Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение участия систем микротрубочек и актиновых филаментов в процессе движения фибробластов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение участия систем микротрубочек и актиновых филаментов в процессе движения фибробластов"

На правах рукописи

Добринских Евгения Александровна ии3054425

Изучение участия систем микротрубочек и актиновых филаментов в процессе движения фибробластов

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология.

автореферат диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003054425

Работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Доктор биологических наук, профессор, Воробьев Иван Андреевич Доктор биологических наук, профессор, Надеждина Елена Сергевна

Кандидат биологических наук, Александрова Антонина Юрьевна

Федеральное Государственное Учреждение Российский Кардиологический Научно-производственный Комплекс Росздрава, лаборатория клеточной подвижности НИИ Экспериментальной кардиологии РКНПК Росздрава.

Защита состоится 20 марта 2007 г. в 15.30 на заседании Диссертационного Совета Д501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет МГУ, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 16 февраля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Е.Н. Калистратова

Актуальность проблемы. Способность к направленному передвижению и поддержанию поляризованной формы является фундаментальным свойством животных клеток. На движении клеток основаны многие процессы в организме: морфогенетические миграции во время эмбрионального развития, передвижение нервных клеток при формировании нервной системы, хемотаксические перемещения клеток крови и иммунной системы и движение фибробластов в процессе заживления раны (Lauffenburger and Horwitz, 1996; Hangan et al., 1997; Monteli, 1999).

Движущаяся клетка обладает поляризованной формой - у нее выделяют передний (ведущий) край, выдвигающийся вперед в направлении движения клетки, стабильные боковые края и задний край (хвост), втягивающийся при движении клетки (Abercrombie, 1978; Cramer et al., 1997). Процесс движения клетки довольно долго изучался и изучается в различных лабораториях. Эти исследования позволили установить, что способность клетки к передвижению и поддержанию поляризации обеспечивается ее цитоскелетом - системами актиновых филаментов и микротрубочек (Васильев и др., 1973; Vasiliev, 1991; Mitchison and Cramer, 1995; Mogilner and Oster, 1996; Cramer et al., 1997; Pollard et al., 2000; Pantaloni et al., 2001).

В процессе движения клетки выделяют несколько фаз. Сначала в направлении движения клетки происходит выдвижение ламеллы - клетка удлиняется. Затем к новому положению ведущего края подтягивается тело клетки с ядром, и происходит вытягивание хвоста. Цикл завершается втягиванием хвоста (Wen-Tien Chen, 1981, Lauffenburger and Horwitz, 1996). Выдвижение ламеллы, инициирующее движение большинства клеток, происходит за счет полимеризации актиновых филаментов, и этот процесс регулируется рядом белков. Большинству типов клеток для направленного движения наряду с актиновой системой необходимы микротрубочки. Однако роль системы микротрубочек в этом процессе до конца не определена -считается, что при формировании ведущего края микротрубочки полимеризуются в направлении полимеризации актиновых филаментов, однако до сих пор не ясна их роль в процессе подтягивания тела клетки и втягивания хвоста. Относительно роли микротрубочек в движении клетки известно, что они участвуют в поддержании поляризованной формы фибробласта, организуют внутриклеточный транспорт, направляя перемещение органелл и везикул по ламелле к переднему краю клетки

(Rodionov et al, 1993; Bershadsky and Futerman, 1994; Wacker et al, 1997). При подавлении транспорта полярность клетки нарушается, и фибробласт перестает ползти (Rodionov et al, 1993).

Анализ литературных данных показал, что локомоция клеток изучалась в основном на фиксированных препаратах или с помощью цейтраферной съемки с существенными интервалами между кадрами, что не позволяет заметить всех изменений на ведущем крае. Так же известно, что системы микротрубочек и актиновых филаментов тесно взаимосвязаны для выполнения такой функции в клетке, как выдвижение ламеллоподии и дальнейшее движение, однако исследованию этой взаимосвязи на живых клетках уделялось очень небольшое внимание. В связи с этим, целью данной работы было прижизненное исследование динамических характеристик ведущего края фибробластов. А так же выяснить, какие элементы цитоскелета (системы микротрубочек и актиновых филаментов) и как влияют на динамические процессы, происходящие на ведущем крае. В работе были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать прижизненное поведение ведущего края фибробластов во времени.

2. Описать изменения морфологии клеток, систем микротрубочек и пучков микрофиламентов при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае с помощью BDM (2,3-бутандионмоноксим).

3. Изучить в динамике поведение ведущего края фибробластов при замедлении полимеризации актиновых филаментов.

4. Изучить динамические изменения поведения ведущего края фибробластов при деполимеризации микротрубочек.

5. Исследовать изменение поведения фибробластов под воздействием BDM при уже разрушенных микрофиламентах.

6. Изучить поведение клеток в ответ на действие BDM при деполимеризации микротрубочек и их восстановлении.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые было показано, что структура ведущего края фибробластов неоднородна. В его составе можно выделить активные области, на которых происходит выдвижение

ламеллоподий и их втягивание, и спокойные области. Втягивающаяся область может выдвигаться снова, а может стать спокойной областью. Спокойная область плоская, на ней не происходит ни втягивания, ни выдвижения края. Граница между активной и спокойной областями остается постоянной в секундной шкале времени. Стабильный край, в отличие от спокойной области на ведущем крае - всегда вогнутый, не имеет распластанной ламеллы и остается таковым в часовой шкале времени. Эти характеристики, по-видимому, универсальны для фибробластов. Они изменяются при различных цитостатических воздействиях.

Также впервые было показано, что без системы микротрубочек в клетке не происходит втягивание активного края.

Было проанализировано восстановление систем актиновых филаментов и микротрубочек в различных условиях. Показано постепенное перераспределение гипертрофированных актиновых пучков в цитоплазме клетки при снятии воздействия нокодазола в системы пучков (стресс-фибрилл) и ламеллярную сеть.

Полученные данные могут быть использованы в лекционных курсах, предназначенных для студентов и аспирантов, специализирующихся в области клеточной биологии.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на заседании кафедры клеточной биологии и гистологии 19 октября 2006 года. Результаты работы были представлены на научных конференциях: Всероссийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Россия, 2000; "40th American Society for Cell Biology Annual Meeting", San Francisco, USA, 2000; 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, August 31- September 4, 2002; "1-й Съезд Общества клеточной биологии", Санкт-Петербург, Россия, 2003; Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре», 17-19 октября. Санкт-Петербург, Россия. 2006

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура работы

Диссертация состоит из глав Введение, Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список литературы.

Материалы и методы

Клеточная культура. В качестве объекта исследования были использованы клетки перевивной линии Vero (фибробластоподобные клетки почки зеленой мартышки, полученные из коллекции клеточных культур Института цитологии РАН) и фибробластов ЗТЗ-Swiss (АТСС). Клетки культивировали при 37°С и 5% С02 в среде DMEM с добавлением HEPES 25 мМ ("ПанЭко", Россия) и 5% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина (100 мкг/мл). Клетки культивировали в течение суток, высевая их в низкой концентрации на покровные стекла (для экспериментов с фиксированными клетками) или в малые чашки Петри с вмонтированными в дно покровными стеклами (для прижизненных наблюдений).

Экспериментальные воздействия. BDM ("Sigma", США) добавляли в среду культивирования в конечной концентрации 20 мМ. Клетки фиксировали через 0, 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 минут воздействия и окрашивали для выявления микротрубочек и актиновых филаментов. Удаление BDM из среды культивирования (в экспериментах, где это было необходимо) производили двукратной сменой среды. Для деполимеризации микротрубочек в среду культивирования добавляли нокодазол ("Sigma", США) в конечной концентрации 4 мкг/мл. Двухчасовая инкубация клеток с нокодазолом приводила к полной деполимеризации микротрубочек. Через 2 ч нокодазол удаляли из среды культивирования путем трехкратной смены среды, и инкубировали клетки в среде без нокодазола в течение 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 мин. Прижизненные исследования проводили в присутствии нокодазола (4 мкг/мл) или BDM (20 мМ и 5 мМ) в среде культивирования. В ряде экспериментов исследовали последовательное воздействие нокодазола и BDM на клетки. Для этого добавляли BDM (20 мМ) в среду культивирования в момент удаления нокодазола (уже в первую смену среды) и проводили восстановление системы микротрубочек в его присутствии в течение 2, 4, 6, 10, 20, 30, 60 мин. Для исследования комплексного воздействия нокодазола и BDM оба вещества добавляли в среду культивирования последовательно - инкубировали клетки с нокодазолом (4 мкг/мл) в течение 2 ч, затем, не удаляя нокодазол, вводили BDM (20 мМ) и фиксировали клетки через 0,10, 20, 30, 60 мин и 24 ч. Для разрушения сети актиновых филаментов в среду культивирования добавляли латрункулин В (Calbiochem, США) в конечной

концентрации 5 пМ на 10 мин. Маточные растворы BDM, нокодазола и латрункулина В готовили, используя диметилсульфоксид (ДМСО). Использованные в экспериментах концентрации ДМСО составляли не более 1% и не влияли на состояние цитоскелета.

Прижизненные наблюдения. Анализ препаратов проводился на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse ТЕ200, с помощью объективов Nikon 40х/0.75 и Nikon 60х/1.4. Полученные изображения посылались в компьютер с помощью охлаждаемой ПЗС камеры CoolSnap HQ (RTE/CCD-1317К/2), управляемой программой Image-Pro Express (Media Cybernetics Inc., США). Экспозиция составляла 0.3 секунды, а интервал между кадрами - 30 и 10 секунд. Эквивалентный размер пиксела составлял при съемке с объективом 40х/0.75 - 3,2 дм и при съемке с объективом б0х/1.4 - 9,5 цм. Во время прижизненных наблюдений на поверхность культуральной среды наносили минеральное масло (Walgreens, США), Для уменьшения фотоповреждения клеток использовали оранжевый светофильтр (ОС-4). Во время наблюдений температура 35-37°С поддерживалась за счет нагрева объектива и держателя для камеры.

Иммунофлуоресцентные исследования. Клетки фиксировали 1,5% глютаровым альдегидом ("Merck", Германия) на фосфатном буфере PBS (pH 7,2) 10 минут. После фиксации клетки отмывали от глютарового альдегида путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Фиксированные клетки для экстракции обрабатывали 1% раствором Triton Х-100 (Sigma, США) на PBS в течение 1,5 ч. Для предотвращения фонового свечения клетки обрабатывали 3 раза по 10 минут 2% раствором NaBHi (Sigma, США) и отмывали путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Для выявления и анализа системы микротрубочек и актинового цитоскелета проводили двойную иммунофлуоресцентную окраску клеток антителами к ß-тубулину и фаллоидином. Клетки окрашивали фаллоидином, коньюгированным с FITC (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО), в разведении 1:16, a затем антителами к ß-тубулину (Amersham, США) в разведении 1:100. В качестве вторых антител использовали меченные флуорохромом Oregon green антитела (Molecular Probes, США) в разведении 1:100. Окраску каждым из трех антител проводили в течение 30 минут при 37°С. Избыток антител в каждом случае отмывали

путем трехкратной смены буфера PBS (по 10 мин каждая смена). Полученные препараты заключали в Moviol 4-88 (Sigma, США) и монтировали на предметных стеклах. Флюоресцентные препараты фотографировали на инвертированном Микроскопе Nikon Eclipse ТЕ200. Съемку проводили с помощью фаз о во контрастных объективов Nikon 100х/1.25 и Nikon 60х/1.4. Полученные изображения посылались в компьютер с помощью охлаждаемой ПЗС камеры CoolSnap HQ (RTE/CCD-1317К/2), управляемой программой WinWiew32 (Princeton Instruments Inc., США). Экспозиция составляла 1 секунду. Эквивалентный размер пиксела составлял при съемке с объективом 100х/1.25 -0,068 цм и при съемке с объективом б0х/1.4-0,105 цм.

Построение кимограмм, В программе MetaMorph (Universal Imaging, США) с помощью специального инструмента Kymograph производили построение кимограммы на каждую активную область ведущего края клетки в течение всего времени съемки. Ширина профиля составляла 200-300 пикселей. Зачем на килограммах обсчитывалось время выдвижения и амплитуда ламе л nono дни, глубина ламеллы (рис. 1). Эти характеристики просчитывались для каждой активной области а клетке в течение всего времени наблюдения. Затем значения усреднялись. Рис. 1. Анализ кимограмм.

На кимограмме представлено изменение поведения ведущего края клеток культуры Vero. Интервал между кадрами в фильме 1 сек Тонкая черная линия — амплитуда выдвижения ламеллоподии. Белая линия - время выдвижения ламеллоподии. Толстая черная линия - глубина ламеллы.

Анализ полученных данных. Обработка фотографий проводилась в программе

Adobe Photoshop (Adobe Inc., США). Полученные фильмы обрабатывались в программе Scion Image (Scion Corporation, США) и MetaMorph (Universal Imaging, США). Статистические данные обрабатывались в программах SigmaPlot (Jandel Scientific, США) и Statistics (StatSoft Inc., США). Достоверность отличий оценивалась по критерию Mann - Whitney (непараметрический анализ).

Результаты и обсуждение. Морфология анализируемых в данной работе клеток Vero соответствует классическому строению фибробласта (Abercrombie, 1978), При редком расположении на стекле клетки поляризованы и активно передвигаются. Их

В

движение описывается типичным локомоторным циклом: происходит выдвижение ламеллы, подтягивание тела клетки с ядром и втягивание хвоста. При этом клетка подтягивается к своему переднему краю и немного ошаривается. Затем цикл повторяется: клетка вновь вытягивает ламеллу и начинает распластываться. Отношение продольной и поперечной осей (фактор формы) клетки составляет в среднем 3:1. Система актиновых филаментов представлена двумя компонентами: на активном крае содержится достаточно большой пул актина, обеспечивающий выдвижение ламеллоподии, а в теле клетки присутствует небольшое количество актиновых филаментов, которые образуют стресс-фибриллы. Стресс-фибриллы в основном располагаются вдоль длинной оси клетки, однако присутствует и небольшое количество стресс-фибрилл, параллельных активному краю.

Микротрубочки в клетках Vero образуют радиальную сеть. Наиболее плотно микротрубочки располагаются около центросомы, которая является центром организации микротрубочек. Большая часть микротрубочек достигает края клетки, и практически все они остаются прямыми.

Морфометрический анализ динамических характеристик поведения ведущего края фибробластов. При описании поляризованной клетки принято выделять в ней ламеллу с ведущим краем, тело клетки и хвост. Ведущий край еще называют активным. Однако, практически все наблюдения за изменением ведущего края до настоящего времени были сделаны на фиксированных препаратах. Мы смогли более детально проследить изменения в структуре лидирующего края клетки с помощью видеосъемки с короткими интервалами между кадрами (10 секунд и меньше). Наблюдения показали, что сам ведущий край не однороден по своей структуре - в его составе можно выделить активную область, ira которой происходит выдвижение ламеллоподий и их втягивание, а так же может происходить раффлинг -выпячивание цитоплазмы вверх, а не параллельно субстрату (Abercrombie М., 1978). Втягивающаяся область может выдвигаться снова, а может стать спокойной областью. Спокойная область плоская, на ней не происходит ни втягивания, ни выдвижения края. Граница между активной и спокойной областями остается постоянной в секундной шкале времени. Стабильный край, в отличие от спокойной области на ведущем крае - всегда вогнутый, не имеет распластанной ламеллы и

остается таковым в часовой шкале времени. Ведущий край можно охарактеризовать следующими величинами - время жизни, длина, процент от периметра клетки. Ведущий край, если не происходит смена направления движения фибробласта, существует в клетке на протяжении довольно длительного периода времени, который может занимать час и больше, что соответствует данным литературы (Gail and Boone, 1970; Gail, 1972). К описанию активной области можно применить все те же параметры, но время существования этой области значительно меньше, чем ведущего края в целом, и составляет минуты. Так же к описанию активной области применимы дополнительные параметры - время выдвижения края и амплитуда колебаний выдвигающейся и втягивающейся ламеллоподии.

В качестве контроля использовали распластанные клетки на следующий день после посева в чистую среду. Как говорилось выше, эти клетки имеют строение типичное для фибробластов: есть одна ламелла с ведущим краем (реже клетки биполярны, т.е. имеют две ламеллы, отделенные довольно длинными стабильными краями), тело, ограниченное стабильными краями, и хвост. Клетки вытянуты - их фактор формы составляет в среднем 3:1. В экспериментах использовали гомогенную популяцию клеток со сходной площадью.

Ламелла с ведущим краем обычно занимает около половины (47%) от периметра клетки. Глубина ламеллы в среднем составляет около 20 цм. Ведущий край имеет выпуклую форму и ограничен вогнутыми стабильными краями. В клетках Vero существует разделение ламеллы на две зоны - быстрого и медленного ретроградного тока актина. На участке с быстрым током актина чаще всего происходит раффлинг. Активная область обычно занимает около 40% от ведущего края клетки. При этом длина активной области практически постоянна в течение

времени наблюдения (рис. 2).

| Рис. 2 График изменения длины активной области в

i & __

С Q.

е

время наблюдения, мин

! клетках ЗТЗ

Протяженность активной области в контроле и при деполимеризованных микротрубочках практически не изменяется во времени.

контроль

нокодазол ¡

Время жизни активной зоны в среднем составляет около 14 минут (таблица 1). Затем

активная зона, как правило, превращается в спокойную область, а активность

ламеллы перемещается в пределах ведущего края. Через некоторое время активность

в данной области может возобновиться. Так же на ведущем крае происходит два вида

периодических процессов: очень быстрые, не различимые глазом, но определяемые

на ким о грамме колебания плазматической мембраны, и более медленные

выдвижения и втягивания ламеллоподий (рис. 3). Время выдвижения ламеллоподии

в активной области занимает 1,07±0,37 мин. Средняя амплитуда (высота)

ламеллоподии составляет 7,бЗ±1,92 цм (таблица 1). Средняя площадь образующихся

ламеллоподий составляет 133,30±5,95 цм г.

Рис.3. Повеление ведущего края клеток культуры Vero,

а - интервал между кадрами 5 секунд. 6 - интервал между кадрами 1 секунда. На килограммах представлено поведение ведущего края фибробластов. Можно различить быстрые флуктуации плазматической мембраны (более темные участки килограммы) и более медленные выдвижения ламеллоподий. Видна глубокая ламел л а.

Масштабный отрезок по вертикали - 20 секунд, по горизонтали 10 |Ж,

Таким образом, мы смогли детально проанализировать поведение ведущего края фибробластов во времени. Так как использовали малые интервалы между кадрами, то нам удалось выявить ранее не описанную неоднородность строения ведущего края. Чтобы проверить, являются ли данные характеристики универсальными для фибробластов, мы взяли другую линию клеток - ЗТЗ-Swiss.

Контрольные клетки ЗТЗ-Swiss так же поляризованы и имеют ярко выраженную ламеллу с одной, реже двумя, активными областями на одном ведущем крае. Ламелла занимает около 48% от периметра клеток. Анализ поведения ведущего края этих фибробластов подтвердил универсальность выбранных нами характеристик для его описания в клетках культуры Vero. Протяженность активной области в клетках ЗТЗ-Swiss составляет около 46 % от протяженности ведущего края клетки (таблица 1). Протяженность активной области так же практически постоянна во времени (рис. 2). Во время наблюдения на ведущем крае в активной области клетки происходит формирование прямых коротких филоподий, образование ламеллоподий и некоторое смещение всей ламеллы вперед. Время жизни активной

области в контрольных клетках составляет 14,17 ± 1,67 мин. Анализ кимограмм показал, что время выдвижения ламеллоподии в активной области занимает 0,62±0,17 мин. Средняя амплитуда (высота) ламеллоподии составляет 3,14±0,94 рм (таблица 1).

Таблица 1. Морфометричсские характеристики поведения ведущего края

фибробластов в контроле.

Характеристика, (среднееЛв.О.) Vero, контроль ЗТЗ-Swiss, контроль

Периметр клетки, цм 208,08± 17,01 254,16*18,51

Протяженность ведущего края, цм. 95,69±10,88 121,66±12,09

Количество ведущих краев 1-2 1 -2

Протяженность активной области, цм 33,83±7,8 56,33±10,25

Суммарная протяженность активных областей, цм 36,63±6,81 70,2±8,45

Время жизни активной области, мин 14±1,7 14,17 ± 1,67

Глубина ламеллы, цм 19,09±2,39 13,42±3,21

Время выдвижения ламеллоподии, мин 1,07±0,37 0,62±0,17

Амплитуда выдвижения ламеллоподии, цм 7,63±1,92 3,14±0,94

Площадь ламеллоподий, цм1 133,30±5,.95 67,17±3,36

Многолетние исследования показали, что для выдвижения ламеллоподии и дальнейшего движения фибробластов необходимы системы актиновых филаментов, полимеризующихся под углом 70°, и микротрубочек. Однако, в свете выявленной нами неоднородности ведущего края, интересно выяснить,

как именно они влияют на динамику движения фибробластов? Для этого исследовалось поведение ламеллы с ведущим краем при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае, с помощью BDM, и деполимеризованных нокодазолом микротрубочках.

Эффект воздействия BDM на клетки Vero. В ответ на введение BDM в среду культивирования ламеллы клеток начинают втягиваться через 4 мин воздействия, и за 1 ч воздействия площадь клеток уменьшается примерно на 70% по сравнению с контролем (рис. 4). Отношение продольной и поперечной осей клетки (фактор формы) также изменяется - за 30 мин опо уменьшается до 1:1 (что соответствует ошаренной форме клетки) по сравнению с 3:1 в контроле.

время воздействия, мин

Рис. 4. Диаграмма изменения плошади клеток Vero при воздействии BDM.

Клетки начинают втягивать ламеялоподии через 5 мин после добавлении BDM в среду культивирования. Через 60 мин средняя площадь клеток уменьшается больше чем вдвое.

Через 2 минуты после добавления

BDM число стресс-фибрилл уменьшается, а оставшиеся становятся тоньше и короче. Таким образом, наблюдаемые нами изменения в клетках Vero на ранних сроках воздействия соответствуют описанным ранее {Cramer and Mitchison, 1995). Во многих клетках происходит образование звездчатых структур из актиновых пучков. К 30 мин воздействия происходит практически полная деполимеризация пучков актиновых филаментов: средняя длина пучков м икро фи л амен то в уменьшается втрое, до 4,53 ± 0,45 цм (в контроле -12,95 ± 1,03 |ím), а их количество снижается более чем в 10 раз (с 48 ± 1 в контроле до 4 ± 1). За 60 мин воздействия BDM система актиновых филаментов деполимеризуется практически полностью в 90% клеток. При этом на лидирующем крае клетки происходит быстрая деполимеризация акти ноной сети. Сеть микротрубочек под воздействием BDM не изменяется, однако вследствие поджатия клеток на поздних сроках инкубации становится практически невозможно проследить за отдельными микротрубочками. При удалении В DM из среды культивирования клетки вновь распластываются и образуют лаыеллы с ламеллоподиями, Таким образом, BDM не только запрещает полимеризацию актиновых филаментов на ранних сроках воздействия (Yarrow et ai., 2003), но и вызывает деполимеризацию пучков актиновых филаментов при более длительном (1 ч) действии.

Поведение ведущего края в клетках культуры Vero при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае. Через 2-3 минуты после добавления в среду культивирования BDM в концентрации 20 мМ вел у ¡Пий край клетки резко останавливается, а еще через 2-3 минуты начинается быстрое втягивание бывших активных краев клетки. Таким образом, используемая нами ранее концеюрация BDM 20 мМ не подходит для детального изучения динамики изменения ведущего края фибробластов. При снижении концентрации BDM до 5 мМ меняется ответ клеток - вед\тций край перестраивается более медленно. При перестраивай и и

ведущего края первыми исчезают быстрые процессы колебания плазматической

мембраны, а более медленные выдвижения-втягивания ламеллоподий сохраняются,

но происходят медленнее, чем s контроле. Ведущий край постепенно сужается.

Уменьшается зона быстрого тока актина до полного исчезновения примерно за 30

минут. На кимограммах видны последовательные события, происходящие на

ведущем крае клетки после добавления в среду культивирования BDM в

концентрации 5 мМ, - сначала происходит резкое втягивание ведущего края, затем в

течение 15-20 минут происходят периодические выдвижения и втягивания

ламеллоподий на ведущем крае (рис. 5, а). При этом исчезает зона быстрого тока

актина, а ведущий край становится постепенно меньше.

Рис. 5. Изменение поведения ведущего края клеток культуры Vero при воздействии BDM 5 мМ.

а - добавление BDM в процессе съемки, б ~ через 1 ч после введения BDM. При введении В DM происходит постепенное и ере страивание ведущего края, происходят приапические выдвижения Солее коротких, пи сравнению е контролем, ламеллоподий. Через час после введения BDM лаиеллоподии образуются лишь изредка.

Анализ кимограмм показывает, что время выдвижения ламеллоподий

незначительно увеличивается, изменяя таким образом скорость выдвижения ламеллоподий приблизительно в 3 раза. Средняя амплитуда (высота) ламеллоподии уменьшается более, чем в три раза. Глубина ламеллы после добавления BDM уменьшается и 4 раза. Средняя площадь образующихся ламеллоподий уменьшается и составляет 95,95±9,41 цм 2 (таблица 2). Через час после введения BDM в концентрации 5 мМ ведущий край так же имеет выпуклую форму и ограничен вогнутыми стабильными краями. Количество ламе л л не изменяется по сравнению с контрольными. Однако протяженность ведущего края уменьшается в 1.5 раза (с 9S,69i0.88 цм до 58,53±0,48 цм), и он занимает таким образом около 30% от периметра клетки. Активная зона также уменьшается и занимает около 10% от длины ведущего края. Ее средняя протяженность составляет 5,71±0,05 цм, При этом время жизни активной области уменьшается почти в 2 раза (до 7,16±0,15 мин), Ламелла несколько сужается, ее глубина в среднем составляет 3,68±0,56 ¡дм. Анализ

кимограмм показывает, что и средняя амплитуда (высота) и время выдвижения

ламеллоподии уменьшаются (рис. 5, б). В дальнейшем ведущий край практически

полностью обездвиживается.

Таблица 2. Морфометрические характеристики поведения ведущего края фибробластов при замедлении полимеризации актиновых филаментов на

Характеристика, (среднее±8.0.) Клетки, через 10 мин после добавления ВРМ Клетки, через 1ч после добавления вим

Периметр клетки, цм 198,09±5,61 188,59±6,42

Протяженность ведущего края, цм. - 58,53±0,48

Количество ведущих краев 1 -2 1-2

Протяженность активной области, цм 5,71±0,05 -

Время жизни активной области, мин 7,16±0,15 -

Глубина ламеллы, цм 4,47±0,79 3,68±0,56

Время выдвижения ламеллоподии, мин 1,22±0,33 0,9±0,33

Амплитуда выдвижения ламеллоподии, цм 2,36±0,56 0,85±0,26

Площадь ламеллоподий, цм1 95,95±9,.41 -

Таким образом, при замедлении полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае фибробластов, происходят драматические изменения в его поведении. Уменьшается глубина ламеллы, амплитуда выдвижения ламеллоподии, и замедляется скорость выдвижения ламеллоподии. Что же происходит с ведущим краем при деполимеризации микротрубочек нокодазолом? Влияние нокодазола на поведение ведущего края исследовалось в двух разных экспериментах - в первом нокодазол добавляли клеткам, распластывавшимся в чистой среде, на следующие сутки после посадки. Клетки изучались через 2 часа воздействия нокодазола. Во втором случае клетки распластывались в среде с нокодазолом в течение суток. Поведение ведущего края в этих клетках отличается.

Динамика ведущего края фибробластов, распластанных при нормальных условиях. При добавлении нокодазола к уже распластанным в нормальных условиях клеткам изменения происходят в два этапа. Первый этап - первичный ответ (быстрый, в течение первых 30 минут) - обычно это ретракция клеток, и второй

(более медленный, через 1-2 часа после начала воздействия). Исследовалось поведение ведущего края клеток при вторичном ответе на действие нокодазола. Через 1-2 часа клетки распластаны, но обычно уже не поляризованы. При деполимеризоваиных микротрубочках фи б роб ласты сохраняют способность к передвижению, однако замедляется динамика движения, что согласуется с данными литературы (Ballestiem et al., 2000). После добавления нокодазола количество ламелл с ведущим (условно) краем увеличивается до 3-6, длина каждого ведущего края уменьшается более чем в 3 раза, каждый ведущий край при этом составляет около 15% от периметра клетки. Время жизни ламеллы с ведущим краем также велико и достигает часа и больше. Протяженность активной области уменьшается и составляет около 13% от длины ведущего края. Время жизни активного края

уменьшается и составляет 4,7±0,46 минут (таблица 3). Глубина ламеллы, определяемая на кимограмме, в среднем составляет й,09±0,84 рм (рис. 6, а).

Рис, 6, Поведение ведущего края в клетках культуры Vero с деполнмеризованнылн микротрубочкам в.

а - ведущий край, через 2 ч воздействия нокодазола б - ведущий край клетки, распластывающейся в присутствии нокодазола (24 ч) в, г - появление областей с быстрым током актина 2 ч и 24 ч воздействия нокодазола соотвстсвенно. Уменьшается глубина ламеллы, амплитуда выдвижения ламеллоподии, однако время выдвижения увеличивается.

Время выдвижения ламеллоподии уменьшается приблизительно в 1,3 раза по сравнению с контрольными клетками (таблица 3). Однако, скорость выдвижения ламеллоподии при деполимеризоваиных микротрубочках сравнима со скоростью выдвижения ламеллоподии при замедлении динамики полимеризации актина на ведущем крае. Средняя площадь образующихся ламеллоподий уменьшается приблизительно в 3 раза, по сравнению с контрольными клетками (133,30±5,.95 цм3 и 48,27±2,б7 цм2 соответственно), В клетках культуры Vero образуются зоны с быстрым током актина (рис. 6, в). Иногда они возникают ла уже существующей

активной области, однако, так же этот процесс может идти вне связи с активными областями. Время жизни этих областей невелико, обычно не больше 20 минут. В конце существования зона быстрого тока обычно втягивается.

Клетки ЗТЗ, обработанные нокодазолом, так же теряют поляризацию и не

имеют одной ярко выраженной ламеллы. Через час после добавления нокодазола в

среду культивирования количество ведущих краев увеличивается до 4 - б,

располагающихся на узких выростах клетки. Во время наблюдения на ведущих

краях в клетках с разрушенными нокодазолом микротрубочками также происходит

формирование филоподий, но часть филоподий при этом становится длинее, но

сравнению с филоподиями в контрольных клетках, и они могут изгибаться. После

обработки нокодазолом протяженность ведущего края клетки уменьшается до

25,79±5,01 (дм, а протяженность одиночной активной области уменьшается и

составляет около !1% от длины ведущего края клетки. Однако общая средняя

протяженность всех активных зон в клетках, обработанных нокодазолом, сравнима с

общей протяженностью активных областей в контрольных клетках и равна 67,9±5,4б

рм, тогда как в контрольных клетках

она составляет 70,2±8,45 цм (рис. 7).

Рис. 7. Диаграмма отношения протяженности ведущего края к суммарной протяженности активных областей в клетках ЗТЗ.

Протяженность ведущего края при деяолимеризомнных микротрубочках уменьшаете« почти в 3 раза, однако суммарная протяженность активных зон сравнима с контрольным значением.

Время жизни одиночной активной области в клетках, обработанных нокодазолом, уменьшается почти в 3 раза но сравнению со временем жизни активного края в контрольных клетках к составляет 4,75±0,17 мин. Глубина ламеллы, определяема* на килограмме, в среднем составляет 7.02± 1,23 цм. Скорость выдвижения ламеллоподии уменьшается, по сравнению с контрольными клетками (таблица 3). Средняя площадь ламеллоподии в клетках без микротрубочек снижается а 2 раза по сравнению с площадью ламеллоподий в контрольных клетках. В Клетках ЗТЗ, обработанных нокодазолом, появляется пульсация цитоплазмы.

Таблица 3. Морфометрические характеристики поведения ведущего края _фибробластов при деполимеризованных микротрубочках._

Характеристика, (среднее±8.0.) Клетки Vero, через 2 часа воздействия нокодазола Клетки ЗТЗ, через 2 часа воздействия нокодазола Клетки, распластанные в присутствии нокодазола

Периметр клетки, дм 192,34±5,90 216,51*17,42 194,45±1,88

Протяженность ведущего края, дм 28,26±3,04 25,79±5,01 27,45±2,97

Количество ведущих краев 4-6 4-6 2-4

Протяженность активной области, цм 3,69±1,04 8,48±2,12 4,94±1,06

Суммарная протяженность активных областей, цм 32,86±7,39 67,9±5,46 -

Время жизни активной области, мин 4,70±0,4б 4,75±0,17 3,80±0,08

Глубина ламеллы,цм 6,09±0,84 7,02± 1,23 2,72±0,80

Время выдвижения ламеллоподии, мин 0,86±0,24 0,56±0,07 0,57±0,09

Амплитуда выдвижения ламеллоподии, дм 2,00±0,62 1,81±0,43 0,90±0,20

Плошадь ламеллоподий, цм' 48,27±12,67 31,83± 10,09 41,53± 9,31

Поведение ведущего края фибробластов, распластанных в присутствии нокодазола. Поведение ведущего края в клетках, которые распластывались в присутствии нокодазола, иное. Количество ламелл в клетках увеличивается по сравнению с контролем до 2 - 4, длина одиночного «ведущего» края составляет около 14 % от периметра клетки, время жизни каждого ведущего края так же исчисляется часами. Протяженность активной области около 18% от ведущего края, но живет активная область еще меньшее время по сравнению с контрольными клетками. Время жизни составляет 3,8±0,08 мин. Средняя площадь образующихся ламеллоподий составляет 41,53±2,31 цм 2 (таблица 3). Глубина ламеллы меньше приблизительно вдвое, по сравнению с клетками, после двух часов воздействия нокодазола, и в среднем составляет 2,72±0,80 цм. При этом скорость выдвижения ламеллоподии в этих клетках уменьшается приблизительно в 2 раза (таблица 3). В клетках, распластывающихся в присутствии нокодазола, так же возникают зоны быстрого тока актина. Эти зоны перемещаются по кругу по всему периметру клетки, имея при этом практически одинаковую протяженность. Время жизни зон быстрого тока актина занимает несколько минут. Таким образом, при деполимеризованных микротрубочках происходит уменьшение протяженности активной области, по сравнению с контролем и клетками, с замедленной динамикой актиновых

филаментов. Также при деполимеризованных микротрубочках увеличивается скорость выдвижения ламеллоподии, по сравнению с клетками, обработанными BDM, однако, площадь образующихся ламеллоподий меньше в клетках с замедленной динамикой актина. Следовательно, полученные результаты позволяют предположить, что для выдвижения ламеллоподий необходимо и достаточно актиновых филаментов, но для увеличения площади ламеллоподии и превращения ее в полноценную ламеллу, необходимо сбалансированное участие обеих систем цитоскелета.

Остается открытым вопрос - какая же из систем отвечает за втягивание активного края? Для ответа на него изучалось сокращение клеток под действием BDM при деполимеризованных пучках актиновых филаментов и микротрубочках. Воздействие BDM на клетки, в которых актиновые филаменты разрушены латрункулином В.Для выяснения роли актиновых пучков в процессе подтягивания ламеллы клетки, было проанализировано поведение клеток в присутствии BDM, в которых микрофиламенты предварительно были деполимеризованы латрункулином В. Контролем служили клетки, культивируемые в нормальной среде. Через 10 минут после введения латрункулина В (5 пМ) происходит практически полная деполимеризация пучков актиновых филаментов, однако, ламеллы клеток не втягиваются, и площадь клеток практически не изменяется (2004 ± 125 рм2 в контроле и 2075 ± 133 рм2 после 10 мин воздействия латрункулина В). Эффект латрункулина, таким образом, оказался аналогичным описанному эффекту цитохалазина В и Д в низких концентрациях (Domnina et al., 1982). На систему микротрубочек латрункулин В не влияет. Она остается радиальной, с фокусом схождения на центросоме и прямыми микротрубочками, которые доходят до края клеток, что соответсвует данным литературы (Spector et al., 1983; Peterson et al., 2000). После добавления BDM на фоне латрункулина клетки сокращаются более активно, чем в его отсутствие: уже через 1 мин клетки начинают втягивать активные края (рис. 8). В течение 30 мин площадь клеток уменьшается примерно на 55%. Уже на ранних сроках воздействия BDM сеть микротрубочек становится хаотичной, и исчезает фокус схождения. Таким образом, втягивание лабильных краев происходит

-S--

h

¡л.

йрС.ЧН SO Uf V:. Г И , H. MHIt

в отсутствие акти новых стресс-фибрилл, причем процесс сокращения клетки

................ускоряется по сравнению с втягиванием

при воздействии только одного BDM.

Рис.8. Диаграмма изменении площади клеток Vero при воздействии лат рун кул и и я В (1, 5, 10 мин), В лат рун кул и на В + BDM.

™ Площадь клеток практически не изменяется в I присутствии латрункулина В, однако немедленно начинает уменьшаться при ~ — - — — — добавлении BDM.

Поскольку система микротрубочек в процессе сокращения клеток изменяется,

то мы предположили, что микротрубочки могут участвовать в процессе втягивания клеточной ламеллы. Для проверки данной гипотезы микротрубочки леполимеризовали воздействием нокодазола, затем в среду добавляли BDM и оценивали поведение клеток.

Воздействие BDM на клетки, в которых микротрубочки предварительно деполимеризоеаны нокодазолом. В результате 2-х часовой инкубации с нокодазолом микротрубочки полностью деполимеризуются, но актиновые фнламенты в теле клеток сохраняются. Клетки с деполимеризованными микротрубочками теряют поляризацию, и их площадь уменьшается примерно на 20% по сравнению с контролем, что также соответствует ранее описанным данным (Pletjushkina et. al, 2001). Пучки актина в клетках Vero после воздействия нокодазола сильно гипертрофированы по сравнению с контрольными клетками. Хотя после деполимеризации микротрубочек и происходит образование ламеллоподий, количество актина в них снижается. В отсутствие микротрубочек клетки не реагируют на BDM: они остаются распластанными спустя 60 мин инкубации в среде с BDM, и площадь их за это время не изменяется. В дальнейшем в течение суток клетки также не изменяют свою форму. Пучки акти новых филаментов деполимеризуются в ответ на действие BDM медленнее, чем при наличии сети микротрубочек: через 60 мин пучки актина остаются так же гипертрофированными по сравнению с нормальными клетками. В присутствии нокодазола полная деполимеризация актиновых пучков н 90% клеток происходит только после 24 ч воздействия BDM. Прижизненные наблюдения подтвердили, что при добавлении

нокодазола клетки теряют полярность, но остаются распластанными. В ответ на введение BDM поведение таких клеток не изменяется. Удаление нокодазола из среды культивирования (но не BDM!) приводит к тому, что клетки начинают втягивать края (по всему периметру) примерно через 6 мин, и в дальнейшем в течение 60 мин клетки продолжают поджиматься, Согласно данным иммунофлуоресцентного анализа 6 мин - это время, за которое первые микротрубочки дорастают до края клетки. Изменение площади клеток при восстановлении микротрубочек в присутствии BDM определяли на фиксированных препаратах. Контролем служили клетки, которые после воздействия нокодазола перенесли в чистую культуральную среду. В течение 1 ч площадь к легок в присутствии BDM уменьшается почти вдвое, _____________________________тогда как в контроле за то же время она

2 к.

1

С ж*

увеличивается (рис. 9).

Рис.9. Диаграмма изменения площаян клеток Vero при восстановлении микрогрубочек в контроле н о присутствии BDM, время восстановления, мин Если в присутствии BDM отмыть нокодазол,

■ контроль ВРМ клетки начинают втягивать ламеллоподни ------------- --------- через 5-6 мни.

При удалении нокодазола из среды культивирования микротрубочки

начинают восстанавливаться уже через 2 минуты, при этом в основном образуются центросомальные ми хр отру бочки и небольшое количество свободных микротрубочек, которые к б-й минуте восстановления в чистой среде депоЛНМеризуются, что согласуется с данными литературы (Смуровз и др., 2002; Чернобыльская и др., 2004). Происходит перестраивая и е актиновых филаментов -постепенно пучки актина становятся тоньше. При этом увеличивается фракция актина на активном крае клеток, и начинают образовываться ламешюподин. Через 60 мин восстановления площадь клеток увеличивается примерно на 50%, система микротрубочек полностью восстанавливается, система актиновых филаментов возвращается к нормальному виду - появляется актин на активном крае, и стресс-фибриллы опять располагаются перпендикулярно активному краю и вдоль длинной оси клетки. В присутствии В ОМ микротрубочки восстанавливаются быстрее, по сравнению с контролем и в других пропорциях: в первые минуты восстановления сеть представлена в основном свободными микротрубочками, количество которых

увеличивается к 6-й мин восстановления. Центросомальные микротрубочки также растут быстрее и представлены большим числом по сравнению с контрольными клетками. Пучки актиновых филаментов под действием BDM перестраиваются не таким способом, как в контроле - на активном крае их не становится больше, однако стресс-фибриллы становятся тоньше и короче. При этом перестройка стресс-фибрилл происходит медленнее, чем при воздействии BDM на клетки - сколько-нибудь заметное утоныпение выявляется только к 10 минуте восстановления. Через 60 мин восстановления площадь клеток уменьшается примерно на 45%, сеть микротрубочек восстанавливается, а стресс-фибриллы практически полностью деполимеризуются. Через 30 мин после отмывки BDM из среды культивирования клетки распластываются, сеть микротрубочек восстанавливается. Таким образом, без микротрубочек не происходит втягивания активных краев клеток. Но как только первые микротрубочки достигают края клетки, происходит быстрое сокращение клеток до шарообразной формы. Следовательно, можно предположить, что за втягивание клетки отвечает именно система микротрубочек.

Выводы

1. Ведущий край поляризованных на стекле фибробластов неоднороден: в нем можно выделить активные и спокойные области. При этом активность ламеллы перемещается в пределах ведущего края. Характеристики, описывающие динамику поведения ведущего края, универсальны.

2. При деполимеризации микротрубочек в фибробластах поведение ведущего края изменяется: происходит уменьшение времени жизни, протяженности активных областей и площади образующихся ламеллоподий.

3. BDM в концентрации 20 мМ вызывает практически полную разборку системы актиновых филаментов в клетках Vero вне зависимости от присутствия или отсутствия микротрубочек.

4. BDM в концентрации 5 мМ подавляет выдвижение ламеллоподий.

5. BDM в концентрации 20 мМ вызывает втягивание активных краев клеток. Данный процесс усиливается при частичной деполимеризации

микрофиламентов и подавляется при деполимеризации микротрубочек. Действие BDM обратимо.

6. BDM влияет на сеть микротрубочек - микротрубочки становятся более извитыми, а также исчезает их фокус схождения.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Добринских Е.А, Григорьев И.С., Воробьев И.А. Влияние ингибитора актомиозиновой системы BDM на систему микротрубочек в фибробластах. Цитология т. 43 №4, стр. 367. Всероссийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Россия, 17-19 окт. 2000.

2. Dobrinskih Е.А., Grigoriev I.S., Vorobjev I.A. Microtubules are necessary for retraction of cultured cells. Mol. Cell Biol. Supplement volume 12,43a - 44a

3. Dobrinskih E.A., Vorobjev I.A. Microtubules are necessary for retraction of cultured cells. 17th European Cytoskeleton Forum, Nyon-Geneva, Switzerland, August 31- September 4, 2002

4. Добринских E.A., Воробьев И.А, Микротрубочки необходимы для втягивания ламеллы в культивируемых клетках Vero. Цитология, т. 45, № 9, с. 869. 1-й Съезд Общества клеточной биологии, 14-17 октября. Санкт-Петербург, Россия. 2003

5. Добринских Е.А., Верховский А.В., Воробьев И.А. Изменение ламеллиподиальной активности фибробластов при деполимеризации микротрубочек: количественный анализ. Цитология, т. 48, № 9, с. 760 - 761. Всероссийский симпозиум «Биология клетки в культуре», 17-19 октября. Санкт-Петербург, Россия. 2006

6. Добринских Е.А., Воробьев И.А. Микротрубочки необходимы для втягивания ламеллы в культивируемых клетках Vero. Цитология, т. 48, № 11, с. 906-917. 2006

Отпечатано в отделе оперативной печати Геологического ф-та МГУ Тираж 7,5" экз. Заказ № ^

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Добринских, Евгения Александровна

Введение

Обзор литературы

Компоненты цитоскелета - микротрубочки и микрофиламенты.

Микротрубочки

Общие свойства.

Расположение.

Свойства микротрубочек. И полярность И динамическая нестабильность эластичность

Функции.

Участие микротрубочек в поддержании полярности клетки

Участие микротрубочек в поддержании архитектуры клетки

Актин.

Общие свойства.

Актиновые структуры в клетке.

Функции.

Полимеризация актина приводит к движению клеточной мембраны

Динамика цитоскелетных структур.

Динамика микротрубочек в интерфазных клетках.

Образование микротрубочек в цитоплазме интерфазных клеток.

Центросомальные микротрубочки.

Свободные микротрубочки.

Белки, ассоциированные с микротрубочками

MAP белки

Моторные белки

Минус-концевые белки

Плюс-концевые белки

Динамика актиновых структур в интерфазных клетках.

Образование сети актиновых филаментов в ламелле.

Образование стресс-фибрилл.

Белки, взаимодействующие с актиновыми филаментами.

Актин-связывающие белки in vivo

Белки, взаимодействующие с мономерным актином

Белки, взаимодействующие с актиновыми филаментами

Миозины.

Миозин II.

Миозин V.

Распластывание и движение клеток по субстрату.

Взаимодействие микротрубочек и микрофиламентов в распластывании, поляризации и движении клеток.

Внутриклеточный траспорт

Ингибиторный анализ как метод исследования функциональной роли цитоскелета.

BDM как ингибитор внутриклеточных процессов.

Нокодазол.

Латрункулины.

Цитохалазины.

Цели и задачи

Материалы и методы

Клеточная культура

Экспериментальные воздействия

Прижизненные наблюдения

Иммунофлуоресцентные исследования

Построение кимограмм

Анализ полученных данных

Результаты

Морфометрический анализ динамических характеристик поведения ведущего края фибробластов.

Эффект воздействия BDM на клетки Vero.

Поведение ведущего края в клетках культуры Vero, при запрете полимеризации актиновых филаментов на лидирующем крае.

Динамика ведущего края фибробластов, распластанных при нормальных условиях.

Поведение ведущего края фибробластов, распластанных в присутствии нокодазола.

Воздействие BDMна клетки, в которых актиновые филаменты разрушены латрункулином В.

Воздействие BDM на клетки, в которых микротрубочки предварительно деполимеризованы нокодазолом.

Обсуждение результатов

Ведущий край поляризованных фибробластов неоднороден

Деполимеризация какой-либо из систем цитоскелета ведет к изменени. поведения на ведущем крае фибробластов.

BDM вызывает втягивание лабильных краев клеток.

В клетках, лишенных микротрубочек, втягивание активных краев под действием BDM не происходит.

Модель взаимодействия стуктур цитоскелета в фибробластах.