Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия"

На правах рукописи

Смурова Ксения Михайловна

УЧАСТИЕ МИКРОТРУБОЧЕК В РЕГУЛЯЦИИ АКТИНОВОГО ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ ЭНДОТЕЛИЯ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Института Физико-химической Биологии им А Н Ьедозерского Московского Государственного Университета им М В Ломоносова и в отделении пульмонологии университета Джона Хопкинса (США)

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Алиева Ирина Борисовна

Доктор биологических наук, профессор, Онищенко Г алина Евгеньевна

Кандидат биологических наук, Быстревская Виктория Борисовна

Ведущая организация

Онколо! ический Научный Центр (Москва)

Зашита состоится 17 февраля 2004 г. в 15.30 на заседании Диссертационного Совета Д 501 001 52 при Московском Государственном Университете им МВ Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, Биологический факулыет МГУ, аудитория М-1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан 28 декабря 2004 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук У £ ^ Калисгратова

Актуальность проблемы

Вопрос о взаимодействии двух систем шпоскепета клетки - микротрубочек и актиновых филаменюв - поднимался еше с 70-х годов, когда в лаборатории Ю M Васильева было показано, что микротрубочки необходимы для образования ламеллы и организации направленною, актин-зависимого движения фибробласта (Vasiliev et al, 1970) Взаимодействия микротрубочек и актина лежат в основе многих фундаментальных клеточных процессов, таких как клеточная подвижность (Vasiliev et al, 1970, Wittmann, Warerman-Storer, 2001) цитокинез (Glol/cr, 2001, Kunyama et al, 2002), движение кортикального тока клетки (Canman, Bernent, 1997, Mandato et al, 2000)

Большинство перечисленных выше работ было выполнено на культивируемых фиброб.частах, и следует понимать, что эта система не отражает нормального поведения фибробласта в живом opi анизме В тканях организма фибробтасты не распластываются на подложке, принимая характерную для культуры поляризованную форму - они перемещаются в объеме, в межклегочном пространстве С точки зрения нормального функционирования более адекватной представляется модель эндотелиального пласта, уникальность которой в том, что выделенные в культуру клетки эндотелия сохраняют барьерную функцию - основную функцию, присущую им в организме

Недавно было показано, что именно от координированной работы микротрубочек и актиновых фштаментов зависит поддержание барьерной функции клетками эндотелия (Venn et al 2001, Petrache et al, 2003, Btrukova et al, 2004) В организме естественным регулятором проницаемости эндотелия является тромбин Тромбин, действуя на клетки через специфический рецептор, запускает каскады внутриклеточных реакций, что приводит к увеличению проницаемости эндотелиального барьера (Garcia et al 1995, 1996, Vérin et al, 2000) С друюй стороны, усиление проницаемости легочного эндотелия происходят в ответ на деполимериыпию микрофубочек нокодаюлом (Venn et al, 2001) Связав воедино эти факты, можно предполагать, чго воздействие тромбина может вызывать реакцию микротрубочек, анало1 ичную той, что вызывает экспериментальное воздействие нокодаюла Проверяя эго предположение, в данной работе мы пытались понять каким образом связаны эти два процесса - действие тромбина и разборка микротрубочек - в клетках эндотелия сохранивших после выделения в кулыуру свое функциональное свойство

Новые технические достижения, в частности, появление специального программною обеспечения для обработки цифровых изображений, открывают возможности не только для детального анализа взаимоотношения разных компонентов цитоскелета клетки, но и позволяют давать им количественную оценку Такая оценка была необходима в данной работе, она позволила количественно оценить изменения в системе микротрубочек и

РОС НАЦИОНАЛЬНА' ; |исмштл

актиновых филаментов при различных воздействиях Полученные количественные результаты были использованы для моделирования поведения микротрубочек с помощью компьютерной симуляции и позволили проверить правильность полученной модели на живых культивируемых клетках Создание модели дало возможность проанализировать распределение микротрубочек в различных частях клетки в функционально активных клетках эндотелия в норме и при действии громбина

Цели работы

Цсгтыо данной работой было исследовать систему микротрубочек и актиновых филаментов при искусственном разрушении микротрубочек с помощью нокодазола и при действии физиологического стимулятора тромбина в клетках эндотелия неточной артерии человека

В работе быта поставлены следующие задачи

1 Исследовать изменения системы микротрубочек и актиновых филаментов пол действием низких доз нокодазола

2 Исследовать систему микротрубочек и актиновых филаментов при действии тромбина

3 Изучить участие микротрубочек в процессе передачи сигнала от тромбина к актиновому ци госкелету

4 Создать модель, описывающую распределение микротрубочек в клетках, проверить правильность полученной модели, и на основании этой модели проанализировать поведение системы микротрубочек в клетках эщкмелия в норме и при действии тромбина

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые было показано, что 1ромбин лиминирует микротрубочки на периферии клетки и юлько затем вызывает образование стресс-фибричл Разрушение микрогрубочек нокодазопом (200 нМ) 1акже приводит к образованию стресс-фибрилл Показано, чго Iиперэкспрессия конститутивно активных а-субьедшшц регуляторных белков 012, 013, Ся2 и Gq приводит к увеличению илошости и толщины стресс-фибрилл, разрушению системы микротрубочек и уменьшению площади клетки В работе впервые было исследовано участие промежуточных регуляторных молекул в вызванном тромбином изменении цитоскелета Предобработка кокиошным токсином снижает вызванные действием тромбина образование стресс-фибричл и деполимеризацию микротрубочек Воздействие тромбина на фоне ипгибирования Шю-киназы уве шчивает площадь, занятую стресс-фибриллами, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора 1И10-кин<н

Для решения поставленных в исследовании задач был разработан количественный метод анализа оптической плотности на цифровых июбражениях клеток Метод позволил детально проанализировать изменения в системе микротрубочек и актиновых филаменгов при различных воздействиях, смоделировать поведение микротрубочек с помощью компьютерной симуляции и проверить правильность полученной модели на живых культивируемых клетках Разработанный метод позволил показать, что действие тромбина не только элиминирует периферические микротрубочки, но и меняет их распределение в центре клетки

Апробация работы

Диссертация была апробирована на заседании омела электронной микроскопии НИИ ФХБ им А Н Белозерско! о 23 сентября 2004 i ода Результаты работы были представлены на научных конференциях Всеросийский симпозиум "Клеточная биология на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Россия, 2000, "40'h American Society for Cell Biology Annual Meeting", San Francisco, USA, 2000, "'1st International Meeting & Workshop on Advanced Light Microscopy", Santa Mana Imbaro (Chieti), Italy, 2001, "3d International Meeting & Workshop on Advanced Light Microscopy ', Barcelona, Spain 2003, "1-й Съезд Общества клеточной биологии", Санкт-Петербург, Россия 2003, "43r<1 American Society for Cell Biology Annual Meeting", San Francisco, USA, 2003, "International Symposium Biological Motility", Пушино, Россия, 2004, "Special Meeting on Cytoskeletal Dynamics From Cell Biology to Development and Disease", Helsinki, Finland, 2004, "Fl SO Annual Congress" Nice, France 2004 Также результаты были доложены па семинаре отлет пучьмонотогии университета Джона Хопкинса, США 24 февраля 2003 года

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ

Структура работы

Диссертация состоит из глав Введение. Обзор литературы, Материалы и Методы, Результаты, Обсуждение, Выводы и Список лшературы Работа изложена на 130 страницах и содержит 27 иллюстраций

Материалы и методы

Культура клеток Культура клеток эндотелия легочной артерии человека (НРАЕС) была получена из компании «Clonetics BioWhittaker Inc » (США) К тетки 6-10 пассажей выращивали на среде EGM-2 («Clonetics BioWhittaker Inc », США) при 37°С и 5% СОг Для ряда экспериментов использовали клетки линии Vero Их культивировали при 37*С и 5% С02

з

в среде DMEM/F12 («Sigma», США) с вдбавтением 3% эмбриональном телячьей сыворотки и генгамицина

Трансфекция Для трансфекции испочьзовали плазмиды, кодирующие конститутивно активную а-субъединицу гетеротримерных белков G12/13 Gl и Gq (Voyno-Yasenetskava et al, 1996) Процедура трансфекции проводилась с использованием Fugene 6 peareiiia но npoioKO'iy фирмы-изгоювителя («Roche», США)

Экспериментальные воздействия Нокодазол («Sigma», США) использовали в концентрации 100 и 200 нМ в течение 30 мин С эмуляцию тромбином («Svgma» США) в концентрации 25 нМ производили в срсдс без сыворотки в течение 5, 10, 20, 30 и 60 мин Gl белок ингибировали кокппюпшым токсином («List Laboratories», США) в концентрации 1 ¡хг/мл (1 ч) Ингибитор Rho-киназ Y-27632 («Tocns» США) использовали в концентрации 5 цМ в течение 1 ч Нокодазол и Y-27632 растворяли в ДМСО Конечная концентрация ДМСО в срсде не превышала 0,1% (v/v)

Иммунофлюоресцентное окрашивание Клетки фиксировали !,5% раствором глютарового альдегида («Sigma», США) в течение 10 мин, пермеабилизовали 0,1% раствором Triton Х-100 («Sigma», США) течение 15 мин и затем обрабатывали 0,2 % раствором NaBHi («Sigma», США) Далее кле1ки инкубировали с первичными (30 мин, 37'С), а затем вторичными антителами (30 мин, 37'С) Препараты заключали в смесь глицерина и воды (1 1 )

Антитела Для окраски микротрубочек в качестве первичных антител использовали моноклоначьные мышиные антшела к р-тубулину («ICN», США), моноклонапьные мышиные антитела к ацетилированному ¡убулину («Accurate Chemicals», США) Дта выянтсния трансфецированных kictok использовани по шклональные кроличьи ангитета к а-субъединицам тримерных белков G12, G13, Gq и Gi2 («Santa Cruz.» США)

В качестве вторичных антител использовали анти-мышиные либо анш-кроличьи антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями Alexa 488- или Alcxa 594-(«Molecular Probes», США) Актиновые фитаменты окрашивали при помощи фаллоидина, конъюгированного с фJlyopoxpoмoм Texas Red («Molecular Probes», США)

Получение и обработка цифровых изображений Препараты анатшировали на микроскопе Nikon F-clipse 1Ь2000 с объективом 60/1,4 («Nikon Intech Со», Япония) Июбражения ¡аписывали на 12 битную цифровую охлаждаемую НЗС-камеру Hamamatsu ORCA-2 («Hamamatsu Photonics», Япония), управляемую программой MetaView («Universal Imaging» США) Обработка изображений проводилась в программе MctaMorph («Universal Imaging», США)

Количественная оценка системы актиновых филаментов и микротрубочек Для оценки количества стресс-фибрилл в клетках на исходных изображениях выделяли область, соответствующую полимеризованному актину (выделялись все участки, превышающий по интенсивности средний уровень фона в клетке в 2 и более раз), и находили отношение их площади к площади всей клетки в целом (Смурова и др , 2004) Аналогичным образом вычисляли относительную площадь занятую системой микротрубочек

Для оценки количества актиновых филаментов r разных участках клетки выделяли гри участка измерения 1) участок, опоясывающий периметр клетки на расстоянии 5 мкм от края клетки. 2) участок, опоясывающий периметр клетки на расстоянии 10 мкм, 3) внутренний участок отстоящий от края клетки на 10 мкм Находили соотношение площади, занятой актиновыми филаментами либо микротрубочками, к пчощади соответствующего участка

Анализ системы микротрубочек в клетках Vero Для полной деполимеризации микротрубочек в клетках Vero использовали нокодазол в концентрации 10 мкг/мл в течение 2 ч Клетки фиксировали через 4, 8, 12, 16, 30 и 60 мин после снятия действия нокодазола Постоянная температура (30°С) поддерживалась на столе с помощью фена («Nicolson Precision Instruments», США) Длины микротрубочек измеряли на обработанных изображениях в программе Scion Image («Scion Corporation», США)

Анализ интенсивности флуоресценции тубулина в ламелле Интенсивность флуоресценции тубулина в ламелле измеряли, как описано ранее (Смурова и др, 2002). на фиксированных препаратах клеток антителами к [З-губулину, в десяти квадратных участках со стороной 3,5 мкм, расходящихся по радиусу от центросомы до края k.ictkh Интенсивность флуоресценции измерялась как средняя оптическая плотность с помощью программы MetaMorph

Моделирование системы микротрубочек Для моделирования клеток содержащих систему микротрубочек с заданными параметрами, использовали программу Corel Draw 10 («Corel Corporation», США) Выделили пять типов клеток с различными длиной и количеством микротрубочек (рис 6) С помощью программы MetaMorph в модельных клетках измеряли динамику снижения оптической пчотности от точки схождения микротрубочек до края клетки

Статистическая обработка данных и построение графиков Все данные приведены со значением стандартного огклонения (SD) Дчя статистической обработки данных и построения графиков использовали прмрамму Sigma Plot 7 1 («SPSS Science», США) Для определения статистическою отличия между двумя выборками использовали t-тест (критерий Стъюдента) Графики аппроксимировали в программах Sigma Plot 7 1 и Table Curve 2D 5 l(«Systat Software Inc », США)

Результаты и обсуждение

В норме в клетках эндотелия легочной артерии человека методом флуоресцентного окрашивания выявлялась актиновая сеть, состоящая и-з неупорядоченных пучков ак типовых филаментов Площадь, занимаемая системой актиновых филаметов, составляла 21,62±5,6 % ог площади клетки Площадь актиновых филаментов в участке, опоясывающем периметр клетки на расстоянии 5 мкм, была несколько выше - 26,4±8,1% Во внутреннем участке, отстоящем на 10 мкч от края клетки, относительная пчощадь актиновых филаменюв составляла 14,15±6,7%, что на треть меньше, чем в целом в клетке Средняя толщина актиновых пучков составляла 0,29±0,09 мкм Таким образом, актиновая сеть в эндотелиальных клетках состоит из тонких актиновых фитаменюв, расположенных неравномерно в объеме клетки - их сеть разрежена в центральной части клетки, но уплотняется в направлении ее края

В ходе иммунофлюоресцснтного исследования в клетках эндотелия выявлялась сеть микротрубочек которые сходились в районе клеточного центра В среднем, микротрубочки занимали 47,9±4 1% от площади всей клетки В центре клетки плотность микротрубочек была максимальна, она постепенно понижалась по направлению к краю клетки Гак, в центре клеток относительная плошадь, занятая микротрубочками, составила 83,3±5,8% В участке, опоясывающем границу клетки на расстоянии 10 мкм, количество микрогрубочек составило 28,3+7,4% от площади участка измерения В крайнем участке, отстоящем на 5 мкм oi края клетки, площадь микротрубочек составила 15,7±6,6% Таким образом система микротрубочек в клетках эндотелия имеет максимальную плотность в районе клеточною центра, и их плотность постепенно понижается но направлению к краю клетки

В клетках легочного «шо гелия выявлялась популяция стабильных микротрубочек, которые идентифицировали с использованием антител к ацетилированному тубулину В норме ацетилированные микротрубочки были расположены в центре клетки и часто не имени выраженного центра схождения Ацетилированные микротрубочки занимали 17,1±4,3% от площади клетки Таким обраюм, на до по ацетилированных микротрубочек приходилось около 35% ог всех микротрубочек в кле!ке

Действие наномолярных доз нокодазола на цитоскелет клеток эндотелия Ранее неоднократно было нокаюно, что разрушение системы микротрубочек в культивируемых клетках приводит к увеличению сократимости клеток и возникновению актиновых стресс-фибрилл (Danowsky, 1989, Fnomoto, 1996; Bershadsky, 1996, Venn, 2001) Поскольку поддержание эндотелиального барьера обеспечивается координирующей друг друга работой белков цитоскелета (Lum, Malik, 1996) то для выявления роли микротрубочек в этом процессе клетки эндотелия обрабэт ивати нокодазолом в концентрациях 100 и 200 нМ

Нокодазол в концентрации 100 нМ не вызывает образования стресс-фибрилл Нокодазол в концентрации 100 нМ в течение 30 мин вызывал частичное разрушение системы микротрубочек на краю клетки, а в центре система микротрубочек оставалась подобной системе, наблюдаемой в контроле После действия нокодазола микротрубочки занимали 30,3±5,5% от плошади клетки Значительно уменьшилось количество микротрубочек на расстоянии 5 мкм от края клетки (1 5± 1,3%) В центральном участке клетки микротрубочек стало меньше всего на четверть от контрольного уровня - 64,7± 11,8% Таким образом, нокодазол в концентрации 100 нМ вызывал частичное разрушение системы микротрубочек, разбирая в основном периферические микротрубочки в зоне 5 мкм от края клетки

Распределение стабильных микротрубочек после действия нокодазола не отличалось от распределения стабильных микротрубочек в контроле, их площадь существенно не отличались от контрольного значения (14,3±3,6%)

Система актиновых филаментов после 30 мин воздействия нокодазола в концентрации 100 нМ визуально не изменялась Площадь стресс-фибрилл в клетке составила 24,5±6,5%, что статистически не отличалось от значения в контроле Незначительно увеличилась площадь актиновых филаментов в ценгральном участке клетки (19,0-Н0,6%), однако на периферии клетки, в участках 5 мкм и 10 мкм от ее края, площадь актиновых филаментов не изменялась (26,2±6,1 и 27,5±6,6% соответсгвенно)

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что нокодаюл в концентрации 100 нМ в течение 30 мин вызывает частичное разрушение микротрубочек па краю клетки, но не влияет на количество ацетилированных микротрубочек и актиновых филаментов

Нокодазол в концентрации 200 нМ вызывает образование стресс-фибрилл

Нокодазол в концентрации 200 нМ в течение 30 мин разрушал систему микротрубочек в клетках эндотелия Количественный анализ показал, что площадь, занимаемая микротрубочками, уменьшилась практически в 3 раза по сравнению с контролем (16,5±3,8%) Значительно уменьшилось количество микротрубочек на краю клетки в зоне 10 мкм от края клетки занимаемая микротрубочками площадь составила 4,4±4,1%

Система апетилированньгх микрогрубочек после действия нокодаюла (200 нМ) визуально не отличалось системы, наблюдаемой в контроле На долю ацетилированных микротрубочек приходилось 15,9±4,1% от площади клетки чю соответствовало общей площади микротрубочек Можно предположить, что после действия нокодазола (200 нМ) в клетке остаются в основном аце I илированные микротрубочки

Система актиновых филаментов после действия нокодазола изменилась визуально возросло содержание стресс-фибрилл, увеличилась их толщина, и изменился характер расположения в клетке Плошадь, занимаемая актиновыми филаментами, увеличилась до

31,8±6,1% В центре кпетки содержание стресс-фибрилл возросло вдвое (30,7±9,0%) по сравнению контролем Содержание актиновых филаментов в зонах 5 и 10 мкм от края клетки существенно не изменилось (28,8±10,1% и 32,8±8,7% соответственно) Тощина актиновых пучков возросла примерно в гри раза по сравнению с контролем - 0 75±0 15 мкм Можно заключил, что действие нокодазола в концентрации 200 нМ приводите к уветичению содержания актиновых филаментов в основном, в центральном районе клетки

Таким образом нокодазол в концентрации 100 нМ разбирая микрогрубочки на краю клетки, не оказывал существенного влияния на количество стресс-фибрилл, toi да как покодазол в концентрации 200 нМ депотимеризуя микротрубочки сильнее, приводил к формированию дополнительных стресс-фибрилл в центре клетки

Действие тромбина на цитоскелет клеток легочного эндотелия человека

Было показано, что тромбин в концентрациях 1-200 нМ вызывает увеличение проницаемости слоя эндшелиальных клеток, сопровождаемое образованием стресс-фибрилл (Bimkova et al, 2004) Поскольку нокодаюл аналогично тромбину, усиливает проницаемость лщотелиального барьера, то логично предположить, что и тромбин также воздействует на микротрубочки Для проверки этой rurioiеил исследовали поведение актиновых филаменгов и микротрубочек эндотелиальных клеток при действии тромбина при концентрации 25 нМ в течение 5-60 мин

Обработка тромбином вызывала увеличение количества стресс-фибрилл, распотоженных по всей цитоплазме клетки Визуально содержание стресс-фибрилл во ¡растало в течение первых 30 мин действия тромбина, а загем снижалось Количественный анализ показал, чю в первые 5 мин птошадь стресс-фибрилл увеличилась до 32,0^-7,0% Через 10 мин, площадь филаментов возросла до 36,3±5 2%, а через 30 мин их площадь была максимальной - 40,8*7,3% (рис 1, а) В течение 30-60 мин воздействия тромбина площадь стресс-фибрилл снижалась, и через 60 мин достигала 22,9±3,9%, что соответствует площади стресс-фибрилл в контроле Таким образом, количество стресс-фибрилл увеличивалось и достигало максимума в течение первых 30 мин а затем снижалось до контрольного значения

S?

- во у 80 1 - - Рисунок 1.

На i ■

s «| t-" | ■ I Н I истограммы

'S" I М Н ^ I Н ■ Н изменения количества

Г| , I I I I I I I I ■ стресс фибрилл (а),

Э20! 1 I I I I 3 ■ ■ ■ ■ ■ 1 микротрубочек (б)

- Hill i^llllli

|о1-ШЛ Sil J „L I. I I II воздействия тромбина g К 5 10 30 60 К 5 10 30 60

с

Действие тромбина изменяло распределение актиновых филаментов в цитоплазме клетки Так, в течение первых 10 мин стимуляции, площадь актиновых филаментов на расстоянии 10 мкм от края клетки несколько снижалась по сравнению с контролем (23,7±7,7%), но существенно возрастала в центре клетки (47,5±9,3%) Через 30 мин воздействия тромбина на краю клетки площадь стресс-фибрилл увеличивалась (36,7±7,7%), а в центре клетки снижалась на треть по сравнению с 10 мин, но, тем не менее, была больше, чем в контроле и составляла 29,7±9,4% Таким образом, в течение 10 мин резко увеличивается количество стресс-фибрилл в центре клетки, а через 30 мин стресс-фибриллы остаются в центре, и дополнительно образуются на краю клетки

Действие тромбина приводило к изменению площади клеток Наблюдалась обратная корреляция между площадью клеток и количеством стресс-фибрилл Так, в течение 5 мин стимуляции тромбином площадь клеток незначительно уменьшилась по стравнению с контролем (3781,8*835,9 мкм2) и составляла 3302,6±835,9 мкм2 В течение 30 мин площадь продолжала снижаться, через 10 мин она составляла 3137,6±802,1 мкм2, а через 30 мин -3044,2±893,3 мкм2 В целом, площадь клеток уменьшалась незначительно, минимальная площадь, наблюдаемая через 30 мин воздействия тромбина, отличалась всего на 20% от контрольного значения

Стимуляция тромбином приводила к изменениям в системе микротрубочек эндотелиальных клеток В течение первых 5-10 мин действия, площадь, занимаемая микротрубочками, снижалась с 60,4±5,0% в контроле до 46,1±5,8% при действии тромбина (рис 1, б) Затем площадь микротрубочек постепенно повышалась и через 30 мин увеличивалась до 51,2*9,1% Через 60 мин действия тромбина площадь, занимаемая микротрубочками, приближалась к контрольному значению и составляла 64,7±6,2% от площади клетки Таким образом, количество микротрубочек уменьшалось в течение первых 5-10 мин действия тромбина, а затем увеличивалось до контрольного значения

Система микротрубочек после действия тромбина визуально отличалась от системы микротрубочек в интактных клетках Через 10 мин действия тромбина в зоне 10 мкм от края клетки площадь микротрубочек понижалась в 2 раза по сравнению с контролем и составляла 22,1±6,8%, а в центре клетки существенно не изменялась (78,7±8,1%) В течение 30 мин стимуляции тромбином распределение микротрубочек не изменялось на периферии клетки их было меньше, чем в центральном участке Таким образом, при действии тромбина уменьшалось количество микротрубочек на периферии клетки Можно предположить, что уменьшение общей площади, занимаемой системой микротрубочек, происходило за счет элиминации периферических микротрубочек

Итак, тромбин действовал на клетки эндотелия, вызывая в первую очередь уменьшение кочичества микротрубочек на периферии клетки и затем образование стресс-фибрилл Изменения цитоскелета в присутствии тромбина были обратимы микрогрубочки и актиновые филаменты принимали пехотный вид через 60 мин после начала стимуляции

Сравнение действия нокодазола и тромбина на цитоскелет клеток эндотелия Нокодазол и тромбин вызывают сходный физиологический ответ при действии на эндогелиальный слой - оба вещества резко увеличивают проницаемость эндотслиальною слоя Проведенный морфометрический анализ позволил сравнить действие нокодазола и тромбина на систему актиновых филаментов и микротрубочек

Деполимеризация микротрубочек может вызвать образование стрссс-фибри м но в таком случае деполимеризация должна быть существенной, как при действии нокодазола в концентрации 200 нМ Деполимеризация микротрубочек на периферии кчетки является достаточным условием для формирования стресс-фибрилл в случае действия тромбина, но не достаточна при действии нокодазола в концентрации 100 нМ Исходя и i полученных данных можно предположить, что тромбин не тотько стимулирует деполимеризацию микротрубочек на краю клетки, но также активирует и дру1 ие сигнальные пути приводящие к образованию стресс-фибрилл Поэтому следующий этап работы был посвящен исследованию промежуточных сигнальных молекул в регуляции цитоскелкта эндотелиалъных клеток

Гиперэкспрессия а-субъединиц белков G12/13, Gi и Gq приводит к деполимеризации микротрубочек Тромбин взаимодействуя с PARI рецептором, вызывает диссоциацию промежуточных регуляторов гетеротримерных белков 012/13, Gi и Gq (Bogatcheva et al, 2002) Дня того чтобы изучить принимают ли участие эти белки в процессе образования стресс-фибрилл и уменьшения количества микротрубочек, вызываемых тромбином, в клетках повышали уровень этих молекул путем гиперэкспрессии

Гипсрэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц G12 и G13 белков приводила к существенному увеличению плотности расположения и толщины стресс-фибрилл Наряду с этим происходила практически полная деполимеризация системы микротрубочек в клетках Количественный анализ показал, что площадь, занимаемая стресс-фибриллами при i иперэкспрессии G12 и G13 белков, увеличивалась примерно в 3 раза и составляла 59,6±5,9 и 66,9±7.3% с001ве!ственн0 При этом площадь, занимаемая системой микротрубочек при гиперэкспрессии G12 и G13 бечков, снижалась до 16,8±8 7 и 12,5±6,6% (рис 2, а)

Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъсдинин Gi и Gq белков вызвала аналогичные эффекты увечичение плотности расположения и толщины стресс-фибрилл и

а

К G12 G13 Gi2 Gq

lili

Рисунок 2. Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а), микротрубочек (б), а также площади трансфецированных клеток (в) при гиперэкспрессии активных а-субъеоинщ G12 G13, Gi2 и Gq белков

частичную деполимеризацию микротрубочек Площадь, занятая стресс-фибриллами, увеличилась примерно в три раза и для Gi и Gq белков составите 59,3i6,l и 59,4±8,5% соответственно Площадь, занимаемая микротрубочками при гиперэкспрссоии а-субъединиц Gi и Gq белков составила 42,0*9,9 и 35,7±9,9%, что всего на треть меньше кошрольного значения

Измерение площади клеток показало, что гиперэкспресоия а-субъединиц G12, G13, Gi и Gq белков вызывает значитетьное (в среднем в три раза) уменьшение площади клеток (рис 2, в) Их площадь при гиперэкспрессии а-субъединицы G12 белка составляла 1433,8±400,9 мкм2 G13 - 1132,2*649,7 мкм2, Gi - 1179,8±116,3 мкм2 и Gq 1110,6±364,6 мкм2

Таким образом, обраювание актиновых стресс-фибрилл индуцировала гиперэкстрессия а-субъединиц всех исследуемых белков, однако раэборку микротрубочек в наибольшей степени вызывала гиперэкспрсссия а-субъсдиниц G12 и G13 белков, a в меньшей степени -Gi и Gq белков (рис 2) Площадь ктегок уменьшалась при írniep экспрессии всех четырех исследуемых белков

Полученные результаты позволили предположить, что белки G12/13, Gi и Gq являются промежуточными звеньями в индуцированных тромбином образовании стресс-фибрилл и разрушении микротрубочек

Ингибирование Gi белка приводит к снижению эффекта тромбина на стресс-фибриллы И микротрубочки Для того чтобы выясншь, принимает ли белок Gi участие в индуцированной тромбином перестройке цитоскелста эндотслиальные клетки обрабатывали специфическим ишибитором Gi белка - коклюшным токсином (Kaslow, Bums, 1992)

После обработки токсином количество актиновьгх филаментов незначительно уменьшалось, до 17,5*3,9%, а количество микротрубочек не изменялось и составляло 57,Хз-3,2%(рис 3, а, б) Площадь клеток также не изменялась по сравнению с контролем

Добавление тромбина на 10 мин в среду, содержащую коклюшный юксин (КТ), не вы швало существенных изменений как со стороны актинового цитоскелега, так и со стороны

К КТ ТР КТ+ТР

К КТ ТР КТ+ТР

Рисунок 3.

Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а) и микротрубочек (б) в контроле, при действии КТ, при действии тромбина и действии тромбина в присутствии КТ

микротрубочек Площадь, занятая актиновыми филаментами (21,0±6,8%) и микротрубочками (57,2±3,4%) в клетках, стимулированных тромбином, на фоне действия коклюшного токсина не отличалась от их количества в интактных клетках Площадь клеток также не изменялась по сравнению с контрольным значением

Таким образом, предобработка коклюшным токсином снижает вызванные действием тромбина образование стресс-фибрилл и деполимеризацию микротрубочек

Цитоскелет клеток эндотелия при действии тромбина в присутствии ингибитора ИИо-киназы Действие тромбина приводит к активации ЯЬо и его эффектора Юю-киназы, что стимулирует образование стресс-фибрилл Чтобы выяснить на каком этапе сигнального каскада ведущего от тромбина к формированию стресс-фибрилл, принимают участие микротрубочки, в клетках ингибировали КЬо-киназу с использовшгием У-27632

Воздействие У-27632 при концентрации 5 цМ в течение 1ч не приводило к существенным изменениям в морфологии клеток эндотелия После действия ингибитора в цитоплазме клеток практически полностью отсутствовали актиновые фибриллы Площадь, занимаемая стресс-фибриллами, уменьшилась в 3,5 раза по сравнению с контролем и составила 6,1±2,1% от площади клетки (рис 4, а) Система микротрубочек после действия ингибитора визуально не изменилась; площадь, занимаемая микротрубочками, немного уменьшилась по сравнению с контролем и составила 40,7±5,3% от площади клетки Можно предположить, что уменьшение плотности микротрубочек в центре клетки происходит из-за снижения натяжения внутри клетки при разрушении актшювого каркаса Площадь эвдотелиальных клеток не изменилась по сравнению с контролем и составила 2693±547 мкм2

изменения

Рисунок 4.

Гистограммы количества стресс-фибрилл (а) и микротрубочек (б) в контроле, при действии У-27632, при действии тромбина и действии тромбина в присутствии У-27632

У+ТР

У+ТР

Таким образом, действие ингибитора Юю-кииазы привело к значительному снижению количества актиновых филаментов и некоторому уменьшению плотности чикротрубочек в центре клетки

Ингибирование КЬо-киназы предотвращало вьнваемос тромбином формирование стресс-фибрилл После совместного действия тромбина и ингибитора, площадь стресс-фибрилл не достигала даже контрольного уровня (14,2±3,9%)

Однако ингибирование КЬо-киназы не предотвращало деполимеризацию чикрогрубочек, вызываемую тромбином (рис 4 б) Так, при действии тромбина в присутствии ингибитора плошаль микротрубочек в целой клетке уменьшалась и составила 36,5±3,0% от площади клетки Количество ацетилированного тубулина при действии тромбина в присутствии У-27632 также уменьшалось и относительная площадь, тнимаемая ацетилированными микротрубочками составляла 8,15±1,9% Значительных изменений в площади клеток не происходило

Таким образом, ингибирование Шю киназы приводило к исчезновению стресс-фибрилл, но не влияло на микротрубочки Воздействие тромбина на фоне ингибирования 1Ую-киназы увеличивало площадь, занятую стресс-фибриллами, но не до исходного значения, тогда как микротрубочки разбирались при действии тромбина вне зависимости от присутствия ин1 ибитора Шю-киназ

Суммируя литературные данные и результаты проведенных нами исследований, можно

предложить следующую схему, иллюстрирующую пути Тромбин регуляции цигоскелета, запускаемые тромбином в эндотелиальных клетках (рис 5)

PAR1

Образование стресс-фибрилл, сокращение

1ромбин взаимодействует с РЛГ< 1 рецептором и активирует 012/13, О! и Gq, что приводит к быстрой деполимеризации микротрубочек на периферии клетки, вследствие чего активируется К1ю и его эффектор КЬо-киназа ИЬо-киназа ре1улирует фосфорилирование легких цепей миоиина, активируя актомиозиновые взаимодействия, что приводит к формированию стресс-фибрилл, сокращению клеток и, как следствие к дисфункции эндотелия

Рисунок 5.

ПрсбпО'шгаемая схема путей,

запускаемых тромбином и регулирующих цитоскелет в клетках эндотелия

Анализ системы микротрубочек в цитоплазме клетки по интенсивности флуоресценции тубулина Как было показано ранее, нокодазол в концентрации 200 нМ вызывает формирование стресс-фибрилл в центре эндотелиальной клетки Аналогично действию нокодазола, 1ромбин вызывает полимеризацию стресс-фибрилл в центре клетки, частично деполимеризуя микротрубочки на краю клетки Встает вопрос, каким образом действие тромбина меняет систему микротрубочек эшкмелиальных клеток в целом9 После действия тромбина в клетке остается значительное количество микрогрубочек, что затрудняет более детальный анализ их системы Поэтому для того, чтобы дать оценку всей системы микротрубочек был применен непрямой метод анализа, основанный на измерении интенсивности флуоресценции тубулина в цитоплазме клетки Вначале была разработана модельная система, позволяющая оценить полученный результат, а затем модель была проверена при помощи искусственного понижения птотности микротрубочек в культивируемых клетках

Моделирование системы микротрубочек Для анализа микротрубочек в живых клетках был применен метод моделирования системы микротрубочек с использованием компьютера (см «Материалы и методы») В используемой модели имелись определенные допущения Во-первых, исходное изображение было плоским, поэтому все микротрубочки лежали в одной горизонтальной плоскости и сходились в единый центр («центросому») Во-вторых, все микротрубочки были прямыми и не пересекались друг с другом

В первую очередь анализировалась система, состоящая только из связанных с «центросомой» микротрубочек, имеющих постоянную длину, равную радиусу клетки (рис 6, клетка 1) В такой клетке график убывания оптической плотности с вероятностью 98% аппроксимируемся кривой экспоненциального затухания (рис 4, а) Данная кривая описываемой формулой у=аеЬх с двумя параметрами а^223 и Ь=0,9

Рели исследовать клетку в которой все микротрубочки сходятся в центре но имеют различную длину (длина половины микротрубочек равна '/г радиуса клетки) (рис 4, клетка 2) то коэффициенты уравнения экспоненциальной регрессии а-214 и Ь=0,4, что говорит о более плавном падении оптической плотности (рис 4, б)

Если в клетке присутствуют три класса связанных с центросомой микротрубочек различных по длине (рис 6, кчетка 3), то в этом случае кривая еще убывает менее круто и коэффициенты уравнения экспоненциальной рефессии равны а = 211, Ь = 0,4 (рис 4, в)

Рели в модельную клетку добавить свободные микрогрубочки в небольшом числе -так, чтобы их количество составляло половину от всех микротрубочек в клетке, а длина варьировала от 'Л до 3Л клеточного радиуса (рис 6, кпетка 4), то с вероятностью 99%, падение оптической плотности описывается уравнением экспоненциальной регрессии третьего порядка (у()=19, а-209, Ь=1,01)

I клетка 1

т;

II

клетка 2

клетка 3

С (

I ^ V " '

клетка 4

клетка 5

2 4 6 а ю

участок измерения

Рисунок 6.

Моделирование системы микротрубочек

/ Модельные клетки с розничным количеством и дчинои связанных с «центросомой» и

свободных микротрубочек

И Графики, отражающие падение оптической плотности по мере удаления от центра схождения микротрубочек На ка т дам графике представлена кривая, аппроксимирующая тип зависимости

И, наконец, ести в модельную клетку добавить большое количество свободных микротрубочек (в пять раз превышающее кочичество «центросомальпых») (рис 6, клетка 5), то падение оптической плотности в этом случае с вероятностью 93% описывается линейным уравнением f-k*x+b (рис 6, д)

Таким образом соотношение свободных и связанных с центросомой микротрубочек определяет характер графика, описывающего падение оптической плотности при моделировании системы микротрубочек Для того чтобы график изменения оптической плотности аппроксимировался линейным убыванием, количество свободных микрофубочек в модельной клетке должно в пять раз превышать количество центросомальпых микротрубочек

Экспериментальная проверка модели Для того чтобы сопоставить количество отдельны* микротрубочек в клетках с характером убывания оптической плотности, исследовали клетки Vero в процессе восстаиовтения системы микротрубочек после действия нокодазола

С течением времени восстановления увеличивалось как число свободных, так и число центросомадьных микрофубочек (таблица 1) Восстановление свободных и связанных с центросомой микротрубочек происходило неравномерно, наблюдалась тенденция к увеличению дочи свободных микротрубочек со временем восстановления

Таблица 1. Количество центросомальных и свободных микротрубочек в процессе восстановления системы микротрубочек nocie действия нокодазола

Время восстановления, мин Количество центросомальных микротрубочек Количество свободных микротрубочек % свободных микротрубочек

4 4,4+2,0 0,4±0,3 9,0

8 17,9+1,0 1,9+0,2 10,6

12 26 8±6 2 4 2+1 8 15,6

16 33,4 i 2,4 6,8 + 1,3 20,3

Плотность микротрубочек убывала по мере удаления от цепгросомы, подчиняясь экспоненциальному закону, через 12 мин (Р^0,99) (рис 7, а) 16 мин (Р=0,99) (рис 7, б), 30 мин (Р=0,98) восстановления (рис 7, в) Как было показано ранее, такое распределение характерно для системы микро трубочек, имеющей радиальную организацию Наиболее быстро интенсивность флуоресценции убывала в первый анализируемый момент восстановления (12 мин) коэффициент Ь уравнения экспоненциальной регрессиир=а*ехр'ь*х был равен 0,3 Скорость падения интенсивности флуоресценции в ¡ависимости от расстояния от центросомы имедлялась с течением времени восстановления, и через 30 мин после удаления нокодазола коэффициент Ь стал равен 0,1 - что огражаел увеличение средней

длины микротрубочек в цитоплазме клеток В интактных клстках плотность чикротрубочек по мере удаления от центросомы убывает еше медленнее, чем через 30 мин восстановления Даже на краю клетки (10-й участок) она составтяет 12% от плотности в первом участке Кроме того, закон убывания не экспоненциальный (р<0,95), а аинейный (Р-0,99) (рис 7 г) Если бы система микротрубочек в интактных клетках Vero имела радиальную организацию, и все микротрубочки были закреплены на центросоме, то плотность расположения микро грубочек от центросомы к ламелле должна была бы уменьшаться по экспоненциальному ¡акону Можно предположить, что это несоответствие указывает на присутствие в цитоплазме большого числа свободных микротрубочек Если сопоставить экспериментальные данные с данными полученными в процессе математического

Рисунок 7.

Изменение интенсивности

флуоресценции микротрубочек, расположенных в области между центросомой и ламеллой кпетки в зависимости от времени восстановления после воздействия нокодазола а - 12 мин ,6-16 мин, в - 30 мин, г - интактные клетки

Аппроксимация экспонентой (р>0 99) линеиная аппроксимация (р - 0 99)

моделирования, то число свободных микротрубочек в клетках Vero должно не менее чем в пять раз превышать число центросомальньк

Таким образом предсказанная ранее при помощи математического моделирования зависимость падения оптической плотности микротрубочек от соотношения свободных и свяшнных микротрубочек быта аналогичной зависимости, полученной экспериментально

Оценка состояния системы микротрубочек в норме и при действии тромбина с помощью измерения интенсивности флуоресценции в клетках эндотелия Как бьпо показано ранее, тромбин изменяет систему микротрубочек в клетках эндотелия, в основном элиминируя микротрубочки на краю клетки Каким образом тромбин действует на

микротрубочки во внутренней части клетки, остается пока не ясным Для тою чтобы изучить действие тромбина на всю систему микротрубочек в клетке, был применен метод измерения интенсивности флуоресценции от центросомы до края клетки

В клетках эндотелия в контроле график падения интенсивности флуоресценции с вероятностью 98% описывается экспонентой у=а*еЬх (рис 8, а) Вид уравнения свидетельствует в пользу того, что большинсгво микротрубочек в клетках эндотелия закреплены на центросоме

При действии тромбина (25 нМ, 30 мин) график падения интенсивности флуоресценции выглядит иначе - до 8 участка ишерения наблюдается линейное падение интенсивности, а затем график выходит на плато (рис 8, б) Такое распределение свечения микротрубочек возможно в том случае, если микро трубочки в центре клетки стали располм аться существенно более плотно Это, в свою очередь, возможно при одном из двух вариантов - либо в центре клетке образуется существенное количество свободных микротрубочек, либо микротрубочки в этом районе становятся значительно более изви шми

Рисунок 8.

Изменение интенсивности флуоресценции микротрубочек, расположенных в области между центросомой и пометой а в контрочьных клетках НРАЕС и б - при действии тромбина Аппроксимация зкепонентой (р^0,98), линейная

аппроксимация - (р >0,97)

Таким образом, подводя moi исследованию действия тромбина на строение цитоскелета, а в частности, системы микротрубочек в культивируемых вне организма специалиюрованных эндотелиальных клетках, можно заключить, что воздействие тромбина не только элиминирует периферические микротрубочки, но и меняет их распределение во внутренней цитоплазме клетки

S

расстояние от центросомы, мкм

Выводы

1 Нокодазол в концентрации 100 нМ разрушает микротрубочки на краю клетки, но не оказывает существенного влияния на количество стресс-фибрилл в клетках эндотелия Нокодазол в концентрации 200 нМ, деполимериэуя микротрубочки сильнее, приводит к формированию дополнительных стресс-фибрилл в центре клетки

2 Тромбин индуцирует дисфункцию эндотелия, вызывая в первую очередь, уменьшение количества микротрубочек на периферии клетки, а затем образование стрссс-фибрилл Действие тромбина меняет распределение микрогрубочек в центре ктстки

3 Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц Gl2, G13 Gi2 и Gq белков приводит к увеличению плошости расположения и толщины стреос-фибриш1, разрушению системы микротрубочек и уменьшению площади клетки

4 1 [редобработка коклюшным токсином снижает вызванные действием тромбина образование стресс-фибрилл и деполимеризацию микротрубочек

5 Уровень цАМФ в клетке не влияет на изменения актинового цитоскелета и микротрубочек, вызываемые тромбином

6 Воздействие тромбина на фоне ингибирования Rho-киназы увеличивает площадь, занятую стрссс-фибриллами, югда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне ¡ависимости от присутствия ингибитора Rho-киназ

7. Полученные результаш позволяют предположить, что громбин регулирует акгиновый цигоскелет эндотелиальных клеток через Rho-Rho-киназный путь, где в качестве промежуточного звена выступает деполимеризация микротрубочек на краю клетки

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Смурова КМ Алиева И Б, Воробьев И А 2000 Динамика восстановпеиия микротрубочек после их ра)рушения нокодаюлом в клепсах культуры Vero Тезисы всеросийского симпозиума "Клеточная биолотя на пороге XXI века" Санкт-Петербург, Циюлогия г 43 №4, стр 394-395

2 1 В Alieva, К М Smurova, I A Vorobjcv 2000 Centrosomal and Free Microtubules During Microtubule System Recovery after lis Fxperimental Disruption Mol Cell Biol Supplement volume 11, 362a

3 Alieva 1 В , Smurova К M , Vorobjev I A 2001 Microtubule System Recovery after Its Fxperimental Disruption in cultured Vero cclls 1st International Meeting & Workshop on Advanced bight Microscopy in Santa Mana Imbaro (C hieti), Italy

4 Смурова К M Алиева И Б, Воробьев И А 2002 Динамика восстановления цитоплазматических микротрубочек после их разрушения нокодаюлом в клетках культуры Vero Биологические мембраны т 19 N 6, с 472-482

5 Smurova К M , Chemobelskaya О А , Aheva IВ 2003 The dynamics of microtubule recovery m vivo rapid growth from the centrosome and slow recovery of free microtubules 3d International Meeting & Workshop on Advanced Light Microscopy Barcelona, Spain

6 Смурова К M, Алиева И Б Воробьев И А 2003 В процессе реполимеризации цитоплазматических микротрубочек, разрушенных нокодазолом, формирование радиальной системы предшествует восстановлению свободных микротрубочек Цитолог ия, т 45, № 9, с 928-929 Тезисы 1-ого съезда общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, Россия

7 Bimkova А , Smurova К , Alieva I, Garcia J G , Voyno-Yasenetskaya T, Venn A D 2003 Microtubule Remodeling in Thrombm-mediated Endothelial Permeability Role of G-protein-dependent Signaling Mo! Cell Biol, Supplement volume 12

8 Birukova A , Smurova К , Birukov К , Kaibuchi К, Garcia J G , Venn A 2004 Role of Rho GTPases m thrombm-mduced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction Microvasc Res , vol 67, p 64-77

9 Smurova К , Aheva I, Vorobjev I, Birukova A , Venn A 2004 Role of microtubules in thrombin to actin signal transduction m pulmonary endothelial cells International Symposium Biological Motility, Pushchino, Russia

10 Smurova К, Alieva I, Vorobjev I, Birukova A , Verm A 2004 Reorganization of Microtubule System in Pulmonary Endothelial Cells m Response to Thrombin Treatment FEBS Special Meeting on Cytobkeletal Dynamics From Cell Biology to Development and Disease Helsinki, Tmland

11 Birukova A, Smurova К, Birukov K, Usatyuk P, Liu F, Kaibuchi K, Ricks-Cord A, Natarajan V, Aheva I Garcia J G, Venn A 2004 Microtubule disassembly induces cytoskeletal remodeling and vascular barrier dysfunction role of Rho-dependent mechanisms I Cell Physiol, vol 201, p 55-70

12 Смурова К M , Бирюкова А А , Гарсиа Дж, Воробьев И А, Алиева И Б , Верин А Д 2004 Реорганизация системы микротрубочек в клетках легочного эндотелия в ответ па во ¡действие тромбина Цитология, Том 46, N8, сгр 695-703

13 Smurova К , Aheva 1, Vorobjev I, Birukova A , Venn A D 2004 Reorganization of microtubule system in pulmonary endothelial cells in responce to thrombin trearment EL SO Annual Congress Nice, France

14 Birukova A , Birukov К , Smurova К , Kaibuchi К Aheva I, Garcia J G , Verm A 2004 Crosstalk between G-proteins and microtubules in thrombm-mduced endothelial bamer dysfiinction FASFB J, vol 18, p 1879-1890

Подписано в печать 28.12.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 усл.пл.

Тираж 75 экз. Заказ № 220 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

РНБ Русский фонд

»--66 1 2006-4

1984

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смурова, Ксения Михайловна

Введение

Обзор литературы

Микротрубочки

Строение микротрубочек

Тубулин способен полимеризоваться in vitro

Полярность микротрубочек

Динамическая нестабильность

Трэдмиллинг 12 Описание динамики отдельной микротрубочки и сети цитоплазматических микротрубочек в целом

Стабильные микротрубочки

Белки, ассоциированные с микротрубочками

MAP белки

Моторные белки

Минус-концевые белки

Плюс-концевые белки

Актин

Актин спонтанно полимеризуется in vitro

При образовании актинового филамента происходит гидролиз АТФ

Актиновый филамент обладает полярностью

Белки, взаимодействующие с мономерным актином

Белки, взаимодействующие с акгиновыми филаментами

Миозины

Образование новых филаментов

Полимеризация актина приводит к движению клеточной мембраны

Актин-связывающие белки in vivo

Акгиновые структуры в клетке

Rho-белки

Общие свойства микротрубочек и актина

Взаимодействия микротрубочек и актина

Регуляторные взаимодействия

Структурные взаимодействия

Микротрубочки и актиновые филаменты в районе контактов

Внутриклеточный транспорт

Эндотелий

Тромбин

Гетеротримерные G-белки

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина

Цель и задачи работы

Материалы и методы

Культура клеток

Трансфекция

Экспериментальные воздействия

Иммунофлюоресцентное окрашивание

Получение и обработка цифровых изображений 44 Количественная оценка системы актиновых филаментов и микротрубочек

Анализ системы микротрубочек в клетках Vero

Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клеток Vero 46 Анализ интенсивности флуоресценции тубулина в ламелле клеток Vero

Моделирование системы микротрубочек

Статистическая обработка данных и построение графиков

Результаты

Актин и микротрубочки в нативных клетках эндотелия человека

Актин

Микротрубочки

Ацетилированные микротрубочки

Тирозилированные микротрубочки

Действие наномолярных доз нокодазола на цитоскелет клеток эндотелия

Действие нокодазола в концентрации 100 нМ

Действие нокодазола в концентрации 200 нМ

Действие тромбина на цитоскелет клеток легочного эндотелия человека

Актиновые филаменты при действии тромбина

Площадь клеток при действии тромбина

Микротрубочки при действии тромбина

Сравнение действия нокодазола и тромбина на цитоскелет клеток эндотелия

Гиперэкспрессия а-субъединиц белков в 12/13, в! и вц приводит к деполимеризации микротрубочек 64 Ингибирование белка приводит к снижению эффекта тромбина на стрессфибриллы и микротрубочки 68 Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии активатора аденилатциклаз

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии форсколина

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в присутствии форсколина

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в присутствии форсколина

Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии ингибитора Шю-киназ 74 Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии ингибитора Шюкиназы У

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в 75 присутствии У

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в 78 присутствии У-27632 Анализ системы микротрубочек в цитоплазме клетки по интенсивности 80 флуоресценции тубулина

Моделирование системы микротрубочек

Экспериментальная проверка модели 83 Оценка состояния системы микротрубочек в норме и при действии тромбина с помощью измерения интенсивности флуоресценции в клетках эндотелия

Обсуждение результатов

Взаимодействия микротрубочек и актина в клетках эндотелия 90 Участие микротрубочек в передачи сигнала от тромбина к актиновому цитоскелету 95 Новые подходы к изучению системы микротрубочек в культивируемых клетках

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Участие микротрубочек в регуляции актинового цитоскелета в клетках эндотелия"

Взаимодействия микротрубочек и актина лежат в основе многих фундаментальных клеточных процессов, таких как клеточная подвижность (Vasiliev et al., 1970; Wittmann, Warerman-Storer, 2001; Small et al., 2002; Salmon et al., 2002), деление клетки (Caman et al., 2000; Glotzer, 2001; Kuriyama et al., 2002), движение кортикального тока клетки (Canman, Bement, 1997; Mandato et al., 2000).

В литературе выделяют несколько типов взаимодействий между микротрубочками и актином. Так, системы микротрубочек и актиновых филаментов контролируют одна другую непрямым образом, действуя через сигнальные каскады. Примером тому является белок RhoA, функционирование которого приводит к формированию стресс фибрилл, а также к избирательной стабилизации микротрубочек (Cook et al., 1998). Кроме регуляторных взаимодействий между двумя системами существуют структурные взаимодействия, то есть микротрубочки и актиновые филаменты связаны при помощи кросс-линкерных белков (Svitkina et al., 1996; Fuchs, Karakesisoglou, 2001; Rodriguez et al., 2003). В литературе существуют данные, что структурные взаимосвязи между микротрубочками и актиновыми филаментами также могут являться и регуляторными (Fukata et al., 2002).

В общем, принцип взаимодействия систем микротрубочек и актиновых филаментов можно назвать функциональной кооперацией. Разрушение одной системы филаментов оказывает сильный эффект на организацию другой системы (Danowski, 1989; Bershadsky et al., 1996; Enomoto, 1996; Cook et al., 1998). Выявлены структурные связи между микротрубочками и актиновыми филаментами. Факторы, выявленные как белки, ассоциированные с микротрубочками, могут связывать актиновые филаменты и микротрубочки in vitro и in vivo. Таким образом, системы микротрубочек и актиновых филаментов связаны как структурно, так и функционально, и эти взаимодействия используются эндотелиальными клетками для поддержания ими свойства эндотелиального барьера (Lee, Gotleib, 2003).

Недавно было показано, что поддержание барьерной функции клетками эндотелия зависит от координированной работы двух компонентов цитоскелета этих клеток - микротрубочек и актиновых филаментов (Verin et al., 2001; Petrache et al., 2003; Birukova et al., 2004). За последнее время было накоплено значительное количество данных о том, что действие воспалительных медиаторов (в том числе тромбина) приводит к реорганизации актинового цитоскелета в клетках эндотелия.

Тромбин, действуя на клетки через специфический рецептор, запускает каскады внутриклеточных реакций, что приводит к увеличению проницаемости эндотелиального барьера, сопровождаемому более интенсивным фосфорилированием легких цепей миозина и формированием дополнительных стресс-фибрилл в эндотелиальных клетках (Garcia et al 1995, 1996; Verin et al., 2000). С другой стороны, усиление проницаемости легочного эндотелия и увеличение уровня фосфорилирования легких цепей миозина происходят в ответ на деполимеризацию микротрубочек нокодазолом (Verin et al., 2001). Связав воедино эти факты, можно предполагать, что воздействие тромбина может вызывать реакцию микротрубочек, аналогичную той, что вызывает экспериментальное воздействие нокодазола. Проверяя это предположение, в данной работе мы пытались понять, каким образом связаны эти два процесса - действие тромбина и разборка микротрубочек - в клетках эндотелия, сохранивших после выделения в культуру свое функциональное свойство.

Появление новых данных во многом было связано с прогрессом в биологических методах исследования, однако, несмотря на появление новых методических подходов, многие вопросы взаимосвязи микротрубочек и актиновых филаментов в настоящее время остаются открытыми. Поэтому в нашей работе и исследовалась взаимосвязь актина и микротрубочек, а в качестве модели использовались культивируемые эндотелиальные клетки.

В работе было показано, тромбин индуцирует дисфункцию эндотелия, вызывая в первую очередь уменьшение количества микротрубочек на периферии клетки, и затем образование стресс-фибрилл. Действиенокодазола в концентрации 200 нМ, разрушая микротрубочки более существенно, также приводит к образованию стресс-фибрилл. Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц регуляторных белков G12, G13, Gi2 и Gq ведет к существенному увеличению плотности расположения и толщины стресс-фибрилл, разрушению системы микротрубочек и уменьшению площади клетки. Воздействие тромбина на фоне ингибирования Rho-киназы увеличивает площадь, занятую стресс-фибриллами, но не до исходного значения, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора Rho-киназ. Действие тромбина не только элиминирует периферические микротрубочки, но и меняет их распределение в центре клетки.

Наши результаты позволяют предположить, что тромбин регулирует актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток через Rho-Rho-киназный путь, где в качестве промежуточного звена выступает деполимеризация микротрубочек на краю клетки.

Обзор литературыМикротрубочкиМикротрубочки — особые клеточные структуры, обладающие характерным строением и являющиеся одним из составляющих цитоскелета. встречаются практически во всех типах эукариоптических клетках.

Микротрубочки играют важную роль в процессах внутриклеточного транспорта, поддержании клеточной формы и в клеточном движении. Во время митоза микротрубочки формируют митотическое веретено н участвуют в перемещении хромосом.

25 пт протофиламентыСтроение микротрубочекМикротрубочки представляют собой полыеневствящиеся цилиндры с внешним диаметром 25 нм ивнутренней полостью диаметром 14 нм (рис. 1).

Стенка цилиндра микротрубочки состоит извысоко консервативного глобулярного белка тубулина. ту0^пинаМолекула тубулина представляет собой гетеродимер, Рисунок 1. Строениеобразованный из двух близкородственных белков — а и микротрубочки ь (Alberts et ai„ 2002).ß-тубулина, связанных нековалентной связью(Weisenberg 1972; Mitchison, Kirschner., 1984). Размер димера тубулина составляет 4x8 нм. В животной клетке встречается, по меньшей мере, шесть изоформ а и ß-тубулина (Raffet al., 1997).

В процессе сборки микротрубочек возникает два типа контактов между тубулиновыми димерами: продольные контакты «голова-хвост» между двумя димерами в протофиламенте и латеральные - между двумя параллельными i фотофила мен там и. составляющими стенку микротрубочки. Продольные контакты более сильные, чем латеральные, поэтому при деполимеризации полимера происходит отслаивание фрагментов иротофиламентов от конца микротрубочки (Mandelkow et al., 1991).

Кроме тубулина в состав микротрубочек входят белки, ассоциированные с микротрубочками — МАР-белки (microtubule associated proteins). Их состав варьирует в зависимости от клеточного типа.

Полярность микротрубочекВ опытах по полимеризации растворенного тубулина, выделенного из мозга быка, на фрагментах аксонем ресничек (Allen, Borisy, 1974) было показано, что на одном конце затравки микротрубочки растут быстрее, чем на противоположном. Быстро растущие концы микротрубочек были названы плюс-концами, а медленно растущие — минус-концами. Полярность микротрубочек обусловлена различной ориентацией субъединиц а- и ß-тубулинов в ее составе. На краю плюс-конца находятся ß-субъединицы, а на краю минус-конца - а-субъединицы.

Динамическая нестабильностьЯвление динамической нестабильности (dynamic instability) было описано впервые в работах Митчизона и Киршнера в 1984 году (Mitchison, Kirshner, 1984). Согласно теории динамической нестабильности Митчизона и Киршнера на обоих своих концах микротрубочки находятся в состоянии постоянной полимеризации-деполимеризации. Скорость сборки-разборки на плюс-конце значительно выше, чем на минус-конце. Собственно, чередование фаз сборки и разборки и получило название динамической нестабильности.

Суть явления динамической нестабильности такова: после включения молекулы тубулина в состав микротрубочки происходит гидролиз ГТФ, связанного с тубулином, до ГДФ. Молекулы тубулина, несущие ГТФ, прочнее связываются с концом микротрубочки (имеют большее сродство) и имеют меньшую константу диссоциации. При быстром росте микротрубочки происходит запаздывание гидролиза, поэтому на быстро растущем конце образуется «шапочка» из ГТФ, препятствующая разборке и способствующая росту микротрубочки. При уменьшении скорости роста происходит полный гидролиз ГТФ на тубулине, и микротрубочка начинает укорачиваться. Фазысборки и разборки длятся но нескольку десятков секунд, переход от роста к укорочению носит случайный характер (рис. 3).димер тубупинаобмен СОР на вТРукорочениеРисунок 3. Гидролиз GTP в процессе деполимеризации микротрубочек (Alberts et al, 2002).GTP кэпгидролиз СТР меняет конформэцию субъединиц и ослабляет связи между нимидеполимеризацияменее стабильный участок МТ содержит СОР-тубулинТрэдмиллингВ условиях равновесия между е о л им ер из о ванным и демолимеризованным губулином [1а плюс-конце происходит преимущественно сборка, а на минус-конце — разборка микротрубочек. Таким образом, происходит удлиннение микротрубочки на одном конце и одновременное ее укорочение на противоположном. Молекулы тубулина, включенные в состав микротрубочки на плюс-конце, медленно передвигаются к минус-концу, где происходит диссоциация. Этот процесс называется трэдмиллингом.

За трэдмиллингом можно наблюдать, введя в клетку флуоресцентную метку в низкой концентрации. После микроинъекции в клетку меченного 1убулина в ее цитоплазме остается эндогенный немеченый тубулин. Онвключается в микротрубочку наравне с меченным тубулином, поэтому каждая микротрубочка обладает своим уникальным рисунком свечения. Если микротрубочка передвигается, а рисунок остается на месте, то можно говорить о трэдмиллинге.

Оказалось, что не в любых клетках микротрубочки могут находиться в состоянии трэдмиллинга - в большинстве существующих клеточных линии тредмиллинг не наблюдается никогда (Rodionov et al., 1999).

Трэдмиллинг можно наблюдать не только в целых клетках, но и в цитоплазматических фрагментах, лишенных центросомы (Rodionov, Borisy, 1997; Rodionov, et al., 1999). При энуклеации фибробластов, в полученных бесцентросомальных фрагментах поведение микротрубочек меняется с динамической нестабильности на трэдмиллинг. Однако в бесцентросомальных фрагментах эпителиальных клеток, плюс-концы микротрубочек показывают динамическую нестабильность, а минус-концы остаются достаточно стабильными. Возможно, в цитоплазме эпителиальных клеток присутствует фактор, стабилизирующий минус-концы свободных микротрубочек (Rodionov et al., 1999).

Описание динамики отдельной микротрубочки и сети цитоплазматических микротрубочек в целомДля количественного описания кинетики поведения конца индивидуальной микротрубочки используют три параметра: скорость полимеризации, скорость деполимеризации и частоту переключения между этими состояниями (Walker et al., 1988). В среднем, в эпителиальных клетках скорость укорочения и удлинения микротрубочек меньше, чем в фибробластах, а частота перехода из фазы укорочения к фазе роста выше. Скорости полимеризации и деполимеризации микротрубочек измерены в клетках разных типов (Shelden, Wadsworth, 1993; Dhamodharan, Wadsworth, 1995; Danowski, 1998; Vorobjev et al., 1997; Rodionov et al., 1999). Оказалось, что эти параметры зависят от типа клетки.

Для описания динамики сети микротрубочек в целом была такжепредложена модель случайного одномерного блуждания (Vorobjev et al., 1997). Авторы модели предполагают, что в каждый момент времени вероятности присоединения и отсоединения субъединицы тубулина на конце каждой индивидуальной микротрубочки равны. Для количественной оценки авторы предлагают использовать два параметра - коэффициент диффузии и коэффициент сноса.

Коэффициент диффузии учитывает различия в поведении отдельных микротрубочек, характеризуя амплитуду осцилляции их концов и равен половине дисперсии смещений концов микротрубочек за искомое время.

Второй параметр - коэффициент сноса. Коэффициент сноса характеризует среднюю скорость смещения концов микротрубочек. Предложенная авторами модель может быть использована только в клетках, где смещение концов микротрубочек описывается нормальным распределением.

Параметры динамической нестабильности видоспецифичны, не постоянны на протяжении клеточного цикла и могут изменяться под воздействием как внутриклеточных, так и внешних факторов. Так, молекулы, связывающиеся с микротрубочками в норме, могут регулировать динамику микротрубочек — например, MAP и МАР-2 уменьшают параметры динамической нестабильности (Dhamodharan, Wadsworth, 1995). При переходе клеток в митоз параметры динамической нестабильности существенно изменяются: микротрубочки становятся более динамичными, возрастает частота катастроф. Это связано с действием таких белков, как Opl8/statmin и ХКСМ1 (Walczak, 2000). Многие химические факторы, вносимые извне, также могут изменять параметры динамической нестабильности. Например, известно, что нокодазол в наномолярных концентрациях влияет на динамику микротрубочек in vivo и in vitro (Vasquez et al., 1997; Григорьев и др., 1997).fСтабильные микротрубочкиВо многих клетках встречаются стабильные микротрубочки (Schuize et al, 1987; Gundersen et al, 1987). В течение многих минут, и даже часов, они не укорачиваются и не удлиняются, в то время как период полуобмена обычных микротрубочек исчисляется минутами в разных клеточных линиях (Wadsworth, McGrail,1990; Vorobjev et al.,1999).

Часто стабильные микротрубочки отождествляют с модифицированными. Сейчас известны три основных типа модификации микротрубочек — ацетилирование, полиглютаминирование и детирозилирование (Gundersen et al., 1984, Maruta et al., 1986; Piperno et al., 1987). Считается, что эти процессы происходят уже после сборки полимера.

В работе Шульца (Schulze et al., 1987) обсуждается связь между посттрансляционной модификацией и стабильностью микротрубочек. Автор утверждает, что постгрансляционная модификация недостаточна для ф достижения стабильности микротрубочек. Так, например, клетки PtKi неимеют ацетилированных микротрубочек, но у них есть стабильные; а эмбриональные фибробласты цыпленка, наоборот, содержат мало стабильных микротрубочек, но много модифицированных. Следовательно, разные типы клеток могут иметь специфические фракции микротрубочек за счет различающихся параметров постгрансляционной модификации и разной скорости обмена микротрубочек.

Белки, ассоциированные с микротрубочкамиMAP белкиКроме тубулина в состав микротрубочек входят различные минорные белки с молекулярной массой от 20 кД до 350 кД. Эти белки получили общее название MAP (от английского microtubular associated proteins). Их состав варьирует в зависимости от клеточного типа. В интерфазе MAP связаны с микротрубочками по всей длине, стабилизируя их структуру. При переходе к митозу происходит гиперфосфорилирование MAP, их связь с микротрубочками ослабляется, и микротрубочки становятся более*динамичными (Tournebize, 2000). На данный момент их известно несколько десятков, и если первые из открытых белков получали соответствующий порядковый номер (MAPI, МАР2 и т.д.), то по мере открытия все новых и новых белков им стали присваивать персональные названия. Наиболее изученные белки, традиционно относимые к этой группе - MAPI, МАР2, МАР4 и tau - влияют на динамические показатели микротрубочек, как правило, стабилизируя их. Белки группы MAPs имеют домен, выступающий из стенки микротрубочки, что позволяет белкам из этого семейства выступать как связующее звено между микротрубочками и различными регуляторными молекулами (Gundersen, Cook., 1999; Srivastava et al., 1998; Gundersen, Cook., 1999). Недавно было показано, что белок МАР2 в нейронах связывается с актиновыми филаментами, причем актин-связывающий домен этого белка расположен внутри домена, связывающего микротрубочки (Roger et al., 2004).

Наиболее хорошо изучен белок, относящейся к группе MAPs, который присутствует в клетках животных - МАР4 (Bulinski, 1994; Nguyen et al., 1997). Данный белок стабилизирует микротрубочки (Ookata et al., 1995). Связь МАР4 с микротрубочками регулируется белком мапмодулином (mapmodulin) (Ulitzur et al., 1997).

Кроме белков группы MAP, на микротрубочках располагаются различные белки-моторы, которые осуществляют транспорт макромолекул по микротрубочкам (Nguyen et al., 1997).

Моторные белкиТранспорт вдоль микротрубочек опосредован белковыми моторами -динеином и кинезинами (Schliwa, 1984; Walker, Sheetz, 1993; Langford, 1995). Одним концом молекулы этих белков ассоциированы с транспортируемым материалом, в основном, мембранами различных органелл а другим - с микротрубочками. Различные представители семейства кинезинов обеспечивают в основном транспорт мембранных органелл от минус к плюс-концу микротрубочки, принимая непосредственное участие в движении хромосом (Endow, 1999).

Цитоплазматический белок динеин - минус-концевой мотор -обеспечивает транспорт в обратном направлении (Paschal et al., 1987; Parschal, Vallee, 1987). Цитоплазматический динеин - комплексный белок (1,2 MDa), состоящий из двух тяжелых цепей по 500 кД. Из тяжелых цепей формируются две головы мотора, обладающие АТР-азной активностью. Также в комплекс входят две средние цепи (70-74 кД), две легкие средние цепи (53-59 кД) и две легкие цепи (8-22 i^)(Paschal et al., 1987; King et al., 1996). Для выполнения своих функций динеину требуется присутствие белка динактина, который впервые был идентифицирован как фактор, активирующий опосредованный динеином транспорт цитоплазматических гранул in vitro (Schroer, Sheetz, 1991). Динактин представляет собой комплекс, состоящий из 7 белков, имеющих размеры от 22 до 150 кД (Holleran et al., 1998). Динактин выступает в роли адаптера, позволяющего динеину связываться с транспортируемыми молекулами.

Таким образом, по микротрубочкам в клетке осуществляется транспорт различных карго, вплоть до целых органелл, и этот транспорт опосредован белками-моторами.

Минус-концевые белкиНа минус-конце микротрубочки локализуются у-тубулин, катанин и нинеин (ninein). у-тубулин - это высоконсервативный, минорный белок, который в составе сложного комплекса способен нуклеировать микротрубочки (Moritz 1995; Moritz et al., 1995; Vogel et al., 1997; Martin et al., 1998; Oegema et al., 1999; Moritz et al., 2000). Он был обнаружен и впервые описан в работах Окли (Oakley, Oakley, 1989). В составе сложного комплекса (yTuRC y-tubulin ring complex, 3000 кД), состоящего из нескольких копий самого у-тубулина и еще как минимум восьми белков, у-тубулин способен нуклеировать микротрубочки (Moritz 1995; Moritz et al., 1995; Vogel et al., 1997; Martin et al., 1998; Oegema et al., 1999; Moritz et al., 2000). В состав комплекса входят около 10-13 молекул у-тубулина (Zheng et al., 1995; Oegema et al., 1999). Именно у-тубулин представляется сейчас исследователям ключевым фактором в процессе нуклеации микротрубочек(Zheng et al., 1995; Wiese. Zheng, 1999; Moritz et al., 2000). В 1998 году был открыт малый KOMrmqticuSC (smal! y-lubulin сотр1ехкД£40 являющегося подфракцией компле^^аКС и локализованного в цитоплазме (Moritz et al., 1998; Oegeina et al., !999^TuSC состоит из двух молекул у-тубулина и двух высоко консервативных белков (Oegema ei al., 1999). Исследование данных комплексов с точки зрения нуклеации микротрубочек показало, чтсуТиКС нуклсирует микрогрубочки в 150 раз эффективнее. чемуТиБС (Oegema et al., 1999).Таким образом, за нуклеацию микротрубочек на центросоме, вероятно, отвечает все же большой комплекс, т.е. yTuRC. С помощью элсктронно-микроскопической томографии (Moritz etal., 2000) и метода электронно-микроскопической иимунолокализации (Keating, Borisy. 2000), было показано, что именно yTuRC формирует затравку для нуклеации микротрубочек. Основываясь на представленных выше фактах и данных собственных исследований, Китинг и Бориеи предложили модель кэпирующей и нуклеирующей затравки микротрубочки. Молекулы у-тубулина (красные кружки на схеме) взаимодействуют а-сгубулином (белые кружки) и другими белковыми компонентамир-тубулинового комплекса - Xgrip 109 и 110 (желтые и оранжевые эллипсы). Эта спиральная структура взаимодействует с конусообразным концевым участком, состоящим из оставшегося Xgrip (голубая зона). Также был обнаружен новый белок, входящий в сослав тубулинового комплекса - CPAP (centrosomal PI.4-assosiated protein). Длина и число связанных с центросомой микротрубочек существенно уменьшается, если in vitro инкубировать центросому с антителами к CPAP. В то же время, полимеризация микротрубочек в отсутствии центросомы не подавляется при добавлении антител к CPAP (Hung et al., 2000).

Рисунок 4. Модель копирующей и нуклеирующей затравки микротрубочки (Keating, Borisy. 2000).

Биохимические и ультраструктурные исследования показали, что у-тубулин является компонентом перицентриолярного материала и тесно ассоциирован с центриолями. В то же время, около 80% от общего количества у-тубулина в клетке находится в свободной цитоплазматической форме и только 20% связано с центросомой (Moudjou et al., 1996). При этом на ультраструктурном уровне у-тубулин выявляется в составе центросомы на всех стадиях клеточного цикла (Muresan et al., 1993). у-Тубулин связан в основном со стенкой центриолярных цилиндров, но, вместе с тем, входит и в состав перицентриолярного материала (Moudjou et al., 1996). Известно также, что у-тубулин связан с центриолями независимо от того, являются ли они центрами организации микротрубочек (Комарова и др., 1996). Было показано, что в составе микротрубочек содержится очень незначительное количество у-тубулина (Baas, Joshi, 1992). Однако показано, что у-тубулин необходим для сборки микротрубочек на центросомах in vivo (Oakley et al., 1990) и, возможно, in vitro (Joshi et al., 1992).

Также минус-концевым белком микротрубочек является катанин -белок, способный разрезать микротрубочки, принимающий участие в отсоединении микротрубочек от центросомы (Ahmad et al., 1999). Белок нинеин, для которого в некоторых клеточных линиях была показана локализация на минус конце микротрубочек, участвует в заякоревании минус конца микротрубочки на материнской центриоли (Mogensen et al., 2000; Piel et al., 2000).

Плюс-концевые белкиНедавно был открыт ряд белков, располагающихся на плюс-конце микротрубочки. Цитоплазматический линкерный белок CLIP-170 (cytoplasmic linker protein 170) был первым белком, для которого была показана колокализация с плюс-концом микротрубочек (Rickard, Kreis., 1990; Diamantopoulos et al., 1999). Причем взаимодействует этот белок только с растущим плюс-концом микротрубочки (Perez et al., 1999). В одной из последних работ из лаборатории Г. Бориси было показано, что CLIP-170может выступать как фшсшр^пасения для микротрубочек (Komarova et al., 2002). К этому же семейству относится белок CLIP-115, который может связываться с другими плюс-концевыми белками, образуя сложный комплекс на плюс-конце микротрубочки (Akhmanova et al., 2001).

Еще один представитель группы белков, локализующихся на плюс-конце микротрубочек - белки семейства ЕВ (end bounding), ЕВ1, ЕВ2 и ЕВЗ консервативны от дрожжей до человека (Tirnauer, Bierer, 2000). Эти небольшие белки (около 35 кД) также специфически связываются только с растущим плюс-концом микротрубочки (Schuyler, Pellman, 2001). Как и другие плюс-концевые маркеры, ЕВ1 формирует кометообразный комплекс на полимёризующемся конце микротрубочки (Mimori-Kiyosue et al., 2000). Находясь на растущем плюс-конце микротрубочки, белок может регулировать его динамику и выступать маркером для взаимодействия с другими белками (Scroer, 2001). Дрожжевой гомолог ЕВ1 - Bimlp, связывается с растущим концом микротрубочки и выполняет две функции. Во-первых, он влияет на динамику микротрубочек, увеличивая частоту переходов, и, снижая частоту пауз (Tirnauer et al., 1999), таким образом, стабилизируя микротрубочки (Tirnauer et al., 2002). Во-вторых, Bimlp осуществляет связь плюс-конца микротрубочки с клеточным кортексом, взаимодействуя с кортикальным белком Kar9p (Lee et al., 1999; Tirnauer et al., 1999; Miller et al., 2000).

Помимо этих белков известны CLASP (CLIP Associated Proteins) и pl50gIud, также связанные с плюс-концом микротрубочек (Hoogenraad et al., 2000; Akhmanova et al., 2001). Считается, что перечисленные белки образуют сложный комплекс на плюс-конце микротрубочки (Akhmanova et al., 2001; Komarova et al., 2002).

Современные представления о составе и взаимном расположении белкового плюс-концевого комплекса микротрубочки суммированы на рис. 5.

Недавно было показано, что плюс-концевые белки микротрубочек играют роль связующего звена между микротрубочками и актиновымифиламентами. Так. CUP-170 имеет сайг связывания с мультидоменным регул нторным белком1QGAP1, ассоциированным с актином, в клетках эпителия и фибробластах (Bashour et al., 1997; Fukata el al., 2002). Белок АРС колокализуется с актиновыми филаментами и растущими концами микротрубочек, он связывает плюс-концевой белок микротрубочек ЕВ1 и принимает участие в формировании митотического веретена (McCartney et al., 2001: Barth et al., 2002). Также микротрубочки и актиновые филаменты мот быть связаны посредством моторных белков (Huang et al., 1999).

АктинАктин - один из наиболее универсальных белков животной клетки, принимающий участие в обеспечении всех форм мышечной и немышечной подвижности. Актин вовлечен в выполнение таких важных для жизнедеятельности клетки и организма в целом функции, как фагоцитоз, движения цитоплазмы, цитокинез. Актин представляет собой глобулярный белок, состоящий из одной полипептидной цепи из 375 аминокислотных остатков. Молекулярный вес актина составляет около 42 к Д. Актин является высококонсервативным белком; его аминокислотная последовательность сходна у растений, животных и дрожжей. У высших эукариот актин кодируется семейством генов. На данный момент идентифицировано как минимум шесть изоформ актина, которые объединяют в 3 класса, на основании характерной для каждого тканеснецифичносги. 11апример, а-актин содержится в гладкой, гюпсречно-полосатой и сердечной мускулатуре^ и у-актины в основном встречаются в немышечных тканях. ИзоформыДинактин fIip170 ЕВ1 Lisi< Clasp2 » ЕВЗАРСClasplV" ЕВ 2Clipl 15Рисунок 5. Плюс-концевые белки микротрубочки (Akhmanova, Galjart; www.bioclips.com)практически не отличаются по способности полимеризоваться и взаимодействовать с другими белками.

Актин спонтанно полимеризуется in vitroАктин выделяют в основном из мышечной ткани, а заем подвергают очистке. При низких концентрациях солей очищенный актин находится в форме мономера, но в условиях физиологического раствора (в присутствии Mg2+ и АТФ) актин спонтанно полимеризуется, образуя филаменты (Fechheimer, Zigmond, 1993). Мономер актина (G-актин) имеет на поверхности сайт связывания с другим мономером. В результате взаимодействия мономеров образуется полимерный филамент (F-актин). Отдельный филамент представляет собой двойную спираль, в которой каждый мономер взаимодействует с четырьмя соседними, причем более сильные связи расположены вдоль каждой из двух спиралей (Bamburg et al., 1999).

Аналогично полимеризации микротрубочек, процесс полимеризации актина протекает в несколько этапов - вначале наблюдается самая медленная лаг-фаза, во время которой три молекулы актина должны соединиться в определенной геометрической конфигурации. Эта стадия называется нуклеацией. Когда нуклеация произошла, дальнейшее присоединение новых молекул актина к концам филамента (полимеризация) происходит быстро. Процесс сборки филаментов обратим - в конце концов, концентрация мономеров падает до уровня, при котором скорости ассоциации и диссоциации мономеров становятся равными, и процесс полимеризации замедляется. Такую концентрацию называют критической. И нуклеация, и полимеризация актина находятся под контролем различных актин-связывающих белков, которые определяют местоположение и длину актиновых филаментов в клетке.

При образовании актинового филамента происходит гидролиз АТФАналогично тубулину, актин имеет на своей поверхности нуклеотид-связывающий сайт, однако в случае актина связанным нуклеотидом являетсяАТФ. Мономеры актина, несущие АТФ, присоединяются к растущему филаменту примерно в 10 раз быстрее, чем мономеры, связанные с АДФ (Wanger, Wegner, 1983). В результате на конце растущего филамента образуется «шапочка» (cap) из молекул, ассоциированных с АТФ. Актиновый филамент, утративший АТФ-сар, с большой вероятностью будет деполимеризоваться (Carlier, 1990). С течением времени АТФ, связанный с составляющими филамент мономерами актина, гидролизуется до АДФ и неорганического фосфата, и такие мономеры деполимеризуются на минус-конце. Для того, чтобы мономер вновь смог полимеризоваться, необходимо, чтобы произошел обмен связанного с ним АДФ на АТФ (Fechheimer, Zigmond, 1993).

Актиновый филамент обладает полярностьюАналогично микротрубочкам, актиновый филамент обладает полярностью, которая обусловлена ориентацией составляющих филамент молекул.

Полярность актинового филамента можно легко определить на электронно-микроскопическом уровне. Метод выявления использует принцип взаимодействия актиновых филаментов с миозином, поскольку миозин связывается с актином строго определенным образом. Продукт взаимодействия актина с миозином имеет вид «стрел», направленных в сторону конца филамента, названного заостренным (минус конец). Противоположный конец актинового филамента получил название оперенного (плюс-конец).

Следствием полярности актинового филамента является различная кинетика полимеризации на разных концах филамента. Это отличие можно обнаружить, если пометить небольшой участок актинового филамента, декорированного миозиновыми головками, а затем добавить к ним мономеры актина в условиях, благоприятных для полимеризации. Зафиксировав через некоторое время растущие актиновые филаменты можно увидеть, что их плюс-концы выросли в среднем в 10 раз больше, чем минус-концы (Cooper,#Pollard, 1982). Эксперименты с добавлением радиоактивно меченного актина к смеси мономеров актина показали, что меченные молекулы, включившиеся в образовавшийся филамент с полюс-конца в итоге покинут его с минус-конца. Этот процесс получил название трэдмиллинга (Wanger et al., 1985).

Белки, взаимодействующие с мономерным актиномБыло показано, что концентрация деполимеризованного актина в цитозоле очень высока - около 200 рМ (Amann, Pollard, 2000). Для сравнения, критическая концентрация для полимеризации актина в ионном растворе примерно в 1000 раз ниже, порядка 0,2 цМ (Pollard, 1986). Более того, оборот субъединиц, входящих в состав филамента в клетке происходит в 100-200 раз быстрее, чем в очищенном растворе актина. Эти существенные отличия происходят из-за того, что в цитоплазме клеток присутствуют особые белки - Р-тимозин, профилин и кофилин, которые способны взаимодействовать с мономерным актином и регулировать его свойства (Sun Ф et al., 1995).

Р-тимозин связывается с АТФ-актином и изолирует пул деполимеризованного актина для того, чтобы он мог мгновенно высвободиться при необходимости полимеризации актиновых филаментов (Cassimeris et al., 1992; Nachmias et al., 1993). Профилин катализирует обмен связанного с актином АТФ и способствует переносу субъединиц актина с тимозина на плюс-конец полимеризующегося актина, регулируя сборку актиновых филаментов вблизи клеточной мембраны (Pantaloni, Carlier, 1993; Carlier et al., 1993). И, наконец, кофилин (также известный как ADF - фактор, деполимеризующий актин) прочно связывается с субъединицами актина и стимулирует их деполимеризацию с минус-конца филамента (Maciver, 1998).

Белки, взаимодействующие с актиновыми филаментамиСреди большого числа актин-связывающих белков выделяют группу так называемых кэпирующих белков, которые связываются с оперенным концом актинового филамента и предохраняют его от дальнейшей полимеризации.mПримерами таких белков являются кэпирующий белок-бета 2 (DiNubile et al., 1995) и CapZ, встречающийся в миофибриллах (Schafer et al., 1995).

Белки семейства гельзолина: гельзолин, виллин, северин разрезают актииовые филаменты, тем самым увеличивая число оперенных концов и активируя полимеризацию актина (Kwiatkowski, 1999).

Актиновые филаменты сшиваются между собой при помощи белков а-актинин (Tang et al., 2001) и ß-спектрин (Djinovic-Carugo et al., 1999), а связь филаментов с поверхностью клетки осуществляют белки семейства Ena/Mena/VASP (Prehoda et al., 1999).

Движение вдоль актиновых филаментов осуществляется белками семейства миозинов (Vale, 2003).

МиозиныНаиболее изученным белком семейства миозинов является миозин II, выделенный впервые из скелетных мышц. Молекула миозина II имеет характерное строение: она состоит из двух тяжелых (200 кД) и четырех легких (20 кД), регуляторных цепей (Kiehart, 1990). Компонентами тяжелой цепи являются глобулярный головной домен, имеющий сайт связывания АТФ и длинный хвостовой домен, который соединяет тяжелые цепи одной молекулы. Используя энергию гидролиза АТФ, молекула миозина способна двигаться вдоль актинового филамента по направлению к его плюс-концу (Kitamura et al., 1999).

В последствии были открыты другие миозины, которые содержат сходные по строению один или два головных домена и различающиеся хвостовые домены. Так, миозины классов I, III, IV и V связываются хвостовым доменом с мембранными органеллами и обеспечивают их транспорт (Wu et al., 2000). Миозин IV - пока единственный известный мотор из семейства миозинов, способный передвигаться к минус-концу актинового филамента (Volkmann, Hanein, 2000).

Ниже приводится схема, иллюстрирующая регуляцию динамики актинового цитоскелета, предложенная Т. Лоллардом и соавторами (Pollard et al., 2001). Внеклеточный стимул связывается с рецептором на мембране клетки и активирует каскад сигнальных молекул. Белок WASP/Scar стимулирует ассоциацию мономеров актина и комплекса Агр2/3. Агр2/3 инициирует рост новых филаментов, используя АТФ-актин, связанный с профилином. Растущая актиновая сеть продвигает мембрану клетки. Филаменты растут до тех пор, пока не связываются с кэпирующими белками. По мере роста филамента происходит гидролиз связанного с актином АТФ, имолекулы АДФ-актина, связавшись с кофилином, диссоциируют с минус-конца фила мента (Pollard et al. 2001).

Результаты независимых исследовательских групп привели к возникновению двух моделей, объясняющих связывание и активацию Агр2/3 комплекса.

Модели различаются по типу ветвления растущего а кти нового фила мента. Так. прямое наблюдение за растущей акшновой сетью при помощи флуоресцентного микроскопа показало, что ветвление филамента, обусловленное работой Агр2/3 происходит сбоку от материнского филамента (В1апсЬот е1 а1., 2000). Однако, по альтернативной модели активированный Агр2/3 комплекс нуклеирует новые филаменты только на оперенном конце уже существующего филамента (РаШа1ош е1 а!. 2000). Поскольку методы выделения и очистки белка, солевые растворы, используемые для изучения функций Агр2/3 несколько отличаются у разных исследователей, то сложно утверждать, какая из двух моделей адекватна.*Полимеризация актина приводит к движению клеточной мембраныБлагодаря росту актиновых филаментов на краю клетки, где поддерживается высокая концентрация мономеров актина, происходит движение клеточной мембраны. Для объяснения этого феномена Могильнером и Остером была предложена модель «броуновской ракеты» (Mogilner, Oster, 1996). Смысл модели состоит в том, что мембрана клетки и кончик актинового филамента постоянно претерпевают быстрые броуновские движения, предоставляющие достаточное место для добавления нового мономера. После присоединения мономера, актиновый филамент принимает свою обычную прямую конфигурацию и проталкивает мембрану вперед на длину одного мономера.

Таким образом, полимеризация актиновых филаментов-в^ на краю клетки используется для выдвижения клеточной мембраны.

Актин-связывающие белки in vivoт<Функции актин-связывающих белков изначально были исследованы в системе in vitro, при изучении движения внутриклеточного паразита Listeria, основанного на полимеризации актина. Однако, в клетке, в отличие от результатов экспериментов in vitro, многие актин-связывающие белки действуют более сложным образом. Примером тому может служить VASP -белок семейства Ena/VASP, имеющий локализацию на лидирующем крае движущейся клетки. VASP увеличивает скорость движения внутриклеточного паразита Listeria (Loisel et al., 1999). Однако в клетке гиперэкспрессия VASP и связывание VASP с мембраной вызывают уменьшение клеточной подвижности и скорости выдвижения ламмелеподии (Bear et al., 2000). Таким образом, VASP является негативным регулятором клеточного движения in vivo, действуя противоположным образом in vitro.

Этот парадокс был разрешен в работе Джеймса Беара и соавторов (Bear et al., 2002), где было показано, что in vivo VASP регулирует геометрию актиновой сети в ламеллоподии, связываясь с оперенными концами филаментов и предотвращая их кэпирование.

Аналогичное несоответствие функций, описанных in vivo и in vitro наблюдается у белка ADF/кофилин, который разрезает актиновые филаменты, формируя новые оперенные концы, что приводит к выдвижению ламеллоподии в клетках аденокарциномы при стимуляции эпидермальным фактором роста (Chan et al., 2000).

Таким образом, различные типы клеток могут инициировать рост актиновых филаментов, используя различные сигнальные пути и молекулы, которые могут быть не представлены в системах in vitro.

Актиновые структуры в клеткеВ клетке актиновый цитоскелет представляет собой единое множество пересекающихся актиновых филаментов и сформированных актином структур, обладающих определенной пространственной организацией. Наиболее известные из этих структур - ламмелоподии, филоподии и стресс-фибриллы встречаются практически во всех видах культивируемых клеток (Small, 1988; Vasiliev, 1991).

Ламеллоподия - это тонкий вырост на краю клетки, который образован плоской сетью актиновых филаментов, плюс-концы которых ориентированы в сторону края клетки (Abraham et al., 1999; Svitkina, Borisy, 1999). Филоподия представляет собой пучок однонаправленных актиновых филаментов (около 15 цм в диаметре), который расположен либо внутри ламмелоподии, либо образует шиловидный вырост клеточной поверхности (Svitkina et al., 2003). Стресс-фибриллы образованы ассоциированными с миозином биполярными актиновыми филаментами, способными к развитию натяжения. Для формирования стресс-фибрилл необходимо их заякоривание на субстрате (Ridley, Hall, 1992).

Регуляторами актинового цитоскелета являются белки семейства Rho: RhoA индуцирует образование стресс-фибрилл, Rae - ламмелоподии и Cdc42 - филоподии (Ridley, Hall, 1992; Nobes, Hall, 1995; Hall, 1998).Rho-белкиМалые ГТФ-азы семейства Rlw являются регуляторами многих внутриклеточных процессов. Так, Rho-белки регулируют организацию клеточной полярности (Etienne-Manneville, 2004), транскрипцию генов (Minden el а!., 1995), прохождение клеточного цикла {Olson et al., 1995). подвижность клеток (Wittmann. Waternian-Storer, 2001). динамику микротрубочек {Cook, 1998). везикулярный транспорт (Novick, Zerial, 1997). различные виды ферментативной активности (Takai et al., 2001) и актиновый цитоскслет (Ridley, Hall. 1992; Nobes, Hall, 1995).

Эти небольшие по размеру белки находятся в одном из двух конформанионных состояний - ассоциированном с ГТФ (активная форма) либо связанном с ГДФ (неактивная форма). В активном состоянии ГТФ-азы взаимодействуют с эффекторным белком до тех пор, пока связанный ГТФ не гидролизуется до ГДФ. Переключения между активным и неактивным состоянием ГТФ-аз находится под контролем специальных факторов: активирующих (фактор обмена гуаниловых нуклсотидов. GEF), инакг ивирующих (белки, активирующие ГТФ-азы. GAP) и ингибиторов обмена гуаниловых нуклеотидов (GDI), которые предохраняют неактивные ГТФ-азы от контакта с мембраной (рис. 7) (Etienne-Manneville. I lall, 2002).

Клеточная мембранаОбщая схема регуляции внутриклеточных процессов, осуществляемая посредством Rho-бeлкoв такова. Внешние сигналы не влияют непосредственно на эффекгорные элементы, а передаются сначала в общуюинтегрирующую систему, основными элементами которой являются Rho-белки (Kjoller, Hall, 1999). Таким образом, каждый внешний сигнал преобразуется в сумму заданным образом локализованных и активированных ГТФ-аз. ГТФ-азы, в свою очередь, модулируют активность и локализацию своих эффекторов, порождая каскад сигналов, приводящих к реорганизации цитоскелета, и, в конечном счете, изменениям в поведении клеток (Bishop, Hall, 2000; Ridley, 2001; Etienne-Manneville, Hall, 2002).

Общие свойства микротрубочек и актинаДве главные эффекторные системы, контролируемые белками семейства Rho - это микротрубочки и актиновые филаменты. Как следует из приведенных выше фактов, организация и принципы функционирования этих цитоскелетных систем имеют много общего. Как актиновые филаменты, так и микротрубочки обнаруживают структурную полярность и асимметрию противоположных концов: быстро растущие плюс-концы склонны к полимеризации, в то время как на минус-концах обычно происходит деполимеризация.

Как для микротрубочек, так и для актиновых филаментов динамика процессов полимеризации и деполимеризации сложна и допускает различные варианты равновесия, включая динамическую нестабильность и трэдмиллинг (Littlefield, Fowler, 2002; Heald, Nogales, 2002). Сборка и разборка фибрилл регулируется множеством специфических белков, но принципы такой регуляции имеют много общего для актиновых филаментов и микротрубочек (Heald, Nogales, 2002; Pollard, Borisy, 2003). Оба типа фибрилл ассоциированы с молекулярными моторами, которые направленно двигаются вдоль этих фибрилл (Cross, Carter, 2000). Домены миозинов и кинезинов обнаруживают много общего в своей структуре (Vale, Milligan, 2000).

Существование некого механизма регуляции для актиновых филаментов обычно указывает на наличие подобного же механизма для регуляции микротрубочек - и наоборот. Например, как молекулярные комплексы, нуклеирующие сборку микротрубочек, так и комплексы, нуклеирующиеполимеризацию актиновых филаментов, включают в себя в качестве основного компонента слегка измененные субъединицы соответствующих фибрилл. Так, главным компонентом комплекса, нуклеирующего микротрубочки, является у-тубулин - белок, гомологичный а- и Р-тубулинам (Moritz, Agard, 2001), в то время, как комплекс Агр2/3, нуклеирующий актиновые филаменты, включает в себя два гомологичных актину белка Агр2 и АгрЗ (Pollard, Beltzner, 2002).

Несмотря на очевидное сходство в организации и принципах регуляции двух цитоскелетных систем, клетка, как правило, использует их для выполнения разных, хотя и связанных между собой функций.

Взаимодействия микротрубочек и актинаЕще в 70-е годы в лаборатории Васильева было показано, что микротрубочки необходимы для образования ламеллы и поддержания направленного, актин-зависимого движения фибробласта (Vasiliev et al.,#1970). Более того, разрушение системы микротрубочек приводит к увеличению сократимости клеток и возникновению актиновых стресс-фибрилл (Danowsky, 1989; Bershadsky, 1996). Позднее было показано, что взаимодействия микротрубочек и актина играют роль в таких важных процессах, как направленное движение клетки, клеточное деление, внутриклеточный транспорт (Rodrigues et al., 2003). Связь двух цитоскелетных систем, обнаруженная ранее на физиологическом уровне, в работах последних лет подвергалась тщательному анализу, который выявил молекулярные механизмы взаимосвязи микротрубочек и актина.

Регуляторные взаимодействияСуммируя литературные и собственные данные, в работе О. Родригес была предложена модель регуляторного взаимодействия систем микротрубочек и актина, при помощи которых две системы контролируют друг друга непрямым образом, действуя на сигнальные каскады (Rodrigues et al., 2003). Известно, что Rho ГТФазы регулируют как актиновый цитоскелет, так и микротрубочки (Wittmann, Waterman-Storer, 2001). Так, белок RhoA,индуцирующий возникновение стресс-фибрилл (Etienne-Manneville, Hall, 2002), одновременно вызывает избирательную стабилизацию микротрубочек (Cook, 1998). Эффекторами белка RhoA являются Rho киназа, которая стимулирует сократимость клеток с помощью фосфорилирования регуляторных легких цепей миозина (Ridley, 2001) и формин mDia, который вызывает полимеризацию актина (Pruyne et al., 2002). Как Rho киназа, так и формин mDia также вызывают и стабилизацию микротрубочек (Palazzo et al, 2001).

Более того, активность Rho-белков регулируется как микротрубочками, так и актином. Разрушение и микротрубочек, и актина приводит к активации белка RhoA (Ren et al., 1999). Было роказано, что фактор обмена гуаниловых нуклеотидов GEF-H1, активирующий RhoA, связан с микротрубочками и высвобождается при их деполимеризации (Krendel et al., 2002).

Структурные взаимодействияКроме регуляторных взаимодействий между микротрубочками и актином существуют структурные взаимодействия, то есть микротрубочки и актиновые филаменты связаны при помощи кросс-линкерных белков (Fuchs, Karakesisoglou, 2001; Rodriguez et al., 2003).

Так, было показано, что молекула линкерного белка плектина боковыми отростками соединяет виментиновые филаменты, микротрубочки и актин-содержащие структуры в клетках разных типов (Svitkina et al., 1996).

Мультидоменный регуляторный белок IQGAP1, ассоциированный с актином, также имеет сайт связывания с плюс-концевым белком микротрубочек CLIP-170 в клетках эпителия и фибробластах (Bashour et al., 1997; Fukata et al., 2002). Белок APC колокализуется с актиновыми филаментами и растущими концами микротрубочек, он связывает плюс-концевой белок микротрубочек ЕВ 1 и принимает участие в формировании митотического веретена (McCartney et al., 2001; Barth et al., 2002). Микротрубочки и актиновые филаменты могут быть также связаны посредством моторных белков (Huäng et al., 1999).

Микротрубочки и актиновые филаменты в районе контактовПримером кооперации между актиновым цитоскелетом и микротрубочками является процесс сборки, созревания и разборки адгезионных контактов. Адгезионные контакты представляют собой молекулярные комплексы, осуществляющие связь между белками матрикса и актиновым цитоскелетом посредством трансмембранных белков семейства интегринов (Geiger et al., 2001; Kaverina et al., 2002).

Внутриклеточный транспортДолгое время считалось, что микротрубочки и актиновые филаменты принимают независимое участие в процессе внутриклеточного транспорта. Однако Кузнецов и соавторы (Кигпе1зоу е1 а]., 1992) показали, что одна и та же органелла в аксоплазме кальмара движется вдоль микротрубочек иактиновых филаментов, переключаясь между двумя цитоскелетными системами. Полученные авторами данные свидетельствуют в пользу гипотезы о кооперативной работе моторов микротрубочек и актиновых филаментов. С тех пор многие независимые исследователи показали, что различные органеллы и везикулы передвигаются при согласованном участии микротрубочек и актина (Langford, 1995; Allan, Schroer, 1999). Так, в клетках меланофоров, микротрубочки отвечают за быстрый транспорт пигментных гранул к периферии клетки, тогда как актиновые филаменты обеспечивают равномерное распределение гранул в цитоплазме клеток (Rodionov et al., 1998). В клетках эндотелия движения секреторных органелл вблизи клеточной мембраны контролируется разнонаправленным действием транспортных систем, ассоциированных с микротрубочками и актином (Manneville et al., 2003). Для объяснения координированной работы двух типов моторов существует предположение, что моторы микротрубочек и актина объединены в специализированные гетерокомплексы (Goode et al., 2000). Подтверждением этой модели является тот факт, что миозин V и кинезиноподобный мотор ассоциированы друг с другом и способны к иммунокопреципитации in vitro (Huang et al., 1999).

Существует две модели, описывающие роль микротрубочек и актина в процессе внутриклеточного транспорта. По одной из них микротрубочки обеспечивают быстрый транспорт на большие расстояния, тогда как актин отвечает за локальные перемещения органелл (Goode et al., 2000; Rogers, Gelfand, 2000). Однако, по другой модели, разные моторы работают синхронно, и движение органеллы зависит от балланса действующих на нее сил, прикладываемых моторными молекулами (Gross et al., 2002).

Таким образом, микротрубочки и актиновые филаменты объединены структурно и регуляторно для выполнения в клетки особых функций. Примером такой функциональной кооперации является такое физиологически важное свойство клеток эндотелия, как поддержание эндотелиального барьера.

ЭндотелийЭндотелий сосудов представляет собой селективный проницаемый барьер между кровью и внутренним пространством всех органов и принимает участие в регуляции транспорта макромолекул и движении клеток крови сквозь стенку сосуда. Поддержание барьерной функции обеспечивается равновесием противодействующих сил, с одной стороны -сил, вызывающих сокращение клетки, а с другой - растягивающих, поддерживающих клетку в плоском состоянии. Активация сил, вызывающих клеточное сокращение приводит к формированию межклеточных промежутков и усилению проницаемости эндотелиального слоя (Garcia et al., 1995; Garcia et al., 1996). Сокращение эндотелиальных клеток обусловлено формированием стресс-фибрилл и активацией актомиозинового взаимодействия (Lum, Malik, 1996; Dudek, Garcia, 2001). Также межклеточные контакты и контакты клеток с субстратом вносят свой вклад в поддержание свойств эндотелиального барьера (Lum, Malik, 1996).

В норме эндотелиальные клетки плотно прилегают и контактируют друг с другом, чем обеспечивают барьер между кровью и тканевой жидкостью. Такие агенты, как цитокины воспаления, вирусы и факторы роста могут менять свойства эндотелиального барьера (Bogatcheva et al., 2002). В поддержании свойств эндотелиального барьера ключевым регулятором является цитоскелет (Lee, Gotlieb, 2003).

Эндотелиальные клетки могут быть выращены в культуре и представляют собой удобную модель для изучения свойств эндотелиального барьера, поддерживаемую клеточным цитоскелетом (Verin et al., 2001).

ТромбинСреди большого числа физиологических факторов, регулирующих проницаемость эндотелия, особое место занимает тромбин. Тромбин образуется на поверхности поврежденных клеток из циркулирующего в крови протромбина и вызывает коагуляцию крови, а также оказывает специфическое действие на эндотелий: нарушает его барьерную функцию истимулирует высвобождение медиаторов воспаления, вазорегуляторных агентов и факторов роста (Bogatcheva et al, 2002). Также тромбин индуцирует прикрепление лейкоцитов к поверхности эндотелиального слоя и их проникновение в подлежащие ткани. Действие тромбина зависит от его способности связываться с рецептором и регулируется протеолитической активностью тромбина.

Молекула тромбина человека представляет собой глобулу, образованную двумя последовательностями: А-цепочкой (49 аминокислотных остатков) и каталитической В-цепочкой (259 аминокислотных остатков), которые соединенены дисульфидной связью. На поверхности глобулы локализуется сайт связывания с субстратом (Grand et al., 1996). Рецептор тромбина PAR-1 (рецептор, активирующий протеиназы) имеет молекулярный вес 47 кД и состоит из семи трансмембранных доменов (Vu et al., 1991). PAR-1 является представителем большого семейства рецепторов, которые связаны с G-белками. Главной функцией PAR-1, как и любого рецептора, является трансформация внеклеточного стимула во внутриклеточный сигнал (Kroeze et al., 2003).

Действие тромбина in vivo и in vitro приводит к нарушению барьерной функции клеток эндотелия. Было показано, что тромбин вызывает быстрое, обратимое и зависимое от концентрации увеличение проницаемости эндотелиального слоя (Garcia et al., 1986; Garcia et al., 1996; Patterson et al., 2000). Увеличение проницаемости эндотелиального слоя сопровождается перестройкой актинового цитоскелета (Garcia et al., 1995, Vérin et al 2001, Birukova et al., 2004). В литературе встречаются данные о действии тромбина на центр организации микротрубочек. В частности, действие тромбина вызывает быстрые изменения организации центросомы: увеличается количество перицентриолярных сателлитов, а также измененяется интенсивность окрашивания центросомы антителами к ацетилированному и тирозилированному тубулину (Vinogradova et al., 2000; Vinogradova et al., 2004).

Гетеротримерные G-белкиПередача сигнала от рецептора тромбина осуществляется за счет активации регуляторных G-белков. Эти белки имеют характерное гетеротримерное строение: а-субъединица имеет нуклеотид-связывающий сайт, а гетеродимерная Ру-субъединица осуществляет связь всего комплекса смембраной клетки. Активация рецептора приводит к диссоциации)субъединиц и обмену ассоциированных с а-субъединицей нуклеотидов с ГДФ на ГТФ, после чего свободные субъединицы становятся способными взаимодействовать с эффекторными молекулами (Offermanns, Simon, 1996; Wittinghofer, Gierschik, 2000). Рецептор тромбина взаимодействует с несколькими G-белками и запускает множество сигнальных механизмов. В эндотелиальных клетках PAR-1 взаимодействует с Gi, Gq и Gl2/13 белками (Bogatcheva et al, 2002).

Активация чувствительного к коклюшному токсину Gi белка ведет к ингибированию аденилат-циклаз, вследствие чего уменьшается уровень цАМФ и ингибируется цАМФ-зависимая протеинкиназа (Manolopolus et al., 1997).Gq-зависимая активация фосфолипазы С приводит к увеличению уровня инозитол-3-фосфата и диацилглицерола, увеличению концентрации внутриклеточного Ca активации протеинкиназы С и, в результате, перестройке актинового цитоскелета (Barr et al., 1997).

И, наконец, G12/13 отвечает за Са-независимую активацию Rho-белка (Buhl et al., 1995). Фактор обмена гуаниловых неклеотидов, активирующий Rho-белок, регулируется не только а-субъединицей Gl2/13, но также а-субъединицей Gq и а-субъединицей или Ру-субъединицей Gi (Seasholtz et al., 1999).

Многие исследования выявили взаимосвязь между микротрубочками и рядом сигнальных молекул. Так, было показано, что различные Ga- и GPy-субъединицы связаны с микротрубочками и могут регулировать их динамику (Roychowdhury, Razenic, 1997; Roychowdhury et al., 1999).

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбинаТаким образом, тромбин регулирует актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток, запуская каскад регуляторных молекулярных механизмов. Действие тромбина приводит к усилению проницаемости эндотелиального барьера, сопровождаемому увеличением фосфорилирования легких цепей миозина и формированием дополнительных стресс-фибрилл в эндотелиальных клетках (Garcia et al 1995, 1996; Vérin et al. 2000). По сравнению с данными об актиновом цитоскелете, информация о роли микротрубочек в функционировании эндотелиального барьера в литературе крайне ограничена. В частности, показан эффект усиления проницаемости легочного эндотелия, и увеличения фосфорилирования легких цепей миозина в ответ на деполимеризацию микротрубочек нокодазолом в клетках легочного эндотелия (Vérin et al., 2001). Но то, каким образом система микротрубочек участвует в регуляции формы эндотелиальных клеток и поддержании функционирования эндотелиального барьера, в настоящее время не известно - и это стало одной из тем настоящего исследования.

Цель и задачиТаким образом, анализ литературных данных показал, что микротрубочки и актиновые филаменты не только имеют много общих свойств, но и тесно взаимосвязаны для выполнения ряда функций в клетке. Так, взаимодействие актина и микротрубочек в эндотелиальных клетках лежат в основе главной физиологической функции этих клеток -поддержании эндотелиального барьера. Если на данный момент молекулярные пути регуляции эндотелиального барьера изучены достаточно хорошо, то вопрос о роли микротрубочек и взаимной регуляции систем микротрубочек и актиновых филаментов в эндотелиальных клетках остается открытым. В связи с этим, целью данной работой было исследовать систему микротрубочек и актиновых филаментов при искусственном разрушении микротрубочек с помощью нокодазола и при действии физиологического стимулятора - тромбина в клетках эндотелия легочной артерии человека.

В работе были поставлены следующие задачи:1. Исследовать изменения системы микротрубочек и актиновых филаментов под действием низких доз нокодазола.

2. Исследовать систему микротрубочек и актиновых филаментов при действии тромбина.

3. Изучить участие микротрубочек в процессе передачи сигнала от тромбина к актиновому цитоскелету.

4. Создать модель, описывающую распределение микротрубочек в клетках, и на основании этой модели проанализировать поведение системы микротрубочек в клетках эндотелия в норме и при действии тромбина.

Экспериментальные воздействияВ ряде экспериментов клетки обрабатывали нокодазолом («Sigma», США) в концентрации 100 и 200 нМ в течение 30 мин. Стоковый раствор нокодазола (ЮтМ) растворяли в ДМСО. Концентрация ДМСО в среде не превышала 0,1% (v/v).

В экспериментах использовали тромбин («Sigma», США) в концентрации 25 нМ. Перед воздействием тромбина клетки промывали бессывороточной средой и стимулировали тромбином также в среде без сыворотки. Время инкубации с тромбином составляло 5, 10, 20, 30 и 60 мин.

В ряде экспериментов перед стимуляцией тромбином клетки предобрабатывали коколюшным токсином («List Laboratories», США) в концентрации 1 цг/мл (1 ч) и затем стимулировали тромбином (25 нМ, 10 мин).

Форсколин («Sigma», США) использовали к концентрации 50 цМ в течение 1ч. Стоковый раствор форсколина (50тМ) растворяли в ДМСО. Концентрация ДМСО в среде не превышала 0,1% (v/v).

Ингибитор Rho-киназ Y-27632 («Tocris», США) использовали в концентрации 5 (хМ в течение 1 ч. Стоковый раствор Y-27632 (50тМ) растворяли в ДМСО. Концентрация ДМСО в среде не превышала 0,1% (v/v).

Иммунофлюоресцентное окрашиваниеДля иммунофлюоресцентного окрашивания клетки фиксировали 1,5% раствором глютарового альдегида («Sigma», США) на физиологическом фосфатном буфере (PBS), рН=6,8 («Sigma», США) в течение 10 мин и отмывали трехкратной сменой PBS (по 10 мин каждая смена). Фиксированные клетки пермеабилизовали 0,1% раствором Triton Х-100 («Sigma», США) на PBS в течение 15 мин с последующей отмывкой PBS (3 раза по 10 мин). Для устранения фонового свечения перед окраской антителами клетки обрабатывали 0,2 % раствором боргидрида NaBH4 («Sigma», США) на PBS (3 раза по 10 мин) и отмывали буфером PBS (3 раза по 10 мин).

Для окраски микротрубочек в качестве первичных антител использовали моноклональные мышиные антитела к ß-тубулину («ICN», США), (разведение 1:200), моноклональные мышиные антитела кацетилированному тубулину («Accurate Chemicals», США), (разведение 1:100) моноклональные мышиные антитела к тирозилированному тубулину («ICN», США), (разведение 1:100).

Для выявления трансфецированных клеток использовали поликлональные кроличьи антитела к а-субъединицам тримерных белков G12, G13, Gq и Gi2 («Santa Cruz,» США), (разведение 1:50). Избыток антител отмывали буфером PBS.

В качестве вторичных антител использовали анти-мышиные либо антикроличьи антитела, конъюгированные с флуоресцентными красителями Alexa 488- или Alexa 594- («Molecular Probes», США), (разведение 1:100).

Актиновые филаменты окрашивали при помощи фаллоидина, конъюгированного с флуорохромом Texas Red («Molecular Probes», США), (разведение 1:200).

Покровные стекла монтировали на предметные, используя в качестве заливочной среды смесь воды и глицерина (1:1). Для сохранности образцов края покровных стекол заливали лаком.

Получение и обработка цифровых изображенийДля исследования полученных после иммунофлуоресцентного окрашивания препаратов использовали микроскоп Nikon Eclipse ТЕ2000 с объективом 60/1,4 («Nikon Intech Co.», Япония). Изображения записывали на цифровую охлаждаемую ПЗС-камеру Hamamatsu ORCA-2 («Hamamatsu Photonics», Япония), управляемой программой MetaView («Universal Imaging», США).

Разрешение полученных 12 битных изображений составляло 9 пиксел/мкм. Обработка изображений проводилась в программах MetaMorph («Universal Imaging», США) и Adobe Photoshop 7.0 («Adobe Inc.», США).

Количественная оценка системы актиновых филаментов и микротрубочекРанее нами были разработаны методики количественной оценки состояния системы микротрубочек (Смурова и др., 2002) и актиновых филаментов (Смурова и др., 2004) в клетке с помощью программы Ме1аМофЬ. Обе методики основаны на измерении интенсивности флуоресценции этих компонентов цитоскелета на цифровых изображениях флуоресцентных препаратов клеток, полученных с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры.

Для оценки количества стресс-фибрилл в клетках на исходных изображениях выделяли область соответствующую полимеризованному актину (выделялись все участки, превышающий по интенсивности средний уровень фона в клетке в 2 и более раз) и находили отношение их площади к площади всей клетки в целом (рис. 9) (Втдкоуа еХ а1., 2004). Аналогичным образом вычисляли относительную площадь, занятую системой микротрубочек.

Для оценки количества актиновых филаментов в разных участках клетки, выделяли три участка измерения:1) участок, опоясывающий периметр клетки на расстоянии 5 мкм от края клетки;2) участок, опоясывающий периметр клетки на расстоянии 10 мкм;3) внутренний участок, отстоящий от края клетки на 10 мкм (рис. 9 б). Для каждого участка измерения находили соотношение площади, занятой актиновыми филаментами, к площади соответствующего участка.

Аналогичным образом вычисляли относительную площадь, занятую системой микротрубочек в разных участках клетки.tРисунок 9. Метод количественной оценки содержания стресс-фибрилл в клетке.а) Клетка НРАЕС, иммунофлуоресцентное окрашивание на актин.б) В анализируемой клетке полимеризованный актин выделен красным цветом. Желтым контуром выделены участки измерения участок, опоясывающий периметр клетки расстоянии 5 мкм, 10 мкм и внутренний участок клетки. Для оценки количества стресс фибрилл на каждом участке измерения находили отношение площади, занимаемой стресс-фибршлами к площади всей данного участка.

Измерение длин микротрубочек в цитоплазме клеток VeroДлины микротрубочек измеряли на обработанных изображениях в программе Scion Image («Scion Corporation», США).

Анализ интенсивности флуоресценции тубулина в ламелле клетокVeroИнтенсивность флуоресценции тубулина в ламелле измеряли, как описано ранее (Смурова и др., 2002) на фиксированных препаратах клеток антителами к Р-тубулину, в десяти квадратных участках со стороной 3,5 мкм (50 пикселов). Участки измерения размещались в разных клетках единообразно по следующей схеме: первый участок захватывал центросому, при этом центросома располагалась в его центре. Следующий квадрат помещался рядом с первым и т.д. по радиусу «звезды» (рис. 10а). Интенсивность флуоресценции измерялась как средняя оптическая плотность с помощью программы MetaMorph. Это значение отражает среднюю интенсивность всех пикселов на данном участке.

Полная интенсивность флуоресценции в клетке складывается из суммы интенсивности флуоресценции полимеризованного в микротрубочки тубулина и интенсивности флуоресценции тубулина, растворенного в цитоплазме клетки, который сохранился после фиксации. Поскольку в измерениях плотности микротрубочек нас интересует только вклад микротрубочек, то из суммарных значений интенсивности флуоресценции были вычтены значения интенсивности, соответствующие деполимеризованному тубулину. Интенсивность флуоресценции растворенного тубулина в каждом участке цитоплазмы пропорциональна толщине клетки. Толщина клетки убывает от центра к ламелле. Поэтому для определения коэффициента толщины клетки была измерена интенсивность флуоресценции в клетках, где весь тубулин находится в растворенной форме (рис. 10, б). Значение интенсивности флуоресценции тубулина на краю ламеллы (последний участок измерения) мы приняли за единицу, а отношения интенсивности каждого последующего участка, к интенсивности последнего участка и составили коэффициенты, характеризующие относительную толщину клетки.

Рисунок 10.

Методика измерения интенсивности флуоресценции микротрубочек в ламелле клеток Vero.а) Интенсивность флуоресценции измеряли в 10 участках, расположенных радиально от центросомы до края тетки.б) Для того, чтобы из суммарного значения интенсивности флуоресценции вычесть пул депошмеризованнаго тубулина вводили коэффициент толщины клетки. Коэффициент считали пропорциональным интенсивности свечения тубулина в клетках, где весь тубулин был переведен в растворенную форму.

Таким образом, плотность микротрубочек (рмт) на каждом участке измерения рассчитывали по формуле:РМТ " I губ." ki I лам. iгде I туб - полная интенсивность флуоресценции тубулина, I пам -интенсивность флуоресценции участка края клетки без микротрубочек, k¡ — поправочный козффициент для толщины клетки в i-том участке измерения.

Моделирование системы микротрубочекДля анализа системы микротрубочек в живых клетках был применен метод их моделирования с использованием компьютера. Используя программу векторной графики Corel Draw 10 («Corel Corporation», США), моделировали изображения клеток, содержащие систему микротрубочек с заданными параметрами. Все микротрубочки были прямыми и имели одинаковую толщину. В итоге выделили пять типов клеток с различными длиной и количеством микротрубочек.

1) В первой модельной клетки система микротрубочек состояла только из связанных с «центросомой» микротрубочек, имеющих постоянную длину, равную радиусу клетки.

2) Затем исследовали клетку, в которой все микротрубочки сходятся в центре, но имеют различную длину (длина половины микротрубочек равна 14 радиуса клетки).

3) Во третьей модельной клетке присутствовали связанные с центросомой микротрубочки разной длины - треть микротрубочек доходила до края клетки, другая треть микротрубочек имела длину примерно 2/3 от радиуса клетки, и длина оставшихся микротрубочек была равной 1/3 от радиуса клетки.

4) Затем в модельную клетку помимо связанных с «центросомой» были введены свободные микротрубочки. Количество свободных микротрубочек составляло половину всех микротрубочек в клетке, длина свободных микротрубочек варьировала от Vi до 3/4 от клеточного радиуса.

5) И, наконец, в пятую модельную клетку добавили большое количество свободных микротрубочек, в пять раз превышающее количество микротрубочек, связанных с «центросомой». Незначительно различавшиеся по длине свободные микротрубочки были равномерно распределены между радиальными микротрубочками, расходившимися из центра клетки.

Затем в модельных клетках измеряли динамику снижения оптической плотности от точки схождения микротрубочек до края клетки. Аналогично измерениям, проводившимся на клетках Vero, оптическая плотностьизмерялась с использованием программы MetaMorph в десяти квадратных участках, расположенных от «центросомы», где плотность микротрубочек была максимальной, до края клетки.

Статистическая обработка данных и построение графиковДанные обрабатывали статистически в программе Sigma Plot 7.1 («SPSS Science», США) и Excel («Microsoft Corp.», США). Для определения статистического отличия между двумя выборками использовали t-тест (критерий Стъюдента).

Для построения графиков использовали программу Sigma Plot 7.1. Для аппроксимации графиков использовали программы Sigma Plot 7.1 и Table Curve 2D 5.1 («Systat Software Inc.», США).РезультатыАктин и микротрубочки в нативных клетках эндотелия человекаЛюпинВ норме в клетках эндотелия легочной артерии человека методом флуоресцентного окрашивания выявляется актиновая сеть, состоящая из неупорядоченных пучков актиновых филаментов (рис. 11, а). Для анализа количества и расположения актиновых филаментов в клетке использовалось измерение отношения площади актиновых филаментов к площади всей клетки в целом, либо к площади соответствующего участка измерения (см. «Материалы и методы»). В контроле площадь, занимаемая системой актиновых филаментов составила 21,62±5,6 % от площади клетки (п=20).

Однако, актиновые филаменты в клетках эндотелия располагались неравномерно: визуально на периферии клетки их содержание было выше, чем в центре клетки. Для того, чтобы оценить неравномерность актиновой сети использовали количественное сравнение площади актиновых филаментов на периферии клетки - в участке, опоясывающем периметр клетки на расстоянии 5 мкм, а также в ее центре - внутреннем участке, отстоящем на 10 мкм от края клетки по отношению к площади участка измерения. Количественные измерения в участке, опоясывающем периметр клетки на расстоянии 5 мкм, показали, что площадь актиновых филаментов в этом участке была несколько выше (26,4±8,1%; п=20), чем площадь филаментов в целой клетке. Однако в центре клетки - внутреннем участке, отстоящем на 10 мкм от края клетки, относительная площадь актиновых филаментов составляла 14,15±6,7% (п=20), что уже на треть меньше, чем в целом в клетке. Средняя толщина актиновых пучков составляла 0,29±0,09 мкм (п=150). Таким образом, актиновая сеть в эндотелиальных клетках состоит из тонких актиновых филаментов, расположенных неравномерно в объеме клетки - их сеть разрежена в центральной части клетки, но уплотняется в направлении ее края.

Рисунок IIИммунофлуоресцентные микрофотографии клеток эндотелия легочной артерии человека.а) Актиновые филаментыб) Микротрубочкив) Ацетилированный тубулинг) Тцрозилированный тубулинМасштабный отрезок равен 20 мкмМикротрубочкиВ ходе иммунофлюореецентного исследования в клетках НРАЕС выявлялась сеть микротрубочек, которые сходились в районе клеточного центра вблизи ядра (рис. 11, б). В центре клетки плотность микротрубочек была максимальна, она постепенно понижалась по направлению к краю клетки, и на периферии легко можно было различить отдельные микротрубочки. В среднем, микротрубочки занимали 47,9±4,1 (п=20) процентов от площади всей клетки. В центре клеток относительная площадь, занятая микротрубочками, составила 83,3±5,8 % (п=20). По мере удаления от центра клетки, количество микротрубочек уменьшалась. В участке, опоясывающем границу клетки и имеющем радиус 10 мкм, количество микротрубочек составило 28,3±7,4 % от площади участка измерения. В самом крайнем участке измерения, захватывающем площадь от края клетки до границы, находящейся на расстоянии 5 мкм от края клетки, площадь микротрубочек составила 15,7±6,6 %.

Таким образом, система микротрубочек в клетках эндотелия имеет максимальную плотность в районе клеточного центра, и их плотность постепенно понижается по направлению к краю клетки.

Как упоминалось ранее, система микротрубочек в клетке неоднородна по химическому составу, что коррелирует с динамическими характеристиками составляющих систему микротрубочек. Так, различают популяцию стабильных, вторично модифицированных, и динамичных, не подвергшимся вторичным модификациям, микротрубочек.

Ацетилированные микротрубочкиВ клетках легочного эндотелия выявляется популяция стабильных, подвергшихся посттрансляционному модифицированию, микротрубочек. Такие микротрубочки можно идентифицировать при иммунофлуоресцентном исследовании с использованием антител к ацетилированному тубулину. В норме ацетилированные микротрубочки расположены в центре клетки и часто не имеют выраженного центра схождения (рис. 11, в). Количественная оценка показала, что ацетилированные микротрубочки занимают в среднем17Д±4,3% (п=20) от площади клетки. Таким образом, на долю ацетилированных микротрубочек приходится около 35% от всех микротрубочек в клетке.

Тирозилированные микротрубочки.

Также в клетках легочного эндотелия присутствуют микротрубочки, не подвергшиеся вторичным модификациям. Примером таких микротрубочек могут служить микротрубочки, не прошедшие детирозилирование, и выявляемые при иммунофлюоресцентном окрашивании антителами к тирозилированному тубулину. Система, образованная тирозилированными микротрубочками, сходна с общей системой микротрубочек в клетке (рис. 11, г). Так, тирозилированные микротрубочки имеют выраженный центр схождения, который находится рядом с ядром. Плотность тирозилированных микротрубочек понижается от центра клетки к краю. В количественном отношении площадь, занимаемая тирозилированными микротрубочками, составляет 47,0±3,6% (п=20), что соответствует площади, занимаемой общей системой микротрубочек.

Действие наномолярных доз нокодазола на цитоскелет клеток эндотелия.

Ранее было показано, что нокодазол в концентрации от 0,1 до 5 цМ вызывает резкое увеличение проницаемости эндотелиального слоя, образованного клетками легочной артерии быка (Уепп, 2001). При этом в отдельных клетках увеличивалось содержание стресс-фибрилл, и происходило образование межклеточных промежутков. Клетки легочного эндотелия человека очень чувствительны к воздействиям химических веществ. Так, нокодазол в высоких концентрациях существенно изменяет морфологию клетки. При действии на монослой, нокодазол в концентрации 2-5 цМ вызывал сильное увеличение проницаемости эндотелия (в 5 раз выше, чем при действии нокодазола в концентрации 100 нМ), при этом с течением времени барьерная функция не восстанавливалась (Уепп, 2001). Поэтому для того, чтобы выявить роль микротрубочек в функции поддержанияэндотелиального барьера в процессе образования стресс-фибрилл, клетки эндотелия легочной артерии человека обрабатывали нокодазолом в концентрациях 100 и 200 нМ. В качестве контрольного использовался препарат, зафиксированный перед началом экспериментального воздействия. Наряду с измерением содержания микротрубочек и актиновых филаментов, анализировали площадь клеток.

Действие нокодазола в концентрации 100 нМНокодазол в концентрации 100 нМ в течение 30 мин вызывал частичное разрушение системы микротрубочек. Микротрубочки деполимеризовались на краю клетки, а в центре система микротрубочек оставалась аналогичной системе, наблюдаемой в контроле (рис. 12, б). Если в контроле микротрубочки занимали 47,9±4,1% (п=20) от площади клетки, то после действия нокодазола - 30,3±5,5%. Наиболее значительно, примерно в 10 раз, уменьшилось количество микротрубочек на периферии клетки, в участке на расстоянии 5 мкм от края (1,5±1,3%). В участке 10 мкм от края клетки количество микротрубочек сократилось втрое по сравнению с контролем (8,1±5,6%). В центральном участке клетки микротрубочек стало меньше всего на четверть от контрольного количества - площадь, занятая микротрубочками в центральном участке, составила 64,7±11,8%.

Таким образом, нокодазол в концентрации 100 нМ вызывает частичное разрушение системы микротрубочек, разбирая в основном периферические микротрубочки в зоне 5 мкм от края клетки.

Распределение стабильных микротрубочек после действия нокодазола (рис. 12, г) визуально не отличалось от распределения стабильных микротрубочек в контроле. Количественный анализ ацетилированного тубулина показал, что площадь, занимаемая ацетилированными микротрубочками после действия нокодазола (14,3±3,6%), существенно не отличались от контрольного значения (отличия статистически не достоверны).

Рисунок ¡2.

Действие нокодазола в концентрации 100 нМ на клетки НРАЕС.а), в) актиновые филаменты о) микротрубочки г) ацетилировапный тубулинМасштабный отрезок равен 20 мкмСистема актиновых филаментов после 30 мин воздействия нокодазола в концентрации 100 нМ визуально не изменялась (рис, 12 а. в). Как и в контроле, в клетках присутствовали тонкие, неупорядоченные стресс-фибриллы. преимущественно расположенные по периферии клетки. Количественные измерения показан и, что в целом площадь стресс-фибрилл в клетке составила 24.5±6,5%. что статистически не отличалось от значения в контроле. Незначительно увеличилась площадь актиновых филаментов в центральном участке клетки (19,0±10,6%). однако па периферии клетки, в участках 5 мкм и 10 мкм от ее края, площадь актиновых филаментов не изменялась {26.2±6.1 и 27,5±6,6% соответственно).

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что нокодазол в концентрации 100 нМ в течение 30 мин вызывает частичное разрушение микротрубочек на краю клетки, но не оказывает влияния на количество ацетилированных микротрубочек и актиновых филаментов.

Действие нокодазола в концентрации 200 нМНокодазол в концентрации 200 нМ в течении 30 мин разрушал систему микротрубочек в клетках эндотелия (рис. 13, б). После действия нокодазола в клетках оставалось незначительное количество микротрубочек. В основном, они расходились от центросомы, однако некоторые микротрубочки теряли связь с центросомой и располагались неупорядоченно. В цитоплазме клеток выявлялся пул деполимеризованного тубулина. Количественный анализ показал, что площадь, занимаемая микротрубочками, уменьшилась практически в 3 раза по сравнению с контролем и составила 16,5±3,8% (п=20) от площади клетки. Также существенно (примерно в 7 раз) уменьшилось количество микротрубочек на краю клетки: в зоне 10 мкм от края клетки занимаемая микротрубочками площадь составила 4,4±4,1% (п=20). В центральном участке клетки площадь, занимаемая микротрубочками, уменьшилась примерно в 2 раза по сравнению с контролем (39,8±9,7%, п=20).

Система ацетилированных микротрубочек после действия нокодазола (200 нМ) визуально не отличалось системы, наблюдаемой в контроле (рис. 13, г). На долю ацетилированных микротрубочек приходилось 15,9±4,1% от площади клетки, что соответствует общей площади микротрубочек после действия 200 нМ нокодазола (16,5±3,8%).

Таким образом, нокодазол вызывал существенную, но не полную деполимеризацию микротрубочек. Можно предположить, что после действия нокодазола (200 нМ) в клетке остаются в основном ацетилированные микротрубочки.

1 \ Я шЛ1 А лШРисунок ¡3.

Действие нокодазола в концентрации 200 нМ на клетки НРАЕС.а), в) актинавые филаментыб) микротрубочкиг) ацетш ирован ный ту буланМасштабный отрезок равен 20мкмСистема актииовых фи лам о нов после действия нокодазола изменилась: визуально возросло содержание стресс-фибрилл (рис. 13; а. в). Увеличилась их толщина и изменилось расположение в клетке: протяженные стресс-фибриллы тянулись через центральный район клетки. Количественные измерения показали, что в целой клетке площадь, занимаемая актиновыми филаментами. увеличилась примерно на половину и составила 31.8±6.1% от площади клетки. Однако, в центре клетки содержание стресс-фибрилл возросло вдвое (30,7±9,0%) по сравнению с контрольным значением. Содержание актииовых филаментов в зонах 5 и И) мкм от края клеткисущественно не изменилось (28,8±10,1% и 32,8±8,7% соответственно). Тощина актиновых фибрилл возросла примерно в три раза по сравнению с контролем и оказалась равной 0,75±0,15 мкм. Возможно заключить, что действие нокодазола в концентрации 200 нМ приводит к увеличению содержания актиновых филаментов в основном, в центральном районе клетки.

Таким образом, нокодазол в концентрации 100 нМ, разбирая микротрубочки на краю клетки,, не оказывает существенного влияния на количество стресс-фибрилл, тогда как нокодазол* в концентрации 200 нМ, деполимеризуя микротрубочки сильнее,- приводит к формированию дополнительных стресс-фибрилл в центре клетки.

Действие тромбина на цитоскелет клеток легочного эндотелия человекаРанее было показано, что тромбин в концентрациях 1-200 нМ вызывает увеличение приницаемости слоя эндотелиальных клеток (В1гикоуа е1 а1., 2004). При этом в цитоплазме клеток заметно увеличивается содержание стресс-фибрилл, а между клетками происходит образование межклеточных промежутков. Поскольку нокодазол, аналогично тромбину, усиливает проницаемость эндотелиального барьера, то логично предположить, что и тромбин также воздействует на микротрубочки. Для проверки этой гипотезы было проведено детальное исследование актиновых филаментов и микротрубочек эндотелиальных клеток при действии тромбина в концентрации 25 нМ. Анализировалась кинетика изменения актиновых филаментов, микротрубочек и площади клеток при разных сроках воздействия тромбина. В качестве контрольного использовался препарат, зафиксированный перед началом экспериментального воздействия.

Актиновые филаменты при действии тромбинаОбработка тромбином вызывала увеличение количества стресс-фибрилл, расположенных по всей цитоплазме клетки (рис. 14, I). Визуальносодержание стресс-фибрилл возрастало в течение первых 30 мин действия тромбина, а затем снижалось.

Количественный анализ показал, что в первые 5 мин стимуляции тромбином происходило увеличение площади стресс-фибрилл в клетке примерно на треть от контрольного значения, площадь стресс-фибрилл составляла 32,0±7,0% от площади клетки (п=15).

В течение 30 мин действия тромбина количество актиновых филаментов продолжало увеличиваться. Так, через 10 мин, площадь филаментов возросла до 36,3±5,2%, а через 30 мин площадь, занимаемая стресс-фибриллами, была максимальной - 40,8±7,3%, что уже в 2 раза превышало контрольное значение.

В течение 30-60 мин воздействия тромбина площадь стресс-фибрилл снижалась, и через 60 мин достигала 22,9±3,9%, что соответствует площади стресс-фибрилл в контроле.

Таким образом, количество стресс-фибрилл увеличивалось и достигало максимума в течение первых 30 мин, а затем снижалось до контрольного значения.

При действии тромбина происходило не только увеличение количества актиновых филаментов, но также их перераспределение в цитоплазме клетки. Так, в течение первых 10 мин стимуляции, площадь актиновых филаментов на расстоянии 10 мкм от края клетки несколько снижалась по сравнению с контролем (23,7±7,7%), но существенно возрастала в центре клетки (47,5±9,3%). Через 30 мин воздействия тромбина на краю клетки площадь стресс-фибрилл увеличивалась (36,7±7,7%), а в центре клетки снижалась на треть по сравнению с 10 мин, но, тем не менее, была больше, чем в контроле и составляла 29,7±9,4%.

Таким образом, при действии тромбина происходит образование и перераспределение стресс-фибрилл в клетке: в течение 10 мин резко увеличивается их количество в центре клетки, а через 30 мин стресс-фибриллы остаются в центре, и дополнительно образуются на краю клетки.

Изменение питоекеле га эндотелиальных клеток при действии тромбина. Í. Иммунофяуоресцентные микрофотографии клеток НРАЕС, обработанных 25 пМ тромбином в течение 5 мин (в, г), Ю мин (д, е). 30 мин (ж. з) и 60 мин (и, к). Правый вертикальны й ря<) - окраска антителами против 0-тубулина Оля выявления микротрубочек; левый вертикальный ряд - окраска фачлоидииом для выявления актина. Контрольный препарат был зафиксирован перед началом экспериментального воздействия (а, б). Масштабный отрезок - 20 мкм.

П. Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а), микротрубочек (б), а также площади клеток (в) после 5-60 мин воздействия тромбина.

61Площадь клеток при действии тромбинаИзмерение площади клеток показало, что при действии тромбина площадь постепенно уменьшается. Наблюдалась обратная корреляция между изменением площади клеток и количеством стресс-фибрилл. Так, в течении 5 мин стимуляции тромбином площадь клеток незначительно уменьшилась по стравнению с контролем - 3781,8±835,9 мкм2 и составила 3302,6±835,9 мкм2. В течении 30 мин площадь продолжала снижаться, и через 10 мин составила•у3137,6±802,1 мкм а через 30 мин - 3044,2±893,3 мкм. В целом, уменьшение площади клеток было незначительным, Минимальная их площадь, наблюдаемая через 30 мин воздействия тромбина, отличалась всего на 20% от контрольного значения.

Микротрубочки при действии тромбинаСтимуляция тромбином приводила к изменениям в системе микротрубочек эндотелиальных клеток (рис. 14, I). Так, в течение первых 510 мин действия, площадь, занимаемая микротрубочками, снижалась с 60,4±5,0% в контроле до 46,1±5,8% при действии тромбина. Затем площадь микротрубочек постепенно повышалась и через 30 мин увеличивалась до 51,2±9,1%. Через 60 мин действия тромбина площадь, занимаемая микротрубочками, приближалась к контрольному значению и составляла 64,7±6,2% от площади клетки.

Таким образом, количество микротрубочек уменьшалось в течение первых 5-10 мин действия тромбина, а затем увеличивалось до контрольного значения.

Система микротрубочек после действия тромбина визуально отличалась от системы микротрубочек в интактных клетках. Через 10 мин действия тромбина в зоне 10 мкм от края клетки площадь микротрубочек понижалась в 2 раза по сравнению с контролем и составляла 22,1 ±6,8%, а в центре клетки существенно не изменялась и была равной 78,7±8,1%. В течение 30 мин стимуляции тромбином распределение микротрубочек не изменялось - на периферии клетки их было меньше, чем в центральном участке.

Таким образом, тромбин действует на систему микротрубочек эндотелиальных клеток, уменьшая количество микротрубочек на периферии клетки. Можно предположить, что уменьшение общей площади, занимаемой системой микротрубочек, происходит за счет элиминации периферических микротрубочек.

Итак, тромбин индуцирует дисфункцию эндотелия, вызывая в первую очередь уменьшение количества микротрубочек на периферии клетки и затем образование стресс-фибрилл. Изменения цитоскелета в присутствии тромбина обратимы: микротрубочки и актиновые филаменты принимают исходный вид через 60 мин после начала стимуляции.

Сравнение действия нокодазола и тромбина на цитоскелет клеток эндотелияНокодазол и тромбин вызывают сходный физиологический ответ при действии на эндотелиальный слой - оба вещества резко увеличивают проницаемость эндотелиального слоя. Проведенный морфометрический анализ позволяет сравнить действие нокодазола и тромбина на систему актиновых филаментов и микротрубочек.

Нокодазол в концентрации 100 нМ в течение 30 мин, деполимеризует микротрубочки на краю клетки, но не вызывает образования стресс-фибрилл.

Действие нокодазола в концентрации 200 нМ в течение 30 мин уменьшает количество микротрубочек примерно втрое от контрольного значения, при этом вдвое увеличивается содержание стресс-фибрилл в центре клетки.

Тромбин в концентрации 25 нМ в течении 30 мин вызывает уменьшение количества периферических микротрубочек вдвое, но в целом система микротрубочек занимает всего на четверть меньшую по сравнению с исходным значением площадь. При этом количество стресс-фибрилл увеличивается как в центре, так и на краю клетки.

Таким образом, образование стресс-фибрилл может быть вызвано деполимеризацией микротрубочек - но в таком случае деполимеризация должна быть существенной, как при действии нокодазола в концентрации200 нМ. Деполимеризация микротрубочек на периферии клетки является достаточный условием для формирования стресс-фибрилл в случае действия тромбина, но не достаточна при действии нокодазола в концентрации 100 нМ. Исходя из полученных данных, можно предположить, что тромбин не только стимулирует деполимеризацию микротрубочек на краю клетки, но также активирует и другие сигнальные пути, приводящие к образованию стресс-фибрилл.

Гиперэкспрессия а-субъединиц белков G12/13, Gi и Gq приводит к деполимеризации микротрубочек.

Тромбин, взаимодействуя с PARI рецептором, вызывает диссоциацию активных а-субъединиц гетеротримерных белков Gl 2/13, Gi и Gq (Bogatcheva et al., 2002). Для того, чтобы выявить роль промежуточных регуляторных молекул G12/13, Gi и Gq в процессе образования стресс-фибрилл и уменьшения количества микротрубочек, вызываемых тромбином, в клетках легочного эндотелия повышали уровень активных субъединиц этих молекул путем гиперэкспрессии (рис. 15-16).

Влияние гиперэкспрессииа-субъедищщ G12 и G13 белков на цитоскелет эндотелиальных клеток.

И.имунофлуоресцентн ы е микрофотографии клеток НРАЕС. трансфецированных ппазмидой, кодирующей конститутивно активную а-субъединицу гетеротримерных белков G12 (а, б) и G13 (в, г). Для выявления трансфецированных клеток использовали антитела ка-субъединицам тримерных белков GI2 и G13 (правая вертикальная панель), для визуализации микротрубочек - окраску антителами к р-тубулину, а актиновых филаментов - фаллоидин (левая вертикальная петель). Трансфецированные метки отмечены стрелками. Масштабный отрезок - 20 мкм.

Влияние гиперэкспрессии а-субъединиц 012 и Од белков на цитоскелет эндотелнальных клеток.

Иммунофлуоресцентные микрофотографии клеток НРАЕС, трансфецированных плазмидои, кодирующей конститутивно активную -субъединицу гетеротримерных белков а2 (а, б) и Gq (в, г). Для выявления трансфецированных клеток использовали антитела ка-субъединицам тримерных белков &2 и Од (правая вертикальная панель) для визуализации микротрубочек - окраску антителам# к -тубулину. а актиновых фшаментов - фаллоидин (левая вертикальная панель). Трансфецированные клетки отмечены стрелками. Масштабный отрезок - 20 мкм.

66вкг.ифппь С1? 613 СПКонтроль С12 С13 &2Кпн-гпопв сгг С13 Е|2 СлРисунок 17, Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а), микротрубочек (б), а также площади трансфецированных клеток (в).

Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц & и Оц белков вызвала аналогичные эффекты: увеличение плотности расположения и толщины стресс-фибрилл и частичную деполимеризацию микротрубочек (рис. 16). Площадь, занятая стресс-фибриллами, увеличилась примерно в три раза и для и вч белков составила 59.3±6.1 и 59.4±8.5% соответственно (рис. 17. а). Площадь, занимаемая микротрубочками, при гиперэкспрессиш-субъединиц 01 и Ск] белков составила 42,0±9.9 и 35,7±9,9%. что всего на треть меныпе контрольного значения (рис. 17, б).

Измерение площади клеток показало, гиперэкспрессия а-субъединиц 012. 013. 01 и Оц белков вызывает значительное (в среднем в три раза) уменьшение площади клеток. Их площадь при гиперэкспрессия а-субъединицы 012 белка составляла 1433.8±400,9 мкм2, 013 - 1132,2±649,7 мкм2, 1179,8±116,3 мкм" и Оц — 1110,6±364,6 мкм2 (рис. 17, в).

Таким образом, образование актиновых стресс-фибрилл индуцируется гиперэкстрессией а-субъединиц всех исследуемых белков, однако разборку микротрубочек в наибольшей степени вызывает гиперэкспрессия а-субъединиц 012 и 013 белков, а в меньшей степени - & и йя белков (рис. 17: а. б). Площадь клеток при гиперэкспрессии всех четырех исследуемых белков уменьшается (рис. 17. в).

Полученные результаты позволяют предположить, что белки 012/13. 01 и Gq являются промежуточными звеньями в индуцированных тромбином образовании сгресс-фибрилл и разрушении микротрубочек.

Ингибирование Gi белка приводит к снижению эффекта тромбина на стресс-фибриллы и микротрубочки.

Для того, чтобы выяснить, принимает ли белок Gi участие в индуцированной тромбином перестройке цитоскелета. эн дотелиал ьные клетки обрабатывали Специфическим ингибитором Gi белка - коклюшным токсином (Kaslow, Burns, 1992).

После обработки токсином количество актиповых филаментов незначительно уменьшается, до 17.5±3,9%, а количество микротрубочек не изменяется и составляет 57,8±3.2% (рис. 18; в. г). Площадь клеток также пе изменяется по сравнению с кон тролем.

Добавление тромбина на 10 мин в среду, содержащую коклюшный токсин (рис. 19; д. е). не вызывало существенных изменений как со стороны актинового цитоскелета, так и со стороны микротрубочек. Площадь, занятая актиновыми фила ментами (21,0±6,8%) и микротрубочками (57.2±3.4%) в клетках, стимулированных тромбином, на фоне действия коклюшного токсина не отличается от их количества в интактных клетках (рис. 19; ж, з). Площадь клеток также не изменяется.

Таким образом, предобработка коклюшным токсином снижает вызванные действием тромбина образование стресс-фибрилл и деполимеризацию микротрубочек.

Рисунок IS.

Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а) и микротрубочек (б) в контроле, при действии РТХ. при действии тромбина и действии тромбина в присутствии РТХ.абконтроль РТХ тромбин РТХ+ тромбинконтроль РТХ тромбин РТХ+ тромбинРТХ+тромРисунок 19.

Влияние коклюшного токсина (РТХ) на вызванные тромбином изменения цитоскелета и клетках эндотелия.

Иммунофлуореецентные микрофотографии клеток НРАЕС, предоб работа нных коклюшным токсином г), а чатем стимулированных тромбином (м\ з). Правый вертикальный ряд - микротрубочки; левый вертикальный ряд - актин. Для сравнения приведены контрольные, не подвергавшиеся экспериментальным воздействиям клетки (а, 6). а также клетки, обработанные тромбином в отсутствии РТХ {д, е). Масштабный отрезок - 20 икм.

Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии активатора аденилатциклаз.

Действуя через специфический рецептор, тромбин активирует связанные с рецептором в-белки, что приводит к запуску множества регуляторных путей в эндотелиальных клетках. (ингибиторный) белок уменьшает уровень внутриклеточного медиатора - циклического АМФ в клетке - и регулирует проницаемость ионных каналов. Синтез цАМФ из АТФ катализируется ферментом аденилатциклазой. Повысить уровень цАМФ в клетках можно искусственно, при использовании специфического активатора аденилатциклаз - форсколина. Поэтому для того, чтобы выявить роль цАМФ в процессе изменения цитоскелета эндотелиальных клеток при действии нокодазола и тромбина, в клетках эндотелия повышали уровень цАМФ с использованием форсколина.

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии форсколинаФорсколин в концентрации 50 цМ в течение 1 ч не вызывал существенных изменений в морфологии эндотелиальных клеток.

Характер расположения актиновых филаментов в обработанных форсколином клетках не отличался от нативных клеток (рис. 20, а). Так, площадь филаментов составила 21,6±5,1% (п=15) от площади всей клетки, что соответствует площади актиновых филаментов в контроле.

Система микротрубочек после обработки форсколином визуально не изменилась (рис. 20, б). Количественные измерения показали, что площадь, занимаемая микротрубочками, немного возросла по сравнению с контролем и составила 42,6±4,2% (п=15) от площади всей клетки. Некоторое увеличение количества микротрубочек произошло в центре клетки, площадь микротрубочек в центральном районе составила 83,3±5,8% (п=15).

Действие форсколина вызвало значительное уменьшение содержания ацетилированного тубулина в эндотелиальных клетках (рис. 20, в). Так, площадь, приходящаяся на ацетилированные микротрубочки, уменьшилась практически в три раза по сравнению с контролем и составила 6,8±3,3% (п=15) от площади клетки.форсколин, н,Рисунок 20,Влияние форсколина на изменения цнтоскелета, вызванные нокодазолом и тромбином, в клетках эндотелия.

Иммунофлуоресцентные микрофотографии клеток НРАЕС, пред обработан пых форсколином (а. б. в), а затем стимулированных нокодазояом в концентрации 100нМ (г, д. е). нокодазолом в концентрации 200 нМ (ж. з. е) и тромбином (к. л, м).

Левый вертикальный ряд - актин; средний вертикальный ряд - микротрубочки, правый вертикальный ряд-ацетилированный тубулин.

Масштабный отрезок - 20 мкм.

Площадь клеток после действия форсколина практически не изменялась и составляла 2775±591 мкм2(п=25).

Таким образом, действие форсколина не приводит к изменениям в актиновом цитоскелете и площади клеток, но значительно снижает количество стабильных микротрубочек.

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в присутствии форсколинаДля выяснения роли цАМФ в реакции цитоскелета эндотелиальных клеток на действие нокодазола, в клетках повышали уровень цАМФ, а затем стимулировали нокодазолом в концентрации 100 и 200 нМ в течение 30 мин. Для сравнения использовали результаты действия нокодазола в отсутствии активатора аденилатциклаз.

Анализ иммунофлуоресцентных изображений показал, что присутствие форсколина не изменяет состояние цитоскелета под действием нокодазола в концентрации 100 нМ (рис. 20, г). Так, количество актиновых филаментов составляет 26,0±4,6% от площади клетки, что соответствует количеству актиновых филаментов в клетках, обработанных только нокодазолом. Количество микротрубочек и ацетилированного тубулина также не изменяется по сравнению с их количеством при действии одного только йокодазола и составляет соответственно 29,3±4,5 и 11,5±4,1% от площади клетки (рис. 20, д, е). Площадь самих клеток незначительно уменьшается - до 2093±910 мкм2.

Иная картина наблюдается при использовании нокодазола в более высокой концентрации 200 нМ. В этом случае форсколин изменяет действие нокодазола на цитоскелет эндотелиальных клеток.

Содержание актиновых филаментов при действии нокодазола в.Vконцентрации 200 нМ в присутствии и отсутствии форсколина не изменяется (рис. 20, ж). Площадь, занимаемая актиновыми филаментами составляет. 31,3±8,1% от площади клетки. Однако, количество микротрубочек в присутствии форсколина под действием нокодазола значительно уменьшается (рис. 20, з). В целой клетке содержание микротрубочекуменьшается в 2 раза и составляет 7,9±2,5% от площади клетки. В зоне 10 мкм от края клетки, количество микротрубочек уменьшается уже в 4 раза и составляет 1,20±1,07 % от площади участка. Содержание ацетилированного тубулина также уменьшается вдвое и становится равным 8,0±2,8% от площади клетки (рис. 20, и).

Площадь клеток незначительно увеличивается и составляет 2506±448 мкм2.

Таким образом, форсколин не вызывает изменений в состоянии цитоскелета при действии нокодазола в концентрации 100 нМ. Однако, при повышении концентрации нокодазола в присутствии форсколина микротрубочки разбираются в 2 раза интенсивнее, и количество ацетилированного тубулина также уменьшается вдвое.

Полученные результаты позволяют заключить, что уровень цАМФ в клетке в целом не изменяет системы актиновых филаментов и микротрубочек, однако влияет на количество стабильных микротрубочек.

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в присутствии форсколинаДля выяснения роли цАМФ в реакции цитоскелета эндотелиальных клеток на действие тромбина, в клетках повышали уровень цАМФ, а затем стимулировали тромбином в концентрации 25 нМ. Для сравнения использовали результаты действия тромбина в отсутствии активатора ад енил атцикл аз.

Анализ изображений показал, что существенных изменений в акгиновом цитоскелете и системе микротрубочек при действии тромбина, в сравнении с действием тромбина в присутствии форсколина не происходит (рис. 20, к). Так, площадь занимаемая актиновыми филаментами, соответствует их площади в отсутствии форсколина (33,2±7,7%). Площадь, занимаемая микротрубочками, также не изменяется и составляет 42,1±4,1% (рис. 20, л). Несколько уменьшается площадь, занимаемая ацетилированными микротрубочками (8,5±3,2%) (рис. 20, м). Площадь клеток также не изменяется существенно (2353±474 мкм2). Полученные результаты позволяют заключить, что уровень цАМФ в клетке не влияет наизменения акгинового цитоскелета и микротрубочек, вызываемые тромбином. Можно предположить, что низкий уровень цАМФ не является обязательным условием, для изменений цитоскелета под действием тромбина.

Цитоскелет клеток эндотелия при действии нокодазола и тромбина в присутствии ингибитора Мо-киназИзвестно, что Шю ГТФ-аза регулирует как актиновый цитоскелет, так и микротрубочки (\МШпапп, \¥а1егтап-81:огег, 2001). Так, ингибирование Шю ГТФ-азы блокирует образование стресс-фибрилл, вызванное деполимеризацией микротрубочек (Епото1:о, 1996). Вместе с тем, ГТФ-аза Ию А, активируемая белком 012/13, выступает в качестве промежуточной сигнальной молекулы при действии тромбина (В¡гикиVа е1 а1., 2004).

Для того, чтобы выяснить роль эффектора Шю-белка Шю-киназы в процессе, приводящем к образованию стресс-фибрилл и уменьшению количества микротрубочек при действии нокодазола и тромбина, использовали специфический ингибитор ХИю киназы У-27632 (Маекалуа е1 а1., 1999).

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии ингибитора Юю-киназы У-27632Воздействие У-27632 при концентрации 5 цМ в течение 1ч не приводило к существенным изменениям в морфологии клеток эндотелия.

Однако, иммунофлюоресцентный анализ показал, что актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток резко изменился (рис. 21, а). После действия ингибитора в цитоплазме клеток практически полностью отсутствовали фибриллярные структуры, значительная доля актина перешла в деполимеризованную форму. Количественные измерения показали, что площадь, занимаемая стресс-фибриллами, уменьшилась в 3,5 раза по сравнению с контролем и составила 6,1±2,1% (п=15) от площади клетки. Плотность актина в исследуемых клетках уменьшалась от центра клетки кпериферии: если в центральном участке площадь филаментов была минимальной (4,0±2,7%), то в зоне 5 мкм от края она достигала 10,4±3,0% от площади участка.

Система микротрубочек после действия ингибитора визуально не изменилась (рис. 21, б). Однако, количественные измерения показали, что площадь, занимаемая микротрубочками немного уменьшилась по сравнению с контролем и составила 40,7±5,3% (п=15) от площади клетки. Наиболее значительно (на 20 %) уменьшилась площадь микротрубочек в центральном районе клетки, она составила 65,8±6,4% от площади выбранного участка. Можно предположить, что эффект уменьшения плотности расположения микротрубочек в центре клетки не является прямым следствием ингибиторования Юю киназ, а происходит вследствие снижения натяжения внутри клетки из-за разрушения актинового каркаса.

Действие ингибитора Шю-киназы привело к снижению количества стабильных микротрубочек (рис. 21, в), их площадь уменьшилась практически в 2 раза по сравнению с контролем и составила 9,9±2,9% от площади клетки.

Площадь эндотелиальных клеток не изменилась по сравнению слконтролем и составила 2693±547 мкм.

Таким образом, действие ингибитора Шю-киназы приводит к значительному снижению количества актиновых филаментов, некоторому уменьшению плотности микротрубочек в центре клетки и уменьшению количества стабильных микротрубочек.

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии нокодазола в присутствии У-27632Для выяснения роли Шю-киназы в ответе цитоскелета эндотелиальных клеток на действие нокодазола, в клетках ингибировали Шю-киназу сРисунок 21.

Влияние У-27632 на изменения цитоскелета, вызванные нокодазолом и тромбином, в клетках эндотелия.

Иммунофлуоресцентные микрофотографии клеток НРАЕС. предобработанных У-27632 (а, б. в), а затем стимулированных нокодазолом в концентрации ЮОнМ (г, д. е). и 200 нМ (ж, з. е). также тромбином (к. л. м).

Левый вертикальный ряд - актин; средний вертикальный ряд — микротрубочки, правый вертикальный ряд - ацетилированный тубулин.

Масштабный отрезок - 20 мкм.использованием У-27632, а затем стимулировали нокодазолом в концентрации 100 и 200 нМ в течение 30 мин. Для сравнения использовали результаты, полученные после действия нокодазола в отсутствии ингибитора Шю-киназы.

При действии нокодазола в концентрации 100 и 200 нМ в присутствии ингибитора Шю-киназы, количество полимеризованного актина увеличивается, однако формирования стресс-фибрилл не происходит (рис. 21, г, ж). Так, при совместном действии нокодазола (100 нМ) и У-27632, площадь, приходящаяся на долю полимеризованного актина, составляет 16,6±8,3% (п=18) от площади клетки, что по-прежнему ниже количества полимеризованного актина в контрольных нативных клетках. При действии нокодазола (200 нМ) в присутствии У-27632 количество полимеризованного актина не достигает его количества в нативных клетках и снижается более, чем в 2 раза по сравнению с его количеством после действия нокодазола в концентрации 200 нМ в отсутствии ингибитора. Однако, при совместном действии нокодазола в концентрации 200 нМ и У-27632 наблюдается аналогичное действию 200 нМ нокодазола перераспределение полимеризованного актина в центр клетки.

Присутствие ингибитора Шю-киназы в среде культивирования усиливает деполимеризацию микротрубочек в ответ на действие нокодазола (рис. 21, д, з). Так, при действии нокодазола в концентрации 100 нМ в присутствии У-27632 микротрубочки деполимеризуются значительно сильнее, чем в отсутствии ингибитора: площадь, занятая микротрубочками уменьшается практически в 4 раза и составляет 8,8±2,4% (п=18) от площади клетки. Неожиданным является тот факт, что микротрубочки в присутствии ингибитора деполимеризуются практически одинаково как при действии нокодазола в концентрации 100 нМ, так и при действии нокодазола в концентрации 200 нМ. После действия нокодазола (200нМ) в присутствии ингибитора площадь микротрубочек в клетке составляет 8,1 ±4,5% (п=18) от площади клетки.

Количество стабильных микротрубочек в клетке после действия нокодазола та1рке значительно уменьшается при добавлении в средуингибитора Rho-киназы (рис. 21, е, и). В присутствии ингибитора после действия нокодазола в концентрации 100 нМ площадь ацетилированного тубулина составила 7,0±1,8% (п=16), а после действия нокодазола в концентрации 200 нМ - 5,1 ±1,6% (п=16) от площади клетки.

Площадь клеток несколько уменьшается по сравнению аналогичными результатами экспериментов по воздействию нокодазола в отсутствии ингибитора. Наиболее значительное изменение площади происходит после действия нокодазола (100 нМ) в присутствии Y-27632.

Таким образом, ингибирование Rho-киназы препятствует возникновению стресс-фибрилл в ответ на действие нокодазола. Однако, ингибирование Rho-киназы увеличивает скорость деполимеризации микротрубочек под действием нокодазола. Исходя из полученных результатов можно предположить, что наличие стресс-фибрилл предохраняет микротрубочки от деполимеризации, вызванной нокодазолом.

Цитоскелет эндотелиальных клеток при действии тромбина в присутствии Y-27632Как уже упоминалось ранее, тромбин взаимодействует с PARI рецептором и активирует G12/13, вследствие чего активируется Rho и его эффектор Rho-киназа, а это в свою очередь стимулирует актомиозиновые взаимодействия и приводит к формированию стресс-фибрилл. Для того, чтобы выяснить в каком этапе сигнального каскада, ведущего от тромбина к формированию стресс-фибрилл, принимают участие микротрубочки, в клетках ингибировали Rho-киназу с использованием Y-27632, а затем стимулировали тромбином в концентрации 25 нМ. Для сравнения использовали результаты действия тромбина в отсутствии ингибира Rho-киназы.

Ингибирование Rho-киназы предотвращало вызваемое тромбином формирование стресс-фибрилл (рис. 21, к). В целой клетке площадь стресс-фибрилл не достигала даже контрольного уровня в нативных клетках и составляла 14,2±3,9% (п=20) от площади клетки (рис. 22, а).с; с;юо иО)о|(О 30с; :оконтроль тромбин У27632 ^7632+контроль тромбин У27632 ^мбинРисунок 22.

Гистограммы изменения количества стресс-фибрилл (а) и микротрубочек (о) в контроле, при действии ¥-27632. при действии тромбина и действии тромбина в присутствии У-27632.

Однако. ингибирование КЬо-киназы не предотвращало деполимеризацию микротрубочек, вызываемую тромбином (рис. 21. л). Так. при действии тромбина в присутствии ингибитора площадь микротрубочек в целой клетке уменьшалась и составила 36.5±3.0% (п=20) от площади клетки (рис. 22, б).

Количество ацетилированиого тубулипа при действии тромбина в присутствии ингибитора также уменьшалось (рис. 21. м) и площадь, занимаемая ацетилированными микротрубочками, составляла 8.15± 1.9% (п=14) от площади клетки.

Значительных изменений в площади клеток не происходило.

Таким образом, ингибирование Юю киназы приводит к исчезновению стресс-фибрилл, но не влияет на микротрубочки. Воздействие тромбина на фоне ингибирования КИо-киназы увеличивает площадь, занятую стресс-фибриллами, но не до исходного значения, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора КЬо-киназ.

Анализ системы микротрубочек в цитоплазме клетки по интенсивности флуоресценции тубулинаКак было показано ранее, нокодазол в концентрации 200 нМ вызывает формирование стресс-фибрилл в центре эндотелиальной клетки. Аналогично действию нокодазола, тромбин вызывает полимеризацию стресс-фибрилл в центре клетки, частично деполимеризуя микротрубочки на краю клетки. Встает вопрос: каким образом действие тромбина меняет систему микротрубочек эндотелиальных клеток в целом? После действия тромбина в клетке остается значительное количество микротрубочек, что затрудняет более детальный анализ их системы. Поэтому для того, чтобы дать оценку всей системы микротрубочек, был применен непрямой метод анализа, основанный на измерении интенсивности флуоресценции тубулина в цитоплазме клетки. Вначале была разработана модельная система, позволяющая оценить полученный результат, а затем модель была проверена при помощи искусственного понижения плотности микротрубочек в культивируемых клетках.

Моделирование системы микротрубочек.

Для анализа системы микротрубочек в живых клетках был применен метод моделирования с использованием компьютера. С помощью векторной графики моделировали изображения клеток, содержащие систему микротрубочек с заданными параметрами, а затем измеряли динамику снижения оптической плотности от точки схождения микротрубочек (аналог центросомы) до края клетки. Оптическая плотность измерялась в десяти квадратных участках, расположенных от «центросомы», где плотность микротрубочек была максимальной, до края клетки. В используемой модели имелись определенные допущения. Во-первых, исходное изображение было плоским, поэтому все микротрубочки лежали в одной горизонтальной плоскости с «центросомой». Во-вторых, все микротрубочки были прямыми и не пересекались друг с другом. В первую очередь анализировалась система микротрубочек, состоящая только из связанных с «центросомой» микротрубочек, имеющих постоянную длину, равную радиусу клетки (рис. 23, клетка 1).! клетка 1п100клетка 2120клетка 31208040клетка 4клетка 5г 4 б в ю участок измеренияРисунок 23.

Моделирование системы микротрубочек.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Смурова, Ксения Михайловна

Выводы

1. Нокодазол в концентрации 100 нМ разрушает микротрубочки на краю клетки, но не оказывает существенного влияния на количество стресс-фибрилл в клетках эндотелия. Нокодазол в концентрации 200 нМ, деполимеризуя микротрубочки сильнее, приводит к формированию дополнительных стресс-фибрилл в центре клетки.

2. Тромбин индуцирует дисфункцию эндотелия, вызывая, в первую очередь, уменьшение количества микротрубочек на периферии клетки, а затем образование стресс-фибрилл.

3. Гиперэкспрессия конститутивно активных а-субъединиц G12, G13, Gi2 и Gq белков приводит к увеличению плотности расположения и толщины стресс-фибрилл, разрушению системы микротрубочек и уменьшению площади клетки.

4. Предобработка коклюшным токсином снижает вызванные действием ф тромбина образование стресс-фибрилл и деполимеризацию микротрубочек.

5. Уровень цАМФ в клетке не влияет на изменения актинового цитоскелета и микротрубочек, вызываемые тромбином.

6. Воздействие тромбина на фоне ингибирования Rho-киназы увеличивает площадь, занятую стресс-фибриллами, тогда как микротрубочки разбираются при действии тромбина вне зависимости от присутствия ингибитора Rho-киназ.

7. Действие тромбина приводит к элиминации периферических микротрубочек и меняет их распределение в центре клетки.

8. Полученные результаты позволяют предположить, что тромбин регулирует актиновый цитоскелет эндотелиальных клеток через Rho-Rho-киназный путь, где в качестве промежуточного звена выступает деполимеризация микротрубочек на краю клетки.

Благодарности

В заключение я хочу поблагодарить моего научного руководителя, Алиеву Ирину Борисовну за неоценимую помощь в создании этой работы, Воробьева Ивана Андреевича за мудрые советы и Григорьева Илью за новые идеи, использованные в данной работе. Также хочу выразить благодарность Александру Верину и Анне Бирюковой (Университет Дж. Хопкинса, США) за внимательное руководство и доброе отношение. Кроме того, я благодарю Татьяну Войно-Ясенецкую (Университет Иллинойса в Чикаго, США) за предоставленные генетические конструкты и Лакшмэ Натараджан (Университет Дж. Хопкинса, США) за помощь при ведении культуры клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смурова, Ксения Михайловна, Москва

1. Воробьев И.А., Григорьев И.С., Бориси Г.Г. Динамика микротрубочек в культивируемых клетках. Онтогенез. 2000. т. 31, N6, с. 420-428

2. Григорьев И.С., Чернобельская A.A., Воробьев И.А. Количественный анализ сальтаторных движений в поляризованных фибробластах. Биол Мембр. 1997. Т. 14(2) с. 160-173

3. Смурова K.M., Алиева И.Б, Воробьев И.А. 2002. Динамика восстановления цитоплазматических микротрубочек после их разрушения нокодазолом в клетках культуры Vero. Биологические мембраны т. 19, N 6, с. 472482.

4. Смурова K.M., Бирюкова A.A., Гарсиа Дж., Воробьев И.А, Алиева И.Б., Верин А.Д. 2004. Реорганизация системы микротрубочек в клетках легочного эндотелия в ответ на воздействие тромбина. Цитология, Том 46, N8, стр. 695-703.

5. Чернобельская O.A., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 2004. Динамика восстановления микротрубочек в клетке: быстрый рост от центросомы и медленное восстановление свободных микротрубочек. Цитология, т. 46, N6, стр. 531-544.

6. Abraham V.C., Krishnamurthi V., Taylor D.L., Lanni F. The actin-based nanomachine at the leading edge of migrating cells. Biophys J. 1999. Sep; 77(3):1721-32.

7. Ahmad F.J., Yu W., McNally F.J., Baas P.W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. J Cell Biol. 1999. Apr 19;145(2):305-15.

8. Akhmanova A., Hoogenraad C.C., Drabek K., Stepanova T., Dortland В., Verkerk T., Vermeulen W., Burgering B.M., De Zeeuw C.I., Grosveld F., Galjart N.

9. Clasps are CLIP-115 and -170 associating proteins involved in the regional regulation of microtubule dynamics in motile fibroblasts. Cell. 2001. Mar 23;104(6):923-35.

10. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology of the Cell, edn. 4. Garland Science, New York. 2002.

11. Allan V.J., Schroer T.A. Membrane motors. Curr Opin Cell Biol. 1999. Aug;l l(4):476-82.

12. Allen C., Borisy G.G. Structural polarity and directional growth of microtubules of . Chlamydomonas flagella. J Mol Biol. 1974 Dec 5;90(2):381-402.

13. Amann K.J., Pollard T.D. Cellular regulation of actin network assembly. Curr Biol. 2000 Oct 19;10(20):R728-30.

14. Baas PW, Joshi HC. Gamma-tubulin distribution in the neuron: implications for the origins of neuritic microtubules. J Cell Biol. 1992 Oct;l 19(1): 171-8.

15. Badley R.A., Woods A., Carruthers L., Rees D.A. Cytoskeleton changes in fibroblast adhesion and detachment. J Cell Sci. 1980 Jun;43:379-90.

16. Bamburg J.R., McGough A., Ono S. Putting a new twist on actin: ADF/cofilins modulate actin dynamics. Trends Cell Biol. 1999 Sep;9(9):364-70.

17. Barr L.F., Campbell S.E., Baylin S.B. Protein kinase C-beta 2 inhibits cycling and decreases c-myc-induced apoptosis in small cell lung cancer cells. Cell Growth Differ. 1997

18. Barth A.I., Siemers K.A., Nelson W.J. Dissecting interactions between EB1, microtubules and APC in cortical clusters at the plasma membrane. J Cell Sci. 2002 Apr 15;115(Pt 8): 1583-90.

19. Bashour A.M., Fullerton A.T., Hart M.J., Bloom G.S. IQGAP1, a Rac- and Cdc42-binding protein, directly binds and cross-links microfilaments. J Cell Biol. 1997 Jun 30;137(7):1555-66.

20. Bear J.E., Loureiro J.J., Libova I., Fassler R., Wehland J., Gertler F.B. Negative regulation of fibroblast motility by Ena/VASP proteins. Cell. 2000 Jun 23;101(7):717-28.

21. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvement of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction. Curr Biol. 1996 Oct l;6(10):1279-89.

22. Bershadsky A.D., Balaban N.Q., Geiger B. Adhesion-dependent cell mechanosensitivity. Annu Rev Cell Dev Biol. 2003;19:677-95.

23. Birukova A.A., Smurova K., Birukov K.G., Kaibuchi K., Garcia J.G., Verin A.D. Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction. Microvasc Res. 2004 Jan;67(l):64-77.

24. Bishop A.L., Hall A. Rho GTPases and their effector proteins. Biochem J. 2000 Jun l;348 Pt 2:241-55.

25. Blanchoin L., Pollard T.D., Mullins R.D. Interactions of ADF/cofilin, Arp2/3 complex, capping protein and profilin in remodeling of branched actin filament networks. Curr Biol. 2000 Oct 19;10(20):1273-82.

26. Bogatcheva N.V., Garcia J.G., Verin A.D. Molecular mechanisms of thrombin-induced endothelial cell permeability. Biochemistry (Mosc). 2002 Jan;67(l):75-84.

27. Brinkley B.R., Wible L.J., Asch B.B., Medina D., Mace M.M., Beall P.T., Cailleau R.M. The microtubule cytoskeleton in normal and transformed cells in vitro. Results Probl. Cell Differ. 1980. N. 11. P.132-8.

28. Buhl A.M., Johnson N.L., Dhanasekaran N., Johnson G.L. G alpha 12 and G alpha 13 stimulate Rho-dependent stress fiber formation and focal adhesion assembly. J Biol Chem. 1995 Oct 20;270(42):24631-4.

29. Bulinski J.C. MAP4 In Microtubules. Edited by JS Hymans, CW Lioyd. New York. Wiley-Liss Inc. 1994. P. 167-182.

30. Canman J.C., Hoffman D.B., Salmon E.D. The role of pre- and post-anaphase microtubules in the cytokinesis phase of the cell cycle. Curr Biol. 2000 May 18;10(10):611-4.

31. Carlier M.F. Actin polymerization and ATP hydrolysis. Adv Biophys. 1990;26:51-73.

32. Cassimeris L., Safer D., Nachmias V.T., Zigmond S.H. Thymosin beta 4 sequesters the majority of G-actin in resting human polymorphonuclear leukocytes. J Cell Biol. 1992 Dec;l 19(5): 1261-70.

33. Chan A.Y., Bailly M., Zebda N., Segall J.E., Condeelis J.S. Role of cofilin in epidermal growth factor-stimulated actin polymerization and lamellipod protrusion. J Cell Biol. 2000 Feb 7;148(3):531-42.

34. Cook T.A., Nagasaki T., Gundersen G.G. Rho guanosine triphosphatase mediates the selective stabilization of microtubules induced by lysophosphatidic acid.

35. Cooper J.A., Pollard T.D. Methods to measure actin polymerization. Methods Enzymol. 1982;85PtB: 182-210.

36. Cross R.A, Carter N.J. Molecular motors. Curr Biol. 2000 Mar 9;10(5):R177-9.

37. Cytrynbaum E.N., Rodionov V., Mogilner A. Computational model of dynein-dependent self-organization of microtubule asters. J Cell Sci. 2004 Mar 15; 117(Pt 8):1381-97.

38. Danowski B.A. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors. J Cell Sci. 1989 Jun;93 (Pt 2):255-66.

39. Daub H., Gevaert K., Vandekerckhove J., Sobel A., Hall A. Rac/Cdc42 and p65PAK regulate the microtubule-destabilizing protein stathmin through phosphorylation at serine 16. J Biol Chem. 2001 Jan 19;276(3): 1677-80.

40. Dhamodharan R., Wadsworth P. Modulation of microtubule dynamic instability in vivo by brain microtubule associated proteins. J Cell Sci. 1995 Apr; 108 ( Pt 4): 1679-89.

41. Diamantopoulos G.S., Perez F., Goodson H.V., Batelier G, Melki R, Kreis TE, Rickard JE. Dynamic localization of CLIP-170 to microtubule plus ends is coupled to microtubule assembly. J Cell Biol. 1999 Jan 11 ;144(1):99-112.

42. DiNubile M.J., Cassimeris L., Joyce M., Zigmond S.H. Actin filament barbed-end capping activity in neutrophil lysates: the role of capping protein-beta 2. Mol Biol Cell. 1995 Dec;6(12): 1659-71.

43. Djinovic-Carugo K., Young P., Gautel M., Saraste M. Structure of the alpha-actinin rod: molecular basis for cross-linking of actin filaments. Cell. 1999 Aug 20;98(4):537-46.

44. Dudek S.M., Garcia J.G. Cytoskeletal regulation of pulmonary vascular permeability. J Appl Physiol. 2001 Oct;91(4): 1487-500.

45. Endow S.A. Determinants of molecular motor directionality. Nat Cell Biol. 1999 Oct;l(6):E163-7.

46. Enomoto T. Microtubule disruption induces the formation of actin stress fibers and focal adhesions in cultured cells: possible involvement of the rho signal cascade. Cell Struct Funct. 1996 Oct;21(5):317-26.

47. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 2002 Dec 12;420(6916):629-35.

48. Etienne-Manneville S. Cdc42 the centre of polarity. J Cell Sci. 2004 Mar 15; 117(Pt 8):1291-300.

49. Fechheimer M., Zigmond S.H. Focusing on unpolymerized actin. J Cell Biol. 1993 Oct;123(l):l-5.

50. Fritsche J., Reber B.F., Schindelholz B., Bandtlow C.E. Differential cytoskeletal changes during growth cone collapse in response to hSema III and thrombin. Mol Cell Neurosci. 1999 Oct-Nov;14(4-5):398-418.

51. Fuchs E., Karakesisoglou I. Bridging cytoskeletal intersections. Genes Dev. 2001 Jan 1;15(1):1-14.

52. Fukata M., Watanabe T., Noritake J., Nakagawa M., Yamaga M., Kuroda S., Matsuura Y., Iwamatsu A., Perez F., Kaibuchi K. Racl and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170. Cell. 2002 Jun 28;109(7):873-85.

53. Garcia J.G., Siflinger-Birnboim A., Bizios R., Del Vecchio P.J., Fenton J.W. 2nd, Malik AB. Thrombin-induced increase in albumin permeability across the endothelium. J Cell Physiol. 1986 Jul;128(l):96-104.

54. Garcia J.G., Davis H.W., Patterson C.E. Regulation of endothelial cell gap formation and barrier dysfunction: role of myosin light chain phosphorylation. J Cell Physiol. 1995 Jun;163(3):510-22.

55. Garcia J.G., Verin A.D., Schaphorst K.L. Regulation of thrombin-mediated endothelial cell contraction and permeability. Semin Thromb Hemost. 1996;22(4):309-15

56. Geahlen R.L., Haley B.E. Use of a GTP photoaffinity probe to resolve aspects of the mechanism of tubulin polymerization. J Biol Chem. 1979 Dec 10;254(23):11982-7.

57. Geiger B., Bershadsky A., Pankov R., Yamada K.M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix—cytoskeleton crosstalk. Nat Rev Mol Cell Biol. 2001 Nov;2(l l):793-805.

58. Glaven J.A., Whitehead I., Bagrodia S., Kay R., Cerione R.A. The Dbl-related protein, Lfc, localizes to microtubules and mediates the activation of Rac signaling pathways in cells. J Biol Chem. 1999 Jan 22;274(4):2279-85.

59. Glotzer M. Animal cell cytokinesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 2001;17:351-86.

60. Goode B.L., Drubin D.G., Barnes G. Functional cooperation between the microtubule and actin cytoskeletons. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(l):63-71.

61. Grand R.J., Turnell A.S., Grabham P.W. Cellular consequences of thrombin-receptor activation. Biochem J. 1996 Jan 15;313 ( Pt 2):353-68.

62. Gross S.P., Tuma M.C., Deacon S.W., Serpinskaya A.S., Reilein A.R., Gelfand V.I. Interactions and regulation of molecular motors in Xenopus melanophores. J Cell Biol. 2002 Mar 4;156(5):855-65.

63. Gundersen G.G., Kalnoski M.H., Bulinski J.C. Distinct populations of microtubules: tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo. Cell. 1984 Oct;38(3):779-89.

64. Gundersen G.G., Khawaja S., Bulinski J.C. Postpolymerization detyrosination of alpha-tubulin: a mechanism for subcellular differentiation of microtubules. J Cell Biol. 1987 Jul;105(l):251-64.

65. Gundersen G.G., Cook T.A. Microtubules and signal transduction. Curr Opin Cell Biol. 1999 Feb;ll(l):81-94

66. Hall A. G proteins and small GTPases: distant relatives keep in touch. Science. 1998 Jun 26;280(5372):2074-5.

67. Heald R., Nogales E. Microtubule dynamics. J Cell Sci. 2002 Jan 1;115(Pt l):3-4.

68. Hesse J., Maruta H., Isenberg G. Monoclonal antibodies localize the exchangeable GTP-binding site in beta- and not alpha-tubulins. FEBS Lett. 1985 Jan l;179(l):91-5.

69. Holleran E.A., Karki S,. Holzbaur E.L. The role of the dynactin complex in intracellular motility. Int Rev Cytol. 1998;182:69-109.

70. Hoogenraad C.C, Akhmanova A., Grosveld F., De Zeeuw C.I., Galjart N. Functional analysis of CLIP-115 and its binding to microtubules. J Cell Sci. 2000 Jun;l 13 (Pt 12):2285-97

71. Huang J.D., Brady S.T., Richards B.W., Stenolen D., Resau J.H., Copeland N.G., Jenkins N.A. Direct interaction of microtubule- and actin-based transport motors. Nature. 1999 Jan 21;397(6716):267-70.

72. Joshi H.C., Palacios M.J., McNamara L., Cleveland D.W. Gamma-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation. Nature. 1992 Mar 5;356(6364):80-3.

73. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J.V. Microtubule targeting of substrate contacts promotes their relaxation and dissociation. J Cell Biol. 1999 Sep 6;146(5):1033-44.

74. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J.V. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility. Int J Biochem Cell Biol. 2002 Jul;34(7):746-61.

75. Keating T.J., Borisy G.G. Immunostructural evidence for the template mechanism of microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 2000 Jun;2(6):352-7.

76. Keller H.U., Niggli V. Colchicine-induced stimulation of PMN motility related to cytoskeletal changes in actin, alpha-actinin, and myosin. Cell Motil Cytoskeleton. 1993 ;25(1): 10-8.

77. Kiehart D.P. Molecular genetic dissection of myosin heavy chain function. Cell. 1990 Feb 9;60(3):347-50.

78. King S.M., Barbarese E., Dillman J.F. Ill, Patel-King R.S., Carson J.H., Pfister K.K. Brain cytoplasmic and flagellar outer arm dyneins share a highly conserved Mr 8,000 light chain. J Biol Chem. 1996 Aug 9;271(32): 19358-66.

79. Kitamura K., Tokunaga M., Iwane A.H., Yanagida T. A single myosin head moves along an actin filament with regular steps of 5.3 nanometres. Nature. 1999 Jan 14;397(6715): 129-34.

80. Kjoller L., Hall A. Signaling to Rho GTPases. Exp Cell Res. 1999 Nov 25;253(l):166-79.

81. Komarova Y.A., Akhmanova A.S., Kojima S., Galjart N., Borisy G.G. (a) Cytoplasmic linker proteins promote microtubule rescue in vivo. J Cell Biol. 2002 Nov 25;159(4):589-99.

82. Komarova Y.A.,Vorobjev I.A., Borisy G.G. (6) Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior; asymmetric transition frequencies and effects of cell boundary. J Cell Sci. 2002 Sep 1; 115(Pt 17) 3517-39

83. Piperno G., LeDizet M., Chang X.J. Microtubules containing acetylated alpha-tubulin in mammalian cells in culture. J Cell Biol. 1987 Feb; 104(2):289-302.

84. Krendel M., Zenke F.T., Bokoch G.M. Nucleotide exchange factor GEF-H1 mediates cross-talk between microtubules and the actin cytoskeleton. Nat Cell Biol. 2002 Apr;4(4):294-301.

85. Kroeze W.K., Sheffler D.J., Roth B.L. G-protein-coupled receptors at a glance. J Cell Sci. 2003 Dec 15; 116(Pt 24):4867-9.

86. Krylyshkina O., Anderson K.I., Kaverina I., Upmann I., Manstein D.J., Small J.V., Toomre D.K. Nanometer targeting of microtubules to focal adhesions. J Cell Biol. 2003 Jun 9;161(5):853-9.

87. Kuriyama R., Gustus C., Terada Y., Uetake Y., Matuliene J. CHOI, a mammalian kinesin-like protein, interacts with F-actin and is involved in the terminal phase of cytokinesis. J Cell Biol. 2002 Mar 4;156(5):783-90.

88. Kuznetsov S.A., Langford G.M., Weiss D.G. Actin-dependent organelle movement in squid axoplasm. Nature. 1992 Apr 23;356(6371):722-5.

89. Machesky L.M., Mullins R.D., Higgs H.N., Kaiser D.A., Blanchoin L., May R.C., Hall M.E., Pollard T.D. Scar, a WASp-related protein, activates nucleation of actin filaments by the Arp2/3 complex. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3739-44.

90. Machesky L.M., Insall R.H. Signaling to actin dynamics. J Cell Biol. 1999 Jul 26;146(2):267-72.

91. Maciver S.K. How ADF/cofilin depolymerizes actin filaments. Curr Opin Cell Biol. 1998 Feb;10(l): 140-4.

92. Maekawa M., Ishizaki T., Boku S., Watanabe N., Fujita A., Iwamatsu A., Obinata T., Ohashi K., Mizuno K., Narumiya S. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 1999 Aug 6;285(5429):895-8.

93. Maly I.V., Borisy G.G. Self-organization of treadmilling microtubules into a polar array. Trends Cell Biol. 2002 Oct;12(10):462-5

94. Mandato C.A., Benink H.A., Bernent W.M. Microtubule-actomyosin interactions in cortical flow and cytokinesis. Cell Motil Cytoskeleton. 2000 Feb;45(2):87-92.

95. Mandato C.A., Bement W.M. Actomyosin transports microtubules and microtubules control actomyosin recruitment during Xenopus oocyte wound healing. Curr Biol. 2003 Jul 1 ;13( 13): 1096-105.

96. Mandelkow E.M., Mandelkow E., Milligan R.A. Microtubule dynamics and microtubule caps: a time-resolved cryo-electron microscopy study. J Cell Biol. 1991 Sep;114(5):977-91.

97. Manolopoulos V.G., Fenton J.W. 2nd, Lelkes P.I. The thrombin receptor in adrenal medullary microvascular endothelial cells is negatively coupled to adenylyl cyclase through a Gi protein. Biochim Biophys Acta. 1997 May 27;1356(3):321-32.

98. Martin O.C., Gunawardane R.N., Iwamatsu A., Zheng Y. Xgripl09: a gamma tubulin-associated protein with an essential role in gamma tubulin ring complex (gammaTuRC) assembly and centrosome function. J Cell Biol. 1998 May 4;141(3):675-87.

99. Maruta H., Greer K., Rosenbaum J.L. The acetylation of alpha-tubulin and its relationship to the assembly and disassembly of microtubules. J Cell Biol. 1986 Aug;103(2):571-9.

100. McCartney B.M., McEwen D.G., Grevengoed E., Maddox P., Bejsovec A., Peifer M. Drosophila APC2 and Armadillo participate in tethering mitotic spindles to cortical actin. Nat Cell Biol. 2001 Oct;3(10):933-8.

101. McNeil P.L., Terasaki M. Coping with the inevitable: how cells repair a torn surface membrane. Nat Cell Biol. 2001 May;3(5):E 124-9.

102. Miller R.K., Cheng S.C., Rose M.D. Bimlp/Yeblp mediates the Kar9p-dependent cortical attachment of cytoplasmic microtubules. Mol Biol Cell. 2000 Sep;ll(9):2949-59.

103. Mimori-Kiyosue Y., Shiina N., Tsukita S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 2000 Jul 13;10(14):865-8.

104. Mimori-Kiyosue Y., Grigoriev I., Lansbergen G., Sasaki H., Matsui C., Severin F., Galjart N., Grosveld F., Vorobiev I, Tsukita S., Akhmanova A. CLASP 1 and

105. CLASP2 bind to EB1 and regulate microtudule plus end dynamics at the cell cortex. J Cell Biol. 2004.

106. Minden A., Lin A., Claret FX., Abo A., Karin M. Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell. 1995 Jun 30;81(7):1147-57.

107. Mitchison T., Kirschner M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 1984. V. 312. P. 237-242.

108. Mogensen M.M., Malik A., Piel M., Bouckson-Castaing V., Bornens M. Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role of ninein. J Cell Sci. 2000 Sep;l 13 (Pt 17):3013-23.

109. Mogilner A., Oster G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 1996 Dec;71(6):3030-45.

110. Moritz M., Braunfeld M.B., Sedat J.W., Alberts B., Agard D.A. Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature. 1995 Dec 7;378(6557):638-40.

111. Moritz M., Zheng Y., Alberts B.M., Oegema K. Recruitment of the gamma-tubulin ring complex to Drosophila salt-stripped centrosome scaffolds. J Cell Biol. 1998 Aug 10;142(3):775-86.

112. Moritz M., Braunfeld M.B., Guenebaut V., Heuser J., Agard D.A. Structure of the gamma-tubulin ring complex: a template for microtubule nucleation. Nat Cell Biol. 2000 Jun;2(6):365-70.

113. Moritz M., Agard D.A. Gamma-tubulin complexes and microtubule nucleation. Curr Opin Struct Biol. 2001 Apr;l 1(2): 174-81.

114. Morrison E.E., Moncur P.M., Askham J.M. EB1 identifies sites of microtubule polymerisation during neurite development. Brain Res Mol Brain Res. 2002 Jan 31 ;98(l-2): 145-52.

115. Moudjou M., Bordes N., Paintrand M., Bornens M. Gamma-Tubulin in mammalian cells: the centrosomal and the cytosolic forms. J Cell Sci. 1996 Apr; 109 ( Pt 4):875-87.

116. Muresan V., Joshi H.C., Besharse J.C. Gamma-tubulin in differentiated cell types: localization in the vicinity of basal bodies in retinal photoreceptors and ciliated epithelia. J Cell Sci. 1993 Apr;104 ( Pt 4):1229-37.

117. Nachmias V.T., Cassimeris L., Golla R., Safer D. Thymosin beta 4 (T beta 4) in activated platelets. Eur J Cell Biol. 1993 Aug;61(2):314-20.

118. Nath J.P., Eagle G.R., Himes R.H. Direct photoaffinity labeling of tubulin with guanosine 5'-triphosphate. Biochemistry. 1985 Mar 12;24(6): 1555-60.

119. Nguyen H.L., Chari S., Gruber D., Lue C.M., Chapin S.J., Bulinski J.C. Overexpression of full- or partial-length MAP4 stabilizes microtubules and alters cell growth. J Cell Sci. 1997 Jan;l 10 ( Pt 2):281-94.

120. Niggli V. Microtubule-disruption-induced and chemotactic-peptide-induced migration of human neutrophils: implications for differential sets of signalling pathways. J Cell Sci. 2003 Mar 1;116(Pt 5):813-22.

121. Nobes C.D., Hall A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia. Cell. 1995 Apr 7;81(l):53-62.

122. Novick P., Zerial M. The diversity of Rab proteins in vesicle transport. Curr Opin Cell Biol. 1997 Aug;9(4):496-504.

123. Oakley C.E., Oakley B.R. Identification of gamma-tubulin, a new member of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillus nidulans. Nature. 1989 Apr 20;338(6217):662-4.

124. Oakley B.R., Oakley C.E., Yoon Y., Jung M.K. Gamma-tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans. Cell. 1990 Jun 29;61(7):1289-301.

125. Oegema K., Wiese C., Martin O.C., Milligan R.A., Iwamatsu A., Mitchison T.J., Zheng Y. Characterization of two related Drosophila gamma-tubulin complexes that differ in their ability to nucleate microtubules. J Cell Biol. 1999 Feb 22;144(4):721-33.

126. Offermanns S., Simon M.I. Organization of transmembrane signalling by heterotrimeric G proteins. Cancer Surv. 1996;27:177-98.

127. Olson M.F., Ashworth A., Hall A. An essential role for Rho, Rac, and Cdc42 GTPases in cell cycle progression through Gl. Science. 1995 Sep 1;269(5228): 1270-2.

128. Osborn M., Born T., Koitsch H.J., Weber K. Stereo immunofluorescence microscopy: I. Three-dimensional arrangement of microfilaments, microtubules and tonofilaments. Cell. 1978 Jul;14(3):477-88.

129. Osborn M., Weber K. Cytoplasmic microtubules in tissue culture cells appear to grow from an organizing structure towards the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 1976 Mar;73(3):867-71.

130. Osborn M., Weber K. The display of microtubules in transformed cells. Cell. 1977 Nov;12(3):561-71.

131. Palazzo A.F., Cook T.A., Alberts A.S., Gundersen G.G. mDia mediates Rho-regulated formation and orientation of stable microtubules. Nat Cell Biol. 2001 Aug;3(8):723-9.

132. Pantaloni D., Carlier M.F. How profllin promotes actin filament assembly in the presence of thymosin beta 4. Cell. 1993 Dec 3;75(5):1007-14.

133. Pantaloni D., Boujemaa R., Didry D., Gounon P., Carlier M.F. The Arp2/3 complex branches filament barbed ends: functional antagonism with capping proteins. Nat Cell Biol. 2000 Jul;2(7):385-91.

134. Parschal B.M., Vallee R.B., 1987 Retrograde transport by the microtubule-associated protein MAP 1C. Nature. 1987. N. 18;330(6144). P. 181-3.

135. Paschal B.M., King S.M., Moss A.G., Collins C.A., Vallee R.B., Witman G.B. Isolated flagellar outer arm dynein translocates brain microtubules in vitro. Nature. 1987 Dec 17-23;330(6149):672-4.

136. Patterson C.E., Lum H., Schaphorst K.L., Venn A.D., Garcia J.G. Regulation of endothelial barrier function by the cAMP-dependent protein kinase. Endothelium. 2000;7(4):287-308.

137. Perez F., Diamantopoulos G.S., Stalder R., Kreis T.E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo. Cell. 1999 Feb 19;96(4):517-27.

138. Petrache I., Birukova A., Ramirez S.I., Garcia J.G., Verin A.D. The role of the microtubules in tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial cell permeability. Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 May;28(5):574-81.

139. Piel M., Meyer P., Khodjakov A., Rieder C.L., Bornens M. The respective contributions of the mother and daughter centrioles to centrosome activity and behavior in vertebrate cells. J Cell Biol. 2000 Apr 17;149(2):317-30.

140. Platts S.H., Martinez-Lemus L.A., Meininger G.A. Microtubule-dependent regulation of vasomotor tone requires Rho-kinase. J Vase Res. 2002 Mar-Apr;39(2): 173-82.

141. Pollard T.D. Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments. J Cell Biol. 1986 Dec;103(6 Pt 2):2747-54.

142. Pollard T.D., Blanchoin L., Mullins R.D. Actin dynamics. J Cell Sci. 2001 Jan;114(Pt l):3-4.

143. Pollard T.D., Beltzner C.C. Structure and function of the Arp2/3 complex. Curr Opin Struct Biol. 2002 Dec;12(6):768-74.

144. Pollard T.D., Borisy G.G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 2003 Feb 21;112(4):453-65.

145. Porter K.R. Cytoplasmic microtubules and their function. Ciba Found. Symp.l966.V.8:308-356

146. Prehoda K.E., Lee D.J., Lim W.A. Structure of the enabled/VASP homology 1 domain-peptide complex: a key component in the spatial control of actin assembly. Cell. 1999 May 14;97(4):471-80.

147. Pruyne D., Evangelista M., Yang C., Bi E., Zigmond S., Bretscher A., Boone C. Role of formins in actin assembly: nucleation and barbed-end association. Science. 2002 Jul 26;297(5581):612-5.

148. Raff E.C., Fackenthal J.D., Hutchens J.A., Hoyle H.D., Turner F.R. Microtubule architecture specified by a beta-tubulin isoform. Science. 1997 Jan 3;275(5296):70-3.

149. Ren X.D., Kiosses W.B., Schwartz M.A. Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton. EMBO J. 1999 Feb l;18(3):578-85.

150. Ren Y., Li R., Zheng Y., Busch H. Cloning and characterization of GEF-H1, a microtubule-associated guanine nucleotide exchange factor for Rac and Rho GTPases. J Biol Chem. 1998 Dec 25;273(52):34954-60.

151. Rickard J.E., Kreis T.E. Identification of a novel nucleotide-sensitive microtubule-binding protein in HeLa cells. J Cell Biol. 1990 May; 110(5): 1623-33.

152. Ridley A.J. Rho family proteins: coordinating cell responses. Trends Cell Biol. 2001 Dec;ll(12):471-7.

153. Ridley A.J., Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 1992 Aug 7;70(3):389-99.

154. Rodionov V.I., Hope A.J., Svitkina T.M., Borisy G.G. Functional coordination of microtubule-based and actin-based motility in melanophores. Curr Biol. 1998 Jan 29;8(3):165-8.

155. Rodionov V., Nadezhdina E., Borisy G. Centrosomal control of microtubule dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Jan 5;96(1): 115-20.

156. Rodionov V.I., Borisy G.G. Microtubule treadmilling in vivo. Science. 1997 Jan 10;275(5297):215-8.

157. Rodriguez O.C., Schaefer A.W., Mandato C.A., Forscher P., Bement W.M., Waterman-Storer C.M. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis. Nat Cell Biol. 2003 Jul;5(7):599-609

158. Roger B., Al-Bassam J., Dehmelt L., Milligan R.A., Halpain S. MAP2c, but not tau, binds and bundles F-actin via its microtubule binding domain. Curr Biol. 2004 Mar 9;14(5):363-71.

159. Rogers S.L., Gelfand V.I. Membrane trafficking, organelle transport, and the cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(l):57-62.

160. Roychowdhury S., Panda D., Wilson L., Rasenick M.M. G protein alpha subunits activate tubulin GTPase and modulate microtubule polymerization dynamics. J Biol Chem. 1999 May 7;274( 19): 13485-90.

161. Roychowdhury S., Rasenick M.M. G protein betalgamma2 subunits promote microtubule assembly. J Biol Chem. 1997 Dec 12;272(50):31576-81.

162. Rusan N.M., Fagerstrom C.J., Yvon A.M., Wadsworth P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Mol Biol Cell. 2001 Apr; 12(4):971-80.

163. Sammak P.J., Borisy G.G. Detection of single fluorescent microtubules and methods for determining their dynamics in living cells. Cell Motil Cytoskeleton. 1988;10(l-2):237-45.

164. Sarma T., Voyno-Yasenetskaya T., Hope T.J., Rasenick M.M. Heterotrimeric G-proteins associate with microtubules during differentiation in PC 12 pheochromocytoma cells. FASEB J. 2003 May;17(8):848-59.

165. Schafer D.A., Hug C., Cooper J.A. Inhibition of CapZ during myofibrillogenesis alters assembly of actin filaments. J Cell Biol. 1995 Jan;128(l-2):61-70.

166. Schaefer A.W., Kabir N., Forscher P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J Cell Biol. 2002 Jul 8;158(l):139-52.

167. Schliwa M. Mechanisms of intracellular organelle transport. Cell Muscle Motil. 1984;5:1-82,403-6.

168. Schmidt A., Hall A. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch. Genes Dev. 2002 Jul 1; 16(13): 1587-609.

169. Schroer T.A., Sheetz M.P. Functions of microtubule-based motors. Annu Rev Physiol. 1991;53:629-52.

170. Schulze E., Asai D.J., Bulinski J.C., Kirschner M. Posttranslational modification and microtubule stability. J Cell Biol. 1987 Nov; 105(5):2167-77.

171. Schuyler S.C., Pellman D. Microtubule "plus-end-tracking proteins": The end is just the beginning. Cell. 2001 May 18;105(4):421-4.

172. Schwer H.D., Lecine P., Tiwari S., Italiano J.E. Jr., Hartwig J.H., Shivdasani R.A. A lineage-restricted and divergent beta-tubulin isoform is essential for thebiogenesis, structure and function of blood platelets. Curr Biol. 2001 Apr 17;ll(8):579-86.

173. Schroer T.A. Microtubules don and doff their caps: dynamic attachments at plus and minus ends. Curr Opin Cell Biol. 2001 Feb;13(l):92-6.

174. Seasholtz T.M., Majumdar M., Brown J.H. Rho as a mediator of G protein-coupled receptor signaling. Mol Pharmacol. 1999 Jun;55(6):949-56.

175. Shelden E., Wadsworth P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. J Cell Biol. 1993 Feb;120(4):935-45.

176. Small J.V. The actin cytoskeleton. Electron Microsc Rev. 1988;1(1): 155-74.

177. Small J.V., Geiger B., Kaverina I., Bershadsky A. How do microtubules guide migrating cells? Nat Rev Mol Cell Biol. 2002 Dec;3(12):957-64.

178. Svitkina T.M., Verkhovsky A.B., Borisy G.G. Plectin sidearms mediate interaction of intermediate filaments with microtubules and other components of the cytoskeleton. J Cell Biol. 1996 Nov;135(4):991-1007.

179. Svitkina T.M., Bulanova E.A., Chaga O.Y., Vignjevic D.M., Kojima S., Vasiliev J.M., Borisy G.G. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network. J Cell Biol. 2003 Feb 3;160(3):409-21.

180. Svitkina T.M., Borisy G.G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J Cell Biol. 1999 May 31;145(5):1009-26.

181. Svitkina T.M., Borisy G.G. Arp2/3 complex and actin depolymerizing factor/cofilin in dendritic organization and treadmilling of actin filament array in lamellipodia. J Cell Biol. 1999 May 31;145(5): 1009-26.

182. Takai Y., Sasaki T., Matozaki T. Small GTP-binding proteins. Physiol Rev. 2001 Jan;81(l): 153-208.

183. Tang J., Taylor D.W., Taylor K.A. The three-dimensional structure of alpha-actinin obtained by cryoelectron microscopy suggests a model for Ca(2+)-dependent actin binding. J Mol Biol. 2001 Jul 20;310(4):845-58.

184. Terry B.J., Purich D.L. Assembly and disassembly properties of microtubules formed in the presence of GTP, 5'-guanylyl imidodiphosphate, and 5'-guanylyl methylenediphosphate. J Biol Chem. 1980 Nov 10;255(21): 105326.

185. Tirnauer J.S., Bierer B.E. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability. J Cell Biol. 2000 May 15;149(4):761-6.

186. Tirnauer J.S., O'Toole E., Berrueta L., Bierer B.E., Pellman D. Yeast Bimlp promotes the G1-specific dynamics of microtubules. J Cell Biol. 1999 May 31;145(5):993-1007.

187. Tirnauer J.S., Grego S., Salmon E.D., Mitchison T.J. EB1-microtubule interactions in Xenopus egg extracts: role of EB1 in microtubule stabilization and mechanisms of targeting to microtubules. Mol Biol Cell. 2002 Oct; 13(10):3614-26.

188. Ulitzur N., Humbert M., Pfeffer SR. Mapmodulin: a possible modulator of the interaction of microtubule-associated proteins with microtubules. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 May 13;94(10):5084-9.

189. Vale R.D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 2003 Feb 21;112(4):467-80.

190. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domnina L.V., Ivanova O.Y., Komm S.G., Olshevskaja L.V. Effect of colcemid on the locomotory behaviour of fibroblasts. J Embryol Exp Morphol. 1970 Nov;24(3):625-40.

191. Vasiliev J.M. Polarization of pseudopodial activities: cytoskeletal mechanisms. J Cell Sci. 1991 Jan;98 (Pt l):l-4.

192. Vasquez R.J., Howell B., Yvon A.M., Wadsworth P., Cassimeris L. Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro. Mol Biol Cell. 1997 Jun;8(6):973-85.

193. Verin A.D., Wang P., Garcia J.G. Immunochemical characterization of myosin-specific phosphatase 1 regulatory subunits in bovine endothelium. J Cell Biochem. 2000 Jan;76(3):489-98.

194. Verin A.D., Birukova A., Wang P., Liu F., Becker P., Birukov K., Garcia J.G. Microtubule disassembly increases endothelial cell barrier dysfunction: role of MLC phosphorylation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2001 Sep;281(3):L565-74.

195. Vinogradova T.M., Balashova E.E. Smirnov V.N., Bystrevskaya V.B. The pattern of centriole immunostaining for tyr- or acet-tubulin changes rapidly in endothelial cells treated with thrombin. Cell Motil Cytosceleton. 2004.

196. Vogel J.M., Stearns T., Rieder C.L., Palazzo R.E. Centrosomes isolated from Spisula solidissima oocytes contain rings and an unusual stoichiometric ratio of alpha/beta tubulin. J Cell Biol. 1997 Apr 7;137(l):193-202.

197. Volkmann N., Hanein D. Actomyosin: law and order in motility. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(l):26-34.

198. Vorobjev I.A., Svitkina T.M., Borisy G.G. Cytoplasmic assembly of microtubules in cultured cells. J Cell Sci. 1997 Nov;l 10 (Pt 21):2635-45.

199. Vorobjev I.A., Rodionov V.I., Maly I.V., Borisy G.G. Contribution of plus and minus end pathways to microtubule turnover. J Cell Sci. 1999 Jul; 112 ( Pt 14):2277-89.

200. Vorobjev I., Malikov V., Rodionov V. Self-organization of a radial microtubule array by dynein-dependent nucleation of microtubules. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Aug 28;98(18): 10160-5.

201. Vu T.K., Wheaton V.I., Hung D.T., Charo I., Coughlin S.R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 1991 Oct 17;353(6345):674-7.

202. Wadsworth P., McGrail M. Interphase microtubule dynamics are cell type-specific. J Cell Sci. 1990 Jan;95 (Pt l):23-32.

203. Walczak C.E. Microtubule dynamics and tubulin interacting proteins. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(l):52-6.

204. Walker R.A., Sheetz M.P. Cytoplasmic microtubule-associated motors. Annu Rev Biochem. 1993;62:429-51.

205. Wanger M., Keiser T., Neuhaus J.M., Wegner A. The actin treadmill. Can J Biochem Cell Biol. 1985 Jun;63(6):414-21.

206. Waterman-Storer C.M., Worthylake R.A., Liu B.P., Burridge K., Salmon E.D. Microtubule growth activates Racl to promote lamellipodial protrusion in fibroblasts. Nat Cell Biol. 1999 May;l(l):45-50.

207. Waterman-Storer C.M., Danuser G. New directions for fluorescent speckle microscopy. Curr Biol. 2002 Sep 17;12(18):R633-40.

208. Wear M.A., Schafer D.A., Cooper J.A. Actin dynamics: assembly and disassembly of actin networks. Curr Biol. 2000 Dec 14-28;10(24):R891-5.

209. Weisenberg R.C. Microtubule formation in vitro in solutions containing low calcium concentrations. Science. 1972 Sep 22;177(54): 1104-5.

210. Wiese C., Zheng Y. Gamma-tubulin complexes and their interaction with microtubule-organizing centers. Curr Opin Struct Biol. 1999 Apr;9(2):250-9.

211. Wittinghofer A., Gierschik P. Highlight: GTP binding proteins central regulators in cell biology. Biol Chem. 2000 May-Jun;381(5-6):355.

212. Wittmann T., Bokoch G.M., Waterman-Storer C.M. Regulation of microtubule destabilizing activity of Opl8/stathmin downstream of Racl. J Biol Chem. 2004 Feb 13;279(7):6196-203.

213. Wittmann T., Waterman-Storer C.M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? J Cell Sci. 2001 Nov;l 14(Pt 21):3795-803.

214. Wu X., Jung G., Hammer J.A. 3rd. Functions of unconventional myosins. Curr Opin Cell Biol. 2000 Feb;12(l):42-51.

215. Yvon A.M., Wadsworth P., Jordan M.A. Taxol suppresses dynamics of individual microtubules in living human tumor cells. Mol Biol Cell. 1999 Apr;10(4):947-59.

216. Zhai Y., Kronebusch P.J., Simon P.M., Borisy G.G. Microtubule dynamics at the G2/M transition: abrupt breakdown of cytoplasmic microtubules at nuclear envelope breakdown and implications for spindle morphogenesis. J Cell Biol. 1996 0ct;135(l):201-14.

217. Zhai Y., Borisy G.G. Quantitative determination of the proportion of microtubule polymer present during the mitosis-interphase transition. J Cell Sci. 1994 Apr;107 ( Pt 4):881-90.

218. Zheng Y., Wong M.L., Alberts B., Mitchison T. Nucleation of microtubule assembly by a gamma-tubulin-containing ring complex. Nature. 1995 Dec 7;378(6557):578-83.