Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Динамика функциональной активности центросомы в клеточном цикле

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Динамика функциональной активности центросомы в клеточном цикле"

\ {

\

| На правах рукописи

I

I-

'I

] УЗБЕКОВ РУСТЕМ ЭДУАРДОВИЧ

]

ДИНАМИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕНТЮСОМЫ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ.

) 03 00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

I

Автореферат

I

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН, профессор В.П Скулачёв) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Ченцов Юрий Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, член-корр. РАН Васильев Юрий Маркович, доктор биологических наук Надеждина Елена Сергеевна, доктор биологических наук Ширинский Владимир Павлович.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

им. В.А. Энгельгардта, РАН.

Защита диссертации состоится

2004 г. в & часов на

МГУ.

Автореферат разослан 5» ру.т&'ЬьХ 2004

г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

2.005>Ч

/ ¿Г

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Функиии иентросомы в интерфазных и митотических клетках -краткий обзор современного состояния проблемы и ее актуальность.

К настоящему времени ультраструктура центросомы на различных объектах подробно изучена, одновременно описано более 100 центросомальных белков. Однако соотнесение морфологических и биохимических знаний об этой органелле ещё только начинается, также как и изучение характера взаимодействия, друг с другом центросомальных белков Функции центросомы настолько многообразны, что появились целые отдельные направления исследований, посвященные участию центросомы в каком-то одном аспекте жизни клетки- в осуществлении равномерного распределения хромосом в митозе и мейозе, в организации системы интерфазных МТ, в регуляции внутриклеточного транспорта, в поддержании клеточной полярности и изменении формы клетки, в процессе формирования ресничек и жгутиков, в образовании мультибелковых ансамблей, ответственных за регуляцию клеточного цикла,

Принципиальной особенностью центросомы, что собственно и дало этой органелле её название, является ее расположение в клетке. При этом важно, что центросома располагается не только вблизи ядра, но и рядом с комплексом Гольджи, в котором происходит «созревание» множества клеточных белков. Всё это в совокупности с тем, что ассоциированные с центросомой МТ униполярны (их минус концы находятся вблизи центросомы, а плюс концы направлены к периферии клетки), а связанные с МТ белки-моторы могут перемещать молекулы и везикулы, как в центробежном, так и центростремительном направлениии, дает основание назвать центросому распределительным центром клетки Однако исключительно распределением функции центросомы не ограничиваются. В её составе обнаружено большое количество регуляторных молекул, которые, взаимодействуя между собой, контролируют продвижение клетки по клеточному циклу

Такое многообразное участие центросомы и связанных с нею структур в жизнедеятельности клетки, естественно, приводит к тому, что нарушение нормального функцирнирования центросомы может иметь фатальные последствия, как для индивидуальной клетки, так и для организма в целом. Ещё автор самого термина «центросома» Воуел предполагал (1914), что нарушение расхождения центросом может приводить через неправильное разделение хромосом к злокачественному перерождению клеток Эта гениальная догадка нашла своё подтверждение - в настоящее время показано, что малигнизация клеток может быть следствием анеуплоидии, которая, в свою очередь, вызывается нарушением расхождения центросом при дисбалансе синтеза регуляторных белков, в частности, центросомальной киназы Аврора А

Исследование молекулярного состава центросомы позволяет перейти на другой уровень понимания функционального значения этой органеллы. Теперь уже можно говорить не о функции, центросомы в целом, а конкретно о

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

СИ 08

функциях входящих в еб состав белков, или мультибелковых комплексов, которые принимают участие в тех или иных процессах.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было исследовать, каким образом мультибелковый комплекс, формирующийся вокруг центриолей, видоизменяется в ходе клеточного цикла, и как эти морфологичесике и биохимические изменения влияют на поведение клетки. Работа проводилась в четырёх основных направлениях:

- изучение поведения клетки в митозе и интерфазе при инактивации

центросомы УФ микрооблучением;

- изучение динамики изменения количества различных центросомальных

белков в клеточном цикле;

- изучение влияния различных цитоскелетных структур на формирование

полюсов веретена деления;

- изучение функциональной активности центросомы in vitro. Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Исследовать влияние инактивации центросомы УФ микрооблучением на стадии метафазы.

2. Проверить, способны ли будут клетки завершать митоз после облучения одного из полюсов веретена деления в анафазе.

3 Если клетки будут способны завершить митоз с облученным в анафазе полюсом, то проследить, как будет проходить распластывание таких клеток, как будет формироваться интерфазная сеть МТ, будут ли способны клетки с облученной центросомой вступать в S-фазу и будут ли центриоли в них реплицироваться

4 Изучить динамику накопления гамма-тубулина при переходе клеток от интерфазы к митозу, выяснить будет ли эта динамика меняться в отсутствие МТ при обработке клеток нокодазолом и при понижении критической концентрации полимеризации тубулина при обработке клеток таксолом.

5 Исследовать внутриклеточную локализацию белков pEg2 и XlEg5 на различных стадиях клеточного цикла.

6. Синхронизовать клетки XL2 на различных стадиях клеточного цикла и исследовать на полученных фракциях синхронизованных клеток динамику экспрессии белков pEg2 и XffigS.

7. Изучить степень и время участия МТ и актиновых филаментов в процессе расхождения центросом при формировании митотического веретена

8. Провести изучение влияния киназы pEg2 на полимеризацию МТ и нуклеирующую активность центросом т vitro

1.3. Научная новизна работы.

В работе впервые было исследовано влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток в митозе и интерфазе Разработанная оригинальная экспериментальная система получения клеток с поврежденной центросомой дала возможность изучить роль центросомы в интерфазной клетке, используя в качестве контроля вторую сестринскую клетку с необлученной центросомой.

Полученные поликлональные AT к рекомбинантному белку, соответствующему С-терминальному участку человеческого гамма-тубулина, позволили получить новые данные о динамике накопления этого белка в центросоме в ходе клеточного цикла

Впервые была разработана методика синхронизации клеток культуры Xenopus laevis XL2. Выведена формула математической зависимости отношения времени удвоения клеточной популяции к продолжительности клеточного цикла от доли клеток в Go-фазе и разработаны новые методы обработки данных экспериментов по синхронизации и определению динамики экспрессии различных белков в клеточном цикле.

Описан новый белок pEg2 из Xenopus laevis, показано, что накопление pEg2 в центросоме начинается в конце S-фазы клеточного цикла, достигая максимума в митозе Показано, что исчезновение белка pEg2 из центросомы в начале Gi-фазы связано с его убиквитин-зависимой деградацией.

Обнаружено, что pEg2 фосфорилирует связанный с МТ кинезин-подобный белок-мотор XlEg5, который появляется между центросомами в момент начала их расхождения перед митозом, что позволило сделать вывод о принципиальном значении взаимодействия pEg2 и XlEg5 в процессе расхождения центросом.

Описаны две стадии процесса расхождения центросом отличные по чувствительности к ингибиторам полимеризации МТ и актиновых филаментов в интерфазе и митозе. Впервые показано, что время между началом распада ядерной оболочки и началом анафазного движения хромосом постоянно для клеток XL2.

Впервые продемонстрировано, что pEg2 вызывает in vitro независимо от его киназной активности стимуляцию полимеризации МТ в разбавленных растворах тубулина, в которых спонтанная самосборка МТ была незначительна. Впервые показано, что pEg2 может взаимодействовать с центросомой in vitro, подавляя способность последней нуклеировать МТ.

1.4. Научно-практическая ценность работы.

Настоящая работа относится к числу фундаментальных научных исследований В ходе ее выполнения проведено комплексное изучение центросомы с использованием морфологических, биофизических, биохимических и молекулярно-биологических методов на различных объектах. Полученные результаты позволяют расширить наши знания о мультифункциональном значении центросомы как специфическом месте в клетке, где концентрируются многие регуляторные белки.

Полученные в ходе выполнения работы совместно с сотрудниками Института с/х биотехнологии AT к гамма-тубулину, одному из главных маркерных белков центросомы, были использованы в нескольких лабораториях при решении разнообразных экспериментальных задач, которые требовали локализации центросомы.

Разработанная автором методика синхронизации клеток культуры Xenopus laevis XL2 на различных фазах клеточного цикла, в комбинации с оригинальными методами математической обработки данных могут быть использованы и уже используются (Blot et al., 2002) для анализа дифференциальной экспрессии различных белков в клеточном цикле

Усовершенствованный метод очистки тубулина из мозга свиньи, с использованием комбинации фосфоцеллюлозной колонки и катионно-обменной мембраны, позволивший получить белок очень высокой чистоты, может быть рекомендован и уже применяется для дальнейшего изучения регуляции полимеризации МТ.

Результаты работы включены в учебные курсы по биологии клетки для студентов Биологического факультета МГУ, Биологического и Медицинского факультетов Университета г Ренна (Франция)

1.5. Апробаиия работы.

Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Трансмиссия хромосом и митоз» (Ленинград 1990); 5, 6 и 7 Конгрессах Европейского общества по фотобиологии (Марбург, ФРГ, 1993; Кембридж, Великобритания 1995; Стреза, Италия, 1997); 9 Европейском Съезде по цитоскелету (Данди, Шотландия, 1994); Европейских конгрессах по клеточной биологии (Прага, Чехия, 1994; Гейдельберг, ФРГ, 1995); Международной юбилейной Конференции посвященной 30-летию основания НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (Москва, 1995); 34, 35 и 38 Конференциях Американского общества клеточных биологов (Сан-Франциско, 1994; Вашингтон, 1995; Сан-Франциско 1998); Международном симпозиуме «Клеточная подвижность» (Пущино-на-Оке, 1995); Всероссийских конференциях «Функциональная морфология клетки» (Санкт-Петербург 1995,

2000); Международной конференции «УФ и синий свет» (Марбург, ФРГ, 1996); Съезде Британского общества клеточных биологов (Манчестер, 1999); Международной Конференции «Рак и клеточный цикл» (Лозанна, Швейцария,

2001); Международной Конференции по микроскопии (Барселона, Испания,

2001); Международной рабочей встрече «Переход от G2 фазы к митозу и связанные с ним критические точки» (Саламанка, Испания, 2001); Конференции французского общества клеточной биологии и французского общества микроскопии «Взаимодействие биология-физика» (Ренн, Франция,

2002), а также на семинарах Московского общества клеточных биологов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, научного клуба «Клеточный цикл» (Ренн, Франция), Биологического и Медицинского факультетов Университета Ренна (Франция), Научного центра Нузийи (Франция), кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ.

2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Принятые сокращения: AT - антитела, ИФ - иммунофлуоресценция; МТ -микротрубочки, УФ - ультрафиолетовый; ЭМ - электронная микроскопия; BrdU - бромдезоксиуридин; PBS - физиологический фосфатный буферный раствор.

В работе были использованы несколько типов клеточных культур, включая клетки человека (HeLa, КЕ37), свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки (XL2), мыши (L-фибробласты), китайского хомячка (BIII-II-FaF-237), зеленой мартышки (Vero), кенгуровой крысы (PtKl) и некоторые другие. Методы культивирования клеточных культур описаны в статьях [1, 5, 7, 10 , 21].

Для прижизненных наблюдений была сконструирована и изготовлена специальная камера, для микрооблучения автором совместно с М.С. В отчалом и И.А. Воробьёвым была сконструирована и изготовлена специальная установка [1, 4]. В ходе выполнения работы были получены и охарактеризованы поликлональные AT к гамма-тубулину [7]. Методы приготовления препаратов для иммуноцитохимического исследования подробно описаны в работах [4, 8, 9]. ЭМ исследование объектов было проведено на ультратонких срезах по стандартной методике, а также методом негативного контрастирования и с помощью крио-ЭМ.

В ходе работы было разработана оригинальная схема синхронизации клеток и предложены новые методы анализа клеточной популяции [9, 12, 19, 20] Для очистки тубулина был выработан новый комбинированный протокол на основе протоколов Mitchison и Kirschner (1984) и Sloboda и Belfí (1998) [21].

Метод выделения центросом был основан на протоколах, разработанных ранее (Bornens et al., 1987; Chretien et al., 1997) с некоторыми модификациями [21].

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глава 3.1. Исследование роли центросомы в клетке с помощью УФ микрооблучения.

3.1.1. Микрооблучение центросомы в ранней метафазе.

После облучения центросомы в ранней метафазе полуверетено со стороны облученного полюса прогрессивно разбиралось, а хромосомы окружали необлученный полюс Контрольное облучение других участков клетки не приводило к разрушению веретена деления Поведение 150 клеток было прослежено прижизненно, часть клеток была использована для ИФ или ЭМ анализа.

Через 2-3 мин после облучения хромосомы смещались к необлученному полюсу и окружали его в течение 5-6 мин, а сам необлученный полюс дрейфовал к центру клетки. Облученный полюс также смещался к центру

клетки ЭМ и ИФ с использованием АТ к альфа- и гамма- тубулину показало, что через 1-3 мин после облучения короткие МТ все ещё обнаруживались вблизи облученного полюса Однако пучки кинетохорных МТ были связаны лишь с необлученным полюсом После того как хромосомы окружали необлученный полюс, в клетках выявлялось несколько фокусов схождения МТ ЭМ исследование клеток через 10-15 мин после облучения показало, что необлученный полюс находился внутри кольца хромосом, кинетохорные пучки, направленные к нему имели длину 1 5-2 мкм Облученный полюс лежал вне кольца хромосом и кинетохорные пучки, направленные к нему отсутствовали Через 2 ч после облучения клетки ошаривались, хромосомы были беспорядочно рассеянны по цитоплазме клеток, как в типичном к-митозе Через 4-8 ч после облучения некоторые клетки переходили в интерфазу без расхождеия хромосом При этом они подвергались неправильному и, часто, неполному цитокинезу, формируя несколько лопастей цитоплазмы, содержащих или не содержащих (цитопласты) хромосомы. Всего до перехода в интерфазу было прослежено 25 клеток, среди них 9 сформировали одну большую клетку с 2-5 ядрами; 12 сформировали по две дочерние клетки, и 4 клетки сформировали по 3 дочерние клетки Дочерние клетки во всех случаях были различной величины и имели отличающиеся друг от друга по размеру ядра

3.1.2. Влияние на ход митоза микрооблучения центросомы в ранней анафазе.

После облучения полюса веретена в анафазе хромосомы, двигавшиеся к облученному полюсу, останавливались примерно на 1 мин и затем продолжали движение со средней скоростью 0 4±0.1 мкм/мин Движение хромосом к противоположному необлученному полюсу было более быстрым 1 0±01 мкм/мин., и почти не отличалось от такового в контрольных клетках (1.3±0.1 мкм/мин). ЭМ и ИФ исследование клеток после микрооблучения центросом в анафазе с использованием АТ к альфа- и гамма-тубулину показало, что в течение 3 мин полуверетено со стороны облученного полюса распадалось на отдельные пучки связанных с кинетохорами МТ, ориентированных практически параллельно друг другу, облученный полюс «отрывался» от веретена и смещался к периферии клетки Противоположное полуверетено не отличалось от контрольного для соответствующей стадии митоза В конце анафазы, окраска на альфа-тубулин не выявляла кинетохорных пучков, связанных с хромосомами со стороны облученного полюса Вместе с тем, в цитоплазме появлялось несколько фокусов полимеризации МТ, пучки МТ интерзоны доходили до обеих групп хромосом. Через 10 мин после начала анафазы две группы хромосом расходились на расстояние 11.9±0 2 мкм (в среднем для 121 клетки), что заметно меньше, чем в контрольных клетках (17 2 ±05 мкм) Смещение хромосом от экватора в сторону облученного полюса было вдвое меньше - отношение расстояний 0 5 ± 0 02 (в среднем для 90 клеток).

Начало цитокинеза в клетках с облученной центросомой задерживалось, по сравнению с контрольными клетками на 10-20 мин Перетяжка формировалась

точно посередине между двумя группами хромосом, в результате этого клетки с облученной центросомой обычно были крупнее, чем их сестринские.

5.7.5. Исследование интерфазных клеток с облученной центросомой.

Для образовавшихся после облучения дочерних клеток была характерна задержка первичного распластывания, которое завершалось только через 1 ч после анафазы (в контроле 30 мин). При этом вначале не наблюдалось различий в распластывании клеток с облученной центросомой и их сестринских, но позднее клетки с облученной центросомой постепенно прекращали распластывание, и занимаемая ими на подложке площадь даже несколько сокращалась (данные регрессионного анализа 29 пар сестринских клеток). Рост сестринских клеток с необлученной центросомой, а также клеток с облученным участком цитоплазмы и их сестринских (17 пар клеток) не отличался от роста интактных клеток. Большинство клеток с облученной центросомой сохраняли жизнеспособность длительное время, вплоть до 50 ч после микрооблучения центросомы.

ИФ исследование показало, что система МТ в сестринских к облученным клетках не отличалась от интактных клеток на тех же стадиях клеточного цикла В клетке с облученной центросомой сеть МТ была значительно менее густой, не было заметно также и одного ярко выраженного центра нуклеации МТ. Однако в клетках СПЭВ МТ, отходящие непосредственно от центросомы составляют лишь небольшую часть общего количества МТ в клетке. Для исследования нуклеирующей активности центросом была использована модель роста МТ в присутствии низкой концентрации (0,15 мкг/мл) нокодазола. В этих условиях (время инкубации 30-90 мин) в контрольных клетках (сестринские к облученным в центросому, клетки с облученным участком цитоплазмы, клетки с облученными хромосомами) большинство свободных МТ разбиралось, а центросома с отходящими от неё МТ выявлялась в виде звезды. В отличие от контрольных, в 15 из 20 исследованных клеток с облученной центросомой звезда МТ отсутствовала, а имелись лишь одиночные МТ, хаотично расположенные в цитоплазме клеток.

ЭМ исследование центросомы сестринских к облученным клетках не выявило отличий от интактных клеток на соответствующей стадии клеточного цикла. В таких клетках, зафиксированных через 3-4,5 ч после митоза, также как и в интактных клетках на активной центриоли появлялось 1-2 перицентриолярных сателлита, в четырёх из шести исследованных клеток на материнской центриоли была обнаружена первичная ресничка (в интактных клетках на 3 из 5) С центриолями были связаны МТ, количество которых было проанализировано по двум категориям - прикрепленные к центриолям и находящиеся в районе центросомы (в радиусе 1 мкм от каждой центриоли), но непосредственно с центролями не связанные Количество МТ обеих категорий в клетках сестринских к облученным и интактных статистически достоверно не различалось и составляло 9,8±1,9 и 11,4±1,7 соответственно (для прикрепленных МТ) и 26,5±2,6 и 22,8±2,4 соответственно (для неприкреплённых МТ в районе центросомы).

После перехода клетки в интерфазу, облученная в анафазе центросома существенно отличалась от центросомы в сестринской ей клетке Несмотря на то, что количество перицентриолярных сателлитов составляло также 1 -2, МТ с обученными центриолями были практически не связаны (в среднем 0,5±0,5 МТ на центросому) Также существенно меньше наблюдалось МТ и в районе облученной центросомы - в среднем было найдено 5,0±1,8 таких МТ На центриолях облученной центросомы никогда не наблюдалось образование первичной реснички.

Общая морфология центриолярных цилиндров в клетках с облученной в анафазе центросомой сохранялась Эти данные позволяют заключить, что УФ микрооблучение способно повреждать функциональную активность центросомы в дозах не вызывающих заметных структурных изменений.

В клетках с облученной центросомой в отличие от их сестринских было нарушено формирование ядрышек, в ядре вплоть до 50 ч после митоза наблюдались структуры сходные с проядрышками Этот эффект не был связан с возможным повреждением рассеянным УФ светом непосредственно хроматина, поскольку в клетках с облученной в анафазе цитоплазмой на том же удалении от хромосом что и полюса, формирование ядрышек происходило нормально В таких проядрышках было нарушено нормальное накопление белка гранулярного компонента ядрышка В23 (нуклеофосмина), который в митозе частично локализуется в полюсах веретена (Зацепина и др., 1995). Таким образом, при микрооблучении полюса веретена в анафазе повреждается и локализованный там В23, что и было возможной причиной нарушения локализации этого белка, а также формирования ядрышек в целом

Уровень синтеза РНК в клетках с облученной центросомой, который был определен по включению 3Н-уридина, был вдвое ниже, чем в сестринских клетках (48±8 против 98±20 зерен, соответственно) Снижение синтетической активности в клетках возможно связано с тем, что клетки с облученной центросомой останавливались в продвижении по клеточному циклу Даже через 24 ч после митоза ни одна из клеток с облученной центросомой не вступила в 8-фазу клеточного цикла, в то время как 9 из 11 их сестринских и все клетки с облученным участком цитоплазмы и их сестринские продолжали движение по циклу, что было показано по включению в их ядра ВгсЮ В клетках с облученной в анафазе центросомой никогда не наблюдалось репликации центриолей, в то время как в сестринских им клетках, зафиксированных через 5ч 40 мин и позднее, во всех случаях были обнаружены процентриоли Следовательно, репликация центриолей в клетках СПЭВ начиналась более чем за два часа до начала Я-фазы клеточного цикла, даже если допустить, что в исследованных клетках продолжительность в]-фазы была минимальна Таким образом, облучение центросомы в анафазе, не блокируя перехода клеток в интерфазу, впоследствии приводило к остановке прохождения клеток по клеточному циклу, либо к значительному замедлению этого процесса

Глава 3.2. Изучение динамики распределения гамма-тубулина в центросоме в интерфазных и митотических клетках с помощью специфических АТ.

3.2.1. Характеризация АТ к гамма-тубулину.

Полученные поликлональные кроличьи АТ к рекомбинантному белку, соответствующему по аминокислотной последовательности С-концевому фрагменту гамма-тубулина человека, были использованы для окраски центросом в клетках различных организмов и различной тканевой принадлежности. АТ во всех клетках выявляли точку или двойную точку вблизи ядра интерфазных клеток, совпадающую с фокусом схождения МТ и полюса веретена деления в митотических клетках. Наиболее интенсивное окрашивание было обнаружено в клетках человека (HeLa и первичные фибробласты), зеленой мартышки (Vero), крысы (первичные культуры фибробластов, клеток-зерен мозжечка и глии), мыши (L-фибробласты) и китайского хомячка (клон 237), менее интенсивно окрашивались клетки свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки Xenopus laevis (XL2) и кенгуровой крысы (PtKi).

АТ к гамма-тубулину в интерфазных клетках выявляли центриоли в клетках большинства исследованных линий от шпорцевой лягушки до человека, что подтверждает консервативность этого белка в ходе эволюции Характер окрашивания в целом совпадал с описанным ранее, с использованием АТ к пептиду, соответствующему по последовательности аминокислот N-концевому участку гамма-тубулина (Joshi et al., 1992; Dibbayawan et al., 1995)

Для более детальной характеристики окраски на нескольких клеточных культурах было определена сравнительная частота встречаемости центриолей на различных расстояниях друг от друга (таблица 1). В таблице клеточные линии расположены в порядке возрастания доли разошедшихся центриолей Как видно, разные культуры клеток существенно отличаются по этому показателю друг от друга, что показывает отсутствие единого универсального и привязанного к определенной стадии клеточного цикла механизма расхождения центриолей, которое является необходимой предпосылкой формирования двух полюсов веретена в последующем митозе.

Обе центриоли, материнская и дочерняя, окрашивались АТ к гамма-тубулину с одинаковой интенсивностью, что свидетельствует о том, что более активная нуклеация МТ на материнской центриоли прямо не связана с количеством гамма-тубулиновых затравок Таким образом, гамма-тубулин запасается на дочерней центриоли задолго до того, как эта центриоль станет активной, его количество не претерпевает при этом существенных изменений, а нуклеация МТ регулируется дополнительными факторами активации (или снятием факторов репрессии нуклеации)

В митотических клетках АТ к гамма-тубулину окрашивали полюса веретена деления Каждый полюс, который содержал две центриоли, окрашивался в виде одного яркого пятна, которое более чем в 1 5 раза превышало по диаметру пятна в интерфазных клетках (1,4±0 2 мкм и 0 8±0 1

мкм соответственно), что свидетельствует об аккумуляции гамма-тубулина в митотическом гало.

Таблица 1. Доля интерфазных клеток, с различными расстояниями между

центриолями.

Клеточная культура Доля клеток с расстоянием между центриолями (%)

< 1 мкм 1-2 мкм 2-5 мкм > 5 мкм

HeLa 96 4 - -

XL2 92 5 2 1

Клетки-зерна мозжечка крысы 91 7 1 1

L-клетки 91 6 1 2

Vero 84 11 2 3

Клетки китайского хомячка 77 14 5 4

Первичные фибробласты крысы 55 14 17 14

СПЭВ 28 40 24 8

Интенсивность окрашивания также нарастала при переходе от интерфазы к митозу, удваиваясь в прометафазе и достигая максимума в метафазе (52,2:4-3,9 условные единицы по сравнению с 12,6±0,1 в интерфазе) В течение анафазы и телофазы интенсивность мечения прогрессивно снижалась, возвращаясь к интерфазному уровню Таким образом, результаты исследования позволяют предположить, что существует два пула связанного с центросомой гамма-тубулина 1) конститутивный гамма-тубулин, который связан с центриолями вне зависимости от клеточного цикла; 2) гамма-тубулин лабильно ассоциированный с центросомой и увеличивающий её способность нуклеировать МТ

3.2.2. Распределение гамма-тубулина в клетках при деполимеризации или стабилизации МТ.

МТ в клетках НеЬа были деполимеризованы нокодазолом (5 мкг/мл), или стабилизированы таксолом (10 мкг/мл).

В интерфазных клетках под воздействием нокодазола происходило прогрессивное уменьшение количества гамма-тубулина в центросомах. Через 2 ч воздействия, когда практически все МТ в клетке были деполимеризованы, оно снижалось на 20%, а через 24 ч воздействия нокодазола количество гамма-тубулина в центросомах падало вдвое

В митотических клетках (к-митозы) спустя 2 ч инкубации в среде с нокодазолом количество гамма-тубулина в центросомах падало в 3,4 раза Диаметр окрашиваемой области снижался на 40%, приближаясь к диаметру пятна в контрольных интерфазных клетках.

В интерфазных клетках через 2 ч воздействия таксола происходило некоторое снижение (в среднем на 40 %) количества гамма-тубулина в центросомах, которое впоследствие сменялось его ростом, так что через 24 ч воздействия таксола количество гамма-тубулина в центросомах увеличивалось в 2 раза. Диаметр окрашиваемого АТ к гамма-тубулину пятна возрастал, при его неизменной средней интенсивности Кроме окрашивания центросом после длительной инкубации (24 ч) в среде с таксолом в цитоплазме клеток появлялись дополнительные, содержащие гамма-тубулин многочисленные точки, располагавшиеся вдоль пучков ацсталированных МТ.

В митотических клетках через 2-4 ч обработки таксолом хромосомы беспорядочно располагались в центральной части клетки и, наблюдалось от 5 до 25 фокусов схождения МТ АТ к гамма-тубулину окрашивали, как правило, только два из таких фокусов. Диаметр окрашиваемых пятен не менялся по сравнению с контролем (около 1,3 мкм), однако интенсивность окраски и, следовательно, общее количество гамма-тубулина на центросомах снижалось в 2,14 раза (через 4 ч).

Несмотря на то, что в клетках после длительного (24 ч) воздействия таксола появлялись многочисленные дополнительные пятна, окрашиваемые АТ к гамма-тубулину и, кроме того, количество этого белка в составе центросом также возрастало, иммуноблоттинг показал, что общее количество гамма-тубулина после такой инкубации заметно не изменилось

Таким образом, можно сделать вывод, что под воздействием таксола, стабилизирующего МТ, происходит концентрация в определенных районах части цитоплазматического пула гамма-тубулина, доля которого в клетке по данным Моифои с соавторами (1996) может составлять до 80 % этого белка

Динамика изменения количества гамма-тубулина на центросоме на ранних сроках обработки таксолом и нокодазолом имела однонаправленный характер -количество гамма-тубулина падало На длительных сроках инкубации в нокодазоле количество гамма-тубулина продолжало снижаться, а при обработке таксолом, напротив, повышалось Описываемые наблюдения можно объяснить следующим образом на начальном этапе обработка нокодазолом приводила к разборке большинства МТ цитоплазмы. Отрыв МТ (вместе с затравками) от центросомы продолжался, в то время как транспорт новых затравок в центросому по все еще существующим МТ снижался; позднее, когда все МТ, связанные с центросомой разбирались, происходила потеря затравок без восстановления за счет доставки новых, что, в конечном счете, приводило к тому, что на центросоме оставался только конститутивный пул гамма-тубулина, и его общее количество снижалось вдвое.

При обработке таксолом, количество свободного тубулина в клетке значительно снижалось, что могло приводить к стимуляции отрыва МТ вместе с гамма-тубулиновыми затравками от центросомы и первоначальному снижению количества гамма-тубулина на центросоме При длительном воздействии таксола центросома была погружена с плотную сеть пучков стабилизированных МТ, которые полностью блокировали отделение МТ с затравками, при этом транспорт новых затравок, хотя вероятно и был нарушен,

но частично сохранился. Совокупность этих двух факторов приводила к повышению количества гамма-тубулина на центросоме

Глава 33. Внутриклеточная локализация Аврора А киназы Xenopus laevis pEg2 и динамика экспрессии этого белка в клеточном цикле.

pEg2 киназа из Xenopus laevis принадлежит к киназам семейства Aurora. Первыми охарактеризованными белками этого семейства были Aurora из Drozophila melanogaster (Glover et al., 1995) и lpll(increase in ploidy) из дрожжей S. cerevisiae (Francisco et al., 1994). К настоящему времени описаны белки этого семейства для многих организмов, включая человека (Niwa et al., 1996; Kimura et al., 1997; Gopolan et al., 1997). По совокупности морфологических и биохимических характеристик семейство киназ аналогичных Aurora и Ipll принято подразделять на три подсемейства: Aurora A Aurora В и Aurora С (Nigg, 2001). pEg2 относится по этой классификации к подсемейству Aurora А киназ.

3.3.1. Получение AT кpEg2 и локализация этого белка в клетке.

Для получения моноклональных AT к pEg2 в качестве антигена был использован рекомбинантный белок экспрессированный в Е .coli. Был отобран клон (ICI), который при иммуноблоттинге выявлял одну полосу в районе 46 kDa, как в экстрактах ооцитов, так и в экстрактах из клеточной культуры XL2 Эти AT были использованы в дальнейших экспериментах.

Для исследования внутриклеточной локализации белка pEg2 были использованы клетки линии XL2. pEg2 выявлялся в районе центросомы в интерфазе и в полюсах веретена деления в митозе. Для локализации центросом в качестве маркера при двойном ИФ мечении были использованы охарактеризованные ранее поликлональные AT против гамма-тубулина, которые окрашивали центросому во всех интерфазных клетках XL2.

В профазе pEg2 выявлялся в районе центросомы во всех клетках. В отличие от интерфазного мечения размер пятна и его яркость значительно увеличивались Начиная с прометафазы и до поздней анафазы, кроме полюса веретена pEg2 детектировался на прилежащих к полюсу МТ веретена. Максимальное количество pEg2 в митотических полюсах отмечалось в метафазе и начале анафазы, в ходе телофазы его количество уменьшалось ниже уровня, наблюдаемого в интерфазных клетках перед митозом. При иммуно-ЭМ исследовании было показано, что pEg2 детектировался в перицентриолярном материале, а в метафазе и анафазе также на МТ кинетохорных пучков.

3.3.2. Динамика экспрессии pEg2 в клеточном цикле.

В отличие от гамма-тубулина, pEg2 выявлялся в районе центросомы не во всех, а только в 26,7 % интерфазных клеток При этом pEg2 мечение отмечалось в двух типах клеток: 1) в клетках ранней G|-фазы с ясно видным остаточным тельцем; 2) в крупных клетках, где гамма-тубулиновое мечение

выявляло дуплицированную центросому в виде двойной точки или в виде двух точек, находящихся на некотором расстоянии друг от друга. Исходя из вышеизложенного, было сделано предположение о зависимости появления рЕ$2 в центросоме от стадии клеточного цикла. Прижизненные наблюдения с последующей окраской клеток (с известным временем после митоза) АТ к рЕд2 показали, что этот белок исчезает из центросомы в течение первого часа после митоза Анализ клеточного цикла линии ХЬ2, проведенный с использованием АТ к ВгсЮ, позволил определить продолжительность всех фаз клеточного цикла. Средняя продолжительность митоза составляла 0,9 ч, в]-фазы 14 ч, Б-фазы 10,8 ч, вг-фазы 2,5 ч, общая продолжительность клеточного цикла 28,2 ч Таким образом, исходя из того, что рЕ%1 окрашивание центросомы было характерно для примерно четверти клеток в поздней интерфазе можно сделать вывод, что этот белок появляется в центросоме в ходе фазы Б

Двойное ИФ исследование АТ к ВгсЮ и АТ к рЕ£2 показало, что центросома во всех клетках с большими и не включившими ВгсЮ ядрами (клетки в -фазе) была окрашена АТ к рЕ§2. В клетках с включавшими Вг<Ш ядрами (клетки в Б-фазе) окрашенными АТ к рЕ^2 было только 26 % клеток. Таким образом, поскольку в клетках ХЬ2 продолжительность Б-фазы составляет в среднем 10,8 ч., рЕ£2 начинает детектироваться в центросоме примерно за 2,8 ч до окончания фазы Б

Для выяснения того, является ли исчезновение рЕ^2 из центросомы в начале Огфазы результатом его перераспределения в клетке или же в ходе клеточного цикла происходит деградация белка, было проведено исследование общего содержания pEg2 во фракциях ХЬ2 клеток, синхронизованных на различных стадиях клеточного цикла. Для исключения ошибок, связанных с процедурами выделения белков, было исследовано изменение не абсолютного количества рЕ^2, а его количества относительно бета-тубулина, белка, концентрация которого в клетках не изменяется на протяжении клеточного цикла. Было показано, что в клетках ХЬ2 минимальный уровень и Eg2 РНК и белка рЕ§2 приходится на в]-фазу клеточного цикла, максимальный уровень на вг-фазу и митоз. Данные количественного иммуноблоттинга показали, что разница в уровне рЕ£2 в С]-фазе и митозе составила 15,4 раза Однако для этого анализа были использованы, хотя и обогащенные клетками соответствующей стадии, но всё-таки фракции смешанного состава Разработанная автором методика расчета содержания белка для гипотетических «чистых» фракций позволила более точно проанализировать сравнительное количество рЕ§2 для различных стадий клеточного цикла. Суть метода состоит в том, что на основании данных о соотношении клеток различных фаз клеточного цикла в каждой из исследуемых фракций и значений относительного количества белка в этих фракциях составляется система линейных уравнений. Подсчитанное таким образом для «чистых» фракций относительное количество рЕ£2 в С]-фазе и митозе различалось в 40.1 раза Следовательно, рЕ£2 быстро деградирует после митоза.

Многие белки, вовлеченные в митоз, деградируют после его завершения. Механизм деградации таких белков связан с так называемой машиной

деградации APC /С (anaphase promoting complex / cyclosome), которая узнает предварительно убиквитинированные белки (Visintin et al., 1997). Белки, подлежащие такой деградации должны содержать определенные последовательности Два типа таких последовательностей были ранее описаны D-box, который содержит две неизменные аминокислоты - аргинин и лизин, разделенные двумя другими аминокислотами (Glotzer et al., 1991) и KEN-box, который характеризуется последовательностью лизин/глютаминовая кислота/аспарагин (Pfleger et а!., 2000). Было обнаружено три потенциальных последовательности в составе белка pEg2, которые могут служить сайтами узнавания для машины убиквитин-зависимого протеолиза' два участка первого типа D1 -box и D2-box и один второго типа KEN-box Исследование деградации рекомбинантных белков с делециями в соответствующих районах Л KEN, AD1, AD2 в экстракте XL2 клеток, синхронизованных в Gi-фазе клеточного цикла, показало, что для деградации pEg2 принципиальное значение имеет D2-box.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в соматических клетках pEg2 деградирует после митоза по убиквитин-зависимому механизму и вновь начинает синтезироваться в конце S-фазы каждого клеточного цикла.

3.3.3. Распределение pEg2 в клетках при деполимеризации МТ.

Клетки XL2 инкубировали в среде, содержащей 10 мкг/мл нокодазола При такой обработке все МТ в митотических клетках разбирались в течение 1 ч Хромосомы в них оставались в конденсированном состоянии и располагались беспорядочно в центральной части клетки Полюса веретена в части клеток были сближены, в других клетках лежали на различных расстояниях друг от друга, однако все они красились AT к pEg2 даже через 9 ч после начала инкубации клеток в среде с нокодазолом. Характер окрашивания был сходен с профазным, поскольку типичное для прометафазы, метафазы и анафазы окрашивание пучков МТ вблизи полюсов пропадало. Таким образом, в митозе сосуществуют две популяции pEg2 - одна из них связана с МТ и уходит в цитоплазму при их деполимеризации, другая связана с перицентриолярным материалом и при деполимеризации МТ сохраняется.

Доля профазных клеток популяции до и в ходе инкубации клеток в нокодазоле (0, 2, 4, 6,9 ч) составляла 0.3 - 0,5 % (данные анализа 20634 клеток). Если бы отсутствие МТ в клетке воздействовало даже на самые ранние фазы накопления pEg2, то доля pEg2+ клеток должна была бы неуклонно снижаться Однако, доля интерфазных клеток, центросома которых окрашивалать AT к pEg2 спустя 9 ч инкубации клеток в нокодазоле не отличалась от уровня в контроле, что показывает, что нокодазол не блокирует продвижение клеток по циклу Поскольку, по нашим данным, накопление pEg2 в центросоме начинается примерно за 5,3 ч до начала митоза, то можно заключить, что аккумуляция этого белка не зависит от наличия МТ в клетке Таким образом, разборка МТ не только не приводит к потере pEg2, связанного с перицентриолярным материалом, но и не препятствует накоплению pEg2 в интерфазных клетках

3.3.4. Распределение pEg2 в клетках при стабилизации МТ.

XL2 были проинкубированы в среде, содержащей таксол (10 мкг/мл), растительный алкалоид, который понижает критическую концентрацию полимеризации тубулина (De Brabander et al., 1981) В митотических клетках такая обработка приводила к дезорганизации веретена деления и образованию множества фокусов схождения МТ, два из которых содержали центросомы Двойная ИФ окраска на гамма-тубулин и pEg2, показала наличие pEg2 только в центросомальных фокусах МТ, при этом окрашивание имело характер сходный с профазным - прилежащие пучки МТ, не окрашивались, в отличие от нормальной прометафазы или метафазы.

Таким образом, можно заключить, что в отличие от ситуации in vitro, где была показана ко-седементация pEg2 со стабилизированными таксолом МТ (Giet, Prigent, 1998), in vivo связывание pEg2 с пучками МТ строго специфично -этот белок выявляется на МТ только в интакгном веретене

Глава 3.4. Взаимодействие Авроры А киназы Xenopus laevis pEg2 с белком XlEg5 в процессе построения митотического веретена.

Для поиска субстратов фосфорилирования pEg2 был использован рекомбинантный белок, pEg2(His)6, который хорошо фосфорилировал основной миелиновый белок (МВР); гистон HI и бета-казеин оказались плохими субстратами, альфа казеин не фосфорилировался совсем Поиск субстратов фосфорилирования в клетке осуществлялся по функции и по локализации Как было показано ранее (Le Guellec et al, 1991) кинезин подобный белок XlEg5 связан с МТ веретена деления Кроме того, добавление AT к этому белку in vitro приводило, также как AT к pEg2, к формированию монополярного веретена в экстрактах яиц Xenopus laevis

3.4.1. Колокализация pEg2 и XlEgS в митотичесикх и интерфазных клетках.

Двойное ИФ окрашивание с помощью поликлональных AT к XlEg5 и моноклональных AT к pEg2 показало, что эти белки частично колокализуются в митотических клетках- в профазе оба белка выявляются в центросомах, причем зона мечения Xffig5 превосходит по диаметру зону мечения pEg2 Начиная с прометафазы и до конца анафазы, XlEg5 выявляется по всему объёму веретена, в то время как pEg2 только в полюсах и прилегающих к ним пучках МТ В телофазе XlEg5 выявляется также вблизи минус концов МТ остаточного тельца.

ИФ исследование распределения белка XlEg5 в интерфазных клетках выявило его появление между центросомами, окрашенными на pEg2 в начале процесса их расхождения Зона колокализации pEg2 и XlEg5 была выявлена на обращенных друг к другу сторонах двух центросом

На синхронизованных клетках XL2 было показано, что в клеточном цикле в Gi-фазе уровень XlEg5 минимален, в S-фазе он увеличивался в 2,3 раза, а в фазе G2 и митозе в 4 и в 5 раз соответственно, по сравнению с уровнем в Gr

фазе В клетках, синхронизованных в Go-фазе, XlEg5 детектировался ещё слабее, чем в фазе Gi

3.4.2. Взаимодействие pEg2 и XlEgS in vitro и in vivo.

Таким образом, данные по локализации и динамике изменения уровня белков позволили предположить, что они взаимодействуют в клетке Для проверки этой гипотезы была проведена реакция иммунопреципитации белков из экстракта яиц Xenopus в обоих направлениях В первом случае, исследовался преципитат белков, связавшихся с носителем (protein G-Sepharose) покрытым AT к pEg2, во втором случае - носитель (protein A-Sepharose) был связан с AT к X1Eg5 В обоих случаях в преципитатах выявлялись оба белка - XlEg5 и pEg2, что прямо указывает на их физическое взаимодействие В контрольных экспериментах без AT или без экстракта белки не выявлялись Если для преципитации был использован экстракт несинхронизованных XL2 клеток, то была отмечена очень слабая преципитация белков, что свидетельствует о том, что их взаимодействие в клетке происходит только в специфические и достаточно короткие периоды клеточного цикла

Дополнительные свидетельства о физическом взаимодействии XlEg5 и pEg2 были получены в эксперименте, где транслированный in vitro в лизате ретикулоцитов кролика в присутствие [35S] метионина XlEg5 был проинкубирован с никель-агарозными шариками, связанными с pEg2(His)6 После инкубации в течение 60 мин при 4°С связавшиеся белки были смыты 250 мМ имидазолом и разделены электрофорезом. В качестве контроля несколько других белков с гистидиновым «хвостом» были связаны с никель-агарозными шариками, но только в смыве с колонки с pEg2(His)6 был обнаружен XlEg5

Взаимодействие между XlEg5 и pEg2 было исследовано также в двугибридной системе В такой системе два разделенных компонента (ДНК-связывающий и активирующий домены дрожжевого фактора транскрипции Gal4), входящие в состав плазмид pGBT9 (или pGBTI 1) и pGADGH дают сигнал только в том случае, если они в клетке (для анализа используются клетки дрожжей с делетшей гена GAL4) пространственно сближаются Таким образом, если исследуемые белки, связанные соответственно с ДНК-связываюшим и активирующим доменами комплекса, взаимодействуют друг с другом, то в клетке происходит активация синтеза репортерного гена lacZ, которая может быть выявлена 5-бромо-4-хлоро-3-индолил b-D-галактопиранозидом (X-Gal). Как было ранее показано, кинезин-подобные белки могут образовывать димеры (Cole et al, 1994), димеризация XlEg5 была использована в качестве позитивного контроля Две молекулы связывались через свои стеблевые домены и формировали гомодимеры Конструкция, кодирующая только стеблевой и хвостовой домены, была использована для анализа, поскольку ранее было показано, что продукция полноразмерного белка HsEg5 (человеческий Eg5) в дрожжах летальна (Blangy et al, 1997) Отрицательный контроль при использовании конструкций не связанных с белками сигнала не давал Когда оба компонента для двугибридной системы были связаны со стеблевыми участками XlEg5, была зафиксирована

существенная бета-галактозидазная активность Меньшая активность обнаруживалась, когда использовались конструкции pGBT9-pEg2 и pGADGH-XlEg5ST, что можно объяснить тем, что аффинность киназы к субстрату всегда ниже, чем в белках, формирующих стабильные димеры. Тем не менее, и этим методом было показано, что XlEg5 и pEg2 обладают способностью к взаимодействию Дополнительно можно отметить, что моторный домен не является необходимым для такого взаимодействия, поскольку в использованных конструкциях он отсутствовал

3.4.3. Фосфорилирование XlEg5 киназой pEg2 in vitro и in vivo.

Поскольку было доказано физическое взаимодействие XlEg5 и pEg2, то следующим шагом было проверить способность киназы pEg2 фосфорилировать X1Eg5 Поскольку, как оказалось, AT к pEg2 (клон ICI) не являются ингибирующими, т е иммунопреципитированный с ними белок сохранял свою киназную активность, стало возможным провести исследование активности белка непосредственно на колонке pEg2 был прецигштирован из экстракта яиц Xenopus laevis и проинкубирован с АТФ, меченой радиоактивным 32Р Радиоактивно меченые преципитированные белки были исследованы после разделения электрофорезом. Было обнаружено 4 таких белка: 46 kDa белок, который представлял собой автофосфорилированный pEg2, 90 kDa белок, 130 kDa белок; белок с молекулярным весом более 200 kDa. Высокофосфорилированный 130 kDa белок мигрировал на электрофорезе, так же как и XlEg5 и присутствовал только в иммунопреципитатах, содержащих pEg2

Для проверки является ли наблюдавшееся фосфорилирование белков из экстракта результатом киназной активности pEg2, активная киназа была заменена на рекомбинантный белок без киназной активности pEg2-K/R-(His)6, в котором лизин 169 был заменён на аргинин Добавление 5 мкг такого белка снижало уровень фосфорилирования 130 kDa белка в 10 раз, в то время как добавление такого же количества бычьего сывороточного альбумина не приводило к каким-либо изменениям Таким образом, фосфорилирование 130 kDa белка киназой pEg2 было специфичным.

Белки семейства bimC, к которому принадлежит XlEg5, состоят из трех доменов' N-терминального моторного домена или головки (Н-домен), стеблевого домена (S-домен) и С-терминального хвостового домена (Т-домен) (Giet et al, 1999) Три различных конструкции, соответствующие усеченной последовательности XlEg5 были экспрессированы в бактериях как GST слитые белки, очищены и использованы m vitro в качестве потенциальных субстратов фосфорилирования для рекомбинантной киназы pEg2(His)ü HS конструкция содержала головной и стеблевой участки, ST стеблевой и хвостовой, а Т только хвостовой участок Только HS и ST белки были фосфорилированы в присутствие pEg2(His)6, что показывает отсутствие фосфорилирования хвостового домена Для определения какой из доменов XlEg5 фосфорилируется киназой pEg2, моторный или стеблевой, было использованое двумерное картирование трипсинизированных фосфорилированных in vitro пептидов Обе

карты были одинаковы, что свидетельствует о том, что фосфорилирование идет только в стеблевом участке. Высоковольтный электрофорез показал, что фосфорилируется остаток серина.

Как было ранее показано (Blangy et al., 1995), человеческий белок HsEg5 фосфорилируется in vivo киназой p34afc2 по остатку треонина в хвостовом домене и неизвестной киназой в стеблевом домене по остатку серина. Для исследования фосфорилирования XlEg5 in vivo синхронизованные в вг-фазе и митозе клетки XL2 были метаболически мечены 32Р. После этого меченый 32Р белок XlEg5 был иммунопреципитирован поликлональными АТ и обработан трипсином Получившиеся пептиды были разделены горизонтальным электрофорезом с последующей восходящей хроматографией.

Как и человеческий HsEg5, XlEg5 был фосфорилирован от vivo в двух трипсинизированных пептидах Один из них мигрировал так же, как и пептид фосфорилированный in vitro киназой р34с<к2, что свидетельствует о фосфорилировании in vivo этой киназой белка Xffig5, как предполагали Sawin и Mitchison (1995) Второй пептид мигрировал идентично пептиду фосфорилированному in vitro киназой pEg2, что прямо свидетельствует о фосфорилировании этой киназой XlEg5 in vivo.

Глава 3.5. Роль МТ и актиновых микрофиламентов в процессе разделения и расхождения центросом в интерфазе и митозе.

После митоза каждая из дочерних клеток получает одну центросому, состоящую из двух центриолей. К началу следующего митоза в этой клетке должно образоваться две центросомы (по две центриоли в каждой), каждая из которых формирует один из полюсов митотического веретена Начало дупликации центриолей в конце Gi-фазы клеточного цикла одно из самых ранних морфологически обнаруживаемых структурных изменений в клетке в процессе её подготовки к делению В отличие от репликации центриолей, процесс их расхождения не имеет четкой привязки к определенному периоду клеточного цикла - для некоторых типов клеток центриоли начинают расходиться ещё до начала репликации, в других типах клеток этот процесс начинается перед митозом или даже непосредственно в митозе. В связи с этим для изучения процесса расхождения центросом первостепенное значение имеет подбор адекватной модели.

АТ к гамма-тубулину выявляли центросомы в 100 % интерфазных клеток XL2 (глава 3.2). При этом 92 % клеток XL2 имели не разделившиеся центросомы С другой стороны, в главе 3 3 было показано, что белок pEg2 появляется в составе центросомы после её дупликации в поздней S-фазе. Доля клеток, с разделившимися центросомами среди окрашиваемых АТ к pEg2 (учитывались только клетки в поздней S-фазе и вг-фазе, но не клетки в ранней Gj-фазе), оказалась существенно выше, чем для клеток с не окрашиваемыми этими АТ центросомами, 26,7 % и 0,7% соответственно Таким образом, в клетках XL2 практически отсутствует расхождение центриолей в ранней интерфазе, и полюса веретена формируются за счёт пре-митотического

расхождения дуплицированных центросом, которое и было исследовано в настоящей работе

3.5.1. Разделение и расхождение центросом в контрольных ХЬ2 клетках.

Как показали измерения 26 7 % интерфазных клеток, содержащих рЕ§2+ центросомы, уже начали разделение центросом (меж-центросомальное расстояние 2 1 мкм) Среднее расстояние во всех рЕ§2+ интерфазных клетках было 1,28+0,17 мкм (здесь и далее средние значения расстояний приводятся с точностью до 0,01 мкм, что не отражает точность измерения, а лишь дает более точное представление о среднем значении расстояния), принимая во внимание, что среднее расстояние в клетках, содержащих разделившиеся центросомы, было 3 44±0,53 мкм Данные о расстоянии между центросомами на различных стадиях клеточного цикла приведены в таблице 2

Таблица 2. Расстояние между центросомами в клетках ХЬ2.

Стадия клеточного цикла Минимальное и максимальное расстояния (мкм) Среднее рассгояеие между центросомами (мкм) Доля клеток с не разошедшимися центросомами (%)

Интерфаза 0,5-23 0,74 ± 0,04 92,1

рЕ^2- интерфаза 0,5-12 0,54 ± 0,03 99,3

pEg2+ интерфаза 0,5-23 1,28 ±0,17 73,3

Профаза 0,5-14 4,76 ± 0,28 6

Прометафаза 0,5-10,5 5,73 ± 0,21 1

Метафаза 6,0-10,0 7,39 ± 0,09 0

Анафаза 7,5-18 11,35 ±0,2 0

Телофаза 11,5-30 17,9 ±0,41 0

Средний размер митотического веретена в метафазе составил 7,4 мкм Исходя из этого значения, для более детального изучения динамики расстояний между центросомами все клетки были разделены на классы В первый класс вошли клетки с не разделившимися центросомами (класс 0,5 мкм - в контрольных рЕ$2+ клетках 73,3 %), во второй класс клетки с расстояниями между центросомами менее половины величины митотического веретена (класс от 1 до 3 5 мкм, в контрольных рЕ^2+ клетках 19,4 %), третий класс составили клетки с расстояниями между центросомами о г половины до средней величины митотического веретена (класс от 4 до 7 мкм, в контрольных рЕд2+ клетках 4,4 %), четвёртый класс составили клетки с расстояниями между центросомами от средней до максимальной величины митотического веретена (класс от 7,5 до 10 мкм, в контрольных рЕ§2+ клетках 1,5 %), пятый

класс составили клетки с расстояниями между центросомами более максимальной величины митотического веретена (класс от 10,5 мкм, в контрольных pEg2+ клетках 1,5 %).

Как было показано в главе 3, pEg2 появляется в районе центросомы примерно за 5,3 ч до начала митоза. Доля клеток с разошедшимися центриолями составляет 26,7 % от всех pEg2+ клеток, следовательно, расхождение центросом в среднем начинается за 1 ч 25 мин до митоза Однако, даже в профазе доля клеток с не разделившимися центросомами все ещё составляет 6%, а в прометафазе 1%. Эти данные показывают, что в клетках линии XL2 для небольшой доли клеток расхождение центросом может начинаться вплоть до прометафазы.

3.5.2. Нарушение разделения центросом в интерфазных клетках при деполимеризации МТ или актиновых филаментов.

Для деполимеризации МТ или/и актиновых микрофиламентов, клетки XL2 были инкубированы в среде, содержащей 5 мкг/мл нокодазола или 0.2 мкг/мл латранкулина-А, соответственно. Время инкубации составляло 2, 4, 6 и 9 ч

2 ч обработка нокодазолом деполимеризовала все митотические МТ и подавляющее большинство интерфазных МТ; 4, 6 и 9 ч обработка нокодазолом приводила к деполимеризации всех МТ в клетках. Обработка нокодазолом останавливала прогрессию клеточного цикла между прометафазой и метафазой, в к-митозе (Hamilton, and Snyder, 1982). При этом после 6 ч обработки нокодазолом, сеть актиновых филаментов оставалась подобной таковой в контрольных клетках. 2 ч инкубации клеток в среде с латранкулином было достаточно для полной деполимеризации актиновых филаментов, при этом интерфазная сеть МТ и митотические веретена сохранялись и после 6 ч обработки латранкулином. Деполимеризация актиновых филаментов блокировала цитокинез, что приводило к формированию двуядерных клеток (митоз выглядел нормальным вплоть до телофазы).

На ранних сроках инкубации (2-6 ч) латранкулин оказывал более сильное ингибирующее воздействие на разделение центросом в интерфазе - уже через 2 ч снижая долю клеток с разделенными центросомами вдвое, а через 4 ч втрое. Нокодазол на этих сроках лишь незначительно снижал долю клеток с разделенными центросомами (в 1,07 и 1,18 раза соответственно). Напротив, для воздействия нокодазола характерно существенное снижение доли клеток с разделенными центросомами в период между 4 и 9 ч инкубации. В конечном итоге, культивирование клеток в среде и с нокодазолом и с латранкулином в течение 9 ч, приводила к увеличению доли интерфазных клеток с неразделенными центросомами, в первом случае до 93,7 % клеток, во втором до 95,2 %, указывая, что оба вещества воздействуют на фазу разделения центросом в интерфазных клетках. Совместное использование нокодазола и латранкулина ещё более усиливало этот эффект (97,4 % интерфазных клеток с неразделенными центросомами через 9 ч инкубации). Представленные результаты показывают, что и МТ и актиновые филаменты, участвуют в процессе разделения центросом перед митозом.

3.5.3. Влияние МТ и актиновых микрофиламентов на расхождение центросом.

Чтобы исследовать эффект нокодазола и латранкулина на процесс расхождения центросом после их разделения в интерфазе, были измерены расстояния между центросомами, которые уже отделились друг от друга (расстояние 1 мкм и более) Для количественного анализа расстояния между центросомами были разбиты на 3 класса: I - от 1 до 3.5 мкм; И - от 4 до 7 мкм, III - 7,5 мкм и более (этот класс объединял IV и V классы «полной» классификации). В контрольных интерфазных клетках, содержащих разделенные pEg2+ центросомы, 72,7% относились к I, 16 4 % ко II и 10.9 % к 1П классу.

В ходе инкубации клеток в нокодазоле, доля клеток I класса прогрессивно уменьшалась, в то время как доля клеток в двух других классах увеличивалась. После 6 ч обработки нокодазолом, почти 50 % клеток, в которых центросомы были разделены, находились друг от друга на расстоянии 7.5 мкм и более.

Обработка клеток латранкулином приводила к противоположному эффекту; доля клеток I класса увеличивалась уже после 2 ч обработки до 93,7% (при этом полностью отсутствовали клетки III класса), а после 6 ч до 100 %. При этом расстояние между центросомами не превышало 1.5 мкм. Полученные данные свидетельствуют об облегчении расхождения уже разделившихся центросом в отсутствие МТ и прямо указывают на участие актиновых микрофиламентов в расхождении центросом в интерфазных клетках.

3.5.4. Расстояние между центросомами в профазных клетках при деполимеризация МТ и/или деполимеризации актиновых филаментов.

Для анализа все клетки были разделены на 4 класса I класс - с расстоянием между центросомами менее 1 мкм, II - от 1 до 3.5 мкм, III - от 4 до 7 мкм, IV - более 7.5 мкм (этот класс объединял IV и V классы «полной» классификации).

В присутствии нокодазола, доля профазных клеток с неразделенными центросомами (I класс) существенно увеличивалась (в контрольных профазах 6 %) - через 2 ч до 34 %, через 4 ч до 42%, через 6 ч до 51 %, через 9ч до 79%. Это указывает на то, разделение центросом в митозе, так же, как и в интерфазе зависит от интактности системы МТ. Доля профазных клеток, содержащих центросомы II и, особенно III класса существенно снижалась через 6 ч инкубации клеток в среде с нокодазолом, поскольку эти классы относительно «обеднялись» в интерфазе Доля клеток IV класса была относительно стабильна, что можно объяснить суммарным эффектом двух тенденций. С одной стороны, в митоз вступало все больше клеток с разошедшимися на большие расстояния центросомами в интерфазе С другой стороны, количество клеток, переходящих в этот класс из предыдущих, последовательно падало вследствие блокирования нокодазолом процесса разделения центросом в интерфазе.

Эффект латранкулина на меж-центросомальное расстояние в профазных клетках был иным. Наиболее заметным различием было полное отсутствие клеток IV класса. Эти данные подтверждают сделанные в предыдущих разделах настоящей главы выводы об участии актиновых филаментов, как в процессе разделения интерфазных центросом, так и в процессе их последующего расхождения Однако в отличие от поздних (рЕ|>2+) интерфазных клеток, соответствующих времен инкубации в латранкулине доля профазных клеток с неразделёнными центросомами снижается более чем в 4 раза и составляет в клетках инкубированных 2 ч в латранкулине - 20 %, 4 ч - 18 %, 6 ч - 20 %, 9 ч - 26 %. Нетрудно заметить, что эта величина практически стабильна и на этих сроках не зависит от времени инкубации клеток в латранкулине Таким образом, при переходе клеток от интерфазы к профазе включается другой механизм разделения центросом, который не зависит от интактности актиновых микрофиламентов.

Другой особенностью распределения расстояний между центросомами в профазных клетках, инкубированных в латранкулине на всех сроках, является высокая доля клеток II класса (от 1 до 3,5 мкм), при том, что доля клеток 1П класса (от 4 до 7 мкм), напротив уменьшается более чем вдвое по сравнению с контрольными профазами. Одним из возможных объяснений этого может бьггь, то, что при достижении расстояния соответствующего примерно половине длины митотического веретена центросомы начинают двигаться по криволинейной траектории вокруг ядра и при отсутствии актиновых филаментов такое движение становится затрудненным, и они задерживаются в этом положении до распада ядерной оболочки С другой стороны, нельзя исключить и того, что подобный «сдвиг» по классам связан с тем, что в отличие от контрольных клеток, центросомы в клетках без актиновых микрофиламентов стартуют в своём расхождении с более «низкого старта» (практически без интерфазного расхождения) и поэтому в среднем в профазе имеют меньшие расстояния между центросомами

При деполимеризации обеих цитоскелетных систем совместным действием нокодазола и латранкулина доля клеток с неразошедшимися центриолями в профазных клетках составляла 46, 52, 60 и 86 % (2, 4, 6, 9 ч воздействия), превышая соответствующие показатели, как для инкубации клеток в нокодазоле, так и в латранкулине Однако в остальных от 14% до 54 % клеток разделение центросом в профазе происходило в отсутствие и МТ и актиновых микрофиламентов. Доля клеток с разошедшимися центросомами в профазе для всех сроков инкубации росла по сравнению с интерфазными рЕ£2+ клетками в 4-5 раз

Приведенные результаты показывают, что в профазе МТ играют существенную роль в процессе разделения центросом, в то время как актиновые микрофиламенты, возможно, необходимы для расхождения центросом на расстояние от 3 5 до 7 мкм при их движении вокруг ядра Вместе с тем, результаты по обработке клеток одновременно нокодазолом и латранкулином позволяют предположить существование в митотических

клетках механизма разделения центросом независимого, ни от МТ, ни от актиновых микрофиламентов.

5.5.5. Нарушение разделения центросом в профазе и прометафазе при деполимеризация актиновых филаментов.

В присутствии латранкулина можно было наблюдать все стадии митотического деления, и сравнивать расстояния между центросомами с соответствующими стадиями нормального митоза В прометафазе, также как и профазе, среднее расстояние между центросомами было меньше, чем в контроле Однако если в профазе разница составляла примерно 1,9 раза, то в прометафазе только 1,3 раза (6 ч инкубации). В метафазных клетках в присутствие латранкулина, веретено деления имело практически нормальную длину, различаясь с контрольным менее чем в 1,1 раза для всех сроков инкубации. Таким образом, в прометафазе и метафазе формирование веретена деления не требовало актиновых филаментов. Анафазные клетки в латранкулине достоверно не различались от контрольных по среднему расстоянию между полюсами В отличие от контрольных клеток в присутствие латранкулина цитокинез был полностью блокирован, центросомы в анафазе доходили практически до клеточной мембраны. Далее хромосомы начинали деконденсироваться и образовывались двуядерные клетки. Также как и в контрольных клетках, мечение центросом АТ к рЕ§2 в телофазе существенно ослаблялось, а в двуядерных клетках исчезало. В последнем случае положение центросом определялось по их мечению АТ к гамма-тубулину В ходе и, особенно, по окончании телофазы, центросомы начинали движение друг к другу. Если среднее расстояние между центросомами в анафазе для 9 ч инкубации было 10.72+0 26 мкм, то для телофазных клеток оно составляло в среднем 5.92±0 58 мкм, а для двуядерных на том же сроке инкубации 1.05±0 25 мкм (при этом 84 % клеток имели полностью сблизившиеся центросомы) Таким образом, при отсутствии в клетках актиновых микрофиламентов при переходе от митоза к интерфазе центросомы в клетках сближаются, формируя один клеточный центр, состоящий из 4 центриолей

3.5.6. Продолжительность различных стадий митоза в присутствии латранкулина.

При ИФ исследовании клеток на различных митотических стадиях в присутствии латрункулина было замечено, что доля метафазных клеток была заметно меньше, чем в контрольных клетках Проведенный количественный анализ подтвердил изменение соотношения встречаемости клеток на различных стадиях митоза Оказалось, что доля клеток в профазе (из всех митотических клеток без учета телофаз) выросла с 20,4 до 30 9 %, в прометафазе увеличилась с 25.0 до 38.1 %, в метафазе снизилась с 39.5 % до 17.5 %, а доля клеток в анафазе осталась практически без изменения (изменилась с 15.1% до 13 4 %)

Эти результаты свидетельствуют о том, что в присутствии латранкулина длина профазы и прометафазы увеличивалась, а метафазы уменьшалась Чтобы прямо это проверить, была исследована продолжительность митотических

стадий в живых клетках Продолжительность анафазы была фактически неизменна (около 6 мин), прометафазы увеличилась более чем в 2 раза (с 7 до 17 мин), а метафазы уменьшилась более чем в 2 раза (с 19 до 8 мин). Продолжительность профазы, определенная из доли клеток на этой стадии митоза в препаратах фиксированных клетках, увеличилась приблизительно вдвое. Хотя продолжительность стадий митоза в отсутствие акгиновых филаментов существенно изменилась, время между концом профазы и началом анафазы оставалось постоянным - 25-26 мин, что говорит о том, что начало анафазы строго задается внутриклеточными регуляторами начинающими «отсчет» от момента распада ядерной оболочки. Однако в клетках с деполимеризованными МТ разделения хроматид в означенный момент не происходит, следовательно, этот процесс может начаться только при условии формирования веретена деления.

Глава 3.6. Исследование влияния Авроры А киназы Xenopus laevis pEg2 на процесс полимеризации МТ и их нуклеацию на центросоме.

3.6.1. Стимуляция полимеризации MTpEg2 киназой in vitro.

Спектрофотометрические эксперименты (длина волны 350 нм) показали, что добавление в смесь полимеризации (тубулин 18,2 мкМ, ГТФ 1мМ, АТФ 1 мМ, на буфере BRB-80) рекомбинантной киназы pEg2-(his)6 существенно увеличивало поглощение раствора по сравнению с контрольными экспериментами. Эффект прогрессивно зависел от концентрации киназы (были исследованы концентрации 0 25-8 мкМ) При добавлении 4 мкМ pEg2-(his)6 прирост поглощения раствора через 20 мин инкубации при 37°С был в 10 раз больше, чем в контроле При добавлении в раствор полимеризации вместо активной киназы рекомбинантного белка без киназной активности pEg2-K/R-(his)6 наблюдался идентичный эффект, что говорит о том, что наблюдаемый эффект не зависел от киназной активности pEg2. Каталитическая активность киназы Аврора связана с С-терминальным доменом этого белка (Roghi et al., 1998) Поскольку киназная активность не играет роли в эффекте стимуляции полимеризации МТ, то можно было предположить, что N-терминального участка будет достаточно для усиления полимеризации МТ Для проверки этого предположения был использован рекомбинантный белок соответствующий N-терминальному участку Аврора А киназы Xenopus laevis Nt-pEg2-(his)6 . Как показали спектрофотометрические эксперименты Nt-pEg2-(his)6 в концентрации 4 мкМ вызывал вдвое большее увеличение поглощения при 350 нм при добавлении его в смесь полимеризации МТ, чем полноразмерные киназы pEg2-(his)6 и pEg2-K/R-(his)6 В контрольных экспериментах вместо киназы в раствор были добавлены в тех же концентрациях бычий сывороточный альбумин или смесь бактериальных белков без экспрессии киназы, которые не оказывали влияния на полимеризацию МТ

При ИФ исследовании смеси полимеризации МТ (3 мин) из чистого тубулина в концентрации 18,2 мкМ было обнаружено небольшое количество

индивидуальных МТ. При добавлении в смесь полимеризации МТ pEg2-(his)6 или pEg2-K/R-(his)6 через 3 мин инкубации при 37°С в растворе обнаруживалось очень большое количество коротких МТ. При увеличении времени инкубации до 20 мин происходило удлинение МТ при некотором снижении их общего количества Таким образом, можно сделать вывод, что добавление киназы приводит к облегчению первой стадии образования МТ -формирования устойчивых к деполимеризации олигомеров тубулина, которые служат точками нуклеации МТ Эффект добавления Nt-pEg2-(his)6 несколько отличался - в растворе обнаруживалось несколько меньшее количество МТ, однако их средняя длина была больше и они часто были объединены в пучки.

Исследование смеси полимеризации методом ЭМ после негативного контрастирования, не выявило каких-либо особенностей МТ, полимеризованных в присутствие полноразмерных киназ. Было показано, что добавление в смесь полимеризации Nt-pEg2-(his)6 действительно вызывает ассоциацию МТ в пучки. Анализ результатов, полученных методом крио-ЭМ, показал, что МТ имели обычное строение и содержали 13, реже 14 протофиламентов, что характерно для полимеризованных in vitro МТ (Chretien et al., 1995).

Сопоставление морфологических данных, полученных методами ИФ и ЭМ, со спектрофотометрическими данными показывает, что под влиянием полноразмерных киназ pEg2-(his)6 и pEg2-K/R-(his)6 происходит образование в растворе большого количества центров нуклеации МТ Более высокий уровень поглощения смеси полимеризации МТ в присутствие Nt-pEg2-(his)6, по всей вероятности, был вызван образованием пучков МТ.

3.6.2. Потеря эндогенной человеческой Аврора А киназы в процессе выделения центросом из клеток КЕ-37.

ИФ исследование клеток человеческой лимфобластомьт КЕ37 с использованием моноклональных AT (клон 5СЗ) показало, что локализация Аврора А киназы на соответствующих фазах клеточного цикла не отличается от ранее описанной для киназы из Xenopus laevis pEg2 Этот белок выявлялся в полюсах веретена в митозе и центросомах примерно 20 % интерфазных клеток Однако во фракциях выделенных центросом эндогенная человеческая Аврора А киназа не обнаруживалась, что было показано, как с помощью с иммуноблотинга, так и ИФ исследованием, в котором для выявления центросом были использованы AT к гамма-тубулину AT к pEg2 (клон ICI) также не выявляли никаких белков в выделенных центросомах.

Потеря центросомами Аврора А киназы в процессе выделения, таким образом, свидетельствует о лабильном характере связи между этим белком и его партнерами в перицентриолярном материале

3.6.3. Ингибирование нуклеации МТ на центросоме pEg2 киназой.

Выделенные центросомы (107/мл) были проинкубированы в течение 15

мин на льду с pEg2-(his)6 или pEg2-K/R-(his)6 или Nt-pEg2-n(his)6 (конц. во

всех случаях 4 мкМ) или только с буфером (контроль) и использовались далее для полимеризации МТ in vitro (конц. тубулина18,2 мкМ).

Спектрофотометрические эксперименты показали, добавление pEg2-(his)6 или pEg2-K/R-(his)6 приводило примерно к 10-кратному увеличению поглощения смеси полимеризации, а добавление Nt-pEg2-(his)6 приводило к еще более сильному росту оптической плотности, аналогично тому, что было отмечено в экспериментах без центросом Двойная ИФ окраска AT к гамма- и альфа- тубулину показала, что через 3 мин после начала инкубации при 37° С в контрольных экспериментах на центросомах было обнаружено формирование МТ в виде "звезд". Добавление в смесь полимеризации pEg2-(his)6 или pEg2-K/R-(his)6 приводило так же, как в экспериментах без центросом, к появлению большого количества коротких МТ. Одновременно, количество МТ, связанных с центросомами, в отличие от контрольных экспериментов, было очень небольшим, значительная часть центросом вообще не нукпеировала МТ. В присутствие Nt-pEg2-(his)6 центросомы формировали звезды МТ, но их «лучи» имели большую толщину и состояли, вероятно, из пучков МТ. Одновременно, много длинных МТ и пучков МТ были найдено в растворе без связи с центросомами

Из приведенных данных можно заключить, что эффект киназы на самосборку МТ в растворе не зависел от присутствия центросом. Для объяснения уменьшения количества МТ связанных с центросомами при полимеризации в присутствие киназы было предложено две гипотезы: 1) количество МТ снижается за счет того, что большая часть тубулина в растворе расходуется на полимеризацию свободных МТ; 2) количество связанных с центросомой МТ снижается за счет ингибирования киназой центросомальных центров нуклеации Для того чтобы выяснить, какая из гипотез соответствует действительности, были сделаны эксперименты, описанные в двух последующих главах

3.6.4. Взаимодействие pEg2 с центросомами, полученными из клеток линии КЕ37.

Центросомы были проинкубированы 15 мин на льду с pEg2-(his)6 или pEg2-K/R-(his)6 или Nt-pEg2-(his)6 или с буфером (контрольные эксперименты) и переочищены в градиенте сахарозы, для того чтобы отделить их от содержащего киназу раствора. Фракции центросом были осаждены на покровные стекла и исследованы двойным ИФ методом с использованием AT к гамма-тубулину и pEg2. Обе полноразмерные киназы активная pEg2-(his)6 и неактивная pEg2-K/R-(his)6 были обнаружены в перицентриолярном материале центросом. Напротив, в центросомах преинкубированных с Nt-pEg2-(his)6 в большинстве случаев (76 7 %) мечение АТми к pEg2 было на уровне неспецифического фона Иммуноблотинг фракций центросом, преинкубированных с рекомбинантными белками перед переочисткой показал наличие pEg2-(his)6 и pEg2-K/R-(his)6 в соответствующих фракциях. Nt-pEg2-(his)6 был найден в детектируемом количестве в центросомальной фракции только, когда было использовано для анализа в 4 раза большее количество центросом.

Полученные результаты позволяют заключить, что только полноразмерные киназы содержащие С-терминальный домен эффективно связываются с центросомой. Это взаимодействие имело место в отсутствие на центросоме МТ и не зависело от киназной активности рекомбинантного белка. Ассоциация с центросомой №-рЕ§2-(Ыз)6 в этих условиях была очень слабая, что соответствует данным, полученным 01е1 и Рп§еп1 (2001) о том, что афинность к центросоме ^терминального домена ниже, чем полноразмерной киназы Аврора А киназа Хепорт \aevis рЕ§2 взаимодействует с человеческими центросомами из КЕ-37 клеток Таким образом, этот тип взаимодействия является консервативным и сохраняется в эволюции, что свидетельствует о его важности в жизнедеятельности клетки

3.6.5. Изучение нуклеирующей способности центросом после их инкубации с рекомбинантными белками и переочистки в градиенте сахарозы.

Центросомы преинкубированные и переочищенные в градиенте сахарозы, были использованы для экспериментов по нуклеации МТ, с последующим ИФ исследованием Центросомы, преинкубированные с буфером или №-рЕд2-(1115)6, формировали "звезды" МТ нормальной структуры Если же для полимеризации МТ были использованы центросомы до переочистки преинкубированые с рЕд2-(Ы5)6 или рЕ§2-К/Я-(Ыз)6, то нуклеации МТ на центросомах не наблюдалось.

Таким образом, можно заключить, что в предыдущих экспериментах по полимеризации МТ на центросомах в присутствие киназы рЕ§2 существенное уменьшение количества ассоциированных с центросомами МТ было вызвано не конкурентным воздействием самосборки МТ в растворе (или не только им), а прямым ингибированием нуклеирующей активности центросом под действием рЕд2-(1ш)6 или pEg2-K/R-(his)6

3.6.6. Наблюдение роста МТ на центросоме в присутствии рЕд2-(Ик)6 или Nt-pEg2-(his)6 с помощью видеомикроскопии с усилением контраста.

В контрольных экспериментах центросомы нуклеировали МТ в виде "звезды". Через 5 минут после начала полимеризации средняя длина МТ составила 8.5 ± 1 5 мкм, так что средняя скорость удлинения за этот период составила 1 7 мкм/мин При этом около 8 % МТ укорачивались Большинство центросом, пре-инкубированных с рЕ§2-(1п8)6 совсем не нуклеировали МТ, небольшая часть центросом нуклеировала от 1 до 5 МТ Если центросомы инкубировали с тубулином перед добавлением pEg2-(his)6 в смесь полимеризации, то нуклеация МТ на центросоме была практически нормальной Скорость роста МТ в присутствии рЕ§2-(1ш)6 в растворе оказалась ниже, чем в контроле, и составила около 0 9 мкм/мин.

В присутствие №ег-рЕ§2 МТ формировали пучки вокруг центросом, которые заметно истончались по направлению к плюс концу МТ (в направлении от центросом) и концы этих пучков (2.5-3 мкм) содержали отдельные МТ Средняя длина МТ после 5 мин инкубации при 37 °С составила 12.3 мкм. Таким образом, скорость удлинения была около 2.5 мкм/мин

Наблюдения сделанные с помощью видеомикроскопии полностью потвердили выводы, сделанные ранее на основании изучения фиксированных образцов с помощью ИФ и ЭМ. Кроме того, был обнаружен важный факт, что если центросомы были преинкубированы с тубулином до киназы, то её ингибирующее нуклеацию МТ действие исчезало. Это наблюдение показало, что киназа может взаимодействовать только со свободными центрами нуклеации, но не с уже занятыми молекулами тубулина. Возможно, что нуклеация небольшого количества МТ отдельными центросомами в присутствие киназы является результатом конкуренции за место связывания между тубулином и киназой.

3.6.7. Иммуно-ЭМ исследование взаимодействия pEg2 с центросомами и МТ.

Иммуно-ЭМ исследование центросом после их инкубации с pEg2-(his)6 выявило этот белок в перицентриолярном материале и, частично, непосредственно на ценгриолярных цилиндрах. Аналогично тому, что было показано ранее при ИФ исследовании, очень небольшое количество МТ отходило от центросом Важно отметить, это мечение часто обнаруживалось вблизи минус концов МТ, связанных с перицентриолярным материалом. В этих случаях, была видна менее электронноплотная, чем перицентриолярный материал сферическая аморфная структура диаметром около 50 нм. С одной стороны, эта структура была связана с перицентриолярном материалом, а с другой стороны к ней примыкал минус конец МТ. На свободных, не связанных с центросомой МТ белок pEg2 был найден около их концов. В этом случае сходного размера и электронной платности сферические структуры был обнаружены вблизи концов МТ.

В присутствии Nt-pEg2-(his)6 перицентриолярный материал был существенно менее элекгронноплотным и содержал небольшое количество этого рекомбинантного белка. Часть, выявляемого иммуно-мечением вблизи центросомы Nt-pEg2-(his)6, была ассоциирована не с перицентриолярным материалом, а с МТ и пучками МТ. Вместе с тем, также как и для pEg2-(his)6, иногда мечение было найдено непосредственно на центриолярных цилиндрах.

Иммуно-ЭМ исследование показало, что Nt-pEg2-(his)6 обнаруживается как на концах пучков МТ, так и на их латеральных поверхностях. Иногда несколько пучков были обнаружены расходящимися из Nt-pEg2-(his)6 содержащих фокусов. Анализ распределения Nt-pEg2-(his)6 позволяет предположить, что инициация образования пучков может быть связана с латеральным взаимодействием МТ, опосредованным Nt-pEg2-(his)6 Возможно, происхождение некоторых пучков связано с одновременным ростом нескольких МТ из одного фокуса, а другие МТ пучки могут образовываться за счет защищенного от деполимеризации, вследствие взаимодействия с Nt-pEg2-(his)6, роста новых МТ вдоль ранее полимеризованных. Ранее Giet и Prigent (2001) предположили, что N-терминальный домен Аврора А киназы может взаимодействовать с МТ через какие-либо МТ-ассоциированные белки В

настоящей работе было показано, что Т^-терминалъньтй домен может непосредственно взаимодействовать с МТ без участия других белков

3.6.8. Эффект супер-экспрессии pEg2 киназы на систему МТ в ХЬ2 клетках.

Клетки линии ХЬ2 были трансфецированы несколькими различными конструкциями, зафиксированы и использованы для ИФ анализа системы МТ с помощью АТ к альфа-тубулину В контрольных экспериментах была сделана трансфекция вектора или вектора с СП5 В обоих сучаях не было отмечено каких-либо изменений в системе МТ. Диффузное распределение вЕР в цитоплазме было показано для клеток трансфецированных вектором с ОРР В клетках трансфецированных ОРР-рЕ§2 было показано накопление этого химерного белка, как в цитоплазме, так и, особенно, в области центросомы Несмотря на то, что концентрация ОРР-рЕ§2 в области центросомы была велика, увеличенного количества МТ в этом районе не наблюдалось. Напротив, в тех районах цитоплазмы вне центросомы, где была высокая концентрация ОЕР-рЕд2, выявлялась аномально высокая плотность МТ В митотических клетках с высоким уровнем экспрессии химерного белка СРР-рЕд2 этот белок был найден ассоциированным с митотическим веретеном В таких веретенах центросомы были не разделены, и веретено было монополярным. Значительное количество клеток с 2 и большим количеством ядер было обнаружено в популяции клеток после трансфекции СРР-рЕд2. Вероятно, это было результатом нарушения формирования нормального митотического веретена и последующего неполного разделения клеток. В клетках, трансфецированных только с СЕР или с вектором такого повышения доли двуядерных клеток отмечено не было.

В конечном счете, все описанные в настоящей главе эффекты можно объяснить взаимодействием pEg2 с тремя белками семейства тубулинов Когда pEg2 взаимодействует с гамма-тубулином - это приводит к подавлению активности содержащих гамма-тубулин центросомальных центров нуклеации МТ. В том случае, когда pEg2 взаимодействует с альфа-тубулином в растворе, это приводит к стабилизации олигомеров тубулина затравки, что защищает минус конец от деполимеризации и, таким образом, способствует росту МТ Наконец, по-видимому, хотя и с меньшей аффинностью, может

взаимодействовать с бета-тубулином, те с той частью димеров тубулина, которые располагаются на плюс концах МТ Как показали прямые наблюдения за удлинением плюс концов МТ в присутствие киназы, скорость их роста была несколько ниже, чем в контроле Одновременно не наблюдалось «катастроф», т е плюс-концы были также защищены взаимодействием с рЕ§2 от деполимеризации.

4. ВЫВОДЫ.

1. Инактивация УФ микрооблучением одного из полюсов в ранней метафазе приводит в клетках СПЭВ к смещению всех хромосом к необлученному полюсу Это свидетельствует в пользу того, что равноудаленное от полюсов веретена положение хромосом поддерживается за счет сил натяжения, передающихся через МТ.

2. УФ микрооблучение одного из полюсов веретена деления в анафазе в культивируемых клетках СПЭВ замедляет движение хромосом к облученному полюсу, но не препятствует завершению клеточного деления и реконструкции ядер в дочерних клетках. Облученная в анафазе центросома при переходе клетки в интерфазу не способна формировать нормальную радиальную систему МТ и образовывать первичную ресничку.

3. В клетках с облученной в анафазе центросомой нарушена структура ядрышек и снижен общий уровень синтеза РНК Это, вероятно, связано с деструкцией УФ аккумулированного в митозе в районе центросомы белка В23 - одного из основных белков ядрышка.

4 Центросома в интерфазных клетках, в которых она в анафазе митоза была облучена УФ, не реплицируется, а сами эти клетки выходят из клеточного цикла, не вступая в S-фазу.

5. В клетке существует два пула связанного с центросомой гамма-тубулина конститутивный гамма-тубулин, который связан с центриолями вне зависимости от стадии клеточного цикла и гамма-тубулин лабильно ассоциированный с центросомой и увеличивающий ее способность нуклеировать МТ.

6 Количество связанной с центросомой серин-треониновой протеинкиназы pEg2 семейства Аврора А в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) зависит от стадии клеточного цикла. Белок pEg2 появляется в центросоме в конце S-фазы клеточного цикла, его количество достигает максимума в митозе, а через 1 ч после митоза он уже не детектируется Исчезновение белка pEg2 из центросомы после митоза связано с его убиквитин-зависимой деградацией, а не перераспределением в другие части клетки.

7. Кинезиноподобный белок XlEg5 появляется между содержащими pEg2 центросомами в момент начала их разделения в конце интерфазы. Количество XIEg5 в клетках XL2, также как и pEg2, достигает максимума в 02-фазе и митозе. Белки XlEg5 и pEg2 взаимодействуют in vitro и т vivo, XlEg5 является одним из субстратов фосфорилирования для протеинкиназы pEg2. Взаимодействие XlEg5 и pEg2, вероятно, необходимо для расхождения центросом.

8. Процесс расхождения центросом перед митозом происходит в две стадии: разделение центросом и собственно расхождение центросом. Разделение центросом зависит и от МТ и от актиновых филаментов, а расхождение центросом при разрушении актиновых филаментов резко замедляется, а при деполимеризации МТ, напротив, облегчается.

9. Ингибирование расхождения центросом при разрушении актиновых филаментов приводит к увеличению продолжительности профазы и прометафазы, в течение которых формируется веретено нормального размера. Время между моментом распада ядерной оболочки и началом анафазного движения хромосом не изменяется за счет существенного сокращения продолжительности метафазы.

10 В митотичесикх клетках разделение и расхождение центросом происходит и при отсутствии МТ и актиновых филаментов, что показывает наличие дополнительной движущей силы этих процессов.

11 Белок pEg2 вызывает независимо от своей киназной активности стимуляцию полимеризации МТ в разбавленных растворах тубулина, в которых спонтанная самосборка МТ незначительна. Для инициации сборки МТ необходим N-концевой домен этого белка.

12. С-терминальный домен белка pEg2 служит для его связывания с центросомой, и такое взаимодействие подавляет способность центросомы нуклеировать МТ in vitro.

Список научных статей опубликованных по теме диссертации:

1. Узбеков Р.Э., Воробьев И А Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 1 Микрооблучение в метафазе дезорганизация веретена и блок клеточного деления. // Цитология 1991. Т. 33, N 2, С. 15-22

2 Узбеков Р Э., Воробьев И А. Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 2. Микрооблучение в анафазе- завершение клеточного деления и судьба интерфазных клеток. // Цитология. 1991. Т. 33, N 10, С. 7984.

3. Узбеков Р.Э, Воробьев И А Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток 3. Ультраструктура центросомы после ультрафиолетового микрооблучения.//Цитология. 1992 Т 34. N2. С. 62-67.

4. Uzbekov R.E., Votchal M.S., and Vorobjev IA Role of the centrosome in mitosis' UV microirradiation study // J Photochem Photobiol (ser. B). 1995. V 29 P. 163-170.

5 Uzbekov RE, and I.A. Vorobjev Behaviour of the mitotic apparatus after ultraviolet microirradiation of the spindle pole // Biophysics 1996 V. 41. N 1. P 161-166.

6. Неверова A.JI., Узбеков P Э., Вотчст M С., Воробьев И. А Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток 4 Синтетическая активность, распластывание и рост клеток с облученной центросомой // Цитология. 1996. Т. 38. N 2. С. 145-154

7 Komarova Yu.A., Ryabov Е.А., Alieva IB., Uzbekov R.E., Uzbekova S.V., and Vorobjev I.A.. Polyclonal antibodies against human gamma-tubulin stain centrioles in mammalian cells from different tissues. // Membr Cell Biol. 1997 V. 10. N5. P. 503-513. -----

ifOC. НАЦИОНАЛЬНАЯ библиотека

С.<1ет*р«ург 1 OS МО акт

8. Roghi С., Giet R, Uzbekov R., Morin N.. Chartram I., Le Guellec R., Couturier A., Doree M., Philippe M, and Prigent C. The Xenopus Protein Kinase pEg2 Associated with the Centrosome in the Cell Cycle-Dependent Manner, Bind to the Spindle Microtubules and is involved in Bipolar Mitotic Spindle Assembly // J Cell Sci 1998. V 111 P. 557-572

9. Uzbekov R., Chartram I, Philippe M and Arlot -Bonnemains Y Cell cycle analysis and conditions of synchronisation of Xenopus cell culture line XL-2. // Exp Cell Res. 1998. V 242. P. 60-68.

10 Uzbekov R.E., Arlot-Bonnemains Y., Chartram /., and Philippe M Kinetic analysis of cell population growth in process of cultivation in vitro. // Membr. Cell Biol. 1999 V. 12. N6. P. 773-782.

11. Neverova A.L., R.E Uzbekov, M.S. Votchal, О V. Zatsepina, and Vorobjev I A. Postmitotic reconstruction of nucleoli in culture cells with UV-microbeam photoinactivated centrosome //Membr Cell Biol. 1999. V. 12 N6 P. 805-815.

12. Uzbekov R., Prigent C., and Arlot-Bonnemams Y. Cell Cycle Analysis and Synchronisation of the Xenopus laevis XL2 Cell Line: Study of the Kinesin Related Protein XlEg5 // Micr. Res. Tech 1999. V. 45 P. 31-42.

13. Giet R, Uzbekov R., Cubizolles F., Le Guellec K., and Prigent C. The Xenopus laevis aurora-related protein kinase pEg2 associates with and phosphorylates the kinesin-relatedproteinXlEg5 Hi Biol. Chem 1999. V 274. P. 15005-15013.

14. Giet R, Uzbekov R, Kireev /., and Prigent C. The Xenopus laevis centrosome aurora-related kinase. //Biol. Cell. 1999. V. 91. P. 461-470

15. Vorobjev I A., Uzbekov R.E., Komarova Yu.A , Alieval B. The content of gamma-tubulin in interphase and mitotic cells after stabilization and after depolymerization of microtubules.//Membr Cell Biol. 2000 V. 14 N 2. P 219235.

16. Arlot-Bonnemains Y., Klotzbucher A., Giet R., Uzbekov R., BihcmR., and Prigent C. Identification of a functional destruction box in the Xenopus laevis aurora-A kinase pEg2. //FEBS Letters. 2001. V. 508. N 1. P. 149-152.

17. Uzbekov R., Kireev I., and Prigent C. Centrosome separation: respective role of microtubules and actin filaments // Biol. Cell. 2002. V. 94. N 4-5. P. 275-288.

18. Uzbekov R, Timirbulatova E., Watrin E., Cubizolles F, Ogereau D., Gulak P., Legagneux V. , Polyakov VJu., Le Guellec К and Kireev I. Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. //J. Cell Sci 2003. V. 116. P. 1667-1678.

19. Узбеков P Э. Исследование сравнительного уровня экспрессии белков в синхронизованных на различных стадиях клеточного цикла клетках XL2 // Цитология 2004. Т 46 N 3 С. 249-256

20. Узбеков Р Э. Анализ клеточного цикла и методика исследования динамики уровня экспрессии белков на его различных фазах с использованием синхронизованных клеток //Биохимия 2004. Т. 69. N5. Р 597-611.

21. Uzbekov R.E., Arlot-Bonnemains Y, Arnal I, Prigent C., Chretien D Xenopus laevis Aurora A kinase pEg2 interacts with MTs and centrosomes in vitro and changes dynamics of MT polymerization. 'Biol Cell. 2004. V P.

По материалам диссертации было также сделано 6 докладов на Всесоюзных и Всероссийских научных конференциях и 21 доклад на международных научных конференциях, тезисы которых опубликованы в научных журналах (12 докладов) или специальных сборниках (15 докладов)

Структура и объём диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, описания методов исследования, 6 глав результатов, заключения, выводов, листа благодарностей, библиографического списка включающего наименований. Работа изложена на 388 листах машинописного текста, содержит 444 фотографии, 28 графиков, 39 схем и рисунков, объединенных в 123 монтажа, 7 таблиц.

9315

РНБ Русский фонд

2005-4 14589

Подписано в печать 12.07.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1 5 п.л Тираж 120 экз. Заказ № 112 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Узбеков, Рустем Эдуардович

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Строение центросомы и ассоциированных с ней структур

2.1.1. Центросома на светооптическом уровне

2.1.2. Ультраструктура центриолярных цилиндров

2.1.3. Перицентриолярные сателлиты

2.1.4. Центриолярные придатки

2.1.5. Полярность центриоли

2.1.6. Различия в строении материнской и дочерней центриолей

2.1.7. Перицентриолярный материал и связь между центриолями в клетке

2.1.8. Первичная ресничка

2.1.9. Исчерченные корешки

2.1.10. Другие структуры в составе интерфазной центросомы

2.1.11. Строение центросомы в митотических клетках

2.2. Механизмы и регуляция образования центриолей в клетках

2.2.1. Механизмы образования центриолей------------------:

2.2.2. Формирование de novo центриолярных цилиндров центросом и базальных телец

2.2.3. Дупликация центриолей вблизи уже существующих в клетке центриолярных цилиндров

2.2.4. Соотношение центриолярного и клеточного циклов

2.2.5. Регуляция центросомального цикла

2.2.6. Поддержание центросомой центрального положения в клетке ~

2.3. Система микротрубочек в клетке и роль центросомы в её организации

2.3.1. Структура, динамические свойства микротрубочек и факторы влияющие на их гетерогенность в клетке

2.3.2. Гетерогенность изоформ альфа- и бета-тубулина, входящих в состав микротрубочек

2.3.3 Посттрансляционные изменения тубулинов —

2.3.4. Микротрубочко-ассоциированные белки

2.3.5. Факторы, участвующие в нуклеации микротрубочек

2.3.6. Нуклеация микротрубочек на центросоме

2.4. Центросома — мультибелковый ко млеке

2.4.1. Новые белки тубулинового семейства

2.4.2. Нинеин

2.4.3. Белок Сер 110

2.4.4. Центрин

2.4.5. Ценексин —

2.4.6. Перицентрин

2.4.7. РСМ-белки

2.4.8. Белки СР60 и СР190.

2.4.9. Молекулярные шапероны.

2.4.10. Тектины.

2.4.11. Катанин

2.4.12. Центросомин

2.4.13. Белок ИиМА

2.4.14. Роль фосфорилирования в регуляции функциональной активности центросомы

2.4.15. Ассоциированные с МТ белки-моторы и их участие в процессе формирования митотического веретена

Цель и задачи работы

3.МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ

Принятые сокращения

3.1. Биологические материалы

3.2. Химические реактивы

3.3. Прижизненные наблюдения за клетками

3.4. Ультрафиолетовое микрооблучение клеток

3.5. Антитела

3.6. Иммунофлуоресцентное исследование клеток

3.7. Авторадиографическое исследование клеток

3.8. Электронная микроскопия

3.8.1. Иммуно-электронная микроскопия

3.8.2. Негативное контрастирование препаратов для ЭМ

3.8.3. Крио-электронная микроскопия

3.9. Синхронизация клеток

3.10. Электрофорез и иммуноблоттинг белков

3.11 Афинная хроматография

3.12. Очисткатубулина

3.13. Выделение центросом из клеток КЕ37

3.14 Полимеризация МТ in vitro

3.15 Исследование киназной активности белков

3.16. Дифференциальная интерференционная микроскопия

3.17. Трансфекция клеток pEg2(GFP)

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Исследование роли центросомы в клетке с помощью ультрафиолетового микрооблучения

4.1.1. Нормальный митоз в клетках СПЭВ

4.1.2. Контрольное микрооблучение

4.1.3. Облучение центросомы в ранней метафазе

4.1.4. Облучение центросомы в поздней метафазе

4.1.5. Облучение центросомы в анафазе: поведение центросом, веретена, и хромосом; выход клеток в интерфазу

4.1.6. Интерфазные клетки с облученной центросомой: формирование ядра и рост клеток

4.1.7. Система МТ и ультраструктура центросом в интерфазных клетках с облученным в анафазе полюсом веретена

4.1.8. Влияние микрооблучения центросомы на внутриклеточный транспорт

4.1.9. Синтетическая активность и продвижение по клеточному циклу клеток с облученной центросомой

4.1.10. Влияние микрооблучения центросомы на её способность к репликации

4.1.11. Формирование ядрышек и накопление в них белка В23 в клетках с облученной в анафазе центросомой

Введение Диссертация по биологии, на тему "Динамика функциональной активности центросомы в клеточном цикле"

Центросома и входящие в её состав центриоли, несомненно, являются наиболее удивительными компонентами эукариотической клетки, В ходе эволюционного развития центриоли появились у древних одноклеточных жгутиконосцев в виде базального тельца жгутика.Поразительная геометрически правильная пространственная организация, сочетающая в себе симметрию девятого порядка в поперечном направлении и полярность организации в продольном направлении, делает центриоль уникальным компонентом клетки, по степени упорядоченности расположения макромолекул, дающей основание сравнивать ее с вирусами. Функция формирования жгутика или реснички сохраняется у центриолей и в многоклеточных организмах — в клетках ресничного эпителия и в сперматозоидах. Однако в ходе эволюционного развития центриоли приобрели и другие важные для клетки функции. Этому способствовало то, что центры нуклеации МТ, расположенные на центриолях нуклеировали не только МТ ресничек, но и цитоплазматические МТ. Очевидное преимущество протекания многокомпонентных биохимЕгческих реакций на плоскости по сравнению с реакциями в объеме клетки привело в ходе эволюции к развитию сложно организованных мембранных органелл. Однако еще более термодинамически выгодно, если такие реакции происходят не на плоскости, а «в точке». Такой особой точкой в клетке в ходе эволюционного развития и стала центросома. Именно в центросоме концентрируются и взаимодействуют друг с другом многие регуляторные молекулы. Еще до того как при делении происходит разделение поровну между дочерними клетками хромосом и, тем более, до начала разделения цитоплазмы, в клетке образуются вместо одного центра два — центросома удваивается. Начало этого удвоения закладывается в инициации дупликации центриолей ещё в конце Gi-фазы клеточного цикла, что может служить первым морфологическим проявлением подготовки клетки к последующему митозу, В митозе две центросомы, включающие в себя 4 центриоли, участвуют в построении веретена деления. Также как и в жгутике, структурную основу веретена деления составляют МТ — еще более древние, чем центриоли, «живые полимеры», которые встречаются во всех эукариотических клетках.Все функции центросомы так или иначе связаны с организацией МТ. При образовании жгутика его МТ, кроме двух центральных, являются продолжением МТ центриолярного цилиндра. В веретене деления МТ или непосредственно нуклеируются в окружающем центриоли митотическом гало, или транспортируются туда моторными белками. Многие регуляторные молекулы, концентрирующиеся в районе центросомы, таюке доставляются туда по радиальной системе МТ интерфазных клеток.Таким образом, термин «центр организации МТ» (ЦОМТ) достаточно точно определяет центросому. Эти термины не вполне идентичны: в клетках могут быть ЦОМТ не совпадающие с центросомой, например в клетках ресничного эпителия базальные тельца ресничек являются ЦОМТ, но не являются центросомами. Во многих типах дифференцированных клеток центросомы уже не являются ЦОМТ, И в составе центриолей, и в веретене деления, и в жгутиках и ресничках, и в цитоплазме интерфазных клеток МТ имеют практически одинаковое строение. Не отличается, в целом, строение МТ и организмах различных таксономических групп, несмотря на существенные различия в аминокислотной последовательности составляющих их белков альфа и бета тубулинов. функция центриолей в клеточном делении не так очевидна, как в процессе инициации роста жгутика или реснички. В этом слз^ае МТ веретена не являются продолжением МТ центриолей, а растут от центров нуклеации, расположенных в окружающем центриоли митотическом гало.Кроме того, центриолей нет в полюсах веретена у высших растений, дрожжей и в полюсах мейотического веретена у многих организмов, в полюсах митотического веретена которых центриоли всегда имеются. Тем не менее бесцентриолярные полюса веретена деления содержат те же основные белки, необходимые для нуклеации МТ. Процесс формирования веретена в большой степени зависит от активности внутриклеточных белков-моторов, которые «фокусируют» минус-концы МТ и белка NuMA, который скрепляет эти концы МТ между собой. Такие искусственные веретена могут быть собраны без участия центросом. Однако в живой клетке в митозе две центросомы всегда выступают в качестве доминантных ЦОМТ, что обеспечивает формирование биполярного веретена и равномерное распределение генетического материала в две дочерних клетки.В предлагаемом далее обзоре литературы рассматриваются история изучения и современное представление о различных морфологических составляющих центросомы, способах удвоения этой клеточной органеллы, а также биохимические свойства, составляющих структурную основу центриолей, МТ и функциональный анализ, входящих в состав центросомы белков.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Узбеков, Рустем Эдуардович

5. ВЫВОДЫ.

1. Инактивация УФ микрооблучением одного из полюсов в ранней метафазе приводит в клетках СПЭВ к смещению всех хромосом к необлученному полюсу. Это свидетельствует в пользу того, что равноудаленное от полюсов веретена положение хромосом поддерживается за счет сил натяжения, передающихся через МТ.

2. УФ микрооблучение одного из полюсов веретена деления в анафазе в культивируемых клетках СПЭВ замедляет движение хромосом к облученному полюсу, но не препятствует завершению клеточного деления и реконструкции ядер в дочерних клетках. Облученная в анафазе центросома при переходе клетки в интерфазу не способна формировать нормальную радиальную систему МТ и образовывать первичную ресничку.

3. В клетках с облученной в анафазе центросомой нарушена структура ядрышек и снижен общий уровень синтеза РНК. Это, вероятно, связано с деструкцией УФ аккумулированного в митозе в районе центросомы белка В23 - одного из основных белков ядрышка.

4. Центросома в интерфазных клетках, в которых она в анафазе митоза была облучена УФ, не реплицируется, а сами эти клетки выходят из клеточного цикла, не вступая в Б-фазу.

5. В клетке существует два пула связанного с центросомой гамма-тубулина: конститутивный гамма-тубулин, который связан с центриолями вне зависимости от стадии клеточного цикла и гамма-тубулин лабильно* ассоциированный с центросомой и увеличивающий ее способность нуклеировать МТ.

6. Количество связанной с центросомой серин-треониновой протеинкиназы рЕ§2 семейства Аврора А в клетках линии ХЬ2 (Хепорш 1аеугя) зависит от стадии клеточного цикла. Белок pEg2 появляется в центросоме в конце Б-фазы клеточного цикла; его количество достигает максимума в митозе, а через 1 ч после митоза он уже не детектируется. Исчезновение белка pEg2 из центросомы после митоза связано с его убиквитин-зависимой деградацией, а не перераспределением в другие части клетки.

7. Кинезиноподобный белок XlEg5 появляется между содержащими pEg2 центросомами в момент начала их разделения в конце интерфазы. Количество XlEg5 в клетках XL2, также как и pEg2, достигает максимума в 02-фазе и митозе. Белки XlEg5 и pEg2 взаимодействуют in vitro и in vivo, XlEg5 является одним из субстратов фосфорилирования для протеинкиназы pEg2. Взаимодействие XlEg5 и pEg2, вероятно, необходимо для расхождения центросом.

8. Процесс расхождения центросом перед митозом происходит в две стадии: разделение центросом и собственно расхождение центросом. Разделение центросом зависит и от МТ и от актиновых филаментов, а расхождение центросом при разрушении актиновых филаментов резко замедляется, а при деполимеризации МТ, напротив, облегчается.

9. Ингибирование расхождения центросом при разрушении актиновых филаментов приводит к увеличению продолжительности профазы и прометафазы, в течение которых формируется веретено нормального размера. Время между моментом распада ядерной оболочки и началом анафазного движения хромосом не изменяется за счет существенного сокращения продолжительности метафазы.

10. В митотических клетках разделение и расхождение центросом происходит и при отсутствии МТ и актиновых филаментов, что показывает наличие дополнительной движущей силы этих процессов.

11. Белок pEg2 вызывает независимо от своей киназной активности стимуляцию полимеризации МТ в разбавленных растворах тубулина, в которых спонтанная самосборка МТ незначительна. Для инициации сборки МТ необходим N-концевой домен этого белка.

12. С-терминальный домен белка pEg2 служит для его связывания с центросомой, и такое взаимодействие подавляет способность центросомы нуклеировать МТ in vitro.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Уникальная центрально-симметричная структура порождала у многих исследователей поразительные, а порой и фантастические гипотезы о функции центросомы в клетке.

История исследования центросомы показала, что категоричность утверждений опровергалась сюрпризами, преподносимыми периодически этой клеточной органеллой, которую Wheatley (1982) назвал центральной загадкой клеточной биологии.

К началу 70-ых годов XX века описание ультраструктуры центросом и базальных телец было в целом завершено (обзоры: Brinkley, Stubblefield 1970; Fulton 1971). Последующие исследования добавили лишь некоторые небольшие детали, в большинстве своём характерные лишь для отдельных типов клеток. Однако функция центросомы в клетке так и оставалась загадочной. Несколько экспериментальных подходов были использованы для исследования центросомы — это, в первую очередь, исследование с помощью специфических антител белкового состава этой органеллы, и разработка методов выделения центросом, что внесло большой вклад в получение знаний о её биохимическом составе. В результате применения этих двух подходов было показано, что в состав центросомы входит множество важных для клетки белков, имеющих как структурную, так и регуляторную функцию.

Бурное развитие новых экспериментальных подходов приводит к возможности исследовать центросому с новых, пока неизвестных, сторон. В настоящее время наука о центросоме настолько разрослась, что появились целые отдельные направления исследований, посвященные участию центросомы в каком-то одном аспекте жизнедеятельности клетки: в организации системы интерфазных микротрубочек, в поддержании и изменении формы клетки, в образовании клеточной полярности, в регуляции внутриклеточного транспорта, в формировании мультибелковых ансамблей, ответственных за регуляцию клеточного цикла, в осуществлении равномерного распределения хромосом в митозе и мейозе, в процессе формирования ресничек и жгутиков и в других клеточных процессах.

Такое многообразное участие центросомы и связанных с нею структур в жизнедеятельности клетки, естественно, приводит к тому, что нарушение нормального функционирования центросомы может иметь фатальные последствия, как для индивидуальной клетки, так и для организма в целом. Ещё Boveri (1914) предполагал, что нарушение расхождения центросом может приводить через неправильное разделение хромосом к злокачественному перерождению клеток. Эта гениальная догадка нашла своё подтверждение во множестве современных исследований. Гиперэкспрессия некоторых центросомальных белков приводила к нарушению деления с одной стороны, и, с другой стороны, в раковых клетках обнаруживалось увеличение синтеза центросомальных белков. В частности, во многих злокачественных клетках в настоящее время обнаружена гиперэкспрессия одного из ключевых регуляторных центросомальных белков - киназы Аврора А, что приводит к неправильному расхождению центросом в митозе, анеуплоидии и малигнизации клеток.

К настоящему времени описано уже более 150 центросомальных белков, но процесс изучения характера их взаимодействия друг с другом ещё только начинается. На наших глазах мозаичность знаний о центросоме сменяется структурированностью, обнаруживаются функциональные связи между различными центросомальными белками. Мощный арсенал молекулярно-биологических и генетических методов, в сочетании с детальным изучением морфологии позволяет накапливать огромное количество новых фактов, обработка и анализ которых становится невозможным без современных информационных технологий. Примечательно, что чем больше мы узнаём о центросоме, тем более важная роль в клетке ей отводится. Поэтому не будет преувеличением сказать, что понимание регуляторных функций мультибелкового комплекса, каким является центросома, видимо уже в недалеком будущем приведет к более глубокому проникновению в тайны организации живой материи.

7. БЛАГОДАРНОСТИ.

Я выражаю свою искреннюю благодарность профессору Юрию Сергеевичу Ченцову, чьи ценные замечания существенно помогли при выполнении и подготовке к защите настоящей работы.

Я благодарен профессору Владимиру Юрьевичу Полякову, чью поддержку я постоянно чувствовал, где бы я ни находился.

Обсуждение результатов настоящей работы с Проф. И.А. Воробьёвым, Prof. M. Philippe, Dr. С. Prigent, Dr. Arlot-Bonnemains, Проф. O.B. Зацепиной, Prof. M. Bornens, Prof. K. Le Guellec, д.б.н. E.C Надеждиной, Dr. R. Giet, д.б.н. И.Б. Алиевой, к.б.н. И.И. Киреевым, к.б.н. Г.А. Журавлевой, Dr. D. Chretien, Dr. I. Arnal и многими другими моими коллегами помогло мне в критическом осмыслении полученных данных. Я хотел бы поблагодарить всех моих коллег и друзей в отделе к

Электронной микроскопии НИИ им. А.Н. Белозерского, в группах «Структура и Динамика Цитоскелета» лаборатории CNRS UMR 6026

Франция) и «Клеточный цикл» в лаборатории CNRS UMR 6061 (Франция) за многолетнее плодотворное сотрудничество.

Благодарю всех соавторов моих публикаций, как по теме диссертации, так и по другим направлениям моей научной работы. Не меньшую благодарность мне хотелось бы выразить анонимным рецензентам всех моих статей.

Не в последнюю очередь то, что работа была завершена несомненная заслуга всей моей семьи - моего папы Э.И. Узбекова, жены C.B. Узбековой, брата Н.Э. Узбекова и дочерей Ольги и Алисы.

Отдельно хочу поблагодарить за помощь в работе с первоисточниками на немецком языке Е.В. Башкову и на французском языке C.B. Узбекову.

Нельзя не отметить и библиотекарей Медицинского факультета Университета г. Ренн H. De Villemeur и научного центра Нузийи H. Bosc и M-L. Touze за неоценимую помощь в получении научной литературы, особенно научных работ 19 века и начала-середины 20 века.

Эта работа в разное время была поддержана грантами РФФИ, Международного Научного фонда, ARC (Association pour la Recherche contre Cancer, France), Rennes Metropole, FRM (Fondation pour la Recherche Médicale).

Кроме того, для выполнения исследований я получал финансовую поддержку от Национального Центра Научных Исследований Франции (CNRS, France), Национального Института Агрономических Исследований (INRA, France), которые финансировали мою работу в качестве приглашенного исследователя и Университета города Ренн, который финансировал мою работу в качестве приглашенного профессора.

8. СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. (1991) Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 1. Микрооблучение в метафазе: дезорганизация веретена и блок клеточного деления. Цитология, Т. 33, N2, с. 15-22.

2. Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. (1991) Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. Цитология, Т. 33, N 9, с. 104-105.

3. Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. (1991) Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 2. Микрооблучение в анафазе: завершение клеточного деления и судьба интерфазных клеток. Цитология, Т. 33, N 10, с. 79-84.

4. Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. (1992) Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 3. Ультраструктура центросомы после ультрафиолетового микрооблучения. Цитология, Т. 34, N 2, с. 62-67.

5. Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1993) Cell behavior after ultraviolet microirradiation of the centrosome in mitosis. Marburg, Abstr. of 5 Congress of the European Society for Photobiology p 264.

6. Uzbekov R.E., Neverova A.L., and Vorobjev I.A. (1994). Ultrastructure and functional activity of the centrosome after UV microirradiation. Cell Biol Intern. 18, N5, p. 422.

7. Uzbekov R.E, Speranskaya S.R., Neverova A.L., and Vorobjev I.A. (1994). Effects of UV microirradiation of the centrosome on cell behaviour. 9th Annual Meeting of the European Cytoskeleton Forum. Dundee, pi 1.

8. Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1994). Continuation of mitosis after centrosome UV microirradiation. Intern. Symposium on Biological Motility. Puschino, p. 229-230.

9. Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1994). Continuation of mitosis after UV microirradiation of the centrosome. Mol. Biol. Cell V. 5, 414a.

10. Uzbekov R.E., Alieva I.B., and Vorobjev I.A. (1995). Chromosome and centrosome movement after UV microirradiation of mitotic spindle. Eur. J. Cell Biol, Sup. V. p. 195.

11. Uzbekov R.E., Votchal M.S., and Vorobjev I.A. (1995) Role of the centrosome in mitosis: UV microirradiation study J. Photochem. Photobiol. (ser. В) V 29, p 163-170.

12. Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1995). Effects of ultraviolet microirradiation of the centrosome on chromosome movement in mitosis. Abstr. of 6-th Congress of the European Society for Photobiology p 104.

13. Alieva I.B., Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1995). Ultraviolet microirradiation of mitotic tissue cultures cells destructs chromosome and centrosome movement. Abstr. of 6-th Congress of the European Society for Photobiology p 105.

14. Узбеков Р.Э., Воробьев И.A. (1995). Динамика и ультраструктура митотического веретена после УФ микрооблучения в митозе. Цитология, Т. 38, N 2. с. 256.

15. Комарова Ю. А., Рябов Е.А., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В., Алиева И.Б., Воробьёв И.А. (1995). Локализация гамма-тубулина в клетках различных клеточных линий. Цитология, Т. 38, N 2 с. 211.

16. Komarova Yu.A., Е.А. Ryabov, R.E. Uzbekov, I.B. Alieva, S.V. Uzbekova, and I.A. Vorobjev. (1995). Gamma-tubulin is associated with centrioles rather than microtubule organizing centers. Mol. Biol. Cell, V.6, 39a.

17. Узбеков Р.Э., Воробьев И.A. (1996). Поведение митотического аппарата после ультрафиолетового микрооблучения полюса веретена. Биофизика, Т.41, N 1, 153-158.

Uzbekov R.E., and I.A. Vorobjev. (1996) Behaviour of the mitotic apparatus after ultraviolet microirradiation of the spindle pole. Biophysics, V. 41, N lpp. 161-166.

18. Неверова A.JI., Узбеков Р.Э., Вотчал M.C., Воробьев И.А. (1996) Влияние УФ микрооблучения центросомы на поведение клеток. 4. Синтетическая активность, распластывание и рост клеток с облученной центросомой. Цитология, Т. 38, N 2, с. 145-154.

19. Комарова Ю. А., Рябов Е.А., Алиева И.Б., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В., Воробьёв И.А. (1996) Локализация гамма-тубулина в клетках различных клеточных линий. Биол. Мембр. Т. 13, N 5 с. 468-475. Komarova Yu.A., Е.А. Ryabov, I.B. Alieva, R.E. Uzbekov, S.V. Uzbekova, and I.A. Vorobjev. (1997) Polyclonal antibodies against human gamma-tubulin stain centrioles in mammalian cells from different tissues, Membr. Cell Biol, V. 10 (5),pp 503-513.

20. Alieva I.B., Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1996) Effect of ultraviolet microirradiation on mitotic cells., Int. Meeting on UV/Blue Light., Philipps University, Marburg, p.86.

21. Neverova A.L., Uzbekov R.E. and Vorobjev I.A. (1996) UV-microirradiation of the centrosome: distant cell events. Int. Meeting on UV/Blue Light., Philipps University, Marburg, p.96.

22. Chernobelskaya A.A., Uzbekov R.E., Vorobjev I.A. (1997) UV microirradiation of microtubule system leads to dramatic changes in character of saltatory granule movements in polarized fibroblasts VERO. Abstr. of 7th Congress of the European Society for Photobiology. Stresa, Italy, 1997, p. 148.

23. Neverova A.L., Uzbekov R.E., Vorobjev I.A. (1997) Centrosome photoinactivation results in changes of spreading and granules saltatory movements. Abstr. of 7th Congress of the European Society for Photobiology. Stresa, Italy, p. 115.

24. Uzbekov R.E., Neverova A.L., Votchal M.S., Zatscpina O.V., Vorobjev

I.A. (1997) Postmitotical reconstruction of nucleoli in culture cells with photoinactivation centrosome. Abstr. of 7th Congress of the European Society for Photobiology. Stresa, Italy, p. 118.

25. Узбеков Р.Э., Арлё-Бонпемэ Я., Шартраи И., н Филипп М. (1998) Кинетический анализ роста клеточной популяции в процессе культивирования in vitro. Биол. Мембр., Т. 15, N 6, с. 614-622. Uzbekov R.E., Arlot-Bonnemains У., Chartrain I., and Philippe M. (1999) Kinetic analysis of cell population growth in process of cultivation in vitro. Membr. Cell Biol V. 12 N 6, p. 773-782.

26. Неверова АЛ., Узбеков Р.Э., Вотчал M.C., Зацепина О.В., Воробьев И.А. (1998) Постмитотическая реконструкция ядрышек в клетках с центросомой фотоинактивированной УФ микрооблучением. Биол. Мембр., Т. 15 N 6, с. 639-647.

Neverova A.L., R.E Uzbekov, M.S. Votchal, O.V. Zatsepina, and Vorobjev I.A. (1999) Postmitotic reconstruction of nucleoli in culture cells with UV-microbeam photoinactivated centrosome. Membr. Cell Biol V 12(6), p. 805-815.

27. Roghi C., Giet R., Uzbekov R., Morin N., Chartrain I., Le Guellec R., Couturier A., Doree M., Philippe M., and Prigent C. (1998) The Xenopus Protein Kinase pEg2 Associated with the Centrosome in the Cell Cycle-Dependent Manner, Bind to the Spindle Microtubules and is involved in Bipolar Mitotic Spindle Assembly. J. Cell Sci. V.lll, p. 557-572.

28. Uzbekov R., Chartrain I., Philippe M and Arlot-Bonnemains Y. (1998). Cell cycle analysis and conditions of synchronization of Xenopus cell culture line XL-2. Exp. Cell Res. V. 242, p. 60-68.

29. Komarova Yu.A., Alieva I.B., Uzbekov R.E., and Vorobjev I.A. (1998) The content of gamma-tubulin in the centrosome after stabilization and after depolymerization of microtubules. Abstr. ASCB Meeting, Mol. Biol Cell V. 9, p. 11a.

30. Uzbekov R., Prigent C., and Arlot-Bonnemains Y. (1999). Cell Cycle Analysis and Synchronization of the Xenopus laevis XL2 Cell Line: Study of the Kinesin Related Protein XlEg5. Micr. Res Tech. V. 45, p. 31-42.

31. Giet R., Uzbekov R., Cubizolles F., Le Guellec K., and Prigent C. (1999) The Xenopus laevis aurora-related protein kinase pEg2 associates with and phosphorylates the kinesin-related protein XlEg5. J. Biol. Chem, V.274, p. 15005-15013.

32. Arlot-Bonnemains Y., Giet R., Uzbekov R., and Prigent C. (1999) Cell cycle dependant regulation of the kinase pEg2 in Xenopus cells. Abstr. BSCD/BSDB Joint Spring Meeting, Manchester, p.l 13.

33. Giet R., Uzbekov R., Kireev I., and Prigent C. (1999) The Xenopus laevis centrosome aurora-related kinase. Biol Cell, V 91, 461-470.

34. Воробьёв И.А., Узбеков Р.Э., Комарова Ю. А., Алиева И.Б. (2000) Распределение гамма-тубулина в интерфазных и митотических клетках при стабилизации и деполимеризации микротрубочек. Биол. Мембраны, V17N2, р. 173-187.

Vorobjev I.A., Uzbekov R.E., Komarova Yu.A., Alieva I.B. (2000) The content of gamma-tubulin in interphase and mitotic cells after stabilization and after depolymerization of microtubules. Membr Cell Biol., V 14(2), 219235.

35. Узбеков Р.Э., Арлё-Боннема Я. (2001) Изучение уровня экспрессии белков в клеточном цикле на синхронизованных клетках. Цитология, V43 N4 р. 404.

36. Узбеков Р.Э., Арлё-Боннема Я. Жие Р., Прнжон К. (2001) Уровень экспрессии протеинкиназы pEg2 и ее локализация в центросоме зависит от стадии клеточного цикла. Цитология, V43 N4 р.404-405.

37. Узбеков Р.Э., Жие Р., Прижон К. (2001) Центросомальная протеинкиназа pEg2 колокализуется с кинезин-подобным белком XlEg5 и фосфорилирует его в процессе формирования митотического веретена. Цитология, V43 N4 р.405.

38. Arlot-Bonnemains Y., Klotzbucher A., Giet R., Uzbekov R., Prigent C.

2001) The Aurora-Ipl-related kinase pEg2 contains a functional "destruction box". Abstr. ISREC Conference "Cancer and the Cell Cycle", Lausanne, Switzerland, P7.

39. Uzbekov R., Kireev I., and Prigent C. (2001) Centrosome separation: respective role of microtubules and actin filaments. New prophase checkpoint? Abstr. ISREC Conference "Cancer and the Cell Cycle", Lausanne, Switzerland, PI38.

40. Uzbekov R.E., Giet R., Arlot-Bonnemains Y., Prigent C. (2001) Role of pEg2 kinase in mitotic spindle construction process. Biol. Cell, V. 93, p. 337.

41. Arlot-Bonnemains Y., Klotzbucher A., Giet R., Uzbekov R., and Prigent C. (2001) Identification of a functional destruction box in the Xenopus laevis aurora-A kinase pEg2. Abstr. EMBO workshop "G2/M progression and associated checkpoints", Salamanca, Spain, p. 53.

42. Arlot-Bonnemains Y., Klotzbucher A., Giet R., Uzbekov R., Bihan R., and Prigent C. (2001) Identification of a functional destruction box in the Xenopus laevis aurora-A kinase pEg2. FEBS Letters , V. 508 (1) p. 149152.

43. Uzbekov R., Kireev I., and Prigent C. (2002) Centrosome separation: respective role of microtubules and actin filaments. Biol. Cell, 94(4-5), p 275-288.

44. Uzbekov R.E., Arlot-Bonnemains Y., Arnal I., Prigent C., Chretien D.

2002) Aurora A kinase pEg2 increases self-assembly of microtubules and inhibits the nucleation activity of centrosomes in vitro. Abstr. Conference "Rencontres Biologie-Physique du Grand Quest" (RBPGO, Rennes 2002).

45. Uzbekov R., Timirbulatova E., Watrin E., Cubizolles F., Ogereau D., Gulak P., Legagneux V. , Polyakov V.Ju., Le Guellec K. and Kireev I.

2003) Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. J. Cell Sci., V. 116, 1667-1678

46. Узбеков Р.Э. (2004) Исследование сравнительного уровня экспрессии белков в синхронизованных на различных стадиях клеточного цикла клетках XL2. Цитология, Т. 46, N 3, с. 249-256.

47. Узбеков Р.Э. (2004) Анализ клеточного цикла и методика исследования динамики уровня экспрессии белков на его различных фазах с использованием синхронизованных клеток. Биохимия, Т. 69, N 5, с. 597-611.

48. Uzbekov R.E., Arlot-Bonnemains Y., Arnal I., Prigent C., Chretien D.

2004) Xenopus laevis Aurora A kinase pEg2 interacts with MTs and centrosomes in vitro and changes dynamics of MTs polymerization. Biol. Cell, (подготовлена к печати).

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Узбеков, Рустем Эдуардович, Москва

1. Абумуслимов С.С., Надеяедина Е.С., Чепцов Ю.С. (1991) Множественные бесцентрнолярные центры организации микротрубочек в гигантских клетках слюнных желез Chironomus cingulatus. Цитология, 33 (12), 36-40.

2. Алиева И.Б. (1999) Роль центросомы в динамической организации системы микротрубочек в клетке. Автореферат докт. диссертации. МГУ, Москва.

3. Алиева И.Б., Воробьёв И.А. (1988) Нокодазол приводит к инактивации центров организации микротрубочек и появлению областей локальной полимеризации микротрубочек в К-митозе. Биополимеры и клетка, 4(2), 91-100.

4. Воробьев И.А., Драчев В.А., Ченцов Ю.С. (1988) Инактивация центросом в митозе лазерным микрооблучением. Биополимеры и клетка. 4(N6), 313-321.

5. Воробьёв И.А., Надеждина Е.С. (1987) Центриолярный аппарат и его роль в организации микротрубочек. Под редакцией Ю.С. Ченцова Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Общие проблемы физико-химической биологииЛ, 1-164.

6. Воробьёв И.А., Чепцов Ю.С. (1977) Ультраструктура центросомы в клетках гемопоэтических тканей аксолотля. Цитология, 19, 598-603. Воробьёв И.А., Чепцов Ю.С. (1987) Ультраструктура центросомы в L-клетках. Онтогенез, 18(4), 354-359.

7. Зацепина О.В., Желев Н., Джордан Г. (1995) Иммунолокализация ядрышкового белка В23 в центросомах в митозе. Мол. Биол., 29, 13591367.

8. Львов К.М., Асланов Р.Б., Гасымов O.K., Мамедов Ш.В. (1975) Фотообразование радикалов N=CH , НСО в белках после УФ облучения. Биофизика, 20, 763-767.

9. Неверова А.Л., Узбеков Р.Э., Вотчал М.С., Воробьев И.А. (1996) Влияние УФ-микрооблучения центросомы на поведение клеток. IV. Синтетическая активность, распластывание и рост клеток с инактивированной центросомой. Цитология, 38(N 2), 145-154.

10. Сахаров В.Н., Воронкова Л.Н. (1966) О последствиях локального облучения ядрышка живой клетки ультрафиолетовым микролучом. Генетика, 6, 144-148.

11. Сахаров В.Н., Воронкова Л.Н. (1993) Кинетика перехода к синтезу ДНК в клеточном цикле у сестринских клеток линии СПЭВ в культуре. Цитология. 35 ^ 6/7), 79-85.

12. Узбеков Р.Э., Воробьев И.А. (1991 б) Влияние ультрафиолетового микрооблучения центросомы на поведение клеток. 2. Последствия облучения в анафазе: завершение деления и судьба интерфазной клетки. Цитология, 33 ^ 10), 79-84.

13. Adachi Y., Copeland T.D., Hatanaka M. and Oroszian S. (1993) Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I spesifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. J. Biol. Chem., 268, 1393013934.

14. Allen R.D. (1969) The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. J. Cell Biol. 40(3), 716-733.

15. Amos L.A. (1977) Arrangement of high-molecular weight associated proteins on purified mammalian brain microtubules. J. Cell Biol. 72, 642-654. Andersen R.S. (1991) The cytoskeleton of chromophyte algae. Protoplasma, 164, 143-159.

16. Andersen S.S.L. (1999) Molecular Characteristics of the centrosome. Int. Rev Cytology, 187,51- 156.

17. Anderson R. G. (1972) The three-dimensional structure of the basal body from the rhesus monkey oviduct. J.Cell Biol. 54(2), 246-265.

18. Anizet, M.P., Huwe, B., Pays, A. and Picard, J.J. (1981) Characterization of a new cell line, XL2, obtained from Xenopus laevis and determination of optimal culture conditions. In vitro, 17(4), 267-274.

19. André J., and Thiéry J.-P. (1963) Mise en evidence d'une sous-structure fibrillaire dans les filaments axonématiques des flageles. J. Microscopie, 2,7180.

20. André J. (1964) Le centriole et la région centrosomienne. J. Microscopie, 3, 23.

21. Andresson T. and Ruderman J.V. (1998) The kinase Eg2 is a component of the Xenopus oocyte progesterone-activated signalling pathway. EMBO J., 17, 5627-5637.

22. Archer FL, Wheatley DN. (1971) Cilia in cell-cultured fibroblasts. II. Incidence in mitotic and post-mitotic BHK 21-C13 fibroblasts. J Anat. 109(2), 277-292.

23. Argarana C.E., Barra H.S., and Caputto R. (1978). Release of 14C.-tyrosine from tubulinyl-[14C]-tyrosine by brain extract. Separation of a carboxypeptidase from tubulin tyrosine ligase. Mol. Cell. Biochem. 19, 17-22.

24. Arlot-Boiinemains, Y., Giet, R., Klotzbucher, A., Uzbekov, R., Bihan R.,and Prigent C. (2001) Identification of a functional destruction box in the

25. Xenopus laevis aurora-A kinase pEg2. FEBSLett. 508, 149-152.

26. Audebert S., Koulakoff A., Berwald-Netter Y., Gros F., Denoulet P. and

27. Edde B. (1994) Developmental regulation of polyglutamylated alpha- and betatubulin in mouse brain neurons. J. Cell Sci. 107(8), 2313-2322.

28. Baas P.W., and Black M.M. (1990). Individual microtubules in the axonconsist of domains that differ in both composition and stability. J. Cell Biol.1.l, 495-509.

29. Bailly E., Doree M., Nurse P., and Bornens M. (1989) p34cdc2 is located in both nucleus and cytoplasm; part is centrosomally associated at G2/M and enters vesicles at anaphase. EMBO J., 8, 3985-3995.

30. Balczon R., Varden C. and Schroer T. (1999). A role for microtubules incentrosome doubling in Chinese hamster ovary cells. Cell Motil. Cytoskel.42, 60-72.

31. Balczon R. and West K. (1977) The identification of mammalian centrosomal antigens using human autoimmune anticentrosome antisera. Cell Motil Cytoskeleton, 20(2), 121-135.

32. Banerjee A., Roach M.C., Trcka P., and Luduena R.F. (1992) Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin.

33. Baron A.T., and Salisbury J.L. (1988) Identification and localization of a novel, cytoskeletal, centrosome associated protein in PtK2 cells. J.Cell Biol. 107, 2669-2678.

34. Baron A.T., and Salisbury J.L. (1992) Role of centrin in spindle pole dynamics. In: The Centrosome (ed. V. I. Kalnins). San-Giego, CA : Academic Press, Inc. 167-195.

35. Baron A.T., Suman V.J., Ncmeth E., and Salisbury J.L. (1994) The pericentriolar lattice of PtK2 cells exhibits temperature and calcium-modulated behavior. J. Cell Sci. 107, 2993-3003.

36. Bartel P.L., Chien C.T., Sternglanz R. and Fields S. (1993) In: Cellular Interactions in Development: A Practical Approach (Ed. Hartley D.A.), Oxford University Press, Oxford, 153-179.

37. Baum P., Furlong C., and Byers B. (1986). Yeast gene required for spindle pole body duplication: homology of its product with Ca2+-binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 5512-5516.

38. Beneden E. van (1876) Recherches sur les Dicyemides, survivants actuels d'un embranchement des mesozoaires. Bull. Acad. Roy. Med. Belg., 41 (ser. II), 1160-1205.

39. Bcncden E. van, and Neyt A. (1887) Nouvelles recherches sur la fécondation et la division mitosique ches l'Ascaride megalocephale. Bull. Acad. Roy. Méd. Belg., 14 (ser. III), No 8.

40. Bernard M., Sanseau P., Henry C., Couturier A., Prigent C. (1998) Cloning of STK13, a third human protein kinase related to Drosophila aurora and budding yeast Ipll that maps on chromosome 19ql3.3-ter. Genomics, 53, 406-409.

41. Biggiogera M., Kaufmann S.H., Shaper J.H., Gas N., Amalric F., Fakan S.1991) Distribution of nucleolar proteins B23 and nucleolin during mouse spermatogenesis. Chromosoma, 100, 162-172.

42. Bischoff J.R. and Plowman G.D. (1999) The Aurora/Ipllp kinase family: regulators of chromosome segregation and cytokinesis. Cell Biol. 9, 454459.

43. Blangy, A., Lane, H.A., d'Herin, P., Harper, M., Kress, M., Nigg, E.A. (1995) Phosphorylation by p34cdc2 regulates spindle association of human Eg5, a kinesin-related motor essential for bipolar spindle formation in vivo. Cell, 83, 1159-1169.

44. Bloom G.S. and Endow S.A. (1994) Kinesin. In Protein Profile, Volume 1, (ed. E. Shaterline) London, Academic Press.

45. Bonifacino J.S., Klausner R.D., and Sandoval I.V. (1985) A widely distributed nuclear protein immunologically related to the microtubule-associated protein MAPI is associated with the mitotic spindle. Proc Natl Acad SciUSA, 82(4), 1146-1150.

46. Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., and Karsenti, E. (1987). Structural and chemical characterization of isolated centrosomes, Cell. Motil. Cytoskeleton, 8, 238-249.

47. Bouck G.B., and Brown D.L. (1973) Microtubule biogenesis and cell shape in Ochromonas. I. The distribution of cytoplasmic and mitotic microtubules. J. Cell Biol. 56, 340-359.

48. Boveri T. (1888) Zellenstudien II., Die Befruchtung und Teiling des Eies von Ascaris megalocephala. Jena Zeit.Naturw., 22, 685-822. Citation from Wilson (1900).

49. Boveri T. (1895) Uber das Verhalten der Centrosomen bei der Befruchtung des Seeigeleies, etc. Verhandl. Phys. Med. Ges. Wurzburg, XXIX. Citation from Wilson (1900).

50. Brewis N.D., Street A.J., Prescott A.R., and Cohen P.T. (1993) PPX, a new protein serine/threonine phosphatase localized to centrosome. EMBO J., 12, 987-996.

51. Brinkley B.R., and Cartwright J. Jr. (1975) Cold-labile and cold-stable microtubules in the mitotic spindle of mammalian cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 253, 428-439.

52. Brinkley B.R., Cox S.M., Pepper D.A., Wible L., Brenner S.L., and Pardue

53. Brown C. R., Doxsey S. J., Hong-Brown L. Q., Martin R. L., and Welch W.

54. J. (1996 a) Molecular chaperones and the centrosome. A role for TCP-1 in microtubule nucleation. J. Biol. Chem. 271, 824-832.

55. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Doxsey, S. J., and Welch, W. J. (1996 b)

56. Molecular Chaperones and the Centrosome A Role for HSP 73 in centrosomalrepair followings heat shock treatment. J. Biol. Chem. 271, 833-840.

57. Bryan J., and Wilson L. (1971) Are cytoplasmic microtubulesheteropolymers? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 1762-1766.

58. Bulinski J.C., and Gundersen G.G. (1991). Stabilization and posttranslationalmodification of microtubules during cellular morphogenesis. Bioessays, 13,285.293.

59. Bulinski J.C., Richards J.E., and Piperno G. (1988) Posttranslational modifications of alpha tubulin: detyrosination and acetylation differentiatepopulations of interphase microtubules in cultured cells. J Cell Biol 106 (4), 1213-1220.

60. Burgos M. H., and Fawcett D.W. (1955) Studies on the fine structure of themammalian testis. I. Différenciation of the spermatids in the cat (Felisdomestica). J. Biophys. Biochem. Cytology, 1(4), 287-300.

61. Burns R.G. (1991) a- , p- , and y-tubulins: sequence comparisons andstructural constraints. CellMotil.Cytoskeleton, 20, 181-189.

62. Busson S., Dujardin D., Moreau A., Dompierre J. and De Mey J.R. (1998)

63. Dynein and dynactin are localized to astral microtubules and at cortical sites inmitotic epithelial cells. Curr. Biol., 8, 541-544.

64. Centouse V.E. and Borisy G.G. (1990) Nucleation of microtubules from mitotic centrosomes is modulated by a phosphorylated epitope. J. Cell Sci. 95 (Pt 3), 405-411.

65. Centouse V.E., Vandre D.D., and Borisy G.G. (1986) Growth of microtubules on mitotic centrosomes is blocked by MPM-2. J. Cell Biol. 103, 412a.

66. Chan C.S., and Botstein D. (1993) Isolation and characterization of chromosome-gain and increase-in-ploidy mutants in yeast. Genetics, 135, 677-691.

67. Chang P., Giddings T.H., Winey M., and Stearns T. (2003) Epsilon-tubulin is required for centriole duplication and microtubule organization. Nat. Cell Biol. 5(1), 71-76.

68. Chang P. and Stearns T. (2000) S-Tubulin and ^-Tubulin: two new human centrosomal tubulins reveal new aspects of centrosome structure and function. Nature Cell Biol 2, 30-35.

69. Chau A.S., and Shibuya E.K. *(1998) Mos-induced p42 mitogen-activated protein kinase activation stabilizes M-phase in Xenopus egg extracts after cyclin destruction. Biol Cell 90(8), 565-572.

70. Chen R., Perrone C.A., Amos L.A., and Linck R.W. (1993) Tektin B1 fromciliary microtubules: primary structure as deduced from the cDNA sequenceand comparison with tektin A1. J. Cell Sci. 106 (3), 909-918.

71. Chretien D., Buendia B., Fuller S.D., and Karsenti E. (1997) Reconstructionof the Centrosome Cycle from Cryoelectron Microgrphs. J. Structural Biol120,117-133.

72. Chretien D., Fuller S.D., Karsenti E. (1995) Structure of growing microtubule ends: two-dimensional sheets close into tubes at variable rates. J. Cell Biol 129(5), 1311-1328.

73. Chretien D., Janosi I., Taveau J-C., and Flyvbjerg H. (1999) Microtubule's Conformational Cap. Cell Structure and Function, 24, 299-303.

74. Chretien D., Metoz F., Verde F., Kersenti E., Wade R.H. (1992) Lattice defects in microtubules: protofilament numbers vary within individual microtubules. J. Cell Biol 117(5), 1031-1040.

75. Chong, J.P., Blow, J.J. (1996) DNA replication licensing factor. Prog. Cell Cycle Res., 2, 83-90.

76. Clark S.W., and Meyer D.I. (1992) Centractin is an actin homologue associated with the centrosome. Nature, 359, 246-250.

77. Clark S.W., and Meyer D.I. (1994) ACT3: a putative centractin homologue in S. cerevisiae is required for proper orientation of the mitotic spindle. J. Cell Biol 127, 129-138.

78. Clemens J.C., Worby C.A., Simonson-Leff N., Mud a M., Maehama T., Hemmings B.A. and Dixon J.E. (2000) Use of double-stranded RNA interference in Drosophila cell lines to dissect signal transduction pathways. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 97, 6499-6503.

79. Cleveland D.W., Hwo S.Y., and Kirschner M.W. (1977) Physical and chemical properties of purified tau factor and the role of tau in microtubule assembly. J. Mol Biol 116(2), 227-247.

80. Cole D.G., Saxton W.N., Sheehan K.B. and Scholey J.M.A. (1994) "Slow" homotetrameric kinesin-related motor protein purified from Drosophila embryons. J. Biol Chem. 269, 22913-22916.

81. Connolly J.A., Kiosses B.W., and Kalnins V.I. (1995) Centrioles are lost as embryonic myoblasts fuse into myotubes in vitro. Eur. J. Cell Biol 39 (2), 341-345.

82. Cook T.A., Nagasaki T., and Gundersen G.G. (1998). Rho guanosine triphosphatase mediates the selective stabilization of microtubules induced by lysophosphatidic acid. J. Cell Biol 141, 175-185.

83. Corthesy-Theulaz I., Pauloin A. and Pfeffer S.R. (1992) Cytoplasmic dynein participates in the centrosomal localization of the Golgi complex. J. Cell Biol 118(6),1333-1345.

84. CtiIIum N.A., Mahon J., Stringer K., and McLean W.G. (1991) Glycation of rat sciatic nerve tubulin in experimental diabetes mellitus. Diabetologia, 34(6), 387-389.

85. Dalcq A.M. (1964). Le centrosome. Bull. Classe Sci Acad. Roy. Belg. 50, 14081449.

86. De Brabander M., De May J., Joniau M., Geuens G. (1977) Ultrastructural immunocytochemical distribution of tubulin in cultured cells treated with microtubule inhibitors. Cell Biol. Int. Rep. 1(2), 177-183.

87. De Brabander M, Geuens G, Nuydens R, Willebrords R, Aerts F, De Mey

88. Desai A., Verma S., Mitchison T.J. and Walczak C.E. (1999) Kin I kinesins are microtubule-destabilizing enzymes. Cell, 96, 69-78.de The G. (1964) Cytoplasmic microtubules in different animal cells. J. Cell Biol. 23, 265-275.

89. Dettman R.W. (1993) A genetic analysis of a developmentally regulated beta-tubulin in Drosophila melanogaster. PhD thesis, Indiana University, Bloomington, Indiana.

90. Diaz-Nido J., Serrano L., Lopez-Otin C., Vandekerckhove J., and Avila J.1990) Phosphorylation of a neuronal-specific beta-tubulin isotype. J. Biol Chem. 265, 13949-13954.

91. Dippel R.Y. (1968) The development of basal bodies in Paramecium. Proc. Nat. Acad. Sci. (Wash.) 61, 461-468.

92. Dirksen E.R. (1961) The presence of centrioles in artificially activated sea urchin eggs. J. Biophys. Biochem Cytol, 11, 244-247.

93. Dirksen E.R. (1971) Centriole morphogenesis in developing ciliated epithelium of the mouse oviduct. J. Cell Biol, 51, 286-302. Dirksen E.R. (1991) Centriole and basal body formation during ciliogenesis revisited. Biol Cell, 72, 31-38

94. Dirksen E.R., and T.T. Croker (1966) Centriole replication in differentiating ciliated cells of mammalian respiratory epithelium . An electron microscopic study. J. Microscopie, 5, 629-644.

95. Ditchfield C., Johnson V.L., Tighe A., Ellston R., Haworth C., Johnson T.,MortIock A., Keen N. and Taylor S.S. (2003) Aurora B couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubRl, Mad2, and Cenp-E to kinetochores. J.CellBiol. 161, 267-280.

96. Doxsey S.J., Stein P., Evans L., Calarco P.D., and Kirschner M. (1994) Pericentrin, a highly conserved protein involved in microtubule organization. Cell, 76, 639-650.

97. Doolin P.F. and Birge W.J. (1966) Ultrastructural organization of cilia and basal bodies of the epithelium of the choroid plexus in the chick embryo. J. Cell Biol. 29, 333-345.

98. Dujardin D.L., and Vallee R.B. (2002) Dynein at the cortex. Curr. Opin. Cell Biol. 14, 44-49.

99. Dutcher S.K. (2001) The tubulin fraternity: alpha to eta. Curr. Opin. Cell Biol. 13(1), 49-54.

100. Dvorak M. (1978) The differentiation of rat ova during cleavage. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol., 55 (2), 5-81.

101. Echeverri C.J., Paschal, B.M., Vaughan, K.T., Vallee, R.B. (1996) Molecular characterization of the 50-kD subunit of dynactin reveals function for the complex in chromosome alignment and spindle organization during mitosis. J. Cell Biol., 132, 617-633.

102. Enos A.P. and Morris N.R. (1990) Mutation of a gene that encodes a kinesin-like protein blocks nuclear division in A. nidulans. Cell, 60, 1019-1027. Erickson H.P. (2000) Gamma-tubulin nucleation: template or protofilament? Nat. Cell Biol. 2(6), E93-E96.

103. Erickson H.P., and Stoffler D. (1996) Protofilaments and rings, two conformations of the tubulin family conserved from bacterial FtsZ to alpha/beta and gamma tubulin. J. Cell Biol. 135(1), 5-8.

104. Ersfeld K., Wehland J., Plessman U., Dodemont H., Gcrke V., and Weber

105. K. (1993). Characterization of the tubulin-tyrosine ligase. J. Cell Biol 120, 725-732.

106. Eshel D., Urrestarazu L.A., Vissers S., Jauniaux J.C., van Vliet-Reedijk J.C., Planta R.J. and Gibbons I.R. (1993) Cytoplasmic dynein is required for normal nuclear segregation in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(23), 1117211176.

107. Fankhauser C., Izauralde E., Adachi Y., Wingfield P., Laemmli U. (1991) Spesific complex of human immunodeficiency virus type I Rev and nucleolar B23 proteins: dissotiation by the Rev response element. Mol. Cell Biol, 11, 2567-2575.

108. Faragher A.J., Fry A.M. (2003) Nek2A kinase stimulates centrosome disjunction and is required for formation of bipolar mitotic spindles. Mol Biol Cell, 14, 2876-2889.

109. Faure S., Vigneron S., Doree M., Morin N. (1997) A member of the Ste20/PAK family of protein kinases is involved in both arrest of Xenopusoocytes at G2/prophase of the first meiotic cell cycle and in prevention of apoptosis. isMBO./., 16, 5550-5561.

110. Fawcett D.W. (1958) The structure of the mammalian spermatozoon. Int. Rev. Cytol. 7, 195-235.

111. Fawcett D.W. and Porter K.R. (1954) A study of the fine structure of ciliated epithelia. J. of Morphology. 94, 221-282.

112. Flory M.R, and Davis T.N. (2003) The centrosomal proteins pericentrin and kendrin are encoded by alternatively spliced products of one gene. Genomics, 82(3), 401-405.

113. Forer, A. (1965) Local reduction of spindle fiber birefrigence in living Nephrotoma surturalis. (Leow) spermatocytes induced by ultraviolet microbeam irradiation. J. Cell Biol., 25, 95—117.

114. Forer, A., and Pickett-Heaps, J.D. (1998) Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome. Res., 6, 533—549.

115. Francisco L., Wang W. and Chan C.S. (1994) Type 1 protein phosphatase acts in opposition to IpLl protein kinase in regulating yeast chromosome segregation. Mol. Cell Biol. 14, 4731-4740.

116. Friedlandcr M, Wahrman J. (1970) The spindle as a basal body distributor: a study in the meiosis of the male silkworm moth, Bombyx mori. J Cell Sci. 7, 65.

117. Fry, A.M., Mayor, T., Meraldi, P., Stierhof, Y.D., Tanaka, K., Nigg, E.A. (1998 a) C-Napl, a novel centrosomal coiled-coil protein and candidate substrate of the cell cycle-regulated protein kinase Nek2. J. Cell Biol., 141, 1563-1574.

118. Fry, A.M., Meraldi, P., Nigg, E.A. (1998 b) A centrosomal function for the human Nek2 protein kinase, a member of the NIMA family of cell cycle regulators. EMBOJ., 17, 470-481.

119. Frydman J., and Hartl F.U. (1996) Principles of chaperone-assisted protein foldind: Differences between in vitro and in vivo mechanisms. Science, 272, 1497-1502.

120. Fuller S.D., Gowcn B.E., Reinsch S., Sawyer A., Buendia B., Wepf R. and Karsenti E. (1995) The core of the mammalian centriole contains gamma-tubulin.C«/r. Biol. 5(12), 1384-1393.

121. Fuller S.D., Kenney J.M., and Karsenti E. (1992) Centrosomes. Curr. Opin. in Structural Biol. 2, 264-274.

122. Fulton C. (1971) Centrioles. In: Origin and continuity of cell organelles. Springer-Verlag New-York Inc., New York, 170-221.

123. Gaertig J., Thatcher T.H., McGrath K.E., Callahan R.C., and Gorovsky

124. M.A. (1993) Perspectives on tubulin isotype function and evolution based on the observations that Tetrahymena thermophila microtubules contain a single a-and B-tubulin. Cell Motil. Cytoskelet. 25, 243-253.

125. Gaglio, T., Dionne, M.A., Compton, D.A. (1997) Mitotic spindle poles are organized by structural and motor proteins in addition to centrosomes. J. Cell Biol., 138, 1055-1066.

126. Gaglio, T., Saredi, A., Bingham, J.B., Hasbani, M.J., Gill, S.R., Schroer, T.A., Compton, D.A. (1996). Opposing motor activities are required for theorganization of the mammalian mitotic spindle pole. J. Cell Biol., 135, 399414.

127. Gaglio, T., Saredi, A., Compton, D.A. (1995) NuMA is required for the organization of microtubules into aster-like mitotic arrays. J. Cell Biol., 131, 693-708.

128. Gall J.G. (1961) Centriole Replication. A study of Spermatogenesis in the Snail Viviparus. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 10, 163-193.

129. Gard D.L. and Kirschner M.W. (1985) A polymer-dependent increase in phosphorylation of beta-tubulin accompanies differentiation of a mouse neuroblastoma cell line. J. Cell Biol. 100, 764-774.

130. Garreau de Loubresse N., Ruiz F., Beisson J., and Klotz C. (2001) Role of delta-tubulin and the C-tubule in assembly of Paramecium basal bodies. BMC Cell Biol. 2(1), 4.

131. Gasch A., Hinz U., Leiss D., and Renkavvits-Pohl R. (1988) The expression of pi and (33 tubulin genes of Drosophila melanogaster is spatially regulated during embryogenesis. Mol. Gen. Genet. 211, 8-16.

132. Gavet O., Alvares C., Gaspar P., and Bornens M. (2003) Centrin4p, a novel Mammalian centrin specifically expressed in ciliated cells. Mol. Biol. Cell, 14(5), 1818-1834.

133. Gavin, R.H. (1997) Microtubule-microfilament synergy in the cytoskeleton. Int. Rev. Cytol, 173, 207-242.

134. George P., Journey L.J., and Goldstein M.N. (1965) Effect of vincristine on the fine structure of HeLa cells during mitosis. J. Natl. Cancer Inst. 35, 355375.

135. Gibbons IR. (1965) Chemical dissection of cilia. Arch Biol (Liege). 76(2), 317352.

136. Gibbons IR. (1966) Studies on the adenosine triphosphatase activity of 14 S and 30 S dynein from cilia of Tetrahymena. J. Biol. Chem. 241(23), 5590-5596.

137. Gibbons I.R. and Grimstone A.V. (1960) On flagellar structure in certain flagellates. J. Biophys. Biochem. Cytol. 7, 697-716.

138. Giet R., McLean D., Descamps S., Lee M.J., Raff J.W., Prigent C., and Glover D. M. (2002) Drosophila Aurora A kinase is required to localize D-TACC to centrosomes and to regulate astral microtubules. J. Cell Biol. 156(3), 437-451.

139. Giet R., and Prigent C. (2001).The non-catalytic domain of the Xenopus laevis auroraA kinase localises the protein to the centrosome. J. Cell Sci. 114, 2095-2104.

140. Giet R., Uzbekov R., Cubizolles F., Le Guellec K., and Prigent C. (1999). The Xenopus laevis aurora-related protein kinase pEg2 associates with and phosphorylates the kinesin-related protein XlEg5. J. Biol. Chem, 274, 1500515013.

141. Gill S.R., Schroer T.A., Szilak I., Steuer E.R., Sheetz M.P. and Cleveland

142. D.W. (1991) Dynactin, a conserved, ubiquitously expressed component of an activator of vesicle motility mediated by cytoplasmic dynein. J. Cell Biol., 115(6), 1639-1650.

143. Glover D.M., Ohkura H. and Tavares A. (1996) Polo kinase: the choreographer of the mitotic stage? J Cell Biol. 135 (6 Pt 2), 1681-1684.

144. Gosti-Testu F., Marty M-C., Berges J., Maunoury R., and Bornens M.1986) Identification of centrosomal proteins in a human lymphoblastic cell line. EMBOJ. 5 (10), 2545-2550.

145. Gundersen, G.G., and Bulinski, J.C. (1988). Selective stabilization of microtubules oriented toward the direction of cell migration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5946-5950.

146. Gundersen G.G., Kalnoski M.H., and Bulinski J.C. (1984). Distinct populations of microtubules: tyrosinated and nontyrosinated cc-tubulin are distributed differently in cells. Cell, 38, 779-789.

147. Gundersen G.G., Khawaja S., and Bulinski J.C. (1987). Postpolymerization detyrosination of a-tubulin: a mechanism for subcellular differentiation of microtubules. J. Cell Biol. 105, 251-264.

148. Gundersen, G.G., Khawaja, S., and Bulinski, J.C. (1989). Generation of a stable, posttranslationally modified microtubule array is an early event in myogenic differentiation. J. Cell Biol. 109, 2275-2288.

149. Gyoeva F.K., and Gelfand V.I. (1991) Coalignment of vimentin intermediatefilaments with microtubules depends on kinesin. Nature, 353, 445-448.

150. Hackney D.D., Lavitt J.D. and Suhan J. (1992) Kinesin undergoes a 9 S to 6 Sconformational transition. J. Biol. Chem., 267(12), 8696-8701.

151. Hackney D.D., Lavitt J.D. and Wagner D.D. (1991) Characterization of alpha2 beta 2 and alpha 2 forms of kinesin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 174(2),810.815.

152. Ha Kim Y., Yeol Choi J., Jeong Y., Wolgemuth D.J., Rhee K. (2002) Nek2 localizes to multiple sites in mitotic cells, suggesting its involvement in multiple cellular functions during the cell cycle. Biochem Biophys Res Commun.290, 730-736.

153. Hallak M.E., Rodriguez J.A., Barra H.S., and Caputto R. (1977). Release of tyrosine from tubulin. Some common factors that affect this process and the assembly of tubulin. FEBS Lett. 73, 147-150.

154. Hamelin M., Scott I.M., Way J.C., and Culotti J.G. (1992) The mec-7 beta-tubulin gene of Caenorhabditis elegans is expressed primarily in the touch receptor neurons. EMBO J. 11(8), 2885-2893.

155. Hames R.S. and Fry A.M. (2002) Alternative splice variants of the human centrosome kinase Nek2 exhibit distinct patterns of expression in mitosis. Biochem. J. , 361, 77-85.

156. Hamilton, B.T., Snyder, J.A. (1982) Rapid completion of mitosis and cytokinesis in PtK cells following release from nocodazole arrest. Eur. J. Cell Biol, 28, 190-194.

157. Hannak E., Kirkham M., Hyman A., and Oegema K., (2001). Aurora-A kinase is required for centrosome maturation in Caenorhabditis elegans. J. Cell Biol 155(7), 1109-1116.

158. Harris G. S., Keath E.J., and Medoff J. (1989) Characterization of alpha and beta tubulin genes in the dimorphic fungus Histoplasma capsulatum. J.Gen. Microbiol, 135, 1817-1832.

159. Hart P.E., Glantz J.N., Orth J.D., Poynter G.M., and Salisbury J.L. (1999). Testis-specific murine centrin, Cetnl: genomic characterization and evidence for retroposition of a gene encoding a centrosome protein. Genomics, 60, 111120.

160. Heald R., Tournebize R., Blank T., Sandaltzopoulos R., Becker P., Hyman A. and Karsenti E. (1996) Self-organization of microtubules into bipolar spindles around artificial chromosomes in Xenopus egg extracts. Nature, 382(6590), 420-425.

161. Heck, M.M., Pereira, A., Pesavento, P., Yannoni, Y., Spradling, A.C., Goldstein, L.S. (1993) The kinesin-like protein KLP61F is essential for mitosis in Drosophila. J. Cell Biol, 123, 665-679.

162. Heidemann S.R. and Sander G. (1977) Evidence for a functional role of RNA in centrioles. Cell, 10(3), 337-350.

163. Heidi A.L. and Nigg E.A. (1997) Cell-cycle control: POLO-like kinases jointhe outer circle. Trends Cell Biol 7, 63-68.

164. Heindenhain M. (1907) Plasma und Zelle, Pt. I, Fischher, Jena.

165. Henneguy L.F. (1898). Sur les rapports des cils vibrátiles avec lescentrosomes. Arch. Microsc. Morph. Exp. 1, 481-496.

166. Hernandez-Verdun D., and Gautier T. (1994) The chromosomes periphery during mitosis. BioEssays., 16, 179-185.

167. Hino M., Kijima Suda I., Nagai Y., and Hosoya H. (2003) Glycosylation of the alpha and Beta tubulin by sialyloligosaccharides. Zoolog. Sci. 20(6), 709715.

168. Hong, Y. R., Chen, C. H., Chang, J. H., Wang, S., Sy, W. D., Chou, C. K. and Howng, S. L. (2000). Cloning and characterization of a novel human ninein protein that interacts with the glycogen synthase kinase 3beta. Biochim. Biophys. Acta. 1492, 513 -516

169. Horio T., Uzawa S., Jung M.K., Oakley B.R., Tanaka K., and Yanagida M.1991) The fission yeast gamma-tubulin is essential for mitosis and is localizedat microtubule organizing centers. J. Cell Sci. 99 (4), 693-700.

170. Houliston E., and Maro B. (1989). Posttranslational modification of distinctmicrotubule subpopulations during cell polarization and differentiation in themouse preimplantation embryo. J. Cell Biol. 108, 543-551.

171. Howard A. and Pele S.R. (1953) Synthesis of Desoxyribonucleic acid innormal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. Heredity1. Suppl. 6, 261-273.

172. Janosi I.M., Chretien D., and Flyvbjerg H. (2002) Structural microtubule cap: stability, catastrophe, rescue, and third state. Biophysical J., 83(3), 13171330.

173. Joshi H.C. (1994) Microtubule organizing centers and gamma-tubulin. Curr. Opin. Cell Biol. 6(1), 54-62.

174. Karki S. and Holzbaur E.L. (1995) Affinity chromatography demonstrates a direct binding between cytoplasmic dynein and the dynactin complex. J. Biol. Chem., 270(48), 28806-28811.

175. Karsenti E., Newport J., Hubble R., and Kirshner M.W. (1984) Interconversion of metaphase and interphase microtubule arrays as studied by the injection of centrosomes and nuclei into Xenopus eggs. J. Cell Biol. 98, 1730-1745.

176. Kenney J., Karsenti E., Gowen B., and Fuller S.D. (1997) Three-dimensional reconstruction of the mammalian centriole from cryoelectron micrographs: the use of common lines for orientation and alignment. J. Struct. Biol. 120(3), 320-328.

177. Khodjakov A., Cole R.W., Oakley B.R. and Rieder C.L. (2000) Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Current Biol. 10, 59-67.

178. Khodjakov A., Cole R.W., and Rieder C.L. (1997) A synergy of technologies: combining laser microsurgery with green fluorescrnt protein tagging. Cell Motil. Cytoskel. 38, 311-317.

179. Khodjakov A. and Rieder C.L. (1999) The sudden recruitment of gamma-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchangethroughout the cell cycle, do not require microtubules. J. Cell Biol. 146(3), 585596.

180. Khodjakov A. and Rieder C.L. (2001) Centrosomes enhance the fidelity of cytoknesis in vertebrates and are required for cell cycle progression. J. Cell Biol 153, 237-242.

181. Khodjakov A., Rieder C.L., Sluder G., Cassels G., Sibon O. and Wang CL. (2002) De novo formation of centrosomes in vertebrate cells arrested during S phase. J. Cell Biol 158, 1171-1181.

182. Knop M., and Schiebel E. (1998) Receptors determine the cellular localization of a gamma-tubulin complex and thereby the site of microtubule formation. EMBOJ., 17(14), 3952-3967.

183. Kochanski R.S. and Borisy G.G. (1990) Mode of Centriole Duplication and Distribution. J. Cell Biol. 110, 1599-1605.

184. Komarova Yu.A., Akhmanova A.S., Shin-ichiro K., Galjart N., and Borisy

185. G.G. (2002) Cytoplasmic linker proteins promote microtubule rescue in vivo. J. Cell Biol 159(4), 589-599.

186. Komarova Yu.A., Ryabov, E.V., Alieva, I.B., Uzbekov, R.E., Uzbekova, S.V., Vorobjev, I.A. (1997). Polyclonal antibodies against human y -tubulin stain centrioles in mammalian cells from different tissues. Membr. Cell Biol, 10,503-513.

187. Komesli S., Tournier F., Paintrand M., Margolis R.L., Job D., and Bornens

188. M. (1989) Mass Isolation of Calf Thymus Centrosomes: Identification of a Specific Configuration. J.CellBiol 109(6), 2869-2878.

189. Krstic K. (1976) Ultrastructure of the Mammalian Cell. New-York, SpringerVerlag. 114-115.

190. Kubo A., Sasaki H., Yuba Kudo A., Tsukita S., and Shiina N. (1999) Centriolar satellites: molecular characterization, ATP-dependent movement toward centrioles and possible involvement in ciliogenesis. J. Cell Biol. 147(5), 969-980.

191. Kufer T.A., Sillje H.H., Korner R., Gruss O.J., Meraldi P. and Nigg E.A. (2002) Human TPX2 is required for targeting Aurora A kinase to the spindle. J. Cell Biol. 158, 617-623.

192. Kumar N., and Flavin M. (1981) Preferential action of a brain detyrosinolating carboxypeptidase on polymerized tubulin. J. Biol. Chem., 256, 7678-7686.

193. HernauIt, S.W., and Rosenbaum, J.L. (1985). Chlamydomonas »-tubulin is posttranslationally modified by acetylation on the E-amino group of a lysine. Biochemistry. 24, 473-478.

194. Q., and Joshi H.C. (1995) gamma-tubulin is a minus end-specificmicrotubule binding protein. J. Cell Biol. 131(1), 207-214.

195. Maccioni R.B., and Cambiazo V. (1995) Role of microtubule-associated proteins in the control of microtubule assembly. Physiological Rev. 75(4), 835864.

196. Mack, G. J., Recs, J., Sandblom, O., Balczon, R., Fritzler, M. J. and Rattncr, J. B. (1998). Autoantibodies to a group of centrosomal proteins in human autoimmune sera reactive with the centrosome. Arthritis Rheum. 41,551 -558.

197. Maekawa T., Leslie R. J., Kuriyama R. (1991) Identification of a minus end-specific microtubule-associated protein located at the mitotic poles in cultured mammalian cells. Eur. J. Cell Biol. 54(2), 255-267.

198. Maney T., Hunter A.W., Wagenbach M. and Wordeman L. (1998) Mitotic centromere-associated kinesin is important for anaphase chromosome segregation. J. Cell Biol., 142, 787-801.

199. Maniotis A. and Schliwa M. (1991) Microsurgical removal of centrosomes blocks cell reproduction and centriole generation in BSC-1 cells. Cell. 67, 495504.

200. Margolis R.L., and Wilson L. (1978) Opposite end assembly and disassembly of microtubules at steady state in vitro. Cell, 13(1), 1-8.

201. Margolis R.L., and Wilson L. (1981) Microtubule treadmills-possible molecular machinery. Nature, 293(5835), 705-711.

202. Marks D.M., West J., and Weeks D. (1987) The relatively large beta-tubulin gene family of Arabidopsis contains a member with an unusual transcribed 5' noncoding sequence. Plant Mol. Biol. 10, 91-104.

203. Maro B. and Bornens M. (1980) The centriole-nucleus association: effects of cytochalasin B and nocodazole. Biol. Cell., 39, 287-290.

204. Maro B., Howlett S. K., and Webb M. (1985). Non-spindle microtubule organizing centers in metaphase II-arrested mouse oocytes. J. Cell Biol. 101, 1665-1672.

205. Mary J., Redeker V., Le Caer J.-P., Rossier J., and Schmitter J.M. (1996). Posttranslational modifications in the C-terminal tail of axonemal tubulin from sea urchin sperm. J. Biol. Chem. Ill, 9928-9933.

206. Matthews K.A., Miller D.F., and Kaufman T.C. (1989) Developmental distribution of RNA and protein products of the Drosophila alpha-tubulin gene family. Dev. Biol. 132(1), 45-61.

207. Matthews K.A., Rees D., and Kaufman T.C. (1993) A functionally specialized alpha-tubulin is required for oocyte meiosis and cleavage mitoses in Drosophila. Development, 117(3), 977-991.

208. Mazia D. (1961) Mitosis and the Physiology of cell division. In: " The Cell"(Ed. J. Brachet and A. Mirsky) Vol. Ill, Academic Press, New York and London.

209. McKean P.G., Vaughan S., and Gull K. (2001) The extended tubulin superfamily. J. Cell Sci. 114(15), 2723-2733.

210. McNally F.J., Okawa K., Iwamatsu A., and Vale R.D. (1996). Katanin, the microtubule-severing ATPase, is concentrated at centrosomes. J. Cell Sci. 109, 561 -567.

211. Melki R., Carlier M.F., Pantaloni D., and Timasheff S.N. (1989) Cold depolymerization of microtubules to double rings: geometric stabilization of assemblies. Biochemistry, 28, 9143-9152.

212. Mendez R., Hake L.E., Andresson T., Littlepage L.E., Rudcrman J.V. and Richter J.D. (2000) Phosphorylation of CPE binding factor by Eg2 regulates translation of c-mos mRNA. Nature, 404, 302-307.

213. Meraldi, P., Honda R., and Nigg E.A. (2002) Aurora-A overexpression reveals tetraploidization as a major route to centrosome amplification in p53-/-cells. EMBO J., 21(4), 483-492.

214. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A.M., Bartek, J., Nigg, E.A. (1999) Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2-cyclin A. Nat. Cell Biol, 1, 88-93.

215. Meselson M., and Stahl F. W. (1958) The replication of DNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 44, 671-682.

216. Middendorp S., Paoletti A., Schiebel E., and Bornens M. (1997). Identification of a new mammalian centrin gene, more closely related to Saccharomyces cerevisiae CDC31 gene. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 94, 91419146.

217. Mignot J-P. (1996) The centrosomal big bang: from a unique central organelle towards a constellation of MTOCs. Biol Cell, 86, 81-91.

218. Mikami A., Paschal B.M., Mazumdar M. and Vallee R.B. (1993) Molecular cloning of the retrograde transport motor cytoplasmic dynein (MAP 1C). Neuron, 10(5), 787-796.

219. Mitchison T. (1989). Polewards microtubule flux in the mitotic spindle: evidence from photoactivation of fluorescence. J. Cell Biol 109, 637 -652.

220. Mitchison T., and Kirschner M. (1984a). Microtubule assembly nucleated by isolated centrosomes. Nature, 312(5991), 232-237.

221. Mitchison T. and Kirschner M.W. (1984b) Dynamic instability of microtubule growth. Nature Lond. 312(5991), 237-242.

222. Mogensen M.M., Malik A., Piel M., Bouckson Castang V., and Bornens M.2000) Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role ofninein. J. Cell Sci. 113 (17), 3013-3023.

223. Moritz M., Braunfeld M.B., Sedat J.W., Alberts B., and Agard D.A.1995) Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature, 378(6557), 638-640.

224. Moritz M., Zheng Y., Alberts B.M., Oegema K. (1998) Recruitment of the gamma-tubulin ring complex to Drosophila salt-stripped centrosome scaffolds. J.Cell Biol. 142(3),775-786.

225. Moudjou M., Bordes N., Paintrand M., and Bornens M. (1996) gamma-Tubulin in mammalian cells: the centrosomal and the cytosolic forms. J. Cell Sci. 109 (4), 875-887.

226. Mountain, V., Simerly, C., Howard, L., Ando, A., Schatten, G., Comp-ton,

227. D.A. (1999) The kinesin-related protein, HSET, opposes the activity of Eg5 andcross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. J. Cell Biol., 147, 351-366.

228. Multigner L., Pignot-Paintrand I., Saoudi Y., Job D., Plessmann U., Rüdiger M., and Weber K. (1996) The A and B tubules of the outer doublets of sea urchin sperm axonemes are composed of different tubulin variants. Biochemistry 35, 10862-10871.

229. Murata Y., Tsuji M., Tani M. (1984) Ultrastructure of glomus tumor J. Cutan.Pathol.ll(l), 53-58.

230. Murray R.G., Murray A.S., and Pizzo A. (1965) The fine structure of mitosis in rat thymic lymphocytes. J. Cell Biol. 26, 601-619.

231. Nachury M.V., Maresca T.J., Salmon W.G., Waterman-Storer C.M., Heald R., Weis K. (2001) Importin beta is a mitotic target of the small GTPase Ran in spindle assembly. Cell, 104, 95-106.

232. Nigg E.A. (1998) Polo-like kinases: positive regulators of cell division from start to finish. Curr. Opin. Cell Biol., 10, 776-783.

233. Nigg E.A. (2001) Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 21-32.

234. Nogales E., Whittaker M., Milligan R.A., and Downing K.H. (1999) High-resolition model of the microtubule. Cell, 96(1), 79-88.

235. Nojima D., Linck R.W., and Egelman E.H. (1995) At least one of the protofilaments in flagellar microtubules is not composed of tubulin. Curr. Biol. 5(2), 158-167.

236. Oakley B.R., Oakley C.E., Yoon Y., and Jung M.K. (1990) Gamma-tubulin is a component of the spindle pole body that is essential for microtubule function in Aspergillus nidulans. Cell, 61(7) 1289-1301.

237. Oakley C.E., and Oakley B.R. (1989) Identification of gamma-tubulin, a new member of the tubulin superfamily encoded by mipA gene of Aspergillus nidulans. Nature,338(6217), 662-664.

238. O'Hara P. T. (1970) Spiral Tilt of Triplet Fibers in Human Leukocyte Centrioles. J. Ultrastructure Research, 31, 195-198.

239. Ohkura H., Hagan I.M., and Glover D.M. (1995) The conserved Schizosaccharomyces pombe kinase plol, required to form a bipolar spindle, the actin ring, and septum, can drive septum formation in Gi and G2 cells. Genes Dev. 9,1059-1073.

240. Okuda M., Horn H. F., Tarapore P., Tokuyama Y., Smulian A.G., Chan P. K., Knudsen E. S., Hofmann I. A., Snyder J. D., Bove K. E., Fukasawa K.2000) Nucleophosmin/B23 is a target of CDK2/cyclin E in centrosome duplication. Cell, 103 (1), 127-140.

241. Olmsted J.B. (1986) Microtubule-associated proteins. Annu. Rev. Cell Biol. 2, 421-457.

242. Oppenheim D.S., Hausehka B.T., and Mcintosh J.R. (1973) Anaphase motions in dilute colchicine. Exp.CellRes. 79, 95-105.

243. Oppenheimer D.G., Haas N., Silflow C., and Snustad D.P. (1988) The (3-tubulin gene family of Arabidopsis thaliancr. Preferential accumulation of the (31 transcript in roots. Gene, 63, 87-102.

244. Osborn M., and Weber K. (1976) Cytoplasmic microtubules in tissue culture cells appear to grow from an organizing structure towards the plasma membrane. ProcNatl. Acad. Sci. USA, 73(3), 867-871.

245. Ou Y.Y., Mack G.J., Zhang M., and Rattner J.B. (2002) CEP110 and ninein are located in a specific domain of the centrosome associated with centrosome maturation. J. Cell Sci. 115(9), 1825-1835.

246. Overy H.R., and R.E. Priest (1966) Mitotic cell division in postnatal cardiac growth. Lab. Invest. 15, 1100.

247. Paintrand M., Moudjou M., Delacroix H., and Bornens M. (1992)

248. Centrosome Organization and Centriole Architecture: Their Sensitivity to

249. Divalent Cations. J. Structural Biol. 108, 107-128.

250. Palazzo R.E., Vaisberg E., Cole R.W., Rieder C.L. (1992) Centrioleduplication in Iysates of Spisula solidissima oocytes. Science, 256, 219-221.

251. Palmer, R.E., Sullivan, D.S., Huffaker, T., Koshland, D. (1992) Role ofastral microtubules and actin in spindle orientation and migration in the buddingyeast, Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Biol, 119, 583-593.

252. Panda D., Miller H.P., and Wilson L. (1999) Rapid treadmilling of brainmicrotubules free of microtubule-associated proteins in vitro and its suppressionby tau. Proc Natl Acad Sci USA, 96(22), 12459-12464.

253. Paoletti, A., and Bornens, M. (1997) Organisation and functional regulation of the centrosome in animal cells. Prog. Cell Cycle Res., 3, 285-299.

254. Paoletti A., Moudjou M., Paintrand M., Salisbury J.L., and Bornens M.1996). Most of centrin in animal cells is not centrosome-associated and centrosomal centrin is confined to the distal lumen of centrioles. J. Cell Sci. 109,3089-3102.

255. Paschal B.M., Holzbaur E.L., Pfister K.K., Clark S., Meyer D.I. and Vallee

256. R.B. (1993) Characterization of 50 kD polypeptide in cytoplasmic dynein preparations reveals a complex with pi50 Glued and a novel actin. J.Biol.Chem. 268, 15318-15323.

257. Paschal B.M., Shpetner H.S. and Vallee R.B. (1987) MAP 1C is amicrotubule-activated ATPase which translocates microtubules in vitro and has dynein-like properties. J.Cell Biol. 105(3), 1273-1282.

258. Paturle-Lafanechere L., Edde B., Denoulet P., Van Dorsselaer A., Mazarguil H., Le Caer J.P., Wehland J., and Job D. (1991) Characterization of a major brain tubulin variant which cannot be tyrosinated. Biochemistry, 30, 10523-10528.

259. Paulin-Levasseur M. and Brown D. L. (1989) Organization of the vimentin system and its spatial relationship to the microtubule complex during the division of mammalian cells growing attached and in suspension. Eur. J. Cell Biol. 49, 189-195.

260. Pease D.C. (1963) The ultrastructure of flagellar fibrils. J. Cell Biol. 18, 313326.

261. Pereira G., and Schiebel E. (1997) Centrosome-microtubule nucleation. J. Cell Sci. 110 (3), 295-300.

262. Pereira G., Knop M., and Schiebel E. (1998) Spc98p directs the yeast gamma-tubulin complex into the nucleus and is subject to cell cycle-dependent phosphorylation on the nuclear side of the spindle pole body. Mol. Biol. Cell, 9(4), 775-793.

263. Peterson S.P. and Berns M.W. (1997) The Centriolar Complex. Int. Rev. Cytology, 64, 81-106.

264. Pfarr C.M., Coue M., Grissom P.M., Hays T.S., Porter M.E. and Mcintosh

265. J.R. (1990) Cytoplasmic dynein is localized to kinetochores during mitosis. Nature, 345(6272), 263-265.

266. Piperno G., LeDizet M., and Chang X.J. (1987) Microtubules containing acetylated alpha-tubulin in mammalian cells in culture. J. Cell Biol 104(2), 289-302.

267. Pirner M.A., and Linck R.W. (1994) Tektins are heterodimeric polymers in flagellar microtubules with axial periodicities matching the tubulin lattice. J. Biol Chem. 269(50); 31800-31806.

268. Plessmann U. and Weber K. (1997) Mammalian sperm tubulin: an exceptionally large number of variants based on several posttranslational modifications. J Protein Chem. 16, 385-390.

269. Pollard T.D. and Earnshaw W.C. (2002) Cell Biology (ed. Earnshaw W.C.) Saunders. Philadelphia (PA), 805 p.

270. Popov A.V., Severin F. and Karsenti E. (2002) XMAP215 is required for themicrotubule-nucleating activity of centrosomes. Curr Biol. 12 (15), 1326-1330.

271. Porter K.R. (1966) Cytoplasmic microtubules and their functions. In:

272. Principles of Biomolecular Organization. G.E.W. Wolstenholme and M.

273. O'Connor, editors. Churchill ( J. & A.) Ltd., London. 308-356.

274. Prigent C. and Giet R. (2003) Aurora A and mitotic commitment. Cell. 114,531.532.

275. Przybylski R.J. (1971) Occurrence of centrioles during skeletal and cardiac myogenesis. J. Cell Biol. 49, 214-221.

276. Raff E.C. (1994) The role of multiple tubulin isoforms in cellular microtubule function. In: Microtubules, Wiley-Liss, Inc. 85-109.

277. Raff E.C., Fuller M.T., Kaufman T.C., Kemphues K., Rudolph J.E., and Raff R. A. (1982) Regulation of tubulin gene expression during embryogenesis in Drosophila melanogaster. Cell, 28, 33-40 .

278. Raff J.W., Kellog D.R., and Alberts B.M. (1993) Drosophila gamma-tubulin is part of a complex containing two previously identified centrosomal MAPs. J. Cell Biol 121(4), 823-835.

279. Raich W.B., Moran A.N., Rothman J.H. and Hardin J. (1998) Cytokinesisand midzone microtubule organization in Caenorhabditis elegarts require thekinesin-like protein ZEN-4. Mol. Biol Cell, 9, 2037-2049.

280. Rao P.N., Zhao J.Y., Ganju R.K., and Ashorn C.L. (1989) Monoclonalantibody against the centrosome. J. Cell Sci. 93 (1), 63-69.

281. Rattner J.B. (1972) Observation of centrioles formation in male meiosis. J.1. Cell Biol 54,20-29.

282. Rattner J.B., and Phillips S.G. (1973) Independence of centriole formation and DNA synthesis. J Cell Biol May;57(2), 359-372.

283. Ray bin, D., and Flavin, M. (1977). Enzyme which adds tyrosine to the tx-chain of tubulin. Biochemistry, 16, 2189-2194.

284. Rieder C.L. (1979) Ribonucleoprotein staining of centrioles and kinetochores in newt lung cell spindles J. Cell Biol 80, 1-9.

285. Rieder C.L. and Alexander S.P. (1990) Kinetochores are transported poleward along a single astral microtubule during chromosome attachment to the spindle in newt lung cells. J. Cell Biol 110, 81 -96.

286. Rieder C.L. and Borisy G.G. (1982) The centrosome cycle in PtK2 cells: asymmetric distribution and structural changes in pericentriolar material. Biol. Cell. 44, 117-132.

287. Rieder C.L. and Cole R. (2000) Microtubule disassembly delays the G2-M transition invertebrates. Curr.Biol. 10, 1067-1070.

288. Rieder C.L., Jensen CG, Jensen LC. (1979) The resorption of primary cilia during mitosis in a vertebrate (PtKl) cell line. J. Ultrastruct. Res. 68(2), 173185.

289. Rieder C.L. and Salmon E.D. (1994) Motile kinetochores and polar ejection forces dictate chromosome position on the vertebrate mitotic spindle. J. Cell Biol. 124,223-233.

290. Robbins E., Jentzsch G., and Micali A. (1968) The centriole cycle in synchronized HeLa cells. J. Cell Biol. 36, 329-339.

291. Rodionov V.l., and Borisy G.G. (1997) Microtubule treadmilling in vivo. Science, 275(5297), 215-218.

292. Ruiz F., Krzywicka A., Klotz C., Keller A., Cohen J., Koll F., Balavoine G., and Beisson J. (2000) The SMI 9 gene, required for duplication of basal bodiesin Paramecium, encodes a novel tubulin, eta-tubulin. Curr. Biol. 10(22), 14511454.

293. Rumyantsev P.P., and Snigirevskaya E. S. (1968) The ultrastructure of differetiating cells of the heart muscle in the state of mitotic division. Acta Morphol. AcadSci. Hung. 16, 271.

294. Sabatini D.D., Bensch K.G., and Barnett R.J. (1963) Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58.

295. Sager P.R., Rothfîeld N.L., Oliver J.M., Berlin R.D. (1986) A novel mitotic spindle pole component that originated from the cytoplasm during prophase. J. Cell Biol 103, 1863-1872.

296. Sakaguchi H. (1965) Pericentriolar filamentous bodies. J. Ultrastruct. Research. 12, 13-21.

297. Salisbury J.L. (1983) Contractile flagellar roots: role of calcium. J. Submicrosc. Cytol. 15, 105-110.

298. Salisbury J.L. (1992) Centrin-based calcium-sensitive contractile fibers of the green algae. In: The Cytoskeleton of Algae (ed. D. Menzel). Boca Raton, FL: CRC Press Inc. 393-410.

299. Salisbury J.L. (1995) Centrin, centrosomes, and mitotic spindle poles. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 39-45.

300. Salisbury J.L., Baron A., Surek B., and Melkonian M. (1984) Striated flagellar roots: isolation and partial characterization of a calcium-modulated contractile organelle. J. Cell Biol. 99(3), 962-970.

301. Sanders M.A., and Salisbury J.L. (1989) Centrin-mediated microtubule severing during flagellar excision in Chlamydomonas reinhardtii. J. Cell Biol. 108 (5), 1751-1760.

302. Sasse R., Glyn M.C., Birkett C.R., and Gull K. (1987) Acetylated alphatubulin in Physarum: immunological characterization of the isotype and itsusage in particular microtubular organelles. J. Cell Biol. 104(1) 41-49.

303. Savage C., Hamelin M., Culotti J.G., Coulson A., Albertson D.G., and

304. Chalfie M. (1989) mec-7 is a beta-tubulin gene required for the production of15.protofilament microtubules in Caenorhabditis elegans. Genes Dev. 3(6),870.881.

305. Sawin, K.E., Le Guellec, K., Philippe, M., Mitchison, T.J. (1992) Mitotic spindle organization by a plus-end-directed microtubule motor. Nature, 359, 540-543.

306. Sawin K.E. and Mitchison T.J. (1995) Mutation in the kinesin-like protein Eg5 disrupting localization to the mitotic spindle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 4289-4293.

307. Schafer D.A., Gill S.R., Cooper J.A., Heuser J.E., Schroer T.A. (1994) Ultrastructural analysis of the dynactin complex: an actin-related protein is a component of a filament that resembles F-actin. J. Cell Biol, 126(2), 403-412.

308. Schatten, G., Simerly, C. and Schatten, H. (1985). Microtubule configuration during fertilization, mitosis and early development in the mouse. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 82, 4152-4156.

309. Schatten H., Walter M., Biessmann H., Schatten G. (1988) Microtubules are required for centrosome separation in sea urchin eggs during fertilization and mitosis. Cell Motil. Cytoskel. 11, 248-259.

310. Schatz P.J., Solomon F., and Botstein D. (1986a) Genetically essential and nonessential a-tubulin genes specify functionally interchangeable proteins. Mol. Cell Biol. 6, 3722-3733.

311. Schatz P.J., Pillus L., Grisafi P., Solomon F., and Botstein D. (1986b) Two functional a-tubulin genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae encode divergent proteins. Mol. Cell Biol. 6,3711-3721.

312. Scheer U., and Benavente R. (1990) Functional and dynamic aspects of the mammalian nucleolus. BioEssays, 12,14-21.

313. Scheer U., and Weisenberger D. (1994) The nucleolus. Current Opinion Cell Biol., 6, 354-359.

314. Schliwa M. (1978) Microtubular apparatus of melanophores. J.Cell Biol. 76, 605-614.

315. Schmidt-Zachmann M.S., Hugle-Dorr B., Franke W.W. (1987) A constitute nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. EMBO J.,6, 1881-1890.

316. Schreiner A. and Schreiner K.E. (1905)Arch.biol. 21, 315. Schroder H.C., Wehland J., and Weber K. (1985). Purification of brain tubulin-tyrosine ligase by biochemical and immunological methods. J. Cell Biol. 106, 276-281.

317. Schroer T.A., Bingham J.B., and Gill S.R. (1996) Actin-related protein 1 and cytoplasmic dynein-based motility what's the connection? Trends Cell Biol., 6(6), 212-215.

318. Schulze E., Asai D.J., Bulinski J.C., and Kirschner M. (1987). Posttranslational modifications and microtubule stability. J. Cell Biol. 105, 2167-2177.

319. Schwann Th. (1839) Mikroscopische Untersuchungen uber die Uebereinstimmung in der Structur und dem Wachsthum der Thiere und Pflanzen. Berlin. Translation in Sydenham Soc., XII. London, 1847. Citation from Wilson (1900).

320. Selby C.C. (1953) Electron micrographs of mitotic cells of the Ehrluch mouse ascites tumor in thin section. Exp. Cell Res. 5, 386.

321. Sen S., Zhou H. and White R.A. (1997) A putative serine/threonine kinaseencoding gene BTAK on chromosome 20ql3 is amplified and overexpressed inhuman breast cancer cell lines. Oncogene, 14,2195-2200.

322. Severson A.F., Hamill D.R., Carter J.C., Schumacher J. and Bowerman

323. B. (2000) The aurora-related kinase AIR-2 recruits ZEN-4/CeKLPl to themitotic spindle at metaphase and is required for cytokinesis. Curr.Biol. 10,1162-1171.

324. Shaw P. J., and Jordan E.G. (1995) The nucleolus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 11,93-121.

325. Sharp D.J., McDonald K.L., Brown H.M., Matthies H.J., Matthics H.J., McDonald H.B., Goldstein L.S. and Theurkauf W.E. (1996) Anastral meiotic spindle morphogenesis: role of the non-claret disjunctional kinesin-like protein. J. Cell Biol 134,455-464.

326. Sharp D.J., Rogers G.C. and Scholey J.M. (2000) Microtubule motors in mitosis. Nature, 407, 41-47.

327. Sharp, D.J., Yu, K.R., Sisson, J.C., Sullivan, W., Scholey, J.M. (1999) Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat. Cell Biol, 1, 51—54.

328. Sloboda R.D., and Belfi L.M. (1998) Purification of tubulin and microtubule-associated proteins by membrane ion-exchange chromatography. Protein Expr. Puri, 13(2), 205-209.

329. Sloboda R.D., Dentler W.L., and Rosenbaum J.L. (1976). Microtubule-associated proteins and the stimulation of tubulin assembly in vitro. Biochemistry, 15, 4497-4505.

330. Sluder G. (1989) Centrosomes and the cell cycle. J. Cell Sci, Supple 12, 253275.

331. Sluder, G., and Hinchcliffe, E.H. (1999) Control of centrosome reproduction: the right number at the right time. Biol Cell, 91, 413-427.

332. Smith, J.C., and Tata, J.R. (1991) Methods in Cell Biology, Vol. 32. In: Wilson, L. (Ed.). Academic Press, pp. 635-654.

333. Smrzka O.W., Delgehvr N., Bornens M. (2000) Tissue-specific expression and subcellular localisation of mammalian delta-tubulin. Curr Biol. 10(7), 413416.

334. Snell W.J., Dentler W.L., Haimo L.T., Binder L.I., and Rosenbaum J.L.1974) Assembly of chick brain tubulin onto isolated basal bodies of Chlamydomonas reinhardi. Science 185(148), 357-360.

335. Snustad D.P., Haas N.A., Kopczak S.D., and Silflow C.D. (1992) The small genome of Arabidopsis contains at least nine expressed P-tubulin genes. Plant Cell, 4, 549-556.

336. Spector D.L., Ochs R.L., Busch H. (1984) Silver staining, immunofluorence, and immunoelectron microscopic localisation of nucleolar phosphoproteins B23 and C23. Chromosoma, 90, 139-148.

337. Spector I., Shobet N.R., Blasberger D., Kashman Y. (1989) Latrunculin-novel marine macrolides that disrupt microfilament organization and affect cell growth: I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil. Cytoskeleton, 13, 127144.

338. Steffen W., Faier E.A., and Linck R.W. (1994) Centrosomal components immunologically related to tektins from ciliary and flagellar microtubules. J. Cell Sci. 107 (8), 2095-2105.

339. Stenoien D.L., Sen S., Mancini M.A. and Brinkley B.R. (2003) Dynamic association of a tumor amplified kinase, Aurora-A, with the centrosome and mitotic spindle. Cell Motil. Cytoskeleton, 55, 134-146.

340. Stephens R.E. (1970) Thermal fractionation of outer fiber doublet microtubules into A- and B- sub fiber components. A- and B-tubulin. J. Mol. Biol. 47, 353363.

341. Stephens R.E. and Lamieux N.A. (1998) Tektins as structural determinants in basal bodies. Cell Motil. Cytoskel 40, 379-392.

342. Steuer E.R., Wordeman L., Schroer T.A and Sheetz M.P. (1990) Localization of cytoplasmic dynein to mitotic spindles and kinetochores. Nature, 345, 266-268.

343. Stevenson V.A., Kramer J., Kuhn J., Theurkauf W.E. (2001) Centrosomes and the Scrambled protein coordinate microtubule-independent actin reorganisation. Nat. Cell Biol., 3, 68-75.

344. Stockinger L. und Cireli E. (1965) Eine bisher unbekannte art der zentriolenvermehrung. Zeitschrift fur Zellforschung und mikroskopische anatomie, 68, 733-740.

345. Stubblefield E. (1965) Centriole differentiation in cells in culture: Formation of basal bodies and cilia in Chinese hamster fibroblasts following Colcemid treatment. J. Cell Biol. 27, 101 A-102A.

346. Stubblefield E., and Brinkley B.R. (1967) Architecture and Function of the Mammalian Centriole. In: "Formation and Fate of Cell organelles" (Ed. K.B. Warren), New York, Academic Press Inc. 175-218.

347. Sullivan K.F. and Cleveland D.W. (1986) Identification of conserved isotypedefining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptideclasses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(12), 4327-4331.

348. Szollosi D. (1964). The structure and function of centrioles and their satellitesin the jellyfish Phialidium gregarium. J. Cell Biol. 21,465-479.

349. Szollosi D., Calarco P., and Donahue R. P. (1972). Absence of centrioles inthe first and second meiotic spindles of mouse oocytes. J. Cell Sci. 11, 521-541.

350. Taillon B.E., Adler S.A., Suhan J.P., and Jarvik J.W. (1992). Mutationalanalysis of centrin: an EF-hand protein associated with three distinct contractilefibers in the basal body apparatus of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 119, 1613—1624.

351. Tanaka T., Kimura M., Matsunaga K., Fukada D., Mori H., and Okano Y.1999) Centrosomal kinase AIK1 is overexpressed in invasive ductal carcinoma of the breast. Cancer Res. 59,2041-2044.

352. Terada Y., Uetake Y. and Kuriyama R. (2003) Interaction of Aurora-A and centrosomin at the microtubule-nucleating site in Drosophila and mammalian cells. J.CellBiol., 162(5), 757-763.

353. Theesfeld, C.L., Irazoqui, J.E., Bloom, K., Lew, D.J. (1999) The role of actin in the spindle orientation changes during the Saccaromyces cerevisiae cell cycle. J. Cell Biol., 146, 1019-1031.

354. Tilney L.G. and Goddard J., (1970) Nucleating sites for the assembly of cytoplasmic microtubules in the ectodermal cells of blastulae of Arbacia purtctulata. J. Cell Biol. 46, 564-575.

355. Toktiyama, Y., Horn, H.F., Kawamura, K., Tarapore, P., Fukasawa, K.2001) Specific phosphorylation of nucleophosmin on Thrl99 by cyclin-dependent kinase 2-cyclin E and its role in centrosome duplication. J. Biol. Chem., 276, 21529-21537.

356. Tournier F., and Bornens M. (1994) Cell Cycle regulation of Centrosome Function. In: Microtubules, Wiley-Liss, Inc. 303-324.

357. Tournier F., Karsenti E., and Bornens M. (1989) Parthenogenesis in Xenopus eggs injected with centrosomes from synchronized human lymphoid cells. Dev. Biol. 136, 321-329.

358. Tschachotin S.S. (1912) Eine Microoperationsvorrichtung. Zs. Wiss. Mikrosk. 29, 188.

359. Uzbekov R., Chartrain I., Philippe M., and Arlot-Bonnemains Y. (1998). Cell cycle analysis and conditions of synchronisation of Xenopus cell culture line XL-2. Exp. Cell Res. 242, 60-68.

360. Uzbekov R.E., Giet R., Arlot-Bonnemains Y., Prigent C. (2001) Role of pEg2 kinase in mitotic spindle construction process. Biol. Cell, V. 93, p. 337.

361. Uzbekov R., Kireev I., and Prigent C. (2002) Centrosome separation: respective role of microtubules and actin filaments. Biol. Cell, 94(4-5), 275288.

362. Vaizel-Ohayon D., and Schejter E.D. (1999) Mutations in centrosomin reveal requirements for centrosomal function during early Drosophila embryogenesis Curr. Biol. 9,889-898.

363. Vale, R. D. (1991). Severing of stable microtubules by a mitotically activated protein in Xenopus egg extracts. Cell. 64:827-839.

364. Vale R.D., Reese T.S., Sheetz M.P. (1985) Identification of a novel forcegenerating protein, kinesin, involved in microtubule-based motility. Cell, 42(1), 39-50.

365. Vallee R.B. (1992) Dynamin: motor protein or regulatory GTPase. J. Muscle Res. Cell Motil. 13(5), 493-496.

366. Vallee R.B. and Gee M.A. (1998) Make room for dynein. Trends Cell Biol. 8(12), 490-494.

367. Van Beneden E. cm. Beneden E. van.

368. Vandre D.D., Kronebusch P., and Borisy G.G. (1984b) Interphase-mitosis transition: microtubule rearrangements in cultured cells and sea urchin eggs. In: Molecular biology of the cytoskeleton (Borisy G.G., Cleveland D.M., Murphy D.B. editors), 3-16.

369. Vasquez R.J., Gard D.L. and Cassimeris L. (1994) XMAP from Xenopus eggs promotes rapid plus end assembly of microtubules and rapid microtubule polymer turnover. J. Cell Biol. 127(4), 985-993.

370. Vaughan K.T. and Vallee R.B. (1995) Cytoplasmic dynein binds dynactin through a direct interaction between the intermediate chains and pl50Glued. J. Cell Biol, 131(6 ptl), 1507-1516.

371. Vernos, I., and Karsenti, E. (1996) Motors involved in spindle assembly and chromosome segregation. Curr. Opin. Cell Biol., 8, 4-9.

372. Virchow R. (1855) Cellular-Pathologie. Arch. Fur Path. Anat., VIII., p. 23. Citation from Wilson (1900).

373. Vorobjev I.A., and Chentsov Yu.S. (1983) The dynamics of reconstitution of microtubults around the cell center after cooling. Eur. J. Cell Biol 30(2), 149153.

374. Walczak C., Vale R.D., Mitchison T.J. and Scholey J.M. (1999) The bipolar kinesin, KLP61F, cross-links microtubules within interpolar microtubule bundles of Drosophila embryonic mitotic spindles. J.Cell Biol, 144(1), 125138.

375. Walczak, C.E., Verma, S., Mitchison, T.J. (1997) XCTK2: a kinesin-related protein that promotes mitotic spindle assembly in Xenopus laevis egg extracts. J.: Cell Biol, 136, 859-870.

376. Walczak C.E., Vernos I., Mitchison T.J., Karsenti E. and Heald R. (1998) A model for the proposed roles of different microtubule-based motor proteins in establishing spindle bipolarity. Curr.Biol. 8, 903-913.

377. Wang D., Umekawa H., Olson M.O.J. (1993) Expression and subcellular location of two forms of nucleolar protein B23 in rat tissue cells. Cell Mol. Biol Res., 39, 33-42.

378. Wang S.Z. and Adler R. (1995) Chromokinesin: a DNA-binding, kinesin-like nuclear protein. J. Cell Biol 128, 761-768.

379. Webster D.R., Gundersen G.G., Bulinski J.C., and Borisy G.G. (1987a). Differential turnover of tyrosinated and detyrosinated microtubules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 9040-9044.

380. Webster D.R., Gundersen G.G., Bulinski J.C., and Borisy G.G. (1987b). Assembly and turnover of detyrosinated tubulin in vivo. J. Cell Biol 105, 265276.

381. Weingarten M.D., Suter M.M., Littman D.R., and Kirschner M.W. (1974) Properties of the depolymerization products of microtubules from mammalian brain. Biochemistry, 13(27), 5529-5537 .

382. Weisenberg R.C., Borisy G.G., and Taylor E.W. (1968) The colchicine-binding protein of mammalian brain and its relation to microtubules. Biochemistry, 7, 4466-4479.

383. Went H.A. (1977)- Can a reverse transcriptase by involved in centriole duplication? J. TheorBiol 68(1) 95-100.

384. Wheatley D.N. (1969) Cilia in cell-cultured fibroblasts. I. On their occurrence and relative frequencies in primary cultures and established cell lines. J. Anat. 105(2), 351-362.

385. Wheatley D.N. (1974) Pericentriolar virus-like particles in Chinese hamster ovary cells. J. Gen. Virol, 24(2), 395-399.

386. Wheatley D.N. (1982) The Centriole: a central enigma of cell biology. Elsevier Biomedical Press, Amsterdam/New York, 232 p.

387. Whitfield W.G., Chaplin M.A., Oegema K., Parry H., and Glover D.M.1995) The 190 kD centrosome-associated protein of Drosophila contains fourzinc finger motifs and binds to specific sites on polytene chromosomes. J. Cell Sci. 108, 3377-3387.

388. Whitfield W.G., Millar S.E., Saumweber H., Frasch M., and Glover D.M.1988) Cloning of a gene encoding an antigen associated with the centrosome in Drosophila. J. Cell Sci. 89, 467-480.

389. Wiese C., Wilde A., Moore M.S., Adam S.A., Merdes A., Zheng Y. (2001) Role of importin-beta in coupling Ran to downstream targets in microtubule assembly. Science, 291, 653-656.

390. Wiese C. and Zheng Y. (1999) Gamma-tubulin complexes and their interaction with microtubule-organizing centers. Curr. Opin. Struct. Biol. 9(2), 250-259.

391. Wilson E.B. (1925)"The Cell in Development and Inheritance." 3rd ed. The Macmillan Company, New York.

392. Wolfe J., (1972) Basal body fine structure and chemistry. Adv.Cell Mol. Biol. 2, 151-192.

393. Wolkowicz M.J., Naaby-Hansen S., Gamble A.R., Reddi P.P., Flickinger C.J., and Herr J.C. (2002) Tektin B1 demonstrates flagellar localization in human sperm. Biol Reprod. 66(1), 241-250.

394. Yaffe D., and Gershon D. (1967) Multinucleated muscle fibers: induction of DNA synthesis and mitosis by polyoma virus infection. Nature (London), 215, 421.

395. Yang J.T., Laymon R.A. and Goldstein L.S. (1989) A three-domain structure of kinesin heavy chain revealed by DNA sequence and microtubule binding analyses. Cell, 56(5), 879-889.

396. Yang S., Ayscough, K.R., Drubin, D.G. (1997) A role for the actin cytoskeleton of Saccharomyces cerevisae in bipolar bud site selection. J. Cell Biol, 136, 111-123.

397. Yen T.J, Li G., Schaar B.T., Szilak I. and Cleveland D.W. (1992) CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature, 359, 536-539.

398. Yvon A.M., and Wadsworth P. (1997). Non-centrosomal microtubule formation and measurement of minus end microtubule dynamics in A498 cells. J. Cell Sci. 110, 2391-2401.

399. Zatsepina O.V., Rousselet A., Chan P.K., Olson M.O., Jordan E.G., Bornens M. (1999) The nucleolar phosphoprotein B23 redistributes in part to the spindle poles during mitosis. J. Cell Sci., 112 (Pt 4), 455-466.

400. Zhang Z., Tanaka Y., Nanaka S., Aizawa H., Kawasaki H., Nakata T. and Hirokawa N. (1993) The primary structure of rat brain (cytoplasmic) dynein heavy chain, a cytoplasmic motor enzyme Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(17), 7928-7932.

401. Zheng Y., Jung M.K., and Oakley B.R. (1991) Gamma-tubulin is present in Drosophila melanogaster and Homo sapiens and is associated with the centrosome. Cell, 65(5), 817-823.

402. Zheng Y., Wong M.L., Alberts B., Mitchison T. (1995) Nucleation of microtubule assembly by a gamma-tubulin-containing ring complex. Nature, 378(6557), 578-583.

403. Zhou H., Kuang J., Zhong L., Kuo W.L., Gray J.W., Sahin A., Brinkley

404. B.R., and Sen S. (1998) Tumour amplified kinase STK15/BTAK induces centrosome amplification, aneuploidy and transformation. Nat Genet. 20, 189-193.