Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние микрооблучения центросомы на поведение клеток

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Влияние микрооблучения центросомы на поведение клеток"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ К ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИИ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукошси

УЗБЕКОВ РУСТЕН ЭДУАРДОВИЧ

УДК 576.353:576.311 ВЛИЯНИЕ МИКРООБЛУЧЕНИЯ ЦЕНТРОСОМЫ НА ПОВЕДЕНИЕ КЛЕТОК

03.00.11

эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Москва, 1992 г.

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. ¿.Н.Белозерского (директор - академик РАН В.П.Скулачов) Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

И.Д.Воробьев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

В.Н. Сахаров;

кандидат биологических наук, В.И. Родионов.

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгарта, РАН.

Защита диссертации состоится " /й " £(4срЬиЯ 1ЭЭ2 г.

в /¿часов на заседании специализированного биологического совета Д 053.05.68 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, !,'.ос:г:а, лэпиюкпо гори, Биологический. факультет МГУ, Ученый соеэт.

О диссертацией можно ознакомиться в библиотеке дологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " С " (Л^Фи^«' 1932 г.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е. Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Поддержание и направленное изменение форм животной клетки, внутриклеточный транспорт и взаимосвязанная ориентация органелл поддергиваются цитоскелетом (термин предложен ОзЬогп П Weber В 1976 ГОДУ).

Одним из кошонентов цитоскелета является система микротрубочек (МТ), принимающая активное участие как в митозе, так и в жизнедеятельности интерфазной клетки. Формирование системы KtT связано с особы?,«и структурами, названными Piokett-Heaps (1969) центрам организации МТ ЩОМТ).

Многочисленными исследованиями показано, что у многоклеточных животных основным ЦОМТ во время деления и в интерфазе является клеточный центр (центросома), включающий в себя цен-триоли (Brlnkiey, 1980). В то se время, постепенно накапливаются данные о том, что функции центросомы в клетке не исчерпываются только организацией МТ (Воробьев, Надеадина, 1987).

Одним из наиболее адекватных экспериментальных методов при работе с живой клеткой является микрооблучение. Оно позволяет избирательно повреждать центросому в живой клетке, :шни-мально затрагивая другие структуры (Berne et ai., 1981).

Целью настоящей работы было изучить с помощью избирательного микрооблучения роль центросомы в поведении культивируемых In vitro клеток. Для достижения цели работы быж поставлены следупцие задачи:

1) Иссследовать, какие изменения происходят в ходе клеточного деления в результате лазерного и ультрафиолетового микрооблучения центросомы на различных стадиях митоза.

2) Выяснить, способна ли клетка с облученной центросомой завершить деление и если да, то способна ли облученная центросома сформировать нормальную интерфазную сеть микротрубочек.

3) Исследовать роль центросомы в организации ненацравленного и хемотаксиче ского движения нейтрофилов.

1-lOSi

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. I

В работе юлучеш новые данные об участка центросош в регуляции важных цатофааиологнческих, процессов - клеточного | двннения и мптотсто ского деления.

Показано, что шкрооблучение центросош Евйтрофхлов приводит к прекращены) двнгения, щщ о тон поляризация клэток л састена микротрубочек в них сохраняется.

Выявлено сусрствовашэ в кэтафазе "критической тороси", повроэденпе лазерным ш. УФ кикрооблучениегг центросоьы до которой приводит к разрущэшт веретена и блоку расхоздэния хро-косом, а облучение после которой не препятствует заверявши митоза.

В ходе приЕлзнвнннх наблцдошй к в фзксероввнных на различных сроках посла мзкрооблучевзя центросом клетках, с пос-лэдущнм и^луноцитохЕ^ичэскша е элктронно^шфоасопичесхагл исследованием, изучено поведение клетки с поврогденноП центросомой.

Впервые прослежена судьба клеток с облучэншП в анафазе центросомой пра пэреходе их нз штоза в инторфазу. Показано, что облученная цэптросош (¡щпщЕонально нэ активна: от нее практически не отходят ИГ, она еэ образует горничной реснички и не реплицируется.

Электронно:-,шкроскопнчас1Ей анализ центросо:лы посла лазерного н У® мпкрооблучэнпя показал, что функциональные нарушашп облученной центросош не сопровождается ультраструктурлнг/л поврэцденшшн, что свидетельствует о фотохимическом мэхшшз-ло воздействия.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Результаты данного исследования ылеют теоретическое научное значение, так как способствует более глубокому пониманию роли центросош в регуляции гизнедеятельностд клетки. Использованные в работе методические подходы могут быть щштэнены

для изучения различных процессов в индивидуальшх клеймах.

Созданная автором, совместно с И.А. Воробьевым п U.C. Вотчалом, установка для ультрафиолетового шшрооблучення клеток, в настоящее время используется для выполнения курсовых и диплслных работ в лаборатории электронной гтикроскопии.

Полученные в работе данные могу? быть использованы в чтении курсов лекидй, посвящешшх немшлечной подвижности и механизму клеточного деления.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации докладывались на 5 Конференции по немишечным фордам подвижности (Чэрннгов, IS88); на 4 Советско-чехословацком сшшознумз "Лазерный и ког.шъютерный эксшрзмент" (Ереван, 1988); на Всесоюзной Школе по пепышечной подаппсстл (Лосево, 1989). Международной конфзранцш "Трансмиссия хромосом и митоз" (Ленинград, 1990); Всесоюзной конференции "Функ-щюнальная морфология клетки"(Санкт-Петербург, 1991).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Получение н прижизненные наблюдения нейтрофдлов.

Человочиокиь нейтрполучали из венозной крови здоровых доноров. Вся использовавшаяся посуда была предварительно сшшконизироьана. Оиликонизация осуществлялась ополаскиванием силиконовой ходкостью (Serva, ФРГ), с последующей просушкой в течение 2 часов в сушильном шкафу при температуре 150°С. Для предотвращения свертывания в кровь добавляли гепарин (Serva, ФРГ) в концентрации 25 мкг/мл.

Для выделения богатой нейтрофиами плазмы кровь центрифугировали при комнатной температуре в течение 15 минут при 1000 об/мин или отстаивали при 4°С в течение 1-2 часов. Лейкоцитарную пленку, находящуюся границе между плазмой и эритроцитами, отсасывали и разбавляли небольшим количеством плазмы.

Перед посадкой клеток покровные стекла были обработаны J-/CSÏ

полилизином (serva, ФРГ, концентрация 2 мг/мл, время обработки 45 минут).

0.2 мл обогащенной найтрофилами плазмы наносили на покровное стекло и выдергивали во влажной камере 15 минут при 37°С. Для сенсибилизации клеток в плазму вводили 2 мкл (концентрация 0.5 мг/ыл) витального красителя акридинового орашявого (LJoc-гор совнархоз, химический завод юл. Войкова) до получения конечной концентрации его в плазме 5 мкг/мл. После инкубации стекла отмывали средой RPHI-1640 (Giboo, Великобритания) и помещали в камеру для прижизненных исследований (аналогичную описанной zigmond., Sallivan, 1979), такие наполленую средой RPMI-1640.

Прижизненные наблюдения нейтрофялов осуществляли в фазовом контрасте (объектив Planapo 40/1.0, масляная кммэсия). Клетки фотографировали в фотомзкроскопе Opton-з на пленку мшс-рат-300.

Культивирование и пршшзненные наблюдения клеток СПЭВ.

Клетки культуры ткани СПВБ (почка эмбриона свиньи) выращивали на круглых, покровных стеклах (в опытах по УФ-микросблученшо использовали кварцевые покровные стекла), которые затем монтировал! в модифицированную камеру Дворака-Штоттлера для прижизненных наблюдений. Для культивирования использовали среду 19Э с ЮЖ эмбриональной аьлнчьой сыворотки с добавлением антибиотиков.

Пршшзненные наблюдения хваток СПЭВ осуществляли в Фазовом контрасте (объектив Plan-Meofluar 40/0.S, глицериновая иммерсия). Клетки фотографировали с помощью мнхрофотонасадки К5ФН-12 на планку микрат-300. В длительных опытах для наблюдения клеток использовали высокочувствительную телесистему на базе трубки ЛИ-703, изготовленную М.С. Вотчалом.

Микрооблучениэ клеток.

Установка для лазерного микрооблучения.

Лазерное гшкрооблучение проводили на установке, изготовленной Воробьевым И.А., Драчевым В.А. и Зоровым Д.Б. (Воробьев и др., 1388). Луч аргонового лазера ILA-120 (Carl Zeiss, ГДР) фокусировали через фотомикроскоп Opton-3 (Opton, ФРГ) объективом планадохромат 100/1.3 в пятно диаметром около 0.3 мкм. Для облучения центросош в нейтрофплах использовали свет с длиной волны 488 нм, для лазерного микрооблучения центросомы в клетках СПЭВ свет с длиной волны 514 нм.

Установка для ультрафиолетового микрооблучения.

Для ультрафиолетового микрооблучения клеток, автором совместно с И.А Воробьевым и М.С. Вотчалом, была изготовлена специальная установка. Облучение проводили через интерфэрен-ционый светофильтр с помощью кварцевых объективов с глицериновой иммерсией: 75/1.0 (ЛОМО) или Ultrafluar I00/I.25 (Opton, ФРГ). Диаметр светового (^^=280 нм) пучка в фокальной плоскости объектива составлял I.6-2 мкм. Плотность мощности облучения составляла около 4x10-2эрг/(мкм2"с).

Иммуноцитохимическое изучение клеток.

Для выявления системы микротрубочек покровные стекла с клетками извлекали из камеры, несколько раз промывали фосфатным солевым (физиологическим) буфером (ФСБ, pH 7.2) при 37°С. Затем клетки лизировали в течение 3-10 мин в растворе, содержащем 50 мМ имидазола (pH 6.8), 5 мМ Mg0l2, I мМ ЭГТА, 0,1 мМ ЭДТА, 35Ж глицерина и 0.5% неионного детергента Nonidet Р-40 (Sigma, США). Далее клетки ополаскивали тем же раствором, но без глицерина и Нонидвта, и фиксировали 0.5%-ным раствором глутарового альдегида в ФСБ 10 мин. Для предотвращения фонового свечения клетки обрабатывали 3 раза по 10 мин раствором

НаВН4 (2 МГ/Ш1), затем 30 мин 0,5 М Трис-HGl (рн 7.4, +4°С) и 30 мин 50 мМ nh4ci (+4°С). После отшвки буфером клетки последовательно обрабатывали моноклональными антителами к тубулину, ФИТЦ-меценными кроличьими антителами против мыши и, в ряде опытов для повышения контрастности, ФИТЦ- мечеными козьими антикроличыши антителами (Sigma, США). Полученные препараты заключали в Эльванол (Sigma, США) или в Мовиол (Calbioohem, Австрия). Флуоресценцию акридинового оранаевого и ФИТЦ-мэчеша антител наблюдали и фотографировали на фотомикроскопе "Оптон-3й (Opton, ФРГ).

Электронная микроскопия.

Для фиксации клеток камеру разбирали, стекло промывали в фосфатном ООЛ6БОМ буфере (рН 7,2-7,4) при 37°С, затем фиксировали в 2,5«-ном глутаровом альдегиде на ФСБ. Далее дофиксиро-вали 1&-ШМ ОаО^, контрастировали уранилацетатом, обезвошвали в спиртах и заключали в Эпон-812 (Serva, ФРГ) по стандартной методике.

Серийные ультратонкие срезы изготовляли на микротоме ькв-З (ъкв, Швеция), монтировали на бленды, покрытые формваро-вой пленкой, окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу, просматривали и фотографировали на электронных микроскопах ни-11, HU-12 (Hitaohi, Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Лазерное микрооблучение центросомы нейгрофилов.

Сенсибилизированные акридиновым оранжевым нейтрофшш хорошо распластывались на покрытых полилизкном стеклах. Через 15-30 мин происходила поляризация и активация до 80 % клеток. Движение нейтрофилов представляло собой циклическое повторение пяти последовательных состояний: I) образование на переднем конце клетки игловидных филлоподнй; 2) переход филлоподий в

1-2 лопастевздные ламедлоподнн, одна пз которых становилась ведущей; 3) быстрое перемещение гранул в ведущую ламвллоподшо; 4) перемещение ядра с ксг.тхгаксо?* оргапелл эндоплазга; 5) под-тягиваппе уроподц. !.!шфооблучение центросом производилось мэзду 3 п 4 стадиями, когда клетки максимально распластаны и между долями ядра в них виден свободный от гранул район клеточного центра. Наличие в этом районе центросомы показано иммуноцитохимичоской окраской антитела*.® к тубулину и элек-тронномикро скопиче ски.

Лазерное мпкрооблучение центросога производилось как в спонтанно двигавшихся пейтрофалах, так и в клетках, двигавшихся в градиенте некротаксиса. В первой серии экспериментов (в различные районы облучено 55 клеток) было показано, что в отличие от микрооблучепил в другие районы клетки (ядро, передняя или задняя часть цнюплазгш), ршкрооблученпе центросомы в большинстве случаев приводило к остановке движения, которое не возобновлялось в течение 30 минут. При этом поляризация клеток сохранялась.

Во второй серии экспериментов (облучено 52 клетки.) после микрооблучения центросомы или, в качестве контроля, других участков клетки, один из нейтрофилов разрушали большой дозой облучения (3 Дж), получая, таким образом моноцентрический градиент некротаксиса. Хомотаксическое отношение движения необлу-ченных клеток составляло в среднем 0.8 - 0.13. Схема треков движения нейтрофилов в градиенте некротаксиса в одном из опытов показана на Рис. I.

В большинстве случаев, как и в предыдущей серии опытов, микрооблученив центросомы приводило к прекращению движения, лишь в 3 из 22 клеток движение не было полностью блокировано, но эти клетки потеряли способность ориентироваться в градиенте некротаксиса. Результаты опытов приведены в таблице I.

Поскольку при использованных дозах облучения большинство клеток останавливались, то закономерен вопрос: не будет ли избирательно подавляться способность нейтрофилов к ориентации в градиенте без полной потери подвижности, если облучать их кле-•3-/огГ\

точный центр более низкими дозами? Для проверки, этого предположения 52 клетки были облучены дозами от 0.003 до 0.06 Дк, с последующим анализом их движения в условиях некротаксиса. Результаты облучения центросомы в более низких дозах показаны в таблице 2.

зования клетки-мишени, сплошной линией - их полоне нив через 150 сек. Жирным контуром выделена клетка-мшенъ ("М"). Клетки 5 и 6 были облучены в район клеточного центра. Клетки 7 и 8 появились в наблюдаемом поле зрения в ходе опыта (их начальное положение не показано).

АБЛИЦА I. Влияние шжрооблучения различных районов нейтрофалов на их подвизпость в градиенте некротаксиса.

РАЙОН ОБЛУЧЕНИЯ

КОЛИЧЕСТВО ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТОК

ЭФФЕКТ ШКРООБЛУЧЕНИЯ

ДВИЖЕНИЕ ПО ДЕЗОРИЕНТАЦИЯ ОСТАНОВКА ГРАДИЕНТУ ДВИЖЕНИЯ ДВИЖЕНИЯ

КЛЕТОЧНЫЙ ЦЕНТР

ЯДРО

ЦИТОПЛАЗМА: АКТИВНЫЙ КРАЙ

ЦИТОПЛАЗМА: 9 УРОПОДА

22 II 10

О 9 9

3

0

1

19 2 О О

9

О

ТАБЛИЦА 2. Результаты облучения центросомы нейтрофнлов малыми дозами.

ДОЗА

КОЛИЧЕСТВО

ЭФФЕКТ МИКРООБЛУЧЕНИЯ

ОБЛУЧЕННЫХ

ОБЛУЧЕНИЯ ДВИЖЕНИЕ ПО ДЕЗОРИЕНТАЦИЯ ОСТАНОВКА

КЛЕТ0К ГРАДИЕНТУ ДВИЖЕНИЯ ДВИЖЕНИЯ

МЕНЕЕ 0.005 Д&

ОТ 0.005 ДО 0.05 Да

БОЛЕЕ 0.05 Дк

6 34 9

О 9 О

О 4

О 21

Таким образом, снижение дозы лазерного микрооблучения не юзволяет добиться увеличения процента дезориентированных кле-гок, и этот эффект, вероятно, не зависит от дозы облучения.

Для элэктронно-мцкроскопиче ского изучения нейтрофалн, облученные в область клеточного центра н потерявшие после этого подвижность, Таксировали через I, 3-5 и 30 шн. Всего было исследовано 7 клеток с облученной центросомой.

Ультраструктура облученного клеточного центра, как и всего нейтрофала в целом, не отличалась от контроля. Не изменилась ни структура центриолей, ни количество отходящих от сателлитов и .свободных фокусов микротрубочек. Такая re картина сохранялась и через 30 мин после облучения. Таким образом, механизм нарушения функционирования цонтроссш, по всей вероятности, фотохимический.

Нейтрофэды принадлежат к тому типу клеток, разборка ЫТ у которых колхицином не только нэ вызывает прекращения движения, а нацротив, приводит к активации ноднпгностп (Allan; wilkln-воп, 1978; Rloh, Hoffsteln, 1981). При втом существенно подавляется их способность к хемотаксису, то есть направленному движению (Bandmann et al., 1974; Haleoh et al., 1977). В наших опытах шкрооблучение цешросош в большинстве случаев подавляло подвижность нейтрофилов, т.е. эффект был прямо противоположен действию колхицина, что монет свидетельствовать о pas-личном механизме действия. Об этом же говорит и то, что быстрого уменьшения количества микротрубочек вблизи центросомы после облучения не наблюдается. С другой стороны, клетки, не потерявшие подвижности после микрооблучения, теряли спообность к направленному двнгзнкю в градиенте некроаттрактакта. Такоо ке поведение маток наблюдается при разборке МТ колхицином (Bandmann et al., 1974; Maleoh et al., 1977).

Центросома, возмоxmo, регулирует дшшение нейтрофилов несколькими способами, которые могут быть связаны или не связаны с полимеризацией МТ. Эти механизмы в различной степени чувствительны к микрооблучению.

Механизм опосредованной МТ регуляции, по-видимому, связан с нарушаем динамического конвейерного процесса полимеризации МТ. При этом центросома теряет способность к полимеризации новых микротрубочек, в то время как образованные ранее продолжа-

ют быть прикрепленными :с пей. В результата такого "замораживания" система микротрубочэк перестает обновляться, нейтроЯял теряет способность переносить цептроссму с ядром п комплексов органолл эндоплазмы и, таким образом, запэрппть своП лсксгло-торный цикл.

Лазерное микрооблучение центросомы клеток СПЗВ з митозе.

Лазерное микрооблучение (длина волны 514 ни) одного из полюсов деления клеток СПЭВ, предварительно сенсибилизированных акридиновым орашгевым в концентрации 0,1-1 мкг/мл, проводили на стадиях прсметафазы, мета- и анафазы. Предварительные эксперименты показали, что акридиновый оранжевый в концентрации до 10 мкгЛ'л не влияет на способность клеток СПЭВ вступать в деление и проходить митоз.

Микрооблучение хромосом вызывает их слипание и остайозку деления. Облучение в цитоплазму (в дозе 0,03-0,05 Дл) вне веретена деления не нарушает нормальный ход митоза (таблица 3). ТАБЛИЦА 3. Влияние лазерного микрооблученпя различных районов клеток СПЭВ на ход митоза.

СТАДИЯ РАЙОН РАССЫПАНИЕ АНОМАЛЬНАЯ ЗАДЕРЖА НОРМАЛЬНОЕ

МИТОЗА ОБЛУЧЕНИЯ ХРОМОСОМ АНАФАЗА ДЕЛЕНИЯ ДЕЛЕНИЕ

*

РАННЯЯ ПОЛЮС (II) 7 3 1 0

МЕТАФАЗА.ЦИТОПЛ. (5) 0 0 I 4

ПОЗДНЯЯ ПОЛЮС (10) 2 4 3 1

МЕТАФАЗА ЦИТОПЛ. (4) 0 0 I 4

ПОЛЕС (22) 0 14 6 2

АНАФАЗА

ЦИТОПЛ. (7) 0 0 0 7

*

Примечание:в скобках указано общее количество облученных клеток.

И

При облучении в клетке одной из центросом в прометафазе нормальная метафазная пластинка не формировалась, клетки постепенно ошаривались и находились в таком положении несколько часов без каких-либо видимых изменений. Хромосомы при этом не декондвнсировались.

Микрооблучение одного из полюсов в метафазе иногда приводило к быстрому смещению хромосом к необлученному полюсу веретена. При этом метафазная пластинка несколько разрыхлялась. Однако анафазного расхождения хромосом не происходило, биваленты образовывали вокруг необлученного полюса розеткоподобную структуру. Клетки ошаривались, через 3-4 часа на них появлялось множество мелких перетякек, что в конечном счете приводило к образованию одной-двух больших перетяжек. Цитотомия до конца не доходила, и образовывались клотки с 2-4 ядрами, которые через 1-2 час распластывались на стекле. Рост ядер в этих 1слетках был неравномерным - одно из них не отличалось от нормального, другое практически не росло.

Микрооблучения одного из полюсов в поздней метафазе и в анафазе приводило к прекращению движения хромосом к этому полюсу, при этом движение хромосом к противополояному полюсу не нарушалось, и митоз завершался цитотомией, которая начиналась с некоторой задержкой. Хромосомы расходились на меньшее, чем в норме расстояние.

Ультрафиолетовое микрооблучение центросомы в метафазе.

Также как при лазерном микрооблучении центросомы, эффект микрооблучения в ранней и поздней метафазе существенно различался. Предпринятое исследование с целью более точно выяснить положение "критической точки" показало, что если облучение центросомы (минимальное время облучения, вызывающее 100%-ный эффект - 5 сек) производилось через 10 мин после распада ядерной оболочки, то анафаза никогда не наступала (40 клеток). Облучение на той же стадии митоза других участков цитоплазмы в таких же, и даже больших дозах (до 60 с) не приводило к разрушению веретена деления, блоку анафазы и цитотомии. При облуче-

ели хромосом (до 15 с) анафаза п цитотомия могли несколько задергиваться, но митоз всегда завершался нормально.

Если микрооблучение проводилось через 35-40 шш после начала прометафазы, то анафаза блокировалась в 5 клетках из 12. Если ге мшфооблучениэ проводилось спустя более 40 мин после начала прсметафазы (10 клеток) ила непосредственно в анафазе (10 клеток), то расхондение хромосом происходило всегда. Таким образом, если учесть, что прометафаза и метафаза вместе длятся около 45 шш, то можно заключить, что примерно за 5-7 шш до начала расхождения хромосом в клетке происходит переход к новому состоянию, характеризующемуся тем, что повреждение одного из полюсов не препятствует завершению митоза.

Далее мы проводили микрооблучение в ранней метафазе, т.е. через 5-10 мин после сформирования метафазной пластинки (время облучения в этой серии экспериментов составляло 5 с), и более чем за 20 мин до начала анафазы.

Всего была прослежена прижизненно судьба 40 клеток (таблица 4). 24 клетки были зафиксированы на различных сроках после микрооблучения и нммуноцитохимически окрашены антителами к тубулину, 6 клеток были исследованы электронномикроскопически.

Уикрооблучение одной центросомы в ранней метафазе вызывало сдеиг хромосом к необлученному полюсу в течение I мин. Окраска на тубулин показала, что в это время полуверэтено со стороны нооблученного полюса укорачивалось. Отличий в ультраструктура мозду двумя полюсами (облученным и необлученным) практически не было.

Далее в течение 5-8 минут происходило разрушение веретена деления, при этом облученный полюс вместе с хромосомами смещался в сторону необлученпого.

IIa следущей стадии (10-20 мин) метафазная пластинка разваливалась, хромосомы собирались в центральной части клетки в виде розетки. Электронная микроскопия подтвердила, что необлу-ченная центросома находилась внутри кольца хромосом, а облученная центросома - вне его. Вокруг облученной центросомы МТ было меньше, чем вокруг необлученной. От обеих центросом отхо-

дели лишь короткие мт, нэ образовывавшие иучкоз. Кроме того, в клетке появлялось нэсколько центров схогщеяия гжкротрубочек, которые не содержали центриолей и располагались нэзду хромосомами.

ТАБЛИЦА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ НЙКРООБЛУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ УЧАСТКОВ КЛЕТКИ В РАННЕЙ ЫЕТАФАЗЕ (ВРЕ.'Л ОБЛУЧЕНИЯ 5 СЕК).

КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК С РАЗЛИЧНЫЕ ОБЛУЧЕННЫЙ НОРМАЛЬНЫЙ НШТЕШИШМ НИТОЗА

УЧАСТОК 1Ш03

КЛЕТКИ ЗАДЕРЖКА РАССЫПАНИЕ АНОМАЛЬНАЯ БЛОК

ДЕЛЕНИЯ ХРОМОСОМ ВДТОТОМИЯ АНАФАЗЫ

ЦЕНТРОСОМА (40) О I 39 5 35

ЦИТОПЛАЗМА (17) 10 7 О О 0

ХР0М0С0Ш (7) 0 6 I О О

Примечания: I) в скобках указано обидее количество облученных клеток; 2) в связи с тем, что в одной клетке могло наблюдаться одновременно несколько различных эффектов, общее число клеток, меньше, чем сумма чисел в столбцах в соответствующей строке.

Большинство клеток с облученным полюсом в период наблюдения (свыше 2 ч) не заканчивали деление цитотомией (таблица 4), однако в 5 клетках мы неСлюдали образование перетяжек без восстановления нормального митотического веретена. Результатом такой аномальной цитотомии было или образование клеток с несколькими ядрами (3 клетки), или неравное деление без расхождения хроматид (2 клетки).

Ультрафиолетовое ндсрооблучэштэ центросом в ана£апе.

Микрооблучеште центросо:ш (полюса зорэтопа долевая) л, г? качество контроля, хромосомы или участка цптоплазги пне вэре-тена деления производили спустя 60-90 секунд после начала ала- ' фазного движения хромосом. Доза облучения (15 сек) Сила з три раза больше той, которая блокировала митоз при облучении в метафазе.

Всего была прослех^епа прижизненно судьба 63 клеток, 43 клетки были зафиксированы на различных сроках после микрооблучения и иилуноцитохимически окрашены антителами к тубулпну, у 15 клеток была исследована ультраструктура.

Наблюдавшийся сразу после облучения одной центросомы эффект состоял в топ, что движение хромосом к облученному полюсу замедлялось по сравнении с их движением к необлученному полюсу в той ко клетке и, в большинстве случаев, в течение 1-2 мин полностью прекращалось (таблица 5). Через I мин после облучения два полуверотепа мало различались, полуверетоно со стороны необлученного полюса лишь несколько короче. Однако уже через 3 мин после облучения центросомы полуверотено со стороны облученного полюса разбиралось, только вдоль пластинки хромосом оставались короткие пучки Ш. Кэяполтсные iff при этом располагались также как в норие.

Затем (10 мин посла облучения полюса п далее), в то нрэмя как хромосо и противоположного полуворэтона группировались вокруг необлученного полюса, soicpyr облученного этого не происходило, а хро:-;осош продолголт оставаться в виде пластинки. Таким образом, в телофазе расстояние между двуш группами хромосом оказывалось примерно в 1,5 раза меньше, чем при нормальном делении.

Со стороны облученного полюса узе через 8-10 ?еш выявлялись внеполюсные цитоплазматическпе центры схождения ИГ, в то время, как с противоположной стороны -il расходились только от полюса. Вследствие остановки движения хромосом к облученному

полюсу перетяжка делила клетку на неравные части и, таким образом 10 клеток, получивших, облученную центросому, были значительно крупнее своих сестринских. Кроме этого, микрооблучение часто вызывало задержку цитотомии и образование дополнительных перетяжек.

Ультраструктура облученной центросомы (фиксация через 2-3 мин после облучения) такте, как и после облучения в метафазе не отличалась от нормальной. От облученного полюса отходило примерно такое же число микротрубочек, и центриоли сохраняли свою взаимноперпендикулярную ориентацию.

ТАБЛИЦА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ МИКРООБЛУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ УЧАСТКОВ КЛЕТКИ В АНАФАЗЕ (ВРЕМЯ ОБЛУЧЕНИЯ 15 СЕК).

КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОК С РАЗЛИЧНЫМИ

ОБЛУЧЕННЫЙ НАРУШЕНИЯМИ МИТОЗА

НОРМАЛЬНЫЙ __

УЧАСТОК КЛЕТКИ МИТОЗ НАРУШЕНИЕ ДВИЖЕНИЯ ХРОМОСОМ ЗАДЕРЖКА ЦИТОТОМИИ БЛОК ЦИТОТОМИИ

ЦЕНТРОСОМА (63) 3 60 58 2

ЦИТОПЛАЗМА (Ю) 3 0 I 0

ХРОМОСОМЫ (20) 2 12 18 0

Примечания: I) в скобках указано общее количество облученных клеток; 2) в связи с тем, что в одной клетке могло наблюдаться одновременно несколько различных аффектов, общее число клеток, меньше, чем сумма чисел в столбцах в соответствующей строке.

Исследование днтэрфззной сета Ж в клетке с облученной в анайазе центросомой.

В клетке с облученной центросомой интерфазная сеть МТ была значительно менее густой, чем з сестринской ей клетке. Не выявлялось тшс~е одного ярко выраженного центра организации Ш. Большое общее количество цнтоплазматлчесхих ?.'Т в интер$оз-ных'клетках СПЗВ мас:<ирует МТ, отходящие непосредственно от центросс-ш, поэтому 131 за 0,5-1,5 ч трэд лизисом клеток вводили в среду кулътггвлроваяия ипт:одазол з концентрации. 0,15 :~сг/ш. Всего татсп образе?! било исследовано 20 :г.лэток, получившее облученную центросому.

В сестрггнск-г! клетках, такте как и в контрольных (облучо-ште в знефзгз учпетт'.а цзтоплаз^ш или одной из хромосом), картина была одготзшног:: при обработке покодазолом з плх з основном разбираются свободные цитоплазматические ?1Т, и центросома с отходищши от иее МТ отчетливо выявляется в виде звезды. В отличие от этого, в 15 из 20 клеток с облученной центроссмо*!, звезда отсутствовала, а имелись лишь одиночные МТ, неупорядоченно расположенные з цатсплазне.

Ультраструктура облученной центросетш в клетках, зсф:н<сп--юрэз 3-1,5 часа после готоза существенно отлячалзсь о? попорола (псслэдозано О л 6 сестринских :слэ-

тск, п :тгй 5 т:оптроль~^х кзптгС; на по^оргпгпхея кякрообду-Сроднее зголлчэстао !ГГ; -.->:: хпгтпфоплеплых, та:с л нпхо-дятртхея вблизи центросомы и и с евлзашгых с ней (в радиусе !

о"- д^ктросош), з еестрт'л.'ктгт. тмэттгвх (соответственно 9.75-1,84 и 26,50^2,60) ко отерлось от количества МТ в кон-трольшгх клетках (соответственно 11,4-1,69 п 22,8-2,33 (Рис. 2), В клетках, цектросся.ч которых Гяла подвергнута мякрооблу-■&.•/«!» я англезе, практдчео1га не Счло пршфошюнных к цоатрао-жм (0,5-0,5), и число МТ в радиусе I шш от центросоо-.'н такт» было низе, чем в сестринских и контрольных (5,0-1,78 МТ) (Рнс. 2).

Количество сателлитов во всех группах клеток не различа-

лось (1-2 сателлита на материнской цеыгр^оли). Первичная ресничка шзлась в 4 из 6 сестринских к облученным клетках и в 3 из 5 контрольных клетках, в то время как на облученной материнской центриоли она никогда нэ образовывалась (0 из 6 клеток).

В сестринских платках, подучивших после митоза необлучен-нуй центросом, черэз 6 часов наблюдалась рошнгкация цептряо-лэ£. В пенсах с облученной цвитрооэгюй в вто время репликации не происходило.

tMil прикреплениие МТ t;V I общее кол-во МТ

Рис. 2. Гистограмма распределения микротрубочек в районе центросомы в трех группах клеток: 1, 2 столбцы - контрольные клетки; 3, 4 столбцы - сестринские клетки, получившие после митоза необлучонную центросому; 5, 6 столбцы - клетки с облученной в анафазе центросомой. Диагональной штриховкой отмечены столбцы, показывающие количество прикрепленных к центросоме мнкротрубочек; горизонтальной штриховкой отмечены столбцы, показывапцие общее количество микротрубочек в радиусе I мкм от центриолей (прикрепленные + не прикрепленные).

На Рис. 3 приведена сушарная схема результатов опытов по влиянию УФ мпкрооблучения центросом на клеточное деление. Левый ряд - деление клетки после облучения центросо!.*ы з поздней кэтафазо и анафзсэ (облучен левый полюс), средний ряд - дэлэшта контрольной клетки, правый ряд - блок ?.!Птоза поело облучения центросом в ранней ;яетафазэ (облучен левый полюс). Цифры рядом со стрэлкг.:»! указывает время мегеду соседншл! рисунке:,-"1. к? -микрооблучение.

выводы.

1. Облучение центросомы нейтрофилов, движущихся в градиенте некротаксиса, приводит к их дезориентации или к полной потере подвижности. Количество МТ в районе центросомы у обездвиже-ных нейтрофилов не снижается. Механизм повреадения, вероятно связан с нарушением динамического процесса обновления МТ, что приводит к невозможности направленного изменения формы клетки.

2. Лазерное микрооблучение центросомы (полюса веретена) в ранней метафазе блокирует анафазное расхождение хромосом и нормальную цитотомию, в результате чего образуются двуядерные клетки. Аналогичное микрооблучение в поздней метафазе и анафазе не препятствует нормальному завершению клеточного деления.

3. Ультрафиолетовое микрооблучение центросомы в метафазе приводит к быстрому сдвигу хромосом к необлученному полюсу в результате ассиметричного разрушения веретена.

4. Последствия микрооблучения центросомы зависят от того, на какой стадии митоза оно было произведено. После микрооблучения центросомы в ранней метафазе расхождение хромосом и цитото-мия блокируются. Облучение центросомы в поздней метафазе и анафазе не препятствует завершению митоза. Таким образом в конце метафазы существует "критическая точка", после прохождения клеткой которой повреждение центросомы не влияет на завершение деления.

5. функциональная инактивация центросомы после ультрафиолетового микрооблучения в анафазе проявляется при переходе клетки в интерфазу. В такой клетке микротрубочки от центросомы не растут. Облученная центросома не образует первичной реснички и не реплицируется. ' .

6. Для функциональной инактивации центросомы, как лазерным, так и ультрафиолетовым микрооблучением, достаточны дозы, не вызывающие ультраструктурных повревдений.

7. Получена экспериментальная модель для изучения функций центросомы при переходе клетки из митоза в интерфазу.

. СПИСОК РАГО? СОТЕДВСОВАШЖ ПО ТРФ ДКССЕРГМПИ.

УзСэкоз Р.Э., Дрзчов В.Л., Воробьев II.Л. Вяшшпе г.П"сро-сблупоппя цзнтросси па поводоппв клэтск. 'Исследование структура, Т.^зпческих сгс~стз и -энергетики биологически актншшх молекул. Тезиса докладов 4 Координационного семинара. Ереван, 1938, стр. 44—15.

Узбеков Р.Э., Воробьев Л.А., Дрзчев В.А. Влияние лазерного :*икросблучонпя клеточного центра па стдпгжють 1:е"Г:трст:!лов. Изтологпя, 1939, тем 31, Л 8 , стр. 874-Е81.

Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. Влияние УФ мэсрооблучения цзнтросомя на поведение клэток. I. Облучение в мэтафазе: распад гтитотэтосяого вэрэтзпа л поругание деления. Цитология, 19Э1,?см 33, .'3 2, стр. 15-22.

Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. Влияние УФ ;<икрооСлучения центросому на поведение клеток. Цитология, 1991, том 33, И 9, стр. 104-105.

Укбггков Р.Э., Бсробьоз II.А. Влияние УФ. микрооблучения центроссг-г на поведение клеток. II Последствия облучения в ана-фэзе: завершение деления и судьба пнтерфазной клетки. Цптоло-ПШ, 1991 ,тсм 33, .'З 10, стр. 79-84.

Узбгяоз Р.Э., Гсрсбыв :;.л. Плншгю .71=

УТГ7Т1Т1ГГ^ГС,>'* ТТОГЭГОГ^0 "я„ ттт 1Т";*ТТГ.ССС,ГЧ

гослэ мтЕгсссблучення. н г^елег.-;;., 1992, тем 34, .'5 2 сто