Роль динамики микротрубочек и структуры их сети в организации внутриклеточного транспорта

Ломакин, Алексей Юрьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль динамики микротрубочек и структуры их сети в организации внутриклеточного транспорта
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль динамики микротрубочек и структуры их сети в организации внутриклеточного транспорта"

□03488 14Б

На правах рукописи

Ломакин Алексей Юрьевич

РОЛЬ ДИНАМИКИ МИКРОТРУБОЧЕК И СТРУКТУРЫ ИХ СЕТИ В ОРГАНИЗАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ТРАНСПОРТА

03.00.03 - молекулярная биология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

1 О ДЕК 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2009

003488146

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в департаменте клеточной биологии Медицинской школы Университета Коннектикута (США).

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Надеждина Елена Сергеевна

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Родионов Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Зацепина Ольга Владимировна

доктор биологических наук

Глушанкова Наталия Александровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН

Защита диссертации состоится «_.. декабря 2009 г. в 11 часов на заседании

диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «_» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди трех известных в настоящий момент типов цитоскелетных структур (микрофиламенты, промежуточные филаменты, микротрубочки) особенно важное место занимает система микротрубочек. Эти цитоскелегные элементы играют ключевую роль в механизмах клеточного деления, активного транспорта органелл по цитоплазме, а также миграции клеток по субстрату. Нарушения функций микротрубочек лежат в основе многих патологических процессов, в том числе опухолевой трансформации и различных нейродегенераций (Alberts et al, 2007).

В большинстве клеток животных микротрубочки располагаются в цитоплазме в виде радиальной сети с фокусом схождения в точке вблизи ядра, называемой центром их организации. Выраженность радиальной организации сети микротрубочек бывает различной. Так, для культивируемых меланофоров характерна радиально-симме1ричная система микротрубочек, в то время как в культивируемых эпителиальных и фибробластоподобных клетках сеть микротрубочек устроена довольно хаотично. Так или иначе, практически все микротрубочки в клетках растут из центров организации так называемыми плюс-концами к периферии, а их минус-концы остаются собранными в центре (Бураков, Надеждина, 2006). Таким образом, сеть микротрубочек анизотропна, что используется клеткой для определения разных направлений транспорта органелл в цитоплазме.

В системах с хаотичной организацией микротрубочек преобладает хаотическое движение органелл, целью которого является объединение друг с другом различных клеточных компартментов. Напротив, в ситуации с радиальной системой микротрубочек доминирует направленный транспорт к центру или к периферии клетки.

Исследования последних лет показали, что многие органеллы в клетке несут на себе моторы обоих знаков, что определяет их движение по микротрубочкам как двунаправленное. Переключение активности одного из моторных белков в составе комплекса с органеллой может изменять вектор движения таких органелл; это явление лежит в основе координации различных транспортных направлений в клетке. Двунаправленный транспорт вдоль микротрубочек и участие в нем конкретных моторных белков, а также механизмы их координации наиболее четко охарактеризованы для мембранных органелл - митохондрий и меланосом - в клетках позвоночных. Однако транспорт немембранных компонентов клетки, например, рибонуклеопротеидных (мРНП) частиц, охарактеризован значительно хуже и описан, в основном, в специфических типах клеток - ооцитах и нейронах.

клетке на плюс-концах постоянно претерпевают чередующиеся фазы роста и укорочения, что в целом делает систему микротрубочек динамичной. Таким образом, распределение органелл в клетке в каждый данный момент, по-видимому, является статистическим результатом сочетания активных перемещений органелл по микротрубочковым путям и динамики самих этих путей. Но вклад динамики микротрубочек в общую картину внутриклеточного транспорта до настоящего времени не исследовался.

Было высказано предположение о том, что динамичные микротрубочки, постоянно собираясь и разбираясь, как бы сканируют внутриклеточное пространство своими плюс-концами в поисках транспортируемых органелл (так называемая модель «поиска и захвата» (К1гесЬпег, МЬсЫзоп, 1986)). Белки, специфически накапливающиеся на плюс-концах микротрубочек, могут временно «приклеивать» к микротрубочкам органеллы, расположенные на периферии, и тем самым способствовать началу их динеин-зависимого движения по микротрубочкам к центру клетки (Уаи^ап, 2004). Экспериментальные данные в пользу этой модели были получены, в основном, при наблюдении взаимодействий динамичных микротрубочек веретена деления с митотическими хромосомами (Тгааиег е1 а!., 2002). Нарушение функций белков, локализованных на плюс-конце микротрубочки, приводило к потере контакта между микротрубочкой и кинетохором хромосомы. Это в конечном итоге служило причиной неравномерной сегрегации генетического материала в митозе (ОгаУ1ат е( а1, 2006). Однако существование феномена «поиска и захвата» и его молекулярные механизмы в интерфазных клетках остаются практически не изученными.

Все вышеизложенное обусловило актуальность настоящего исследования и определило его цель и задачи.

Цель работы: диссертационное исследование ставило своей основной целью выяснение влияния микротрубочек и их динамики на внутриклеточный транспорт органелл в клетках с различной организацией микротрубочек в интерфазе - радиальной или хаотичной.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние ингибирования динамики микротрубочек на внутриклеточный транспорт меланосом в культивируемых меланофорах Хепорш 1аеш с радиальной системой микротрубочек.

2. Провести детальные видеонаблюдения за контактами плюс-концов микротрубочек с меланосомами во время активации динеин-зависимого транспорта.

3. Установить роль белков плюс-концов микротрубочек (ЕВ1, СЫР170, р150с'"к') в «захвате» меланосом микротрубочками.

4. Охарактеризовать транспорт цитоплазматических мРНП стрессовых гранул и проанализировать зависимость этого процесса от микротрубочек и их динамики в культивируемых клетках НеЬа с хаотичной системой микротрубочек.

5. Провести детальные видеонаблюдения за совместным поведением стрессовых гранул и микротрубочек в клетках.

6. Установить участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул.

глобальная динамика плюс-концов микротрубочек является определяющим фактором в осуществлении синхронного динеин-зависимого транспорта мембранных органелл в клетках с радиальной системой микротрубочек. Показано, что когда плюс-концы растущих микротрубочек контактируют с меланосомами, то меланосомы, временно заякоренные в результате контакта, приступают к минус-концевому транспорту вдоль микротрубочки. Это первое наблюдение об использовании интерфазной клеткой механизма «поиска и захвата», некогда предложенного для объяснения способов взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками веретена деления в митозе. Кроме того, в настоящем исследовании впервые выявлено участие белков, специфически аккумулирующихся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs), в осуществлении временных контактов между микротрубочкой и транспортируемой органеллой. Впервые продемонстрирована роль белка CLIP 170 в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом. Также, впервые показано функциональное значение ЕВ 1-зависимого привлечения CLIP 170 на плюс-конец микротрубочки.

Впервые показана ассоциация мРНП стрессовых гранул с клеточными микротрубочками. Впервые описан и охарактеризован внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и его зависимость от системы микротрубочек. Показано, что динамика микротрубочек не играет существенной роли в транспорте стрессовых гранул. Впервые продемонстрировано участие микротрубочек в процессе диссоциации стрессовых гранул.

Выяснение механизма взаимодействия микротрубочек с транспортируемыми грузами может оказаться полезным не только для понимания функций микротрубочек во внутриклеточном транспорте, но и для поиска фармакологических мишеней в патологически измененных клетках, с нарушенной функцией внутриклеточного транспорта. Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения меланосом и стрессовых гранул могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебных лекционных и практических курсах по молекулярной биологии клетки.

Апробация работы. Диссертационная работа прошла апробацию на объединенном заседании ученого совета факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ и отдела функциональной биохимии биополимеров НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ 15 октября 2009 г.

Результаты работы были представлены на семинаре департамента системной биологии медицинской школы Гарвардского Университета (Бостон, США, 2009), на семинаре департамента клеточной биологии медицинской школы Университета Коннектикута (Фармингтон, США, 2009).

Материалы диссертационного исследования послужили основой для докладов на следующих конференциях:

- 49ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Диего, США, 2009);

- Гордоновская научная конференция «Подвижные и сократимые системы» (Нью-Хэмпшир, США, 2009);

- 48ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Сан-Франциско, США, 2008);

- Международный симпозиум «Биологическая подвижность: современные достижения и перспективы» (Пущино-на-Оке, Россия, 2008);

- Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции» (Пущино-на-Оке, Россия, 2007,2008);

- IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008);

- Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008);

- XIX Зимняя молодежная научная школа-конференция «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2007);

- Летняя объединенная конференция Американского общества клеточных биологов и Европейского форума по исследованию цитоскелета (ASCB/ECF) (Дижон, Франция, 2007);

- 47ая Ежегодная конференция Американского общества клеточных биологов (ASCB) (Вашингтон, США, 2007).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 14 печатных

работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа написана и оформлена по традиционному плану. Рукопись включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, содержит 3 таблицы и 73 рисунка. Список литературы включает 237 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для достижения поставленной цели и решения задач настоящей работы использовался комплекс методов.

Культивирование клеток. В работе использовали культивируемые in vitro клетки карциномы шейки матки человека HeLa и иммортализованные меланофоры из кожи Xenopus laevis.

Культуры клеток HeLa выращивали в среде DMEM/F-12 ("Панэко") с добавлением 10% бычьей эмбриональной сыворотки ("Биолот") и ЮСМО"6 г/мл гентамицина ("Sigma"). Культуры поддерживали при температуре 37°С в атмосфере насыщенных водяных паров с 5% содержанием СОг. Культуры меланофоров выращивали в среде L-15 ("Sigma") с добавлением 20% бычьей эмбриональной сыворотки, FBS ("HyClone"), 5х\0* г/мл инсулина ("Sigma") и 100x10"6 г/мл стрептомицина и 100 ЕД/мл пенициллина ("Sigma") при температуре 27°С.

Экспериментальные воздействия на культуры клеток. Для стабилизации динамики микротрубочек клетки инкубировали в течение 5-10 минут в среде, содержащей 10"6 M таксола ("Sigma"). Для стабилизации динамики актиновых филаментов клетки инкубировали в течение 5-10 минут в среде, содержащей 10"6 г/мл джасплакинолида ("Sigma"). Для деполимеризации системы микротрубочек клетки инкубировали 60 минут на льду при +4°С, а затем в среде, содержащей 10"6 г/мл нокодазола ("Fluka") в течение часа при +37°С. Разрушения актиновых филаментов добивались при воздействии на

клетки латрункулина A ("Calbíochem") в конечной концентрации 0,5х 10'6 г/мл в течение 20 минут.

Для индукции образования стрессовых гранул клетки инкубировали в течение 30 минут в среде, содержащей 2x10"3 M арсената натрия, Na2HAsC>4 ("Реахим"). Биосинтез белка ингибировали при воздействии на клетки циклогексимида ("Sigma") в концентрации 10*10"6 г/мл в течение часа. При гормональной стимуляции транспорта меланосом в меланофорах клеткам предварительно заменяли полную ростовую среду на бессывороточную, после чего добавляли мелатонин или меланоцит-стимулирующий гормон, MSH ("Sigma") до конечной концентрации 10'8 M и инкубировали в течение 10-20 минут.

Работа с плазмидной ДНК и процедура трансфекции. Полноразмерная кДНК CLIP 170, а также кДНК его N-концевого (CLIP 170ДС/'Head', 4-309 а.о.) и С-концевого (GFP-CLIP170AN/'Tair, 1027-1320 а.о.) фрагмента были клонированы в векторе pEGFP-С1 ("Clontech"). Полноразмерная кДНК ЕВЗ человека (EB3-C-GFP) клонирована в плазмидном векторе pEGFP-Nl ("Clontech"). Вышеуказанные ДНК-конструкции были любезно предоставлены проф. А. Ахматовой (Медицинский Центр Эразмус, Роттердам, Нидерланды). кДНК миозина V с делецией моторного домена - GFP-MyoVa-AM - была любезно предоставлена проф. В. Гельфандом (Северо-западный Университет, Чикаго, США). Коммерчески доступная полноразмерная кДНК полиА-связывающего белка РАВР-1 человека ("ATCC-LGC Standards") была ранее клонирована в нашей лаборатории к.б.н. П.А. Ивановым в плазмидных векторах pEGFP-Cl и mCherry-Cl ("Clontech"). Вектор pEGFP-tubulin был приобретен у компании "Eurogen".

Для наращивания плазмидной ДНК использовали штамм Е. coli DH5a Трансформацию бактериальных клеток осуществляли с помощью метода электропорации. Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием колонок фирмы "Qiagen" в формате Miniprep или Maxiprep EndoFree.

Проверку наличия искомой вставки в препарате плазмидной ДНК осуществляли путем рестриктного анализа по сайтам клонирования с последующим разделением фрагментов с помощью гель-электрофореза в агарозных блоках (Sambrook et al., 1989).

Трансфекцию клеток векторньми ДНК проводили липосомным методом согласно протоколу производителя с использованием реагентов Lipofectamine 2000 ("Invitrogen"), Fugenö ("Roche") или TRANSIT ("Mirus"). Для определения трансгена клетки анализировали спустя 16-24 часа после трансфекции.

Антитела. В работе были использованы: мышиные моноклональные антитела к а-тубулину, клон DM1A ("Sigma"), к промежуточной цепи динеина DIC, клон 74.1 ("Covance"), ЕВ1 и pl50GW("BD Transduction Laboratories"); крысиные моноклональные антитела к а-тубулину, клон CBL270 ("Millipore"); кроличьи поликлональные антитела к CLIP 170, Н-300 ("Santa Cruz"), N-концу CLIP170, №2221 и к С-концу CLIP170, №2360 (любезно предоставленные проф. А. Ахмановой), к р170 субъединице фактора инициации трансляции eIF-За (антитела бьши получены в лаборатории ранее) и к GFP ("Abeam").

В качестве вторых антител использовали козлиные или ослиные антитела, выработанные против иммуноглобулинов мыши, крысы или кролика и, конъюгированные с флуорофорами Alexa 488, Oregon Green, Alexa Fluor 594, Texas Red ("Molecular Probes"),

Cy5 ("Jackson ImmunoResearch"), или с ферментными метками - пероксидазой хрена ("Jackson ImmunoResearch") и щелочной фосфатазой ("KPL").

Иммуноцитохимия и иммуиофлуоресцентная микроскопия. Для иммунолокализации антигенов в клетках использовали следующий протокол: клетки, растущие на покровных стеклах, промывали теплым (+37°С) 0,1 M фосфатно-солевым буфером (PBS), затем фиксировали абсолютным метанолом 10 минут при -20°С, после чего проводили постфиксацию 4% раствором формальдегида ("ICN Biomedicals") в течение 10 минут при +4°С. Далее клетки вьвдерживали 5-10 минут в 0,1% растворе Triton Х-100 ("Serva") при комнатной температуре. Растворы первичных и вторичных антител готовили на 3% бычьем сывороточном альбумине (BSA) ("Serva"). Инкубацию с антителами осуществляли при комнатной температуре, в течение 30 минут.

Для выявления F-актина клетки фиксировали 4% раствором формальдегида в течение 10 минут при комнатной температуре и подвергали пермеабялизации 0,1% раствором TritonX-100 в течение 10 минут. Далее клетки инкубировали с фаллоидином, конъюгированным с флуорохромом FITC ("Alexis"). Дальнейшие манипуляции проводили по общепринятой схеме. В некоторых случаях препараты клеток докрашивали DAPI ("Sigma") для выявления хромосомной ДНК.

Анализ препаратов проводили с помощью эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 2000М ("Carl Zeiss") (объектив 63*1.4NA PlanApo; 100*1,3NA PlanApo), оснащенного устройством для наблюдения в фазовом контрасте и 16-битной цифровой CCD камерой AxioCam HRm ("Carl Zeiss"). С помощью программного обеспечения AxioVision 3.1 ("Carl Zeiss") изображение передавалось на компьютер и запоминалось в виде графического файла. Полученные изображения обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Adobe Photoshop Version 8.0 ("Adobe").

Для ко-локализационного анализа препараты исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (система LSM 510, "Carl Zeiss") (объектив 100x1.3NA PlanApo). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм - для зеленого канала и He-Ne-лазер с длиной волны 543 нм - для красного канала. Применяли раздельное сканирование для сигналов из разных каналов: флуоресценция в области 500-530 нм - зеленый и 580-640 нм - красный канал. Совмещение двух сигналов проводили с помощью компьютерной программы Zeiss LSM Image Browser ("Carl Zeiss").

Микроинъекция. Для визуализации системы микротрубочек в живых клетках клетки микроинъецировали раствором тубулина, конъюгированного с флуоресцентным красителем СуЗ ("Ameisham Biosciences"). Препарат тубулина очищали из мозга быка и конъюгировали с красителем по ранее описанной методике (Semenova, Rodionov, 2007). Процедуру инъекции проводили с использованием микроманипулятора ("Leitz") и микроинъекционной системы 5242 ("Eppendorf"). Концентрация СуЗ-тубулина в микроигле составляла 6*10'3 г/мл. Результаты микроинъекции наблюдали 1 час спустя.

Видеомикроскопия. Прижизненные наблюдения за динамическим поведением СуЗ-меченых микротрубочек, GFP-EB1- и GFP-CLIP170-KOMeT проводили с использованием мультирежимного эпифлуоресцентного микроскопа Nikon ECLIPSE ТЕ 300 ("Nikon") (объектив Plan xlOO 1.25 NA), оснащенного сенсором Andor iXon EM-CCD с эффектом электронного умножения ("Andor Technology") под управлением программы

MetaMoiph Version 7.0 ("Universal Imaging"). Съемку проводили с 3-секундным интервалом в течение 10 минут.

Видеонаблюдения за совместным поведением мюсротрубочек и мРНП стрессовых гранул проводили в клетках, ко-экспрессирующих eGFP-тубулин и mCheny-PABP, с помощью мультиспектрального эпифлуоресцентного микроскопа на базе Axiovert 2000М ("Carl Zeiss") (объектив 100*1.3NA PlanApo), оснащенного высокоскоростным контроллером для наблюдения в нескольких спектральных каналах, а также цветной цифровой CCD камерой HAMAMATSU С4880 ("Hamamatsu Photonics") под управлением программы /Manager Version 1.3-beta (открытый ресурс лаборатории Р. Вэйла, Университет Калифорнии в Сан-Франциско, США). Съемку проводили с 3-секундным интервалом в течение 5 минут.

Наблюдения за динамикой GFP-PABP-содержащих мРНП стрессовых гранул в живых клетках проводили с применением инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа Axiovert 2000М ("Carl Zeiss") (объектив 63*1.25NA Plan-NEOFLUAR), оснащенного 16-битной цифровой CCD камерой AxioCam HRm ("Carl Zeiss") под контролем программы AxioVision 3.1 ("Carl Zeiss"). Съемку проводили с 3-секундным интервалом в течение 1 минуты.

Перед началом видеонаблюдений клетки обрабатывали оксиразой ("Oxyrase Company"), позволяющей снизить эффекты фотообесцвечивания и фотоповревдения клеток. Поверх культуральной среды наносили слой минерального масла ("CVS Pharmacy") для предотвращения ее контакта с воздухом.

Для прижизненных наблюдений за движением меланосом использовали светлопольную вндеомикроскопию (микроскоп Nikon ECLIPSE ТЕ 300; объектив 20* Plan Fluar 0.50 NA ("Nikon"); цифровая видеокамера Flashbus, RS-170 ("Watec Corp"); съемка в течение 10-20 минут с 10-секундным интервалом). Для проведения трекинга единичных меланосом с высоким разрешением была использована фазово-контрастная микроскопия с видеоусилением.

Биохимическое выделение препарата меланосом из клеток, Меланофоры разрушали механическим путем в присутствии ингибиторов протеаз; лизат подвергали низкоскоростному центрифугированию для получения «тяжелой» (ядра и крупные клеточные обломки) и «легкой» (цитозоль с прочими органеллами) фракции, как описано ранее (Kashina et al, 2004). Меланосомы из легкой фракции осаждали при 14000 об/мин. Полученные пробы уравнивали по оптической плотности меланина (Х= 350 нм).

Вестерн-блот анализ меланосомных белков. Пробоподготовку, одномерный гель-электрофорез белков и перенос на мембрану осуществляли по общепринятой методике (Towbin et al, 1979). Иммунореактивные полосы выявляли с помощью коммерческого реагента SuperSignal West Femto maximum sensitivity substrate ("Pierce Biotechnology"). Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую пленку Kodak X-Omat К Film.

Компьютерные алгоритмы анализа видеоизображений. Количественный анализ цифровых изображений сводился к установлению XY-координат движущихся объектов или среднего уровня интенсивности флуоресценции объекта интереса в пикселях. Для этих целей применяли компьютерные программы MetaMorph Version 7.0 ("Universal Imaging") и Image] 1.39s (Открытый ресурс Национальных Институтов Здоровья США).

Статистический анализ данных. Результаты трех независимых экспериментов суммировали и статистически обрабатывали с помощью пакета прикладных программ Excel for Windows ("Microsoft"). Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение (М ± SD), а в некоторых случаях - как среднее ± стандартная ошибка среднего (М ± SEM). Статистически достоверные отличия сравниваемых независимых выборок, имевших нормальное распределение, определяли при помощи непарного двухвыборочного t-теста Стьюдента в автоматической программе P-value Calculator (http://www.graphpad.com/quickcalcs/ttestl .cfm). Критический уровень значимости принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Перемещения меланосом по цитоскелетным трекам в мелаиофорах Xenopus laevis как идеальная модель для изучения механизмов транспорта мембранных органелл. Меланофоры содержат в цитоплазме пигмент меланин, который сконцентрирован в особых мембранных везикулах - меланосомах. Вместе с другими разновидностями пигментных клеток, меланофоры участвуют в быстром изменении цвета кожных покровов у рыб, амфибий и рептилий. Под действием гормона эпифиза мелатонина происходит синхронный транспорт меланосом от периферии к центру клетки (агрегация меланосом). Явление обратное агрегации - дисперсия - стимулируется гипофизарным гормоном меланотропином/меланоцит-стимулирующим гормоном (MSH). Система микротрубочек в меланофорах имеет классическую радиальную архитектуру: в центре клетки находятся минус-концы микротрубочек, собранные на центросоме, а на периферию обращены их плюс-концы. Агрегация происходит благодаря быстрому транспорту меланосом вдоль микротрубочек в направлении их минус-концов. В качестве мотора агрегирующие меланосомы используют цитоплазматический динеин. Дисперсия включает в себя кинезин-2-зависимое перемещение меланосом в направлении плюс-концов микротрубочек и переход меланосом на актиновые филаменты, где транспорт осуществляется актин-зависимым мотором миозином V (Rodionov, Borisy, 1999). При стимуляции агрегации меланосомы должны перейти с актина назад на микротрубочки и затем начать движение от плюс-конца к минус-концу микротрубочек.

Стабилизация динамики микротрубочек приводит к нарушению процесса агрегации меланосом в меланофорах Xenopus laevis. До последнего времени вопрос о том, каким образом меланосомы сменяют актиновые треки на микротрубочковые, оставался открытым. Во-первых, можно предположить, что миозиновый мотор подвозит органеллу к близлежащей микротрубочке. Однако меланосомы и большинство микротрубочек, особенно на периферии клеток, оказываются разнесенными друг от друга на значительные расстояния. В такой ситуации вероятность доставки органеллы миозином к микротрубочковому треку невелика. С другой стороны, как недавно было показано (Semenova et al, 2008), собственная динамика актиновых филаментов важна для осуществления некоторых видов внутриклеточного транспорта. Полимеризуясь, актин способен прокладывать треки для движения карго. Можно представить ситуацию, при которой актиновый филамент подрастает к микротрубочке, а затем миозин V подвозит органеллу к этой микротрубочке. И, наконец, третья возможность состоит в использовании клеткой собственной динамики микротрубочек и их способности к

«поиску и захвату». Прижизненные наблюдения за динамикой микротрубочек в меланофорах Хепорш показали, что микротрубочки в ламелле меланофора способны дорастать до мембраны и, демонстрируя типичные признаки динамической нестабильности, постоянно «сканировать» периферические зоны клетки. Подобное «сканирование» могло бы позволить микротрубочкам «собрать» меланосомы с актиновой сети на периферии клетки.

Для того чтобы выяснить, какой из трех механизмов работает при агрегации меланосом, мы подавили зависимый от миозина V транспорт меланосом путем экспрессии в клетках доминантно-негативного мутанта миозина V с делецией моторного домена (ОРР-МуоУа-АМ), а с применением фармакологических ингибиторов (джасплакинолид, таксол) затормозили динамику актиновых филаментов и микротрубочек. Оценка эффекта от указанных воздействий на перераспределение меланосом с периферии к центру клетки, выявила, что ни динамика актина, ни миозин-зависимый транспорт не вносят какого-либо вклада в агрегацию меланосом. Следовательно, необходимо было исследовать влияние динамики микротрубочек.

Мы подобрали условия обработки таксолом (10"6 М, 5 мин), при которых таксол подавлял динамическую нестабильность микротрубочек, но практически не влиял на структуру сети микротрубочек и ее плотность. Видеонаблюдения за направленным транспортом меланосом в контрольных клетках и в клетках, обработанных таксолом, выявили существенные различия в кинетике транспорта меланосом при агрегации (Рис. 1).

Время (с) Время (с)

Рис. 1. Таксол специфически подавляет процесс агрегации меланосом. Положение меланосом было оценено с помощью компьютерной программы \ietaMorph путем измерения плотности черного пигмента в пределах площади клетки во времени. Данные представлены в виде М±50.

Подсчет фракций агрегированных, частично агрегированных и диспергированных клеток, показал, что предобработка таксолом приводит к значительному увеличению в популяции меланофоров доли частично агрегированных и диспергированных клеток в ответ на сигнал к агрегации. При этом нам не удалось установить каких-либо существенных отличий в транспорте меланосом в ответ на сигнал к дисперсии (Рис. 2). Это наблюдение говорит о специфичном влиянии таксола на протекание именно минус-концевого транспорта меланосом.

100 -|

0 ь- 80 -

5 60 -

ш аг 40 -

о. С 20 -

0 -

Мелатонин

мен

□ Агрегированы ые □'Частично агрегированные Ц Диспергированные

-Тахо1 +Тахо1 -Тахо! +Тахо|

Рис. 2. Предобработка клеток таксолом при запуске процесса агрегации меланосом приводит к значительному увеличению фракции клеток с диспергированными или частично агрегированными меланосомами. Данные представлены в виде М ± БО.

Динамичные плюс-концы микротрубочек осуществляют «поиск и захват» меланосом во время агрегации. Каким образом динамичные микротрубочки могут вовлекаться в регуляцию минус-концевого транспорта меланосом? Для поиска ответа на этот вопрос мы решили провести прижизненные наблюдения за совместным поведением индивидуальных микротрубочек и меланосом в меланофорах, микроинъецированных раствором СуЗ-меченого тубулина. Предпринятые видеонаблюдения за меланофорами во время агрегации позволили зарегистрировать контакты плюс-концов микротрубочек с меланосомами на периферии клетки. Микротрубочка подрастала к неподвижной меланосоме, контактировала с ней своим плюс-концом, в результате такого контакта органелла оказывалась связанной с микротрубочкой и приступала к перемещению в направлении ее минус-конца (Рис. 3).

Рис. 3. Динамичные плюс-концы микротрубочек осуществляют «поиск и захват» меланосом во время агрегации. Флажком показано положение меланосомы, стрелкой - положение плюс-конца микротрубочки. Время указано в секундах. Масштабная линейка, 2 мкм.

В клетках, где динамика микротрубочек была подавлена с помощью таксола, мы никогда не встречали подобного рода взаимодействий. Таким образом, динамичные микротрубочки используют механизм «поиска и захвата» для того, чтобы «собрать» на периферии клетки меланосомы, подлежащие транспорту к центру.

Белки плюс-концов микротрубочек (+Т1Рв) и их роль в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом во время агрегации. Итак, динамичные микротрубочки «собирают» своими плюс-концами меланосомы, что является необходимым условием для инициации минус-концевого транспорта последних. Каковы же молекулярные механизмы взаимодействия плюс-концов микротрубочек с

меланосомами? Наиболее вероятными кандидатами на роль «связки» между плюс-концом микротрубочки и меланосомой являются белки, специфически аккумулирующиеся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs).

Наиболее важными представителями этой группы являются белки ЕВ1/3, CLIP170, pl50cw, которые объединены общим свойством формировать димеры и взаимодействовать друг с другом и тубулином микротрубочек по принципу «голова-хвост». Эти взаимодействия приводят к формированию так называемого шпос-концевого комплекса на конце растущей микротрубочки. ЕВ 1/3 ассоциируется с тубулином на плюс-конце растущей микротрубочки. Связываясь своим N-концевым доменом с хвостом ЕВ1, CLIP170 экспонирует С-концевой домен, за который цепляется голова pl50G/uei' (Komarova et al., 2002; Lansbergen et al, 2004; Komarova et al., 2005). Указанные особенности белков плюс-концевого комплекса позволили применить доминантно-негативный подход для оценки роли этих белков в обнаруженном нами явлении «поиска и захвата» меланосом плюс-концами микротрубочек. Для этих целей мы специфически вытесняли с плюс-конца микротрубочек эндогенные +TIPs, экспрессируя в клетках соответствующие конструкции, и наблюдали за тем, как отсутствие того или иного белка скажется на способности меланофоров агрегировать меланосомы в ответ на гормональный стимул. В частности, мы экспрессировали в клетках рекомбинантные белки с С-концом «закрытым» GFP или фрагменты белков, не способные к димеризации (детально схема эксперимента рассматривается в диссертации).

В ходе указанных экспериментов нам удалось выяснить, что удаление CLIP 170 и pl50GW, но не одного лишь pl50G/ued, с плюс-концов микротрубочек специфически ингибирует процесс агрегации в меланофорах (Таблица 1).

+TIPs регулируют в клетках множество важнейших процессов, и, в первую очередь, динамику микротрубочек, а также работу динеин-динактинового комплекса. Нарушение локализации и функций +TIPS могло сказаться на транспорте меланосом именно за счет изменения параметров динамической нестабильности микротрубочек или активности динеина, т.е. скорости минус-концевого транспорта. Мы измерили параметры динамики микротрубочек и скорость двунаправленного транспорта единичных меланосом в клетках, экспрессирующих доминантно-негативные конструкции, использованные в нашей работе. Оказалось, что при экспрессии доминантно-негативных конструкций эти параметры действительно несколько изменяются (данные приведены в диссертации).

Таблица 1. Влияние смещения +Т1Рб с плюс-концов микротрубочек на способность меланофоров агрегировать меланосомы в ответ на гормональный стимул.

Экспрессия доминантно-негативной конструкции Локализация эндогенных белков на плюс-концах микротрубочек Способность агрегировать меланосомы

ЕВ1 CLIP170 р150сй""'

EB3-C-GFP - - - -

GFP-CLIP170AN + - - -

GFP-CLIP170AC + + - +

Для оценки вклада изменений в динамике микротрубочек и двунаправленного транспорта единичных органелл в агрегацию меланосом была разработана стохастическая компьютерная модель транспорта меланосом вдоль микротрубочек, учитывающая вероятность «встречи» микротрубочки и меланосомы и скорость перемещения меланосомы. Согласно компьютерному моделированию, изменения в динамике микротрубочек и двунаправленного транспорта единичных органелл, выявленные в клетках, экспрессирующих доминантно-негативные конструкции, не вносят существенного вклада в процесс агрегации меланосом. Это позволяет рассматривать принципиальный результат экспериментов по вытеснению +TIPs с плюс-концов микротрубочек, при экспрессии доминантно-негативных конструкций, как специфичный. Также, применяя биохимические методы анализа, мы показали, что цитоплазматический динеин, ассоциированный с меланосомами, не покидает своего карго на фоне экспрессии доминантно-негативных конструкций (данные приведены в диссертации).

Наши наблюдения свидетельствовали о возможной роли белка CLIP 170 в осуществлении временных контактов между плюс-концом микротрубочки и поверхностью меланосомы во время агрегации, поэтому на следующем этапе мы перешли к визуализации непосредственного взаимодействия CLIP 170 с меланосомами в живых клетках. Для этих целей мы проэкспрессировали полноразмерный CLIP170 дикого типа, слитый с GFP, и индуцировали процесс агрегации в меланофорах. GFP-CLIP170 в клетках связывается с плюс-концами микротрубочек и формирует кометы, разлетающиеся от центросомы к периферии. GFP-CLIP170-KOMeTbi часто сталкиваются с меланосомами, и мы показали, что в ~80% случаев такие столкновения приводят к инициации центростремительного транспорта меланосом (Рис. 4). Чтобы показать специфичность такого взаимодействия, мы проэкспрессировали другой +TIP - EB3-C-GFP, который подобно GFP-CLIP170 формирует кометы, однако контакты ЕВЗ-C-GFP-KOMeT с меланосомами приводили к инициации транспорта последних лишь в 7,8% случаев. Скорее всего, это происходит из-за того, что полноразмерный ЕВЗ, слитый с GFP на С-конце, действует как доминантно-негативный фактор в отношении CLIP 170, вытесняя его с плюс-конца микротрубочки.

Рис. 4. Контакт меланосомы с плюс-концом микротрубочки, покрытым GFP-CLIP170, приводит к инициации минус-концевого транспорта. Белой сплошной линией очерчено положение меланосомы в пространстве и во времени. Черной сплошной линией очерчено положение GFP-CLlP170-KOMeTbi, сталкивающейся с меланосомой. Кимограф был построен в программе ImageJ при вырезании области интереса из кадров видеофильма длиной 60 секунд. Временной интервал между кадрами составил 3 секунды.

Обратившись к математическому моделированию, мы выяснили, что лишь одного снижения количества контактов, приводящих к инициации минус-концевого транспорта,

достаточно для ингибирования агрегации, сравнимого по эффективности с действием таксола.

Чтобы заингибировать CLIP 170 другим методом, мы применили микроинъекцию в клетки антитела против CLIP 170. Введение в клетки антитела против CLIP 170 специфически блокировало агрегацию меланосом, не влияя на их дисперсию. Микроинъекция же неспецифических антител не оказывала влияния на транспорт меланосом (Рис. 5). Клетки, инъецированные антителом против CLIP 170, демонстрировали фенотип, схожий с таковым при доминантно-негативном ингибировании CLIP 170, или при воздействии на клетки таксола, что еще раз доказывает роль белка CLIP 170 в «захвате» меланосом посредством плюс-концов микротрубочек и критичность этого взаимодействия для инициации динеин-зависимого транспорта.

Мспатпиии А/1СЫ

Преиммунная Clip 170 Преиммунная Clip170

сыворотка Антитело сыворотка Антитело

Рис. в. Микроинъекция антитела против СЬ1Р170 приводит к резкому увеличению фракции клеток с диспергированными или частично агрегированными меланосомами при индукции процесса агрегации. Цвета столбиков соответствуют обозначенным на рис. 2. Данные представлены в виде М ± вБ.

Одним из важнейших предсказаний нашей модели является принципиальная способность СЫР170 взаимодействовать не только с плюс-концами микротрубочек, но и с поверхностью меланосом.

Для проверки данной гипотезы мы биохимически выделили и очистили препарат меланосом из меланофоров в диспергированном и агрегированном состоянии. Чистоту препарата оценивали иммуноблотингом с антителами против растворимого цитозольного

окп Е D А EDA

150_ 100 Щ£ jP^ypW-'Ulfc

a-CLIP-170 a-GAPDH

Рис. 6. СЫР170 соочищается с белками меланосом. Белки тотального экстракта (Е) меланофоров, а также меланосом, выделенных из меланофоров в агрегированном (А) и диспергированном (О) состоянии были разделены с помощью электрофореза в 7,5%

полиакриламидном геле. Белковые полосы в дальнейшем были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и выявлены с помощью иммуноферментного мечения антителами на CLIP170 или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) как маркер растворимых цитозольных белков. Слева указан молекулярный вес полипептидов.

С использованием антител против CLIP 170 мы показали присутствие данного белка в составе белков меланосомной фракции (Рис. б), что доказывает возможность взаимодействия CLIP170 с меланосомами во время процесса агрегации и позволяет предложить модель взаимодействия плюс-концов микротрубочек с меланосомами (Рис. 7).

Рис. 7. Модель взаимодействия CLIP170 на плюс-конце микротрубочки с меланосомой. CLIP 170, заякоренный за счет ЕВ1 на плюс-конце микротрубочки, взаимодействует с гипотетическим адаптером (CLIP-170 binding factor) на поверхности меланосомы (Pigment granule). В результате подобного взаимодействия происходит сближение микротрубочки и меланосомы, что приводит к активации динеинового мотора (Dynein), «сидящего» на меланосоме, и началу минус-концевого транспорта по микротрубочке.

Стрессовые гранулы в клетках млекопитающих как модельные объекты для изучения активного транспорта немембранных компонентов - мРНК-белковых комплексов. Одним из наиболее ранних и специфичных ответов клетки на неблагоприятные воздействия (тепловой шок, окислительный стресс, УФ облучение и некоторые другие) является падение общего уровня белкового синтеза за счет ареста трансляции мРНК. При этом в цитоплазме эукариотических клеток возникают плотные образования, называемые стрессовыми гранулами (Kedersha et al, 1999). Стрессовые гранулы представляют собой гигантские рибонуклеопротеидные (РНП) комплексы, состоящие из малых рибосомных субчастиц, некоторых факторов инициации трансляции, мРНК и мРНК-связывающих белков. мРНК в составе стрессовых гранул инертна и не участвует в трансляции, т.к., перемещаясь в стрессовые гранулы, мРНК одевается целой «шубой» различных стабилизирующих белков, что уменьшает ее деградацию. При снятии стрессового воздействия на клетку гранулы разбираются, и инициаторные комплексы вновь вовлекаются в процесс трансляции (Kedersha et al, 2002). Стрессовые гранулы -образования временные. Они возникают через 15-20 минут после начала стрессового воздействия на клетку и исчезают в течение 1,5-3 часов после его снятия (Kedersha, Andersen 2002). Эти наблюдения породили интерес к изучению динамики стрессовых гранул в клетке. Использование флуоресцентно-слитых форм белков, идентифицированных в составе стрессовых гранул, позволяет проводить прижизненные

наблюдения за их поведением в культивируемых клетках. Оказалось, что стрессовые гранулы являются динамичными образованиями цитоплазмы: они постоянно обмениваются с ней своими компонентами; курсируют по клетке, двигаясь в различных направлениях, и нередко сливаются друг с другом (КеёегеЬа е/ а1, 2005; ОЬп е! а1„ 2008). Было показано, что образование стрессовых гранул сильно зависит от целостности микротрубочек в клетках. При разрушении микротрубочек нокодазолом стрессовые гранулы не формируются в ответ на окислительный стресс, однако при отмывке нокодазола на фоне окислительного стресса восстановление системы микротрубочек сопровождается образованием стрессовых гранул (1уэпоу еГ а1, 2003). Следует отметить, что визуализация внутриклеточного движения компонентов трансляционного аппарата как индивидуальных молекул (мРНК, мРНК-связывающих белков и трансляционных факторов) практически трудно выполнима. В этой связи стрессовые гранулы, размер которых в среднем составляет 1-2 мкм, являются очень удобным объектом для наблюдений.

Внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и зависимость этого процесса от динамики микротрубочек. Предпринятые нами видеонаблюдения за живыми клетками НеЬа, экспрессиругощими маркерный белок стрессовых гранул - РАВР, слитый с вРР, показали, что стрессовые гранулы - довольно динамичные цитоплазматические образования, способные перемещаться по клетке. За времена порядка десятков секунд одна и та же стрессовая гранула способна совершить направленное перемещение вдоль условной линии и вновь вернуться на изначальную позицию; в некоторых случаях скорости и дистанции таких перемещений были значительными (до I мкм/с); некоторые стрессовые гранулы совершали движения с неупорядоченной траекторией; другие же и вовсе хаотично колебались относительно некоего условного положения равновесия без совершения эффективного перемещения. При разрушении системы микротрубочек, но не актиновых филаментов, происходит резкое снижение скорости движения стрессовых гранул в клетке. Средняя скорость движения гранул в клетках после разборки микротрубочек составила 0,04 мкм/с против 0,13 мкм/с в контроле. Лишь 1,5% гранул (против 10% в контроле) в клетках с деполимеризованными микротрубочками движутся со скоростью, превышающей пороговое значение 0,2 мкм/с (критерий, используемый при характеристике активного транспорта различных компонентов в клетке; МШп е/ а1, 2006). В этих условиях начинают превалировать хаотические низкоамплитудные колебания гранул без совершения эффективного перемещения, либо всякое движение затормаживается. В отличие от транспорта меланосом, перемещение стрессовых гранул как к центру клетки, так и на ее периферию, не зависит от динамичности плюс-концов микротрубочек; обработка клеток таксолом существенно не влияет ни на расположение гранул в цитоплазме, ни на скорость их транспорта. Совокупное движение стрессовых гранул можно охарактеризовать как хаотическое перемещение по цитоплазме: они заметно не смещаются ни к центру, ни к периферии клетки.

Для точной характеристики движения стрессовых гранул мы применили строгий математический анализ изменения среднеквадратичного смещения (МБО) гранул по времени, позволяющий разложить движение частицы на составляющие компоненты (диффузионную компоненту и активный транспорт, зависимый от моторных белков) и оценить вклад каждой компонента. Результата предпринятого анализа показали, что в

клетках лишь небольшая фракция стрессовых гранул (~10%) демонстрирует активное движение, остальное движение описывается как простая или затрудненная диффузия. Усредненное движение стрессовых гранул в клетках в целом можно описать как затрудненную диффузию (Рис. 8). Следует отметить, что везикулярные частицы сходного размера, двигающиеся по микротрубочкам в клетках СНО-К1, демонстрируют аналогичный характер движения (Heinzer et al., 2008).

Разрушение системы микротрубочек приводит к полному нивелированию фракции стрессовых гранул, движущихся путем активного транспорта. Среднее значение коэффициента диффузии D для гранул, двигающихся в цитоплазме контрольных клеток, оказалось в ~3 раза больше, чем для гранул в клетках с разрушенными микротрубочками (1,9x10"3 мкм2/с против 6x10'4 мкм2/с соответственно).

Определенная нами средняя скорость перемещений РАВР-содержащих стрессовых гранул (~0,13 мкм/с) в клетках HeLa хорошо совпадает с уже охарактеризованными средними скоростями микротрубочки-зависимого транспорта различных мРНП-частиц. Например, в нейронах мРНП-частицы, содержащие белок СРЕВ, перемещаются со средней скоростью 0,06-0,13 мкм/с (Huang et al., 2003); в кардиоцитах мРНП-частицы, содежащие белки ZBP1 и Staufen, транспортируются по микротрубочкам со скоростью 0,08-0,15 мкм/с (Scholz et al., 2008); IMP-1-содержащие РНП в фибробластах передвигаются по цитоплазме со скоростью 0,12 мкм/с (Rackham, Brown, 2004).

- Г'

¿Л_к

1 (.im

Рис. 8, Анализ транспорта стрессовых гранул. А - типы движений, которые демонстрируют стрессовые гранулы в цитоплазме клеток HeLa. Показаны треки индивидуальных гранул. Классификация типов движения произведена на основе расчета MSD для гранул, d.m. (directed motion) - направленное перемещение, активный транспорт; s.d. (simple diffusion) -простая диффузия; o.d. (obstructed diffusion) - затрудненная диффузия; c.d. (confined diffusion) -ограниченная диффузия. Б - график изменения по времени коэффициента диффузии для стрессовых гранул, показанных на А. Обозначения те же. В - график изменения по времени среднего значения коэффициента диффузии стрессовых гранул в различных условиях эксперимента. 1 - контроль, 2 - латранкулин А, 3 - таксол, 4 - нокодазол.

Наблюдение прямого взаимодействия стрессовых гранул с микротрубочками в живых клетках. Охарактеризовав разнотипные движения гранул и, проследив зависимость их быстрых и на большие дистанции перемещений от целостности микротрубочек, мы перешли к изучению взаимодействия стрессовых гранул с микротрубочками в живых клетках. Для этих целей нами были получены клетки, транзиентно экспрессирующие eGFP-тубулин и mCherry-PABP. Видеонаблюдения с помощью двухканальной флуоресцентной микроскопии за совместным поведением

{¡.т. \ s.d.

O.Ü. cd.

О 10-3

■d-.m.

О 10 20 30 т. s

iirAS W®

Q Ю-3

1,2

О 20 40 № №,5

стрессовых гранул и микротрубочек показали, что подвижные гранулы ассоциированы с микротрубочками. Будучи связанными с микротрубочками, гранулы демонстрируют разнообразные типы движений: направленные сальтаторные движения (скачки на значительные расстояния за небольшой промежуток времени), двунаправленные перемещения и низкоамплитудные колебания относительно некоторого положения равновесия (Рис. 9). Учитывая, что в клетках НеЬа микротрубочки образуют густую сеть, движение большинства стрессовых гранул можно описать как низкоамплитудные перемещения в трехмерных ячейках, которые образуются в густой сети хаотично расположенных микротрубочек. Двигаясь в пределах таких ячеек, стрессовые гранулы могут совершать прыжки в соседние микродомены.

Рис. 9. Двунаправленный транспорт стрессовых гранул вдоль клеточных микротрубочек. Клетки были трансфецированы двумя плазмидами - евРР-тубулин (для визуализации микротрубочек) и шСЬеггу-РАВР (для визуализации стрессовых гранул). С помощью двухканальной флуоресцентной микроскопии был получен видеофильм. Приведена последовательность фрагментов, вырезанных из кадров видеофильма длиной 30 секунд. Временной интервал между кадрами фильма составил 3 секунды. Кадры видеофильма были обработаны в программе «1пмще1-деконволюция» для получения более четкого изображения и различения индивидуальных микротрубочек.

Изучая ассоциацию стрессовых гранул с микротрубочками на препаратах фиксированных клеток, нам удалось выявить, что стрессовые гранулы по своей морфологии напоминают плод ежевики. Отдельные «субъединицы» стрессовых гранул размером ~0,1-0,5 мкм удавалось также обнаружить колокализованными с микротрубочками. Это свидетельствует о том, что, по-видимому, стрессовые гранулы формируются за счет транспорта по микротрубочкам отдельных мРНП комплексов, которые, налипая друг на друга, и формируют более крупные конгломераты - стрессовые гранулы. Косвенным доказательством этой гипотезы служит наше наблюдение о том, что нередко мелкие стрессовые гранулы «сливаются» друг с другом с образованием одной, более крупной гранулы (Рис. 10).

0" г 6"» 9"* 12"

г# * . 4 4 г* * 6 Ш 1 * Г ._ а | • % £ У

Рис. 10. Морфология и динамика стрессовых гранул. А - морфология стрессовых гранул по данным иммунофлуоресцентной микроскопии. Клетки были фиксированы ледяным метанолом с последующей постфиксацией 4% параформальдегидом и иммуноцитохимически окрашены на один из маркерных белков стрессовых гранул - еГОа. Показаны две стрессовые гранулы, состоящие из множества мелких «субъединиц». Масштабная линейка - 1 мкм. Б - объединение двух стрессовых гранул в одну гранулу в цитоплазме живых клеток. Показан участок цитоплазмы

клетки, экспрессирующей один из маркеров стрессовых гранул - GFP-PABP. Время указано в секундах. Масштабная линейка, 2 мкм.

Участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул. Ранее было показано, что при деполимеризации клеточных микротрубочек стрессовые гранулы не формируются в ответ на окислительный стресс, однако восстановление целостности сети микротрубочек на фоне окислительного стресса сопровождается образованием стрессовых гранул de novo (Ivanov et al., 2003). Эти наблюдения свидетельствуют о том, что интактная система микротрубочек необходима для формирования стрессовых гранул из составляющих компонентов. В то же время, хорошо известно, что стрессовые гранулы - образования временные. Они возникают через 15-20 минут после начала стрессового воздействия на клетку и исчезают, путем диссоциации на составляющие, в течение 1,5-3 часов после его снятия (Kedersha, Andersen 2002). Поэтому, характеризуя роль микротрубочек в транспорте стрессовых гранул и их компонентов, для нас представляла самостоятельный интерес задача выяснения участия системы микротрубочек в процессе разборки стрессовых гранул. При планировании экспериментов в этом направлении, мы взяли на вооружение факт разборки стрессовых гранул при воздействии на стрессированные клетки ингибитором трансляции, циклогексимидом (Kedersha et al., 2005). Мы разрушали систему микротрубочек в клетках, предварительно обработанных арсенатом для индукции стрессовых гранул. Обработка клеток со стрессовыми гранулами циклогексимидом вызывала их исчезновение в клетках с интактной системой микротрубочек. Однако в клетках, где микротрубочки были разрушены, разборка стрессовых гранул под действием циклогексимида была подавлена. Нами также была проверена вовлеченнность микрофиламентов в разборку стрессовых гранул под действием циклогексимида. Для этого стрессированные арсенатом клетки обрабатывали латрункулином А, вызывающим деполимеризацию актиновых филаментов. Далее такие клетки инкубировали в среде с циклогексимидом, фиксировали и окрашивали антителами к eIF3a. Оказалось, что исчезновение стрессовых гранул в таких клетках происходит так же, как и в контроле (Рис.11). __

s s п fioo • ¡3. 901 80 • £j 70- О g 60- Ш g- 50 ■ y 0 40 • и в 10 1 20 1 —f—i

S 0 0 a с □ Control DArs SArs-N эс ■ Ars-LatA BArs-Chx 3Ars-Noc-Chx BArs-LatA-Chx

Рис. 11. Деполимеризация микротрубочек, но не актиновых филаментов подавляет разборку стрессовых гранул в ответ на циклогексимид. Ars - арсенат; Noc - нокодазол; LatA -латрункулин А; Chx - циклогексимид. Данные представлены в виде М ± SEM.

Таким образом, разрушение микротрубочек, но не микрофиламентов влияет на разборку стрессовых гранул под действием циклогексимида на фоне стресса. То есть микротрубочки необходимы не только для формирования стрессовых гранул, как было показано ранее, но и для их разборки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты исследования, важно подчеркнуть, что в данной работе нами впервые описан зависимый от микротрубочек транспорт немембранных органелл, стрессовых гранул, в клетках млекопитающих, а также охарактеризованы новые детали хорошо известного транспорта мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Xenopus laevis. Полученные данные позволяют заключить, что различия в структуре и плотности сети микротрубочек сказываются на организации внутриклеточного транспорта органелл. Так, в меланофорах Xenopus с хорошо выраженной радиальной организацией микротрубочек происходит быстрый, направленный и синхронный транспорт органелл. В клетках HeLa с хаотичной системой микротрубочек наблюдается асинхронное перемещение органелл, носящее хаотический характер. Плотность сети микротрубочек в меланофорах много меньше, чем в клетках HeLa, поэтому в меланофорах существует механизм, способный привести транспортируемые органеллы в контакт с микротрубочками. Данный механизм основан на явлении динамической нестабильности микротрубочек. Микротрубочки в меланофоре выступают не просто в качестве рельсов, вдоль которых моторные белки перевозят меланосомы, микротрубочки, благодаря своей динамичности, сами активно вовлекаются в процесс транспорта, играя роль «ловцов» меланосом, подлежащих транспортировке. В ответ на стимул к мгновенному изменению положения пигмента клетка мобилизует все возможные механизмы для прохождения этого процесса с максимальной эффективностью. Скорее всего, подобный механизм был приобретен в процессе эволюции и закреплен естественным отбором, ибо быстрое изменение цвета кожных покровов играет ключевую роль в социальном поведении животных, а также приобретении ими покровительственной окраски в природных условиях. В густой сети микротрубочек органелле не сложно найти свой транспортный трек, поэтому ингибирование динамики микрогрубочек в клетках HeLa существенно не влияет на транспорт стрессовых гранул. По-видимому, как дм транспорта самих стрессовых гранул, так и для их формирования из «субъединиц» или диссоциации на составляющие компоненты, важно наличие целостного трека, вдоль которого молекулярные моторы могут транспортировать компоненты стрессовых гранул и сами гранулы,

ВЫВОДЫ

1. Глобальная динамика плюс-концов микротрубочек необходима для быстрой и синхронной агрегации мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Xenopus. Динамичные плюс-концы микротрубочек взаимодействуют с меяаносомами, подлежащими минус-концевому транспорту, по механизму «поиска и захвата».

2. Белок CLIP 170, аккумулирующийся на концах растущих микротрубочек, принимает участие в формировании временных контактов между плюс-концом микротрубочки и

меланосомой. Указанные взаимодействия необходимы для инициации динеин-зависимого транспорта меланосом.

3. Белок динактинового комплекса р\50а1иЫ, также ассоциированный с плюс-концами микротрубочек, не участвует в «захвате» меланосом микротрубочками.

4. Немембранные органеллы, стрессовые гранулы, перемещаются в клетках по микротрубочкам. Транспорт стрессовых гранул характеризуется как асинхронное перемещение, носящее хаотический характер.

5. Динамика микротрубочек не вносит вклада в результирующее движение стрессовых гранул.

6. Микротрубочки необходимы не только для формирования стрессовых гранул, как было показано ранее, но и для их разборки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lomakin A.J., Semenova I., Zaliapin I., Kiaikivski P., Nadezhdina E,, Slepchenko В., Akhmanova A., and Rodionov V. CLIP-170-dependent capture of membrane organelles by microtubules initiates minus-end directed transport // Dev. Cell. - 2009. - Vol. 17. - P. 323333.

2. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Search-and-capture of membrane organelles by dynamic microtubules is required for initiation of dynein-dependent transport // Mol. Biol. Cell. - 2007. - Suppl. Vol. 18. - P. 192a.

3. Ivanov P.A., Lomakin A.J., Nadezhdina E.S. RNP Stress Granule Dynamics Depends on Microtubules and Microtubule Motors // Mol. Biol. Cell. - 2007. - Suppl. Vol. 18. - P. 198a.

4. Nadezhdina E.S., Ivanov P.A., Lomakin A.J. Microtubules in stress granule dynamics // American Society for Cell Biology & European Cytoskeleton Forum Summer Meeting "Dynamic Interplay between Cytoskeletal and Membrane Systems". Materials of the Conference. - Dijon, France, 2007. - P. 35.

5. Надеждина E.C., Иванов П.А., Ломакин А.Ю. Микротрубочки в динамике стрессовых гранул I! Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции». Сборник тезисов. - Пущино: Институт белка РАН, 2007. - С. 134.

6. Ломакин А.Ю., Иванов П.А., Надеждина Е.С. Участие тубулинового цитоскелета в трансляционной регуляции экспрессии генома в условиях клеточного стресса // XIX Зимняя молодежная научная школа-конференция «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Сборник тезисов. - М.: Институт биоорганичесхой химии РАН, 2007. - С. 36.

7. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina Е., Akhmanova A., Rodionov V. Regulation of the CLIP-170-dependent interaction of membrane organelles with the plus ends of cytoplasmic microtubules essential for initiation of the minus-end directed transport // Mol. Biol. Cell. -2008. - Suppl. Vol. 19.-P. 298b.

8. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Cytoplasmic linker protein 170 is essential for 'search-and-capture' of membrane organelles by dynamic microtubules // IVth Meeting of the Russian society for biochemistry and molecular biology. Abstract book. - Novosibirsk: SB RAS, 2008. - P. 152.

9. Lomakin A., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., Rodionov V.I. Cytoplasmic linker protein 170 (CLIP-170) is essential for initiation of dynein-driven transport of melanosomes

// Materials of international symposium "Biological motility: achievements and perspectives". - Pushchino: Foton-Vek, 2008. - Vol. 2. - P. 235.

10. Lomakin A., Chudinova E., Ivanov P., Nadezhdina E. Role for microtubules and microtubule associated motor proteins in the dynamics of ribonucleoprotein stress granules // Materials of international symposium "Biological motility: achievements and perspectives". - Pushchino: Foton-Vek, 2008. - Vol. 2. - P. 234.

П.Ломакин А.Ю., Надеждина E.C., Ахманова A.C., Родионов В.И. Идентификация белков микротрубочек, необходимых для их взаимодействия с меланосомами // Международная конференция «Биосинтез белков, их структура и функции». Сборник материалов конференции. - Пущино: Институт Белка РАН, 2008. - С. 165.

12. Ломакин А.Ю., Семенова И.А., Надеждина Е.С., Ахманова А.С., Родионов В.И. «Поиск и захват»: молекулярные основы динамического взаимодействия микротрубочек с мембранными органеллами // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Секция «Биология». Тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс, 2008. - С 237.

13. Rraikivski P., Lomakin A., Semenova 1., Nadezhdina Е., Akhmanova A., Rodionov V. Regulation of microtubule dynamics enhances capture of pigment granules by growing microtubule ends during pigment aggregation in melanophores // Mol. Biol. Cell. - 2009. -Suppl. Vol. 20. - P. 203a.

14. Lomakin A., Kraikivski P., Semenova I., Nadezhdina E., Akhmanova A., and Rodionov V. Changes in microtubule dynamics enhance the CLIP-170-dependent binding of pigment granules to microtubules during pigment aggregation in melanophores И Materials of Gordon Research Conference "Motile & Contractile Systems". - New London, USA, 2009. - P. 51.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 17.11.2009 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 635. Тел. 939-3890. ТелУФакс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. МБ. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ломакин, Алексей Юрьевич

Список сокращений, принятых в работе

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общее понятие о цитоскелете. Микротрубочки как важнейший элемент цито скелета. Тонкая структура микротрубочек

1.2. Организация системы микротрубочек в клетках. Динамика микротрубочек

1.3. Ассоциированные с микротрубочками белки (МАРб). Контроль динамики микротрубочек со стороны МАРб

1.4. Молекулярные моторы, работающие на микротрубочках. Роль кинезина и динеина в осуществлении транспорта по микротрубочкам

1.5. Активный транспорт и его логика. Виды грузов, транспортируемых по микротрубочкам: мембранные и немембранные "карго". Координация моторных комплексов

1.6. Соотношение динамики микротрубочек и внутриклеточного транспорта. Взаимодействие микротрубочек с перевозимыми грузами: модель «поиска и захвата». Основные представители белков семейства +TIPs: ЕВ1, CLIP 170, pl50c/"ei/ и их участие во взаимодействии микротрубочек с перевозимыми грузами

1.7. Меланофоры позвоночных животных как удобная система для изучения активного транспорта мембранных органелл

1.8. Стрессовые гранулы в клетках млекопитающих как модельные объекты для изучения активного транспорта немембранных компонентов - РНК-белковых комплексов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культивирование клеток

2.2. Экспериментальные воздействия на культуры клеток

2.3. Работа с плазмидной ДНК и процедура трансфекции

2.4. Антитела

2.5. Иммуноцитохимия и иммунофлуоресцентная микроскопия

2.6. Микроинъекция

2.7. Видеомикроскопия

2.8. Определение уровня полимеризованного тубулина в живых клетках

2.9. Биохимическое выделение препарата меланосом из клеток

2.10. Вестерн-блот анализ меланосомных белков

2.11. Компьютерные алгоритмы анализа видеоизображений

2.12. Математический аппарат

2.13. Статистический анализ данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Стабилизация динамики микротрубочек приводит к нарушению процесса агрегации мембранных органелл, меланосом, в меланофорах X. laevis

3.2. Динамика актиновых филаментов и зависимый от миозина V транспорт не важны для процесса агрегации меланосом

3.3. Динамичные плюс-концы микротрубочек осуществляют «поиск и захват» меланосом во время агрегации

3.4. Устранение белкового комплекса ЕВ 1 -CLIP 170-р\$QGlued с плюс-конца микротрубочки влечет за собой нарушение процесса агрегации меланосом

3.5. Диссоциация с плюс-концов микротрубочек эндогенного CLIP 170 приводит к нарушению процесса агрегации меланосом

3.6. Контакты плюс-концов микротрубочек, обогащенных GFP-CLIP170, с меланосомами приводят к инициации минус-концевого транспорта последних

3.7. Дефекты агрегации меланосом в клетках с нарушенной локализацией CLIP 170 на плюс-конце микротрубочки объясняются резким снижением частоты плюс-концевых контактов, приводящих к инициации минус-концевого транспорта меланосом

3.8. CLIP 170 соочищается с белками меланосом

3.9. Немембранные органеллы, стрессовые гранулы, ассооциированны с клеточными микротрубочками

ЗЛО. Стрессовые гранулы транспортируются по микротрубочкам in vivo

3.11. Целостность микротрубочек, но не актиновых филаментов важна для активного транспорта стрессовых гранул

3.12. Динамика микротрубочек не вносит существенного вклада в транспорт стрессовых гранул

3.13. Участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1. Роль динамики микротрубочек в инициации динеин-зависимого транспорта меланосом

4.2. Белки плюс-концов микротрубочек (+TIPs) и их роль в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом во время агрегации

4.3. Внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и зависимость этого процесса от динамики микротрубочек

4.4. Участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль динамики микротрубочек и структуры их сети в организации внутриклеточного транспорта"

Актуальность проблемы. Среди трех известных в настоящий момент типов цитоскелетных структур (микрофиламенты, промежуточные филаменты, микротрубочки) особенно важное место занимает система микротрубочек. Эти цитоскелетные элементы играют ключевую роль в механизмах клеточного деления, активного транспорта органелл по цитоплазме, а также миграции клеток по субстрату. Нарушения функций микротрубочек лежат в основе многих патологических процессов, в том числе опухолевой трансформации и различных нейродегенераций (Alberts ct al., 2007).

В большинстве клеток животных микротрубочки располагаются в цитоплазме в виде радиальной сети с фокусом схождения в точке вблизи ядра, называемой центром их организации. Выраженность радиальной организации сети микротрубочек бывает различной. Так, для культивируемых меланофоров позвоночных характерна радиально-симметричная система микротрубочек, в то время как в культивируемых эпителиальных и фибробластоподобных клетках сеть микротрубочек устроена довольно хаотично. Так или иначе, практически все микротрубочки в клетках растут из центров организации так называемыми плюс-концами к периферии, а их минус-концы остаются собранными в центре (Бураков, Надеждина, 2006). Таким образом, система микротрубочек анизотропна, что используется клеткой для определения разных направлений транспорта органелл в цитоплазме.

Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков - механохимических АТФаз, принадлежащих к двум суперсемействам: динеинам и кинезинам. Связываясь одним концом молекулы с микротрубочкой, а другим - с переносимым грузом, кинезины, как правило, перемещают свой груз к плюс-концу микротрубочки, а динеины - к ее минус-концу (Holzbauer, Valle, 1994; Schroer, 1994; Vale, Fletterick, 1997). ч Исследования последних лет показали, что многие органеллы в клетке несут на себе моторы обоих знаков, что определяет их движение по микротрубочкам как двунаправленное. Переключение активности одного из моторных белков в составе комплекса с органеллой может изменять вектор движения таких органелл; это явление лежит в основе координации различных транспортных направлений в клетке. Двунаправленный транспорт вдоль микротрубочек и участие в нем конкретных моторных белков, а также механизмы их координации, наиболее четко охарактеризованы для мембранных органелл - митохондрий и меланосом - в клетках позвоночных, а также липидных капель, занимающих промежуточное положение между мембранными и немембранными органеллами, в эмбрионах Drosoph.Ua. Однако транспорт немембранных компонентов клетки, например, рибонуклеопротеидных (мРНП) частиц, охарактеризован значительно хуже и описан, в основном, в специфических типах клеток - ооцитах и нейронах.

Традиционно микротрубочкам в организации внутриклеточного транспорта отводится роль «рельсов», вдоль которых моторные белки перевозят органеллы. Тем не менее, это представление кажется односторонним, ибо микротрубочки - не застывшие арматурные элементы, а вполне динамичные образования. Большинство микротрубочек в клетке на плюс-концах постоянно претерпевают чередующиеся фазы роста и укорочения, что в целом делает систему микротрубочек динамичной. Таким образом, распределение органелл в клетке в каждый данный момент, по-видимому, является статистическим результатом сочетания активных перемещений этих органелл по микротрубочковым путям и динамики самих этих путей. Но вклад динамики микротрубочек в общую картину внутриклеточного транспорта до настоящего времени не исследовался.

Было высказано предположение о том, что динамичные микротрубочки, постоянно собираясь и разбираясь, как бы сканируют внутриклеточное пространство своими плюс-концами в поисках транспортируемых органелл (так называемая модель «поиска и захвата» (КлгзсЬпег, МксЫэоп, 1986)). Белки, специфически накапливающиеся на плюс-концах микротрубочек, могут временно «приклеивать» к микротрубочкам органеллы, расположенные на периферии, и тем самым способствовать началу их динеин-зависимого движения по микротрубочкам к центру клетки (УаицЬап, 2004). Экспериментальные данные в пользу этой модели были получены, в основном, при наблюдении взаимодействий динамичных микротрубочек веретена деления с митотическими хромосомами (Тлгпаиег е( а1., 2002а). Нарушение функций белков, локализованных на плюс-конце микротрубочки, приводило к потере контакта между микротрубочкой и кинетохором хромосомы. Это в конечном итоге служило причиной неравномерной сегрегации генетического материала в митозе (Огау1ат еГ а1, 2006). Однако существование феномена «поиска и захвата» и его молекулярные механизмы в интерфазных клетках, остаются практически не изученными.

Все вышеизложенное обусловило актуальность настоящего исследования и определило его цель и задачи.

Цель исследования: работа ставит своей основной целью выяснение влияния динамики микротрубочек на внутриклеточный транспорт мембранных (меланосомы) и немембранных (мРНП-гранулы) органелл в клетках с различной организацией микротрубочек в интерфазе.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить влияние ингибирования динамики микротрубочек на внутриклеточный транспорт меланосом в культивируемых меланофорах Xenopus laevis с радиальной системой микротрубочек.

3. Установить роль белков плюс-концов микротрубочек (ЕВ1, CLIP 170, p\50GIued) в «захвате» меланосом микротрубочками.

4. Охарактеризовать транспорт цитоплазматических мРНП стрессовых гранул и проанализировать зависимость этого процесса от динамики микротрубочек в культивируемых клетках HeLa с хаотичной системой микротрубочек.

5. Провести детальные видеонаблюдения за совместным поведением стрессовых гранул и микротрубочек в клетках.

6. Установить участие микротрубочек в разборке стрессовых гранул.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе получены оригинальные, мирового уровня результаты, позволяющие выявить физиологическую роль явления динамической нестабильности микротрубочек в интерфазной клетке: глобальная динамика плюс-концов микротрубочек является критичным фактором для осуществления синхронного динеин-зависимого транспорта мембранных органелл в клетках с радиальной системой микротрубочек. Показано, что, когда плюс-концы микротрубочек контактируют с меланосомами, то органелла, временно заякоренная в результате контакта, приступает к минус-концевому транспорту вдоль микротрубочки. Это первое наблюдение об использовании интерфазной клеткой механизма «поиска и захвата», некогда предложенного для объяснения способов взаимодействия кинетохоров хромосом с микротрубочками веретена деления в митозе. Кроме того, в настоящем исследовании впервые выявлено участие белков, специфически аккумулирующихся на плюс-концах микротрубочек (+TIPs), в осуществлении временных контактов между микротрубочкой и транспортируемой органеллой. Впервые продемонстрирована роль белка CLIP 170 в осуществлении механизма «поиска и захвата» меланосом. Также, впервые показано функциональное значение ЕВ1-зависимого привлечения CLIP 170 на плюс-конец микротрубочки.

Впервые показана ассоциация таких немембранных органелл как мРНП стрессовых гранул с клеточными микротрубочками. Впервые описан и охарактеризован внутриклеточный транспорт стрессовых гранул и его зависимость от системы микротрубочек. Впервые продемонстрировано участие микротрубочек в процессе диссоциации стрессовых гранул.

Разработанные методические подходы к наблюдению и анализу движения меланосом и стрессовых гранул могут быть использованы для изучения внутриклеточного транспорта других органелл.

Материалы диссертационной работы могут быть использованы в учебных лекционных и практических курсах по молекулярной биологии клетки.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ломакин, Алексей Юрьевич

выводы

1. Глобальная динамика плюс-концов микротрубочек необходима для быстрой и синхронной агрегации мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Хепорт. Динамичные плюс-концы микротрубочек взаимодействуют с меланосомами, подлежащими минус-концевому транспорту, по механизму «поиска и захвата».

2. Белок СЫР 170, аккумулирующийся на концах растущих микротрубочек, принимает участие в формировании временных контактов между плюс-концом микротрубочки и меланосомой. Указанные взаимодействия необходимы для инициации динеин-зависимого транспорта меланосом.

3. Белок динактинового комплекса р150с/"еаГ, также ассоциированный с плюс-концами микротрубочек, не участвует в «захвате» меланосом микротрубочками.

5. Динамика микротрубочек не вносит вклада в результирующее движение стрессовых гранул.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая результаты исследования, важно подчеркнуть, что в данной работе нами впервые описан зависимый от микротрубочек транспорт немембранных органелл, стрессовых гранул, в клетках млекопитающих, а также охарактеризованы новые детали хорошо известного транспорта мембранных органелл, меланосом, в меланофорах Хепориз Полученные данные позволяют заключить, что различия в структуре и плотности сети микротрубочек сказываются на организации внутриклеточного транспорта органелл. Так, в меланофорах Хепорш с хорошо выраженной радиальной организацией микротрубочек происходит быстрый, направленный и синхронный транспорт органелл. В клетках НеЬа с хаотичной системой микротрубочек наблюдается асинхронное перемещение органелл, носящее хаотический характер. Плотность сети микротрубочек в меланофорах много меньше, чем в клетках НеЬа, поэтому в меланофорах существует механизм, способный привести транспортируемые органеллы в контакт с микротрубочками. Данный механизм основан на явлении динамической нестабильности микротрубочек. Микротрубочки в меланофоре выступают не просто в качестве рельсов, вдоль которых моторные белки перевозят меланосомы, микротрубочки, благодаря своей динамичности, сами активно вовлекаются в процесс транспорта, играя роль «ловцов» меланосом, подлежащих транспортировке. В ответ на стимул к мгновенному изменению положения пигмента клетка мобилизует все возможные механизмы для прохождения этого процесса с максимальной эффективностью. Скорее всего, подобный механизм был приобретен в процессе эволюции и закреплен естественным отбором, ибо быстрое изменение цвета кожных покровов играет ключевую роль в социальном поведении животных, а также приобретении ими покровительственной окраски в природных условиях. В густой сети микротрубочек органелле не сложно найти свой транспортный трек, поэтому ингибирование динамики микротрубочек в клетках НеЬа существенно не влияет на транспорт стрессовых гранул. По-видимому, как для транспорта самих стрессовых гранул, так и для их формирования из «субъединиц» или диссоциации на составляющие компоненты, важно наличие целостного трека, вдоль которого молекулярные моторы могут транспортировать компоненты стрессовых гранул и сами гранулы.

136

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ломакин, Алексей Юрьевич, Москва

1. Бураков А.В., Надеждина Е.С. 2006. Динеин и динактин как организаторы системы клеточных микротрубочек. Онтогенез. 2006. 37: 1-17.

2. Кулик А.В., Гиоева Ф.К., Минин А.А. 2002. Видеомикроскопическое исследование движения митохондрий. Онтогенез. 33: 366-373.

3. Alberts В., Jonson A., Levis J., Raff M., Roberts К, Walter P. 2007. Molecular Biology of the Cell. 5th ed. New York: Garland Publishing.

4. Sambrook et al., 1989. J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. In: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

5. Stephen L. Wolfe. 1995. Introduction to Cell and Molecular Biology. USA: Wadsworth Publishing Company.

6. Akhmanova A., Hoogenraad C.C. 2005. Microtubule plus-end-tracking proteins: mechanisms and functions. Curr. Opin. Cell Biol. 17: 47-54.

7. Akhmanova A., Steinmetz M.O. 2008. Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 309-322.

8. Andersen J., Wilkinson C., Mayor T., Mortensen P., Nigg E., Mann M. 2003. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426: 570574.

9. Arnal I., Heichette C., Diamantopoulos G.S., Chrétien D. 2004. CLIP-170/tubulin-curved oligomers coassemble at microtubule ends and promote rescues. Curr. Biol. 14:2086-2095.

10. Bacher C.P., Reichenzeller M., Athale C., Herrmann H., Eils R. 2004. 4-D single particle tracking of synthetic and proteinaceous microspheres reveals preferential movement of nuclear particles along chromatin poor tracks. BMC Cell Biol. 5: 45.

11. Bassell G.J., Zhang H., Byrd A.L., Femino A.M, Singer R.H., Taneja K.L., Lifshitz L.M, Herman I.M, and Kosik K.S. 1998. Sorting of beta-actin mRNA and protein to neurites and growth cones in culture. J. Neurosci. 18: 251-265.

12. Bieling P., Kandels-Lewis S., Telley I.A., van Dijk J., Janke C., Surrey T. 2008. CLIP-170 tracks growing microtubule ends by dynamically recognizing composite EBl/tubulin-binding sites. J. Cell Biol. 183: 1223-1233.

13. Bloom G.S., Endow S.A. 1995. Motor proteins 1: kinesins. Protein Profile. 2: 1105-1171.

14. Bloom G.S., Goldstein L.S. 1998. Cruising along microtubule highways: how membranes move through the secretory pathway. J. Cell Biol. 140: 1277-1280.

15. Borisy G.G., Rodionov V.I. 1999. Lessons from the melanophore. FASEB J. Suppl. 2: S221-224.

16. Broadus, J., Fuerstenberg, S., and Doe, C.Q. 1998. Staufen-dependent localization of prospero mRNA contributes to neuroblast daughter-cell fate. Nature. 391: 792-795.

17. Bu W., Su L.K. 2001. Regulation of microtubule assembly by human EB1 family proteins. Oncogene. 20:3185-3192.

18. Bu W., Su L.K. 2003. Characterization of functional domains of human EB1 family proteins. J. Biol. Chem. 278: 49721-49731.

19. Bulinski J.C., Gundersen G.G. 1991. Stabilization of post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis. BioEssays. 13: 285-293.

20. Bullock, S.L., Nicol, A., Gross, S.P., and Zicha, D. 2006. Guidance of bidirectional motor complexes by mRNA cargoes through control of dynein number and activity. Curr. Biol. 16: 1447-1452.

21. Burkhard J., Echeverri C., Nilson T., Vallee R. 1997. Overexpression of the dynamitim (p50) subunit of the dynactin complex disrupts dynein-dependent maintenance of membrane organelle distribution. J. Cell Biol. 139: 469-484.

22. Cambray-Deakin, M.A., Robson, S.J., Burgoyne, R.D. 1988. Colocalisation of acetylated microtubules, glial filaments, and mitochondria in astrocytes in vitro. Cell Motil. Cytoskeleton. 10: 438-449.

23. Cassimeris L. 2002. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers.Curr. Opin. Cell Biol. 14: 18-24.

24. Cassimeris L., Spittle C. 2001. Regulation of microtubule-associated proteins. Int. Rev. Cytol. 210: 163-226.

25. Caviston J.P., Holzbaur E.L. 2006. Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport. Trends Cell Biol. 16: 530-537.

26. Chang P. and Stearns T. 2000. 8 tubulin and 8 tubulin: two new human centrosomal tubulins reveal new aspects of centrosome structure and function. Nature Cell Biol. 2: 30-35.

27. Chang P., Giddings T.H.Jr., Winey M., Stearns T. 2003. Epsilon-tubulin is required for centriole duplication and microtubule organization. Nature Cell Biol. 5: 71-76.

28. Cheeseman, I.M., Desai, A. 2008. Molecular architecture of the kinetochore-microtubule interface. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9: 33-46.

29. Cole D.G., Chinn S.W., Wedaman K.P., Hall K., Vuong T., Scholey J.M. 1993. Novel heterotrimeric kinesin-related protein purified from sea urchin eggs. Nature. 18: 268-270.

30. Colin E., Zala D., Liot G., Rangone H., Borrell-Pagès M., Li X. J., Saudou F., Humbert S. 2008. Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons. EMBO J. 27: 2124-2134.

31. Coquelle F.M., Caspi M., Cordelières F.P., Dompierre J.P., Dujardin D.L., Koifman C., Martin P., Hoogenraad C.C., Akhmanova A., Galjart N., De Mey J.R., Reiner O. 2002. LIS1, CLIP-170's key to the dynein/dynactin pathway. Mol. Cell Biol. 22: 3089-3102.

32. Culver-Hanlon T., Lex S., Stephens A., Quintyne N., King S. 2006. A microtubule-binding domain in dynactin increases dynein processivity by skating along microtubules. Nat. Cell Biol. 8: 264-270.

33. Dammermann A., Merdes A. 2002. Aseembly of centrosomal proteins and microtubule organization depends on PCN-1. J. Cell Biol. 159: 255-266.

34. Davidkova G., Carroll R.C. 2007. Characterization of the role of microtubule-associated protein IB in metabotropic glutamate receptor-mediated endocytosis of AMP A receptors in hippocampus. J. Neurosci. 27: 13273-13278.

35. De Brabander M., De May J., Joniau M., Geuens G. 1997. Ultrastructural immunocytochemical distribution of tubulin in cultured cells treated with microtubule inhibitors. Cell Biol. Int. Rep. 1: 177-183.

36. De Matteis M.A., Morrow J.S. 2000. Spectrin tethers and mesh in the biosynthetic pathway. J. Cell. Sci. 113:2331-2343.

37. Deacon S.W., Serpinskaya A.S., Vaughan P.S., Lopez Fanarraga M., Vernos I., Vaughan K.T., Gelfand V.I. 2003. Dynactin is required for bidirectional organelle transport. J. Cell Biol. 160: 297-301.

38. DeGracia D.J., Rafols J.A., Morley S.J., Kayali F. 2006. Immunohistochemical mapping of total and phosphorylated eukaryotic initiation factor 4G in rat hippocampus following global brain ischemia and reperfusion. Neuroscience. 139: 1235-1248.

39. Delgehyr N., Silllibourne J., Born ens M. 2005. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function. J. Cell Sci. 118: 1565-1575.

40. Desnos C., Huet S., Darchen F. 2007. 'Should I stay or should I go?': myosin V function in organelle trafficking. Biol. Cell. 99: 411-423.

41. Dictenberg J., Zimmerman W., Sparks C., Young A., Vidair C., Zheng Y., Carrington W., Fay F., Doxey S. 1998. Pericentrin and y-tubulin form a protein complex and are organized into a novel lattice at the centrosome. J. Cell Biol. 141: 163-174.

42. Dictenberg, J.B., Swanger, S.A., Antar, L.N., Singer, R.H., and Bassell, G.J. 2008. A direct role for FMRP in activity-dependent dendritic mRNA transport links filopodial-spine morphogenesis to fragile X syndrome. Dev. Cell. 14: 926-939.

43. Didiot M.C., Tian Z., Schaeffer C., Subramanian M., Mandel J.L., Moine H. 2008. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Res. 36: 4902-4912.

44. Dimitrov A., Quesnoit M., Moutel S., Cantaloube I., Poiis C., Perez F. 2008. Detection of GTP-tubulin conformation in vivo reveals a role for GTP remnants in microtubule rescues. Science. 322: 1353-1356.

45. Dixit R., Barnett B., Lazarus J.E., Tokito M., Goldman Y.E., Holzbaur E.L. 2009. Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106: 492-497.

46. Dragestein K.A., van Cappellen W.A., van Haren J., Tsibidis G.D., Akhmanova A., Knoch T.A., Grosveld F., Galjart N. 2008. Dynamic behavior of GFP-CLIP-170 reveals fast protein turnover on microtubule plus ends. J. Cell Biol. 180: 729-737.

47. Draviam V.M., Shapiro I., Aldridge B., Sorger P.K. 2006. Misorientation and reduced stretching of aligned sister kinetochores promote chromosome missegregation in EB1- or APC-depleted cells. EMBO J. 25: 2814-2827.

48. Drewes G., Ebneth A., Mandelkow E. 1998. MAPs, MAPKs and microtubule dynamics. Trends Biochem. Sci. 23: 307-311.

49. Dujardin D., Wacker U.I., Moreau A., Schroer T.A., Rickard J.E., De Mey J.R. 1998. Evidence for a role of CLIP-170 in the establishment of metaphase chromosome alignment. J. Cell Biol. 141: 849-862.

50. Eliscovich, C., Peset, I., Vernos, I., and Mendez, R. 2008. Spindle-localized CPE-mediated translation controls meiotic chromosome segregation. Nat. Cell Biol. 10: 858-865.

51. Faulkner N.E., Dujardin D.L., Tai C.Y., Vaughan K.T., O'Connell C.B., Wang Y., Vallee R.B. 2000. A role for the lissencephaly gene LIS1 in mitosis and cytoplasmic dynein function. Nat. Cell Biol. 2: 784-791.

52. Feng Y., Olson E.C., Stukenberg P.T., Flanagan L.A., Kirschner M.W., Walsh C.A. 2000. LIS1 regulates CNS lamination by interacting with mNudE, a central component of the centrosome. Neuron. 28: 665-679.

53. Ferrandon D., Elphick L., Niisslein-Volhard C., St Johnston D. 1994. Staufen protein associates with the 3'UTR of bicoid mRNA to form particles that move in a microtubule-dependent manner. Cell. 79: 1221-1232.

54. Fujimura K., Katahira J., Kano F., Yoneda Y., Murata M. Microscopic dissection of the process of stress granule assembly. 2009. Biochim. Biophys. Acta. 1793: 1728-1737.

55. Fukata M., Watanabe T., Noritake J., Nakagawa M., Yamaga M., Kuroda S., Matsuura Y., Iwamatsu A., Perez F., Kaibuchi K. 2002. Racl and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 109: 873-85.

56. Fumoto K., Hoogenraad C.C., Kikuchi A. 2006. GSK-3beta-regulated interaction of BICD with dynein is involved in microtubule anchorage at centrosome. EMBO J. 25: 5670-5682.

57. Gauger A.K., Goldstein L.S. 1993. The Drosophila kinesin light chain. Primary structure and interaction with kinesin heavy chain. J. Biol. Chem. 268: 13657-13666.

58. Gindhart J.G., Goldstein L.S. 1996. Tetratrico peptide repeats are present in the kinesin light chain. Trends Biochem. Sci. 21: 52-53.

59. Goodson H.V., Skube S.B., Stalder R., Valetti C., Kreis T.E., Morrison E.E., Schroer T.A. 2003. CLIP-170 interacts with dynactin complex and the APC-binding protein EB1 by different mechanisms. Cell Motil. Cytoskeleton. 55: 156-173.

60. Grishchuk E.L., Mcintosh J.R. 2006. Microtubule depolymerization can drive poleward chromosome motion in fission yeast. EMBO J. 25: 4888-4896.

61. Gross S.P., Tuma M.C., Deacon S.W., Serpinskaya A.S., Reilein A.R., Gelfand V.l. 2002. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J. Cell Biol. 156: 855-865.

62. Gundersen G.G., Kim I., Chapin C.J. 1994. Induction of stable microtubules in 3T3 fibroblasts by TGF-beta and serum. J. Cell Sei. 107: 645-659.

63. Gyoeva F.K., Bybikova E.M., Minin A.A. 2000. An isoform of kinesin light chain specific for the Golgi complex. J. Cell Sei. 113: 2047-2054.

64. Gyoeva F.K., Sarkisov D.V., Khodjakov A.L., Minin A.A. 2004. The tetrameric molecule of conventional kinesin contains identical light chains. Biochemistry. 43: 13525-13531.

65. Harada A., Takei Y., Kanai Y., Tanaka Y., Nonaka S., Hirokawa N. 1998. Golgi vesiculation and lysosome dispersion in cell lacking cytoplasmic dynein. J. Cell Biol. 141: 51-59.

66. Hayashi I., Ikura M. 2003. Crystal structure of the amino-terminal microtubule-binding domain of end-binding protein 1 (EB1). J Biol. Chem. 278:36430-36434.

67. Hayashi I., Plevin M.J., Ikura M. 2007. CLIP-170 autoinhibition mimics intermolecular interactions with pl50Glued or EB1. Nat. Struct. Mol. Biol. 14: 980-981.

68. Hayashi I., Wilde A., Mal T.K., Ikura M. 2005. Structural basis for the activation of microtubule assembly by the EB1 and pl50Glued complex. Mol. Cell. 19:449-460.

69. Heinzer S., Wörz S., Kalla C., Rohr K., Weiss M. 2008. A model for the self-organization of exit sites in the endoplasmic reticulum. J. Cell Sei. 121: 55-64.

70. Hirokawa N. 2006. mRNA transport in dendrites: RNA granules, motors, and tracks. J. Neurosci. 26:7139-7142.

71. Holleran E.A., Ligon L.A., Tokito M., Stankewich M.C. Morrow J.S., Holzbaur E.L. 2001. Beta III spectrin binds to the Arpl subunit of dynactin. J. Biol. Chem. 276: 36598-36605.

72. Holzbauer, E.L.F. and Vallee, R.B. 1994. Dyneins: molecular structure and cellular function, Annu. Rev. Cell Biol. 10: 339-372.

73. Honnappa S., John C.M., Kostrewa D., Winkler F.K., and Steinmetz M.O. 2005. Structural insights into the EB1-APC interaction. EMBO J. 24: 261-269.

74. Honnappa S., Okhrimenko O., Jaussi R., Jawhari H., Jelesarov I., Winkler F.K., Steinmetz M.O. 2006. Key interaction modes of dynamic +TIP networks. Mol. Cell. 23: 663-671.

75. Hoogenraad C.C., Akhmanova A., Grosveld F., De Zeeuw C.I., Galjart N. 2000. Functional analysis of CLIP-115 and its binding to microtubules. J. Cell Sci. 113: 2285-2297.

76. Hoogenraad C.C., Wulf P., Schiefermeier N., Stepanova T., Galjart N., Small J.V., Grosveld F., de Zeeuw C.I., Akhmanova A. 2003. Bicaudal D induces selective dynein-mediated microtubule minus end-directed transport. EMBO J. 22: 6004-6015.

77. Hook P., Vallee R.B. 2006. The dynein family at a glance. J. Cell Sci. 119: 4369-4371.

78. Kanai, Y., Dohmae, N., and Hirokawa, N. 2004. Kinesin transports RNA: isolation and characterization of an RNA-transporting granule. Neuron. 43: 513-525.

79. Karki S., Holzbaur E.L. 1999. Cytoplasmic dynein and dynactin in cell division and intracellular transport. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 45-53.

80. Kashina A., Rodionov V. 2005. Intracellular organelle transport: few motors, many signals. Trends Cell Biol. 15:396-398.

81. Kashina A.S., Semenova I.V., Ivanov P.A., Potekhina E.S., Zaliapin I., Rodionov V.I. 2004. Protein kinase A, which regulates intracellular transport, forms complexes with molecular motors on organelles. Curr. Biol. 14: 1877-1881.

82. Kayali F., Montie H.L., Rafols J.A., DeGracia D.J. 2005. Prolonged translation arrest in reperfused hippocampal cornu Ammonis 1 is mediated by stress granules. Neuroscience. 134: 1223-1245.

83. Kedersha N., Anderson P. 2002. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochem. Soc. Trans. 30: 963-969.

84. Kedersha N., Chen S., Gilks N., Li W., Miller I.J., Stahl J., Anderson P. 2002. Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deflcient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules. Mol. Biol. Cell. 13: 195-210.

85. Kedersha N., Tisdale S., Hickman T., Anderson P. 2008. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 448: 521-552.

86. Kedersha N.L., Gupta M., Li W., Miller I., Anderson P. 1999. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J. Cell Biol. 147: 1431-1442.

87. Khodjakov A., Lizunova E.M., Minin A.A., Koonce M.P., Gyoeva F.K. 1998. A specific light chain of kinesin associates with mitochondria in cultured cells. Mol. Biol. Cell. 9: 333-343.

88. Kim H., Ling S., Rogers G., Kural C., Selvin P., Rogers S., Gelfand V. 2007. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport. J. Cell Biol. 176: 641-651.

89. King S.J., Schroer T.A. 2000. Dynactin increases the processivity of the cytoplasmic dynein motor. Nat. Cell Biol. 2: 20-24.

90. Kirschner M.W., Mitchison T. 1986. Microtubule dynamics. Nature. 324: 621.

91. Klotz A., Rutberg M., Denoulet P., Wallin M. 1999. Polyglutamylation of atlantic cod tubulin: immunochemical localization and possible role in pigment granule transport. Cell Motil. Cytoskeleton. 44: 263-273.

92. Klymkowsky M.W., Bachant J.B., Domingo A. 1989. Functions of intermediate filaments. Cell Motil. Cytoskeleton. 4: 309-331.

93. Kolobova E., Efimov A., Kaverina I., Rishi A.K., Schrader J.W., Ham A.-J., Larocca M.C., Goldenring J.R. 2009. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR-1 with RNA stress granules. Exp. Cell Res. 315: 542-555.

94. Komarova Y., Lansbergen G., Galjart N., Grosveld F., Borisy G.G., and Akhmanova A. 2005. EB1 and EB3 control CLIP dissociation from the ends of growing microtubules. Mol. Biol. Cell 16: 5334-5345.

95. Komarova Y.A., Akhmanova A.S., Kojima S., Galjart N., Borisy G.G. 2002a. Cytoplasmic linker proteins promote microtubule rescue in vivo. J. Cell Biol. 159: 589-599.

96. Komarova Y.A., Vorobjev I.A., Borisy G.G. 2002b. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. J. Cell Sci. 115:3527-3539.

97. Kreitzer G., Liao G., Gundersen G.G. 1999. Detyrosination of tubulin regulates the interaction of intermediate filaments with microtubules in vivo via a kinesin-dependent mechanism. Mol. Biol. Cell. 10: 1105-1118.

98. Kuznetsov S.A., Langford G.M., Weiss D.G. 1992. Actin-dependent organelle movement in squid axoplasm. Nature. 356: 722-725.

99. Ma S., Chisholm R.L. 2002. Cytoplasmic dynein-associated structures move bidirectionally in vivo. J. Cell Sci. 115: 1453-1460.

100. MacRae T.H. 1997. Tubulin post-translational modifications—enzymes and their mechanisms of action. Eur. J. Biochem. 244: 265-278.

101. Maiato H., Rieder C.L., Khodjakov A. 2004. Kinetochore-driven formation of kinetochore fibers contributes to spindle assembly during animal mitosis. J. Cell Biol. 167: 831-840.

102. Manna T., Honnappa S., Steinmetz M.O., Wilson L. 2008. Suppression of microtubule dynamic instability by the +TIP protein EB1 and its modulation by the CAP-Gly domain of pl50glued. Biochemistry. 47: 779-786.

103. Martin M., Iyadurai S.J., Gassman A., Gindhart J.G., Hays T.S., Saxton W.M. 1999. Cytoplasmic dynein, the dynactin complex, and kinesin are interdependent and essential for fast axonal transport. Mol. Biol. Cell. 10: 3717-28.

104. Miller P.M., Folkmann A.W., Maia A.R., Efimova N., Efimov A., Kaverina I. 2009. Golgi-derived CLASP-dependent microtubules control Golgi organization and polarized trafficking in motile cells. Nat. Cell Biol. 11: 1069-1080.

105. Mimori-Kiyosue Y., Shiina N., Tsukita S. 2000. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr. Biol. 10: 865-868.

106. Mimori-Kiyosue Y., Tsukita S. 2003. "Search-and-capture" of microtubules through plus-end-binding proteins (+TIPs). J. Biochem. 134: 321-326.

107. Minin A. A. 1997. Dispersal of Golgi apparatus in nocodazole-treated fibroblasts is a kinesin-driven process. J. Cell Sci. 110: 2495-2505.

108. Minin A.A., Kulik A.V., Gyoeva F.K., Li Y., Goshima G., Gelfand V.I. 2006. Regulation of mitochondria distribution by RhoA and formins. J. Cell Sci. 119: 659-670.

109. Mishima M., Maesaki R., Kasa M., Watanabe T., Fukata M., Kaibuchi K., Hakoshima T. 2007. Structural basis for tubulin recognition by cytoplasmic linker protein 170 and its autoinhibition. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 104: 10346-10351.

110. Mitchison T., Kirschner M. 1984. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312: 237-242.

111. Mizuno M., Singer S.J. 1994. A possible role for stable microtubules in intracellular transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. J. Cell Sci. 107: 1321-1331.

112. Moeller B.J., Cao Y., Li C.Y., Dewhirst M.W. 2004. Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules. Cancer Cell. 5: 429-441.

113. Montie H.L., Kayali F., Haezebrouck A.J., Rossi N.F., Degracia D.J. 2005. Renal ischemia and reperfusion activates the elF 2 alpha kinase PERK. Biochim. Biophys. Acta. 1741: 314324.

114. Moore A., Wordeman L. 2004. The mechanism, function and regulation of depolymerizing kinesins during mitosis. Trends Cell Biol. 14: 537-546.

115. Morrison E.E. 2007. Action and interactions at microtubule ends. Cell Mol. Life Sci. 64: 307317.

116. Muller M.J., Klumpp S., Lipowsky R. 2008. Tug-of-war as a cooperative mechanism for bidirectional cargo transport by molecular motors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105: 46094614.

117. Nagasaki T., Liao G., Gundersen G.G. 1994. Isolated plasma membranes induce the loss of oriented detyrosinated microtubules and other contact inhibition-like responses in migrating NRK cells. J. Cell Sci. 107: 3413-3423.

118. Nakagawa H., Koyama K., Murata Y., Morito M., Akiyama T., Nakamura Y. 2000. EB3, a novel member of the EB1 family preferentially expressed in the central nervous system, binds to a CNS-specific APC homologue. Oncogene. 19: 210-216.

119. Nielsen F.C., Nielsen J., Kristensen M.A., Koch G., Christiansen J. 2002. Cytoplasmic trafficking of IGF-II mRNA-binding protein by conserved KH domains. J. Cell Sci. 115: 2087-2097.

120. Niethammer M., Smith D.S., Ayala R., Peng J., Ko J., Lee M.S., Morabito M., Tsai L.H. 2000. NUDEL is a novel Cdk5 substrate that associates with LIS1 and cytoplasmic dynein. Neuron. 28:697-711.

121. Nogales E., Wang H.W. 2006. Structural intermediates in microtubule assembly and disassembly: how and why? Curr. Opin. Cell Biol. 18: 179-184.

122. Ogawa F., Kasai M., Akiyama T. 2005. A functional link between Disrupted-In-Schizophrenia 1 and the eukaryotic translation initiation factor 3. Biochem. Biophys. Res. Commun. 338: 771-776.

123. Ohn T., Kedersha N., Hickman T., Tisdale S., Anderson P. 2008. A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly. Nat. Cell Biol. 10: 1224-1231.

124. Perez F., Diamantopoulos G.S., Stalder R., Kreis T.E. 1999. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 96: 517-527.

125. Pierre P., Scheel J., Rickard J.E. and Kreis T.E. 1992. CLIP-170 links endocytic vesicles to microtubules. Cell. 70: 887-900.

126. Raff E.C., Fackenthal J.D., Hutchens J.A., Hoyle H.D., Turner F.R. 1997. Microtubule architecture specified by a B-tubulin isoform. Science. 275: 70-73.

127. Rickard J.E. and Kreis T.E. 1996. CLIPs for organelle-microtubule interactions. Trends Cell Biol. 6:178-183.

128. Rickard J.E., Kreis T.E. 1990. Identification of a novel nucleotide-sensitive microtubule-binding protein in HeLa cells. J. Cell Biol. 110: 1623-1633.

129. Rieder C.L., Alexander S.P. 1990. Kinetochores are transported poleward along a single astral microtubule during chromosome attachment to the spindle in newt lung cells. J. Cell Biol. 110:81-95.

130. Rodionov V.I., Gyoeva F.K., Tanaka E., Bershadsky A.D., Vasiliev J.M., Gelfand V.I. 1993. Microtubule-dependent control of cell shape and pseudopodial activity is inhibited by the antibody to kinesin motor domain. J. Cell Biol. 123: 1811-1820.

131. Rodionov V.I., Hope A.J., Svitkina T.M., Borisy G.G. 1998. Functional coordination of microtubule-based and actin-based motility in melanophores. Curr. Biol. 8: 165-168.

132. Rodionov V.I., Nadezhdina E. and Borisy G.G. 1999. Centrosomal control of microtubule dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 115-120.

133. Roegiers, F., and Jan, Y.N. 2000. Staufen: a common component of mRNA transport in oocytes and neurons? Trends Cell Biol. 10: 220-224.

134. Rogalski A.A., Singer S.J. 1984. Associations of elements of the Golgi apparatus with microtubules. J. Cell Biol. 99: 1092-1100.

135. Rogers S.L., Gelfand V.I. 1998. Myosin cooperates with microtubule motors during organelle transport in melanophores. Curr. Biol. 8: 161-164.

136. Rogers S.L., Karcher R.L., Roland J.T., Minin A.A., Steffen W., Gelfand V.I. 1999. Regulation of melanosome movement in the cell cycle by reversible association with myosin V. J. Cell Biol. 146: 1265-1276.

137. Rom, I., Faicevici, A., Almog, O., and Neuman-Silberberg, F.S. 2007. Drosophila Dynein light chain (DDLC1) binds to gurken mRNA and is required for its localization. Biochim. Biophys. Acta. 1773: 1526-1533.

138. Rosenbaum J.L., Moulder J.E., Ringo D.L. 1969. Flagellar elongation and shortening in Chlamydomonas. The use of cycloheximide and colchicine to study the synthesis and assembly of flagellar proteins. J. Cell Biol. 41: 600-619.

139. Roze E., Saudou F., Caboche J. 2008. Pathophysiology of Huntington's disease: from huntingtin functions to potential treatments. Curr. Opin. Neurol. 21: 497-503.

140. Ruggiu M., Speed R, Taggart M., McKay S.J., Kilanowski F., Saunders P., Dorin J., Cooke H.J. 1997. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis. Nature. 389: 73-77.

141. Sandblad L., Busch K.E., Tittmann P., Gross H., Brunner D., Hoenger A. 2006. The Schizosaccharomyces pombe EB1 homolog Mal3p binds and stabilizes the microtubule lattice seam. Cell. 127: 1415-1424.

142. Santama N., Er C.P.N., Ong L.L., Yu H. 2004. Distribution and functions of kinectin isoforms. J. Cell Sci. 117: 4357-4369.

143. Sasaki S., Shionoya A., Ishida M., Gambello M.J., Yingling J., Wynshaw-Boris A., Hirotsune S.A. 2000. LISl/NUDEL/cytoplasmic dynein heavy chain complex in the developing and adult nervous system. Neuron. 28: 681-696.

144. Saxton W.M., Stemple D.L., Leslie R.J., Salmon E.D., Zavortink M., Mcintosh J.R. 1984. Tubulin dynamics in cultured mammalian cells. J. Cell Biol. 99: 2175-2186.

145. Scheel J., Kreis T.E. 1991. Motor protein independent binding of endocytic carrier vesicles to microtubules in vitro. J. Biol. Chem. 266: 18141-18148.

146. Scholey J.M. 1996. Kinesin-II, a membrane traffic motor in axons, axonemes, and spindles. J. Cell Biol. 133: 1-4.

147. Scholz D., Baicu C.F., Tuxworth W.J., Xu L., Kasiganesan H., Menick D.R., Cooper G. 4th. 2008. Microtubule-dependent distribution of mRNA in adult cardiocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294: HI 135-1144.

148. Schroer T.A. 1994. Structure, function and regulation of cytoplasmic dynein. Curr. Opin. Cell Biol. 6: 69-73.

149. Schroer T.A. Dynactin. 2004. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20: 759-779.

150. Schroer T.A., Sheetz M.P. 1991. Two activators of microtubule-based vesicle transport. J. Cell Biol. 115: 1309-1318.

151. Schulze E., Kirschner M. 1988. New features of microtubule behaviour observed in vivo. Nature. 334: 356-359.

152. Schuyler S.C., Pellman D. 2001. Microtubule "plus-end-tracking proteins": The end is just the beginning. Cell. 105: 421-424.

153. Semenova I., Burakov A., Berardone N., Zaliapin I., Slepchenko B., Svitkina T., Kashina A., Rodionov V. 2008. Actin dynamics is essential for myosin-based transport of membrane organelles. Curr Biol. 18: 1581-1586.

154. Shelden E., Wadsworth P. 1993. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. J. Cell Biol. 120: 935-945.

155. Skoufias D.A., Burgess T.L., Wilson L. 1990. Spatial and temporal colocalization of the Golgi apparatus and microtubules rich in detyrosinated tubulin. J. Cell Biol. Ill: 1929-1937.

156. Slep K.C., Vale R.D. 2007. Structural basis of microtubule plus end tracking by XMAP215, CLIP-170, and EB1. Mol. Cell. 27: 976-991.

157. Souquere S., Mollet S., Kress M., Dautry F., Pierron G., Weil D. 2009. Unravelling the ultrastructure of stress granules and associated P-bodies in human cells. J. Cell Sci. 122: 3619-3626.

158. Steinmetz M.O., Akhmanova A. 2008. Capturing protein tails by CAP-Gly domains. Trends Biochem. Sci. 33: 535-545.

159. Stenoien D.L., Brady S.T. 1997. Immunochemical analysis of kinesin light chain function. Mol. Biol. Cell. 8: 675-689.

160. Su L.K., Burrell M., Hill D.E., Gyuris J., Brent R., Wiltshire R., Trent J., Vogelstein B., Kinzler K.W. 1995. APC binds to the novel protein EB1. Cancer Res. 55: 2972-2977.

161. Tai C.Y., Dujardin D.L., Faulkner N.E, Vallee R.B. 2002. Role of dynein, dynactin, and CLIP-170 interactions in LIS1 kinetochore function. J. Cell Biol. 156: 959-968.

162. Takahashi M., Yamagiwa A., Nishimura T., Mukai H., Ono Y. 2002. Centrosomal proteins CG-NAP and kendrin provide microtubule nucleation sites by anchoring gamma-tubulin ring complex. Mol. Biol. Cell. 13: 3235-3245.

163. Tanaka E., Ho T., Kirschner M.W. 1995. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128: 139-155.

164. Tanenbaum M.E., Galjart N., van Vugt M.A., Medema R.H. 2006. CLIP-170 facilitates the formation of kinetochore-microtubule attachments. EMBO J. 25: 45-57.

165. Thomas M.G., Martinez Tosar L.J., Loschi M., Pasquini J.M., Correale J., Kindler S., Boccaccio G.L. 2005. Staufen recruitment into stress granules does not affect early mRNA transport in oligodendrocytes. Mol. Biol. Cell. 16: 405-420.

166. Tirnauer J.S., Bierer B.E. 2000. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. J. Cell Biol. 149: 761-766.

167. Tirnauer J.S., Canman J.C., Salmon E.D., Mitchison T.J. 2002a. EB1 targets to kinetochores with attached, polymerizing microtubules. Mol. Biol. Cell. 13: 4308-4316.

168. Tirnauer J.S., Grego S., Salmon E.D., Mitchison T.J. 2002b. EB1-microtubule interactions in Xenopus egg extracts: role of EB1 in microtubule stabilization and mechanisms of targeting to microtubules. Mol. Biol. Cell. 13: 3614-3626.

169. Tirnauer J.S., O'Toole E., Berrueta L., Bierer B.E., Pellman D. 1999. Yeast Bimlp promotes the Gl-specific dynamics of microtubules. J. Cell Biol. 145: 993-1007.

170. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354.

171. Toyoshima I., Yu H., Steuer E.R., Sheetz M.P. 1992. Kinectin, a major kinesin-binding protein on ER. J. Cell Biol. 118: 1121-1131.

172. Tsai N.-P., Tsui N.-C., Wei L.-N. 2009. Dynein motor contributes to stress granule dynamics in primary neurons. Neuroscience 159: 647-656.

173. Tuma M.C., Gelfand Y.I. 1999. Molecular mechanisms of pigment transport in melanophores. Pigment Cell Res. 12:283-294.

174. Vale R.D. 2003. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112: 467-480.

175. Vale R.D., Fletterick R.J. 1997. The design plan of kinesin motors. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 745-777.

176. Valetti C., Wetzel D.M., Schrader M., Hasbani M.J., Gill S.R., Kreis T.E., and Schroer T.A. 1999. Role of dynactin in endocytic traffic: effects of dynamitin overexpression and colocalization with CLIP-170. Mol. Biol. Cell. 10:4107-4120.

177. Vallee R.B., Williams J.C., Varma D., Barnhart L.E. 2004. Dynein: An ancient motor protein involved in multiple modes of transport. J. Neurobiol. 58: 189-200.

178. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Komm S.G., Olshevskaja L.V. 1970. Effect of colcemid on the locomotory behaviour of fibroblasts. J. Embryol. Exp. Morphol. 24: 625-640.

179. Vaughan K.T. 2004. Surfing, regulating and capturing: are all microtubule-tip-tracking proteins created equal? Trends Cell Biol. 14: 491-496.

180. Vaughan K.T., Tynan S.H., Faulkner N.E., Echeverri C.J. and Vallee R.B.1999. Colocalization of cytoplasmic dynein with dynactin and CLIP-170 at microtubule distal ends. J. Cell Sci. 112: 1437-1447.

181. Vaughan P.S., Miura P., Henderson M., Byrne B., and Vaughan, K.T. 2002. A role for regulated binding ofpl50(Glued) to microtubule plus ends in organelle transport. J. Cell Biol. 158: 305-319.

182. Verde F., Dogterom M., Stelzer E., Karsenti E., Leibler S. 1992. Control of microtubule dynamics and length by cyclin A- and cyclin B-dependent kinases in Xenopus egg extracts. J. Cell Biol. 118: 1097-1108.

183. Verhey K.J., Meyer D., Deehan R., Blenis J., Schnapp B.J., Rapoport T.A., Margolis B. 2001. Cargo of kinesin identified as JIP scaffolding proteins and associated signaling molecules. J. Cell Biol. 152:959-970.

184. Villace, P., Marion, R.M., and Ortin, J. 2004. The composition of Staufen-containing RNA granules from human cells indicates their role in the regulated transport and translation of messenger RNAs. Nucl. Acids Res. 32: 2411-2420.

185. Vitre B., Coquelle F.M., Heichette C., Gamier C., Chrétien D., Arnal I. 2008. EB1 regulates microtubule dynamics and tubulin sheet closure in vitro. Nat. Cell Biol. 10: 415-421.

186. Vorobjev I.A,, Nadezhdina E.S. 1987. The centrosome and its role in the organization of microtubules. Int. Rev. Cytol. 106: 227-293.

187. Wadsworth P. 1999. Regional regulation of microtubule dynamics in polarized, motile cells. Cell Motil. Cytoskeleton. 42: 48-59.

188. Wadsworth P., McGrail M. 1990. Interphase microtubule dynamics are cell type-specific. J. Cell Sci. 95: 23-32.

189. Walczak C.E., Heald R. 2008. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. Int. Rev. Cytol. 265: 111-158.

190. Waterman-Storer C.M., Karki S., and Holzbaur E.L. 1995. The pl50Glued component of the dynactin complex binds to both microtubules and the actin-related protein centractin (Arp-1). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 1634-1638.

191. Waterman-Storer C.M., Karki S.B., Kuznetsov S.A., Tabb J.S., Weiss D.G., Langford G.M., Holzbaur E.L. 1997. The interaction between cytoplasmic dynein and dynactin is required for fast axonal transport. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 12180-12185.

192. Waterman-Storer C.M., Salmon E. 1999. Positive feedback interactions between microtubule and actin dynamics during cell motility. Curr. Opin. Cell Biol. 11: 61-67.

193. Waterman-Storer C.M., Salmon E.D. 1998. Endoplasmic reticulum membrane tubules are distributed by microtubules in living cells using three distinct mechanisms. Curr. Biol. 8: 798806.

194. Waterman-Storer C.M., Salmon W.C., Salmon E.D. 2000. Feedback interactions between cell-cell adherens junctions and cytoskeletal dynamics in newt lung epithelial cells. Mol. Biol. Cell. 11:2471-2483.

195. Watson P. and Stephens D.J. 2006. Microtubule plus-end loading of pl50(Glued) is mediated by EB1 and CLIP-170 but is not required for intracellular membrane traffic in mammalian cells. J. Cell Sci. 119: 2758-2767.

196. Webster D.R., Wehland J., Weber K., Borisy G.G. 1990. Detyrosination of alpha tubulin does not stabilize microtubules in vivo. J. Cell Biol. 111:113-122.

197. Weil, T.T., Forrest, K.M, and Gavis, E.R. 2006. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev. Cell. 11: 251-262.

198. Weisbrich A., Honnappa S., Jaussi R., Okhrimenko O., Frey D., Jelesarov I., Akhmanova A., Steinmetz M.O. 2007. Structure-function relationship of CAP-Gly domains. Nat. Struct. Mol. Biol. 14: 959-967.

199. Westermann S., Wang H.W., Avila-Sakar A., Drubin D.G., Nogales E., Barnes G. 2006. The Daml kinetochore ring complex moves processively on depolymerizing microtubule ends. Nature. 440: 565-569.

200. Wharton R.P., Struhl G. 1989. Structure of the Drosophila BicaudalD protein and its role in localizing the the posterior determinant nanos. Cell. 59: 881-892.

201. Wieland G., Orthaus S., Ohndorf S., Diekmann S., Hemmerich P. 2004. Functional complementation of human centromere protein A (CENP-A) by Cse4p from Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 24: 6620-6630.

202. Wilczynska A., Aigueperse C., Kress M., Dautry F., Weil D. 2005. The translational regulator CPEB1 provides a link between dcpl bodies and stress granules. J. Cell Sci. 118: 981-992.

203. Wittmann T., Waterman-Storer C.M. 2001. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J. Cell Sci. 114: 3795-3803.

204. Wu R.C., Qin J., Yi P., Wong J., Tsai S.Y., Tsai M.J., O'Malley B.W. 2004. Selective phosphorylations of the SRC-3/AIB1 coactivator integrate genomic reponses to multiple cellular signaling pathways. Mol. Cell. 15: 937-949.

205. Wynshaw-Boris A. 2007. Lissencephaly and LIS1: insights into the molecular mechanisms of neuronal migration and development. Clin. Genet. 72: 296-304.

206. Yoon, Y.J., and Mowry, K.L. 2004. Xenopus Staufen is a component of a ribonucleoprotein complex containing Vgl RNA and kinesin. Development. 131: 3035-3045.

207. Yu C., York B., Wang S., Feng Q., Xu J., O'Malley B.W. 2007. An essential function of the SRC-3 coactivator in suppression of cytokine mRNA translation and inflammatory response. Mol. Cell. 25: 765-778.

208. Zaliapin I., Semenova I., Kashina A., Rodionov V. 2005. Multiscale trend analysis of microtubule transport in melanophores. Biophys J. 88: 4008-4016.

209. Zhai Y., Borisy G.G. 1994. Quantitative determination of the proportion of microtubule polymer present during the mitosis-interphase transition. J. Cell Sci. 107: 881-890.

Информация о работе

Ломакин, Алексей Юрьевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Роль динамики микротрубочек и структуры их сети в организации внутриклеточного транспорта - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы