмечено положение фрагментов pl50Glucd и МВР на радиоавтографе.

Р R/a Р R/a Р R/a Р R/a

250 -150 - 100 -75 - - ' *

50 -37 -25 - - 5 1 - т

МВР +

p150(N)-WT +

p150(J4)-3TA +

0150-5-heatl +

„ Р150-5-head

K¡

- p150(N)

- МВР

Делеционный анализ pl50Glucd показал, что сайт фосфорилирования расположен в МТ-связывающей области, а точнее между 131 и 151 а.о.. Сайт-направленный мутагенез выявил три следующих друг за другом остатка треонина (Тк^.цу), являющиеся мишенью фосфорилирования киназы LOSK: радиоактивный у-фосфат АТР переставал включаться в белок при замене этих остатков на аланиловые (Рис. 6).

Данные были подтверждены с помощью Вестерн-блоттинга с антителами к фосфотреонину, которые окрашивали рекомбинантный фрагмент pl50GIl,cd только после инкубации с LOSK в присутствии АТР. Сайт фосфорилирования (RRTTTRK) в целом не противоречит консенсусной последовательности фосфорилирования Y-X-T*-<J)-R/K, где Ф -ароматическая или гидрофобная аминокислота, и схож с сайтом автофосфорилирования LOSK (KNTRT*1QRR) (Pike et al„ 2008).

Рис. 7. Фосфорилирование динактина по Thri4s.147 способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек А - Система микротрубочек в клетках Vero, экспрессирующих доминантно-негативный конструкт LOSK (Kimut) и один из мутантов р 150Gluecl (GFP-pl50-3TA или GFP-pl50-3TE). Б - Количество клеток (%) с радиальной системой МТ при экспрессии мутантов pl50Glued и коэкспрессии мутантов pl50Glued с доминантно-негативным мутантом LOSK. В, Г - Соосаждение мутантных N-концевых фрагментов pl50Gll,cd (1-157 а.о.) с микротрубочками in vitro. S - супернатант, Р - осадок. Контроль — осаждение при тех же условиях в отсутствие микротрубочек (-МТ).

Для изучения роли фосфорилирования pl50Glucd в организации микротрубочек in vivo мы получили слитые с GFP полноразмерные мутанты pl50clued по сайту фосфорилирования один из них имитировал фосфорилированное состояние (р150-ЗТЕ Thr 145147 в нем были заменены на Glu), а другой - нефосфорилированное (р 150-ЗТА Thr 145147 были заменены на Ala)

При экспрессии полноразмерного pl50clucd дикого типа или мутанта р150-ЗТЕ в Vero увеличивалось количество клеток с хаотичной системой микротрубочек, что объясняется присутствием с составе полноразмерной молекулы суперскрученного участка CCI, ингибирующего динеин (Рис 7, Б) Однако более 50% клеток все же сохраняли радиальность микротрубочек А при экспрессии мутанта pl50o,ued -ЗТА радиальность МТ сохраняли лишь 35% клеток

Дальнейшее изучение роли фосфорилирования дипактипа киназой LOSK мы проводили при одновременной экспрессии мутантов pl50Glued и доминантно-негативного конструкта киназы LOSK (Kimut), который вызывал хаотизацию микротрубочек в 80% клеток Коэкспрессия мутанта р150-ЗТЕ приводила к восстановлению радиальной организации МТ в 59% клеток, а при коэкспрессии мутанта pl50GIucd -ЗТА микротрубочки оставались хаотичными (Рис 7) Это свидетельствует о важности фосфорилирования pl50olucd по Thr^s 147 для поддержания радиальной организации микротрубочек в клетках

Кроме того, мы проверили способность pl50olucd взаимодействовать с микротрубочками m vitro в зависимости от статуса фосфорилирования по Thr 145147 Для этого аффинно очищенные N-концевые фрагменты (1-157 а о ) pl50olucd дикого типа (Thr) и мутанта pl50Glued-3TE, слитые с GST, инкубировали с собранными in vitro микротрубочками и осаждали через 4M глицериновую подушку Осадки и супернатанты анализировали Вестерн-блотом, окрашенным антителами к pl50Glucd Оказалось, что замена Thr на Glu привела к снижению сродства pl50olued к микротрубочкам почти треть белка оставалась в супернатанте, в то время как р150 дикого типа почти весь (89%) связывался с микротрубочками и обнаруживался в осадке МТ (Рис 7)

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о важности активности протеинкиназы LOSK для поддержания жизнеспособности клеток и для формирования радиальной системы микротрубочек Нами также идентифицирован субстрат фосфорилирования LOSK - компонент динактинового комплекса р 150OIued Вероятно, именно фосфорилирование динактина протеинкиназой LOSK необходимо для заякоривания микротрубочек на центросоме и формирования их радиальной системы Данные о нарушении перемещения аппарата Гольджи в поляризованных клетках позволяют предположить, что протеинкиназа LOSK может быть вовлечена и в процессы поляризации и перемещения клеток по субстрату, в которых также принимает участие динеин-динактиновый комплекс

Белок pl50clued экспрессируется в виде двух нзоформ, отличающихся длиной МТ-связывающего участка. Изоформы pl50G'"ed по-разному взаимодействуют с микротрубочками. pl50clued -1Л, имеющая большее сродство, распределяется в клетке по всей длине микротрубочек, а менее аффинная P150GI,,ed-lB - локализуется на «плюс»-концах микротрубочек

Долгое время считалось, что белок pl50°lucd существует в виде двух изоформ повсеместно встречающейся 150 кД и специфичной для нейронов 135 кД, синтез которой начинается внутри интрона 5 Анализ нуклеотидных баз данных выявил две изоформы с массой 150 кД, отличающиеся длиной МТ-связывающего участка Изоформа pl50Glued -1А включает все аминокислоты N-концевой части белка, а изоформа pl50Glu£d-lB лишена 20 аминокислот (131-151 а о ), затрагивающих BMBD домен (Рис 1, 8)

экзоны 3й | 4й | 5й | 6й | 7й I 8й

131 151

р150-1A SSASKVLKREGTDTTAKTSKLRGLKPKKAPTARKTTTRRPKPTRPASTGVAGASSSL

р150-1В SSASKVLKREGTDTTAKTSKL-...................PTRPASTGVAGASSSL

р135 MMRQAPTARKTTTRRPKPTRPASTGVAGASSSL

Рис. 8. Сравнение аминокислотных последовательностей изоформ pl50Glued.

Показана экзонная структура выбранной области в состав вариабельного участка 131-151 а о входят 5-7 экзоны Последовательности pl50Glucd-lA (ВАЕ37079, из гипоталамуса мыши), pl50Glued-lB (САН10575, из коры головного мозга человека), р135 (ААН7158, из гиппокампа человека) взяты из базы данных NCBI

Мы предположили, что такая вариабельность изоформ может определять их различное сродство к МТ, что, возможно, имеет функциональное значение Для изучения взаимодействия изоформ с микротрубочками т vitro мы проводили опыты по соосаждению с МТ Для этого использовали рекомбинантные аффинно очищенные N-концевые фрагменты (1-157 а о) двух изоформ, слитые с GST, которые инкубировали с собранными in vitro микротрубочками и осаждали Более 85% длинной изоформы (pl50Glucd-lA) обнаруживалось в осадке МТ, в то время как почти вся (76%) короткая (pl50Glued-lB) оставалась в супернатанте, практически не связываясь с микротрубочками (Рис 9, Б, В)

Для изучения взаимодействия с микротрубочками т vivo мы экспрессировали полноразмерные изоформы pl50°'"ed, слитые с GFP, в клетках Vero и наблюдали их внутриклеточную локализацию Оказалось, что pl50clued-lA и pl50GI"cd-lB по-разному распределялись вдоль микротрубочек Короткая изоформа локализовалась в виде комет на «плюс»-концах микротрубочек, повторяя распределение эндогенного динактина, а длинная декорировала

микротрубочки по всей длине, что свидетельствовало от ее сильном сродстве к МТ (Рис. 9, А). Причем внутриклеточная локализация изоформ не зависела от уровня экспрессии.

А Флуоресценция GFP

ИФО

GFP-P150-1A К' :•-> ' anti-tubulin

GFP-p150-1B

ф,{

Л" lÉlSlIX;; .

МТ

-МТ

1А 1В

я , -* t

8 ™

ш ш

0 о

1 о

i -

§ sr

о ю Í а О

100

60

20

1А

1В

1А 1В

контр. контрИ

■ '' ■

Рис. 9. Взаимодействие изоформ pl50GluKl с микротрубочками. А - локализация изоформ pl50Glucd-lA и pl50Glucd-lB, слитых с GFP, при их экспрессии в клетках Vero. Б, В -Соосаждение N-фрагментов (1-157 а.о.) изоформ pl50Glued с микротрубочками in vitro. S -супернатант, Р - осадок. Контроль - осаждение при тех же условиях в отсутствие микротрубочек (-МТ).

Белок pl50G,ued тканеспеиифично экспрессируется в виде двух изоформ. Изоформа pl5()';l""'-l/\ доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетках; изоформа pl50Gll":d-lB экспрессируется повсеместно.

Можно предположить, что высокая аффинность pl50olued-lA помогает удерживать динеин-динактиновый комплекс на микротрубочке, что особенно важно, например, для аксонного транспорта. Исходя из этого, мы исследовали тканеспецифичность экспрессии длинной изоформы методом RT-PCR. Для этого выделяли тотальную РНК из тканей и клеточных культур, синтезировали кДНК и проводили ПЦР с праймерами, специфичными к короткой и длинной изоформам.

Оказалось, что мРНК pl50Glucd-lA представлена только в нервной ткани, где ее количество значительно превосходит количество короткой pl50Glucd-lB (Рис. 10, А). Также

длинная изоформа р 150Glucd-1А в следовых количествах обнаруживается в культивируемых клетках: первичной и трансформированной культурах мышиных фибробластов и трансформированных культурах HeLa и Vero. Короткая изоформа представлена во всех типах тканей и клеточных культур.

Для более подробного изучения внутриклеточной локализации и тканеспецифичной экспрессии двух изоформ мы получили поликлональные антитела, узнающие изоформу pl50Glued-1А. Антитела были проверены на специфичность: для этого ими окрашивали Вестерн-блот с лизатами клеток Vero, трансфицированных GFP- pl50ollied-lA или GFP-pl50Ghied-lB. В клетках, экспрессирующих pl50Glucd-l А, такое окрашивание выявляло две полосы: 180кД, соответствующую GFP-p ] 50olued-1 А, и минорную 150кД полосу эндогенного р150О1ик|-1А. При экспрессии же GFP-p 150-1В окрашивалась только полоска эндогенного pl50Glucd-lA массой 150кД (Рис. 11).

>s

А = i

м ü я г-

Р150-1В ГГ11 GAPDH НД^ЮЗП

Б

мозж. БП почка печень серд селез легкое мышцы

anti-p150-1A anti-p150 (pan)

Рис. 10. Тканеспецифичная экспрессия изоформ pl50GI"ed. А - RT-PCR с кДНК, полученными из тканей человека. GAPDH - контрольные ПЦР кДНК глицеральдегидфосфатдегидрогеназы. Б - Вестерн-блот с лизатами тканей мыши, окрашенный поликлональными антителами к pl50Glucd-lA (anti-pl50-lA) и моноклональными антителами к pl50Gklcd (anti-pl50 (pan)). На дорожки нанесены лизаты тканей мозжечка, больших полушарий головного мозга (БП), ствола мозга, почки, печени, сердца, селезенки, легкого и поперчно-полосатых мышц. Поликлональные антитела узнают р 150Glucd-1А в лизатах тканей мозга (отмечены звездочками) и специфичную для нейронов изоформу р135, начало которой пересекается с вариабельным участком (131-151 а.о.), который использовался для получения антител к изоформе 1А.

CI

оз га

i¡?

■е-

5

ir'** ** * ■ шЯШШЛ

4ММ

p150 (pan) р150-1А

р150 (pan)

(-180 kD) р150 (-150 kD) ►

тубулин ►

«МММ шм -i 1 i -•> —.....H - - .

... j ¿аъ&жыятю

г i. - . ; --

GFP-p150-1B (-180 kD)

Рис. 11. Проверка специфичности поликлональной сыворотки к pl50Glued-lA.

Иммуноблотгинг с лизатами клеток Vero, экспрессирующими pl50GI"ed-lA или P150Glucd-lB, слитые с GFP. Половина каждой дорожки окрашена моноклональными антителами к pl50Glucd (р150 (pan)), вторая половина - поликлональной сывороткой к pl50olued-lA (pi50-1 А). Контроль количества нанесенного материала - окрашивание антителами к тубулину.

anti-p150-1A anti-tubulin

% * --'¿¿h., -m-- 1 _-Д»--- 4 : •- • ■■ llfy ^айвй-»/-. • w* Г '

ф X . .• . -, „.к" :■ W^Ví -■.. il,'''! ' Ф: m £ ' ^ Ш ^

Рис. 12. Локализация эндогенного pl50Glued-lA в клетках Vero.

Иммунофлуоресцентное окрашивание поликлональными антителами к pl50Glucd-lA (слева) и антителами к тубулину (справа) в контрольных клетках (А) и в клетках с разобранными нокодазолом микротрубочками (Б).

Вестерн-блот с лизатами тканей и клеточных культур, окрашенный поликлональными

антителами, подтвердил данные RT-PCR о тканеспецифичности экспрессии длинной изоформы:

она была обнаружена в тканях мозга и клеточных культурах и отсутствовала в тканях не-нервного

происхождения (Рис. 10, Б, Рис. 11).

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Vero поликлональными антителами к p]50Gued-iA выявило локализацию длинной изоформы на центросоме и по всей длине отдельных МТ (Рис. 12, А). Окрашивание становилось гомогенным при разборке микротрубочек нокодазолом (Рис. 12, Б) и после истощения сыворотки антигеном, что свидетельствовало о специфичности покраски.

Экспрессия изоформы pl50GI"ed-lA в культивируемых клетках увеличивается при нарушении коифлюэитности монослоя, и этот белок преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.

В клетках Vero, растущих в разреженном монослое, pl50Glucd-l А обнаруживалась лишь на некоторых микротрубочках, в то время как большая часть микротрубочек оставалась не связанной с pl50GllJcd-lA. При этом в клетках, растущих в плотном монослое, содержащие pl50Gted-iA микротрубочки отсутствовали.

A anti-p150Glued-1A

anti-tubulin

se w

p150Glued-1A

тубулин

Рис. 13. Экспрессия p150Glued-lA в поляризованных клетках Vero. А -

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток Vero на краю раны монослоя поликлональной сывороткой к pl50Gllied-lA (слева) и к тубулину (справа). Б - Вестен-блот с лизатами клеток Vero, растущих в плотном (С), субконфлюэнтном (SC) монослое или в плотном монослое через 2 часа после нанесения экспериментальной раны (W). Контроль количества нанесенного материала -окрашивание антителами к тубулину.

Интересно, что отсутствуя в не-нервных тканях in situ, pl50Glued-lA экспрессируется в первичной культуре фибробластов и в культивируемых фибробласто- и эпителиоподобных клетках Это позволяет предположить, что pl50G,ucd-lA может участвовать в процессах распластывания, поляризации или перемещения клеток по субстрату Иммунофлуоресцентное окрашивание поляризованных клеткок на краю экспериментальной раны монослоя показало увеличение количества pl50Glucd-lA Интересно, что все микротрубочки, покрытые pl50°'ued-lA, были обращены к ведущему краю клетки (Рис 13, А) Методом Вестерн-блоттинга мы сравнили уровень экспрессии pl50°lucd-lA в клетках Vero, растущих при различной плотности монослоя Оказалось, что в конфлюэнтной культуре Vero изоформа 1А практически отсутствует, и ее количество заметно увеличивается в разреженной культуре или после нанесения раны в монослое (Рис 13, Б)

Таким образом, нами впервые было показано, что белок pl50Glued экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся по аффинности к микротрубочкам При этом более аффинная к микротрубочкам изоформа pl50Glued -1А характерна для нервных и для культивируемых клеток, что, вероятнее всего, связано с ростом отростков и ламелл клеток или процессами локомоции Участие динактина в подвижности клеток и в клеточном морфогенезе было продемонстрировано ранее (Watson and Stephens, 2006) При дальнейших исследованиях необходимо будет учитывать существование изоформы динактина pl50clued -1А, которая отличается по свойствам и, верочтно, более важна в функциональном отношении, по сравнению с изоформой pl50Glucd-lB, ранее описываемой как общий пул динактина

выводы

1 Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется

2 Подавление экспрессии протеинкиназы LOSK приводит к уменьшению содержания динактина на центросоме, нарушению удержания микротрубочек на центросоме и к хаотизации системы микротрубочек клетки

3 Субъединица динактинового комплекса белок pl50G,ucd является субстратом фосфорилирования протеинкиназой LOSK in vitro Сайт фосфорилирования представляет собой три следующих друг за другом остатка треонина (145-147) Фосфорилирование pl50olued по этим положениям способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек в клетке

4 Белок pl50olucd тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной участка связывания микротрубочек Изоформа pl50Glul:d-lA доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетках, изоформа pI50c'"ed-lB экспрессируется повсеместно

5 Изоформы pl50G'ued по-разному взаимодействуют с микротрубочками pl50Glued-lA, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная pl50GI"ed-lB - локализуется на плюс-концах микротрубочек

6 Экспрессия в культивируемых клетках изоформы pl50c,ued-lA увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и эта изоформа преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

1 Жаппарова О Н , Бураков А В , Надеждина Е С (2007) Динеин-динактиновый комплекс необходим для удержания, но не для нуклеации микротрубочек на центросоме Биохимия 72, 1515-1524

2 Burakov A, Kovalenko О, Semenova I, Zhapparova О, Nadezhdina Е, Rodionov V (2008) Cytoplasmic dynein is involved m the retention of microtubules at the centrosome in interphase cells Traffic 9,472-480

3 Burakov A, Zhapparova O, Kovalenko O, Zinovkina L, Potekhina E, Shanina N, Weiss D, Kuznetsov S, Nadezhdina E (2008) Ste20-related Protein Kinase LOSK (SLK) Controls Microtubule Radial Array in Interphase Molecular Biology of the Cell 19, 1952-1961

Тезисы докладов на конференциях*

1 Burakov А V , Kovalenko О V, Zinovkma L А, Potekhma Е S , Zhapparova О N , Kuznetsov S А, Nadezhdina Е S (2005) Materials of 45fll ASCB Annual Meeting, San-Francisco, p 671a-672a

2 Nadezhdina E S , Burakov A V , Kovalenko О V, Zhapparova О N , Rodionov VI (2006) Materials of International Symposium «Biological motility basic research and practice», Pushchino, p 98-99

3 Nadezhdina E S , Burakov A V, Kovalenko О V , Zhapparova О N, Brodsky IВ , Zinovkma L A, Potekhma E S , Shanina N A , Rodionov VI (2007) Materials of International Conference on "Protein biosynthesis, structure and function", Pushchino, p 51

4 Burakov A V, Kovalenko О V , Zhapparova О N, Nadezhdina E S , Rodionov VI (2007) Materials of ASCB/ECF summer meeting «Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems», p 30-31

5 Бураков А В , Жаппарова О H , Коваленко О В , Родионов В И, Надеждина Е С (2007) Цитология 49, 722-723

6 Zhapparova О, Dergunova L, Raevskaya N, Bryantseva S, Shanina N, Nadezhdina E (2007) Materials of 47lh ASCB Annual Meeting, Washington DC, p 456

7 Nadezhdina E S , Zhapparova О N , Kovalenko О V, Burakov A V, Shanina N A, Bryantseva S A (2008) Materials of International Symposium «Biological motility basic research and practice», Pushchino, p 246-247

8 Жаппарова О H, Зиновкина Л А, Шанина Н А, Надеждина Е С (2008) "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов", Новосибирск, с 176

9 Жаппарова О Н, Брянцева С А, Дергунова JI В, Раевская Н М , Шанина Н А , Надеждина Е С (2008) "IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов", Новосибирск, с 196

Заказ № 32/09/08 Подписано в печать 04 09 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \v\vw с/г ги, е-тш1 т/о@с/г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жаппарова, Ольга Наилевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Строение микротрубочек.

Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам.

Структура динеин-динактинового комплекса.

Участие динеин-динактинового комплекса во внутриклеточном транспорте.

Взаимодействие динеин-динактинового комплекса с микротрубочками.

Организация микротрубочек в клетке.16.

Нуклеация миктротрубочек на центросоме.

Участие динеина в процессах нуклеации микротрубочек.

Заякоривание микротрубочек на центросоме.

Участие динеин-динактинового комплекса в заякоривании микротрубочек на центросоме.

Роль протеинкиназ в регуляции организации микротрубочек.

Строение и функции протеинкиназы LOSK.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Молекулярное клонирование.

RT-PCR.

Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинг.

Экспрессия в бактериях и аффинная очистка белка.

Соосаждение с микротрубочками.

Сборка микротрубочек на центросомах in vitro.

Киназная реакция in vitro.

Получение поликлональной сыворотки.39.

Антитела.

Культивирование клеток.

Микроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Полученные в работе ДНК-конструкты.

Оценка степени радиальности микротрубочек.

Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность

Микроскопия, РЕЗУЛЬТАТЫ.

Полученные в работе ДНК-конструкты.

Оценка степени радиальности микротрубочек.

Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.

Нокдаун протеинкиназы LOSK приводит к хаотизации системы микротрубочек, уменьшению содержания динактина на центросоме и нарушению поляризации аппарата Гольджи на краю раны в монослое.

Субъединица динактинового комплекса белок pl50Glued является субстратом фосфорилирования LOSK (Thr 145-147) in vitro.

Фосфорилирование динактина по П1Г145.147 способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек.

Белок pl50Glued экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной МТ-связывающего участка. Изоформы pl50Glued по-разному взаимодействуют с микротрубочками: pl50Glued-lA, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная pl50Glued-lB - локализуется на «плюс»-концах микротрубочек.

Белок р150С1ие(1тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ. Изоформа pl50Glued-lA доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетах; изоформа pl50GIued-lB экспрессируется повсеместно.

Экспрессия изоформы pl50Glucd-lA в культивируемых клетках увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и этот белок преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ:.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жаппарова, Ольга Наилевна

1. Ингибирование динеина, вызванное разобщением с динактином, приводит к нарушению удержания микротрубочек на центросоме, при этом нуклеирующая активность центросомы сохраняется.2. Подавление экспрессии протеинкиназы LOSK приводит к уменьшению содержания динактина на центросоме, нарушению удержания микротрубочек на центросоме и к хаотизации системы микротрубочек клетки.3. Субъединица динактинового комплекса белок pl50G l u e d является субстратом фосфорилирования протеинкиназой LOSK in vitro. Сайт фосфорилирования представляет собой три следующих друг за другом остатка треонина (145-147). Фосфорилирование р150 и е по этим положениям способствует поддержанию радиальной организации микротрубочек в клетке.4. Белок pl50G l u e d тканеспецифично экспрессируется в виде двух изоформ, отличающихся длиной участка связывания микротрубочек. Изоформа pl50G l u e d-lA доминирует в тканях нервного происхождения и в минорных количествах обнаруживается в культивируемых клетках; изоформа pl50G l u e d-lB экспрессируется повсеместно.5. Изоформы р150 и е по-разному взаимодействуют с микротрубочками: pl50 G u e -1А, имеющая большее сродство, распределяется по всей длине микротрубочек, а менее аффинная pl50G l u e d-lB - локализуется на плюс-концах микротрубочек.6. Экспрессия в культивируемых клетках изоформы pl50 G u e -1А увеличивается при нарушении конфлюэнтности монослоя, и эта изоформа преимущественно распределяется вдоль микротрубочек, обращенных к ведущему краю клетки.