Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование структурной организации центросомы и ее взаимосвязи с другими клеточными компонентами

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование структурной организации центросомы и ее взаимосвязи с другими клеточными компонентами"

'Л

московский 'Государственный университет имени м.в.Ломоносова

йчнИпс«!!. Биологический факультет Г »о ;1иуп«м1наг)_;_____

Йен

£Й1КМЛЦГЗ На правах рукописи

НАДЕЗЩИНА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

удк 576.353:575.311

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ЦЕНТРОСОМЫ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗИ С ДРУГИМИ КЛЕТОЧНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ

03.00.25 - Клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского МГУ

Официальные член-корреспондент РАН, профессор, доктор биологических доктор биологических наук доктор биологических наук

оппонента:

наук Б.Ф.Поглазов

С.Г.Васецкий А. В.Зеленин

Ведущая организация: Институт канцерогенеза Онкологического научного центра РАМН

Защита диссертации состоится "/•!> " ,-?../199зг. часов на заседании Специализированного совета Д.053.05.68 при Московском государственном университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Диссертация разослана

199-Чг.

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

i. введение

I.I. Актуальность проблеш

I.I.I. Структура и функции центросомы - краткий обзор литературных данных

Центросома - это органелла эукариотической клетки, котсроГ; после длительной дискуссии в научной литература било дано определение "структуры, которая организует клеточ;ше микротрубочки, находится в клетке, как правило, в единственном числе и удваивается в каждом цикле клеточного деления параллельно

УДВОеНИЮ генетического материала" (Paweletz et al., 19S<!. Exp.Cell

Pes., 152: 47-65). Под организацией микротрубочок при этом понимают инициации их роста после экспериментального рззрушошя или при физиологических перестройках цитоскелета в ходе митотического цикла, либо просто тот факт, что значительная часть клеточных микротрубочек сходится к центросоме.

Микротрубочкм - наиболее лабилышй компонент цитоскелета; они постоянно и с достаточно высокой скоростью разбираются на субъединицы - молекулы тубулкна - и полимеризуются вновь. Сборка микротрубочек в клетке обычно происходит на специальных структурах. Любые клеточные компоненты, непосредственно инициирующие рост мшеротру бочек, называют центрами организации микротрубочек (ЦоМТ) (Pickett-Heaps. 1969. Cytobios, 1: 257-280). ЦОМТ часто являются центросомами, однако могут и не бать тлкоиымп. Например, множественные ЦОМТ, евзяанные с Сазалышми тельцами ресничек мультиресничшх клеток центросомами ке являются.

Структуры, отвечающие определению центросома, в клетках животных и растений бывают различных типив. У многих зщзиих растений, грибов и простейших животных, имзщих закрытий митоз, это полярные шапочки или полярные тельца - особые измененный участки ядерной оболочки. У жгутиковых организмов это сложный комплекс соединенных коннективами базалышх телец, лежащих р основа;ли жгутиков (Онищенко, 1982.. Успехи совр. Оиол., 94: 360-375). Строение самих базальных телец кино- и стереоцилий очень сходно у всех изученных организмов, от динофлагеллят до млекопитающих. Их основу составляет цилиндр из девяти триплетов микротрубочек, служащих как бы матрицей для образования Э периферических дублетов микротрубочек зксонемц. Связанные же с базальшл'л тельцами конкектиьы, сателлита, корешки и т.п., г,г5ыч!:;>

являющиеся ЦОМТ для 'датоплазмагаческих мжротру бочек, имеют эначательные видовые ОТЛИЧИЯ (Wheatley, D.N. 1982. "The Centriole: A Central Enigma of Coll Biology." Elsevier, Amsterdam. 232 p.).

Рис.1. Схема строения цектросош клетки позвоночных. Ц -центриоли; показаны также микротрубочки, отходящие от различных структур перицентриолярного материала. Размеры центриолвй - 0,2 мкм в диаметре и около 0,5 мкм в длину.

В клетках позвоночных животных, на которых в основном выполнено настоящее исследование, центросома (рис.1) состоит из центриолей, точно таких же по своей ультраструктуре органелл, что и описанные выше Оазальные тельца жгутиков и ресничек, а также из перицентриолярного материала, от которого непосредственно растут клеточные микротрубочки. в мягких условиях центросома может быть выделена из клеток как единое целое. Количество и структура перицентриолярного материала в центросоме меняются в широких пределах в зависимости от физиологического состояния клетки, в частности, в митотическом цикле; центриоли же остаются практически неизменными (Kuriyaraa, Borisy, 1981. J.Cell Biol., 91: 822-826; Vorobjev. Chentsov, 1982 . J.Cell Biol., 93: 938-949; Brown et al..,

1985. Europ. j. cell Biol., 37: 130-139). Центросома насекомых отличается от Центросомы позвоночных некоторыми мелкими деталями ультраструктуры центриолей и перицентриолярного материала.

Показано, что в центросоме всегда находятся минус-концы микротрубочек, а к периферии клетки обращены их плюс-концы

(Helderaann, Mcintosh, 1980. Nature (bond.), 286: 517-51У) , И ЧТО

центросома обычно расположена в геометрическом центре клетки (Euteneur, Schliwa, 1992. J. Cell Biol., 116: 1157-1166). Из ЭТОГО следует, что если мембранная органелла, передвигающаяся по клеточным микротрубочкам, направляется специфическим транслокатором к минус-концу микротрубочки, то она попадает в центр клетки, а если к плюс-концу - то к плазмалемме. в этом, вероятно,-и состоит биологический смысл> существования во многих клетках центросомы как единственного ЦОМТ.

Микрургическое удаление центросома из клеток не слишком сильно влияет на систему уже существующих микротрубочек. Однако ОНО приводит к блоку шготического цикла (Maniotis, Schliwa, 1992. Ceil, 67: 495—504). Полагают, что это происходит из-за того, что в центросоме аккумулируются клеточные регуляторные белки, в частности, регулирующие события митоза протеинкиназэ p34cdc2 и ЦИКЛИЯ В (Baily et at., 19Й9. EMBO J., 0: 3985т3995). ИвхаНИЭЫ И

смысл их аккумуляции в центросоме непонятны. Возможно, что регуляторные белки, которым необходимо взаимодействовать друг с; другом, концентрируются у минус-концов микротрубочек, расположенных в центросома. Таким образом, центросома может содернать молекулярные компонента, не относящиеся прямо к ее функционировании как ЦОМТ, а компартменгализованные в ней.

I.I.2. Актуальные вопросы в изучении цзктросош

Важность центросома как клеточной органеллы представляется очевидной. Тем не менее, многие вопросы, связанные с ней, остаются открыты ли. Так, до сих пор не известен механизм полимеризации на центросоме клеточных мтсротрубочек. Непонятно, и как образуется сама центросома - т.з. совокупность центриолей и перицзнгриолярного материала. Наконец, сложность строения центросомы заставляет предполагать, что ее функции полимеризацией шпфо трубочек и дает коштартментализацией ре гуля торных белков не ограничиваются. Поэтому необходимо исследовать как возможные клеточные Функции центросомы, так и ее структурную организацию на всех уровнях.

Полагают, что пошмо шкротрубсчек, центросома участвует в организации промэкуточвыг фнламентеда клетки. При разрушешш учкрэгрубочйя шь щх «cScrazz на itisiicy ¡ззкотсра г.агсболачасгш^

едз izixvz'i&z. осеттршйл околоя даркл.

;Л*;ЙГ3L\ а поолз е;-_: г-г^чь pacnpocrpaHrjrr".'

цитоплазме. Центросома обычно расположена в агрегате, к возможно, что реагрегация промежуточных филаыентов связана именно с ней

(Eckert et al., 1982. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 46: 403-412). Необходимо найти экспериментальные условия, в которых образовывался бы небольшой и динамичный агрегат промежуточных филаментов, чтобы проследить, как он будет соотноситься с центросомой.

Центросома, как правило, расположена возле ядра, и б движущихся по субстрату культивируемых клетках, где центросома быстро перемащается вслзд з? активным краем, расстояние между ней и ядром сохраняется минимальным. Это заставляет предположить, чго центросома структурно связана с ядром. Ранее было показано (Boinens, 1977. Nature (bond.), 270: 80-82; Nadezhdlna et al., 197S. Europ. J.Cell Biol., 19: 109-115), ЧТО ДейСТВИТвЛЬНО В

изолированных фракциях клеточных ядер содержатся центросомы, структурно связанные с ядром. Однако остается недоказанным, что эта связь существует и в аивых культивируемых кле,тках. Непонятно также, какие элементы цитоскелета могут в ней участвовать.

Неясно, к каким последствиям для клетки может привести искусственное смещениз центросомы из геометрического центра, в частности, смещение митотического веретена.

Иногда при терминальной дайЕеренцировке клетки могут утрачивать ценгрюли; например, это происходит с поперечнополосатыми мышечными волокнами. В зрелых мышечных волокнах перицентриоляршй материал ассоциируется с ядерной оболочкой, и в этих клетках содержится лишь небольшое количество микротрубочек (Connoly et al., 1985. Europ. J.Cell Biol., 39: 341-345). Неясно, как организована центросома (или ЦОМТ) в клетках, где нет центриолей, но мижротрубочек много, например, в гигантских клетках слганых желез двукрылых насекомых.

Из-за крайне незначительного объема, который центросомы занимают в клетках, и хрупкости перицентриолярного материала их трудно выделить для изучения биохимического состава в виде чистой изолированной фракции в препаративных количествах. Единственная группа исследователей, которым это удалось, показала, что белковый состав центросом крайне сложен (Bornens et ai., 1987. cell Motu. Cytoakeluton, it 238-249). Вероятно, ЧТО РЭЗЛИЧНЫМ Субструктурам,

входящий в состав центросомы и ценгриолярных цилиндров, должны соответствовать различные белки. Поэтому было Он существенно

научиться фракционировать центросомы на различные субструктуры,

- ♦ -

чтобы в дальнейшем более точно определять принадлежность того или иного белка х той или иной субструктуре. Кроме того, из некотори* экспериментальных данных следует, что в центросоме, помимо белков, может содержаться РНК, играющая структурную роль или даже роль автономного генома ценгриолей (went, 1977. Exp.ceii Res., 108: 63-73). Однако однозначных данных о наличии или отсутствии в составе центросом нуклеиновых кислот нет. Их было бы попытаться получить,- исследовав центросому цитохимическим методом Бернара, который позволяет выявлять РНК на ультратонких срезах.

Функциональным тестом на сохранность центросом при их выделении часто служит их способность индуцировать поело макроинъекции в ооцит xeropus lasvis шртенсгекетичсское дробление (Heidemann, Kircchner, 1975. J.Cell 3iol., 67: 105-117; Klotz et

ai., 1990. j.cell Biol., no: 405-415). Несмотря на активное использование этого теста, до сих пор ве установлено, что именно происходит с центросомами после их инъекции в ооцит.

Наиболее перспективным методом в изучеим белков центросомы является метод получения монсклояалышх антител: можно иммунизировать животных частично очищенным препаратом центросом и затем иметь моноклональние антитела к одному из белков. Существенным здесь является поиск функционально активных белков центросомы, особенно учествуида в полимеризации микротрубочек. Антитела к таким белсам должны блокировать сборку микротрубочек на центросоме.

1.2. Поль я задачи работы

Целью настоящей работы было исследование структуры, молекулярной композиции и клеточных функций центросомы. В работе были поставлены следу плие задачи:

1. Изучать, существует -ш структурная связь центросомы с Еяторфазкым ядром в живых культивируемых клетках. Использовать для этого метод ультрацентрифугирования клеток.

2. Исследовать, как влияет на протекание митоза смещение митотического веретена (в том числе центросом) из центра клеток, вызванное центрифугированием.

3. Еыявить методом .ультрацентрифугирования в клетках центр организации промежуточных фшаментов и установить, соответствует ли он по расположению в клетке центросоме.

4. Исследовать свойства системы миеротрубочек в гигантских ¡стетках слюнных желез личинок chirononus и выявить структуры, являюпиеся

них центрами организации микротрубочек.

5. Изучить устойчивость различных компонентов центриолей и центросом in vitro к экстрагирующим агентам.

6. Цитохимическим методом Бернара исследовать, есть ли в центросоме или в центриолях РНК.

V. Исследовать ультраструктуру цитастеров, образующихся в ооцитах xenopus laevis после инъекции в них препаратов центриолей или Оазальных телец.

8. Получить панели, моноклоналыэш антител к центросоме культивируемых клеток и использовать полученные антитела для идентификации новых белковых компонентов центросомы, важных для ее функционирования.

1.3. Научная новизна работы

В работе впервые продемонстрировано, что в живых культивируемых клетках существует структурная связь центриолей с ядром, которая нарушается при действии цигохаяазина В, повреждающего актидавый цитоскелвт. Получено уникальное явление блокирования митоза на стадии метафазы без разрушения мжротрубс-чек веретена, возникающее при искусственном смещении веретена.

С помощью ультрадантрифугнрования янвых клеток впервые убедительно показано, что центросома является центром организации не только мпфотруОочек, но и прог-йнгутсчннх фйламэнтов метки.

Впервые изучена система микротрубочек в гигантских клетках слюнных желез личинок chironomus и показано, что зтн клетки содержат мнокествешше бесцентриоляряке ЦОМТ, часть которых связана с ядерной оболочкой.

Исследовэна устойчивость выделенных центриолей и центросом культивируемых клеток к экстрагирующим воздействиям и впервые установлено, что структурной основой центриолей является их матрикс, а не микротрубочки триплетов.

Впервые показано, что инъецированные в ооцит xenopus laevia экзогенные центриоли замещаются центриолями из собственного материала ооцита. Это меняет существовавшее ранее представление о том, что экзогенные центриоли в яйце только аккумулируют на себе существувдий ■ там в диспергированном виде перицентриолярный материал.

Получены уникальные панели моноклональных антител к цитоскелегным клеточным структурам, в том числе к центросомам.

Выявлены свойства ранее не известного антигена, узнаваемого моноклональными антителами sn-зсв, который располагается п микротрубочках, непосредственно отходящих от центросомы. Обнаружен антиген интерхроматиновых районов клеточного ядра, доступность которого для антител меняется при действии на клетку агентов, разрушающих микротрубочки, что является первым экспериментальным доказательством существования структурных изменений клеточных ядер в ответ -на изменения, происходящие в цитоскелете. С помощью моноклональных антител rn-c6 выявлен высокомолекулярный фосфопротеин и впервые показано, что он участвует в связывании ДНК с ядерным матриксом в ядре и в сборке микротрубочек на центросоме. Эти данные раширяют представления о молекулярном устройстве центросомы и о механизме полимеризации на ней микротрубочек.

1.4. Научно-практическая ценность работы

Данная работа относится к числу фундаментальных научных исследований. Полученные результаты, значительная часть которых является принципиально новой, расширяют представления о биологии клетки и могут быть использованы при написании учебников, в чтении' курсов лекций и разработке новых научно - исследовательских программ. Разработанные методы, в частности, метод ультрацентрифугарования яквых прикрепленных к субстрату клеток или метод выделения базальных телец из молоки рыб, а также полученные мояоклональнне антитела к центросоме,'цитоскелетным структурам и клеточному ядру могут применяться и уже применяются в практической исследовательской работе других лабораторий.

1.5. Алробзщя работа

Материалы диссертации были представлены на xvl конференции ФЕБО (Москва, 1984), на рабочем совещании по молекулярным аспектам цитоскелете (Тбшисн, 1987), нз Г/ и v Всесоюзных совещаниях и II школе по нэмшечвым формам подвижности (Чернигов, 1984, 1988, Лосево, IS89), на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 1591), на х Всесоюзном симпозиуме "Структура я функции клеточного ядра" (Гродно, 1990) и на 12 Европейском рабочей совещании по клеточному ядру .(Ле-Дьяблорв, 199Г).

- ? -

2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2 Л.Биологические материалы

Б работе использовала культивируемые клетки линий кеьа (карцинома шейки матки человека), СПЭВ (эмбриональный эпителий почки свиньи), L-клетки (трансформированные ф1бробласты мши), рзхбз Ад8.653 (ипзлома мыши), ват (эпителий трахеи эмбриона быка), BlII-II-FaF-23? (фиОробластк китайского хомячка) и эмбриональные фиброблэсты мыши и человека. Клетки культивировали в средах 193, вмк, имЕ али EPMI, в завясшостк от типа клеток, с добавлением 10% эмбриональной или постнатальной сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиков. Гкбридоьшые клонн культивировали в среде крмх с добавлением 15% эмбриональной сыворотки, э-меркаптозханола, гшюкезнтина, тимидина и гентамицина. Для экспериментов клетки монослойных культур рассовали на покровные стекла, обычно покрытыз полилизином, и выравдшали 1-2 су т. в среде с 5% С0о.

Созревание ООЦИТОВ Xenopus laeviB проводили ill vitro под действием прогестероне и хориогенина. О созревании судали по изменении шгменхного рисунка.

СЛВННЫе железы ЛИЧИНОК Chi г о.юти s clngulatus (мотыля) получали от особей, выдержанных без кормления в часто сменяемой проточной воде в течение 15 - 20 сут. для уменьшения содержания в клетках секрета.

2.2. Химические реактивы

В работе использовали тонкие химические реактивы и препараты фйрмеНТОВ Производства фирм Sigma Inc., Serva И CalbLochem, глютаровый альдегид,' хлориды магния и кальция и фосфатные соли фирмы Merck; другие неорганические соединения, глицерин и сахарозу производства Реахима. Таксол был любезно предоставлен доктором M.saffness (США).

2.3. Антитела

Поликлоналыше аф!ишо очищенные антитела к тубулину, полученные в кролике, и моноклональные антитела к виментину, клон NT-эо, были любезно предоставлены И.С.Тинт. Человеческие аутоиммунные антитела к малым ядерным РНП были любезно предоставлены профессором А.В.Поверенным и М.А.Семеновым. Моноклональные антитела yI2 к sm-антигену малых ядерных (мя) РНП и моноклональные антитела «sc35 к сплайсинговому фактору, не

- в -

входящему в мяРНП, были люЗезно предоставлены профессором H.G.Gail (США).

Моноклональные антитела к а-тубулину, клон dh-i, а также моноспецифические антятела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека, полученные в козе или кролике, конъюгированные с флюоресцешизогиоцианахом (fitc) , триметилродэмкнизотиоцизнзтом (tritc) юш пароксидазой Храна , были производство фирмы Sigma Inc .

2.4. Сватсоптические исследования

Для выявления в культивируемых клетках центриолей на светооптическом уровне использовали окрашивание кедезним гематоксилином но методу Ченцова с соавт. (Ченцов и др., 1982. Цитология, 24: 243-247).

Для иммунофяуорасцентного окрашивания культивируемых клеток чаще всего использовали метод фиксации по Вернадскому с соавт. (Bershadsky et al., 1979. Cell Biol. Int. Rep., 3: 45-50), при

котором клетки предварительно пермеабилизовывали в растворе детергента, а затем фиксировали 2% свежеприготовленным раствором' парвформальдэгида на фосфатно-солевом физиологическом буфере (pbs) или 0,5% глютаровым альдегидом на pbs. Применяли также непосредственную $инсацюо культивируемых клеток 3% пзраформальдегидом, глютаровш альдегидом или абсолютным метанолом при -20°С. Иммунофлуоре сцеигнсо окрашивание проводили по стандартной методике. Использовали метод Кунса, т.е. клетки сначала инкубировали с 'антителами к внутриклеточным компонентам, а затем - с акоиввдовши антителами, конъюгированннми с флуорохромами.

Притазнзшше наблюдения клеток проводили в герметичной камере со средой культивирования при 3?°С.

Все светоошягаеские наблюдения проводили на Фотомикроскопе-3 фцш Opton, Использовали Объектива Neofluar И Planapo, 40х, 63х и юох; из методов наблюдения применяли, фазовоконтрастинй, флуоресцентный и в проходящем свете.

2.5. Электронная микроскопия

Для электрониошпсроскошческого исследования культивируемые клетки, изолированные фракции клеточных органелл, ооциты xenopus laavis а другие объекты исследования фиксировали 0,5 - 1.0* глютаровым альдегидом.. на pbs, если они предварительно били

подвергнуты пермеабилизации, или 2,5£ глюгаровым альдегидом на фосфатном буфере Зеренсена, если речь ила об интактных клетках. Затем материал дополнительно фиксировали 1% oso4, проводили через спирты возраставдией концентрации, дополнительно контрастировали 2% раствором уранилацетата в 70$ спирте и заключали в эпон по стандартной методике. Если предполагалось проводить дифференциальное окрашивание РНК по методу Бернара, то материал не обрабатывали ни oso4, ни уранилацетагом.

Ультратонкиэ срезы изготавливали на ультратоме ькв-з, монтировали на бленда с фзрмваровой подложкой, окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу.

Злектрошю микроскопические наблюдения и фотографирование проводили в электронных микроскопах ни-ив и ни-12 фарш Hitachi при ускоряющем напряжении 75 юл

2.6. Центрифугирование живых прикрепленных к субстрату клеток

Для центрифугирования клетки культуры СПЭВ и ь-клетки, выращенные на покровных стеклах размером 9x18 мм, помещали в прорезь специального вкладыша в центрифужные пробирки который предохранял стекла от разрушения. Центробежная сила при этом оказывалась направленной под углом около 20° к плоскости стекла с клетками. Пробирки заполняли средой культивирования. Центрифугирование проводили в роторе с откидывающимися стаканами sw-5o центрифуги spinco L2-65B фирмы Beckman. Температура ротора была либо комнатной, либо (особенно в экспериментах, связанных с изучением митоза) поддерживалась на уровне 34 - 38°С.

Рис. 2, Схема измерений центрифугированной клетки. Объяснения см. в тексте, cfv - направление вектора центробежной силы

Результаты экспериментов по центрифугированию требовали

количественой оценки. Центрифугированные и контрольные клетки измеряли либо с помощью окуляр-микрометра в препаратах, окрашенных железным гематоксилином, либо на фазовоконтрастных микрофотографиях препаратов. Схема измерений представлена на рис.2. Строго вдоль длинной стороны покровного стекла (что совпадало с направлением центробежной силы) в клетках измеряли общую длину (А), диаметр ядра (В), расстояние от центрипетального края клетки до ядра (С) и до центриоли (Е), расстояние от ядра до центробежного края клетки (с) и расстояние от центриоли до ядра (р). Результаты измерений подвергали статистической обработке по стандартной программе и оценивали различия по критерию Стьюдента.

2.7. Препаративное выделение субклеточных фракций

Препарат, обогащенный центриолями из селезенки крупного рогатого скота, выделри по методу, описанному ранее (Nadezhdina et al., 1978. Cell Biol. Intern. Rep., 2: 601-606), исключая последнее центрифугирование в сахарозном градиенте.

Центриоли из печени крыс выделяли по той же методике, но фосфатный буфер изначально бал заменен 20 мм ГЭА pH 7,6.

Базальные тельца (центросомы) из сперматозоидов вьюна выделяли ПО методу Maller et al. <Exp.Cell Res., 1976, 99: 285). Вкратце, -сперматозоида сначала гомогенизировали в растворе, содержавшем Тратон Х-100, и отделяли головки от дебриса центрифугированием в растворе сахарозы. Затем головки инкубировали в 12 мМ ЭДТА, что приводило к диспергированию хроматина, гомогенизировали препарат и получали осадок центросом центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Осадок несколько раз переосаждали в 20 мМ ТЭА pH 7,4.

Препарат микротрубочек получали из мозга крупного рогатого скота с помощью циклов деполимеризации - полимеризации микротрубочек, как описано в работе sheianski et ai. (Proc.iJatl.Acad.sei USA, 1973, 70s 765 -768} с модификациями ПО Кузнецову С СОЭВТ. (FEBS Lett., 1978, 95: 339-342). БбЛКИ, ассоциированные с - микрогрубочками, отделяли от тубулина хроматографией на фосфоцеллюлозе по методу Weingarten et al. (Proc.Natl.Acad.Sei. USA, 1975, 72: 1858-1862). ОЧИЩвННЫЙ ОТ ассоциированных белков тубулин получали по методу seinto et ai. (Cell Motu. Cytoskel., 1992, 22: 7-24) полимеризацией микротрубочк в 0.5 M PIPES pH 6,9, I MM MgClr -I ММ ЭГТА И 2,5* DMSO.

2.8.Получение иоиоклональных антител к белкам, ассоциированным с

шшротрубочками мозга, и к центросоме

Для получения моноклоналыш антител использовали препарат белков, ассоциированных с микротрубочками мозгэ, и препараты центриолей из селезенки крупного рогатого скота и базальных телец спермзхозоидов вьюна, выделенные, как описано в п.2.7. Эти препараты обрабатывали трихлоруксусной кислотой; полученный осадок многократно промывали абсолютным ацетоном а высушивали на воздухе. Для шмунизации мышей препарат суспендировали в pbs, смешивали с полным адыовантом Фрейда и вводили внутрибрюшинно из расчета 0,5 - I да белка на одно животное. Бустирование проводили внутривенной инъекцией того ко количества препарата без адыовзнта; через 3 дня после бустировашя животных умерщвляли н сливали I08 клеток I« селезенки с I07 клеток шеломы гзхгз Ад8.б53 с помощью полиэтменгликоля. Гибрщдаые клетка выращивали в селективной среде, Скрляшг клонов проводили с помощью иммуноферменхного анализа (для белков, ассоциированных с микротрубочками мозга) или с помощь» иммунсфлуорасцентного окрашивания культивируемых клеток СПЭВ. Клоны, продуцирующие антитела искомой специфичности, реклонировэли триады. Для экспериментов использовали как среду, кондиционированную клонами, так и аещткую шдкость от шлаей, в брюшную полость которых вводили гибридомнке клетки,

2.9. Электрофорез и имыунноблоттинг белков

Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле по

МеТОДУ Laenimli (Nature, 1970, 227; 4406-4412).

Для иммуноблоттинга белки из полиакриламидных гелей переносили на нитроцеллюлозные фильтры методом полусухого электрофоретического переноса и далее окрашивал! фильтры антителами, как указано в работе Towbin et ai. (proc.

Natl.Acad.Sei. USA, 1979, 76: 4350-4354). ВТОрЫв ВИДОСПвЦИфИЧеСКИв

антитела были конгыогированы с пероксидазой хрена; для ее выявления использовали 4-хлор-1-нзфтол.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Интерфазное ядро в живых культивируемых клетках структурно связано с центросомой

Ранее било показано (Bornens, 1977. Nature, 270: 80-82; Nadezhdina et al., 1979. Europ.J.Cell Biol., 19: 109-115; Karo, Bornens, 1980. 3iol.Cellulaire, 39: 287-290), ЧТО В препаратах

Евделешшх из печени крыс или из культивируемых клеток ядер содержатся центросомы, структурно связанные с ядерной оболочкой. Ассоциация центросом с ядрами в этих препаратах моглз, однако, возникать артефактно, например, в процессе гомогенизации клеток. Чтобы выяснить, существуот ли связь центросомы с ядром с живых клетках, необходимо было вызвать перемещение ядер в клетках и проследить, будут ли при этом перемещаться " вслед за ниш центросомы. Наиболее адекватным методом для этого нам представлялся метод ультрацентрифугирования живых клеток.

Центрифугирование живых клеток довольно ширско применялось в эмбриологических я цитологических исследованиях с конца прошлого века вплоть до 60-х годов нынешнего, когда оно было почти забыто, как нам кажется, незаслуженно. Б основном подвергали центрифугированию яйцеклетки для их разделения на фрагменты (Anderson, 1970.J. cell Biol., 47: 711-733) и клеточные суспензии или кусочки тканей в изогшкнических растворах для исследований ВЯЗКОСТИ и поверхностного натяжения клеток (Eeams, Kessel, 1968. Cancer Res., 28s 1944-1951), Центрифугирование клеток монослойных культур, прикрепленных к стеклу, ранее никем не применялось.

В некоторых работах расположение органэлл в центрифугирована в изошшшческом растворе клетках было исследовано на светооптическом а ультраструктурном уровнях и показано, что клеточные ядра при соответствующих ускорениях могут седаментировать к центробежному краю клеток, а остальные оргзнеллы разделяться на СЛОИ - стратафгамроваться (Bessis, Thiery, 1955, Revue d'Heroatoiogie, 10: 583-605). Поведение шгоскелетннх структур и возможная ассоциация с ниш других органелл никем не исследовались, так как в то время цитоскелет еще не был открыт.

Мы предположили,. что раз ядра гомогенизированных клеток увлекают за собой связанные с ними центросомы, сегментируя в пробирке, то они могут увлечь за собой центросомы и при седиментации в живых клетках, если связь центросомы с ядром там действительно существует. Поэтому мы подвергли живые распластанные

по стеклу клетки культур СПЭВ, рвт и ь-клеток центрифугирование, как описано в разделе 2.6, и проследили за перемещениями в них ядер и центросом.

Сначала необходимо было подобрать центробежное ускорение, вызывающее перемещение ядер, но не приводящее к гибели клеток. Оказалось, что вязкость клеточного содержимого настолько велика, что после центрифугирования при комнатной температуре вплоть до 15 мин при 20000 g ядра заметно не смещались. При 3?°С смещение ядер начиналось после 15 мин при 10000 д. Центрифугирование при 70000 д приводило к повреждению клеток; они начинали окрашиваться трипановым синим. Для дальнейших экспериментов мы выбрали центрифугирование клеток в течение 30 - 120 мин при 10000, 20000 и 40000 д, приводившее к смещении ядер к центробежному краю клеток (рис.3). Окрашиваний витальными красителями показало, что такого воздействия клетки сохраняли жизнеспособность. ■

Рис.3. Центрифугированные при 40000 д в течение 30 мин клетки культуры СПЭВ. Стрелками указаны центросомы, Окрашивание железным гематоксилином по Ченцову с соавт.

На электронномикроскопических фотографиях центрифугированных клеток было видно, что их ядра были смещены к центробежному краю клетки, и под ними оставалась небольшая полоска цитоплазмы. Клеточные - органеллы были стратифицированы: митохондрии занимали зону сразу над ядром и по его боковым сторонам; лшшдные капли

скапливались на центрипетальном полюсе клетки.

Сначала мы решили изучить", будет ли расположение ядра в клетках восстанавливаться после центрифугирования, т.е. не приводит ли центрифугирование к необратимому повреждению цитоскелетнюс структур. № подвергали живые монослойные культуры клеток СГОВ и fbt ультраценгрифугированию при 20000 g в течение 2 час; температура ротора была комнатной. После центрифугирования стекла с клетками возвращали в чашки Петри со средой культивирования при 37°С и фиксировали через 3, 6 и 22 час восстановления.

При фаэовоконтрастном микроскопическом исследовании через 6 ч восстановления клеток смещение ядер было гораздо менее заметным, чем сразу посла центрифугирования,а через 22 ч восстановления клетки были неотличимы по внешнему виду от контрольных. Таким образом, смещенные к периферии клеток в результате центрифугирования ядра действительно постепенно возвращались к центру клеток.

Чтобы более точно охарактеризовать процесс перемещения ядер от периферии к центру клеток, ш провели измерения контрольных и' центрифугированных клеток в разные сроки после центрифугирования по схет, отраженной на рис.2 (в данных опытах рэсшонение центросомы не учитывали). Оказалось, что в результате центрифугирована длина клетки и диаметр ядра практически не менялись. Для количественной оценки расположения ядер в клетках мы выбрали безразмерную величину с/о, т.е. отношение расстояния от центршетальной границы клетки до ядра (с) к расстоянию от ядра до центробежной границы клетки (d), взятыми по одной линии, параллельной вектору центробежного ускорения (длинной стороне покровного стекла с клетка®), и проходящей через центр ядра.

Результаты измерений приведены в таблице I и на рис.4.

Анализ разброса значений c/d в контрольных клетках показал, что только в третьей части клеток ядро на выбранном направлении измерений действительно лежало в . геометрическом центре (0,6<{C/D)<1,6), а в остальных клетках оно было заметно смещено к какому-либо краю клетки (рис. 4а). Среднее значение c/d при этом не отличалось от единицы. После центрифугирования клеток (0 ч в табл. I) средняя величина c/d сильно увеличивалось, однако на гистограмме распределения значений с/о (рис. 4 б) было видно, что у части клеток ядра оставались расположенными в центре клеток или даже в их центрипетальной части. В результате центрифугирована

происходило как бы смещение всей гистограммы распределения вправо, без особого изменения ее форма. Это говорит о том, что какие-то клеточные структуры ограничивали возможности ядер к паремещешям по клетке.

Через 3 к 6 ч посла центрифугирования соотношение с/о было более близка-) к контрольному, а через 22 ч не отличалось от контрольного (табл. I, рис. 4 б, г).

Таблица 1. Расположение .ядер (соотношение С/и) в культивируемых клетках после ультрацентркфугировзния и 'в различные сроки восстановления после него

культура клеток вариант эксперимента время после центрифугирования

контроль о ч 3 ч 6 Ч 22 ч

FBT I 1,3—0,2 3,7*1,0 1,9*0, 4 - 1,5*0, 5

СПЭВ I 1,3*0,3 3,1*0,7 2,2*0, •i 2,0*0, 5 1,4*0, 3

II - 3,3*0,8 - 1,5*0, 4 0,95*0, 2

III - - 2,7*0, 6 - 1,4*0, 4

IV - 3,3*0,7 2,1*0 9 1,6*0, 5 -

V - - - 2.8*0, 9 -

Обозначения в таблице: варианты эксперимента! I Овз дополнительны* воздействий! XI - 0,1 мкг/мл нокодаэолв лобавлено в среду перед центрифугированием; III - ю мкг/ил нокодазола добавлено в среду сразу после центрифугирования; IV -10 мкг/мл нокодаэола дооавлено в среду за 16 час до центрифугирования; V - 2 мкг/ил цитохалазинв В добавлено в среду сразу поело центрифугирования.

Иммунофлуоресцентиов исследование показало, что в клетках СПЭВ и гвт система микротрубочек после центрифугирования практически не менялась. Промежуточные филаменты в клетках .СГОВ всплывали к центрипетальному краю клеток (это явление будет подобие рассмотрено в следующем разделе), однако их расположение в клг.тк-ях полностью восстанавливалось за 2 ч, когда восстановление положения ядер было еще далеко не окончательным. Таким образом, лишние ядер к центру клеток происходило при наличии нормальной ¿vm микротрубочек и промежуточных филаментов. Окрашивание клеток

- lü -

СПЭВ фаллоидином, меченым родамином, показало, что и--актин в них сосредоточен в кортикальном слое, что обычно для эпителиальных клеток, отдельные небольшие стресс-фибриллы можно увидеть только в ламелле краевых клеток островков, и какие-либо содержащие актин структуры в околоядерной области не выявляются.

Рис. 4. Гистограммы распределения величины с/о в клетках СПЭВ. а - контрольные клетки; б - клетки сразу же после центрифугирования; в. д, е - через 6 час после центрифугирования; д - действие 0,1 мкг/мл нокодазола; е - действие 2 мкг/мл цитохалазина В; г - клетки через 22 ч после центрифугирования.

По горизонтали - величина с/о; по вертикали - доля клеток о данным значением с/о, х.

Чтобы выя1. 'ть, какие цитоскелетшв структуры участвуют в перемещении ядер к центру клеток, ш воздействовали на клетки нокодззолом и цитохалазином В. В концентрации 0,1 мкг/мл нокодозол приводил к фрагментации и дезорганизации сети микротрубочек, а в концентрации 10 мкг/мл - к быстрому и полному разрушению этой сети. Агрегация сети промежуточных фнламзнтов развивалась через 4 -6ч дейстзия нокодазола, поэтому, изменяя время добавления агента - за 16 ч до центрифугирования, немедленно перед ним или сразу после него - т наблюдали перемещение ядер как при полностью агрегировавших промежуточных Зиламентах, гак и при их практически нормальной сети, причем в обоих случаях без микротрубочек. Цитохалазин В в обычно применяемой концентрации 10 мкг/мл за время, необходимое для эксперимента, приводил к сильной эрборизации клеток, делавшей измерения невозможными. Поэтому мы применили 2 мкг/мл цитохалазина В, которые частично разрушали актиновые структуры.

В клетках СПЭВ скорость восстановления центрального расположения ядер в присутствии нокодазола либо не отличалась от

^л 1—1-11111_I_1—1_ I I I 1. 1 I_I_I_к__

а« 1.о 2.з г.л ол ч.о г.? лз

- п -

контрольной, если яд .был добавлен в среду сразу после центрифугирования, либо превосходила контрольные значения,, если яд добавляли заранее (р<0,05). Через 22 ч ядра возвращались к центру клеток. Разброс значений с/о а клетках через 6 час после центрифугирования, находящихся под действием нокодаэола (рис. 4 д), был меньше, чем в контроле. Б присутствии в среде 2 мкг/мл цитохалазина В скорость возвращения ядер к центру клеток была меньше, чем в контроле (р<0,05), а гистограмма распределения с/о имела гораздо больший разброс (рис. 4 е).

•Таким образом, центрифугирование живых клеток в выбрайном режиме не вызывало в них видалых необратимых изменений; смещенные ядра постепенно возвращались к центру клеток. Вперемещении ядер от периферии к центру клеток участвовал актиновый компонент цитоскелета, а микротрубочки и промежуточные фкламенты скорее мешали, чем способствовали, этому перемещению.

Чтобы ответить на основной вопрос, ради ответа на который проводились эксперименты по центрифугированию клеток - связано ли ядро с центросомой в живых клетках, необходимо было установить, увеличивается ли расстояние между центросомой и ядром при седиментации ядер в клетках, и не происходит ли седиментации самой центросомы. Мы центрифугировали клетки в различных режимах, фиксировали их сразу после центрифугирования, окрашивали железным гематоксилином по методу Ченцова с соавт., как описано в разделе 2.4, и измеряли по полной схеме, приведенной на рис.2. Результаты измерений отражены в Табл. 2-4.

Табл.2. Параметры клеток СПЭВ после центрифугирования в течение 30 мин при различных ускорениях (37°С).

вариант опыта А В С D Е Р

контроль 10000 g 20000 д 40000 g 42,1-1,6 14,8—0,5 42,6-1,0 14,5-0,3 4 2,7-0,9 13,5-0,3 41,0-1,4 12,4-0,3 13,В^1,1 13,5-1,1 21,5-1,3 6,5-0,6 24,9-0,8 4,4-0,4 23,1-1,1 5,6-0,5 21.0-0,9 21,6-1,1 24.1-0,9 21,8-1,2 1,1-0,2 2,0-0,2 2,1-0,2 1,9-0,2

Обозначения в таблице: « - длина клеток; в - диаметр ядер; с -расстоицие от центриаетальвоИ границы клетки до ядра; о расстоицио от ядра ао центробежной граикцн клетки; с - расстояииь от иомтрииеталыюй границы клетки до центриоли; г - расстояние от цавгриолм до ядра (см. также рис.2). Расстояния даны в ики - s.o.

Табл.3. Параметры клеток СПЭВ после центрифугирования в различных режимах при комнатной температуре

вариант опыта А В С 0 Е Р

контроль 40 - 30 ■ 40-60 СВ,15-15 37.6-1,9 12,4-0,8 37.7-1,7 12,2-0,5 38,4-2,6 11,7-0,4 33,8^1,5 12,7—0,4 13,0-1,0 12,5-1,2 22.0-1,4 4,4-0,4 22,9-2,2 3,2-0,3 17.1-1,2 4, 1—0, 7 17, 6-0,8 21,3-1,1 21,3-1,5 16,6^1,1 1,1*0,1 1,8-0,3 2,1-0,3 4,0-0,6

Обозначения в таблице: 40 - 30 - центрифугирование при 40000 д в течение 30 мин; 40 - 60 - центрифугирование при 40000 д в течение 60 мин; СВ. 16-15 - клетки инкубировали с 10 мкг/мл цвтохалазииа В 4 чао перед центрифугированием и центрифугировали в присутствии цитохалазина В при 15000 д в течение 15 мин. Остальные обозначения как в табл.2.

Из данных, праведеных в таблицах, видно, что длина клеток <а) при центрифугировайии практически не менялась. При этом ядра никогда не достигали центробежного края клеток; , под ниш всегда оставался слой цитоплазмы в несколько мкм. Абсолютное смещение' ядер в клетках прз центрифугировании (изменение величины с) составляло 7-9 мкм. Цэнтросош в ь-клетках при центрифугировании не смещались, то есть величина к не изменялась. В клетках же СПЭВ она смещались ъ цэнтробешом направлении на 3- 4 мкм (Р<0,01). Расстояние между центросомами и ядром в результате центрифугирования в клетках СПЭВ увеличивалось на I мкм (р<0,01), а в ь-кявтках но изменялось (р>0,05). То, что центросом:! в клетках после центРЕЩупгррваЕИЯ располагались на разсстояшш около 2 мкм от ядра, было вндао я на электронных микрофотографиях этих клеток.

Табл.4. Параметры ь-клеток после центрифугирования з течение различного времени щт 40000 д (комнатная температура).

вариант ошта А В С .0 Е V

контроль 30 пин 60 мин 35,3-1,8 15, 3-0,5 31,0-1,6 14,0-0, 9 32,0-1,5 12,3-0,6 10,0-1,2 9,5-1,1 15.4-1,1 1,8-0,2 17.5-1,7 2,3-0,3 17,2-1,8 15,6-1,1 17,5-1,3 1,3-0,2 1.«±0,3 1,5-0,2

Обозначения - как в таол.2.-

- "19"-

Из данных таблиц также следует, что ядра и центросомы занимали некоторую определенную позицию в клетках уже через 30 мин центрифугирования при 2СООО д (3?°С) или 40000 д (20°С). Продолжение центрифугирования или увеличение его скорости не приводили к дальнейшему смещению ядер или центросом или к изменению расстояния между ними, хотя, как уже говорилось, ядра никогда не досгкгалк цекгробвюгого края клеток. Это показыззет, что я;соа били ограничены в возможности своего перемещения по клетке, и что в использованных рвкимах центрифугирования центросомы не сздиментировади в клетках сами rio себе.

Поскольку в литературе имелись сведения с том, что

ЦИТОХЗЛаЗИН В Нарушает СВЯЗЬ ЦеНТрОСОМЦ С ЯДРОМ (Maro,. Bornens, 1980. Bioi.Celluiaire, 39:287-290), К ПОСКОЛЬКУ МЫ уже

удостоверились сами, что цитохалазин В влияет на внутриклеточную подвижность ядер, ш применили обработку клеток этим агентом. Оказалось, что при действии на клетки цитохалазина В ядра могут перемещаться на то же расстояние, что в контроле, при меньшем ускорении к времени центрифугирования (табл. 2). Центросома при этом не меняла своего расположения в клетке, и расстояние от центросомы до ядра сильно увеличивалось, ь-клетки настолько сильно арборизнровались при действии на них цитохалазина Е, что их было невозможно измерить. Однако по электронномикроскопическим данным в ь-клетках, центрифугированных при действии цитохалазина В, растояние от центросомы до ядра также увеличивалось и достигало почти 5 мкм. Нами тага били получены данные (эти данные втаблкцах не приведены), что действие агентов, раэрушавдх микротрубочки, не приводит к увеличению расстояния между центросомой и ядром при центрифугировании.

Таким образом, при центрифугировании живых культивируемых клеток ядра движутся в центробежном поле и либо увлекают за собой центросому, которая смещается вслед за ними из центра клетки, либо "повисают" в клетках в такой позиции, что расстояние от них до центросомы не изменяется. При действии на клетки цитохалазина В центросомы перестают следовать аа седиментирунцими ядрами. Это говорит о том, что в живых клетках действительно существует структурная связь центросомы с ядром, которая нарушается при Дййетиии цитохвдазина В, т.е. при нарушении актинового компонента цитоскелета.

Такой вывод подтверждается рядом данных, полученных другими аморнми. Известно, что при энуклеация клеток в присутствии

цитохалазина В центросома обычно остается в цитопластв и очень редко попадает В кариопласт (Goldman et al., 1975. Exp.Cell Res., 93: 175-183), тогда как при энуклеации интактных клеток центросома удаляется ИЗ НИХ вместе С ядром (Karsenti et al., 1984. .J.CeJ 1 Biol., 98: 1763-1776). Показано такая, что цитохалазин D (аналогичный по своему действию цитохалазину В) ингибирует внутриклеточные перемещения центросомы в лейкоцитах в ответ на внешние стимулы (Euteneur, Schliwa, 1985. J.Cell Biol., 101: 96-103).

В выделенных из интерфазных клеток комплексах центросомы с

ЯДОЗМ (Dales et al., 1973. J.Cell Biol., 59: 643-660; Bornens, 1977.Nature, 270: 80-32; Nadezhdina et al., 1979. Europ.J.Cell Biol., 19: 109-115; Haro, Bornens, 1980. Btol.Cellulaire, 39:287-290; Nelson, Traub, 1982. Cell Biol. Intern. Rep., 6:

215-223) после обработки их Тритоном X-I00 мевду ядрами и центросомами можно найти в основном промежуточные филаменты. Однако показано, что такие комплексы можно выделить я из клеточных ЛИНИЙ, лишенных промежуточных филаментов (Nelson, Traub, 1982.Cell Biol.intern. Rep., 6: 215-223), тогда как они не выделяются из' клеток, обработанных цнтохалазшом В (Haro, Bornons, 1980.

Biol.Cellulaire, 39:267-290).

Центросома явялется центром организации клеточных мнкротрубочек; ..роме того, как будет подробно описано в разделе 3.3, она организует и-промэзуточные фаламента клетки. Структурная связь центросош с этими компонентами цитоскелете изучена сравнительно хорошо. Из нзпшх данных следует, что центросома взаимодействует и с актиновыкш филаментзми, причем это взаимодействие моеэт играть больиув роль в клетках. Счсьидно, что оно заслуживает отдэльного изучения в гослвдуэдих исследованиях центросош.

3.2. Центросриа является центром организации промеЕуточкых Сллашнтов клетки

При ищувофлуоресцентшп исследованиях цигоскелета центрифугированных клеток мы обнаружили, что в их околоядерносм района иногда можно вздеть окруттй небольшой агрегат промззуточных фзлакентов, по рзсполояаюш совпадающий с фокусом схождения клеточных кикротруСочек - центросомой (рис.5). Это явление, представляющее - значатальннй интерес, для понимания

возможной роли центросома в регуляции сети промеауточных

-

филаментов, было исследовано наш! подробно.

Рис.5. Микротрубочки (а) и промежуточные филамёнты (б) в клетках СПЭВ, центрифугированных при 2000Q g в течение 3 ч. Стрелки указывают на центры организации промежуточных филаментов.

Белки промежуточных филаментов нерастворимы в ■

физиологических ионных условиях, поэтому условия их полимеризации в клетках сильно отличаются от условий полимеризации микротрубочек или актщювых филаментов, которые могут диссоциировать на составляющие их белковые субъединиш и вновь собираться из них. Так, если разрушить клеточные микротрубочки колцемидом или нокодазолом, а затем отмыть агенты от клеток, то в культивируемых клетках восстанавливающиеся мЯсротрубочки начнут расти от одного центра в каждой клетке (ЦОМТ), образуя характерные "звезда"

(Osborn, Weber, 1976. Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 73i 867-871).

ЦОМТ в данном случае явялется центросома (Brinkiey et ai.,

}9В1.J.Cell Biol., 90: 554-562). ДЛЯ Промежуточных фИЛаМОНТОВ

такой эксперимент поставить невозможно, поскольку невозможно их полное разрушение.

Однако сеть промежуточных филаментов в клетках может подвергаться значительным структурным перестройкам без разборки составляющих ее филаментов. При действии на клетки агентов, разрушающие мшфогрубочки, в также ванадата, акриламида, некоторых токсинов (обзор: Traub,P. 1985. Intermediate filaroente, Springer-Verlag. Berlin ), И При ВВвДвНИИ В КЛвТКИ 8НТИТ6Л К виментину или кератину (Klyrakovaicy et al., 1983. J.Cell Biol., 96!

494-500) промежуточные филаменты собираются в плотный агрегат возле клеточного ядра. После 'снятия воздействия околоядерный агрегат постепенно расправляется, и сеть промежуточных филаментов восстанавливается (Geuens et al., 1983. Call Biol.Intern.Rep., 7: 35-47). Перераспределение по клетке промежуточных филаментов наблюдается так® в митозе, при распластывании клеток по субстрату и т.п.

Шло преположево, что образование околоядерного агрегата и восстановление из него системы промежуточных филаментов связаны с существованием центра организации промежуточных филаментов (Ecxert

et al., 1982. Cold Spring Harbor Syrsp. Quant. Biol., 46: 403-412),

локализованного внутри агрегата. К сожалению, околоядерный агрегат промежуточных филаментов обычно настолько обширен и плотен, что в нем не • удается обнаружить какой-либо определенной структуры, которая могла бы быть таким центром.Правда, отмечалось, что агрегат промежуточных филаментов часто окружает центросому или находится рядом С H9t (Starger et el., 1978. J.Cell Biol., 78: 93108; Blose, 1980. Europ.J.CeU Biol, 22: 373-379), ЧТО Привело К

преголожения, что мвкротрубочки и промежуточные филаменты могут' иметь Общий центр организации (Goldman et al., 1980 In: "Microtubules end Microtubule Inhibitors" M.De Brabandar and J, Da Key, eds. Elsevier, Mew ïorlc. pp. 91-102).

Другого ро.-'э данные в пользу того, что центросома мота г быть центром организации прожиточных Адамантов, была получена в работе Kalnins et al. (Brain Ses., 1985, 3*5: 322 - 326). Эти авторы показала, что в культивируемых клетках астроглии, экспрессируэднх виментин, можно индуцировать экспрессш специфических кислых балков глнальных промежуточных филаментов, и что эти белка сначала появляется а райоЕз центросомы, з затем распространяется на. всю цитоплазму. Однако данное явление могло относиться только к специфическим балкам глея.

Чтобы доказать, что центросома действительно является центром организации промежуточных филаментов клетки, необходимо было продемонстрировать, что промежуточные филаменты могут концентрироваться именно в районе центросомы, и что они могут скапливаться в этом районе и распределяться из него без образования обширного агрегата и без разрушения микротрубочек. Хорошей моделью для этих получения таких доказательств явились центрифугированные клетки. ,

В контрольных клетках СПЭВ содержались проиедуткчиые

филаменты только виментинового типа. Эти филаменты образовывали густую сеть, иногда с небольшими сгущениями на концах псевдоподий. После центрифугирования клеток СПЭВ при 2000 <? в течение 2 ч, как описано в разделах 2.6 и 3.1, их промежуточные филаменты концентрировались в плотном агрегате, расположенном в центрипетальной части клеток (рис. 6 а). Небольшое количество промежуточных фщаментов связывало этот агрегат с ядром и околоядерным районом. Система микротрубочек клеток при центрифугировании практически ,не изменялась по сравнению с контролем, то есть представляла собой рыхлую'сеть, сгущающуюся в районе расположенной сразу над ядром (см. раздел 3.1) центросомы.

Рис.6. Промежуточные филаменты в клетках СПЭВ после центрифугирования при 20000 д в течение 2 ч (а) и восстановления от центрифугирования в течение 40 мин (0).

Электронномикроскопическое исследование показало, что агрегат ссостоял из большого числа промежуточных филаментов нормального вида, часто ассоциированных с липидными гранулвми. Вероятно, именно ассоциация промежуточных филаментов с липидом и служила причиной юс флотации при центрифугировании.

При восстановлении клеток после центрифугирования промежуточные филаменты начинали перераспределяться, и через 2 -3 ч появлялась их нормальная сеть. Через 40 - 60 мин после окончания центрифугирования в значительном числе клеток (примерно в половина, а в некоторых островках в абсолютном большинстве) вблизи центрипетального полюса ядра обнаруживался центр организации

виментиновых фяламентов, представляющий из себя небольшой округлый агрегат с рздиально расходящимися из него отдельными филаментами (рис. 6 6).

В ряде клеток, в которых обнаруживались центры организации промежуточных фмаментов, флотировавшие промежуточные филаменты отсуствовали, но иногда можно было видеть и центрипетальный агрегат, и околоядерный центр организации. В этом случае всегда присутствовали пучки филаментов, связывавшие агрегат с центром организации. В целом, чем больше было скопление филаментов в околоядерной зона, тем меньше по размеру был центрипетальный агрегат. Поскольку околоядерные центры организации промежуточных филаментов можно было видеть в клетках и на более ранние и Солее поздние рроки после центрифугирования, но в меньшем количестве клеток, и в клетках в итоге формировалась нормальная сеть промежуточных фяламентов, то можно было предположить, что образование отчетливого центра организации промежуточных фйламентов в околоядерной зоне было одним из этапов восстановления сети после центрифугирования, причем во всех клетках.

В клетках СПЭВ локализацию ЦОМТ (центросомы) можно было' определить по характерному с гуще ют радиально расходящихся микротрубочек. При двойном иммунофлуоресцентном окрашивании клеток антнелэми к глулину и виментшу удалось установить, что в пределах разрешающей способности метода расположение ЦОМТ и центра организации промежуточных фяламентов в клетках совпадало (рис. 5). Иногда в клетках взблвдали два близко расположенных ПО!®, и в этом случае обнаруживали тзшз совпадающие с ними по локализации два центрз организации промежуточных фяламентов.

Электронвомикроскопическое исследование показало, что в клетках, кмещнх вкравшшй центр организации ¡громе псу точных фшаментов, эти филзмента действительно сгущаются вокруг центросомы и образуют в ней хаотическое сплетение.

Г.знтры организации промежуточных фяламентов были хорошо видны также в клетках, зафиксированных непосредственно после 3 - 4 ч центрифугирования (рис. 5). Эти центры такта совпадали по своей локализации с ЦОМТ. После еще более продолжительного центрифугирования (6ч) в части клеток обнаруживали центры организации промежуточных филаментов, а в других - центрипетальный агрегат. Вероятно, это отражало попытки клеток адаптироваться к повышенной силе тяжести. При вшшательном изучении культур клеток СПЭВ, окрашенных антителами к виментину, оказалось, что в них

всегда можно найти несколько клеток на стекло, в которых виден отчетливый центр организации промежуточных фнламентов, такой же, как описано выше.

Таким образом, з отличие от клеток, обработанных микротрубочковыми ядами, в центрифугированных клетках мы наблюдали образование агрегатов виментиновых фнламентов, значительно удаленных от клеточного ядра и предполагаемого района локализации центров организации промежуточных фнламентов, и, кроме того, при полной сохранности сета, микротрубочек. Это позволило нам впервые наблюдать процесс концентрирования промежуточных фнламентов в районе центросомы и перераспределения сети промежуточных фнламентов из нее, т.е. работу центра организации промежуточных фнламентов, в практически интактных клетках. По всей видимости, центр организации промежуточных фнламентов расположен. именно в центросоме. Возможно, что при перестройках сети промежуточных фнламентов они двигаются вдоль микротрубочек от периферии к центру с помощью минус-концевых транслокаторов, достигают центросомы к в ней меняют транслокатор, начиная двигаться от минус- к плюс-концу микротрубочки - от центра к периферии. Это предположение, однако, является гипотетическим и требует экспериментальной проверки в дальнейшей работе.

3.3 Смещение ыитотического веретена при центрифугировании живых культивируемых клеток блокирует шггоз в ыетафаза Митотические клетки в культуре СПЭВ ке округляются, поэтому митотические фигуры хорошо видны на светооптических препаратах. Мы обратили внимание на то, что в центрифугированных (как описано в разделах 3.1 и 3.2) клетках митотические фигуры имеют искаженный по сравнению с нормальной картиной вид: веретено выглядит как бы разломанным надвое, поскольку хромосомы седаыентируют к центробежному краю клеток, а центросомы остаются в центре клеток. Однако более внимательный анализ показал, что встречаются и внешне нормальные метафазные веретена, целиком седиментирующиа к центробежному краю (рис. 7).

Центросомы, как уже обсуадалось в разделе I.I, в интерфазе расположены в геометрическом центре клеток, вероятно, из-за взаимодействия ■ отходящих от них микротрубочек с клеточным кортексои (Kuteneuar, Schllwa, 1992. J.Cell Biol., 116:

1157-1166) .• в митозе центросомы находятся в полюсах митотичеекого веретене, и от них отходят иикротрубочки как центральной чести

веретена, так и астральной звезды. Полагают, что взаимодействие микротрубочек астральной звезда с клеточным кортексом определяет место закладки цитотоцической перетяжки, и что именно по этим микротрубочкам происходит транспорт компонентов, участвующих в ее образовании (Rappaport, 1986. Int. Rev. CytoX., 105:245-281).

Рис. 7. Прометафээа (а) и метафаза (б) в клетках СПЭВ после центрифугирования (20000 д, 2 ч, 37°С). Окрашивание железным' гематоксилином. Ц - центросомы.

Мы решили изучить, как будет протекать митоз в клетках СПЭВ после смещения мнтотического веретена, вызванного центрифугированием. Для исследования китоза мы центрифугировали клетки СПЭВ при 37°С; применяли ускорение 20000 д и время центрифугирования от 2 до 10 час. Поскольку нормальный митоз в клетках СПЭВ продолаается около I ч, то такое время позволяет говорить о ходе митоза под действием центробежного ускорения.

Оказалось, что"роз ломанные" митогические фигуры, наблюдавшиеся в клетках СПЭВ после центрифугирования, представляли собой прометзфазы, практически не отличавшиеся по размерам полуяеретен и расстоянию иедду полюсами, от контрольных. Единственное отличие состояло в том, что вся масса хромосом была смещена в одну сторону - к центробезному краю клетки. В клетках, где стадия митоза соответствовала, очевидно, метафаза, веретено было целиком ощутимо смещено к центробежному крап клетки и иногда несколько изогнуто Плечи хромосом свисали из кзтафазной пластинки в центробежном направлении. Веретена обычно располагались под углом 90 - 45° к вектору центробежного ускорения и никогда - вдоль него. Длина центрифугированных метзфазных

веретен (I3,5±I,0 mío-!) Сила такой же, как в контроле - 14,0^1,0 мкм.

Табл.5. Соотношение фаз митоза в ' контрольных и центрифугированных клетках СПЭВ, в %.

время центрифугирования время восстановления прометафаз метафаз анвфаз

контроль 47 43 9

2 ч - 85 15 0

2 Ч 20 мин 23 71 6

5 ч - 36 64 0

5 ч 20 мин 24 61 17

Примечание! профазы и телофазы не псдсчктывались.

В клетках после центрифугирования мы никогда не наблюдали ни анафаз, ни телофаз (табл. 5), но они появлялись в препаратах уже через ю мин поело окончания центрифугирования. Из данных табл. 6 следует, что во время центрифугирования происходил блок митоза нз стадии метафазы. При этом накопление мзтафаз шло не только в относительных, но и в абсолютных единицах, так как общий митотический индекс, составлявший в контрольной культуре без учета телофаз 1,3$, в результате пятичасового центрифугирования поднимался до 3&. Это говорит о том, что центрифугирование не вызывало ни ингибировааня вступления клеток в митоз, ни гибели анафазных клеток.

Воздействие на делящиеся клетки ускорения 20000 дв течение 2 - 5 час, как уже говорилось, оказалось обратимым. Через 20 мин после окончания центрифугирования в перпаратах не было искаженных митотических фигур, все митозы были нормальными.

Прижизненные наблюдения показали, что немедленно после прекращения действия на клетки центробежного ускорения хромосомы начинали движение а центркпетальном направлении. Уже через 90 с после остановки ротора (самый ранний срок, какой удалось наблюдать) хромосомы заметно отодвигались от центробежного края клетки. Хромосомы сначала направленно перемещались к центру клетки со скорость» порядка нескольких мкм в мин, а через 2-4 мин начиналось их неупорядоченное движение, сходное с обычным

проматафэзшш движением, и заканчивающееся формированием обычной метафззной пластшзш. Иногда удавалось наблюдать перемещение к центру клэтжв целой мзтвфазной пластинки, в которой до анафазы более не происходило перемещений отдельных хромосом. Непосредственного перехода смещенного митоза к анафазе, без восстановления центрального располокзнпя веретена в клетке, мы никогда не наблюдали. Длительность митоза от момента остановки ротора до начала цитотомаи варьировала от 20 ь»лн до I ч, т.е. была практичзски нормальной и нашего меньше, чем при восстановлении ьштоза после опяйят от клеток цитостзтиков (лие/а, Уогоьзеу,

1991. СЬгсиОЗОта, 100: 532-542).

Ориентация когафазшсс веретен и направленно перетяаки между дочерний клвяс&чг в восстановленных мятозах были произвольными и не коррэлирйвалг с гащ:звд9Ш!ем вектора центробежного ускорения. Поэтому ответить на поставлашнй в начало данного исследования вопрос - как будет закладываться перетяжка при-делении клэток со ешцзшзш вэрэтевом - нем зе удалось.

Однако мы установила, что в результате центрифугирования шшх ютзток происходят блок штатичесшго деления на стадии' мэт-ефззы, который не сспровоздавтся сколько-нибудь заме твой дэструкцкай мнтотнчаского зэре'дша. В этом отношении иегшьзоззвная "одо.ть является уникальной, так как применявшиеся до сих пор ингибитора гатоза вызывали разрушение иитотического веретена. Создается Еючатлэяюз, что к блоку штоза на стадия кзтафзга приводшю ймзезо смещение ыэг.афазкого воретенб из центра клетки. Бозмоаш, что блок митоза происходил как раз из-за нарушения взаимодействия мзтотического эппарзтз с клеточной периферией.

3.4. Гигантские клетки слюнных язлез шаток емгопотив содеряат шояэствениыэ бесцентриолярвда центры организации и ;срструОочок, часть которых связана с ядерной оболочкой . Гигантские клетки слшных етлэз личинок двукрылых насекомых, известные ерзди биологов своими полятешшш хромосомами, была для нас интересны как объект исследования тем, что ош не содераат мяошетввншх ценгриолвй (но крайней мера, их не удавалось обнарушть на электрошцх ютрофотографаях), однако их цитоплазма изобилует мшфотрубочквш, хорошо видашш на электронных микрофотографиях. Мы ращялн ясслздовать, какие структуры являются ШЖГ для этих кногочисленянз михротрубочек. По определению, Ш"

' .. • -- 29 - ' V • • - . ;

называется любая структура, от которой- восстанавливаются клеточные микротрубочки после их экспериментального разрушения (Prankei,

1976.Proc.Natl.Acad. Set. USA, 73: 2798-2802). МЫ рвШИЛИ ВЫЯВИТЬ

ЦОМТ в гигантских клетках слюнных желез, разрушив их микротрубочки и затем наблюдая за восстановлением.

В принципе возможно было, что в обширной цитоплазме гигантских клеток имеется центросома обычного строения, которая и дает начало всем микротрубочкам, или что микротрубочки образуются без ЦОМТ, хаотично по всей цитоплазме. По аналогии с мышечными клетками позвоночных, лишенными центриолей, можно было также ожидать, что роль центросомы переходит к ядерной оболочке (Connoiy

et al., 1985. Eur. J. Cell Biol., 39: 341 - 345; Taesin et al., 1985. J. Cell Biol., 100: 35-46).

Рис. 8. Микротрубочки в гигантских клетках слюнных желез сыгопотие с!пди1а(;ив. А - клетка, сильно раздавленная при изготовлении препарата, видны узлы сгущения сети микро трубочек; б - 15 мин восстановления ыикротрубочек после экспериментального разрушения. Видны ЦОМТ.

Иммунофлуоресценгное исследование (которое было проведено для данного типа клеток впервые) показало, что цитоплазма гиганских клеток слюнных желез содержит множество шперотру бочек, ориентированных в апикальной части клеток по направлению от ядра к просвету желеЗы, и хаотично расположенных в базальной части клеток. При изготовлении препаратов клетки приходилось сильно придавливать к стеклу грузиком, иначе микроскопические наблюдения цитоплазмы были невозможны. В сильно раздавленных при этом клетках

- зо -

было видно, что сеть микротрубочек имеет выраженные узлы сгущения (рис. 8 а).

При фазовоконтрастноы исследовании в цитоплазме клеток были видны немногочисленные плотные гранулы диаметром около I мкм и материал средней плотности, заполнявший цитоплазму в виде тяжей и ячеек. Расположение узлов сгущения сети микротрубочек совпадало с расположением узлов этого материала и не совпадало с расположением плотных гранул.

Микротрубочки гигантских клеток слюнных желез сшгопотиз с!пди1а^в не разрушались воздействием 20 мкг/мл нокодазола или охлаждением во льду. Однако их удалось разрушить совместным действием нокодазола и холода. Через 2 - 3 ч инкубации в клетках были видны несколько десятков не очень интенсивно окрашивавшихся антителами к тубулину пятен, иногда звездчатой формы, но лишенных видимых фибрилл и множество коротких микротрубочек по всей поверхности гигантского ядра. Через 6 ч инкубации окрашивание сохранялось только по поверхности ядра, но клетки уже не были способны к восстановлению и погибали.

После 3 ч инкубации на холоду с нокодазолом и 15 мин отмывки от него при комнатной температуре в гигантских клетках слюнных желез были видны многочисленные интенсивно окрашенные антителами к тубулину пятна диаметром 1,0-1,5 мкм, разбросанные по цитоплазме и в большом количестве сосредоточенные вдоль поверхности ядра, от которых отходили короткие микротрубочки (рис. 8 6). Через 30 мин отмывки от нокодазола микротрубочки, отходившие от этих пятен, становились более длинными; формировались отчетливые "звезда''. От. ядра отходили длинные микротрубочки. Через 60 мин "звезды" сливались друг с другом в общую сеть; ядро было как бы оплетено микротрубочками. Через 90 мин система микротрубочек была неотличима от контрольной.

Внимательное электронномикроскопическое исследование гигантских клеток слюнных желез показало, что микротрубочки в их цитоплазме действительно радаально сходятся в районы цитоплазмы, свободные от гранул секрета, которые, однако, ьа содержат каких -либо специфических клеточных структур или даже выраженного электронноплотного материала. Кроме того, микротрубочки отходят от ядерной оболочки (чего обычно не бывает в культивируемых кг.зтках млекопитающих), но ■ каких-либо специфических изменений ядерной обоочки в местах прикрепления микротрубочек нет.

Таким образом, гигантские клетки слпнных желез мотыля имеют

- 5Г-

мнонэстввшше бесцентриолярные ЦОКТ, которые частью разбросаны по цитоплазме, а часть» сосредоточены на ядерной оболочке. Такой тип организации системы мшсротрубочек уюшален для этого типа клеток. Бесцентриолярные ЦОМТ у швотных ранее демонстрировались только для ооцитов и ранних .зародышой идя лилий клеток, полученных из предшественников ООЦИТОВ (Calarco-GiUiara et al., 1983. Cell, 35s 621 - 629; Szollosl et al., 19S6. Ear. J.Cell Biol., 40 t

100-104). Кроме того, было показано, что с поперечнополосатых мышечных волокнах роль ЦОМГ переходат к ядерной обоочке (Connoiy

et al., Eur. J. Cell Biol., 1985, 39: 341 - 345; TaBSiil et al., J. ceil Biol., 1985, loo: 35 - 46). Последнее мы наблюдала И В гигантских клетках сланных желез; здесь уместно вспомнить, что у низших животных и у растений центросома обычно самым тесным образом связана с ядерной оболочкой ели дзш является ее видоизмешшм участком (см. раздел I.I.I). Возможно, что ассоциация ЦОМТ с ядерной оболочкой связана с кеоходаюстьв обеспечивать ориентацию ыикротрубочзк в апикальном района ¡елепек.

Утрата гигантскими клетками сишнях калах центриолей, вероятно, связана с политвнязацией их хромосом (Онвдешсо. Чашов, 1977. Тезисы докл. 1Г Всесоюзного симпозиума по шлншюйдйн, Ереван), как и утрата цзнтршлей шизчшма шлокнаш связана с их шогоядерноетьв. Однако, в отлична от мытвчпш волокли, гигантские клетки, вероятно, нуждаются в большом колнчэстве микротрубочек, так как им нужно обеспечивать направленный транспорт секрета к апикальной поверхности. Вероятно, что именно для формирования большого количества микротрубовдк в них и образуются множественные Оесцентриолярные ЦОМТ

3.5. Структурную основу центриолей и базальта: телец составляет их матрикс, сохраняющий общую конфигурацию органелла после искусственного удаления шгкротрубочек триплетов Центросомы в клетках позвоночных обычно состоят из ценнтриолей и перицентриолярного материала. Вероятно, центриоли содержат какие-то молекулярные компоненты, способствующие аккумуляции на них перицантрколярного материала. Стенка центриолярных цилиндров построена из девяти триплетов микротрубочек, покрытых снаруш слоем тонкофибриллярного матрикса. В состав цилиндра входят, кроме того, многочисленные мелкие структуры, расположенные в его просвете и прикрепленные к нему снаружи. Биохимический состав центриолярных цилиндров и уж тем

- зГ-

'бол&а их отдельных компонентов неизвестен; изучался только брутто - состав белков центросомы (Dörnens et al., 1S87. Cell Motil, and CytOEk., S: 23В - 249), КОТОРЫЙ 0КЭЗЗЛСЯ ОЧвНЬ СЛОЖНЫМ. МЫ предприняли попытку дифференциально экстрагировать различные компонента центршлярного ' цилиндра простейшими химическими агентами, расиатрпвая. это как подход к дальнейшему биохимическому анализу этой структуры.

Б экспериментах использовали препарат центриолэй из селезенки крупного рогатого скота и препарат базальннх телец из сперматозоидов вьюна, выделенные, как описано в разделе 2.7. Алкквога этих препаратов инкубировали в растворах различных зкстрагирувдих пгентов ь течение 30 мин на холоду, фиксировали глгтаровым альдегидом к исследовали методом электронной микроскопии на ультратонккх срезах.

.-•а

:Л t ~ : - . -'i ■ - f V1 Д1

.■fcfe'.' ' &

Л. ' :■ •. * у'

У-

в,. al"

* кл ■

А "

•В А

Рис. 9. Злектронношкроскопические фотографии цевтриолей, подученные путем усиления контраста рэдоально-симметричных ci-руктур по методу Markham et al. (Virology, 1963, 20; 88). А -центрголь селезенки крупного рогатого скота в 20 мМ ТЭА рН 7,4; В - такая же центриоль после обработки 1,0 И kci.

В 20 мМ растворе ТЭА, который применялся при выделении центриолей и базальных телец, они имели в целом такую же ультрастутуру, что и in situ. Микротрубочки центриолярных цилиндров, матрикс, система связок между тршлетами и втулки внутри цилиндров выглядели нормальными (рис. 9 а).

Обработка 0,2 - 0,6 М растворами nací и kci приводила к постепенному разрушению микротрубочек триплетов как в центрголях, так и в базальных тельцах. Степень разрушения сильно варьировала в различных триплетах даже в пределах одной центриоли или одного базального тельца. Микро трубочки фрагментов аксонем, встречающихся

в препаратах базальта телец, при этих обработках оставались интактными.

После инкубации в 1,0 М nací (kcí> микротрубочки центриолярных цилиндров полностью разрушались. Вместо них можно было видеть 9 симметричных просветов в остающемся компактном матриксе (рис.9 б). Связки между триплетами, по-видимому, также удалялись, но втулку в просвете цилиндра иногда можно было обнаружить. Обычно на поперечном срезе экстрагированной центриоли или базального тельца была видна структура, которую мы обозначили как "центриолярную оправу".

На продольных срезах экстрагированные центриоли и базальные тельца имели такую же форму и размеры, что и исходные. Толщина матрикса в центриолярных оправах не изменялась по сравнению с исходными органеллами; размер отверстий соответствовал размеру центриолярных триплетов микротрубочек. Дальнейшее повышение концентрации соли до 2,0 М не оказывало воздействия на структуру центриолярной оправы.

Мы также обрабатывали центриоли и базальные тельца Mgci2, ЭДТА и cacij, взятыми в различных концентрациях, в том числе в сочетаниях с 0,6 Ы Nací. Оказалось, что двувалентные катионы не влияют сколько-нибудь существенно на структуру центриолей; в больших концентрациях эти растворы действовали точно так же, как растворы Nací и кс1 соответствующей ионной силы.

В растворах с кислыы и щелочным рН выявлялись различия между центриолями из селезенки крупного рогатого скота н базальными тельцами из сперматозоидов вьвна. Так, обработка 20 мМ ТЭА рН 3,0 приводила к полному разрушению триплетов микротрубочек центриолей и появлению центриолярных оправ; базальные тельца при таком рН растворялась полностью. Напротив, цри рН 9,5 полностью растворялись центриоли, тогда как Сазальнне тельца выглядели почти нормальными и утрачивали лишь часть своих микротрубочек. При рН 9,0, в отличие от всех других воздействий, сильно менялся матрикс центриолей - он утоньшался и отхода от триплетов на значительное расстояние; микротрубочки при этом частично разрушались.

Разрушение микротрубочек центриолей и базальных телец и появление в препарате их центриолярных оправ происходило также при действии 0,05% раствора гепарина.

Таким образом, наиболее стабильной частью центриолей н базальных телец является их матрикс. Интересно, что при образовании новых центриолей или базальных телец сначала возникает

короткий цилиндр из - плотного тонкофибриллярного материала матрикса, а затем в нем постепенно появляются триплеты Мйкротрубочек (KâlniRS, Porter, 1969. 2.Zöllforsch., 100: 1-30). Клеточные микротрубочки, помимо первдентриолярного материала, могут отходить к от матрикса центриолей, т.е. в нзтивном состоянии он, вероятно, содержит функционально активные компоненты центросомы. По-вмижму, эти компоненты утрачиваются при получении цонтриолярной оправы, тзк кзк показвно, что экстракция уже 0,2 -0,4 M раствором KCl элиминирует способность центросом инициировать полимеризацию микротрубочек in vitro (Kuriyama, 1984. J.Cell Set., 66: 277). Такие же обработки приводят и к утрате центриолями способности индуцировать дробление 0СЦИТ0В Xenopus laevis (Klotz et al., 1990. J. Cell Biol., 110: 405 - 415). Полученные НЭМИ цеитртаяярныа оправы, вероятно, состоят именно из структурных компонентов центриолей.

Иикротрубочки центрдалярных цилиндров более стабильны, чем клеточные цитоплазматические микротрубочкй, так как они не разрушаются на холоду и в разбавленных растворах, которые применяются при выделении препаратов центриолей. Однако они сказались более лабильными, чем микротрубочки аксонвм, остающиеся неразруиенными в 0,5 - 0,6 M kci. Показано, что микротрубочки центриолей формируются из того тубулина, который в момент формирования имеется в клетке (Kochsnskt, Borisy, 1990. j.coii Biol., 110: 1599-1605), Т.е. HB СОСТОЯТ ИЗ КаКОГО-ЛИбО

специфического тубулина. Опыты с воздействием на центриоли pH 9,0 показывают, что и не мзтрикс стабилизирует микротрубочки центриолей. Недавно было показано, что микротрубочки аксонам стабилизированы ГИСТ0Н0М Hl (Multignec et al., 1992. Nature, 360t 33-39). Возможно, что микротрубочки центриоляриых цилиндров токе стабилизированы каким-либо сходным белком, поскольку они разрушаются при действии гепарина.

Klotz et al. ( 3, Cell Biol., 1990, 110; 405 - 415) В СВ00Й

работе твкяе пытались фракционировать выделанные центросомы различными экстрагирующими агентами, чтобы выяснить, какие- их компоненты участвуют в индукции дробления в ооцитах xenopus, Однако им не удалось получить центриолярных оправ, похожих на те, что получались в наших экспериментах, описаиш в предыдущем разделе. Мы предположили, что причиной различий в результатах экспериментов было использование нам" разных детергентов - к lot* et ai. использовали Нонидет Р-40, а мы - Тритон X-IQ0. Эта

детергенты имеют сходную химическую природу, но разную длину входящей в состав их молекулы углеводной цепи.

Мы пермеабилизовывали клетки культуры неьа растворами различных детергентов в течение 15 мин, затем обрабатывали их 0,6 - 2,0 M раствором ыаС1 или кс1 и изучали структуру их центросом методом электронной микроскопии на ультратонких срезах. Использовали 0,01 - 1,058 раствор Тритона Х-100, 0,1 - 0,5% раствор Нонидета Р-40, 0,1 - 0,5% раствор Brij-sa и 0,01£ раствор дигитонина. Оказалось, что после пермеабилизэции клеток в любом из использованных детергентов центросомы в них выглядели практически одинаково. Исключение составляли лишь мембранные везикулы, которые сохранялись возле центросомы после использования Brij-se, дигитонина и 0,01% Тритона Х-100 и отсутствовали после использования 0,1 - 1% Тритона Х-100 или Нонидета Р-40.

Однако после воздействия на клетки концентрированным раствором соли выявились отличия во влиянии различных детергентов на немембранную структуру - центриоляршй цилиндр. Оказалось, что для разрушения солью микротрубочек центриолярных цилиндров и появления центриолярных оправ необходима обработка Тритоном Х-100 в -дабой из использованных концентраций. После пермеабшшзации клеток любым другим детергентом, в том числе Нонидетом Р-40, экстракция микротрубочек центриолярных цилиндров солевым раствором не удавалась.

Мы также обрабатывали пермеабилизированные различными детергентами клетки неьа раствором, а который был добавлен I мИ cacij. Клеточные микротрубочки при этом почти полностью разрушались. Однако после пермеабшшзации дагитонином или Brij-se в перицентриолярном материале центросомы можно было найти короткие фрагменты микротрубочек, а после Тритона Х-100 или Нонидета Р-40 такие фрагменты микротрубочек отсутствовали.

Таким образом, неионный детергент Тритон Х-100 может влиять на взаимодействие мевду собой молекулярных компонентов центросомы, и предварительная обработка раствором Тритона Х-100 является необходимым условием для получения центриолярных оправ. Разрушающее влияние Тритона Х-100 на цитоскелетные структуры, в частности, на актиновые филаменты (Lewis, Bridgman, 1992. J. Cell Biol., 119: 1219 - 1243) и на ассоциацию стабилизирующих факторов С микротрубочками (Schliwa et al., 1981. Proc. Natl. Acad. Sel. usa, 78: 1037 - 1041) отмечалось и в других работах.

'3.6. Цитохимическим методом Бернара РШ-С выявляется только на

иикротрубочках центриолей

Препарат базалышх телец сперматозоидов вьюна, выделенный, как описано в разделе 2.7, содержал 350 мкг ДНК и 75 мкг РНК в расчете на I мг бежа, а' после обработки 1,0 И Nací этот же препарат, который состоял практически только из оправ базальных телец, содержал 30 мкг ДНК и 50 мкг РНК на I мг бежа. Это было аргументом в пользу того, что центриоли (базальныа тельца) могут содержать РНК. Однако 5% РНК, содержащиеся в препарате, могли происходить и из примесей - рибосом или других компонентов белоксинтезируидего аппарата.

Для выяснения вопроса о том, есть ли в центриолях РНК, мы использовали также цитохимический метод Бернара, состоящий в окршивании ультратонких электронномикроскопических срезов уранилацетатом с последующей дифференцировкой в ЭДТА. Мы брали для экспериментов препарат ядер, содержащий центриоли, так как необходимо было сравнивать окрашивание центриолёй с положительным окрашиванием известных РНП-структур и отрицательным окрашиванием хроматина.

Центриоли, содержавшиеся в препарате ядер печени крыс, окрашивались уранилацетатом - ЭДТА очень интенсивно, на уровне окрашивания рибосом и интерхроматиповых гранул ядра. При этом окрашивание распределялось вдоль микротрубочек центриолярного цилиндра. Матрикс центриолей окрашивался менее интенсивно, на уровне фибриллярных компонентов и мембран, содержавшихся в препарате.

После инкубации с РНКазой А интенсивное окрашивание микротрубочек центриолей пропадало, и вся органелла выглядела окрашенной равномерно. Интенсивность этого окрашивания была меньше, чем оставшихся в препаратах немногочисленных ядерных РНП, но больше, чем хроматина.

После обработки препарата ядер, содержащих центриоли, 0,6 М Nací, в них можно было видеть центриолярные оправы с фрагментами центриолярных микротрубочек. Эти фрагменты также интенсивно окрашивались уранилацетатом - ЭДТА. После обработки такого препарата РНКазой А центриоли выглядели неокрашенными, их с трудом можно было найти не срезах.

Таким образом, центриоли содертт какой-то компонент, который интенсивно, на уровне известных РНП-с руктур, окрашивается

уранилацетатом-ЭДТА по Бернарда. Этот компонент связан ■ с микротрубочками центриолярного шшшдра, не экстрагируется 0,6 М Nací, но перестает окрашиваться после обработки РККазой. Возможно, что это РНК. однако локализация ее выглядит странной и не соответствует современным представлениям о свойствах микротрубочек. Тубулин - кислый белок (pi - 5,1), и белки, ассоциированные с микротрубочками, имеют основную природу. Поэтому прямая ассоциация РЕК со стенкой мшсротрубочки, состоящей из тубулина, вряд ж возможна, зотя, конечно, она могла бы происходить через промежуточные компоненты. Не исключено, что положительное окрашивание мнкротрубочек цантриолей уранилацетатом - ЭДТА является зртефактным.

Данные в литературе о РНК в составе центриолей и центросом удивительно противоречивы, и даже один и тот же эксперимент у разных авторов дает разные результаты. Например, одни утверждают, что обработка РНКазой А , ингибируех ' способность • центросом инициировать Сборку микротрубочек in vitro (Snyder, 1980.Cell Biol. Intern. Rep., 4: 859 - 866; Pepper, Brinkley, 1980.Call Motility, is 1-15) или индуцировать образование цитастеров в ооштах Xenopus (Heidenánn et al., 1977. Cell, 10: 337 - 350),

другие se находят, что РШаза А на эти функции центросом не влияет

(Kuriyarna, 1384. J. Call Sei., 66: 277 - 295; Klotz et ai., 1950. J. Cell Biol., 110: 405-415). ПО-ВЩШШМУ, ДЛЯ рЗЗеНИЯ ВОПРОС? O

том, есть ли в составе центриолей РНК, вугшы серьезные дополнительные исследования.

3.8 В центре цитастеров, образующихся после инъекции центриолей или бззальшх телец в оовдты xenopuo laovis, лежат только новообргзовввнкые цзнтриоли

Инъекции препаратов базальных телец шш цеятрколей в ооцит xenopus íaevis приводят к появлению в его ооплазмз цитастеров в инициируют партеногенетическое дробление, которое может доходить до бластулы и даже до вылуплешя головастика (Heidcreoan,

Kirschner, 1975. J. Cell Biol., 67: 105-117; Maller et al., 1976. Bxper. Cell Res., 99*. 285-294; Heideniann et al., 1977. Cell, 10: 337-350; Kareenti et al., 19fl4. J.Cell Biol., 98: 1730-1745).

Этот тает использовался для определения функциональной сохранности центриолей в выделенных препаратах (Klotz et ai., 1990. J.ceii Biol., no: 405-415). Полагали, что основная роль базальных телец и центриолей состоит в том, что они аккумулируют на себе

перицентриолярный материал центросомы и индуцируют полимеризацию микротрубочек, что, в сюв очередь, запускает дальнейшие события, связанные С дроблением (Hirano, Ishikawa, 1979. Dev. Growth Dif£., 2i: 473-481); при нормальном оплодотворении эту роль могут играть базальныо тельца сперматозоида.

Однако фрагменты зксонем жгутиков, которые эффективно инициируют полимеризацию микротрубочек in vitro, не индуцируют цитастеров в ооците; с другой стороны, запуск дробления после инъекции в ооцит базальных телец не ингибируется действием нокодазола, разрушающего микротрубочки (Picard et ai., 1937. Nature (bond.), 327: 170-172). Возможно, что базальные тельца и центриоли содержат белки (нуклеиновые кислоты?), попадание которых в ооцит запускает каскад реакций, приводящих к началу дробления, но не связанных непосредственно с микротрубочками. Например, таким белком мс£ет быть ассоциированная с центриолями протеинкиназа P34cdc2 или циклин в.

Ооциты животных обычно не содержат центрдалей, а сйермии -содержат. Устоявшееся представление о динамике ахроматингвого аппарата в раннем развитии состоит в том, что центриоли (базальные тельца) спермия сразу после его инкорпорации в яйцо индуцируют образование спермальной звезда, необходимой для передвижения и слияния проонуклеусов, а затем удваиваются и оказываются лежащими в полюсах веретена первого деления дробления. В дальнейшем они продолжают удваиваться в каждом митотическом цикле и в конечном счете дают начало всем центриолям организма, развившегося из зиготы. Возможно, что это представление верно для некоторых, организмов, например, для морских ежей, однако однозначных экспериментальных данных, доказывающих преемственность центриолей (базальных телец) старшее в развитии, не получено. Напротив, показано, что у млекопитающих базальные тельца спермия не участвуют в первых делениях дробления, и центриоли образуются de novo на более ПОЗДНИХ стадиях развития (Schatten et al., 1986. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83: 105-109).

Мы решили изучить, существует ли ли реально преемственность между инъецированными в ооцит xenopus laevis центриолями или базальными тельцами и центриолями в цитастерах, образующимися после инъекции. Для этого мы решили сравнить ультраструктуру центриолей в инъецируемых npenapaiax и в цитастерах, или, если удастся, пометить инъецируемый материал.

Мы инъецировали в зрелые ооциты xenopus laevis 20 нл

суспензии препарата, обогащенного центриоляш из печени крыс, или препарата базальных телец сперматозоидов вьюна, выделенных как описано в разделе 2,7. Суспензия обычно была приготовлена на 10 мм ТЭА рН 7,4, причем при выделении центриолей из печени крыс буфер ТЭА применялся на всех этапах выделения.

После инъекции ооциты инкубировали при 21 - 23 °С до появления борозд дробления, а затем фиксировали для световой и электронной микроскопии как описано в разделах 2.4 и 2.5.

Из 360 ооцитов, инъецированных суспензией базальных телец сперматозоидов вьюна, 163 сформировали отчетливые борозды дробления в течение примерно 1,5 ч после инъекции. Эта реакция не зависела от того, были ли ооциты активированы уколом иглы до инъекции или нет. После инъекции центриолей из печени крыс реакция была только в предварительно активированных ооцитах, и выражалась она в появлении "защипок" - неглубоких борозд поверхности. Инъекции чистого буфера или препаратов после длительного (см. далее) хранения никогда не вызывали появления борозд дробления или даже "защипок". Препараты базальных телец оставались активными в течение примерно 16 ч хранения в разбавленном буфере на льду, препараты центриолей - в течение примерно 5 ч. Препараты очень быстро теряли активность при комнатной температура и при повышении тонной силы раствора даже до фнэиологичаских значений, так что нам пришлось отказаться от попыток пометить их шш исследовать влияние на них различных ферментов.

При световой микроскопии оогтаов, образовавших борозды дробления или "защипка" после инъекции, мы обнаруашш многочисленные вдгастеры на ш аншальном полюре, полностью такие же, как были описаны ранее другими авторами, Пбри"ислешш выше. Цитастеры располагались группами; иногда в этих группах бала видна фигура митоза и хромосомы. Если ооциты не обнаруживали никакой реации поверхности после инъекции, то в них не было и цитастеров. Цитастеры в ооцитах, инъецированных базальными тельцами шш центриоляш, практически не отличались по своему расположению и морфологии. Число цитастеров в ооплазые уменьшалось при разведенки инъецируемой суспензии чистым буфером.

ультраструктура цитастеров во всех случаях была цримэрно одинаковой и соответствовала ультрасгруктуре цитастеров, описанных ранее другими авторами для ооцитов морской звезды, инъецированных базальныш тельцаш спермнэв (Kurlyaraa, Xanatani, 1981. J. Cell sel., 49: 33-49) или для ооцитов xenopus, инъецированных

центросомами ИЗ культивируемых клеток ¡Karsenti et al., 1984. J.Cell Biol., 98: 1730-1745). ЦиГЭСТвр ПреДСТЭВЛЯЛ СОбОЙ ОбЛЗСТЬ

ооплазмы, свободную от желточных гранул и заполненную мелкими пузырьками, митохондриями, рибосомами и т.д. В центре цитастеров можно было видеть центриоди, окруженные плотным материалом типа митотического гало, с фокусами сгущения. В этом материале било много микротрубочек. Иногда общее гало окружало несколько лежащих поодэль друг от друга центриолей, так что цктастер получался не округлым, а вытянутым. Центриоли в цитастерах обычно были одиночными, то есть от одной до другой было не менее I мкм. Возле цитастеров мы находили также кариомзры, т.е. исследованные нами ооциты, вероятно, можно было отнести к стадии телопрофазы между первым и вторым делением дробления.

Щ

Рис. 10. Ультраструктура базальных телец сперматозода вьюна (а, б) и центриолей печени крыс (в, г) в изолированных препаратах и центриолей цитастеров в ооците хопориз 1аеу1з (д-з). В просвете цилиндра центриолей (д-з) видна "ось со спицами".

Чтобы судить об ультраструктуре центриолей, их нужно наблюдать на ультратонких поперечных срезах, поскольку косые и даже продольные срезы не дают достаточного количества информации. Нам удалось наблюдать на поперечных срезах 5 центриолей в ооцитах, инъецированных базальными тельцами, и 3 центриоли в ооцитах, инъецированных ценгриолями. Все 8 центриолей имели характерную ультраструктуру, которая никогда не встречалась у инъецирогэнных органоидов (рис. 10) и является специфической для центриолей в первые часы после их формирования (УогоЫеч, сьоп1ао«, .г.сои в!о1., 1982, ). Конкретнее, в просвете цвнтриолирного цилиндра у

них была выражена радиально-сишэтричнзя структура "ось со спицами" (cartwheel); триплеты мдкротрубочек были развернуты под углом около 45° к радиусу цилиндра; отсутствовала часть системы связок между триплетами; на одном из концов цилиндра вместо триплетов микротрубочек можно было видеть их дублеты. Инъецированнные же препараты содержали только зрелые центриоли, в которых отсутствовала "ось со спицами", угол между триплетами и радиусом составлял около 80°, а сами' триплеты шли по всей длине цилиндра и были соединены полной системой связок.

Мы можем предложить только два возможных объяснения полученного результата. Во-первых, можно представить, что инъецированные в яйцо центриоли (базальные тельца) меняют свою морфологию и приобретают черты ювешшьных центриолей. Во-вторых, что кажется более вероятным, инъецированные органоиды индуцируют образование новых центриолей, а сами рассасываются или не лежат в центре цитастеров. Если бы инъецированные центриоли функционировали наравне с новообразованными, то мы обнаружили бы их среди 8 исследованных с вероятностью 0,99 (критерий Стювдента), считая, что за 1,5 ч, к началу первой телопрофазы, кавдая инъецированная центриоль (базальноэ тельце) успевала дать начало только одной центриоли цитасгера (что более всего согласуется с обширными данными по скорости и времена образования центриолей в раннем развитии).

Степень участия инъецированных центриолей в образовании; новых ' может быть различной и нуждается в дальнейшем исследовании. Эку может быть прямое образование новых органоидов на стенке старых, как при обычном удвоении центриолей, или «й -индукция образования центриолей de novo, как то происходит у шюкоантаювдх. Во -всяком случае, образование цитастеров оказывается Солее сложным цроцессом, чем это полагали ранее.

3.8. Мококлоналъные антитела против центросома можно подучить после иммунизации животных любым субклеточным препаратом, содержащий центросомы, либо препаратом белков микротрубочек. Моноклональше антитела против центросомы часто реагируют и с другими клеточвьши компонента®.

Дальнейшее исследование центросомы предполагает в первая очередь исследование ее молекулярной композиции. Чтобы понять, из каких белков состоит центросома, где эти белки локализована в сложных структурах центросомы и какие они выполняют функции,

'необходимо иметь антитела к белкам центросомы; иным способом идентифицировать белки практически невозможно. Специфические антитела могут быть поликлональные и моноклональнне; для получения моноспецифических поликлональных антител необходимо иметь индивидуальный белок в препаративных количествах. Для белков центросомы это пока недостижимо. Мы предположили, что можно будет получить моноклональные антитела к центросоме, если иммунизировать животных частично очищенным препаратом изолированных центриолей или базалышх телец, а может быть, и препаратом белков, ассоциированных с микротрубочками. Предполагалось, что после такой иммунизации будет получен набор моноклональных антител, каждое из которых будет узнавать какой-то из белков центросома.

3.8.1. Получение монохяональных антител против белков,

ассоциированных с микротрубочками, и проблема специфичности

моноклональных антител

3 первом из проведенных экспериментов мы иммунизировали мышей препаратом белков, ассоциированных с микротрубочками из "эзга крупного рогатого скота. Поскольку центросома служит местом инициации роста мккротрубочек, можно было ожидать, что ассоциированные с микротрубочками белки, облегчающие полимеризацию тубулина, будут концентрироваться в районе центросомы. Из 28 полученных, как описано в разделе 2.8, гибридомных клонов, продуцировавших антитела к смеси белков, использованной для иммунизации, только 3 продуцировали антитела против индивидуальных белков, а остальные 25 - антитела, узнававшие в иммуноблоттинге с белками микротрубочек козга 2 или больше полипептидов. Большинство антител узнавало белки нейрофиламентов, которые присутствовали в пррепарате в виде небольшой примеси.

Однако, например, клон EI2 продуцировал антитела против единственного полипептида молекулярной массой 34 кД (рис. II), который был нами затем идентифицирован как легкая цепь высокомолекулярного (350 кД) белка, ассоциированного с микротрубочками, называющегося MAPI. Эти антиуела не окрашивали культивируемых не-нервных клеток при ишунофлуоресцентном исследовании и не узнавали никаких полипептидов при иммуноблоттинге тотального клеточного экстракта. Таким образом, при использованном нами способе иммунизации животных получение строго специфических антител к одному полипептиду оказалось в принципе возможным.

12345 6 8 7 9, 10 11

Рис.II. Анализ специфичности моноклоналызых антител методом иммуноблоттинга. I - 5 - белки микротрубочек мозга крупного рогатого скота; 6 и 8 - белки культивируемых клеток fbt; 7 и 9 - II - белки культивируемых клеток СПЭВ. I, 6 и 7 -электрофорез белков; 2-5и8-И- иммуноблоттинг с антителами: 2 - EI2; 3 и 8 - еш-17; 4 и 9 - rn-c6; 5 и 10 -sn-зсв; II - sn2-1f5.

Чаще встречалась другая ситуация. Так, клон rn-17 продуцировал моноклональше антитела, которые в препарате микротрубочек реагировали сразу с двумя высокомолекулярными белками - MAPI и ЫАР2; белки кейрофиламантов они не узнавали. В культивируемых клетках fbt и в шшшшх эмбриональных фибробластах, которые в принципе содержат МАР2, антитела с ним не реагировали, а узнавали дублет полипептидов молекулярной массы около 100 кД' и, в клетках fbt, полипептид 210 кД (рис. II).

В культивируемых клетках при иммунофяуоресцентном исследовании антитела окрашивали микротрубочки (в частности, митотическое веретено), промежуточные филаменты и многочисленные мелкие точки по цитоплазме. При имыуноэлектронной микроскопии этих клеток оказалось, что антитела связываются с окаймленными пузырьками (вероятно, соответствующим точкам, видимым при световой микроскопии), и в ввде мелких кластеров располагаются также вдоль некоторых'микротрубочек и промежуточных филаментов. Таким образом, было показано, что один и тот ке антиген может быть связан в клетке с несколькими структурами. Это противоречило существовавшим в то время (1134 г.) представлениям о том, что каждая клеточная

'структура состоит из специфических только для нее белков.

Дальнейшее развитие исследований структурных клеточных белков опровергло эти представления. Оказалось, что ода и тот жз Оелок может участвовать в построении разных органоидов. В частности, транслокатор кшззин в разшх условиях может быть ассоциирован либо с мембранными органоидами, либо с микротрубочками; белок мшфотрубочек 1ДАГ2 может взаимодействовать с актиновкми филаментами я т.п. Наиболее ярким примером здесь является, вероятно, конститутивный белок хроматша гистон hi, который стабилизирует аксонему жгутика сперматозоида (Muitigner et ai.,

Natura, 1992( 360: 33 - 39).

Кроме того, при исследованиях первичной структуры белков оказалось, что многие цитоскелетные белки зукариот имеют значительную гомологи» или просто совпадающие небольшие участки молекулы, что, возможно, отражает их эволюционное родство или функциональное сходство. Некоторые полипепгиды оказываются настоящими химерами, "составлегашми" из участков, гомологичных различным другим голипептидам. Из этого следует, что мою клон а льни в антитела можно рассматривать как антитела к определеннной антигенной детерминанте, но на к индивидуальному бедку, и что перекрестное реагирование антител с несколькими белками или с несколькими клеточными структурами может отражать реальное сходство этих белков или реальное связывание одного бежа с несколькими структурами. Это сильно усложняет исследование молекулярной композиции органоидов, но и может дать дополнительную информации.

Только одно из моноклональных антител (км-сб>, полученных нами к белкам микротруйочек мозга, в культивируемых клеткэх при иммунофшуоресцентном исследовании окрашивало центросому. Антитела rn-c6 окрашивали также множественные небольшие пятна в интерфазных ядрах и митотическое веретено. В препарате белков микротруйочек мозга антитела rn-сб узнавали белок MAPI и белки нейрофиламентов nf-l и nf-m (рис. II). Окрашивание полностью снималось предварительной обработкой щелочной фосфатазой, т.е. антигенная детерминанта содержала фэсфаткую группу. Сравнение первичных структур указанных белков показало, что они действительноимеют несколько совпадающих участков, в том числе содержащих серии, который в данном окружении может быть фосфорилирован. Дальнейшее исследовпние, проведенное с помощью антител p.n-c6, будет описано в разделе 3.11.

3.8.2. Получение моноклональных антител к препаратам, содержащим центриоли или центросому

В последующей работе по получению панелей моноклональных антител к центросоме мы иммунизировали животных различными перпаратами, содержащими центриоли или центросомы, а скрининг гибридомных клонов проводили по иммунофлуоресцентному окрашиванию клеток. После иммунизации мышей препаратом центриолей из селезенки крупного рогатого скота большинство полученных клонов продуцировало антитела против компонентов ядра или промежуточных филаментов, которые действительно составляли значительную массу препарата. Только один из клонов, sn-зсв, продуцировал антитела против центросомы; они будут подробно описаны в разделе 3.II.

После иммунизации животных препаратом базальных телец из сперматозоидов вьюна, где базальные тельца составляли мажорный компонент, мы получили 27 гибридомных клонов, продуцируадих антитела к различным клеточным компонентам, из которых 6 клонов продуцировали антитела к центросоме культивируемых клеток.

Поскольку получающиеся при описанных способах иммунизации антитела могли реагировать практически с любыми структурами в преыеабилизованных Тритоном Х-100 клетках неьа, мы использовали препарат таюс: клеток для иммунизации животных, хотя центросомы в нем были явно минорным компонентом. Действительно, эффективность иммунизации оказалась примерно той же, что и при использовании препарата база льнах телец: из 24 клонов, продуцируодих антитела к внутриклеточным компонентам, антителч к центросоме продуцировали тоже 6.

Из 14 полученных нема гибридомных клонов,' продуцирующих антитела к центросома, лишь I продуцировал антитела, специфически реагировавшие с центросомой в штарфазньк клетках. Но и эти антитела целиком окрашивали штотическое веретено. Остальные клоны продуцировали антитела, окрашивающие центросому и еще какую-либо клеточную структуру: интерфазное ядро, промежуточные филаменты, часть микротрубочек и т.п. Все 14 клонов давали разный паттерн окрашивания клеток. Этот результат совпадает с данными других авторов, которые также применяли для получения антител иммунизацию животных тотальным нефрак1щошфовашшм препаратом центросом, и лишь один из двух десятков клонов продуцировал строго специфичные к центросоме антитела (saiitto et ¿1., 1992. cell Motu. Cytoskeieton, 22: 7-24). Более того, спектр получавдихся антител по паттерну окрашивания культивируемых клеток у нас и у этих

авторов был сходен. Вероятно, при иммунизации животных данной сложной смесью белков иммунная система дает ответ на саше сильные и, возможно, в первую очередь на общие для нескольких белков антигенные детерминанты. Для получения другого набора антител к центросоме, по-видимому, нужно использовать частично фракционированные белки центросом. Однако и полученные наш антитела давали такие интересные паттерны иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, что т провали подробные исследования антигенов для части этих антител, надеясь получить новую информацию о центросоме.

3.9 Микротрубочки, непосредственно отходявдее от цектросош, могут

отличаться по антигенным свойствам от других клеточных

шкротрубочек, что определяется наличие« в них особого белка

либо особыми свойстваии тубулина

Моноюшальные антитела зи-зсз была наш получены при иммунизации мыш препаратом центриолей из селезенки крупного рогатого скота. В культивируемых клетках СПЭВ при иммунофлуоресцентном исследовании они окрашивали яркое небольшое пятно в цитоплазме возле ядра, имевшее вид крошечной звездочки, и митотические веретена на всех стадиях митоза (рис.12). Кроме того, в цитоплазме очень слабо и пунктирно окрашивалась сеть фибрилл, которые при двойном иммунофяуресцентном окрашивании совпадали с микротрубочками, окрашенными антителами к тубулину. Яркое пятно при этом совпадало с центросомой. Иногда слабое окрашивание зы-зсв было видно и в некоторых ядрах. Результаты окрашивания клеток СПЭВ были одинаковыми при всех использованных способах фиксации (см. раздел 2.4); обработка щелочной фосфатазой также не влияла на окрашивание.

Обработка живых клеток СПЭВ нокодазолом (I мкг/мл, 4 - 18 ч) или пермеабилизированных Тритоном Х-100 клеток 0,6 М раствором кс1 полностью элиминировала окрашивание фибрилл в цитоплазме, которые, следовательно, действительно были микротрубочками, а на промежуточными филаментами. После обработки к-иаток таксолом-(Ю мкг/мл, 4 ч) окрашивание центросомы антителами вк-зсв пропадало, во пунктирно окрашивались пучки мнкротрубочек в цитоплазме (рис. 12). После обработки клеток винбластшоы (10 мкг/мл, 4 - 18 ч> цзнтросома также не окрашивалась, но неярко окрашивались винбластиновые паркристаллы, причем окрашивание ослабевала при увеличении времени инкубации.

Рис. 12. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток СПЭВ моноклоналышш антителами зи2-зс8. А - контрольные клетки; Б - 10 мин восстановления микротрубочек после разрушения холодом

Точно так же, -кьк. и клетки СПЭВ, окрашивались антителами эн-зсв клетки культуры в111-и-гар-237 (фибробласты китайского хомячка). В ь-клетках пунктирно окрашивалась сеть микротрубочек, а эмбриональные мышиные фибробласты совсем не окрашивались.

Когда клетки СПЭВ охладили на 2 ч до 6°С, а затем нагрели до 37°С в течение 10 'мин, то образовавшиеся в них звезда микротрубочек, отходящих от центшсомы, ярко окрашивались антителами Бы-зсв (рис.12). Таким . образой, антитела БЫ2-зс8 окрашивали только микротрубочки, непосредственно, отходящие от ЦОМТ, и таксольные микротрубочки. ... '

При иммуноблоттинге антитела бн-зсв узнавали в препарате микротрубочек мозга крупного рогатого скота полипептида молекулярной массы около 75, 55 и 52 кЦ, а в препарате белков клеток СПЭВ - полипептнда молекулярной массы 55, 52 и 30 кД (рис. II). Поскольку полипептвд 55 кД совпадал по молекулярной массе с тубулином, необходимо было удостовериться, не является ли он тубулином. Мы провели преинкубации антител эн-зсв с тубулином из мозга, очищенным на фосфоцеллюлозе, и с тотальным белком микротрубочек из мозга, где концентрация тубулина была в несколько раз больше. Кроме того, мы провели шмуноблоттинг с препаратом очищенного тубулина. Результаты этих экспериментов показали, что антителе БЫ2-зс8 реагировали, хотя и слабо, с. очищенным тубулином из мозга.

Другими авторами было описано мококлональное антитело (anti-Tuba), которое узнавало в иммуноблоттинга д-субъединицу тубулина, ко окрашивало клетки "комплементарным'' к антителам SN-3CS способом: все шкротрубочки, кроме микротрубочек митотического варитена и, судя по иллюстрациям, приведенным в работе, микротрубочек, ОТХОДЯЩИХ ОТ центросомы (Goasela, Ingram, 1989.' Exp.Cell Rea. , 184: 471- 483) . АВТОРЫ УСТЭН0ВИЛИ, ЧТО antí-Tub'¿ да направлен специфически против какой-либо из известных модификаций тубулина: его изотшов, детирозоякрованной, тирозилировонной и ацетилкроЕаняой форм. Характер окрашивания клеток антителами arit-i-Tub2 к вм-зсв таю:;з не совпадал с характером распределения в клетках этих модификаций тубулина

(Gundersen et al., 1984. Cell, 38: 775 - 739; Piperno, Fuller, 1985. J. Cell SiOl., 101: 2035 - 2094). ДЗНЕЫв ПО ОКрПШНВаШШ т.-клеток и ¡шшнннх эмбрионагьш фиброблзстов показывают, что вздовая специфичность здесь тоже ни при чем. Возможно, что речь идет о какой-то повой модификация тубулина или специфической конфирмации его молекулы.

На исключено также, что антитела sn-зсв узнают белок, ассоциированный с мнкротрубочкаии, н антигенно сходный с тубулакои. Набор полипептидов, узнаваемых антителами sti-зса в препарата белков микротрубочек мозга, сходен с набором полипептидов так называемых этор-белков, которыми обогащены холодоустойчивые шкротрубочки мозга (Job et al., 1982-. Biochero., 2i: 509). Природа антигена антител SN-зса, по-видимому, требует дальнейших исследований.

Интересно, что антитела к новообразованным микротрубочкам были нами получены после иммунизации животных 'препаратом, в котором из микротрубочек содержались только стабильные триплеты центрнолярного цилиндра.

3.10. В интерхроиатиновых районах ядра содержится белок, родственный по антигенной детерминанте ассоциированному с ыикротрубочкаии белку 170 кД. Этот ядерныЧ белок маскируется при действии на клетку некоторых агентов, разрушающих микротрубочки.

Другие антитела, sn2-ips, полученные после иммунизации мыши препаратом Оазальных телец сперматозоидов вьюна, в тотальном препарате белков клеток СПЗВ (и HeLa) узнавали один полипептид

...пекулярной массы 170 кД (рис. II). Антитела sn2-ips реагировали также с белком 170 кД, содержащимся в препарате микротрубочек, выделенных из надпочечников крупного рогатого скота (препарат был любезно предоставлен Ф.Ф.Севериным). Тем не менее, при иммунофлуоресцентном исследовании они окрашивали в клетках (СПЭВ, неьа и мышиных эмбриональных фабробластах) как микротрубочки (интерфазные - слабо, штотические - ярче), так и мелкие пятна в ядрах. Окрашивание можно было наблюдать в фиксированных формалином пермеабилизованных клетках или в фиксированы! абсолютным метанолом клетках; после фиксации формалином непермеабилизованшх клеток или всех видов фиксации глютаровым альдегидом окрашивание было диффузным. Сравнение окрашивания ядер антителами sn2-ifs и антителами т12 и asc35 к сплайсинговым факторам, а также аутоиммунными антителами человека к ыяРНП и специфическим к ДНК красителем Hoechst 33258 показало, что антитела sh2-ifs окрашивали га и и рхрома типовые районы - места сосредоточения ядерных РНП-частиц

{Carrao-Fonseca et al-, 1991. ЕМБ0 J., 10: 195-206).

Рис. 13. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток СПЭВ антителами зыг-1Р5 (А) после инкубации их с нокодазолом (I мкг/мл, 6 ч) и (Б) с таксолом (10 мкг/мл, 6 ч). Чтобы проверить, что фибриллы, окрашиваемые антителами эы2-1Р5 в цитоплазме, являются именно микротрубочками, мы обработали клетки СПЭВ агентами, разрушанцими микротрубочки. Оказалось, что поведение антигена в цитоплазме полностью соответствует поведению микротрубояекокрашивание в цитоплазме становилось диффузным после 3- 18 ч инкубации клеток в I мкг/мл нокодазола или колцемвда или 10 мкг/мл колхицина. После 18 час в 5

мкг/мл таксола окранивгяись характерные пучки микротрубочек (рис. 13), а после 18 ч в 10 мкг/мл винбластина - характерные паракристаллы,.

Интересной особенность» антигена антител SN2-1F5 оказалось то, что после длительной инкубации клеток в нокодазоле, колцемиде или колхицине окрашивание пропадало не только из цитоплазмы, но и из ядер (рис. 13). Напротив, после инкубации в таксоле или винбластине окрашивание ядер было очень четким (рис. 13). После инкубации в нокодазолэ антиген не пропадал из ядер, а маскировался в них, так как если клетки посла пермеабшшзации дополнительно экстрагировали 0,4 М раствором kci, окрашивание ядер восстанавливалось.

Мы проверили также, па является ли антиген антител sn2-ifs компонентом ядорного матрикса. Оказалось, что он утрачивается при изготовлении препарата ядерного матрикса культивируемых клеток m situ посла стадии обработки РНКазой А, хотя сохраняется после экстракции 2,о М Naci и обработок Дйазой I.

Таким образом, в интерхроматиновых районах ядер содер ятся связанный с РНП-частицами антиген, маскирующийся при действии на клетку агентов, разрушающих ыикротрубочки. Возможно, его маскирование связано с повышением концентрации свободного тубулина или других белков микротрубочек в цитоплазме при действии этих агентов. Ранее какие-либо изменения в ядре, происходящие в ответ на разрушение клеточных микротрубочек, описаны не были.

Антитела SW2-1F5 были получены после иммунизации мыши препаратом, полученным из сперматозоидов, в которых практически нет ядерных РНП-компонентов. Скорее всего, антиген содержался именно в базальных тельцах, и это еще раз заставляет вспомнить, что по некоторым данным в центросоме содержится РНК.

3.II. Антиген ыоноклональных антител RH-C6, узнающих фосфоэпитоп в белке MAPI и нейрофилаыантах, локализован в ядерном матриксе, где он лабильно связан с ДНК через мд2+, и в центросоме, где он участвует в полимеризации микротрубочек

Моноклональные антитела яи-св, о которых уже говорилось в разделе 3.8.1, при иммунофлуоресцентном ■ окрашивании всех исследованных типов культивируема клеток (СПЗВ, ноьа, гнт, ь-клеток, эмбриональных фгброблзстов мыши и человека) выявляли в них мелкие пятка в интерфазных ядрах, центросому и мктотическоо

веретено (рис. 14). Сравнение окрашивания ядер антителам! rn-c6 и антителами YI2 и <*sc35 к сплайсинговым факторам, а также аутоиммунными антителами человека к мяРШ! и специфическим к ДНК красителем Hoechst 33258 показало, что антитела кы-сб, как и описанные в разделе 3.10 антитела sn2-ifs, окрашивали интерхроматкновые районы ядер, т.е. места сосредоточения ядерных РНП и прохождения транскриптами процессинга.

При ишуиобдоттинге анитела ьш-сб узнавали в тотальном препарате белков куиьтивнремых клеток набор полипептидов молекулярной массы от 100 до 280 кД (рис. II).

Ранее несколькими независимыми грушами авторов отмечалось, что антитела к ассоциированному с микротрубочками мозга белку MAPI (там, где это было исследовано, имелся в виду его вариант MAPIB) окрашивают в культивируемых клетках мелкие пятна в ядрах и/или центросому, а также митотическое веретно и, иногда, микротрубочки

(Sato et al., 1933. Cell Struct. Fu-et., 8: 245-254; Sherline, Mascardo, 1982. J.Cell Blol., 93: 507-511; Bonifacino et al., 1985. Proc. Natl. Acai. Sei. USA, 82: 1146T 1150; Diaz-Nldo, Avila, 1989. J.Cell Sei-, 92: 607-620.). АНТИТбЛЭ К варианту MAPIA окрашивали ТОЛЬКО микротрубочки (Bloom et al., J.Cell Biol., 1984, 98: 331-340). Антитела к MAPI (В), огфзпшваюцие ядра и центросому, при иммуноблоттинге в культивируемых клетках обычно узнавала, как и антитела ют-сб, набор высокомолекулярных далидашэдов и были направлены против антигенной детерминанты, содержащей фосфат. Антитела к антигену со сходными характеристиками были получены также после иммунизации животных центросомами (seiitto et al., 1992. Cell Motil. Cytoekeletoa, 22: 7-24) ЕЛИ препаратами клеточных ядер (Не et al.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1991, 88: 7469-7473). Некоторые детали характеристик антигенов (устойчивость к солевым экстракциям, распределение в интерфазных шясротрубочках

---, Рис. 14. Иммунофдуоресцен-

. -'<( тное окрашивание клетки

"культуры lfeLa моноклональ-

ными антителами RK-C6.

•р . Видно окрашивание кктер-Й хромагивовых районов ядра É и центросомы.

и т.п.) отличались в работах разных авторов, что позволяло

- 52

предположить, что речь- идет о семействе полштетидов, имеющих несколько общих антигенных детерминант.

Интересной особенностью антител bn-c6 было то, что б пермвзбаиизовакных Тритоном Х-100 и фйксированых формалином или глютарсвым альдегидом клетках они окрашивали но все ядра в клеточном монослое . Тзкое не явление отмечали для своих антител Sato St el. (Exp. Cell Has., ÍS84, 155: 33-42), KOTOptje ПНТЭЛИСЬ

его связать с различной степенью фэсфсршшрования антигена в ядрах.

Однако ш установили, что при применении других способов фиксации антиген антител кн-со выявляется во всех ядрах всех исследованных культур. Это происходи? при использовании фиксации метанолом или смесью спирт - уксусная кислота. Напротив, при фиксации формалином ихк глютаровым альдегидом без предварительной пармеабилизадаш клаток окрашенными оказываются только отдельные ядра в монослов, в основном принадлежащие к поздней телофазе митоза. Мы такие получили ядерные матрикск культивируемых клеток СГОВ и HeLa in situ и установили, что антиген антител rk-C6 является постоянным компонентом ядерного матрикса, поскольку эти структуры окраавталисъ одинаково во всех клетках монослоя.

Мы предположили, что антиген антител RN-сб может Сыть маскирован в ядрах либо из-за изменений своей конформации, либо из-за связывания с какими-либо другим компонентами ядра - ДНК, РНК или белками. Мы исследовали эти возможности, проведя ряд экспериментов с нермеабилизоввшшни детергентом культивируемыми клетками НеЬа.

Ми помещали лермеабилизованныэ Тритоном Х-100 клетки в буфер, содержавший 50 мЫ ТЭА рН 7,4 и 5 мМ Mgci2 (ТМ-5), в котором хроматин конденсировался, или в 20 мМ ТЭА (ТМ-0), в котором хроматин диспергировался (Поляков и др., 1979. Цитология, 21: 514-519) хроматин. Клетки также обрабатывали ДНКазой I, РНКазой А или протеиназоЯ К. Обычно мы применяли последовательные 20-ти минутные инкубации клеток в ТМ-5, ТМ-0 и снова в ТМ-5. После обработок мы фиксировали клетки, окрашивали их антителами rn-c6 и подсчитывали число окрашенных, слабсокрашенных и неокрашенных ядер в препаратах (табл. 6).

Обработка протеиназой К в указанных условиях не влияла на характер окрашивания клеток антителами rn-C6. Из да-тпи таблицы видно, что антиген выявлялся в ядра .с в растворе ТМ-0, деконденсирупцем хроматин, а также после действия ДНКаза I. В

РНКазе А, по-видимому, происходила частичная экстракция антигена, который, ввозможно, связан с компонентами гетерогенной ядерной РНК в составе ядерного магрикса. Отсутствие влияния ТМ-5 на антиген после обработки ДНКазой I говорило о том, что его маскирование в ТМ-5 не было связано с его собственными конформационными изменениями.

Табл.6. Количество ярко окрашенных, слабоокрашенных и неокрашенных антителами ш-се ядер в клетках неьа после различных обработок, в %

первая инкубация инкубация вторая ин- количество ядер, %

в ТМ-5 в ТМ-0 кубация в ярко слабо не ок-

в ТМ-5 окраш. окраш. рашенных

+ _ _ ' 19 17 64

+ + - 100 0 0

+ + + 66 • 5 31

+ РНКаза А - - 18 9 .73

+ РНКаза А - 83 17 0

+ РНКаза А + + 0 97 3

+ ДНКаза I - - 100 0 0

+ ДНКаза I + • 100 0 0

+ ДНКаза I + + 100 0 0

в таблице означает, что инкубация в данном растворе проводилась, - что не проводилась,. Использовали ХОО

мкг/мл РНКазы А и IOO икг/ыл ДНКаэа X. '>

Мы также обработали клетки нуклеазой из микрококков и установили, что в отличие от ДНКззы I, этот фермент, судя по окрашиванию специфичным к ДНК краснгелем ноосЬвъ 33253, в примененых наш условиях обработки удалял ДНК из ядер не полностью. В части ядер окрашивание Hoechst 33258 сохранялось, и эти ядра не окрашивались антителами rh-cs (рис. 15), и наоборот, после полного удаления хроматина ядра были ярко окрашены.

№ решшш, что маскирование аптигенлой детерминанта в ядрах происходит из-за их кд2+- зависшего' связывания с ДНК. Для проверки этого предположения ш инкубировали предварительно обработайте ЛНКазой I и тщательно промытые клетка с раствором экзогенной ДНК :(из тимуса крупного рогатого" скота). Оказалось,

окрашивание Hoechst 33258. Стрелки указывают на неокракегашь ядра.

что инкубация с ДНК в ТМ-5 почти полностью ингибируот окрашивание клеток антителами ен-сс, а инкубация в ТМ-0 - нз влияет на зго. Во всех описаниях выше экспериментах в качестве контрольных ми использовали моноклинальные антитела yî.2 и «бсзб и аутоиммунные антитела человека к мяРНП. Окрашивание ядер этими антителами на зависело от инкубации в ТМ-5 и ТМ-О, действия ДНКаз и ДНК, но антигены полностью отмывались поело инкубации в РНКазе А.

Таки образом, антиген антител ш*-се, локализованный в ядерном матрэдеев, лабильно связан с ДНИ через ид2+, что может приводить к маскировании его для антител. Вероятно, проявление антигена в клетках после пермеабилизация в буфере ikm носит сложный характер и зависит как от частичной декошактизащш хроматина, происходящей з этом буфзрв, так и от действия эндогенных нуклеаз. Причина различий, проявляющихся между отдельными ядрами в буфере ikm и в буфере ТМ-5, должна быть исследована особо.

Способность белков, ассоциированных с микротрубочками, MAPI и МАР2 образовывать комплексы с ДНК была ранее продемонстрирована в хроматографических исследованиях (Hancock, Burns, 1987. Bioph.Bloch. Acta, 927: 163-169). Полагают, что эти белки могут ассоциироваться с IHK за счет электростатических взаимодействий через сайты связывания этих белков с тубулином, резко обогащенные ОСНОВНЫМИ аминокислотами (Noble et al., 1989. J.Cell Biol., 109: 3367-3376).

Мы также изучили, не участвует ш антиген антител rn-c6 в сборке микротрубочек на центросоме. Для этого мы использовали систему сборки микротрубочек in vitro из очищенного тубулина на центросомах в обработанных нокодазолом и пермеабияизованных раствором Нокидета Р-40 клетках неьа по методу Seinto et ai.

(Cell Motil. Cytoskeleton, 1992, 22: 7-24). В КОНТРОЛЬНЫХ

препаратах, а также в препаратах, инкубированных перед инкубацией с тубулином с антителами сзсзб (асцитная кйдкость), yI2 (культуральная срада) и sh2-ifs (культуральная среда и асцитная жидкость), в клетках образовывались обширныэ звезда из микротрубочек, расходящихся из района центросомы. После инкубации же с антителами ¡ш-Сб (культуральной средой и асцитной жидкостью от 2 разных мыией) сборка шкротрубоочек на центросомах клеток HeLa полностьи ингибировалась.

Таки образом, один и тот же антиген может участвовать в связвании ДНК с ядерным магриксом и в сборке микротрубочек на центросоме. Открытым остается вопрос, скольким полипептидам принадлежит эта антигенная детерминанта. Скорее всего, в ядре находятся несколько таких полшептвдов, а в центросома - еще один или несколько других (Dias-Nido, Avila, 1989. J.Cell Sol., 92: 607-620). Наши дзнше хорошо соотносятся с данными о том, что гистон hi, который считался сугубо ядерным белком, связываниям ДНК с высокой специфичностью, ассоциирован о аксошысЕ Егутиков и стабилизирует ее микротрубочки (Multigner et al., 1992. Nature, 360: 33 - 39). Возможно, как пшут эк' авторы "микротрубочки и ДНК действительно используют общие компоненты для своей структурной и функциональной регуляции" и центросома связана ^ с ядром на только структурно, но и функционально.

ВЫВОДЫ

1. Интврфазные ядра в живых культивируемых клетках животных структурно связаны с центросомой, причем эта связь опосредована актнновым компонентом цитоскелета.

2. В культивируемых клетках центросома является центром организации виментиновых промежуточных фшгамзнгов.

3. Смещение митогичэского веретена к периферии культивируемой животной клетей без его видимой деструкции блокирует штоз на стадии ыетафазы.

4. В гигантских клетках слюнных нелез сыгопошив cingulatus содержатся множественные бесцентрюлярвые центры организации шжротрубочек, часть которых ассоциирована с ядерной оболочкой.

5. Структурной основой цектр'лолей и баэальшх телец является их ыатрикс, сохраняющий конфигурацию органеллы после искусственного удаления триплетов мрсротрубочек.

6. Штастеры, возникающие в ооците хепориа 1аеу1з после инъекции гйгерологичннх центриолай, к первой телопрофазе дробления содержат только новообразованные ценхриоли.

7. Моноклоналыше антитела к центросоме можно получить после иммунизации животных препаратом, содержащим даже минорные количества цеьтрколей или центросом. В состав центросом входит много различии антигенов. Моноклоналыше антитела к центросоме часто реагируют с другими клеточными структурами.

8. Мгосротрубочки, непосредственно отходящие от центросома, отличаются по антигенным свойствам от других клеточных инкротрубочек, что определяется наличием в них особого белка либо особыми свойствами тубулша.

9. При действии на клетку агентов, разрушаювди микротрубочки, в интерфазном ядре могут происходить структурные перестройки.

10. Один и тот же антиген локализован в ядерном матриксе, где он лабильно связан с ДШС чорез мд2+, и в центросоме, где он участвует в полимеризации микротрубочек.

Список печатных работ по теме диссертации:

1. Наде ¡¡едина е. с. Цитохимическое выявление рнк в центриолях. //Тезисы докл. XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии. 1982, Суш.

2. Надевдина Е.С. Структурная связь центриолей с интерфазннм ядром. //Труды ш Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. 1982, Тбилиси.

3. Надевдина Е.С., Воробьев И.А. Деформация и смещение митотического веретена при центрифугировании живых .леток блокирут митоз.// Доклады Академии Наук СССР 1984. т.276, N4. С.965- 968.

4. Иадевдина Е.с., Родионов В.И., ВаЯсберг Е.А., Гельфанд В.И. Моноклональные антитела к MAP из мозга связываются с микротрубочками в культивируемых клетках. //Тезисы докл. 16 конференции Федерации Европейских биохимических обществ. 1934, Москва.

5. Pais D., Nadezhdina E.S., Chentsov Yu.S. Evidence for ths nucleus- centriole association in living cells obtained by ultracentrifugation.//European Journal of Cell Biology 1984. V.33, p. 190 - 196.

6. Rodlonov V.I., Nadezhdina E.S., Leonpva E.V., Vaisberg E.A., Kuznotsov S.A., Gelfand V.I. Identification of a 100 kD protein associated vith microtubules, intermediate filaments, .»nd coated vesicles in cultured cells.//Experimental Coll Research 1985. V.159, p. 377 - 387.

8. Fais D., Nadeahdina E.S., Chentsov Yu.S. The centriolar rim. The structure that maintaines configuration of centrioles and basal bodies in the absence of their microtubules. //Experimental Cell Research 1986. V.164, p. 27-34.

9. Kuznetsov S.A., Rodionov V.I., Nadezhdina E.S., Murphy D.3., Gelfand V.I. Identification of a 34 kD polypsptide as a light chain of microtubule-associatad protein - 1 (MAPI) and its association with MAPI peptide that binds to Microtubules. //Journal of Cell Biology 1986. V.102, p. lb60-1066.

10. Надеадина E.C., Вайсберг E.A. Реорганизация системы промежуточных филаментов и выявление центров их организации при центрифугировании прикрепленных к субстрату клеток. // Цитология 1987. т.29, ы 5, с. 543 - 548.

11. Воробьев И.А., Надеадина Е.С. Центрнолярный аппарат и его роль в организации система шгкротрубочзк.// Сер. "Обде проблема фззико-ашической биологии". ВИНИТИ, 1937. Москва. Т. 7.

12. Vorobjev I.A., Nadezhdina E.S. The Centrosome and Its Pole in the Organization of HicrotubulftS.// International Revicnv

of Cytology 1937. V. 106, p. 227 - 293.

13. Соловьянова С.Б., Порвчнзя M.A., Надездина E.C. Идентификация с помощь» моноклоналышх антител одного из белков

микротрубочек, локализованного преимущественно в центросоме и в митотичаском веретене. /'/Доклада Академии Наук СССР 1989. т. 309, N 2, 464-467.

12.Абаимова Т.Я., Кузнецов С.А., Надеждгтаа Е.С., Родионов В.И., Ткачева Н.П. Выявление с помощью моноклональных антител высокомолекулярного структурного бедка ядерного матрикса, являющегося аналогом MAPI. // Тезисы х Всесоюзного симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". Гродно, с.4.

13.Абаимова Т.Я., Надеядшха E.C. 1991. Иммуноцитохимическое выявление маскированной ДНК антигенной детерминанты бе ядерного матрикса. //Цитология, т.33, ы 9, с. 46 - 47.

14.Крохина Т.Е., Надеэдина E.C. 1991. Роль элементов цитоскелета в процессе возвращения в центр клеток их ядер, смещенных центрифугированием. //Цитология т. 33, N 4, с. 28 - 37.

15,.Абумуслимов С.С., Надеждина Е.С., Ченцов Ю.С. 1991. Множественные бесцентриолярные центры организации микротрубочек в гигантских клетках слюнных желез chironomus clngulatus. //ЦИТОЛОГИЯ, Т.33, N 12, С. 36 - 40. •

16.Alleva I.B., Nadezhdina E.S., Valsberg E.A., Vorobjev I.A. 1992. Microtubule and intermediate filaraenc patterns aronnd the centrosoraa in Interphase cells. // In: "The Centrosorae". V.I.Kalnins, ed. Academic Presa, Inc. P. 103 - 129.

и.ЛОаимова 1.Я., Надеэдина е.С. Высокомолекулярный фосфопротеиы ядерного матрикса. являодийся аналогом белка MAPI из микротрубочек мозга, ассоциирован с ДНК мд - зависимым образом. //Доклада Академии наук СССР, т. 324, н2, с.430 - 433.

20. Fedotov I.Yu., Nadezhdina E.S. The influence of different detergents on the sensitivity of HeLa cells cantrosoraas to extracton agents. Cell Biology Inernational Reports 1993. (in press).